CN102964452B

CN102964452B - 用于治骨质疏松症和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸

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Publication number: CN102964452B
Application number: CN201210533954.XA
Authority: CN
Inventors: 余琼
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN102964452A

Abstract

用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸，它涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。解决目前尚无同时有效治疗骨质疏松和肥胖药品的缺陷。用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该融合蛋白核酸的序列如SEQ ID NO：1所示。本发明可用于医药领域。

Description

用于治骨质疏松症和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。

背景技术

老年人骨质疏松发病率较高，全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。根据世界卫生组织（WHO）的标准，美国国家健康和营养调查（NHANES Ⅲ，1988~1994年）结果表明，骨质疏松严重影响老年人生活质量，50岁以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他们的一生中都会出现骨质疏松性骨折，一旦患者经历了第一次骨质疏松性骨折，继发性骨折的危险明显加大。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松症患者9000万，占总人口的7.1%。随着社会老龄化的进程，骨质疏松症的发病率呈上升趋势，预计到2050 年将增加到2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。有学者对1995~1996年美国骨质疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年发生数进行调查显示，每年发生骨质疏松性骨折150万次，其中椎体骨折70万次，腕部骨折20万次，髋部骨折30万次，其它骨折30万次。

肥胖与骨量关系临床观察表明，肥胖与骨密度(BMD)提高有关。肥胖是骨量的保护因素，超重和肥胖的妇女绝经后较同龄非超重妇女骨量高且骨丢失较慢。体重下降是绝经早期骨丢失的危险因素，提高体重指数可减缓绝经后骨丢失。但肥胖也常常引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。

发明内容

本发明既要降低肥胖者的体重，使之远离高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎等风险；同时又增加其骨量，避免骨质疏松的发生，而提供的一种用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白及编码该融合蛋白的核酸。

本发明用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明上述用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明msCT-rhLeptin融合蛋白采用人为改造的Leptin和鲑鱼降钙素基因编码翻译而成。具有降低使用者体重，并防治骨质疏松的效果。

本发明用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白微生物制剂，不产生拮抗反应，使用安全。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，该核酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白的核酸的质粒载体pUC（msCT/Obese’）。将pUC（msCT/Obese’）载体用BamH I和EcoRⅠ双酶切出来（酶切反应体系如表1所示），并用BamHI和EcoRⅠ双酶切pGEX-6P-1（酶切反应体系如表2所示）；再将本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的DAN片段（msCT/Obese’）与经过双酶切的载体pGEX-6P-1的连接（连接反应体系如表3所示）。

表1

pUC（msCT/Obese’） 20 μl
	10×M buffer 6μl
BamHI 3μl
	EcoRⅠ 3μl
不含DNA酶的ddH2O 28μl

表2

载体pGEX-6P-1 20 μl
	10×M buffer 6μl
BamHI 3μl
	EcoRⅠ 3μl
不含DNA酶的ddH2O 28μl

表3

双酶切的载体pGEX-6P-1 3 μl
	融合蛋白的DNA片段 13μl
10×T4 DNA连接酶 buffer 2μl
	T4 DNA连接酶 2μl

融合蛋白的DAN片段与载体pGEX-6P-1 16℃放置连接过夜，得到载体pGEX-msCT/Obese’；然后将载体pGEX-msCT/Obese’转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，选择阳性重组子命名为大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）。

载体pGEX-6P-1上不含有KpnⅠ酶切位点，本实施方式合成的pGEX-msCT/Obese’均能为KpnⅠ单酶切开，说明本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白基因成功导入质粒pGEX-6P-1中。

随机挑取大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）菌落37℃过夜培养，提取质DNA，用KpnⅠ进行单酶切，并用相应的空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序。测序工作委托生物公司进行，大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）内含有SEQ ID NO：1所示DNA。

将大肠杆菌BL21（DE3-msCT/Obese’）置于LB培养基30℃环境条件下培养18h，然后采用GST标签融合蛋白法进行蛋白的分离纯化，本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白的表达量为39%。

本实施方式融合蛋白（msCT-rhLeptin融合蛋白）治疗骨质疏松实验：

取雌性SD大鼠，无菌条件下摘除双侧卵巢，其中阴性对照组切除双侧一小块脂肪。5天后取存活健康大鼠48只，随机分为6组，每组8只，分别口服以下药物：

模型组：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

阴性对照组：质量浓度为0.5% 的CMC-Na溶液，灌胃剂量为5ml/kg；

实验组：质量浓度为0.5%的msCT-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg；（获得的用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白用无菌水溶液溶解）

阳性对照组1：阿仑膦酸钠(Alen)5mg/kg。

阳性对照组2：质量浓度为0.5%的msCT蛋白溶液，灌胃剂量为5ml/kg。

阳性对照组3：质量浓度为0.5%的rhLeptin溶液，灌胃剂量为5ml/kg。

连续给药三个月，处死后各取大鼠股骨头，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其一片，经清洗，10%次氯酸钠浸泡6h，超声清洗15min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，干燥，离子溅射镀膜，SX-40扫描电镜观察，加速电压20kV。

观察骨质疏松治疗对比实验结果，实验结果见表4，结果表明阳性对照组1、阳性对照组2、阳性对照组3和实验组都具有治疗骨质疏松的作用，且实验组的效果最好。

表4　骨小梁宽度的比较和骨面积（X±SD）

组别	n	给药剂量	骨小梁宽度X±SD	骨小梁面积X±SD
					模型组	8	5ml/kg	50.41±13.9	0.3558±0.070
阴性对照组	8	5ml/kg	114.36±13.6	0.6383±0.0340
					阳性对照组1	8	5mg/kg	111.36±14.8	0.6591±0.0432
阳性对照组2	8	5ml/kg	118.47±13.2	0.6884±0.0479
					阳性对照组3	8	5ml/kg	54.35±17.26	0.5783±0.0415
实验组	8	5ml/kg	126.68±15.9	0.7334±0.0419

本实施方式融合蛋白（msCT-rhLeptin融合蛋白）体重调节实验：

将雌性ob/ob小鼠40只，以10只为一组，共分为4组。分别注射媒介物（0.7%生理盐水）、rhLeptin、sCT-rhLeptin融合蛋白和L-肉碱，每天1mg、持续28天，每天记录小鼠的体重，实验结果如表5所示。本实施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。

表5

	0.7%生理盐水	rhLeptin	sCT-rhLeptin融合蛋白	L-肉碱
					原始体重（g）	57.6±0.6	59.7±0.8	60.4±0.7	57.8±0.8
28d后体重（g）	56.6±0.5	51.2±0.8	51.3±0.8	50.8±0.7
					体重改变（g）	-0.1	-8.5	-9.1	-7.0
P<d		0.01	0.01	0.01

本实施方式融合蛋白（msCT-rhLeptin融合蛋白）毒性实验：

哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量50ug/kg）。实验组注射总剂量 1mg/kg，一次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。

给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养14天和30天，小鼠均未出现死亡。

msCT-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3000r/min，离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶(ALT) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表6所示。

表6

msCT-rhLeptin融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、坏死等。主要脏器的病理观察结果如表7所示。

表7

组别

天数

心

肝

脾

肺

肾

对照组

14

3.59±0.63

32.11±2.37

4.46±0.90

2.71±0.92

7.72±0.93

实验组

14

3.48±0.89

30.61±3.21

4.68±0.73

2.92±0.79

7.71±0.88

对照组

30

3.61±0.67

32.12±2.22

4.59±0.88

2.92±0.63

7.85±0.78

实验组

30

3.53±0.88

30.66±3.18

4.48±0.61

2.95±0.58

7.84±0.81

实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓均无水肿、变性、坏死等异常改变。

本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异无显著性。均说明msCT-rhLeptin融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明msCT-rhLeptin融合蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明msCT-rhLeptin融合蛋白较好的生物相容性，对小鼠无明显急性毒性、长期毒性。

本实施方式对天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）进行了改造，改造后的msCT［Gly⁸，Ala¹⁶，del-Tyr²²］（sCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸，第16位的亮氨酸用丙氨酸置换，删除第22位的酪氨酸），改造后的msCT的生物活性可达8600IU/mg。

Leptin是obese基因编码的表达产物，由白色脂肪细胞和胎盘产生的由167个氨基酸组成的分泌蛋白，此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号，其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因由105个碱基组成，编码35个氨基酸的rhLeptin（RecombinantHuman Leptin，人重组瘦素）。

本实施方式融合蛋白在msCT和rhLeptin之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅没有使msCT和rhLeptin丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施方式在融合基因C-端添加Arg，可以去除C-末端酰胺化的基团。本实施方式融合蛋白在大肠杆菌内的表达量也比单一的msCT和rhLeptin表达量高。

本实施方式融合蛋白在治疗骨质疏松和肥胖方面的效果也超过单一的msCT或Leptin。本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首过效应。

二级结构的改变没有产生体内毒性，本实施方式融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化，本实施方式融合蛋白具有分离纯化容易的特点。

采用基因工程方法生产发酵制备msCT-rhLeptin融合蛋白具有生产成本低，生物活性高，免疫原性低，活性高，半衰期长的优点。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。

具体实施方式二：本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序列由生物工程公司合成。

本实施方式用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸序中改变了天然鲑鱼降钙素（salmon calcitonin，sCT）的基因和瘦素（Leptin）的基因，而且在msCT和Obese’之间插入KpnⅠ酶切位点，既可以提高所编码融合蛋白的稳定性，同时也改变融合蛋白的二级结构，使其生物性能提高。

本实施方式在融合蛋白基因两侧分别加上BamHI和EcoRⅠ酶切位点，而且根据大肠杆菌偏爱密码子的特点，重新设计了融合基因编码碱基序列。

Claims

1.用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白，其特征在于用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

2.编码权利要求1用于治骨质疏松和肥胖的msCT-rhLeptin融合蛋白的核酸，其特征在于该核酸的序列如SEQ ID NO：1所示。