CN103013900B

CN103013900B - msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株

Info

Publication number: CN103013900B
Application number: CN201210585414.6A
Authority: CN
Inventors: 余琼
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Hebei Shang Yu Agricultural Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103013900A

Abstract

msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷。msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21（DE3-msCT/AcAP5）按以下步骤制备：一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。

Description

msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。

背景技术

血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。而对于老年人其凝血系统又有其特殊性，老年人纤维蛋白原（FIB）含量、组织型纤溶酶原激活物增加以及纤溶酶原激活物抑制剂复合物的增加都导致老年人的高凝状态，所以更容易形成血栓；其中研究发现绝经期后的女性的血栓发生率远高于男性。

老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织（WHO）的标准，美国国家健康和营养调查（NHANESⅢ，1988～1994年）结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050年将增加到2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995～1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。

对于老年人骨质疏松和血栓已成为常见多发病，且往往同时存在，特别是绝经期后的女性。如果患者服用多种药物同时治疗骨质疏松和血栓，容易产生药物拮抗反应；若要错开服药时间一方面要靠考虑药物的半衰期，另一方面还要考虑药物有效浓度，而且给患者造成不便。

目前缺乏一种可以同时有效治疗骨质疏松和血栓的药品。

发明内容

本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和血栓药品的缺陷，而提供的一种msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株。

msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5，大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5按以下步骤制备：

一、将含有msCT-AcAP5融合蛋白基因的质粒载体pUC-msCT/AcAP5用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得msCT-AcAP5融合蛋白的DNA片段；

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

三、msCT-AcAP5融合蛋白的DNA片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/AcAP5；

四、用载体pGEX-msCT/AcAP5转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5。

本发明中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5发酵产生的msCT-AcAP5融合蛋白含有127个氨基酸。本发明msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5发酵产生的msCT-AcAP5融合蛋白可用于同时治疗骨质疏松和血栓，适合同时患有这两种疾病的患者使用。且msCT-AcAP5融合蛋白为微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。

本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5可大规模发酵生产msCT-AcAP5融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和血栓奠定了物质基础。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5，大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5按以下步骤制备：

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21（DE3）。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤一中质粒载体pUC-msCT/AcAP5酶切反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式步骤一酶切反应在37℃条件下反应10h，然后1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

本实施方式步骤二酶切反应在37℃条件下反应10h，然后0.6%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点在于：步骤三中酶连接反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一、二或三相同。

本实施方式步骤三酶连接反应在16℃条件下进行。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

本实施方式msCT-AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC-msCT/AcAP5。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5，大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5按以下步骤制备：

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

四、用载体pGEX-msCT/AcAP5转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5；

其中步骤一中质粒载体pUC-msCT/AcAP5酶切反应体系为：

其中步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为：

其中步骤三中酶连接反应体系为：

其中步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式中msCT-AcAP5融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC-msCT/AcAP5。本实施方式在构建msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5时去除了AcAP5基因的原始信号肽，而且在msCT和犬钩虫抗凝血肽之间插入KpnⅠ酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoRⅠ酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。

载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点，本实施方式合成的pGEX-msCT/AcAP5均能为KpnⅠ单酶切开，说明本实施方式msCT-AcAP5融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-1中。然后将质粒pGEX-msCT/AcAP5导入大肠杆菌BL21（DE3）中，选取阳性克隆。

随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5菌落37℃过夜培养，提取质DNA，用KpnⅠ进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn Ⅰ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5内含有SEQ ID NO：1所示DNA。

将大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5置于LB培养基28℃环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和血栓的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为38.2%。

利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5发酵获得的msCT-AcAP5融合蛋白进行试验：

msCT-AcAP5融合蛋白治疗骨质疏松实验

取雌性SD大鼠在无菌条件下摘除双侧卵巢，12周后取存活健康大鼠32只，随机分为4组（阳性对照组1、阳性对照组2、融合蛋白实验组和阴性对照组），每组8只。另取雌性SD大鼠切除双侧一小块脂肪，12周后随机取存活健康大鼠8只作为假手术对照组。共计5组，分别口服以下药物：

假手术对照组：质量浓度为0.5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

阴性对照组：质量浓度为0.5%的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

融合蛋白实验组：质量浓度为0.5%的msCT-AcAP5融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg；（获得的用于治疗骨质疏松和血栓的msCT-AcAP5融合蛋白用无菌水溶解）

阳性对照组1：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg；

阳性对照组2：质量浓度为0.5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。

连续给药三个月，处死后取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。

观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明融合蛋白实验组、阳性对照组1和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且融合蛋白实验组的效果最好。

表1骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）

组别	n	给药剂量	骨小梁宽度X±SD	骨小梁面积X±SD
					假手术对照组	8	5ml/kg	112.50±14.89	0.6911±0.0510
阴性对照组	8	5ml/kg	52.34±16.8	0.5347±0.0500
					阳性对照组1	8	5ml/kg	115.76±14.5	0.6962±0.0593
阳性对照组2	8	5ml/kg	117.52±14.1	0.6970±0.0485
					融合蛋白实验组	8	5ml/kg	124.78±15.9	0.7051±0.0438

融合蛋白（msCT-AcAP5）通过静脉注射给药治疗骨质疏松效果更佳。

msCT-AcAP5融合蛋白抗大鼠血栓实验：

取SD大鼠48只，随机分为6组，每组8只，即空白组、对照组1(阳性药)、对照组2(AcAP5多肽)和msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高剂量组。对照组1选用肝素钠注射液(给药剂量为1650U/kg)，对照组2(给药剂量为200μg/kg)，msCT-AcAP5融合蛋白低、中、高剂量组(给药剂量5倍递增)的给药剂量分别为40μg/kg、200μg/kg、1mg/kg，空白组给予同体积的生理盐水。全部由静脉注射给药，经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS-14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度(测量的时间间隔为4s，以百分数表示数据，全部过程持续5min)。

观察抗血栓治疗实验结果，实验结果见表2，结果表明空白组的颈动脉堵塞程度与另外五组都用明显的区别。

表2msCT-AcAP5融合蛋白抗大鼠颈总动脉血栓的效果

组别	n	给药剂量	颈总动脉的堵塞程度(%)
				空白组	8	0μg/kg	100.00±0.00
对照组1	8	1650U/kg	49.26±41.98
				对照组2	8	200μg/kg	36.45±24.82
融合蛋白低剂量组	8	40μg/kg	40.26±41.31
				融合蛋白中剂量组	8	200μg/kg	26.39±42.63
融合蛋白高剂量组	8	1mg/kg	10.69±14.56

msCT-AcAP5融合蛋白毒性实验：

哈尔滨医科大学实验动物中心提供SPF级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射总剂量1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。

给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。

msCT-AcAP5融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心5min，吸取血清，用Beckman全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(URCA)、总胆红素(TBIL)、总胆汁酸(TBA)。血生化指标如表3所示。

表3

msCT-AcAP5融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾HE染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。

表4

组别

天数

心

肝

脾

肺

肾

对照组

14

3.59±0.60

32.06±2.38

4.46±0.82

2.75±0.92

7.74±0.90

实验组

14

3.50±0.75

30.57±3.20

4.67±0.65

2.94±0.68

7.73±0.87

对照组

30

3.63±0.65

32.14±2.22

4.58±0.49

2.92±0.65

7.86±0.75

实验组

30

3.53±0.60

30.60±3.17

4.47±0.65

2.94±0.59

7.87±0.80

实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的HE染色及骨髓Wright染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。

本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明msCT-AcAP5融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明msCT-AcAP5融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表msCT-AcAP5融合蛋白msCT-AcAP5融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。

犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）目前应用的有AcAP5、AcAP6和AcAPc2三种重组蛋白。本实施方式选用AcAP5并去除了其原始信号肽序列，由77个氨基酸组成，AcAP5是Xa因子（凝血因子）的高效特异性抑制剂，与Xa的反应位区在肽37-42(-C-R-S-P-G-C-)，作用位点在第40位精氨酸和第41位甘氨酸之间。AcAP5主要抑制凝血因子Xa，直接与Xa的活性中心结合从而特异性抑制Xa，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。

本实施方式对天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）进行了改造，改造后的msCT［Gly⁸，Ala¹⁶，del-Tyr²²］（sCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸，第16位的亮氨酸用丙氨酸置换，删除第22位的酪氨酸），改造后的msCT的生物活性可达8600IU/mg。

本实施方式获得的msCT-AcAP5融合蛋白在msCT和犬钩虫抗凝血肽之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使AcAP5和msCT丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5内msCT-AcAP5融合蛋白的表达量也比单一的AcAP5或msCT在大肠杆菌中的表达量高。

本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。

构建本实施方式大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5时改变了原有msCT和犬钩虫抗凝血肽AcAP5的二级结构，这种改变没有产生体内毒性，发酵产生的融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5发酵msCT-AcAP5融合蛋白具有分离纯化容易的特点。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。

Claims

1.msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5，大肠杆菌BL21（DE3）-msCT/AcAP5按以下步骤制备：

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

其中，步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC-msCT/AcAP5酶切反应体系为

3.根据权利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为

4.根据权利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中酶连接反应体系为

5.根据权利要求1所述的msCT-AcAP5融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-AcAP5融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。