CN103031268B - OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株 - Google Patents
OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株 Download PDFInfo
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Abstract
OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷。OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）按以下步骤制备：一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。
背景技术
老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织（WHO）的标准，美国国家健康和营养调查（NHANES Ⅲ，1988~1994年）结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050 年将增加到2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995~1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。
肥胖与骨量关系临床观察表明，肥胖与骨密度(BMD)提高有关。肥胖是骨量的保护因素，超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素，提高体重指数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。
发明内容
本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷，而提供的一种OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株。
OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）按以下步骤制备：
一、将含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（OGP/Obese’）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段；
二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-OGP/Obese’；
四、用载体pGEX-OGP/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）。
本发明中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明OGP-rhLeptin融合蛋白采用人为改造的Leptin和成骨生长肽基因编码翻译而成。具有降低使用者体重，并防治骨质疏松的效果。
本发明用于治骨质疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。
本发明OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）发酵产生的OGP-rhLeptin融合蛋白共52个氨基酸。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）可大规模发酵生产OGP-rhLeptin融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和肥胖奠定了物质基础。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）按以下步骤制备：
一、将含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（OGP/Obese’）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段（OGP/Obese’）；
二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-OGP/Obese’；
四、用载体pGEX-OGP/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）。
本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21（DE3）。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤一中质粒载体pUC（OGP/Obese’）酶切反应体系为
其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式步骤一酶切反应在37℃条件下反应10h，然后1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为
其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
本实施方式步骤二酶切反应在37℃条件下反应10h，然后0.6%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点在于：步骤三中酶连接反应体系为
其他步骤及参数与具体实施方式一、二或三相同。
本实施方式步骤三酶连接反应在16℃条件下进行。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
本实施方式OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（OGP/Obese’）。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’），大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）按以下步骤制备：
一、将含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC（OGP/Obese’）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段（OGP/Obese’）；
二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；
三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-OGP/Obese’；
四、用载体pGEX-OGP/Obese’转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）；
其中步骤一中质粒载体pUC（OGP/Obese’）酶切反应体系为：
其中步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为：
其中步骤三中酶连接反应体系为：
其中步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本实施方式中OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（OGP/Obese’）。本实施方式在构建OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）时在OGP和Obese’之间插入KpnⅠ酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoRⅠ酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。
载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点，本实施方式合成的pGEX-OGP/Obese’均能为KpnⅠ单酶切开，说明本实施方式OGP-rhLeptin融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-1中。然后将质粒pGEX-OGP/Obese’导入大肠杆菌BL21（DE3）中，选取阳性克隆。
随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）菌落37℃过夜培养，提取质DNA，用KpnⅠ进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）内含有SEQ IDNO：1所示DNA。
将大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）置于LB培养基28℃环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和肥胖的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为38.7%。
利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）发酵获得的OGP-rhLeptin融合蛋白进行试验：
OGP-rhLeptin融合蛋白治疗骨质疏松实验：
取雌性SD大鼠在无菌条件下摘除双侧卵巢，12周后取存活健康大鼠40只，随机分为5组（阳性对照组1、阳性对照组2、融合蛋白实验组和阴性对照组），每组8只。另取雌性SD大鼠切除双侧一小块脂肪，12周后随机取存活健康大鼠8只作为假手术对照组。共计6组，分别口服以下药物：
假手术对照组：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；
阴性对照组：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；
融合蛋白实验组：质量浓度为0.5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg；（获得的用于治疗骨质疏松和血栓的OGP-rhLeptin融合蛋白用无菌水溶解）
阳性对照组1：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg；
阳性对照组2：质量浓度为0.5%的OGP蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。
阳性对照组3：质量浓度为0.5%的rhLeptin溶液，灌胃剂量为5ml/kg。
连续给药三个月，处死后取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。
观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明融合蛋白实验组、阳性对照组1和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且融合蛋白实验组的效果最好。
表1 骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）
| 组别 | n | 给药剂量 | 骨小梁宽度X±SD | 骨小梁面积X±SD |
| 假手术对照组 | 8 | 5ml/kg | 112.41±15.33 | 0.6910±0.0513 |
| 阴性对照组 | 8 | 5ml/kg | 53.74±16.5 | 0.5748±0.0551 |
| 阳性对照组1 | 8 | 5ml/kg | 112.28±14.7 | 0.6588±0.0429 |
| 阳性对照组2 | 8 | 5ml/kg | 114.98±13.2 | 0.6873±0.0474 |
| 阳性对照组3 | 8 | 5ml/kg | 54.52±17.4 | 0.5781±0.0422 |
| 融合蛋白实验组 | 8 | 5ml/kg | 121.40±15.2 | 0.7115±0.0467 |
融合蛋白（OGP-rhLeptin）通过静脉注射给药治疗骨质疏松效果更佳。
OGP-rhLeptin融合蛋白体重调节实验：
将雌性ob/ob小鼠40只，以10只为一组，共分为4组。分别注射媒介物（0.7%生理盐水）、rhLeptin、sCT-rhLeptin融合蛋白和L-肉碱，每天1mg、持续28天，每天记录小鼠的体重，实验结果如表2所示。本实施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。
表2
| 0.7%生理盐水 | rhLeptin | sCT-rhLeptin融合蛋白 | L-肉碱 | |
| 原始体重（g） | 59.9±0.6 | 59.5±0.8 | 59.4±0.7 | 58.8±0.8 |
| 28d后体重（g） | 58.9±0.5 | 51.0±0.8 | 50.7±0.8 | 51.8±0.7 |
| 体重改变（g） | -0.1 | -8.5 | -8.7 | -7.0 |
| P<d | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
OGP-rhLeptin融合蛋白毒性实验：
哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。
给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。
OGP-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶(ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。
表3
OGP-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。
表4
| 组别 | 天数 | 心 | 肝 | 脾 | 肺 | 肾 |
| 对照组 | 14 | 3.60±0.62 | 32.10±2.39 | 4.46±0.94 | 2.71±0.90 | 7.72±0.92 |
| 实验组 | 14 | 3.49±0.90 | 30.59±3.24 | 4.68±0.82 | 2.92±0.77 | 7.71±0.89 |
| 对照组 | 30 | 3.61±0.68 | 32.14±2.23 | 4.59±0.81 | 2.92±0.65 | 7.85±0.79 |
| 实验组 | 30 | 3.54±0.85 | 30.67±3.14 | 4.48±0.67 | 2.95±0.57 | 7.84±0.80 |
实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。
本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明OGP-rhLeptin融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明OGP-rhLeptin融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表OGP-rhLeptin融合蛋白OGP-rhLeptin融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。
成骨生长肽（OGP）是一种由14个氨基酸组成的小肽，具有促进体外成骨细胞增殖、体内成骨及刺激造血等功能，并且其氨基酸序列与组蛋白H4的C末端完全一致，与小鼠T细胞受体β链V区部分同源，OGP能增加细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达，增加碱性磷酸酶活性、胶原合成和钙盐沉积。对于骨折的愈合，骨质疏松症，急、慢性贫血病的预防和治疗及其在肿瘤放、化疗过程中刺激骨髓细胞造血的作用。
Leptin是obese基因编码的表达产物，由白色脂肪细胞和胎盘产生的由167个氨基酸组成的分泌蛋白，此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号，其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因由105个碱基组成，编码35个氨基酸的rhLeptin（Recombinant Human Leptin，人重组瘦素）。
本实施方式OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）发酵产生的OGP-rhLeptin融合蛋白在OGP和rhLeptin之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使OGP和rhLeptin丧失生物活性，反而提高了其生物活性；并且在融合基因C-端添加Arg，可以去除C-末端酰胺化的基团。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）内OGP-rhLeptin融合蛋白的表达量也比单一的CTx或OGP在大肠杆菌中的表达量高。
本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）产生的融合蛋白在治疗骨质疏松和肥胖方面的效果也超过单一的OGP或CTx，且该融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。
本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）所产融合蛋白二级结构的改变没有产生体内毒性，具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，所产融合蛋白具有分离纯化容易的特点。
采用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-OGP/Obese’）发酵制备OGP-rhLeptin融合蛋白具有生产成本低，生物活性高，免疫原性低，活性高，半衰期长的优点。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
Claims (6)
1.OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21(DE3)-OGP/Obese’，大肠杆菌BL21(DE3)-OGP/Obese’按以下步骤制备：
一、将含有OGP-rhLeptin融合蛋白基因的质粒载体pUC-OGP/Obese’用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得OGP-rhLeptin融合蛋白的DNA片段；
二、用BamHI和EcoR Ⅰ双酶切质粒pGEX-6P-1；
三、OGP-rhLeptin融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-OGP/Obese’；
四、用载体pGEX-OGP/Obese’转化大肠杆菌BL21(DE3)，选择阳性重组子，即获得OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-OGP/Obese’。
2.根据权利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC-OGP/Obese’酶切反应体系为
3.根据权利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为
4.根据权利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中酶连接反应体系为
5.根据权利要求1所述的OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
6.根据权利要求5所述的OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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