JPH01500199A - 創傷の治癒および骨の再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷の治癒および骨の再生 発明の背景 本発明はＡｎｔｏｎｉａｄｅｓらの米国特許出願Ｎｏ．９３０．７６２号：発明 の名称「外傷の治癒（Ｈｅａｌｉｎｇ　Ｅｘｔｅｒｎａｔ　Ｗｏｕｎｄｓ）Ｊ　 ：出願臼１９８６年１１月１４日の一部継続出願であり、その内容も参照により 本明細書に含まれている。

本発明は創傷の治癒に関する。

成長因子類は、特定の標的細胞集団を刺激するポリペプチドホルモンである。成 長因子の例には、血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）　、インシニリン様成長因 子（ＩＧＦ−１）、）ランフホーミング成長因子（ＴＧＦ−β）、上皮性成長因 子（ＥＧＦ）　、および繊維芽成長因子（ＦＧＦ）がある、ＰＤＧＦは、血流中 の血小板の顆粒中に見出される、カチオン性の熱安定性蛋白質であり、繊維芽ａ ｈａのｉｎ　ｖｉｔｒｏ蛋白質合成およびコラーゲンの生産を刺激することが知 られている。この因子は、また繊維芽細胞、平滑筋細胞およびダリア細胞の１ｎ ｖｉ　ｔｒｏでの細胞分裂および化学遊走因子としての作用も持つことが知られ ている。

ＰＤＧＦをｉｎ　ｖｉｖｏの創傷治癒に用いることは既に提案されている０例え ば、Ｇ　ｒ　ｏ　ｔ　ｅ　ｎ　ｄ　ｏ　ｒ　ｓ　ｔ（１９８４）　Ｊ、Ｔｒａｕ ｍａ２４　：　５４９−５２　には、コラーゲンゲルで含浸させそしてラットの 胃中に移植したＨｕｎｔ　Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ金網チャンバーにＰＤＧＦを加え たところ、新たに合成されるコラーゲンの量が増加したことが記載されている。

しかしながら、Ｌｅ５ｔｚｅｌ　らｙ　（１９８５）　Ｊ　、Ｄ　ｅ　ｒ　ｍ　 ａ　ｔ　ｏ　Ｉ　、Ｓｕｒｇ−Ｏｎｃｏｌ、１１＝６１７　２２によれば、ＰＤ ＧＦを単独またはＦＧＦおよびＥＧＦと組み合わせて用いたとき、ハムスターの 通常のｇＩ傷の治癒を促進することはできなかった。

Ｍ　ｉ　ｃ　ｈ　ａ　ｅ　Ｉ　ｉら（１９８４）は、［柔軟および硬質組織の修 復（Ｓｏｆｔ　ａｎｄ　Ｈａｒｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｐａｉｒ）、１　（Ｈｕ ｎｔ、Ｔ、に、ら編集）、Ｐｒａｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨー ク。

３８０〜３９４頁）において、血小板リッチプラズマから得た部分精製ＰＤＧＦ ＩＩ！ｌ物を家兎の角膜に移植したとき、脈管形成を刺激したことを報告してい る。ＰＤＧ成効果に関与したものと示唆している。

λＩ旦叉尤 一般に、本発明は、その−態様において、創傷に有効量の精！ＩＰＤＧＦおよび 精製ＩＧＦ−１を含む組成物を適用して、哺乳類、例えばヒト患者の外傷を治癒 する技術に関する。この組成物は、少なくともその一部において、上皮組織およ び結合組織の増殖および全蛋白質およびコラーゲンの合成を刺激することにより 、創傷の治癒に寄与する０本発明の組成物を用いた創傷の治癒は、そのような治 療を行わないとき（即ち、外部からの薬剤を用いない時）または純粋なＰＤＧＦ のみまたは純粋な■ＧＦ−Ｉのみを用いたときに比べて、一層効果的である。

他の態様において、本発明は患者の傷ついた若しくは折れた骨の区域に、純化Ｐ ＤＧＦおよび純化Ｉ　ＧＦ−１を含む本発明の組成物の有効量を塗布することに より適用して、哺乳類、例えばヒト患者の骨を再生する技術に関する。この組成 物は、少なくともその一部において、結合組織、骨およびセメント質の増殖およ び全蛋白質およびコラーゲンの合成を刺激することにより、創傷の治癒に寄与す る８本発明の組成物を用いた骨の再生は、そＧＦ−１のみを用いたときに比べて 、−Ｆ！ｔＪｈ果的である。

上記両態様の何れにおいても、本発明の好ましい態様では、組成物は薬学的に許 容される担体物質、例えば市販の不活性ゲルまたは溶液（例えば、アルブミンま たはメチルセルロースを添加した塩類液）中で、精ｉＷＰ　ＤＧＦおよびＩＣＦ −１（両者ともに市販品として入手可能である）を混合して、製造される。最も 好ましくは１．精製ＰＤＧＦおよびＩＧＦ−１は、重量対重量比で、１：４ない し２５：１、好ましくは１：２ないし１０：１、そしてより好ましくはｌ：１ま たは２：１で混合される。

ｔｉ製ＰＤＧＦおよびＩ　ＧＦ−１はヒト血小板から、または組換えＤＮＡ技術 でえられるであろう、従って、ＰＤＧＦおよびＩ　ＣＦ−１の用語は、哺乳類、 好ましくは霊長類の面小板または遺伝子組換え材料から由来した両方を意味し、 最も好ましくは、霊長類は人類であるがチンコードするＤＮＡ配列を挿入し、次 いで翻訳されたサブユニットを細胞で処理してえられたヘテロダイマーでもよく 、あるいは、サブユニットの一方のみ（好ましくはベータもしくは「２」チェー ン）をコードするＤＮＡを細胞に挿入し、これを培養してホモダイマーのＰＤＧ Ｆ（ＰＤＧＦ−１もしくはＰＤＧＦ−２ホモダイマー）を製造してもよい。

本発明において精製という用語は、他の成分と混合する前に重量で９５％以上が ＰＤＧＦまたはＩＧＦ−Ｉであり、即ち天然に付随する他の蛋白質、脂質および 炭水化物が実質的に存在しないことを意味する。

精製蛋白質ａｉｉｉ物は、一般にポリアクリルアミドゲル上でＰＤＧＦまたはＩ 　ＧＦ−１の各サブユニットに対して一本のみの主要バンドを与える。最も好ま しくは、本発明の組成物中に用られる精製ＰＤＧＦまたはＩ　ＧＦ−■はアミノ 末端アミノ酸配列分析で判定したとき、純粋なものである。

本発明の組成物は、哺乳類の外傷、例えばＲ疹、裳傷および火傷の治癒のための 、迅速且つ有効な方法を提供する。この組成物は、自然治癒１ち外から薬剤を与 えないとき）または純粋ＰＤＧＦまたはＩ　ＣＦ−Ｉのみに比較して結合組織の 形成を増強する。純粋ＰＤＧＦのみと異なり、この組成物は新たな結合組織を約 ２５０％増大し、上皮組織の増殖を約９５％増大する。得られる上皮層は自然治 癒に比べて厚いだけでなく、それを新たな結合組織と結合するための上皮突起（ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）をより多く含み、従って一層し っかり結合し、創傷の防護効果も大きい。さらに傷の発生のおそれも少ない。

本発明の組成物は、哺乳類例えば歯根膜病の経歴のあるヒトの結合組織および骨 の再生のための、迅速且つ有効な方法を提供する。この組成物は自然治癒（即ち 外から薬剤を与えないとき）または純粋ＰＤＧＦまたはＩＧＦ−Ｉのみに比較し て結合組織および骨の形成を増強する。

本発明の他の態様および利点は、好ましい態様に基づく以下の記載および生弊請 求の範囲から明らかにされる。

ましいｆｉ筆の 好ましい態様について、説明する。

本発明によれば、精製ＰＤＧＦおよび［ＧＦ−１の組合せで製造されたＰＤＧＦ ／Ｉ　ＧＦ−１混合物を用いて、外傷、例えば￥ＲＭおよび火傷が治療され、そ して骨および結合組織が再生される。ＩＧＦ−１はＡ　ｍ　ｇ　ｅ　ｎ社（サウ ザンド　オースク、カリホルニア）およびＫａｂｉ社（スウェーデン）から市販 されている。精製組換えＰＤＧＦおよびヒト血小板から由来する精！Ｐ　ＤＧ　 Ｆは、ＰＤＧＦ社（ホスト：／、　１”ｊｆ工４ｘ　ｙツ＞　、Ｃｏ　１１　ａ ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社（ウォルサム。

マサチェセフッ）およびＡｍｇｅｎ社（サウザンドオースク、カリホルニア）か ら市販されている。精ＮＰＤＧＦは次のようにして１１壓することも可能である ：洗浄したヒト血小板ベレ７）５００ないし１０００単位をＩＭＮａＣｌ（血小 板単位あたり２−）に懸濁し、１００℃で１５分間加熱する。上滑を遠心分離で 分離し、沈澱をＩＭＮａＣｌで抽出する。

抽出物を合わせ、０．０８Ｍ　ＮａＣ１−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバフファ ー（ｐＨ７，４）に対して透析し、このバッファーて平衡化したＣＭ−セファデ ックスＣ−５０と４℃で一夜混合する０次いでこの混合物をカラム（５Ｘ１００ ｃｍ）に注入し、０．０８Ｍ　ＮａＣｔ−ｏ−０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ ー（ｐＨ７゜４）で充分に洗浄し、ＩＭＮａＣｌで溶出しそして１０　ｍｌｌシ ラシ２ンずつに回収する。

活性フラクシｉンをプールし、０．３ＭＮａＣ１−〇、ＯＩＭリン酸ナトリウム バッフｙ−（ｐＨ７，４＞に対して透析し、遠心分層し、０．３Ｍ　ＮａＣ１− ０゜０１Ｍリン酸ナトリウムバフファー（ＰＨ７，４）で平衡化した２−５Ｘ２ ５ａｓのブルーセファロース（Ｐｈａｒこの部分精製ＰＤｃ；ＦフラクシＩンを ＩＭＮａＣｌで１＝１希釈し、１Ｍ酢酸で透析し、そして凍結乾燥する。凍結乾 燥サンプルは０．８Ｍ　ＮａＣｌ−０，０１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（Ｐ Ｈ７，４）に溶解しそして同バフファーで平衡化した１、２Ｘ４０ｃｎのＣＭ− セファデックス　Ｃ−５Ｏカラムに通過させる０次いでＰＤＧＦをＮａＣ１勾配 （０，０８ないしＩＭ＞で溶出００ｃｍのバイオゲル　Ｐ−１５０（１００ない し２００メフシエ）のカラムにのせる０次いでＰＤＣ；Ｆを１Ｍ酢酸で溶出し、 ２−ずつのフラクシｌンにして回収する。

１００ないし２００■の蛍白質を含む各活性フラクシ替ンを凍結乾燥し、１００ ｍ１の０．４％トリフルオロ酢酸に溶解し、フェニルボンダバックカラム（Ｗａ ｔｅｒｓ社）による逆相高性能液体クロマトグラフィーに付する。アセトニトリ ルの直線勾配（０ないし６０％）により精１１ＰＤＧＦが得られる。

組換えＤＮＡ技術でのＰＤＧＦは、次のようにして調製される： ヒト血小板から得られる血小板由来成長因子（Ｐ　ＤＧＦ）は二種のポリペプチ ド配列（ＰＤＧＦ−１およびＰＤＧＦ−２ポリペプチド）を含む（Ａｎｔｏｎｉ ａｄｅｓ、Ｈ，Ｎ、およびＨｕｎｋａ　ｐ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅ　ｒ、　Ｍ、（１９ ８３）Ｓｃｆｅｎｃｅ、−２２０＝９６３　９６５）。

ＰＤＧＦ−１はクロモシーム７中に存在する遺伝子によりコードされ（Ｂｅｔｓ ｈｏｌｔｚ、Ｃｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３２０　＝　６９５−６９９）　、そして ＰＤＧＦ−２はクロモシーム２２　（Ｄａｌ　Ｉａ−Ｆａｖｅｒａ、Ｒ。

（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１８：６８６−６８８）中に存在するｓｉｓオ ンコジーン（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ。

Ｒ９ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２１：２７’５−２７７）によってコード される＊　ｓｉｓ遺伝子はサル肉腫ウィルス（Ｓｉｍｉａｎ　Ｓａｒｃｏｍａ　 ＶｉｒｕＳ：以下ＳＳｖという）の形質転換蛋白質をコードしており、この蛋白 質はＰＤＧＦ−２ポリペプチドにｖＭ接に関係している。ヒト細胞ｃ−ｓｉｓも またＰＤＧＦ−２鎖をコードする（Ｒａ　ｏ、Ｃ，Ｄ、ら（１９８６）Ｐｒｏｃ 、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８３　：　２３９２−２３９６ ）、これら二種のＰＤＧＦのポリペプチド鎖は、別のクロモシームに存在する異 なる遺伝子によりコードされるので、ヒトＰＤＧＦはＰＤＧＦ−１およびＰＤＧ Ｆ−２のジスルフィド結合したヘテロダイマーからなるか、鵞たは二種のホモダ イマー（ＰＤＧＦ−１のホモダイマーおよびＰＤＧＦ−２のホモダイマー）の混 合物からなるか、または上記ヘテロダイマーと二種のホモダイマーの混合物より なる可能性がある。

ＰＤＧＦ−２１１をコードする遺伝子を含むｓｓｖで感染した培養中の哺乳類細 胞は、ＰＤＧＦ−２ポリペプチドを合成しそしてそれをジスルフィド結合したホ モダイマーに加工することが知られている（Ｒｏｂｂｉｎｓ。

Ｋ、ら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０５：６０５　６０８）、さらに、ＰＤＧ Ｆ−２ホモダイマーは、ヒトＰＤＧＦに対して調製した抗血清と反応する。さら にまた、分泌されたＰＤＧＦ−ホモダイマーの機能的性質は、培養中の繊維芽細 胞のＤＮＡ合成を刺激する点、１８５ｋｄの細胞膜蛋白質のチロシン残基でのホ スホリル化を誘発する点および特異的細胞表面ＰＤＧＦリセブターとの結合に関 してヒト（”’Ｉ）−ＰＤＧＦと競合する能力を有する点で、血小板由来ＰＤＧ Ｆのそれと類似している（Ｏｗｅｎ、Ａ、ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、、２ ２５：５４−５６）、同様な性質は、培養正常ヒト細胞（例えばヒト動脈内皮細 胞）からのｓ　ｉ　ｓ　／　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ−２遺伝子生成物について、または ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２発現ヒト悪性細胞からの生成物についても示されているｃ ｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ、３：１４５−１５１）。

組換えＰＤＣＦ−２ホモダイマーは、ｃ−ｓｉｓ／ＰＤＧＦ−２遺伝子のクロー ンを発現ベクターを用いてマウス細胞に導入して得ることができる。この発現に 用いるｃ−ｓｔｓ／ＰＤＧＦ　２クローンは、正常ヒト培養上皮細胞からえられ る（Ｃｏ　１１　ｉ　ｎｓ、　Ｔ、ら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ、２１６：７ ４８−７５０）。

１１旦亙１ 創傷の治癒を促進するために、ＰＤＧＦ／Ｉ　ＧＦ−１混合物の有効性を調べる ため、次の実験を行った。

体重１０ないし１５ｋｇの幼若白色ヨークシャ一種の豚（Ｐａｒｓｏｎ’　ｓ　 Ｆａｒｍ、／％ドレイ、マサチュセフッ）を手術前に少な（とも６時間絶食させ 、次いで麻酔した。睡眠条件下で背中および首の部分を刈り、剃り、そして穏や かな石鹸および水で洗浄した０次いで、外傷を付する部分を７０％アルコールで 消毒した。

１ｃＩｍ×２Ｃ１１の大きさの傷を深さ０．５ｍｍに作るため、改良カストロビ ーヨエレクトロケラトーム（Ｃａｓｔｒｏｖｉｅｊｏ　ｅｌｅｃｔｒｏｋｅｒａ ｔｏｍｅ）（Ｓｔｏｒｚ製、セントルイス、ミズーリをＢｒｏｗｎｅｌｍｓ、Ｉ ｎｃ、で改良したもの）を用いた。この１ｊ４傷は上皮の完全な除去およびその 下層の真皮の部分的除去をもたらした（第２度の火傷に相当する）、各創傷は少 なくとも１５ｍ５の健全皮膚により隔てた。同一の治療を受ける創傷はグループ にまとめ、他のグループから少なくとも３ａ１１隔てた。成長因子での治療を受 けない創傷は、治療を受けるグループから少なくとも１０ｃｍＦｉてた。

創傷は、生物学上許容されるゲルに分散した次の成長因子での一回の塗布により 、直接処置した：　１）５００ｎｇｋ粋Ｔ＝トＰＤＧＦ　（高性能液体クロマト グラフィーで精製したもの）または組換えＰＤＧＦのみ＝２）各々次ｒ：（ｃ） ５００ｎｔのＩＧＦ−１゜ 創傷の付与に続いて、３日目から１００日目かけて、生検標本を採取した０組織 学的評価のための生検標本は、深さ約３−−の楔状で採取し、１０％ホルマリン に保存した。生物化学的分析およびオートラジオグラフィーのための標本は、エ レクトロケラドームを用いて採取した。

標本の最終寸法は１．　５ｍｍＸ　Ｉ　Ｏ＊ｍＸ　１．５ｓｕ＋？ア−ｚり。

生物化学的分析用には創傷当たり３つの標本を採取し、オートラジオグラフィー 用には創傷当たり２つの標本を採取した。標本は採取した後、冷却したイーグル 修正基本培地（ＥＭＥＭ）にｌθ％仔牛血清を添加した培地に保存した。生検標 本は、次のように分析した。

オートラジオグラフィー 生検標本を１５μＣｉ　／　１ｎｌの３Ｈ−チミジンを含む０゜３−のイーグル 修正基本培地（ＥＭＥＭ）＋　１０％牛脂児血清で１時間インキュベートシ、そ の標本を次いで１および包埋技術を用いて、標本から４ミクロンの切片を切り出 した。これを次に脱パラフィンして、ヌクレア・トラクト・エマルジ２ン（Ｎｕ ｃｌｅａｒ　Ｔｒａｃｔｅｍｕ　１　ｓ　ｉ　ｏ　ｎ）　ＮＴＢ　−２（コダッ ク社）に浸漬し、２週間暴露した。続いてこれを現像しヘマトキシリンおよびエ オシンで染色した。

染色標本のオートラジオダラムを記録し、標識された（細胞膜たり５以上の粒） 細胞の全数を等しく分布する点で数えることにより点数付けした。

１１１煎且】 組織学的検討の標本は標準的パラフィン含浸および包埋技術を用いて調製した。

４ミクロンの切片を作り、予め濾過したハリス・ヘマトキシリンおよびアルコー ル性エオシンで染色し、その後顕微鏡で観察した。全ての標本において、２人の ａ富者が切片の均一分布点で別個に点数をつけた。上皮組織層および結合組織層 の幅は、顕微鏡の接眼レンズ内に置いたグリッドを用いて測定し、その結果を同 じ条件で観察したミクロメーターの結果と比較して、−驕に換算した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏの 生検標本を、０．　３ｍｆｆ１のＥＭＥＭ＋　１０％牛脂児血清、１５　μｃｔ ／ｍ（Ｄ　３Ｈ−チミジンおよび５　ｕ　Ｃｉ／　ｒｎｌ　（０１４Ｇ−ロイシ ンを含む個別の試験管へ移し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベ ート時間の終了後、培地を除去し、０．５ｍｌの冷５％過塩素酸を加えて組織の 代謝を停止させた０次に、この標本を細かく砕き３回洗浄し、得られた沈澱を０ ．５ｍｌの１４−８Ｍ水酸化アンモニウムに再懸濁し、超音波で破砕した。超音 波処理の後、標本を密閉試験管内で４５℃で１６ないし２４時間インキユベート シ、再度超音波処理し、クロスチャンネルカウンティングでの標準的液体シンチ レーシタン法ヲ用いて、放射活性を測定した。

ＤＮＡおよび　白　の、 ＤＮＡの測定は、Ｌａｂａｒｃａら（１９８０）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ２０：３４４　５２の方法を修正した方法で行った。濃厚水酸化アンモニウム中 の組織抽出物の５０パを、ＩＭのリン酸ナトリウムおよび２Ｍの塩化ナトリウム を含む４００ｄのバフファー溶液（ｐｎ？−０）に加え、生じた溶液の州をＨＣ Ｉで７．４に調整した。その後、州を７．４に保持したままで最終溶液量を５０ ０．１とした。次にこの溶液を、ヘキスト色素（ＨｏｅｃｈｓＬ　ｄｙｅ）（１ ，１４ｍｇ／ｍｆｆ１）を含むバッファー溶液（０，０５Ｍリン酸ナトリウム、 ２Ｍ塩化ナトリウム、　ＰＨ−７−４）　２．　５ｍｊ！に添加した。励起波長 ３５２ｎｗで蛍光を誘発し、４５４ｄｍで発光の強さを測定した。標準曲線を得 るためには、同様の処理を施した仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。

ｓＰＬ水酸化アンモニウム中の組織抽出物の蛋白質含量は、ブラッドフォード法 （Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２：２４８− ５４）によりウシ血清アルブミンを標準物として測定した。

葭基 組織学的評価からの結果は、精製ヒ）　ＰＤＧＦまたば組換えＰＤＧＦとＩＧＦ −１との組合せで処置された創傷は、治療をうけなかった創傷、純粋ＩＧＦ−Ｉ 、純粋ＰＤＧＦによる治療を受けた創傷、または他の成長因子と組み合わせたＰ ＤＧＦによる治療を受けた創傷に比べて、結合組織および上皮層が厚く、且つよ り多くの上皮突起がこれらの層を結合していることを示した。処置の後６週間目 まで、傷の発生の兆候は認められなかった。

オートラジオグラフィーによれば、ＰＤＧＦ／ＩにＦ−■で処置した創傷におい て、無処置、ＰＤＧＦのみまたはＩＣＦ−１のみの処置の１！１ｍよりも３Ｈ− チミジン標識細胞の比率の増加が見られた０代謝標識の結果は、３Ｈ−チミジン および１４ｃ−ロイシンの取込みは、精！１ＰＤＧＦ／ＩＣＦ−１１１！ｌ物で 処置した創傷において、無処置の創傷よりも大きいことを示し、同様にＰＤＧＦ ／ＩＣＦ−１処置創傷はＤＮＡおよび蛋白質含有量も多かった。

前記の様にしてｒＩＲ１１シた組換え精＠ＰＤＧＦ−２ホモダイマーも、単独ま たはＩＧＦ−１と組み合わせて、部分厚さの皮膚創傷に試験した。６日目の創傷 の組織学的分析によれば、ＰＤＧＦ−２またはＩ　ＧＦ−Ｉのみの投与は、結合 組織の形態または上皮の形態に関して対照との有意な相違が無かった。しかしな がら、ＰＤＧＦ−２をＩＧＦ−１と組み合わせると、手術の６日後に新たな結合 組織層の幅の２．０倍の増加および上皮の厚さの２０％の増加をもたらした。９ 日目には、ＰＤＧＦ−２のみでは新たな結合組織および上皮厚さのいずれにも２ ２％の増加をもたらした。Ｉ　ＣＦ−Ｉと組み合わせたＰＤＧＦ−２は、新結合 組織および上皮層の両者に７５％の増加をもたらした。ＰＤＧＦ−２／ＩＧＦ− １処置の創傷は明確な光の偏光領域を有し、このことから、この創傷がＰＤＧＦ −２単独措置または治療無しの創傷に比して一層成熟した結合組織を有すること が示された。

従って、上記の動物モデルを用いた組換えＰＤＧＦ−２の創傷への適用は、精製 ヒトＰＤＧＦを組換えＩＧＦ−１と組み合わせたときと同様の結果を与えた０組 換えＰＤＧＦ−２およびＩ　ＣＦ−１の組み合わせは、新たな繊維芽細胞の数お よびコラーゲン合成速度の劇的な増加をもたらし、治療を行わなかった動物また は組換えＰＤＧＦ−２またはＩＧＦ−１単独処置に比べて、真皮および表皮の増 生（２，５倍の総増加）を伴った。

これらの結果は、組換えＰＤＧＦ−２ホモダイマーおよび天然精製しトＰＤＧＦ の両者は、ＩＧＦ−１とともに創傷に局所投与したとき、相乗的に相互作用する ことを示唆する。

厭Ｉ ｎ製ＰＤＧＦの適当な用量を決定するため、上記実験を繰り返したが、創傷の１ ＩＩＩ１２あたり、生物学的に許容されるゲル３０パ中に分散した２、５Ｈｇ１ ５．Ｏｎｇ、およびＩＯｎｇのＰＤＧＦ　（精１１ＰＤＧＦに換算して）で創傷 を治療した。その結果、最適効果はＰＤＧＦ含量が５゜Ｏｎｇ／ｓ＋■２または それ以上のときに得られた。

精製ＰＤＧＦ＋　Ｉ　ＧＦ−Ｉの適当な用量を決定するため、ＰＤＧＦとＩＣＦ −１の重量対重量比が、１：１０ないし２５：ｌの範囲の組み合わせを上記のよ うにして評価した。最適の結果は、比率が１：ｌおよび２：１のときに得られた 。

１弘五ユ ＰＤＧＦ／ＩＧＦ−１調製物が歯根膜および／または骨の増殖を促進する効果を 調べるため、次の実験を行った。

先ず最初に、自然に歯根膜の病気を生じたピーグル犬を、放射線写真検査で選別 した。３０％ないし８０％の骨の消失を認めたものにつき、最初に超音波装置で 歯石を取り除いた。外科的皮膚弁および根面平滑化外電を施に精１１ＰＤＧＦお よびＩＧＦ−１を含有する組成物で治療した。４分の１の歯には、コントロール ゲルのみまたは精！１ＰＤＧＦのみまたはＩ　ＧＦ−１のみを適用した。

出および骨のブロック生検標本は、手術後２週間で採取し、標準的な脱鉱物質お よび処理法を用いて組織学的検討を行う準備をした。

ｙし羽 歯根膜および骨標本の組織学的分析の結果は、実験標本（即ち、ＰＤＧＦ／Ｉ　 ＧＦ−１の組み合わせで処置したもの）の歯根表面に隣接して、新たな骨形成の 明確な領域が存在しており、そしてこの新生骨に隣接する歯根表面上にセメント 質に類似する沈着物が存在した。新生骨は標本の骨膜表面にも存在し、靭帯の根 尖延長部分に歯強直の領域が生じた。骨芽様細胞の厚い層および結合組織が新た に生成されたセメント質の中に入るコラーゲン繊維とともに新生骨の裏を覆って いた。

コントロール標本においては、新たな骨の生成の証拠は認められず、新規セメン ト質様沈着物は存在せず、結合組織は骨の表面に垂直に並び、元の骨を覆うキャ ップを形成するように見えた。従って、この結果は本発明のＰＤＧＦ／Ｉ　ＧＦ −Ｉ組成物は骨形成および結合組織応答を増強することを示した。

他の態様は、請求の範囲内である。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血小板由来の精製された成長因子および精製されたインシュリン様成長因子 を含む組成物の創傷治療有効量を外傷部に適用することよりなる、哺乳類動物の 外傷を治療する方法。 ２．血小板由来の精製された成長因子およびインシュリン様成長因子を含む組成 物の創傷治療有効量を投与することよりなる、哺乳類動物の骨を再生させる方法 ・３．組成物中の血小板由来の成長因子対インシュリン様成長因子の重量対重量 比が、１：４ないし２５：１の間にある、請求項１または２記載の方法。 ４．比率が１：２ないし１０：１である請求項３記載の方法。 ５．比率が約１：１または２：１である請求項４記載の方法。 ６．血小板由来の精製された成長因子および精製されたインシュリン様成長因子 を、重量対重量比で１：４ないし２５：１で含む、創傷治癒および骨再生用組成 物。 ７．比率が１：２ないし１０：１である請求項６記載の組成物。 ８．比率が約１：１または２：１である請求項７記載の組成物。 ９．血小板由来の精製された成長因子および精製されたインシュリン様成長因子 を、重量対重量比で１：４ないし２５：１で混合することよりなる、創傷治癒用 組成物の製造方法。