DK175889B1 - Sårheling og knogleregenerering - Google Patents

Description

DK 175889 B1

Den foreliggende opfindelse er baseret på en continuation-in-part, US SN 930 762, indleveret 14. november 1986 af Antoniades et al. med titlen "Hea-5 ling External Wounds”.

Opfindelsen angår heling af sår.

Vækstfaktorer er polypeptidhormoner, som stimulerer en defineret population 10 af target-celler, målceller. Eksempler på vækstfaktorer omfatter blodpladeaf-ledt vækstfaktor (PDGF), insulinlignende vækstfaktor (IGF-I), transformerende vækstfaktor β (TGF-β), epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblastvækst-faktor (FGF). PDGF er et kationisk, varmestabilt protein, der findes i granuler-ne fra cirkulerende blodplader, som vides at stimulere in vitro proteinsyntese 15 og kollagenproduktion af fibroblaster. Den er også kendt for at virke som et in vitro mitogen og kemotaktisk middel for fibroblaster, glatmuskelceller og glial-celler.

Det er blevet foreslået at anvende PDGF til at fremme in vivo sårheling. F.

20 eks. beskriver Grotendorst (1984) J. Trauma 24:549-52 tilsætning af PDGF til Hunt-Schilling trådnetkamre imprægneret med en kollagengel og implanteret i ryggene på rotter; PDGF viste sig at forøge mængden af syntetiseret nyt kollagen. Leitzel et al. (1985) J. Dermatol. Surg. Oncol. 11:617-22 var imid-lertid ikke i stand til at accellerere normal sårheling i hamstere under anven-25 delse af PDGF alene eller i kombination med FGF og EGF.

Michaeli, et al. (1984), ’’Soft and Hard Tissue Repair” (Hunt, T.K. et al., udg.),

Praeger Publishers, New York, side 380-394, rapporterer anvendelsen af et delvist renset præparat af PDGF opnået fra blodpladerigt plasmastimuleret 30 angiogenese, når det blev implanteret i kanincornea. Fordi PDGF ikke er en I

angiogen vækstfaktor, foreslog forskerne, at en ukendt faktor i deres delvist i

I DK 175889 B1 I

I 2 I

I rensede PDGF-præparat var ansvarlig for den angiogene virkning. I

I Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af blodpladeafledt vækstfak- I

I tor og IGF-I ved fremstillingen af et medikament til (a) sårheling og/eller (b) I

I 5 knogleregenerering.

I Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat omfattende blodpladeaf- I

I ledt vækstfaktor og IGF-I. I

I 10 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et farma- I

I ceutisk præparat, hvilken fremgangsmåde omfatter blanding af blodpladeaf-

I ledt vækstfaktor og IGF-I. I

I Opfindelsen angår derudover et produkt indeholdende blodpladeafledt I

I 15 vækstfaktor og IGF-I til anvendelse som kombineret præparat til samtidig, I

I separat eller sekventiel sårheling og/eller knogleregenereringsterapi. I

I Opfindelsen kan således foretrukkent være til hjælp ved heling af ydre sår I

I hos et pattedyr, f. eks. et menneske, ved påføring til såret af en effektiv I

I 20 mængde af et præparat, der indeholder renset PDGF og renset IGF-I. Præ- I

I paratet hjælper med heling af såret, i det mindste delvist, ved at fremme I

I væksten af epithelvæv og bindevæv og syntese af totalprotein og kollagen. I

I Sårheling under anvendelse af præparatet ifølge opfindelsen er mere effektiv I

I end sårheling uden behandling (dvs. uden påføring af exogene midler) eller - I

25 ved behandling med renset PDGF alene eller renset IGF-I alene. I

I Opfindelsen er således til hjælp ved regenerering af knogler hos et pattedyr, I

I f. eks. et menneske, ved til patienten at administrere, foretrukkent ved påfø- I

I ring til det beskadigede område eller den beskadigede knogle, af en effektiv I

I 30 mængde af et præparat, der indeholder renset PDGF og renset IGF-I. Præ- I

I paratet hjælper med regenerering, i det mindste delvist, ved at fremme væk- I

DK 175889 B1 3 i j sten af bindevæv, Knogle og cementum, og ved at stimulere protein- og kol- ; lagensyntese. Regenerering under anvendelse af præparatet ifølge opfindelsen er mere effektiv end den, der opnås uden behandling {dvs. uden påføring af exogene midler) eller ved behandling med renset PDGF alene eller renset 5 IGF-I alene.

Præparaterne ifølge opfindelsen fremstilles foretrukkent ved i en farmaceutisk acceptabel bærer, f. eks. i handelen tilgængelige inerte geler eller væsker (f. eks. saltvand suppleret med albumin eller methylcellulose) at kombi-10 nere renset PDGF og IGF-I (der begge er tilgængelige i handelen). Mest fo-retrukkent kombineres renset PDGF og IGF-I i et vægtforhold på mellem 1:4 og 25:1, foretrukkent mellem 1:2 og 10:1 og mere foretrukkent 1:1 eller 2:1.

Det rensede PDGF og IGF-I kan opnås fra humane blodplader eller ved re-kombinant DNA teknologi. Ved udtrykkene "PDGF" og "IGF-I" menes således 15 såvel blodpladeafledt som rekombinante materialer af pattedyroprindelse, foretrukkent fra primater, særligt foretrukkent fra et menneske, men der kan også tale om en chimpanse eller en anden primat. Rekombinant PDGF kan være rekombinant heterodimer, fremstillet ved indsætning i dyrkede prokaryote eller eukaryote celler af DNA sekvenser, der koder for begge subunits, 20 underenheder, og derpå tillader de translaterede underenheder at blive behandlet af cellerne til dannelse af heterodimer, eller DNA, der koder for netop én af underenhedeme (foretrukkent β-kæden eller "2"-kæden) kan indsættes i celler, som derpå dyrkes til fremstilling af homodimer PDGF (PDGF-1 eller PDGF-2 homodimer).

25

Udtrykket "renset" som anvendt heri refererer til PDGF eller IGF-I, som før blanding med den anden komponent, er 95% eller derover, efter vægt, PDGF eller IGF-I, dvs. er i alt væsentligt fri for andre proteiner, lipider og kulhydrater, med hvilke den er naturligt forbundet.

Et renset proteinpræparat vil almindeligvis givet et enkelt hovedbånd på en 30

DK 175889 B1 I

polyacrylamidgel for hver underenhed PDGF eller IGF-I. Mest foretrukkent er I

den rensede PDGF eller IGF-I anvendt i præparaterne ifølge opfindelsen ren I

som bedømt ved aminoterminal aminosyresekvensanalyse.

5 Præparatet ifølge opfindelsen giver en hurtig, effektiv måde til heling af ydre I

sår hos pattedyr, f. eks. liggesår, flænger og forbrændinger. Præparatet for-

bedrer bindevævsdannelse sammenlignet med naturlig heling (dvs. uden til- I

sætning af exogene midler) eller ren PDGF eller IGF-I alene. Ulig ren PDGF I

alene fremmer præparatet en ca. 250%'s forøgelse i nyt bindevæv og en ca. I

10 95%'s forøgelse i væksten af epithel væv. Det opnåede epithellag er tykkere I

end det, der dannes ved naturlig heling, og indeholder også flere epithelfrem- I

spring, der forbinder det til det nye bindevæv; det er således mere fast bun- I

det og beskyttende. Desuden minimeres ardannelse. I

15 Præparatet ifølge opfindelsen giver også en hurtig, effektiv metode til regene- I

rering af bindevæv og knogler hos pattedyr, f. eks. mennesker, med en peri- I

dontal lidelse. Præparatet forøger bindevævs- og knogledannelse sammen- I

lignet med naturlig heling (dvs. uden tilsatte exogene midler) eller ren PDGF I

eller IGF-I alene. I

20 I

Andre træk og fordele ved opfindelsen fremgår af den efterfølgende beskri- I

velse af foretrukne udførelsesformer derfor samt af kravene. I

Ydre sår, f. eks. liggesår og forbrændinger, behandles, og knogle- og binde- I

25 væv regenereres ifølge opfindelsen med PDGF/IGF-l-blandinger fremstillet I

ved at kombinere ren PDGF og IGF-I. IGF-I er tilgængeligt i handelen fra I

Amgen Corporation (Thousand Oaks, CA) og Kabi (Sverige). Renset rekom- I

binant PDGF og renset PDGF afledt fra humane blodplader er tilgængeligt i I

handelen fra PDGF, Inc. (Boston, MA), collaborative Research (Waltham, I

30 MA), og Amgen Corp. (Thousand Oaks, CA). Renset PDGF kan også frem- I

stilles som følger: DK 175889 B1 5 500-1000 enheder vaskede humane blodpladepellets suspenderes i 1 M NaCI (2 ml pr. blodpladeenhed) og opvarmes ved 100 °C i 15 minutter. Den overliggende væske eller supernatanten adskilles derpå ved centrifugering, og bundfaldet ekstraherés to gange med 1 M NaCI.

5

Ekstrakterne kombineres og dialyseres mod 0,08 M NaCI -0,01 M natrium-phosphatpuffer (pH 7,4) og blandes natten over ved 4 °C med "CM-Sephadex® C-50" bragt i ligevægt med pufferen. Blandingen hældes derpå på en søjle (5 x 100 cm), vaskes ekstensivt med 0,08 M NaCI - 0,01 M na-10 triumphosphatpuffer (pH 7,4) og elueres med 1 M NaCI, idet der opsamles 10 fraktioner.

Aktive fraktioner samles og dialyseres mod 0,3 M NaCI -0,01 M natrium-phosphatpuffer (pH 7,4), centrifugeres og passeres ved 4 °C gennem en 2,5 15 x 25 cm søjle af blå "Sepharose®" (Pharmacia) bragt i ligevægt med 0,3 M NaCI - 0,01 M natriumphosphatpuffer (pH 7,4). Søjlen vaskes derpå med pufferen, og delvist renset PDGF elueres med en 1:1 opløsning af 1 M NaCI og ethylenglycol.

20 De delvist rensede PDGF fraktioner fortyndes (1:1) med 1 M NaCI, dialyseres mod 1 M eddikesyre og lyophiliseres. De lyophiliserede prøver opløses i 0,8 M NaCI - 0,01 M natriumphosphatpuffer (pH 7,4) og passeres gennem en 1,2 x 40 cm søjle af ”CM-Sephadex® C-50" bragt i ligevægt med pufferen. PDGF elueres derpå med en NaCI-gradient (0,08 til 1 M).

25

De aktive fraktioner kombineres, dialyseres mod 1 M eddikesyre, lyophiliseres og opløses i et lille volumen 1 M eddikesyre. Portioner på 0,5 ml påføres en 1,2 cm x 100 cm søjle af "Biogel® P-150" (100 til 200 mesh) bragt i ligevægt med 1 M eddikesyre. PDGF elueres derpå med 1 M eddikesyre, mens 30 der opsamles fraktioner på 2 ml.

______________.1

I DK 175889 B1 I

I 6 I

I Hver aktiv fraktion indeholdende 100 til 200 mg protein lyophiliseres, opløses I

I i 100 ml 0,4%'s trifluoreddikesyre og underkastes omvendt faset HPLC på en I

I phenyl-"Bondapak"-søjle (Waters). Eluering med en lineær acetonitrilgradient I

I (0 til 60%) giver ren PDGF. I

I 5 I

I PDGF fremstilelt ved rekombinant DNA-teknologi kan fremstilles som følger:

I Blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) afledt fra humane blodplader indeholder I

I 2 polypeptidsekvenser (PDGF-1 og PDGF-2 polypeptider, Antoniades, H.N. I

I 10 og Hunkapiller, M. (1983) Science 220:963-965). PDGF-1 kodes for at gen I

I lokaliseret i kromosom 7 (Betsholtz, C. et al., Nature 320:695-699). og I

I PDGF-2 indkodes af sis-oncogen (Doolittle, R. et al., (1983) Science I

I 221:275-277) lokaliseret i kromosom 22 (Dalla-Favera, R. (1982) Science I

I 218:686-688). Dette sis-gen koder for det transformerende protein af Simian I

I 15 Sarcoma Virus (SSV), som er nært beslægtet med PDGF-2 polypeptid. Det I

I humane cellulære c-sis koder også for PDGF-2-kæden (Rao, C.D. et al I

I (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2392-2396). Fordi to forskellige gener I

I lokaliseret i separate kromosomer koder for de to polypeptidkæder af PDGF, I

I eksisterer der den mulighed, at human PDGF består af en disulfid sammen- I

I 20 kædet heterodimer af PDGF-1 og PDGF-2 eller en blanding af de to homo- I

I dimere (homodimer af PDGF-1 og homodimer af PDGF-2) eller en blanding I

I af den heterodimere og de to homodimere. I

I Pattedyrceller i kultur inficeret med SSV, som indeholder genet kodende for I

I 25 PDGF-2-kæden, viste sig at syntetisere PDGF-2 polypeptidet og give det i I

I form af en disulfid-bunden homodimer (Robbins, K. et al. (1983) Nature I

I 305:605-608). Desuden reagerer PDGF-2 homodimer med antisera dannet I

I mod human PDGF. Endvidere er de funktionelle egenskaber af den sekrete- I

I rede PDGF-2 homodimer svarende til egenskaberne for blodplade-afledt I

I 30 PDGF derved, at den stimulerer DNA syntese i dyrkede fibroblaster, den in- I

I ducerer phosphorylering ved tyrosinresten pået 185 kd cellemembranprotein, I

DK 175889 B1 7 og den er i stand til at konkurere med human (125I)-PDGF om binding til specifikke celleoverflade PDGF receptorer (Owen, A. et al. (1984) Science 225:54-56). Tilsvarende egenskaber blev vist for sis/PDGF-2 genproduktet afledt fra dyrkede normale humane celler (f. eks. humane arterielle endotheli-5 alceller) eller fra humane maligne celler, der udtrykker sis/PDGF-2-genet (Antoniades, H. et al (1985) Cancer Cells 3:145-151).

Den rekombinante PDGF-2 homodimere opnås ved indføring af cDNA kloner af c-sis/PDGF-2 gen i museceller under anvendelse af en ekspressionsvek-10 tor. c-sis/PDGF-2 klonen anvendt til udtrykkelse blev opnået fra normale humane dyrkede endothelialceller (Collins, T., et al. (1985) Nature 216:748-750).

Sårheling 15

For at bestemme effektiviteten af PDGF/IGF-l-blandinger til at fremme sårheling blev følgende eksperimenter foretaget.

Unge hvide Yorkshire-svin (Parson's Farm, Hadley, MA) med en vægt på 20 mellem 10 og 15 kg blev fastet i 6 timer før kirurgi og derpå bedøvet. Under aseptiske betingelser blev ryg- og brystarealeme klippet, barberet og vasket med mild sæbe og vand. Området, der skulle forsynes med sår, blev derpå desinficeret med 70%'s alkohol.

25 Sår med en størrelse på 1 x 2 cm blev indført ved en dybde på 0,5 mm under anvendelse af en modificeret Castroviejo elektrokeratom (Storz, St. Louis, MO, som modificeret af Brownells, Inc.). Sår resulterende i komplet fjernelse af epithelet såvel som en del af den underliggende hud (sammenlignelig med en andengradsforbrænding). Individuelle sår blev adskilt med mindst 15 mm 30 usåret hud. Sår, der modtog identisk behandling, blev arrangeret som en gruppe og adskilt fra andre grupper med mindst 3 cm. Sår, der ikke modtog _______ ... __i I DK 175889 B1 nogen vækstfaktorbehandling, blev adskilt fra sår, der modtog sådan behandling, med mindst 10 cm.

Sårene blev behandlet direkte med en enkel påføring af følgende vækstfakto-5 rer suspenderet i bioacceptabelt gel: 1) 500 ng ren human PDGF (renset ved HPLC) eller rekombinant PDGF alene, 2) 500 ng ren PDGF i kombination med hver af følgende: a) 500 ng EGF, b) 500 ng EGF plus 500 ng IGF-I, c) 500 ng IGF-I.

10 Efter såring blev der taget biopsi-prøver på dag nummer 3 til og med nummer 10. Biopsi-prøver for histologisk bedømmelse blev taget som kiler ca. 3 mm dybe og anbragt i 10%’s formalin. Prøver for biokemisk analyse og autoradiografi blev opnået under anvendelse af en elektrokeratom. De endelige definitioner af prøverne var 1,1 mm x 10 mm x 1,1 mm. Tre prøver pr. sår 15 blev samlet for biokemisk analyse, mens der blev samlet to prøver pr. sår for autoradiografi. Efter samling blev prøverne opbevaret i koldt Eagle's Modified Essential Medium (EMEM) suppleret med 10% føtal kalveserum. Biopsi-prøverne blev analyseret som følger.

20 Autoradioarafi

Biopsi-prøver blev inkuberet i 0,3 ml Eagle's Modified Essential Medium (EMEM) plus 10% føtal kalveserum indeholdende 15 pCi/ml 3H-thymidin i 1 time. Prøverne blev derpå vasket to gange med 10%'s formalin. Fire pm (mi-25 kron) sektioner blev foretaget fra prøverne under anvendelse af standardpa-rafinimprægnerings- og indlejringsteknik. De blev derpå deparafineret, dyppet i "Nuclear Tract emulsion NTB-2" (Kodak), og eksponeret i 2 uger. Dernæst blev de fremkaldt og farvet med hæmotoxylin og eosin.

30 Autoradiogrammer af de farvede prøver blev optegnet og talt som ens fordelte punkter ved tælling af det totale antal mærkede celler (5 korn eller mere pr.

DK 175889 Βϊ 9 celle) mod det totale antal celler i området.

Histologisk bedømmelse 5 Histologiske prøver blev fremstillet under anvendelse af standardparafinim-prægnerings- og indlejringsteknik. Fire mikronsektioner blev fremstillet og farvet under anvendelse af filtreret Harris-hæmotoxylin og alkoholisk eosih.

De blev iagttaget under et mikroskop. Alle prøver blev bedømt blindt af to forskere med ensartet fordelte points under sektionerne. Bredden af epithel-10 og bindevævslagene blev bedømt under anvendelse af et net anbragt i mi kroskopets okular. Målingen blev derpå overført til millimeter under anvendelse af et mikrometer set under samme betingelser.

In vitro metabolisk mærkning 15

Biopsi-prøver blev overført til individuelle rør indeholdende 0,3 ml EMEM plus 10% føtal kalveserum, 15 pCi/ml 3H-thymidin og 5 pCi/ml 14C-leucin, og inkuberet i 1 time ved 37 °C. Efter forløbet af denne time blev mediet Ijemet og vævsmetabolisme standset ved tilsætning af 0,5 ml kold 5%’s perchlorsyre.

20 Prøverne blev derpå findelt og vasket tre gange. Det resulterende bundfald blev resuspenderet i 0,5 ml 14,8 M ammoniumhydroxid og lydbehandlet. Efter lydbehandling blev prøverne inkuberet i lukkede rør ved 45 °C i 16-24 timer, genlydbehandlet, og radioaktiviteten blev målt under anvendelse af standardvæskescintillationsmetoder med krydskanalstælling.

25 DNA og proteinbestemmelse DNA-bestemmelse blev foretaget under anvendelse af en modifikation af metoden af Labarca et al. (1980) Anal. Biochem. 120:344-52. En 50 pliter ali-30 quot vævsekstrakt i koncentreret ammoniumhydroxid blev sat til 400 pliter pufferopløsning indeholdende 1 M natriumphosphat og 2 M natriumchlorid

_' ______ _I

I DK 175889 B1 I

I 10 I

(pH 7,0). pH for den resulterende opløsning blev indstillet til 7,4 under an- I

I vendelse af HCL. Derefter blev det endelige slutopløsningsvolumen bragt til I

500 pliter under opretholdelse af pH 7,4. Opløsningen blev derpå sat til 2,5 I

I ml pufret opløsning (0,05 M natriumphosphat, 2 M natriumchlorid, pH = 7,4) I

I 5 af Hoesht-farvestof (1,14 mg/ml). Fluorescens blev indført ved en excitations- I

I bølgelængde på 352 nm, og emissionen blev målt ved 454 nm. Kalvetymus I

I DNA fremstillet ved identisk behandling blev anvendt til fremstilling af Stan- I

I dardkurver. I

I 10 Proteinindhold i vævsekstrakten i koncentreret ammoniumhydroxid blev målt I

ved Bradford-metoden (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-54) med bo- I

I vin serum albumin som standard. I

I Resultater I

I 15 I

Resultaterne fra histologisk bedømmelse indikerede, at sår behandlet med I

I kombinatinen af renset human PDGF eller rekombinant PDGF og IGF-I hav- I

I de tykkere bindevævs-og epithellag, og mere omfattende epithelspidser for- I

I bindende disse lag end sår, der ikke modtog behandling, modtog ren IGF-I, I

I 20 ren PDGF eller PDGF i kombinatin med andre vækstfaktorer. Der var ingen I

I tegn på ardannelse op til 6 uger efter behandling. Autoradiografi afslørede en I

I forøgelse i det procentvise antal 3H-thymidin-mærkede celler i PDGF/IGF-I- I

I behandlede sår i sammenligning med sår, der ikke modtog nogen behand- I

I ling, modtog PDGF alene eller IGF-I alene. Metaboliske mærkningsresultater I

I 25 viste, at optagelsen af 3H-thymidin og 14C-leucin var større for sår behandlet I

I med renset PDGF/IGF-l-præparater end for sår, der ikke modtog nogen be- I

I handling. De med PDGF/IGF-I behandlede sår har tilsvarende større indhold I

I af DNA og protein. I

I 30 Den rekombinante rensede PDGF-2 homodimere, fremstillet som beskrevet i I

I det foregående, blev også afprøvet i hudsår af partiel tykkelse alene eller i I

11 DK 175889 B1 kombination med IGF-I. Histologisk analyse af de seks dage gamle sår indikerer, at påføringen af PDGF-2 eller IGF-I alene ikke resulterer i nogen sig-• nifikante forskelle fra kontroller i bindevæv eller epidermal morphologi. Når imidlertid PDGF-2 blev kombineret med IGF-I, gav kombinationen en 2,0 5 ganges forøgelse i bredden af det nye bindevævslag og en 20%’s forøgelse i epidermaltykkelse seks dage efter operation. Efter ni dages forløb resulterede PDGF-2 alene i 22%’s forøgelse i såvel nyt bindevæv som epidermaltykkelse. PDGF-2 i kombination med IGF-I resulterede i 75%’s forøgelse i lagene af såvel nyt bindevæv som epidermalt væv. Bindevævet fra PDGF-2/IGF-I 10 behandlede sår havde afgrænsede områder med polarisering af lys, hvilket indikerede, at disse sår indeholdt mere modent bindevæv end sår modtagende PDGF-2 alene eller ingen behandling.

Anvendelse af rekombinant PDGF-2 til sårheling under anvendelse af den i 15 det foregående beskrevne dyremodel giver således resultater svarende til dem, der opnås med renset human PDGF kombineret med rekombinant IGF- I. Kombinationen af rekombinant PDGF-2 og IGF-I giver dramatiske forøgelser i antallet af nye fibroblaster og kollagensyntesehastigheden, sammenlignet med hyperplasia for dermis og epidermis (2,5 ganges total forøgelse) 20 sammenlignet med kontroldyret i fravær af behandling eller ved behandling med rekombinant PDGF-2 eller IGF-I alene.

Disse resultater indikerer, at rekombinant PDGF-2 homodimer og nativ renset human PDGF begge virker synergistisk med IGF-I, når de påføres sår.

25

Dosering

For at bestemme den omtrentlige dosis af renset PDGF blev de i det foregående beskrevne eksperimenter gentaget med undtagelse af, at sårene blev 30 behandlet med 2,5 ng, 5,0 ng og 10 ng PDGF ækvivalenter renset PDGF pr. mm2 sår dispergeret i 30 pliter biokompatibel gel. Resultaterne viste, at op- _____i I DK 175889 B1 | timale virkninger opnåedes, når PDGF-indholdet var 5,0 ng/mm2 eller derover.

For at bestemme den passende dosis ren PDGF plus IGF-I blev kombinatio-5 ner, i hvilke vægtforholdet mellem PDGF og IGF-I lå i området 1:10 til 25:1 bedømt som beskrevet i det foregående. Optimale resultater blev opnået med et forhold på mellem 1:1 og 2:1.

Knoqlereqenererinq

For at bestemme effektiviteten af PDGF/IGF-I præparater til at fremme periodontium- og/eller knoglevækst blev følgende eksperimenter foretaget.

Beagle-hunde med naturligt forekommende periodontalsygdom blev udvalgt 15 på basis af en initial radiografisk undersøgelse. De tænder, som udviste 30 til 80%'s bentab blev til at begynde med renset under anvendelse af ultralydinstrumenter. Kirurgisk lap- og rodhøvlingsteknik blev derpå anvendt, og forsøgstænderne blev behandlet med et præparat indeholdende renset PDGF og IGF-I i et farmaceutisk acceptabelt bærerstof, f. eks. i handelen tilgænge-20 lige inerte geler, såsom methylcellulose. Tænder i de resterende kvadranter modtog kontrolgel alene eller ren PDGF eller IGF-I alene. Blokbiopsier af tænder og knogle blev taget to uger efter operation og præpareret for histologisk bedømmelse under anvendelse af standarddemineraliserings- og behandlingsteknikker.

25

Resultater

Resultater af histologisk analyse af periodontale prøver og knogleprøver indikerede, at ved siden af de rodflader, der var forsøgsprøver (dvs. sådanne be-30 handlet med PDGF/IGF-I kombination) var der klare områder med ny knogledannelse til stede og en aflejring lignende cementum på den rodoverflade, DK 175889 B1 13 der var nabostillet til den nye knogle. Ny knogle var også til stede på den pe-riosteale overflade af prøverne, og områder med ankylose fandtes i den api-. kale udstrækning af ligamentet. Et tæt lag af osteoblast-lignende celler og bindevæv forede den nyligt dannede knogle med nyligt dannede kollagen-’ 5 fibre indsat i den nyligt dannede cementum.

I kontrolprøver var der ingen tegn på ny knogledannelse, ingen nye cemen-tumlignende aflejringer, og bindevæv var orienteret vinkelret på knogleoverfladen, der syntes at danne en "kappe" over den oprindelige knogle. Resulta-10 terne indikerer således, at PDGF/IGF-I præparatet ifølge opfindelsen forbedrer osteogenrespons og bindevævsrespons.

s

Claims (10)

1. Anvendelse af blodpladeafledt vækstfaktor og IGF-I ved fremstilling af et medikament til (a) sårheling og/eller (b) knogleregenerering.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor vægtforholdet mellem den blodpladeafled-te vækstfaktor og IGF-I ligger mellem 1:4 og 25:1.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori forholdet ligger mellem 1:2 og 10:1.

4. Anvendelse ifølge krav 2, hvori forholdet er ca. 1:1 eller 2:1.

5. Farmaceutisk præparat omfattende blodpladeafledt vækstfaktor og IGF-I vækstfaktor.

6. Præparat ifølge krav 5, hvori vægtforholdet mellem blodpladeafledt vækstfaktor og IGF-I ligger mellem 1:4 og 25:1.

7. Præparat ifølge krav 5, hvori forholdet ligger mellem 1:2 og 10:1.

8. Præparat ifølge krav 5, hvori forholdet er ca. 1:1 eller 2:1.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat ifølge krav 5, hvilken fremgangsmåde omfatter blanding af blodpladeafledt vækstfaktor og 25 IGF-I.

10. Produkt indeholdende blodpladeafledt vækstfaktor og IGF-I til anvendelse som et kombineret præparat til samtidig, separat eller sekventiel anvendelse ved sårheling og/eller knogleregenereringsterapi.