CN102965325B

CN102965325B - msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株

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Publication number: CN102965325B
Application number: CN201210533952.0A
Authority: CN
Inventors: 余琼
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN102965325A

Abstract

msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，它涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和止痛药品的缺陷。msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步骤制备：一、获得融合蛋白DAN片段；二、双酶切质粒；三、酶连接；四、转化大肠杆菌BL21。本发明可用于医药制备领域。

Description

msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白转基因工程菌株。

背景技术

老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织（WHO）的标准，美国国家健康和营养调查（NHANES Ⅲ，1988~1994年）结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050 年将增加到2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995~1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。

当骨折发生时，患者最初的感受便是疼痛。在骨折早期治疗过程中，疼痛从始至终都存在着。它不仅影响患者的治疗效果，同时也直接影响肢体的功能恢复。不同类型的骨折均存在不同程度的疼痛、功能障碍、肢体肿胀，而疼痛是首先应考虑解决的问题。因为疼痛可引起交感神经兴奋，继而反射性抑制胃肠功能，引起食欲减退；疼痛还可影响睡眠质量，引起体内多种激素的释放，产生相应的病理生理改变，使机体抵抗力下降,直接影响创伤愈合及功能恢复。因此解除骨折患者的疼痛感是治疗的重要组成部分。

如果患者服用多种药物治疗骨质疏松并止痛，容易产生药物拮抗反应；若要错开服药时间一方面要靠考虑药物的半衰期，另一方面还要考虑药物有效浓度，而且给患者造成不便。

目前缺乏一种可以同时有效治疗骨质疏松和止痛的药品。

发明内容

本发明要解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和止痛药品的缺陷，而提供的一种msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株。

msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步骤制备：

一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/CTx）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DAN片段；

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

三、msCT-CTx融合蛋白的DAN片段与经过双酶切的载体pGEX-6P-1进行酶连接，然后16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/CTx；

四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）。

本发明中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

由于骨折患者均为突然致伤，无思想准备，再加上相关知识缺乏，治疗过程长；患者因疼痛恐惧常呈被动体位，特别是老年骨折患者，往往会引起将来功能障碍，而且恢复期较长。本发明msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）发酵产生的msCT-CTx融合蛋白可治疗骨质疏松的同时止痛，对于骨质疏松所引发骨折的患者治疗效果显著，而且由于可以明显减轻或消除患处疼痛感，患者心理负担小、康复快，愈后功能恢复期短。

本发明用于治疗骨质疏松和止痛的msCT-CTx融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。

本发明msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）发酵产生的msCT-CTx融合蛋白共60个氨基酸。本发明采用生物基因工程手段获得大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）。采用本发明基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）可大规模发酵生产msCT-CTx融合蛋白，具有广泛应用前景。本发明为治疗骨质疏松和止痛奠定了物质基础。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步骤制备：

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

本实施方式步骤四采用电击转化法转化大肠杆菌BL21（DE3）。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤一中质粒载体pUC（msCT/CTx）酶切反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：步骤三中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点在于：步骤二中酶连接反应体系为

其他步骤及参数与具体实施方式一、二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

本实施方式msCT-CTx融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（msCT/CTx）。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步骤制备：

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

四、用载体pGEX-msCT/CTx转化大肠杆菌BL21（DE3），选择阳性重组子，即获得msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）；

其中步骤一中质粒载体pUC（msCT/CTx）酶切反应体系为：

其中步骤三中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为：

其中步骤二中酶连接反应体系为：

其中步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示；步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式中msCT-CTx融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成，并由生物工程公司制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（msCT/CTx）。本实施方式在构建msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）时改变了天然鲑鱼降钙素（salmoncalcitonin，sCT）的基因，而且在msCT和CTx之间插入KpnⅠ酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。并在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoRⅠ酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。

载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点，本实施方式合成的pGEX-msCT/CTx均能为KpnⅠ单酶切开，说明本实施方式msCT-CTx融合蛋白成功导入质粒pGEX-6P-1中。然后将质粒pGEX-msCT/CTx导入大肠杆菌BL21（DE3）中，选取阳性克隆。

随机挑取阳性克隆大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）菌落37℃过夜培养，提取质DNA，用KpnⅠ进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）内含有SEQ ID NO：1所示DNA。

将大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）置于LB培养基28℃环境条件下培养15h，然后采用GST标签融合蛋白纯化方法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治疗骨质疏松和止痛的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为38.6%。

利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）发酵获得的msCT-CTx融合蛋白进行试验：

msCT-CTx融合蛋白治疗骨质疏松实验：

取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别口服以下药物：

阴性对照组(control)：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

模型组：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

实验组：质量浓度为0.5%的msCT-CTx融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg；（获得的用于治疗骨质疏松和止痛的msCT-CTx融合蛋白用无菌水溶液溶解）

阳性对照组1：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg。

阳性对照组2：质量浓度为0.5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。

连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。

观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表1，结果表明实验组、阳性对照组1和阳性对照组2都具有治疗骨质疏松的作用，且实验组的效果最好。

表1　骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）

组别	n	给药剂量	骨小梁宽度X±SD	骨小梁面积X±SD
					模型组	8	5ml/kg	50.02±19.7	0.3850±0.0487
阴性对照组	8	5ml/kg	112.48±15.2	0.6910±0.0501
					阳性对照组1	8	5mg/kg	113.24±16.7	0.6017±0.0480
阳性对照组2	8	5ml/kg	118.29±13.2	0.6882±0.0452
					实验组	8	5ml/kg	125.79±15.7	0.7171±0.0420

msCT-CTx融合蛋白热板镇痛实验：

挑取大小相近的雌性SD大鼠70只，任意分为7组，每组10只。调节热板温度为55±0.5℃，置大鼠于热板上，测定各大鼠的正常痛反应。以大鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛阙时间为5~30s为正常，60s为最大值。

空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组1给予低剂量的吗啡(25μg/kg)，阳性对照组2给予高剂量的吗啡(125μg/kg)，阳性对照组3给予CTx（0.75μg/kg），融合蛋白低剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白0.25μg/kg，融合蛋白中剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白0.75μg/kg，融合蛋白高剂量组给予本实施方式msCT-CTx融合蛋白1.5μg/kg。药后0.5h、lh、2h、3h重复上述测定，记录痛觉反应时间。记录给药后不同时间的痛阙，求出各组平均值，实验结果如表2所示。实验结果说明本实施方式转基因工程菌株产生的msCT-CTx融合蛋白具有优异的镇痛效果。

表2

msCT-CTx融合蛋白毒性实验：

哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。

给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。

msCT-CTx融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。

表3

msCT-CTx融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。

表4

组别

天数

心

肝

脾

肺

肾

对照组

14

3.58±0.58

32.10±2.34

4.33±0.80

2.71±0.89

7.69±0.92

实验组

14

3.51±0.76

30.61±3.28

4.57±0.76

2.92±0.60

7.68±0.84

对照组

30

3.62±0.57

32.09±2.24

4.46±0.79

2.94±0.65

7.86±0.80

实验组

30

3.56±0.87

30.63±3.27

4.37±0.60

2.95±0.60

7.86±0.74

实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。

本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明msCT-CTx融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明msCT-CTx融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明msCT-CTx融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无明显急性毒性、长期毒性。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺毒液的活性多肽。通常是由10~46个氨基酸残基组成；分子量小，结构多样，富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架，主要作用于钠、钾、钙等多种离子通道和神经递质受体，阻断或增强神经兴奋信号的传递，是迄今为止发现分子量最小的一类多肽毒素。本实施方式转基因工程菌株中设计的芋螺毒素由25个氨基酸残基组成。

本实施方式对天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）进行了改造，改造后的msCT［Gly⁸，Ala¹⁶，del-Tyr²²］（sCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸，第16位的亮氨酸用丙氨酸置换，删除第22位的酪氨酸），改造后的msCT的生物活性可达8600IU/mg。

本实施方式msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）发酵产生的msCT-CTx融合蛋白在CTx和msCT之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使msCT和CTx丧失生物活性，反而提高了其生物活性；并且在融合基因C-端添加Arg，可以去除C-末端酰胺化的基团。本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）内msCT-CTx融合蛋白的表达量也比单一的CTx或msCT在大肠杆菌中的表达量高。

本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）产生的融合蛋白在治疗骨质疏松和止痛方面的效果也超过单一的msCT或CTx，且该融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。

本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）所产融合蛋白二级结构的改变没有产生体内毒性，具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，所产融合蛋白具有分离纯化容易的特点。

采用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）发酵制备msCT-CTx融合蛋白具有生产成本低，生物活性高，免疫原性低，活性高，半衰期长的优点。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。

本实施方式msCT-CTx融合蛋白除有止痛效果外，也能用于治疗焦虑症、帕金森氏病、肌肉紧张和高血压等病症；具双重效应，一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制兴奋毒性神经递质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。

Claims

1.msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx），大肠杆菌BL21（DE3-msCT/CTx）按以下步骤制备：

一、将含有msCT-CTx融合蛋白基因的质粒载体pUC（msCT/CTx）用BamH I和EcoRⅠ双酶切，获得msCT-CTx融合蛋白的DNA片段；

二、用BamHI和EcoRⅠ双酶切质粒pGEX-6P-1；

其中，步骤一中msCT-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中质粒载体pUC（msCT/CTx）酶切反应体系为

3.根据权利要求1所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤三中质粒pGEX-6P-1酶切反应体系为

4.根据权利要求1所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤二中酶连接反应体系为

5.根据权利要求4所述的msCT-CTx融合蛋白转基因工程菌株，其特征在于步骤一中msCT-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。