CN115916222A - 用于增强自体脂肪移植物的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于自体脂肪组织移植的组合物和方法。在一个实施方式中，所述组合物包含重组的部分有序多肽(Fractomer)或“Fractomer”和来自于受试者的脂肪组织。在一种情况下，所述Fractomer具有通用结构[(GXGVP)n‑α‑螺旋]m，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且α‑螺旋是具有约5至50个丙氨酸残基的任何基于聚丙氨酸的α‑螺旋。在另一种情况下，所述Fractomer具有结构[(GXGVP)n‑GX1(A)25X1]m，其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数。

Description

用于增强自体脂肪移植物的组合物和方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月5日提交的美国临时专利申请号63/035,173的优先权，所述临时申请整体通过参考并入本文。
联邦资助的研究
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号为1R41CA244110-01A1的政府支持下做出。美国政府在本发明中具有一定权利。
对序列表的参考
根据37C.F.R.§1.821(c)，本申请与计算机可读形式的序列表一起提交。通过EFS提交的文本文件“028193-9366-WO01_sequence_listing_2-JUN-2021_ST25.txt”于2021年6月2日生成，含有23个序列，文件大小为37.4千字节，并整体通过参考并入本文。
技术领域
本文描述了用于自体脂肪组织移植的组合物和方法。在一个实施方式中，所述组合物包含重组的部分有序多肽(Fractomer)或“Fractomer”和来自于受试者的脂肪组织。在一种情况下，所述Fractomer具有通用结构[(GXGVP)n-α-螺旋]m，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且α-螺旋是具有约5至50个丙氨酸残基的任何基于聚丙氨酸的α-螺旋。在另一种情况下，所述Fractomer具有结构[(GXGVP)n-GX1(A)25X1]m，其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数。
背景技术
在每年接近6百万经历再造整形外科手术的美国人中，自体脂肪移植是治疗轮廓不规则和体积缺陷的一个有价值的选项。尽管由于其持久性和先天的生物相容性而是优选的，但脂肪移植物、特别是例如在乳腺切除术后患者中使用的大体积移植物，由于收获的组织的可用体积不足而通常需要多次手术。因此，对与组织移植物相关的新的创新存在着需求。
发明内容
本文描述的一个实施方式是一种组织基质组合物，其包含：重组的部分有序多肽(Fractomer)；和脂肪组织。在一种情况下，所述Fractomer包含：多个无序结构域和多个结构化结构域。在另一种情况下，所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且n是大于或等于1的整数；并且所述结构化结构域包含聚丙氨酸结构域。在另一种情况下，所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中X是Val(SEQ ID NO：3)或Ala(SEQ ID NO：4)或Ala和Val的混合物，并且其中n是1至50的整数。在另一种情况下，X是Ala和Val的比例为10:1至1:10(Ala:Val)的交替迭代。在另一种情况下，X是Ala和Val的比例为1:1(SEQ ID NO：5)或1:4(SEQIDNO：6)的交替迭代。在另一种情况下，所述聚丙氨酸结构域包含(Ala)m，其中m是5至50的整数。在另一种情况下，所述聚丙氨酸结构域包含下述一者或多者：(A)25(SEQ ID NO：7)；K(A)25K(SEQ ID NO：8)；D(A)25K(SEQ ID NO：9)；GD(A25)K(SEQ ID NO：10)；或GK(A25)K(SEQID NO：11)。在另一种情况下，所述多肽包含：[(GXGVP)n-GX1(A)25X1]m，其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数([(SEQ ID NO：2)n-(SEQ ID NO：10或11)]m)。在另一种情况下，所述多肽包含下述一者或多者：M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；M[(GVGVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：13)；M[(GVGVP)15-GK(A25)K]6-GWP(SEQ IDNO：14)；M[(GVGVP)15-GK(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：15)；M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：16)；M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：17)；M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)；或M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：19)。在另一种情况下，所述多肽包含下述一者或多者：M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；或M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)。在另一种情况下，所述Fractomer具有加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)。在另一种情况下，所述冷却转变温度(Tt-冷却)是浓度不依赖性的。在另一种情况下，所述加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)在约10℃至约45℃的范围内。在另一种情况下，所述Fractomer在高于所述Tt-加热下形成固体聚集体。在另一种情况下，所述固体聚集体在被冷却至低于所述Tt-冷却时再溶解。在另一种情况下，所述固体聚集体是稳定的三维基质。在另一种情况下，所述固体聚集体包含多个微孔。在另一种情况下，所述多个微孔的尺寸在约1μm至约150μm的范围内。条款1的组合物，其中所述组合物包含约200μM至约2mM之间的Fractomer。在另一种情况下，所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。在另一种情况下，所述组合物包含以体积计约10％至约90％范围内的脂肪组织抽吸物。在另一种情况下，所述组合物包含以体积计约25％至约75％范围内的脂肪组织抽吸物。在另一种情况下，所述组合物包含约50体积％的脂肪组织抽吸物。在另一种情况下，所述组合物包含比例在约1:9至约9:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。在另一种情况下，所述组合物包含比例在约1:3至约3:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。在另一种情况下，所述组合物包含比例为约1:1的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。在另一种情况下，所述组合物是可成形液体或半固体。在另一种情况下，所述组合物是可注射或可植入的。在另一种情况下，所述组合物可成形或可模制成2维或3维形状、面积或体积。在另一种情况下，所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
本文描述的另一个实施方式是一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：向所述受试者给药治疗有效量的本文所描述的组合物，所述组合物包含：重组的部分有序多肽(Fractomer)；和脂肪组织，以便在所述受试者中增强自体脂肪移植物。
本文描述的另一个实施方式是一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：向所述受试者共同给药治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织。在一种情况下，所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。在另一种情况下，所述Fractomer和脂肪组织被同时或顺序给药。在另一种情况下，所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，并且所述Fractomer在所述脂肪组织给药之前给药。在另一种情况下，所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，其中所述脂肪组织在所述Fractomer给药之前给药。在另一种情况下，将所述Fractomer和脂肪组织在体外合并，成形或模制成2维或3维形状、面积或体积，并原位植入到所述受试者中。在另一种情况下，所述Fractomer和脂肪组织在给药之前是可成形液体、半固体或模制半固体，并且在给药后形成固体聚集体。在另一种情况下，将所述Fractomer和脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下共同给药到受试者，并且所述Fractomer和脂肪组织在暴露到所述受试者的体温后形成固体。在另一种情况下，所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
本文描述的另一个实施方式是一种制备自体脂肪移植组合物的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得脂肪组织；和(b)将重组的部分有序多肽(Fractomer)与步骤(a)的脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下合并，以形成混合物。在另一种情况下，所述方法还包括：(c)将所述混合物成形成形状、面积或体积。在另一种情况下，所述方法还包括：(d)通过注射或植入将所述混合物共同给药到所述受试者。在一种情况下，所述混合物在高于所述Fractomer的Tt-加热的温度下形成固体聚集体。
本文描述的另一个实施方式是一种试剂盒，其包含重组的部分有序多肽(Fractomer)，以及用于合并的容器、用于特定体积维度的模具或用于脂肪组织抽吸和/或给药的工具中的一者或多者。
本文描述的另一个实施方式是治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织用于在有需要的受试者中进行自体脂肪移植的用途。
附图说明
所述专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的副本将在提出要求并付出必要费用后由专利局提供。
图1示出了所提出的将重组的部分有序肽或“Fractomer”(基质)与收获的脂肪(脂肪组织抽吸物)合并以用于重新注射的方法。将收获的脂肪组织抽吸物与Fractomer溶液合并并混合，并将所述混合物注射到受试者的缺陷区域中。体温启动Fractomer支架的形成并截留脂肪组织抽吸物，以使移植物稳定。
图2示出了脂肪与脂肪组织抽吸物相比的结构差异的实例。在抽脂和加工后，脂肪失去其固体样特性，并且不具有机械完整性以维持形状或体积。
图3A–B示出了Fractomer(SEQ ID NO：12)是热响应性的，并且在加热时形成多孔网络。图3A示出了在可调的阈值温度下(例如20℃至37℃之间)，Fractomer经历相分离成为多孔固体网络(左图和中图)。三维重建共聚焦图像揭示出当Fractomer被加热时呈现出复杂的弹性蛋白样网络(右图)。图3B示出了向Fractomer溶液以5质量％添加绿色荧光蛋白(GFP)，表明孔隙度允许与传统的(例如透明质酸)水凝胶相比更大的营养物流动。
图4A–B示出了储存对Fractomer(SEQ ID NO：12)转变温度和蛋白质降解的影响。图4A示出了在冻干并在-20℃下储存1、2、5和6个月后重悬浮的Fractomer的光密度(OD)测量值。在任何时间点均未观察到Fractomer转变温度的变化。图4B示出了在冻干并在-20℃下储存1、5和6个月后重悬浮的Fractomer的SDS-PAGE分析。在任何时间点均未观察到Fractomer蛋白质水平的变化或降解的迹象。
图5A–C显示Fractomer可以包封健康的脂肪细胞并改善形状和突出。图5A示出了单独的脂肪组织抽吸物(上图)、50体积％的脂肪组织抽吸物：Fractomer溶液(SEQ ID NO：12)(250μM)(中图)和50体积％的脂肪组织抽吸物：Fractomer溶液(SEQ ID NO：12)(750μM)(下图)的混合物的共聚焦显微镜分析。以1:1的比例与不同Fractomer浓度(低＝250μM，高＝750μM)混合并用LipidTOX(红色，也染色Fractomer)和DAPI(蓝色)染色的脂肪组织抽吸物表明在各个脂肪细胞周围存在Fractomer，其将大面积的脂肪细胞保持在一起。图5B示出了单独的脂肪的组织学H&E染色分析，图5C示出了与Fractomer(SEQ ID NO：18)(250μM)混合的脂肪组织抽吸物的组织学H&E染色分析。在图5C中可以看出Fractomer散布在更密集的脂肪细胞的区域之间。
图6A–D示出了使用单独的Fractomer和脂肪+Fractomer产生3D模具的示例性方法和分析。图6A示出了将脂肪：Fractomer(SEQ ID NO：12)的混合物注入到3D打印的模具中并置于37℃下以允许Fractomer聚集的图示。图6B示出了单独的Fractomer(SEQ ID NO：12)在低(500μM，左图)、中(750μM，中图)和高(2mM，右图)浓度下的示例性模制形状，并表明随着Fractomer浓度的提高形状保持提高。图6C示出了脂肪(人类脂肪组织抽吸物)+Fractomer溶液(SEQ ID NO：12)混合物的离体模具。不同比例的脂肪组织抽吸物与Fractomer溶液(750μM)的混合物证实了Fractomer：脂肪组织抽吸物比率的提高与单独的脂肪相比相当大地提高了模具的形状和突出维持。图6D示出了被注入到3D打印的模具中并置于37℃下以允许Fractomer聚集的单独的猪脂肪与猪脂肪+Fractomer溶液(SEQ ID NO：18)的混合物之间的比较。发现与单独的猪脂肪相比，猪脂肪组织抽吸物与Fractomer的混合物在从模具释放后形状保留提高。
图7示出了可以在注射时控制Fractomer的形状。将红外标记的Fractomer(SEQ IDNO：12)以3种不同形状模式注射到小鼠的后胁中：球形(左列)，散点(中列)和细长杆(右列)。在注射后1个月(上图)和4个月(下图)时的IVIS光谱成像表明所有3种注射形状模式均保持形状。
图8A–C显示了Fractomer(SEQ ID NO：12)蛋白的稳定性和降解可以用浓度控制。图8A示出了对于不同的Fractomer溶液浓度(低＝250μM，中＝750μM，高＝1500μM)来说，在BL/6小鼠中注射后6个月时标记的Fractomer的归一化荧光强度。图8B示出了用不同Fractomer浓度的制剂(低＝250μM，中＝750μM，高＝1500μM)注射的BL/6小鼠在6个月过程中的示例性荧光光谱图像。发现具有高Fractomer浓度的制剂的注射直至6个月的时间点保持在原位(下排图)。图8C示出了注射后的长期Fractomer吸收曲线。对于低(250μM)、中(750μM)和高(1500μM)浓度的Fractomer注射来说，测量归一化的荧光强度(左轴)和体积(右轴)。具有低Fractomer浓度的制剂的注射似乎在几个月后被完全吸收，而具有中和高Fractomer浓度的制剂的注射显示出荧光和体积两者的长期保持。
图9A–F显示了Fractomer(SEQ ID NO：12)提高脂肪体积保留。图9A示出了在实验组中用于注射到nu/nu小鼠中的示例性脂肪：Fractomer溶液(250μM)比例的图示。图9B示出了在注射到nu/nu小鼠中后，脂肪：Fractomer比例对体积保留时间的影响。1周时间内的体积分布显示，使用Fractomer时体积保留率提高。图9C示出了在每种脂肪：Fractomer溶液(基质)混合物比例下，1周时的体积分布的快照。图9D示出了不同脂肪：Fractomer混合物在注射后6周时的归一化体积。在不包含稳定化Fractomer基质的情况下使用减少的脂肪量(50体积％的脂肪)时，体积保留率显著降低。图9E示出了单独的脂肪和50体积％的脂肪+Fractomer溶液(750μM)注射在3个月时间段内的体积保留率。发现在这个较长时间段内Fractomer提高脂肪体积保留率。图9F示出了在单独的脂肪注射和脂肪+Fractomer(750μM)注射之间移植的脂肪的有效体积。以每mL注射的脂肪计，发现较高浓度的Fractomer制剂(750μM)使单独的脂肪移植物的有效体积提高到三倍。
图10A–C显示了与单独脂肪制成的移植物相比，在与Fractomer(SEQ ID NO：12)一起制成的脂肪移植物中血管供应高。图10A示出了单独的脂肪移植物(上图)与比例为1:1的脂肪：Fractomer溶液(250μM)移植物(下图)相比的组织学分析，并表明Fractomer的持续存在和血管(CD31+)区段(小箭头)在脂肪细胞团之间的支持性Fractomer区段中的高普遍性。图10B示出了在单独的脂肪与1:1脂肪：Fractomer溶液(250μM)混合物之间注射后1个月时的脂肪分布的组织学比较。在两个不同移植物组之间没有观察到细胞组成的差异，尽管在脂肪+Fractomer实验组中使用少50体积％的脂肪。图10C示出了脂肪组织抽吸物和Fractomer溶液(250μM)的1:1混合物在30天时的放大照片。实线箭头指向残余Fractomer的证据，虚线箭头指向移植物内新形成的血管供应。
图11A–B显示了在用单独的脂肪注射的小鼠中囊肿形成，而在用脂肪+Fractomer(SEQ ID NO：12)混合物注射的小鼠中没有观察到囊肿形成。图11A示出了在用单独的脂肪注射的小鼠中在3个月时间段内的囊肿形成。在3个月内捕获包含单独的脂肪或脂肪组织抽吸物和Fractomer溶液(750μM)的1:1混合物的移植物的超声波。箭头指向在单独脂肪组中大的油囊肿的发生(顶行，中间右侧和最右侧图)。超过50％的用单独脂肪注射的小鼠发生囊肿，而0％的用脂肪+Fractomer的混合物注射的小鼠形成囊肿。图11B示出了在注射后3个月，小鼠中来自于单独的脂肪和1:1脂肪：Fractomer溶液(750μM)移植物的细胞组成的组织学比较。单独脂肪组显示出囊肿形成的明显迹象，而在脂肪：Fractomer组中没有观察到囊肿形成。可以看到Fractomer支持脂肪细胞。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，本文中描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相结合使用的任何术语和所述领域的技术在本领域中是公知且常用的。在有冲突的情况下，以包括定义在内的本公开为准。下文描述了示例性方法和材料，尽管与本文中描述的相似或等同的方法和材料可用于本文中描述的实施方式和方面的实践和测试。
当在本文中使用时，术语“氨基酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”、“载体”、“多肽”和“蛋白质”具有本领域普通技术的生化学家将会理解的它们的常用含义。在本文中使用标准的单字母核苷酸(A、C、G、T、U)和标准的单字母氨基酸(A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y)。
当在本文中使用时，诸如“包括”、“含有”、“具有”等的术语意味着“包含”。本公开还设想了“包含”本文中呈现的实施方式或要素、“由它们组成”和“基本上由它们组成”的其他实施方式，不论是否明确阐述。
当在本文中使用时，在本公开的情形中(特别是在权利要求书的情形中)使用的没有具体数目的指称应该被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文中另有指明或明显与上下文矛盾。此外，除非另有指明，否则没有具体数目的指称意味着“一个或多个”。
当在本文中使用时，术语“或”可以是连词或反意连词。
当在本文中使用时，术语“基本上”意味着极大或显著程度，但不完全。
当在本文中使用时，术语“约”或“大约”在应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所陈述的参比值相近或在所述特定值的可接受的误差范围内的值，所述可接受的误差范围由本领域普通技术人员确定，并且部分依赖于所述值如何测量或确定，例如测量系统的限制。在一种情况下，术语“约”是指在被术语“约”修饰的值的至多±10％的变动范围内的任何值，包括整数和分数分量两者。或者，根据本领域中的做法，“约”可以意味着在3个或更多个标准偏差以内。或者，例如对于生物系统或过程来说，术语“约”可以意味着在值的一个数量级以内，在某些实施方式中在5倍以内，在某些实施方式中在2倍以内。当在本文中使用时，符号“～”意味着“约”或“大约”。
本文公开的所有范围包括作为离散值的两个端点以及所述范围内指定的所有整数和分数。例如，0.1–2.0的范围包括0.1、0.2、0.3、0.4……2.0。如果端点被术语“约”修饰，则指定的范围将被扩大至所述范围内的任何值、包括端点的至多±10％的变动或3个或更多个标准偏差以内。
当在本文中使用时，术语“活性成分”或“活性药物成分”是指提供药理、通常是有益效果的药剂、活性成分、化合物或物质、组合物或其混合物。
当在本文中使用时，术语“对照”或“参比”在本文中可互换使用。“参比”或“对照”水平可以是预定值或范围，其被用作基线或基准，针对它们来评估实测结果。“对照”也指对照实验或对照细胞。
当在本文中使用时，术语“药剂”表示包括细胞在内的任何形式的活性成分制剂或组合物，其含有通过至少一次或多次给药足以启动或产生治疗效果的量。“制剂”和“组合物”在本文中可互换使用。
当在本文中使用时，术语“预防”是指以统计显著的程度或本领域普通技术人员可检测的程度阻止或减少障碍的进展。
当在本文中使用时，术语“有效量”或“治疗有效量”是指将要给药到受试者的药剂、组合物或细胞的基本上无毒性，但足以预防、治疗或在某种程度上改善正经历或受试者易于患上的疾病或病症的一种或多种症状的量。结果可以是疾病的征兆、症状或病因的减少或减轻或生物系统的任何其他所需变化。有效量可以基于每位受试者个体的因素，包括但不限于受试者的年龄、体型、疾病类型或程度、疾病阶段、给药途径、使用的补充疗法的类型或程度、正在进行的疾病过程和所需治疗的类型。
当在本文中使用时，术语“受试者”是指动物。通常，所述受试者是哺乳动物。受试者也指灵长动物(例如人类，男性或女性，婴儿、青少年或成人)、非人类灵长动物、大鼠、小鼠、兔、猪、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、鱼、鸟等。在一个实施方式中，所述受试者是灵长动物。在一个实施方式中，所述受试者是人类。
当在本文中使用时，如果受试者将在生物学、医学或生命质量上从治疗获益，则此类受试者是“需要此类治疗的”。需要治疗的受试者不必定表现出症状，特别是在预防性治疗的情况下。
当在本文中使用时，“治疗”、“疗法”和/或“治疗方案”是指对患者表现出的或患者可能易感的疾病、障碍或生理状况做出响应而进行的临床干预。治疗的目的包括缓解或预防症状，减缓或停止疾病、障碍或病症的进展或或恶化，和/或缓解疾病、障碍或病症。在某些实施方式中，所述疾病、障碍或病症需要增强自体脂肪移植物。适合的治疗/病症包括但不限于根治术、乳腺切除术后和乳房肿瘤切除术后乳房重建、美容增强、面部重建/植入术、鼻整形术以及需要使用自体脂肪转移的其他治疗例如脚掌脂肪垫萎缩、手部重建、Parry-Romberg综合征和颅面创伤等。
当在本文中使用时，术语“抑制”是指给定生物过程、病症、症状、障碍或疾病的减轻或抑制或生物活性或过程的基线活性的显著降低。
当在本文中使用时，“治疗”是预防，阻止、抑制、阻遏、逆转、减轻、改善或抑制包括障碍或疾病在内的生物过程的进展，或完全消除疾病。治疗可以以急性或慢性方式进行。术语“治疗”也指在患病之前降低所述疾病或与这种疾病相关的症状的严重程度。“阻遏”或“改善”疾病、障碍或其症状涉及在此类疾病、障碍或其症状临床出现后向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。“预防”或“阻止”疾病、障碍或其症状涉及在所述疾病、障碍或其症状发作之前向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。“抑制”疾病或障碍涉及在诱导所述疾病或障碍之后但在其临床表象或症状显现之前向受试者给药本文描述的细胞、组合物或化合物。
当在本文中使用时，“氨基酸”是指天然存在的和非天然合成氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸。在本文中氨基酸可以用它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号指称。氨基酸包括侧链和多肽骨架部分。
术语“表达载体”是指本领域中已知的质粒、病毒或另一种媒介，用于编码所需蛋白质的核酸序列可以被插入或引入在其中。
术语“宿主细胞”是易于用核酸构建物或表达载体转化、转染、转导、接合的细胞。
宿主细胞可以源自于植物、细菌、酵母、真菌、昆虫、动物等。在某些实施方式中，所述宿主细胞包括大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
术语“对照”、“参比水平”和“参比”在本文中可互换使用。所述参比水平可以是预定值或范围，其被用作基准，针对它来评估实测结果。当在本文中使用时，“对照组”是指一组对照受试者。所述预定水平可以是来自于对照组的截止值。所述预定水平可以是来自于对照组的平均值。截止值(或预定截止值)可以通过适应性指数模型(AIM)方法来确定。截止值(或预定截止值)可以通过来自于患者组的生物样品的受试者工作曲线(ROC)分析来确定。正如生物学领域中公知的，ROC分析是确定测试区分一种病症与另一种病症的能力，例如确定每种标志物在鉴定CRC患者中的表现。或者，截止值可以患者组的生物样品的四分位数分析来确定。例如，截止值可以通过选择与第25百分位-75百分位范围内的任何值相对应的值，优选为与第25百分位、第50百分位或第75百分位、更优选为第75百分位相对应的值来确定。此类统计分析可以使用本领域中已知的任何方法来进行，并且可以通过任何可商购的软件包来实施。靶或蛋白质活性的健康或正常水平或范围可以根据标准做法来定义。
对照可以是不含重组的部分有序多肽(Fractomer)的药剂或细胞。对照可以是偶联有或包封有不同于本文中详述的Fractomer的多肽或聚合物的分子或包含所述分子的样品。对照可以是疾病状态已知的受试者或从其获得的样品。所述受试者或从其获得的样品可以是健康的、患病的、治疗前患病的、治疗期间患病的或治疗后患病的或其组合。对照可以包括例如单独的药剂或细胞或其本身。
当在本文中使用时，“多核苷酸”可以是单链或双链的，或者可以含有双链和单链序列两者的部分。多核苷酸可以是天然或合成的核酸、DNA、基因组DNA、cDNA、RNA或杂交体，其中所述多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
“肽”或“多肽”是通过肽键相连的两个或更多个氨基酸的连接序列。多肽可以是天然的、合成的或修饰的或天然和合成的组合。肽和多肽包括蛋白质例如结合蛋白、受体和抗体。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常被称为结构域，例如酶结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和胞质尾结构域。“结构域”是多肽的形成多肽的紧凑单元的部分，并且通常为15至350个氨基酸长。示例性结构域包括具有酶活性或配体结合活性的结构域。典型的结构域由组织化较低的区段例如β-片层和α-螺旋的区段组成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立的三级单元的非共价缔合形成的三维结构。“基序”是多肽序列的部分并包括至少两个氨基酸。基序可以是2至20、2至15或2至10个氨基酸长，在某些实施方式中，基序包括3、4、5、6或7个连续氨基酸。结构域可以包含一系列可能相同或不同的基序。
“重组的”当用于指称例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，是指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的改变进行修饰，或所述细胞源自于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在所述细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因，或表达原本异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。
当在本文中使用时，“样品”或“测试样品”可以意味着将要在其中检测或确定靶的存在和/或水平的任何样品，或包含本文所描述的药剂、细胞或Fractomer的任何样品。样品可以包括液体、溶液、乳液或悬液。样品可以包括医学样品。样品可以包括任何生物流体或组织，例如血液、全血、血液级分例如血浆和血清、肌肉、间隙液、汗液、唾液、尿液、眼泪、滑液、骨髓、脑脊液、鼻分泌物、痰液、羊水、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、呕吐物、粪便物质、肺组织、外周血单核细胞、总白细胞、淋巴结细胞、脾细胞、扁桃体细胞、癌细胞、肿瘤细胞、胆汁、消化液、皮肤或其组合。在某些实施方式中，样品包含等分试样。在其他实施方式中，样品包含生物流体。样品可通过本领域已知的任何手段获得。样品可以以从患者获得的原样直接使用，或者可以例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的灭活、添加试剂等进行预处理，以本文中讨论或原本在本领域中已知的某种方式改变所述样品的特性。
“基本上同一的”可以意味着第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100个氨基酸的区域内具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
当在本文中针对多核苷酸使用时，“变体”意味着(i)所指称核苷酸序列的一部分或片段；(ii)所指称核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与所指称多核苷酸或其互补体基本上同一的多核苷酸；或(iv)在严紧条件下与所指称多核苷酸、其互补体或与其基本上同一的序列杂交的多核苷酸。
“变体”可以被进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守替换而在氨基酸序列方面不同，但保留了至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体或多肽结合或促进免疫应答的能力。变体可以意味着基本上同一的序列。变体可以意味着其功能性片段。变体也可以意味着多肽的多个拷贝。所述多个拷贝可以是串联的或者被连接物隔开。变体也可以意味着具有与所指称多肽的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列并保留至少一种生物活性的多肽。氨基酸的保守替换，即将氨基酸用性质(例如亲水性程度或带电荷区的分布)相似的不同氨基酸代替，在本领域中被认为通常涉及次要变化。这些次要变化可以通过考虑氨基酸的亲水指数来部分鉴定。参见Kyte等，J.Mol,Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知，具有相近亲水指数的氨基酸可以被替换，并且仍然保留蛋白质功能。在一种情况下，具有±2的亲水指数的氨基酸被替换。氨基酸的疏水性也可用于揭示将导致多肽保留生物功能的替换。在多肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该多肽的最大局部平均亲水性，正如在完全通过参考并入本文的美国专利号4554101中所讨论的，这是一种已报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用度量。正如在本领域中理解的，具有相近亲水性值的氨基酸的替换可导致多肽保留生物活性，例如免疫原性。可以用亲水性值在彼此的±2范围内的氨基酸进行替换。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受到该氨基酸的特定侧链的影响。与该观察相一致，与生物功能相容的氨基酸替换被理解为取决于氨基酸的相对相似性，特别是那些氨基酸的侧链，正如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他性质所揭示的。
变体可以是在完整基因序列的全长或其片段内基本上同一的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以在所述基因序列的全长或其片段内具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、88％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。变体可以是在氨基酸序列的全长或其片段内基本上同一的氨基酸序列。所述氨基酸序列可以在所述氨基酸序列的全长或其片段内具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、88％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
当在本文中使用时，“增强的”是指改善自体脂肪组织或脂肪移植物的体积、形状、存活率、改进的血液供应和坏死的减少。在一种情况下，自体脂肪组织或脂肪移植物通过脂肪组织和Fractomer的组合来增强，这导致脂肪移植物的长期维持和存活率的增强，包括脂肪移植物的体积和形状的保留、改善的血管化、增强的存活率和坏死的减少。
当在本文中使用时，“同时给药”是指将Fractomer和脂肪组织或脂肪组织抽吸物的组合在低于Fractomer的Tt-加热点的温度下混合，将所述组合给药到受试者，然后在从所述受试者的体温加热到高于Fractomer的Tt-加热点后，所述Fractomer在原位包围并包封所述脂肪组织抽吸物。
当在本文中使用时，“共同给药”是指Fractomer和脂肪组织或脂肪组织抽吸物的给药。所述共同给药可以是“同时给药”(正如本文中描述的，在给药之前将所述Fractomer与脂肪组织组合)或“顺序给药”。当在本文中使用时，“顺序给药”是指将所述Fractomer或脂肪组织中的任一者首先给药，然后相应地给药所述脂肪组织或Fractomer中的另一者的给药。在顺序给药中，所述Fractomer和脂肪组织的组合在给药后原位发生。
当在本文中使用时，“可成形”是指Fractomer和脂肪组织组合物被成形或模制成各种不同的二维或三维形状、面积或体积的能力和在长时间段内维持这种形状、面积或体积的能力。具体的示例性形状或体积包括乳房、臀部、手部、膝盖和放置在皮肤或皮肤移植物下的二维层或受试者的身体中存在的其他不规则或不定形状或体积。
组合物
本文描述的一个实施方式是一种用于增强自体脂肪移植物的可注射组织基质组合物，所述组合物包含重组的部分有序多肽或“Fractomer”和脂肪组织、由它们组成或基本上由它们组成。在某些实施方式中，所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。在一个实施方式中，所述组合物包含约10–90体积％的脂肪组织抽吸物，包括所述指定范围内的所有整数。在另一个实施方式中，所述组合物包含约25–90体积％的脂肪组织抽吸物，包括所述指定范围内的所有整数。在某些实施方式中，所述组合物包含至少25体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少35体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少45体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少50体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少60体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少70体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少80体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少90体积％的脂肪组织抽吸物。将脂肪或脂肪组织抽吸物的体积与特定浓度的Fractomer溶液合并，以提供本文中描述的各种不同的脂肪：Fractomer比例。例如，将900μL脂肪或脂肪组织抽吸物与100μL Fractomer溶液合并会是9:1的体积比或90体积％的脂肪。
当在本文中使用时，术语“Fractomer“是指被设计以模拟天然弹性蛋白的一类重组人造蛋白质，它们是热响应性的，允许它们作为液体注射，但在体温下迅速形成多孔固体网络。示例性的Fractomer描述在整体通过参考并入本文的国际专利申请公布号WO2019006374 A1中。在某些实施方式中，所述Fractomer包含重组的部分有序多肽(POP)。每个POP可以包括多个无序结构域和多个结构化结构域。所述POP通过随温度改变溶解性和聚集体溶解/形成，可以表现出相变行为。
Fractomer由形成完美的α-螺旋并被周期性插入到非结构化弹性蛋白样多肽(ELP)中的寡聚丙氨酸(5至500个，但通常为A25)的结构化结构域组成，所述ELP由通常总共80–120个(GXGVP)n五肽基序的重复序列组成(～30–50kDa)(SEQ ID NO：1)，其中X是脯氨酸之外的任何标准氨基酸。在一种情况下，所述非结构化多肽或“无序结构域”是(GXGVP)n基序(SEQ ID NO：2)，其中X是Val(SEQ ID NO：3)或Ala(SEQ ID NO：4)或Ala和Val的混合物，并且其中n是1至50的整数。在一种情况下，X是Ala和Val的比例为10:1至1:10(Ala:Val)的交替迭代。在另一种情况下，X是Ala和Val的比例为1:1(SEQ ID NO：5)或1:4(SEQ ID NO：6)的交替迭代。Fractomer通过质粒携带的编码Fractomer的基因的过表达，在大肠埃希氏杆菌中重组合成。
Fractomer与传统的水凝胶相比具有几个优点。Fractomer在皮下注射后仅通过α-螺旋(Ala)25结构域之间的疏水性相互作用自发交联的能力是显著的。将弹性蛋白样多肽(ELP)或其他合成聚合物交联成水凝胶所需的大多数化学交联技术具有显著缺点。小分子交联剂通常可能是有毒的，并且难以控制注射的聚合物溶液在原位的化学或酶交联的动力学。此外，大多数水凝胶是无孔的，或者需要使用成孔剂或模板法来引入体内材料整合所需的孔隙度。这些材料随后必须被植入在所需部位处。尽管这些障碍可以被克服，但物理交联的简单性和在身体热量的简单作用下自发形成机械上稳定的多孔网络，是在脂肪移植中使用Fractomer与其他可注射材料相比前所未有的优势。
Fractomer的无序结构域和结构化结构域可以以任何可能的方式排布，在某些实施方式中，Fractomer的一个或多个无序结构域位于至少两个相邻的结构化结构域之间。在某些实施方式中，所述Fractomer包括多个串联重复的结构化结构域和多个串联重复的无序结构域，在某些实施方式中，所述多个串联重复的结构化结构域位于所述多个串联重复的无序结构域的C-端，在某些实施方式中，所述多个串联重复的结构化结构域位于所述多个串联重复的无序结构域的N-端。在某些实施方式中，所述Fractomer被排布成[无序结构域]q-[结构化结构域]r[无序结构域]s-[结构化结构域]t，其中q、r、s和t独立地是0至100，例如1至100、2至100、1至50或2至50的整数。在某些实施方式中，所述Fractomer被排布成[无序结构域]q-[结构化结构域]r，其中q和r独立地是1至100的整数。在某些实施方式中q、r、s和t独立地是0至10、0至20、0至30、0至40、0至50、0至60、0至70、0至80、0至90、0至100、1至10、1至20、1至30、1至40、1至150、1至60、1至70、1至80、1至90或1至100的整数。
所述Fractomer可以包括多个无序结构域。所述无序结构域可以包含当通过CD观察时具有极少或没有二级结构并具有相变行为的任何多肽。所述无序结构域可以包括重复氨基酸、不重复氨基酸或其组合的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述Fractomer的约20％至约99％例如约25％至约97％、约35％至约95％或约50％至约94％包含无序结构域。所述Fractomer的至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％可以包含无序结构域。
在某些实施方式中，所述无序结构域包含(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸，并且n是大于或等于1的整数。在某些实施方式中，m是1至500的整数。在某些实施方式中，m是至少、至多或恰好是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500。在某些实施方式中，m可以小于500、小于400、小于300、小于200或小于100。在某些实施方式中，m是1至500、1至400、1至300、1至200或60至180。在某些实施方式中，m是60、120或180。在某些实施方式中，X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。在某些实施方式中，X是Val或Ala或Ala和Val的交替迭代。在某些实施方式中，X是Val。在某些实施方式中，X是Ala。在某些实施方式中，X是Ala和Val的交替迭代。在某些实施方式中，X是Ala和Val的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1的交替迭代。在某些实施方式中，X是Ala和Val的比例为1:1或1:4的混合物。在某些实施方式中，X是Ala和Val的比例为10:1至1:10(Ala:Val)、例如5:1至1:5或1:1至1:4的交替迭代。
结构化结构域
所述Fractomer可以包括多个结构化结构域。所述结构化结构域当通过CD观察时可以具有二级结构，例如α-螺旋。所述结构化结构域可以包含至少一个聚脯氨酸结构域和聚丙氨酸结构域，在某些实施方式中，所述Fractomer包含交替的无序结构域和结构化结构域。在某些实施方式中，所述结构化结构域只包含聚丙氨酸结构域。在某些实施方式中，所述结构化结构域只包含聚脯氨酸结构域。
在某些实施方式中，所述Fractomer的约4％至约75％、例如约5％至约70％、约6％至约60％或约7％至约50％包含结构化结构域。所述Fractomer的至少约2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％可以包含结构化结构域。
在某些实施方式中，所述结构化结构域包含聚丙氨酸结构域。每个聚丙氨酸结构域可以包括至少5个丙氨酸残基。每个聚丙氨酸结构域可以具有至少约60％的采取α-螺旋构象的氨基酸。在一种情况下，所述结构化结构域包含聚丙氨酸结构域(Ala)m，其中m是5至500的整数。在另一种情况下，所述聚丙氨酸结构域包含下述一者或多者：(A)25(SEQ ID NO：7)；K(A)25K(SEQ ID NO：8)；D(A)25K(SEQ ID NO：9)；GD(A25)K(SEQ ID NO：10)；或GK(A25)K(SEQ ID NO：11)。
在一个实施方式中，所述Fractomer包含：多个无序结构域，每个无序结构域包含PG基序，其包含选自PG、P(X)nG(SEQ ID NO：20)和(B)mP(X)nG(Z)p(SEQ ID NO：21)或其组合的氨基酸序列，其中m、n和p独立地是1至15的整数，并且其中B、X和Z独立地是任何氨基酸；和多个结构化结构域，每个结构化结构域包含聚丙氨酸结构域，每个聚丙氨酸结构域包含至少5个丙氨酸残基，并具有至少约50％的采取α-螺旋构象的氨基酸；其中所述Fractomer表现出相变行为。在一种情况下，至少一个无序结构域包含(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQIDNO：1)，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且n是大于或等于1的整数。在另一种情况下，每个聚丙氨酸结构域中至少约60％的氨基酸采取α-螺旋构象。在另一种情况下，每个聚丙氨酸结构域包含[Bp(A)qZr]n(SEQ ID NO：22)或[(BAs)tZr]n(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列，其中B是Lys、Arg、Asp或Glu，A是Ala，Z是Lys、Arg、Asp或Glu，n是1至50的整数，p是0至2的整数，q是1至50的整数，r是0至2的整数，s是1至5的整数，并且t是1至50的整数。在另一种情况下，所述结构化结构域包含下述一者或多者：(A)25(SEQ ID NO：7)；K(A)25K(SEQ IDNO：8)；D(A)25K(SEQ ID NO：9)；GD(A25)K(SEQ ID NO：10)；或GK(A25)K(SEQ ID NO：11)。在另一种情况下，所述Fractomer的约4％至约75％包含结构化结构域。在另一种情况下，所述Fractomer在低于下临界溶液温度(LCST)下可溶。在另一种情况下，所述Fractomer具有加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)，并且其中所述加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)是相同的，或者其中所述加热转变温度(Tt-加热)高于冷却转变温度(Tt-冷却)。
在另一个实施方式中，所述Fractomer包含多个无序结构域和多个结构化结构域。在一种情况下，所述Fractomer具有通用结构[(GXGVP)n-α-螺旋]m，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且α-螺旋是具有约5至50个丙氨酸残基的任何基于聚丙氨酸的α-螺旋。在另一种情况下，所述Fractomer具有结构[(GXGVP)n-GX1(A)25X1]m，其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数(例如[(SEQ ID NO：2)n-(SEQ IDNO：10或11)]m)。在另一种情况下，所述Fractomer包含一个或多个下述结构：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：13)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：14)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：15)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：16)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：17)；
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：19)。
在一种情况下，所述Fractomer包含下述结构：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)。
本文所描述的示例性序列、序列基序和Fractomer构建物示出在下面的表1中。
Figure BDA0003975359060000231
Figure BDA0003975359060000241
Figure BDA0003975359060000251
Figure BDA0003975359060000261
Figure BDA0003975359060000271
Figure BDA0003975359060000281
Figure BDA0003975359060000291
所述Fractomer也可以包括非天然存在的氨基酸衍生物，例如可UV交联的氨基酸衍生物。所述非天然氨基酸衍生物可用于在不同Fractomer之间和同一Fractomer内引入共价交联。例如，可以将包含可UV交联的氨基酸衍生物的Fractomer暴露到UV光，这可以导致在所述氨基酸衍生物与另一个Fractomer的氨基酸侧链之间或与同一Fractomer(具有所述氨基酸衍生物)的氨基酸侧链之间形成共价交联。所述可UV交联的氨基酸衍生物可以是已用叠氮化物基团官能化的任何氨基酸。在某些实施方式中，所述氨基酸衍生物是对叠氮基苯丙氨酸。
所述可UV交联的氨基酸衍生物可以以不同的量包含，而不影响所述Fractomer在不同温度下转变的能力。例如，所述可UV交联的氨基酸衍生物可以以约0.1％至约20％(所述Fractomer的)、例如约0.5％至约15％或约1％至约10％(所述Fractomer的)包含在所述Fractomer内。
所述Fractomer可以通过随温度改变溶解性和聚集体的形成而表现出相变行为。Fractomer的相变行为可能源自于Fractomer的无序结构域的相变行为。“相变”和“转变”可以是指多肽的聚集，其在特定温度下急剧出现。所述相变可以是可逆的，尽管特定溶解温度可以与特定聚集温度相同或不同。
在某些实施方式中，所述Fractomer在低于下临界溶液温度(LCST)时可溶。LCST是低于其时所述多肽可混溶的温度。
转变温度(Tt)是Fractomer从一种状态变成另一种状态时的温度。状态可以包括例如可溶性多肽、凝胶和不同尺寸和维度的聚集体。所述Fractomer可以具有加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)。在某些实施方式中，所述加热转变温度(Tt-加热)是浓度依赖性的。在某些实施方式中，所述冷却转变温度(Tt-冷却)是浓度不依赖性的。所述Tt-加热可能主要由所述无序结构域决定。所述Tt-冷却可能主要由所述结构化结构域决定。
低于转变温度(LCST或Tt)，所述Fractomer可能高度可溶。在加热到高于转变温度后，所述Fractomer可能疏水性塌陷并聚集，形成单独的相。
所述Fractomer可以在各种不同温度下相变。所述Fractomer可以具有约0℃至约100℃、约10℃至约50℃或约20℃至约42℃的转变温度(Tt)。所述加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)可以相同。当在本文中使用时，当温度在彼此的2.0℃、1.0℃、0.5℃或0.1℃以内时，所述温度可以是“相同的”。在某些实施方式中，所述加热转变温度(Tt-加热)高于冷却转变温度(Tt-冷却)。在所述Fractomer具有高于Tt-冷却的Tt-加热的实施方式中，所述两个转变温度之间的差可以被称为回滞，在某些实施方式中，所述Fractomer具有约5℃至约70℃，例如约5℃至约60℃或约10℃至约50℃的回滞。
所述Fractomer的相变行为可用于根据被称为“可逆相变循环”的方法纯化所述Fractomer，其中将所述Fractomer的可逆相变行为用于使溶液通过可溶性和不溶性相进行循环，从而除去杂质。相变也可以使用亲液盐例如硫酸铵或氯化钠来触发。可以向包含所述Fractomer的溶液添加所述亲液盐，所述亲液盐被添加直至所述Fractomer形成聚集体或从溶液沉淀出来。所述聚集体可以通过离心沉积，并重悬浮在第二种溶液或缓冲液中。在冷却至低于其Tt后或当亲液盐从溶液中移除时，所述Fractomer的聚集体可以重新溶解在所述溶液中。在某些实施方式中，所述Fractomer不需任何层析纯化即可被纯化。在某些实施方式中，所述Fractomer通过重组产生并从例如大肠埃希氏杆菌的细菌培养物中纯化。
在某些实施方式中，当温度高于Tt-加热时，所述Fractomer可以形成聚集体。当冷却至低于Tt-冷却的温度时，所述聚集体可以重新溶解。
所述由多个Fractomer形成的聚集体可能具有可以从Fractomer的结构产生的有利性质。例如，所述聚集体可能具有物理的非共价交联。这些物理的非共价交联可能由彼此相互作用的结构化结构域的螺旋束集引起。除了物理的非共价交联之外，所述聚集体还可能具有共价交联(例如化学交联)。共价交联可以被包括在所述聚集体中以便提高它们的机械稳定性而不改变它们的多孔结构，在某些实施方式中，所述聚集体可以从多个Fractomer形成，然后可以通过共价交联(在形成所述聚集体后)进一步稳定。共价交联可以通过本文所描述的具有叠氮化物官能团的可UV交联的氨基酸衍生物引入。可以并入到聚集体中的交联的其他实例包括但不限于小分子交联和半胱氨酸二硫桥。化学小分子交联的一个实例是四(羟甲基)氯化鏻(TMPC)，其可以交联Fractomer中的赖氨酸。
此外，所述由多个Fractomer形成的聚集体可能具有固体样性质，使其与液体样凝聚结构区分开。例如，所述聚集体可能具有高于其损耗模量(G″)的储能模量(C)，例如具有比其G”高2×、5×、10×、15×、20×、25×、30×、35×、50×或100×的G′。在某些实施方式中，所述聚集体具有比其G″高2×至100×，例如比其G”高10×至50×或20×至35×的G′。
所述由多个Fractomer形成的聚集体可能具有各种不同尺寸和维度。在某些实施方式中，所述聚集体是稳定的三维基质。在某些实施方式中，所述聚集体是分形样的，在某些实施方式中，所述聚集体是凝胶样的，在某些实施方式中，所述聚集体是多孔的，具有空隙体积，例如所述聚集体的非蛋白质富集相。在某些实施方式中，所述空隙体积是可调的。例如，所述聚集体可能具有(聚集体体积的)约60％至约90％的空隙体积，此外，所述聚集体可能包含直径为约1μm至约100μm，例如约1μm至约10μm、约3μm至约5μm、约25μm至约60μm、约30μm至约50μm或约3μm至约50μm的孔眼。
还提供了编码本文中描述的Fractomer的多核苷酸。载体可以包含编码本文中详述的Fractomer的多核苷酸。为了获得多肽的表达，人们可以将编码所述多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体中，所述表达载体含有指导转录的启动子、转录/翻译终止子以及对于编码蛋白质的核酸来说用于翻译起始的核糖体结合位点。载体的一个实例是pET24。适合的细菌启动子在本领域中是公知的。还提供了一种宿主细胞，其用包含编码本文所描述的Fractomer的多核苷酸的表达载体转化或转染。用于表达蛋白质的细菌表达系统是可用的，例如在大肠埃希氏杆菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌(Salmonella)中。参见Paiva等，Gene 22:229-235(1983)；Mosbach等，Nature 302:543-545(1983)。用于此类表达系统的试剂盒是可商购的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统在本领域中是公知的，并且也是可商购的。反转录病毒表达载体可用于本发明。
所述Fractomer可以按照本领域技术在宿主细胞中重组表达。所述Fractomer可以通过本领域技术人员已知的任何手段纯化。例如，所述Fractomer可以使用层析例如液相层析、孔径排阻层析或亲和层析或其组合来纯化，在某些实施方式中，所述Fractomer不需层析即可纯化，在某些实施方式中，所述Fractomer使用可逆相变循环来纯化。
在其他实施方式中，本公开在本文中还提供了一种包含多个Fractomer的支架。所述支架可以在高于所述Fractomer的转变温度的温度下形成，以便所述多肽形成聚集体。所述支架可以是可注射的。
根据一个实施方式，还提供了一种细胞支架。细胞支架包括所述支架和多个细胞。所述细胞可以包括各种不同的类型。在某些实施方式中，所述细胞包括干细胞、细菌细胞或人类组织细胞或其组合。
所述支架可以具有低免疫原性或低抗原性或两者。所述支架可以促进细胞生长、细胞召集和细胞分化中的至少一者或其组合。所述支架或细胞支架可能适合于细胞移植、组织再生、细胞培养和基于细胞的体外测定。此外，所述支架和/或细胞支架可以促进血管形成、伤口愈合或其组合。
根据一个实施方式，还提供了一种药物递送组合物。所述药物递送组合物可以包括本文详述的在高于Tt-加热下自组装成聚集体的多个Fractomer和包封在所述聚集体内的药剂。所述药剂可以是治疗性的。在某些实施方式中，所述药剂选自小分子、核苷酸、多核苷酸、蛋白质、多肽、糖类、脂类及其组合。在某些实施方式中，所述药剂包含脂肪组织。在某些实施方式中，所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。在一个实施方式中，所述药物递送组合物包含约10–90体积％的脂肪组织抽吸物，包括所述指定范围内的所有整数。在另一个实施方式中，所述组合物包含约25–90体积％的脂肪组织抽吸物，包括所述指定范围内的所有整数。在某些实施方式中，所述组合物包含至少25体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少35体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少45体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少50体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少60体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少70体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少80体积％的脂肪组织抽吸物。在其他实施方式中，所述组合物包含至少90体积％的脂肪组织抽吸物。
在其他实施方式中，如上详述的Fractomer和/或药物递送组合物可以按照制药领域的专业技术人员公知的标准技术配制成药物组合物。因此，组合物可以包含Fractomer或其聚集体和/或Fractomer或其聚集体和有效量的脂肪组织(例如脂肪组织抽吸物)以及一种或多种可药用载体、赋形剂或活性药物成分(API)。可以制备所述组合物用于给药到受试者。此类组合物可以通过医疗领域的专业技术人员公知的剂量和技术，考虑到诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况和给药途径等因素来给药。
所述组合物可以预防性或治疗性给药。在预防性给药中，它们可以以足以诱导应答的量给药。在治疗性应用中，它们以足以引发治疗效果的量给药到有需要的受试者。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种用途有效的量将取决于例如所给药的Fractomer方案的具体组合物、给药方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状态和处方医生的判断，在某些实施方式中，所述Fractomer可以与药剂、细胞、脂肪组织(例如脂肪组织抽吸物)或其组合共同给药。
本文提供的组合物可以通过本领域中公知的方法来给药，如在Donnelly等，Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997)；FeLgner等，美国专利号5,580,859；Feigner，美国专利号5,703,055；和Carson等，美国专利号5,679,647中所述，所有所述文献的内容整体通过参考并入本文。可以将所述Fractomer复合到粒子或珠子，它们可以例如通过疫苗枪给药到个体。本领域技术人员会知道，可药用载体、包括生理上可接受的化合物的选择取决于例如给药途径。
所述组合物可以通过各种不同途径递送。典型的递送途径包括肠胃外给药，例如真皮内、肌肉内或皮下递送。其他途径包括口服给药、鼻内、阴道内、透皮、静脉内、动脉内、肿瘤内、腹膜内和表皮途径。在某些实施方式中，所述Fractomer静脉内、动脉内或腹膜内给药到所述受试者。
方法
本文提供的组合物可用于大量方法中。本公开的一个方面提供了一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本文所提供的组合物，以便在所述受试者中增强所述自体脂肪移植物，由该步骤组成或基本上由该步骤组成。
本公开的另一个方面提供了一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括向所述受试者共同给药治疗有效量的本文所提供的Fractomer和治疗有效量的脂肪组织，由该步骤组成或基本上由该步骤组成。在某些实施方式中，所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。在一个实施方式中，所述Fractomer和脂肪组织被同时给药。在另一个实施方式中，所述Fractomer在所述脂肪组织之前给药。在另一个实施方式中，所述Fractomer在所述脂肪组织之后给药。
对于相关领域的普通技术人员来说，显然可以对本文描述的组合物、制剂、方法、过程和应用做出适合的修改和改编，而不背离其任何实施方式或方面的范围。所提供的组合物和方法是示例性的，并且不打算限制任何指定实施方式的范围。本文公开的各种不同实施方式、方面和选择都可以以任何变化或迭代方式组合。本文描述的组合物、制剂、方法和过程的范围包括本文描述的实施方式、方面、选择、实例和优选项的所有实际和潜在组合。本文描述的组合物、制剂或方法可以省略任何组分或步骤，替换本文公开的任何组分或步骤，或包括本文中别处公开的任何组分或步骤。本文公开的任何组合物或制剂的任何组分的质量与所述制剂中任何其他组分的质量或所述制剂中其他组分的总质之比在本文中公开，如同它们被明确地公开。在通过参考并入的任何专利或出版物中任何术语的含义与本公开中使用的术语的含义有冲突的情况下，以本公开中所述术语或短语的含义为准。此外，上述讨论仅仅公开并描述了示例性实施方式。本文引用的所有专利和出版物以其特定教导通过参考并入本文。
本文描述的发明的各种不同实施方式和方面由下述条款总结：
条款1.一种组织基质组合物，其包含：
重组的部分有序多肽(Fractomer)；和
脂肪组织。
条款2.条款1所述的组合物，其中所述Fractomer包含：
多个无序结构域；
多个结构化结构域。
条款3.条款2所述的组合物，其中
所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且n是大于或等于1的整数：并且
所述结构化结构域包含聚丙氨酸结构域。
条款4.条款2所述的组合物，其中所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中X是Val(SEQ ID NO：3)或Ala(SEQ ID NO：4)或Ala和Val的混合物，并且其中n是1至50的整数。
条款5.条款4所述的组合物，其中X是Ala和Val的比例为10:1至1:10(Ala:Val)的交替迭代。
条款6.条款5所述的组合物，其中X是Ala和Val的比例为1:1(SEQ ID NO：5)或1:4(SEQ ID NO：6)的交替迭代。
条款7.条款3所述的组合物，其中所述聚丙氨酸结构域包含(Ala)m，其中m是5至50的整数。
条款8.条款3所述的组合物，其中所述聚丙氨酸结构域包含下述一者或多者：
(A)25(SEQ ID NO：7)；
K(A)25K(SEQ ID NO：8)；
D(A)25K(SEQ ID NO：9)；
GD(A25)K(SEQ ID NO：10)；或
GK(A25)K(SEQ ID NO：11)。
条款9.条款3所述的组合物，其中所述多肽包含：
[(GXGVP)n-GX1(A)25X1]m；
其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数([(SEQ ID NO：2)n-(SEQ ID NO：10或11)]m)。
条款10.条款3所述的组合物，其中所述多肽包含下述一者或多者：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：13)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：14)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：15)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：16)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：17)；
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：19)。
条款11.条款3所述的组合物，其中所述多肽包含下述一者或多者：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)。
条款12.条款1-11中的任一项所述的组合物，其中所述Fractomer具有加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)。
条款13.条款12所述的组合物，其中所述冷却转变温度(Tt-冷却)是浓度不依赖性的。
条款14.条款12所述的组合物，其中所述加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)在约10℃至约45℃的范围内。
条款15.条款12-14中的任一项所述的组合物，其中所述Fractomer在高于Tt-加热下形成固体聚集体。
条款16.条款15所述的组合物，其中所述固体聚集体在被冷却至低于Tt-冷却时再溶解。
条款17.条款15所述的组合物，其中所述固体聚集体是稳定的三维基质。
条款18.条款15所述的组合物，其中所述固体聚集体包含多个微孔。
条款19.条款18所述的组合物，其中所述多个微孔的尺寸在约1μm至约150μm的范围内。
条款20.条款1所述的组合物，其中所述组合物包含约200μM至约2mM之间的Fractomer。
条款21.条款1所述的组合物，其中所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。
条款22.条款21所述的组合物，其中所述组合物包含以体积计约10％至约90％范围内的脂肪组织抽吸物。
条款23.条款21或22所述的组合物，其中所述组合物包含以体积计约25％至约75％范围内的脂肪组织抽吸物。
条款24.条款22-23中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约50体积％的脂肪组织抽吸物。
条款25.条款21所述的组合物，其中所述组合物包含比例在约1:9至约9:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
条款26.条款21所述的组合物，其中所述组合物包含比例在约1:3至约3:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
条款27.条款21所述的组合物，其中所述组合物包含比例为约1:1的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
条款28.条款1所述的组合物，其中所述组合物是可成形液体或半固体。
条款29.条款1所述的组合物，其中所述组合物是可注射或可植入的。
条款30.条款1所述的组合物，其中所述组合物可成形或可模制成2维或3维形状、面积或体积。
条款31.条款1所述的组合物，其中所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
条款32.一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：
向所述受试者给药治疗有效量的条款1所述的组合物，以便在所述受试者中增强自体脂肪移植物。
条款33.一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：
向所述受试者共同给药治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织。
条款34.条款33所述的方法，其中所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。
条款35.条款33所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被同时或顺序给药。
条款36.条款35所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，并且所述Fractomer在所述脂肪组织给药之前给药。
条款37.条款35所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，并且所述脂肪组织在所述Fractomer给药之前给药。
条款38.条款35所述的方法，其中将所述Fractomer和脂肪组织在体外合并，成形或模制成2维或3维形状、面积或体积，并原位植入到所述受试者中。
条款39.条款33所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织在给药前是可成形液体、半固体或模制半固体，并且在给药后形成固体聚集体。
条款40.条款39所述的方法，其中将所述Fractomer和脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下共同给药到受试者，并且所述Fractomer和脂肪组织在暴露到所述受试者的体温后形成固体。
条款41.条款33所述的方法，其中所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
条款42.一种制备自体脂肪移植组合物的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得脂肪组织；和
(b)将重组的部分有序多肽(Fractomer)与步骤(a)的脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下合并，以形成混合物。
条款43.条款44所述的方法，其还包括：
(c)将所述混合物成形成形状、面积或体积。
条款44.条款42或43所述的方法，其还包括：
(d)通过注射或植入将所述混合物共同给药到所述受试者。
条款45.条款44所述的方法，其中所述混合物在高于所述Fractomer的Tt-加热的温度下形成固体聚集体。
条款46.一种试剂盒，其包含重组的部分有序多肽(Fractomer)，以及用于合并的容器、用于特定体积维度的模具或用于脂肪组织抽吸和/或给药的工具中的一者或多者。
条款47.治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织用于在有需要的受试者中进行自体脂肪移植的用途。
实施例
实施例1
将Fractomer与脂肪组织(脂肪)混合的方法
脂肪移植是一种使用抽脂术从患者身体的一个部位移除脂肪组织，并在同一手术期间将该材料注射到新的区域中用于重建或美容增强的临床过程。对抽吸的脂肪进行加工以除去过量血液、油和非脂肪组织，并将加工过的组织(被称为脂肪组织抽吸物)收集在注射器中，用于注射回到所述患者中(在另一个身体区域中)。
可以将纯化的脂肪组织抽吸物与液体Fractomer合并，用于注射到正在重建的区域中。图1示出了所提出的将Fractomer与收获的脂肪合并以用于稳定化的脂肪移植物的重新注射的方法。将收获的脂肪组织抽吸物与Fractomer基质溶液混合，然后将所述脂肪组织抽吸物：Fractomer混合物注射到患者的缺陷区域中。升高的体温导致Fractomer形成固体支架结构，这导致移植物稳定。也可以将纯化的脂肪组织抽吸物与液体Fractomer在加热的离体模具中合并，在那里所述Fractomer在加热时聚集，使模制的脂肪形状稳定，然后可以将其植入到患者的所需区域中。
图2示出了未加工的脂肪和加工过的脂肪组织抽吸物之间的结构差异。在抽脂和加工后，脂肪失去其固体样特性，并且不具有机械完整性以维持形状或体积。通过将脂肪组织抽吸物与Fractomer混合，可以加强结构和机械完整性以帮助维持脂肪移植物的形状和体积保留。
Fractomer(SEQ ID NO：12)是热响应性的，并且在加热时形成固体多孔弹性蛋白样网络(图3A)。Fractomer在室温下是液体并且可注射，但在体温下聚集并形成固体多孔网络，其中较高的温度启动Fractomer支架形成并截留脂肪组织抽吸物。Fractomer经历相分离成为固体多孔网络的阈值温度是可调的。通过调节Fractomer的组成和区段组织，有可能设计出具有高的表面积体积比和与天然弹性蛋白相近的分形维度的机械稳定的网络。Fractomer(SEQ ID NO：12)在较高温度下的多孔网络也允许与传统的水凝胶相比更大的营养物流动(图3B)。
实施例2
Fractomer在几种储存条件下是储存稳定的
为了评估Fractomer的保质期，将至少3批(以确保重复性)高纯度Fractomer(SEQID NO：12)分成等分试样并储存在三种不同条件下：(1)冻干并储存在室温下，(2)冻干并储存在-20℃下，(3)重悬浮在PBS中并储存在-20℃下。在直至6个月的定期时间点，使用UV分光光度法光密度和SDS-PAGE评估蛋白质降解的发生(图4A–B)。由于Fractomer蛋白高度无序并因此在所有时间功能变性，因此它们与大多数蛋白质相比具有显著降低的储存要求。冻干并在-20℃下储存的Fractomer样品显示出准确的Tt-加热或Tt-冷却相变没有随时间变化(图4A)，并且在其他两种条件下储存的样品显示出相似的结果。此外，在任何时间点通过SDS-PAGE没有观察到靶Fractomer蛋白条带的丧失或迁移，并且没有观察到截短/降解产物、杂质或其他额外的条带(图4B)。
实施例3
Fractomer可以包封健康的脂肪细胞并改善形状和突出
将舍弃的人类脂肪组织抽吸物与不同的Fractomer浓度混合，并使用共聚焦显微镜和组织学进行分析(图5A–C)。在所有情况下，所述脂肪组织抽吸物由超过>90％的团集成50-500个细胞的团块的大脂肪细胞组成，它们是小得足以通过抽脂插管的片段。在室温下将浓度范围为250μM至1mM的Fractomer以1:1的比例与所述脂肪组织抽吸物混合，然后置于37℃温箱中30min，然后(a)染色并使用共聚焦显微镜成像，或(b)在10％福尔马林中固定过夜，然后进行石蜡包埋和H&E染色，用于组织学分析。
图5A示出了脂肪组织抽吸物：Fractomer(SEQ ID NO：12)混合物的共聚焦显微镜分析。将脂肪组织抽吸物与不同浓度的Fractomer(低＝250μM，高＝750μM)以1:1的比例混合，并用LipidTOX(红色，也染色Fractomer)和DAPI(蓝色)染色。成像揭示出脂肪细胞的结构或存活率没有变化。尽管在各个脂肪细胞之间的小间隙中观察到Fractomer，但Fractomer的主要功能是作为一种高度多孔的“胶”，将脂肪细胞团块保持在一起。
图5B–C示出了单独的脂肪与脂肪组织抽吸物：Fractomer(SEQ IDNO：18)的1:1比例的混合物相比的组织学分析。将单独的脂肪组织抽吸物和与Fractomer(250μM)混合的脂肪组织抽吸物固定并用H&E染色。可以看到Fractomer散布在更密集的脂肪细胞的区域之间。
实施例4
使用单独的Fractomer和脂肪+Fractomer产生3D模具
也使用3D打印的半球形模具评估了Fractomer在与脂肪共注射时维持形状和突出的能力。将Fractomer(SEQ ID NO：12)在液体状态下注射到模具中，并允许其在37℃下聚集5min，然后除去模具(图6A)。在使用浓度在200μM至2mM范围内的单独的Fractomer(SEQ IDNO：12)时，需要使用～500μM的最低浓度来维持突出以保持形状(图6B)。图6B演示了在低(500μM)、中(750μM)和高(2mM)浓度下模制单独的Fractomer，显示出随着浓度提高形状保持提高。将Fractomer溶液(750μM)(SEQ ID NO：12)进一步以各种不同的比例与人类脂肪组织抽吸物混合，以确定它对脂肪形状稳定性的影响(图6C)。Fractomer能够显著改善在单独情况下行为只是类似于油性液体的脂肪组织抽吸物的形状保持(图6C)。当将Fractomer溶液(750μM)(SEQ ID NO：18)以1:1的比例与抽脂的猪脂肪在3D打印的模具中混合并在37℃下放置以允许Fractomer聚集时，观察到等同的结果(图6D)。这些结果表明当将脂肪与Fractomer混合时获得了令人吃惊且出人意料的互补机械相互作用。
总而言之，发现脂肪组织抽吸物与Fractomer的混合物改善从模具释放后的形状保留。最令人吃惊且出人意料的发现是脂肪+Fractomer混合物的可成形性。即使在形成后，包封的脂肪也可以被模制、成形、切割和一般性操作，而不丧失结构完整性。在体内操作这种材料以获得所需形状的能力，为外科医生使用脂肪组织抽吸物在患者中填充和重建缺陷提供了前所未有的控制程度。
实施例5
Fractomer的形状可以在注射时控制
Fractomer注射物的形状也可以基于注射模式来控制。将荧光标记的Fractomer溶液(750μM)(SEQ ID NO：12)以三种不同的形状模式注射到小鼠的后胁中，并在注射后1个月和4个月使用IVIS光谱成像来监测形状。对于所有三种形状——球形、细长杆和散点来说，注射物在所述注射物的整个寿命期间维持它们的所需形状(图7)。
实施例6
Fractomer显示出长期稳定性，并且降解可以使用浓度来控制
当用于增强脂肪移植时，Fractomer应该被设计成在与脂肪增殖相一致的时间线上降解和再吸收，允许脂肪细胞在Fractomer被分解成无毒氨基酸时取代它的体积。最终产生完全由患者自己的组织构成的组织移植物的受控降解避免了外来物体反应的长期风险，因为Fractomer并非打算作为永久植入物。
为了评估Fractomer的长期稳定性，将Fractomer(SEQ ID NO：12)的不同制剂用近红外染料荧光标记并注射到BL/6免疫活性小鼠中。BL/6小鼠的使用确保了免疫调节降解如果存在的话将被捕获。随后在10个月内使用IVIS光谱体内成像跟踪了Fractomer蛋白的降解速率和体内稳定性。在6个月时荧光保留的快照证实了Fractomer降解可以用浓度控制(低＝250μM，中＝750μM，高＝1500μM)，因为与低浓度相比，对中和高浓度的Fractomer来说荧光强度明显更高(图8A)。用不同Fractomer浓度的制剂注射的BL/6小鼠中的代表性荧光光谱图像示出在图8B中。
使用Fractomer的低浓度制剂(250μM)持续再吸收直至3个月(图8C)。尽管在荧光扫描中Fractomer的存在是明显的，但没有明显的可见或可触及的体积(图8C)。发现Fractomer的中(750μM)和高(1500μM)浓度制剂更加稳定，具有更长的体内持久性(图8C)。
实施例7
Fractomer提高脂肪存活率和体积保留
使用Fractomer(SEQ ID NO：12)的低浓度(250μM)溶液，首先筛选了脂肪：Fractomer比例以确定在移植物中减少脂肪的影响。在nu/nu小鼠株系中，在6周内评估了单独的脂肪(100％脂肪)、90体积％的脂肪+Fractomer溶液、75体积％的脂肪+Fractomer溶液、50体积％的脂肪+Fractomer溶液和50体积％的脂肪+PBS对照的注射混合物。选择Nu/nu小鼠是为了防止人类脂肪组织的排斥。在实验组中用于注射到nu/nu小鼠中的不同脂肪：Fractomer溶液(250μM)混合物的示例图示出在图9A中。
在注射后，对于50体积％的脂肪+PBS对照组来说，在前24hr小时中观察到最大的体积丧失(图9B)。这可能是由于脂肪混合物中存在残余的油，其在手术室中的脂肪纯化过程中未被移除，这在临床上是常见的。当与不同比例的Fractomer基质混合时，脂肪移植物在1周内显示出体积保留的改善(图9B–C)。在注射后6周，使用少至少50％的脂肪组织即可实现与单独的脂肪相同的最终体积(图9D)。在不包含稳定化Fractomer基质的情况下使用降低的脂肪量(50体积％的脂肪)时，体积保留率显著降低(图9D)。
为了进一步调查脂肪体积保留率的改善，使用了更高浓度(750μM)的Fractomer并延长了观察时间(图9E)。将50体积％的脂肪+Fractomer溶液的注射与单独的脂肪注射进行了3个月的比较，此时由于单独脂肪的对照组中有害的囊肿形成，实验被终止。使用这种更高浓度Fractomer的制剂显示出更高的体积保留率(图9E)。归一化到注射的初始脂肪的量，通过将脂肪与Fractomer合并在3个月时移植的脂肪的有效体积变为三倍(图9F)。
植入物的组织学分析揭示出与单独脂肪制成的移植物相比，在与Fractomer(250μM)一起制成的脂肪移植物中血管供应高(图10A)。在脂肪细胞团之间的支持性Fractomer区段中观察到CD31+血管标志物的高普遍性(图10A，小的红色箭头)。CD31+染色揭示出在移植物的存活的脂肪细胞团和富含Fractomer的区段两者中血管形成的高普遍性，表明Fractomer可能能够提高植入的脂肪的存活率。
在注射后1个月，单独的脂肪和1:1脂肪：Fractomer(250μM)混合物之间的脂肪分布的组织学比较表明移植物的细胞组成没有差异，尽管在脂肪+Fractomer实验组中使用了少50体积％的脂肪(图10B)。这表明脂肪：Fractomer移植物的良好掺入，并表明在Fractomer基质内脂肪增殖可能以高水平发生。此外，在注射后30天观察到残余Fractomer的迹象，并且没有指示慢性炎症的外来物体反应(图10C)。与来自于体外混合物的组织学结果相似，Fractomer似乎作为一种蛋白质“胶”存在，维持脂肪细胞团之间的体积，同时为形成新的ECM、细胞浸润和血管化提供了时间。
实施例8
在脂肪+Fractomer混合物中没有观察到单独脂肪注射物中的囊肿形成和坏死
尽管在使用Fractomer时脂肪组织有效体积的增加是成功的关键度量，但增加脂肪体积的确切生物组成同样重要。例如，避免囊肿形成、钙化和坏死对于健康脂肪组织的发育至关重要。健康脂肪形成中的这些异常的迹象使用超声波、组织学和显微CT的组合来筛查。在用单独的脂肪或脂肪组织抽吸物和Fractomer溶液(750μM)(SEQ ID NO：12)的1:1混合物注射的小鼠中捕获了3个月内脂肪移植物的超声(图11A)。在单独的脂肪组的移植物中，在注射后1个月和3个月时观察到作为脂肪坏死的关键标志物的大的油囊肿的形成(图11A，顶行图，白色箭头)，而对于用脂肪+Fractomer溶液注射的任何小鼠来说，没有观察到囊肿形成(图11A，底行图)。到1个月时，在>50％的用单独脂肪注射的小鼠中观察到这些囊肿。此外，发现在整个3个月的时间过程中这些囊肿的体积扩大，并且在几只小鼠中囊肿几乎占据了整个注射物的体积。此外，在3个月时单独脂肪和1:1脂肪：Fractomer溶液(750μM)移植物的细胞组成的组织学比较显示出在单独脂肪组中大的油囊肿形成的明显迹象(图11B，左图)。然而，通过组织学分析在任何Fractomer移植物中没有观察到囊肿形成(图11b，右图)。值得注意的是，较高浓度的Fractomer溶液(750μM)在3个月时导致Fractomer的保留率更高，并且可以看出Fractomer支持脂肪细胞。这些结果与使用较高浓度Fractomer的再吸收研究的数据相一致。
单独脂肪组中囊肿的形成与人类中脂肪坏死的临床观察相一致。50体积％的脂肪+Fractomer溶液的注射物是脂肪细胞和残余Fractomer的非均质混合物，在对比CT下具有血管化的明显征兆(在单独脂肪中未看到)。此外，在脂肪+Fractomer移植物中没有观察到钙化，其在小鼠中会显示为点状白色纹理。使用Fractomer的移植物的健康改善可能归因于脂肪组织的使用量减少，这需要更少的初始代谢需求。此外，Fractomer的多孔性质和快速血管化可以迅速为脂肪细胞存活和生长提供营养物。
实施例9
猪自体脂肪移植模型中的Fractomer
啮齿动物模型足以优化关键变量，但小型动物几乎没有皮下脂肪组织，并且它们的软组织结构在解剖学上与人类不同。此外，尽管裸小鼠是免疫缺陷的并且可以耐受人类细胞，但人类脂肪的使用代表了与自体移植相比在身体反应和可用注射量两方面的重要变化。因此，在小型猪模型中进一步评估长期Fractomer增强的脂肪移植。这项提出的实验证明，在公认的猪自体脂肪移植模型中Fractamer可以扩大体积，并以临床相关的体积产生健康的脂肪组织。
对小型猪进行麻醉，并在邻近脊柱的背部高出3–4cm处产生小的中线切口。使用电力辅助抽脂，使用4mm套管抽吸皮下脂肪储库。目标是收获大约50cm3脂肪组织。如有必要，产生额外的切口以允许在后胁附近抽脂。使用用于制备移植用人类脂肪的RevovleTM系统清洗并加工脂肪。然后将脂肪组织抽吸物分成四个不同的注射制剂混合物，体积各为～25cm3，它们可能会在临床上用于乳房重建形状和小肿块切除术的手术修正：100体积％的脂肪组织抽吸物(单独的脂肪)，50体积％的脂肪组织抽吸物+Fractomer溶液，25体积％的脂肪组织抽吸物+Fractomer溶液，或单独的Fractomer。将每个25cm3混合物注射到乳房脂肪中的独特部位中。使用～3mL注射物沿着猪的胁部对这些组进行重复实验，以模拟在非乳房应用中使用Fractomer。这项任务的一个关键组分是在模拟临床的环境中对Fractomer进行“易用性”分析，允许深入了解能够确保与现有外科实践相一致的最终产品递送技术的类型。然后使猪恢复，饲养并监测。
目标是确定用Fractomer稳定的脂肪移植物的体积保留率以及该体积的细胞健康/组成。据报道，取决于植入技术，自体脂肪移植物的临床脂肪体积保留率在6个月时在30–60％之间，并且在小型猪模型中也看到了类似的保留率。通过初始注射物的持续存活以及注射的脂肪细胞的增殖或增大，与Fractomer组合的脂肪的体积会长期维持。这是合理的预期，因为当将脂肪在Fractomer基质中稀释时，每单位体积注射物的氧气和其他营养物的消耗量会低于纯脂肪。每单位体积较低的消耗量会提高扩散为注射的脂肪细胞充分递送所需营养物质的可能性。这些结果使用3D超声和定期活检的组合来评估。成像允许确定使用移植物时囊肿形成的可能性。在第10、60和180天时使用针头活检提取组织(或在第180天完全切除)，用于细胞组成、纤维化、新生血管化、坏死和慢性炎症的组织学调查。
序列表
<110> 杜克大学（DUKE UNIVERSITY）
<120> 用于增强自体脂肪移植物的组合物和方法
<130> 028193-9366-WO01
<150> US 63/035,173
<151> 2020-06-05
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 序列可以重复1次或更多次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是除了脯氨酸之外的任何氨基酸
<400> 1
Gly Xaa Gly Val Pro
1               5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 序列可以重复1次或更多次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Ala或Val
<400> 2
Gly Xaa Gly Val Pro
1               5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 序列可以重复1次或更多次
<400> 3
Gly Ala Gly Val Pro
1               5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 序列可以重复1次或更多次
<400> 4
Gly Val Gly Val Pro
1               5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> G[A1:V1]GVP = GAVGP GVGVP；示出了重复序列；Ala在第一重复序列中；
Val在第二重复序列中；这个基序可以重复1次或更多次
<400> 5
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
1               5                   10
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> G[V4:A1]GVP = GVGVP GVGVP GVGVP GVGVP GAGVP；示出了5个重复序列；Val
在前4个重复序列中，并且Ala在第5个重复序列中；这个基序可以重复1次或更多次
<400> 6
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
1               5                   10                  15
Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
            20                  25
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            20                  25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
            20                  25
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
            20                  25
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
            20                  25
<210> 11
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Gly Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys
            20                  25
<210> 12
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Met Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
        35                  40                  45
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
    50                  55                  60
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
            100                 105                 110
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
        115                 120                 125
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
    130                 135                 140
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
145                 150                 155                 160
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
                165                 170                 175
Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly
        195                 200                 205
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
    210                 215                 220
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
                245                 250                 255
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
            260                 265                 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala
        275                 280                 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
305                 310                 315                 320
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
                325                 330                 335
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
            340                 345                 350
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
        355                 360                 365
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
    370                 375                 380
Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385                 390                 395                 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly
                405                 410                 415
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
            420                 425                 430
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
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Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
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Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            500                 505                 510
Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
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Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly
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Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<223> 合成的
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly
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Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Lys Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
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Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
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Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val
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Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro
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Gly Val Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
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Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly
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Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Met Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
        35                  40                  45
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
    50                  55                  60
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
            100                 105                 110
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
        115                 120                 125
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
    130                 135                 140
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
145                 150                 155                 160
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly
        195                 200                 205
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
    210                 215                 220
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
                245                 250                 255
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
            260                 265                 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala
        275                 280                 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
305                 310                 315                 320
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
                325                 330                 335
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
            340                 345                 350
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
        355                 360                 365
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
    370                 375                 380
Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385                 390                 395                 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly
                405                 410                 415
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
            420                 425                 430
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
        435                 440                 445
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
    450                 455                 460
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
465                 470                 475                 480
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala
                485                 490                 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            500                 505                 510
Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
        515                 520                 525
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly
    530                 535                 540
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val
545                 550                 555                 560
Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
                565                 570                 575
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
            580                 585                 590
Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
        595                 600                 605
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Trp Pro
    610                 615                 620
<210> 18
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Met Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
            20                  25                  30
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
        35                  40                  45
Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
    50                  55                  60
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
            100                 105                 110
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
        115                 120                 125
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
    130                 135                 140
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly
145                 150                 155                 160
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala
                165                 170                 175
Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            180                 185                 190
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly
        195                 200                 205
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
    210                 215                 220
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
225                 230                 235                 240
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
                245                 250                 255
Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
            260                 265                 270
Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala
        275                 280                 285
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
    290                 295                 300
Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro
305                 310                 315                 320
Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly
                325                 330                 335
Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val
            340                 345                 350
Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly
        355                 360                 365
Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Ala Gly Val
    370                 375                 380
Pro Gly Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385                 390                 395                 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Gly Trp Pro
                405                 410                 415
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(16)
<223> Xaa是任何氨基酸，并且第3-16位氨基酸中的任一者或所有可以存在或不存在
<400> 19
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Gly
<210> 20
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(15)
<223> Asx 2-15可以存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(31)
<223> 独立于第32-47位处的Glx的任何氨基酸；并且其中第18-31位氨基酸中的任一者或所有可以存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(47)
<223> Glx 32-47独立于第17-31位处的Xaa；并且其中Glx 33-47中的任一者或所有可以存在或不存在
<400> 20
Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Asx Pro
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
            20                  25                  30
Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx Glx
        35                  40                  45
<210> 21
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 第1-2位处的任何或所有Asx可以存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(54)
<223> 基序可以重复1-50次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(52)
<223> 第4-52位处的任一或所有Ala可以存在或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(54)
<223> 第53-54位处的任何或所有Glx可以存在或不存在
<400> 21
Asx Asx Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Ala Ala Glx Glx
    50
<210> 22
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Asx可以是Lys、Arg、Asp或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 基序可以重复1-50次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(3)
<223> 基序可以重复1-50次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Ala可以重复1-5次
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Glx可以是Lys、Arg、Asp或Glu，并且可以重复0-2次
<400> 22
Asx Ala Glx
1

Claims (47)

1.一种组织基质组合物，其包含：
重组的部分有序多肽(Fractomer)；和
脂肪组织。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fractomer包含：
多个无序结构域；
多个结构化结构域。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中
所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，并且n是大于或等于1的整数：并且
所述结构化结构域包含聚丙氨酸结构域。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述无序结构域包含多个(GXGVP)n的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其中X是Val(SEQ ID NO：3)或Ala(SEQ ID NO：4)或Ala和Val的混合物，并且其中n是1至50的整数。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中X是Ala和Val的比例为10:1至1:10(Ala:Val)的交替迭代。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中X是Ala和Val的比例为1:1(SEQ ID NO：5)或1:4(SEQ ID NO：6)的交替迭代。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚丙氨酸结构域包含(Ala)m，其中m是5至50的整数。
8.根据权利要求3所述的组合物，其中所述聚丙氨酸结构域包含下述一者或多者：
(A)25(SEQ ID NO：7)；
K(A)25K(SEQ ID NO：8)；
D(A)25K(SEQ ID NO：9)；
GD(A25)K(SEQ ID NO：10)；或
GK(A25)K(SEQ ID NO：11)。
9.根据权利要求3所述的组合物，其中所述多肽包含：
[(GXGVP)n-GX1(A)25X1]m；
其中X是A或V，X1是K或D，n是10至20的整数，并且m是4至8的整数([(SEQ ID NO：2)n-(SEQ ID NO：10或11)]m)。
10.根据权利要求3所述的组合物，其中所述多肽包含下述一者或多者：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：13)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：14)；
M[(GVGVP)15-GK(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：15)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：16)；
M[(G[A1:V1]GVP)16-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：17)；
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]4-GWP(SEQ ID NO：19)。
11.根据权利要求3所述的组合物，其中所述多肽包含下述一者或多者：
M[(GVGVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：12)；或
M[(G[V4:A1]GVP)15-GD(A25)K]6-GWP(SEQ ID NO：18)。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的组合物，其中所述Fractomer具有加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述冷却转变温度(Tt-冷却)是浓度不依赖性的。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述加热转变温度(Tt-加热)和冷却转变温度(Tt-冷却)在约10℃至约45℃的范围内。
15.根据权利要求12-14中的任一项所述的组合物，其中所述Fractomer在高于Tt-加热下形成固体聚集体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述固体聚集体在被冷却至低于Tt-冷却时再溶解。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述固体聚集体是稳定的三维基质。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中所述固体聚集体包含多个微孔。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述多个微孔的尺寸在约1μm至约150μm的范围内。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含约200μM至约2mM之间的Fractomer。
21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含以体积计约10％至约90％范围内的脂肪组织抽吸物。
23.根据权利要求21或22所述的组合物，其中所述组合物包含以体积计约25％至约75％范围内的脂肪组织抽吸物。
24.根据权利要求22-23中的任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约50体积％的脂肪组织抽吸物。
25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含比例在约1:9至约9:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
26.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含比例在约1:3至约3:1范围内的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包含比例为约1:1的Fractomer和脂肪组织抽吸物的混合物。
28.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是可成形液体或半固体。
29.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是可注射或可植入的。
30.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物可成形或可模制成2维或3维形状、面积或体积。
31.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
32.一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：
向所述受试者给药治疗有效量的根据权利要求1所述的组合物，以便在所述受试者中增强自体脂肪移植物。
33.一种在受试者中增强自体脂肪移植物的方法，所述方法包括：
向所述受试者共同给药治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述脂肪组织包含脂肪组织抽吸物。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被同时或顺序给药。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，并且所述Fractomer在所述脂肪组织给药之前给药。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织被顺序给药，并且所述脂肪组织在所述Fractomer给药之前给药。
38.根据权利要求35所述的方法，其中将所述Fractomer和脂肪组织在体外合并，成形或模制成2维或3维形状、面积或体积，并原位植入到所述受试者中。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述Fractomer和脂肪组织在给药前是可成形液体、半固体或模制半固体，并且在给药后形成固体聚集体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中将所述Fractomer和脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下共同给药到受试者，并且所述Fractomer和脂肪组织在暴露到所述受试者的体温后形成固体。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述Fractomer允许所述脂肪组织的细胞浸润和血管化。
42.一种制备自体脂肪移植组合物的方法，所述方法包括：
(a)从受试者获得脂肪组织；和
(b)将重组的部分有序多肽(Fractomer)与步骤(a)的脂肪组织在低于所述Fractomer的Tt-加热下合并，以形成混合物。
43.根据权利要求44所述的方法，其还包括：
(c)将所述混合物成形成形状、面积或体积。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其还包括：
(d)通过注射或植入将所述混合物共同给药到所述受试者。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述混合物在高于所述Fractomer的Tt-加热的温度下形成固体聚集体。
46.一种试剂盒，其包含重组的部分有序多肽(Fractomer)，以及用于合并的容器、用于特定体积维度的模具或用于脂肪组织抽吸和/或给药的工具中的一者或多者。
47.治疗有效量的重组的部分有序多肽(Fractomer)和治疗有效量的脂肪组织用于在有需要的受试者中进行自体脂肪移植的用途。
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