MX2012009687A - Metodos y composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas y métodos para el tratamiento de tendinopatías. - Google Patents
Metodos y composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas y métodos para el tratamiento de tendinopatías.Info
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Abstract
Se proporcionan aquí composiciones y métodos para el tratamiento de tendinopatías, tal como la tenosinovitis, la tendinosis o tendinitis, incluyendo la tendinopatía de Aquiles, la tendinopatía rotuliana, la epicondilitis media o "codo de golfista", la fascitis plantar, y tendinopatía de puño giratorio, y en particular a los métodos para el tratamiento de las tendinopatías mediante el administrar composiciones que comprenden el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).
Description
MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE
PLAQUETAS Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TENDINOPATÍAS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reclama los beneficios de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América No. 61/306,938 presentada el 22 de Febrero de 2010, de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie No. 61/311,284, presentada el 5 de Marzo de 2010, del la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie No. 61/428,809, presentada el 30 de Diciembre de 2010, y de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América serie No. 61/429,428, presentada el 3 de Enero de 2011, todas las cuales sin incorporadas por referencia aquí en sus totalidades .
CAMPO TÉCNICO
Esta invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de tendinopatías , tal como tenosinovitis , tendinosis o tendinitis, incluyendo la tendinopatía de Aquiles, la tendinopatía rotular, la epicondilitis lateral o "codo de tenis", la epicondilitis media o "codo de golfista" , fascitis plantar y tendinopatía de puño girador, y en particular a métodos para el tratamiento de tendinopatías mediante el administrar composiciones que comprenden el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Un tendón es una banda dura de tej ido conectado fibroso que usualmente conecta el músculo al hueso. Las propiedades elásticas de los tendones modulan las fuerzas durante el movimiento o locomoción, proporcionando una estabilidad adicional sin un trabajo activo. Estos también almacenan y recuperan energía a una eficiencia alta. Los tendones saludables normales están compuestos primeramente de arreglos paralelos de fibras de colágeno tipo I empacadas juntas muy cercanamente, pero también incluye una cantidad pequeña de elastina y de proteoglicanos . Debido a su ultraestructura altamente especializada, un nivel bajo de vascularización y de rotación de colágeno lenta, los tendones son muy lentos para sanar si son lesionados, y raramente vuelven a ganar su resistencia original. Los rasgados parciales sanan por la producción rápida de colágeno tipo-III desorganizado el cual es más débil que el tendón normal. La frecuencia de lesiones en la región dañada del tendón es común.
Las tendinopatías son desordenes crónicos o lesiones de los tendones que aparecen como resultado de un desbalanceo entre las respuestas catabólica y anabólica que resultan de un desgaste gradual y rasgado del tendón por el sobreuso o envejecimiento. El resultado de este desbalanceo es una degeneración de tendón, debilidad, rasgado y dolor. En contraste, las lesiones de tendón agudas tales como, por ejemplo, la ruptura de tendón o el desprendimiento del hueso son muy repentinas y usualmente requieren cirugía para reparar la ruptura o volver a sujetar el tendón al hueso. Cualquiera puede desarrollar una tendinopatía pero la gente que tiende hacer los mismos movimientos una y otra vez en sus trabajos, deportes o actividades diarias regulares son más factibles de desarrollarlas de nuevo. La tendinopatía usualmente provoca dolor, rigidez, y pérdida de fuerza en el área afectada.
El término tendinopatía se refiere a dos tipos de lesión de tendón: tendinosis y tendinitis . El término también abarca la tendonsinovitis , una tendinopatía del forro exterior del tendón que ocurre en ciertos tendones tal como los tendones flexores y el tendón de Aquiles.
La tendinosis es una lesión no inflamatoria al tendón caracterizada por la degeneración intratendinosa del tendón usualmente en la forma de microdesgarros en el tej ido y alrededor del tendón causados por el sobreuso, que llevan a un aumento en el número de células de reparación de tendón alrededor del área del daño. La degeneración del tendón es causada por el daño a las fibras de colágeno o la desorganización de las fibras de colágeno, y los componentes vasculares del tendón los cuales pueden reducir la resistencia a la tensión del tendón y pueden llevar a una ruptura de tendón si no se trata. Los cambios en la organización de colágeno se caracterizan por la separación/soltura/rizado de las fibras, pérdida de orientación paralela, disminución de diámetro de fibra y disminución en la densidad general de colágeno. Además, las microdesgarros también pueden ocurrir de manera que están rodeados por eritrocitos, fibrina y de depósitos de fibromectina . Por otro lado, hay un aumento en el colágeno tipo III (reparador) . Estos cambios de organización de matriz bien pueden llevar a disminuir la birrefringencia bajo microscopía de luz polarizada. En adición al contenido de colágeno y a la organización, la tendinosis se caracteriza también por el aumento en la sustancia de base mucoide (proteoglicanos) y la variación en densidad celular en las áreas afectadas. Algunas áreas contienen tenositos anormalmente suficientes, con núcleos redondeados y una evidencia ultraestructural de producción incrementada de proteoglicanos y proteína. En contraste, otras áreas de tendón afectado pueden contener menos tenositos que lo normal, con núcleos picnóticos pequeños. Otra característica de la tendinosis es la proliferación de vasos capilares y arteriolas. Las varias subcategorías de degeneración de tendón en la tendinosis se han identificado por microscopía electrónica: (1) degeneración hipóxica, (2) degeneración hialino, (3) degeneración mucoide o mixoide, (4) degeneración fibrinoide, (5) degeneración lipoide, (6) calcificación, y (7) fibrocartilaginosa y metaplasia de hueso. Estas patologías pueden consistir con una prevalencia variable, dependiendo del sitio anatómico y la naturaleza de la descarga que los causó (por ejemplo, la hipoxia contra la carga mecánica,-lesión aguda contra crónica) . Por ejemplo, el área de degeneración mucoide está caracterizada por ligeras microscopía, grandes parches mucoides y vacuolas entre las fibras. Sin embargo, la degeneración lipoide esta caracterizada por una acumulación intratendinosa anormal de lípido que resulta en la interrupción de la estructura de fibra de colágeno. En algunos casos, la tendinosis esta acompañada por necrosis focal o calcificación del tendón. Esta es una razón muy común para el dolor crónico que rodea una coyuntura. La tendinosis también esta caracterizada por una ausencia de la respuesta inflamatoria inicial. Las células inflamatorias se piensa que son mediadores de fase temprana del proceso de reparación sin las cuales la tendinosis puede convertirse en una condición crónica.
Los aumentos característicos en contenido de agua y desorganización de la matriz de colágeno asociados con la tendinosis pueden ser diagnosticados mediante ultrasonografía o formación de imágenes de resonancia magnética. Los síntomas pueden variar desde un dolor simple y rigidez en el área local del tendón a una sensación de quemado que rodea la coyuntura completa alredor del tendón lesionado. Para muchos pacientes, el dolor es frecuentemente peor durante y después de la actividad, y el área de tendón y coyuntura puede hacerse más rígida al día siguiente al pegar el hinchado sobre el movimiento del tendón.
La tendinitis es una lesión inflamatoria del tendón, caracterizada por la degeneración como aquella observada en la tendinosis, pero también acompañada por la inflamación del tendón acompañada por una rotura vascular y una respuesta de reparación inflamatoria. La tendinitis es frecuentemente acompañada por una proliferación fibroblástica y miofibroblástica, así como de hemorragia y un tejido de granulación organizante. Generalmente la tendinitis es mencionada por la parte del cuerpo involucrada tal como la tendinitis de Aquiles (que afecta al tendón de Aquiles) o la tendinitis rotular (también conocida como "rodilla del brinco" que afecta el tendón rotular) aún cuando hay ciertas excepciones, tal como la epicondilitis lateral (también conocida como el "codo de tenis" que afecta el tendón Extensor Carpí Radialis Brevis) . Los síntomas pueden variar dése valores y rigidez local a una sensación de quemado que rodea la coyuntura completa alrededor del tendón inflamado. En algunos casos, la tendinitis esta caracterizada por hinchamiento, algunas veces esta acompañada por calor y rojez; también puede haber nudos visibles que rodean la coyuntura. Para muchos pacientes, el dolor es usualmente peor durante y después de la actividad, y el tendón y el área de coyuntura pueden hacerse más rígidos al día siguiente al apretarse los músculos por el movimiento del tendón.
Los tratamientos actuales son primariamente paliativos en naturaleza, con el tratamiento tradieionalmente enfocándose sobre mediciones en contra de la inflamación, incluyendo el tratamiento con drogas antiinflamatorias no esteroidales (NSAIDs) , inyecciones esteroides y terapia física, a pesar del hecho de que la tendinosis tiende a no estar asociada con la respuesta inflamatoria. Más recientemente, la terapia de onda de choque, la terapia de láser de nivel bajo, la escleroterapia y otros tratamientos experimentales se han probado. Para la mayor parte, parece que algunos tratamientos (por ejemplo, NSAIDs y las inyecciones de cortisona) ofrecen un alivio a corto plazo, mientras que el beneficio a largo plazo de los tratamientos actuales permanece no claro. Por tanto, hay una necesidad de métodos mejorados para tratar las tendinopatías que ofrecen beneficios a largo plazo en comparación a las modalidades de tratamiento existentes.
Ka PDGF es almacenada en los granulos-alfa de plaquetas y es segregada durante la reparación del tejido por las células activadas localmente, incluyendo macrófagos, fibroblastos, y células endoteliales . El PDGF-BB es uno de los productos principales de la hemorragia y de la inflamación de la lesión del tendón aguada. El factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) es una proteína del sanado de herida la cual es conocida por ser quimotáctica (migración de células) y mitogénica (migración de células) y mitogénica (proliferación de célula) para células de origen mesenquinal, incluyendo células de hueso (osteoblastos) y de tendón (tenosito) . Adicionalmente, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB ha sido mostrado por regular el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que lleva a una angiogénesis incrementada (revascularización) la cual es esencial para el proceso degenerativo exitoso.
El tendón de Aquiles es el tendón más grueso y más fuerte en el cuerpo humano, el cual permite a este soportar cargas altas. El ambiente de carga mecánica en el cual el tendón de Alquiles funciona hacia este propenso a la ruptura. Las rupturas de tendón de Alquiles pueden ocurrir como un resultado de una variedad de factores, sin embargo la ruptura esta frecuentemente asociada con los cambios degenerativos. (Mafulli N, Wong J, Almekinders L. , tipos y epidemiología de tendinopatía . Clínicas en medicina de los deportes, 2003;22:675-692). Después del proceso de reparación, los tendones de Alquiles rotos demuestran una reducción de colágeno tipo I y un aumento relativo en la cantidad de colágeno tipo III. Este cambio en la composición lleva a un menor enlazamiento cruzado y a una resistencia a la tensión reducida. Aún después del sanado, un tendón de Aquiles roto permanece más débil debido a la hipercelularidad, desorganización y enlace cruzado de colágeno disminuido (Mafulli N, Moller HD, Evans CH. Sanado de Tendón: puede este ser optimizado??. Diario Británico de Medicina de los Deportes, 2002;36:315-316). La controversia existe en relación al tratamiento óptimo para las rupturas de tendón de Aquiles con los pros y los contras a ambas terapias conservadoras (no de operación) y quirúrgicas. Los tratamientos de no operación resultan en una tasa de re-ruptura superior y una resistencia disminuida pero evita los costos y riesgos asociados con la cirugía. (Inglis AE, Scott N, Sculco TP, y otros. Rupturas del tendón de Aquiles: una evaluación objetiva de tratamiento quirúrgico y no quirúrgico. J Bone Joint Surg Am. 1976; 58:990-993; Nistor L. tratamiento quirúrgico y no quirúrgico de la ruptura del tendón de Aquiles : un ensayo al azar prospectivo. J Bone Joint Surg Am. 1981 63(3) :394; Chalmers J. Artículo de revisión: tratamiento de rupturas de tendón de Aquiles. Diario de cirugía ortopédica 200 8 (1) : 97-99) . La reparación quirúrgica conlleva el riesgo de la cirugía y la anestesia; sin embargo proporciona una resistencia incrementada, tasas de red-ruptura inferiores y un retorno temprano a las actividades atléticas. (Nistor L. tratamiento quirúrgico y no quirúrgico de la ruptura del tendón de Aquiles: un ensayo al azar en perspectiva. J Bone Joint Surg Am. 1981 63(3):394-9; Rettig A. Liotta Fj . Klootwyk TE, Porter DA, Mieling P. Riesgo potencial de ruptura en reparación de tendón de Aquiles primaria en atletas más jóvenes de 30 años de edad. Diario americano de medicina de los deportes 2005 : 33 (a) : 119-123) . Sin importar la preferencia clínica para el tratamiento de las rupturas del tendón de Aquiles agudas, la reparación quirúrgica continuará teniendo su lugar en el espectro de tratamiento de estas lesiones en la población de pacientes activos. El aumento del proceso de reparación de lógica, mejorando por tanto el sanado de tendón, puede potencialmente llevar a un retorno más rápido a la actividad y a resultados clínicos mejorados en comparación a las modalidades de tratamiento actuales .
Ha habido varios estudios en vivo e in vitro en relación al aumento biológico del sanado de tendón. Vea por ejemplo: Sechherman, HJ, Archambaul J , Rodeo SA, y otros, El rhBMP-12 acelera el sanado de las reparaciones de puño girador en ovejas. J Bone Joint Surg Am. 2008 ; 90 (10) : 2206-2219 ; Chan BP, Fu SC, Qin L, y otros. Suplemento con dependencia del tiempo de factor de crecimiento para promover el sanado de tendón. Clin Orthop Relat Res. 2006;448:240-247; Uggen JC, Di es J. Uggen C , y otros . La terapia de gen de tendón modula el ambiente de reparación local en el hombro. J Am Osteopath Assoc.
2005 ; 105 (1) : 20-21 ; Gelberman R, Thompoulos S. Sakiyama-Elbert S., y otros. Los efectos tempranos de administración de factor de crecimiento derivado de plaquetas sostenido sobre las propiedades funcionales y estructurales de tendones de flexor intrasinoviales reparados : un estudio biomecánico en vivo de 3 semanas en caninos .
J Hand Surg Am. 2007;32 (3) :373-379; Thomopoulos S. Das R, Silva MJ y otros. Sanado de tendón flexor mejorado a través de entrega controlada de factor de crecimiento derivado de plaquetas -BB en la reparación del tendón usando un sistema novedoso de entrega promueve la proliferación de células y remodelación de colágeno. J Orthop Res. 2007 ; 25 (10) : 1358-1368 ; Diñes J, Grande D, Diñes D. Ingeniería de tejido y sanado de tendón de puño girador. Diario de cirugía de codo y hombro Septiembre y Octubre 2007: 204S-206S.
La entrega de rhPDGF-BB al sitio de reparación en dosis suficientes y sobre el curso de tiempo adecuado e4s importante para lograr el efecto clínico deseado. Varios estudios describen suturas recubiertas con biológicos. Vea por ejemplo Rickert M. Jung M. Adiyaman M. Richter W, Wimank HG. La sutura de factor 5 de crecimiento diferenciación estimula el sanado del
tendón en un modelo de tendón de Aquiles en ratas. Factores de crecimiento 2001;19:115-126; eiler A. Forster C, Hunt P, Falk R, Jung T, Unterhauser FN, Bergmann V, Schmidmaier G, Hass NP. La influencia del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB aplicado localmente sobre remodelación de injerto de tendón libre después de reconstrucción del ligamento anterior. Diario Americano de Medicina de los Deportes 2004;32 (4) : 881-891; Diñes J, Weber L, Razzano P, y otros. El efecto de las suturas recubiertas de factor-5 de diferenciación de crecimiento sobre reparación de tendón en modelo de rata. Diario de cirugía de codo y hombro 2007 ; 16 : 215S-221S; Uggen C, Diñes J, McGarry M, y otros. El efecto de las suturas recubiertas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas recombinantes BB sobre el sanado de puño girador en modelo de ovejas, Artroscopía: 2010:26(11): 1456-1462.
Lo que se requiere son suturas mejoradas para entregar un PDGF a un tendón, por ejemplo, para reparar un tendón roto tal como los tendones de Aquiles rotos .
SÍNTESIS
En un aspecto se proporciona aquí un método para tratar una tendinopatía que comprende el administrar a un sitio afectado una cantidad efectiva de una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaqueta y un amortiguador. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinosis. En algunas incorporaciones, la tendinopatia es una tenosinovitis . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de un factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA, un factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, un factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB, un factor de crecimiento derivado de plaquetas-CC y un factor de crecimiento derivado de plaquetas-DD. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB . En algunas incorporaciones el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano recombinante (rh) . En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 75µ y alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre 500 pg a alrededor de 1,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 5,000 pg a alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 450 pg a alrededor de 3,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 400 pg a alrededor de 1,000 g del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 500 pg a alrededor de 900 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 600 µg a alrededor de 800 g de factor derivado de crecimiento de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 650 pg a alrededor de 750 pg de PDGF-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende alrededor de 700 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor 1.0 mililitros a alrededor de 2.0 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor de 1.5 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato ("PBS"), acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano ("tris"), N-2-hidroxietilpirazina-N' 2-ácido etano sulfónico ("HEPES"), 3-(N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2 - (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-acetamido) cido iminodiacetico ("ADA"), piperazina-N-N' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2-acetamido) -2-ácido amonioetanosulfónico (ACES" ) . En algunas incorporaciones, el amortiguador es acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio es una concentración de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio es una concentración de alrededor de 20 mM. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de alrededor de 6. En algunas incorporaciones, la administración es por inyección directa al sitio afectado. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es una unión oseotendón. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es un tendón. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía de Aquiles, tendinopatía rotuliana, epicondilitis lateral, epicondilitis media, fascitis plantar y tendinopatía de puño girador. En algunas incorporaciones la tendinopatía es epicondilitis lateral. En algunas incorporaciones, la composición es administrada como una dosis única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada mediante una inyección única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada en más de una dosis. En algunas incorporaciones, la composición es administrada mediante una inyección única una vez a la semana por cuatro semanas. En algunas incorporaciones, el método en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 60 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 65 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparaciones a una línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 70 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a la línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un tendón que logra por lo menos alrededor del 80 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método resulta en el tendón que logra por lo menos alrededor del 85 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método resulta en que el tendón logra por lo menos alrededor del 90 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración.
En otro aspecto, se proporciona aquí un método para tratar la tendinopatía que comprende la administración de un sitio afectado de una cantidad efectiva de una composición que consiste de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinosis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinitis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tenosivitis. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA, factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB, factor de crecimiento derivado de plaquetas-CC, y factor de crecimiento derivado de plaquetas-DD . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano recombinante (rh) . En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 75pg y alrededor de 7,500 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 500 g a alrededor de 1,000 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 5,000 g a alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 450 g a alrededor de 3,000 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 400 g a alrededor de 1,000 g del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 500 g a alrededor de 900 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 600 g a alrededor de 800 pg de factor derivado de crecimiento de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 650 µg a alrededor de 750 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 700 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor 1.0 a alrededor de 2.0 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor de 1.5 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato ("PBS")/ acetato de sodio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano ("tris"), N-2-hidroxietilpirazina-N' 2-ácido etano sulfónico ("HEPES"), 3- (N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2- (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-acetamido) ácido iminodiacetico ("ADA"), piperazina-N-N' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2-acetamido) -2-ácido amonioetanosulfónico ("ACES"). En algunas incorporaciones, el amortiguador es acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta una concentración de alrededor de 20 mM. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de alrededor de 6. En algunas incorporaciones, la administración es mediante inyección directa al sitio afectado. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es una unión de oseotendón. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es un tendón. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía de Aquiles, tendinopatía rotuliana, epicondilitis lateral, epicondilitis media, fascitis plantar y tendinopatía de puño girador. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es epicondilitis lateral. En algunas incorporaciones, la composición es administrada como una dosis única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada por una inyección única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada en más de una dosis. En algunas incorporaciones, la composición es administrada por una inyección única una vez a la semana por cuatro semanas. En algunas incorporaciones, el método resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 60 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 65 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 70 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el método resulta en un tendón que logra por lo menos alrededor del 80 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método resulta en el tendón que logra por lo menos alrededor del 85 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método resulta en el tendón que logra por lo menos alrededor del 90 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método consiste de administrar a un sitio afectado una cantidad efectiva de una composición que consiste de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador.
En otro aspecto, se proporciona aquí una composición para usarse para el tratamiento de una tendinopatía que comprende una cantidad efectiva de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinosis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinitis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tenosivitis. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-CC, y el factor de crecimiento derivado de plaquetas-DD . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano recombinante (rh) . En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor del 75 pg y alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 500 pg a alrededor de 1,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 5,000 pg a alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 450 pg a alrededor de 3,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 450 pg a alrededor de 3,000 pg del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 400 pg a alrededor de 1,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 500 pg a alrededor de 900 pg de factor derivado de crecimiento de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 600 pg a alrededor de 800 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 650 g a alrededor de 750 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva comprende entre alrededor de 700 g de factor de crecimiento derivado de placas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor de 1.0 mililitros a alrededor de 2.0 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, la composición tiene un volumen de alrededor de 1.5 mililitros por dosis. En algunas incorporaciones, el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salda amortiguada con fosfato ( "PBS"), acetato de sodio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano ("tris"), N-2-hidroxietilpirazina-N' 2-ácido etano sulfónico ("HEPES"), 3 - (N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2 - (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-Acetamido) ácido iminodiacetico ("ADA"), piperazina-N-N' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2-acetamido) -2-ácido amonioetanosulfónico ("ACES"). En algunas incorporaciones, el amortiguador es acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM.
En algunas incorporaciones, el acetato de sodio es una concentración de alrededor de 20 mM. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, la composición tiene un pH de alrededor de 6. En algunas incorporaciones, el tratamiento comprende administrar la composición la administración mediante inyección directa al sitio afectad. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es una unión de oseo-tendón. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es un tendón. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía de Aquiles, tendinopatía rotuliana, epicondilitis lateral, epicondilitis lateral, fascitis plantar y tendinopatía de puño girador. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una epicondilitis lateral. En algunas incorporaciones, la composición es administrada como una dosis única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada por una inyección única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada en más de una dosis. En algunas incorporaciones, la composición es administrada por una inyección única una vez a la semana por cuatro semanas. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento de la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 60 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en una resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 65 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 70 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en que el tendón logre por lo menos alrededor del 80 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el método resulta en que el tendón logre por lo menos alrededor del 85 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en el tendón que logra por lo menos alrededor del 90 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después de la administración. En algunas incorporaciones, la composición consiste de una cantidad efectiva de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador.
En otro aspecto, se proporciona aquí el uso de composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas descritas aquí en conexión con los métodos descritos aquí, a menos que se note de otra manera o sea claro del contexto específico. Las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas descrito aquí también puede usarse en la preparación de un mecánicamente para emplearse en los métodos descritos aquí .
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra el efecto del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB recombinante humano sobre migración de célula de tenocitos.
La figura 2 muestra el efecto del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB recombinante humano sobre la proliferación de células de tenocitos como se midió por la incorporación de BrdU.
La figura 3 muestra el sitio de inyección en la coyuntura de tendón-calcáneo en la pierna derecha. Las inyecciones se llevaron a cabo con una jeringa de insulina usando una aguja de 28.5 G.
La figura 4 muestra una imagen representativa de un complejo de metatarso de rata-Achilles-gastrocnemio seguido por el procesamiento de animales de prueba para una prueba biomecánica.
La Figura 5 muestra una imagen representativa de una sección sagital desde la orilla lateral del sitio de unión de tendón de Aquiles (T) -calcáneo (C) .
Figura 6A muestra los resultados de un estudio de respuesta de dosis sobre un crecimiento de tendón de observación bruta para la aplicación entre- tendón de un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante, isoforma BB ( "rhPDGF-BB" ) , en un modelo de lesión de tendón de Aquiles de rata inducido por colágeno siete días después del tratamiento. Una sola inyección única de una dosis media (10.2 mg) o alta (102 g) del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante- BB produjo un aumento significante en el tamaño del tendón siete días después de el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB .
Figura 6B muestra el resultado del mismo estudio veintiún días después del tratamiento del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . El efecto de una inyección única de una dosis alta (102 pg) de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre el tamaño del tendón fue comparable al efecto de la inyección con solo amortiguador de acetato de sodio veintiún días después del tratamiento .
La figura 7 es una presentación diferente de los datos de las figuras 6A y 6B, mostrando el tamaño del tendón bruto a 7- y 21- días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante (0 = sin crecimiento a 3 = crecimiento severo) .
La figura 8 muestra el ancho del tendón (pm + SEM) en la inserción calcáneo: a 7 - y 21 días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante .
La Figura 9 muestra anchura de tendón (µ?? + SEM) en el cuerpo del tendón a las 7- y 21 - días después del tratamiento con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
La figura 10 muestra el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre la tasa de proliferación celular (cuenta de células + SEM) a 7 - y 21 - días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
La figura 11 muestra las propiedades mecánicas de los tendones de Aquiles: carga máxima a la rotura (N + SEM) a 7 -y 21 - días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
La figura 12 muestra los valores de veces-concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de suero después de una dosis IV.
La figura 13 muestra los valores de concentración-tiempo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB suero después de una dosis IT.
La Figura 14A muestra el perfil de liberación in vitro respecto de la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado en cada punto desde las suturas de 4-0 Vicryl .
La Figura 14B muestra la liberación acumulativa in vitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre 48 horas desde las suturas 4-0 Vicryl (medio ± SEM) .
La figura 14C muestra la dosis acumulativa en vivo estimada de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante -BB en contra de la concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en la solución de recubrimiento de sutura. La figura 14D muestra los tramos de sutura de 4-0 Vicryl implantados.
DESCRIPCION DETALLADA
Todas las referencias citadas aquí, incluyendo sin limitación, las patentes, solicitudes de patentes y referencias científicas se incorporan aquí por esta mención en su totalidad.
Las composiciones y los métodos de la invención sorprendentemente resultan en un tratamiento mejorado de tendinopatías . En algunas incorporaciones, las composiciones y los métodos de la invención resultan en una resistencia incrementada del tendón y en una tasa incrementada de la recuperación de resistencia del tendón. En algunas incorporaciones, las composiciones y métodos de la invención resultan en una resistencia incrementada del tendón. En algunas incorporaciones, las composiciones y métodos de a invención resultan en una tasa incrementada de la recuperación de resistencia del tendón. Por ejemplo, al sanar un tendón después de una lesión, la resistencia biomecánica el tendón aumenta como un proceso del sanada del tendón. La administración de una composición de la invención puede resultar en un aumento más rápido en la resistencia del tendón. Sin desear el estar unido por una teoría este aumento más rápido en resistencia puede ayudar a promover el sanado el tendón; siempre que el sostenimiento de carga no aumente además la lesión del tendón, el sostenimiento de carga sobre un tendón generalmente mejorada la respuesta de sanado del tendón, ya que esto generalmente resulta en una remodelación y reorganización de tejido mejorada. Un aumento inicial más rápido en la resistencia del tendón (por ejemplo, resultando de la administración de una composición de la invención) puede resultar en una capacidad para comenzar el sostenimiento de carga sobre el tendón más rápidamente, mejorando por tanto además la respuesta de sanado del tendón. Sin desear el estar unido por una teoría, la mejora en la resistencia del tendón puede ser provocada por un aumento en la proliferación celular y/o en la producción de matriz extra celular, y/o por una mejora en la organización del te ido (por ejemplo, una mejora en la organización de la matriz extracelular) .
Adicionalmente, sin desear estar unido por una teoría, los inventores sorprendentemente descubrieron que cuando las composiciones de la invención son administradas directamente en el tendón (por ejemplo, por inyección) , el factor de crecimiento derivado de plaquetas permanece localizado en el sitio de administración (por ejemplo, en el sitio de inyección) . Por ejemplo, como se detalla adicionalmente en el Ejemplo 5 dado abajo, fue inesperado el que la administración de una composición consistiendo de factor de crecimiento derivado de plaquetas en un amortiguador pudiera resultar en el factor de crecimiento derivado de plaquetas que permaneciera localizado en el sitio de la inyección.
Definiciones
Como se uso aquí, el término "tratamiento" se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar el curso natural de la patología clínica del desorden que esta siendo tratado (por ejemplo una tendinopatía tal como una tendinosis, una tendinitis o una tenosinovitis) . Deseablemente los efectos del tratamiento incluyen, por ejemplo, uno o más de disminuir el dolor o rigidez de el miembro o articulación afectada, aumentar la movilidad y resistencia del miembro o articulación afectada, disminuir la tasa de la progresión de la tendinopatía, disminuyendo la inflamación, aumentar la resistencia del tendón mejorar la tasa de recuperación de la resistencia del tendón, aminorar o paliar el estado de la enfermedad, y la remisión, o mejor pronóstico. Un individuo es "tratado" exitosamente, por ejemplo, si uno o más síntomas asociados, con una tendinopatía son mitigados o eliminados.
Como se usó aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a por lo menos una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr los resultados terapéuticos o profilácticos deseados. Una cantidad efectiva puede ser proporcionada en una o más administraciones .
La referencia a "alrededor" de un valor o parámetro dado aguí también incluye (y describe) incorporaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro por si mismo.
Como se uso aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de "uno" , "unas" y "el" incluyen la referencia plural a menos que el contexto claramente indique de otra manera, por ejemplo, la referencia a un "homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas" es una referencia a uno o múltiples homodímeros de factor de crecimiento derivado de plaquetas, e incluye equivalentes de los mismos conocidos por aquellos expertos en el arte y otros.
Se entiende que todos los aspectos e incorporaciones de la invención descritas aquí incluyen "comprendiendo", "consistiendo" y "consistiendo esencialmente de" aspectos e incorporaciones. Deberá entenderse que los métodos o composiciones "consistiendo esencialmente de" los elementos recitados incluyen solo los pasos o materiales específicos de aquellos que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de esos métodos y composiciones (por ejemplo, administrar a un sitio afectado una cantidad efectiva de una composición consistente esencialmente de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y de un amortiguador, o una composición que consiste esencialmente de una cantidad efectiva de un factor de crecimiento derivado de plaquetas en una solución amortiguada) .
Factor de crecimiento derivado de plaquetas y Composición del Mismo
Como se empleo aquí, el término "factor de crecimiento derivado de plaquetas" o "PDGF" se refiere a una cualquier de cuatro isoformas diferentes de factor de crecimiento derivado de plaquetas que activan las respuestas a celulares a través de dos receptores diferentes. Estas isoformas incluyen A (observada como un homodímero designado factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y como parte de un heterodímero con la isoforma B designada factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB) , B (observada como un homodímero designado factor de crecimiento derivado de plaquetas -BB y como parte de un heterodímero con la isoforma A designada factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB) , C (observado como un homo dímero designado factor de crecimiento derivado de plaquetas-CC) y D (observado como un homodímero designado factor de crecimiento derivado de plaquetas-DD) . Generalmente aquí, el término "factor de crecimiento derivado de plaquetas se refiere generalmente a los homo dímeros y heterodímeros de factor de crecimiento derivado de plaquetas conocidos (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD) .
Se proporcionan aquí métodos para el tratamiento de tendinopatías en un individuo y composiciones para usarse en esos métodos. En general, los métodos para el tratamiento comprenden administrar una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas a un sitio afectado en un individuo que tiene una tendinopatía. Específicamente, los métodos de tratamiento comprenden administrar una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador al sitio de la tendinopatía. En algunas incorporaciones, la composición comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador (por ejemplo una solución amortiguada de factor de crecimiento derivado de plaquetas) .
En algunas incorporaciones, las composiciones comprenden un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, DD-PDGF, y mezclas y derivados de los mismos. En algunas incorporaciones, el dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas es un homodímero. En algunas incorporaciones, el homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, DD y PDGF- . En algunas incorporaciones, el homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB . En algunas incorporaciones, el dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas es un heterodímero . En algunas incorporaciones, el heterodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB .
En algunas incorporaciones, factor de crecimiento derivado de plaquetas puede ser obtenido de fuentes naturales . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas puede ser producido mediante técnicas de ADN recombinantes . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o fragmentos el mismo pueden ser producidos usando técnicas de síntesis de péptido conocidos por un experto en el arte, tal como una síntesis de péptido de fase sólida.
Cuando se obtienen de fuentes naturales, el factor de crecimiento derivado de plaquetas puede ser derivado de fluidos biológicos. En algunas incorporaciones, los fluidos biológicos pueden comprender cualquier fluido tratado o no tratado asociado con organismos vivientes incluyendo la sangre. Los fluidos biológicos también pueden comprender componentes de sangre incluye un concentrado de plaquetas, plaquetas aperesadas, plasma rica en plaquetas, plasma, suero, y plasma congelado fresco. Los fluidos biológicos pueden comprender plaquetas separadas de plasma y resuspendidas en un amortiguador o un fluido fisiológico.
Cuando se produce mediante técnicas ADN recombinantes, una secuencia ADN codificando un monómero único (por ejemplo, un factor de crecimiento derivado de plaquetas cadena-BB o cadena-A) puede ser insertado dentro de células procarióticas o eucarióticas para la expresión para producir subsecuentemente el homodímero (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas- o factor de crecimiento derivado de plaquetas-AA) . En algunas incorporaciones, el factor derivado de crecimiento de plaquetas comprende un homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, DD o PDGF-DD) . En algunas incorporaciones, el heterodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas puede ser generado mediante el insertar secuencias ADN codificadas para ambas unidades monoméricas del heterodímero dentro de células procariotas o eucariotas cultivadas y permitiendo a las unidades monoméricas trasladadas el ser procesadas por las células para producir el heterodímero (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB) . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un heterodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas-AB) . El factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano recombinante comercialmente disponible puede ser obtenido de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitándose a Leinco Technologies, Inc., (Saint Luis, Missouri, Estados Unidos de América) y a R&D Systems, Inc., (de Miniápolis, Minnesota, Estados Unidos de América) .
En algunas incorporaciones descritas aquí, el factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante ("rhPDGF"). En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante ("rhPDGF") es un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas seleccionado del grupo que consiste de rhPDGF-AA, rhPDGF-BB , rhPDGF-AB, rhPDGF-CC, rhPDGF-DD, y mezclas y derivados de los mismos. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante es un homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante. En algunas incorporaciones, el homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante es seleccionado del grupo que consiste de rhPDGF-AA, rhPDGF-BB , rhPDGF-CC, y rhPDGF-DD . En algunas incorporaciones, el homodímero de factor recombinante derivado de plaquetas humano recombinante es un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante es un heterodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante. En algunas incorporaciones, el heterodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante es un rhPDGF-AB.
En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-B comprende uno o más de los siguientes fragmentos: amino ácidos 1-31, 1-32, 33-108, 33-109, y /o 1-108 de la cadena-B humana completa. La secuencia de amino ácido completa (amino ácidos 1-109) de la cadena-B del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano es proporcionada en la Figura 15 de la Patente de los Estados de América No. 5,516,896. Se entiende que las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB de la presente invención pueden comprender una combinación de factor de crecimiento derivado de plaquetas-B humano intacto (amino ácidos 1-109) y fragmentos de los mismos. Otros fragmentos del factor de crecimiento derivado de plaquetas pueden ser empleados tal como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos de América No. 5,516,896. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB comprende por lo menos 65 por ciento de un factor de crecimiento derivado de plaquetas-B humano de longitud de completa (amino ácidos 1-109) . En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB comprende por lo menos 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, o 99 por ciento o un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano de longitud completa (amino ácidos 1-109) .
En algunas incorporaciones, la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante) seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, DD y PDGF- , y la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas a una concentración variando de desde alrededor de 0.01 miligramos/mililitro a alrededor de 10.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.05 miligramos/mililitro a alrededor de 5.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 1.0 miligramos/mililitro, o desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 2.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 3.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 4.0 miligramos/mililitro, alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 0.4 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 5.0 miligramos/mililitro, alrededor de 0.9 miligramos/mililitro a alrededor de 1.5 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas a una concentración de alrededor de 3.4 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas a una concentración de alrededor de 1.0 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas a una concentración de alrededor de 0.34 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas a una cualquiera de las siguientes concentraciones: alrededor de 0.05 mg/ml; alrededor de 0.1 mg/ml; alrededor de 0.15 mg/ml; alrededor de 0.2 mg/ml; alrededor de 0.25 mg/ml; alrededor de 0.3 mg/ml; alrededor de 0.35 mg/ml; alrededor de 0.4 mg/ml; alrededor de 0.45 mg/ml; alrededor de 0.5 mg/ml, alrededor de 0.55 mg/ml, alrededor de 0.6 mg/ml, alrededor de 0.65 mg/ml, alrededor de 0.7 mg/ml; alrededor de 0.75 mg/ml; alrededor de 0.8 mg/ml; alrededor de 0.85 mg/ml; alrededor de 0.9 mg/ml; alrededor de 0.95 mg/ml; alrededor de 1.0 mg/ml; alrededor de 1.5 mg/ml; alrededor de 2.0 mg/ml; alrededor de 2.5 mg/ml; alrededor de 3.0 mg/ml; alrededor de 3.5 mg/ml; alrededor de 4.0 mg/ml; alrededor de 4.5 mg/ml, o alrededor de 5.0 mg/ml. Se entiende que estas concentraciones son simplemente ejemplos de incorporaciones particulares, y que la concentración de dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas puede estar dentro de cualquiera de los rangos de concentración declarados anteriormente .
En algunas incorporaciones, el dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo un dímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante) es un PDGF-BB. En algunas incorporaciones, la composición comprende el PDGF-BB a una concentración variando desde alrededor de 0.01 miligramos/mililitro a alrededor de 10.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.05 miligramos/mililitro a alrededor de 5.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 1.0 miligramos/mililitro, o desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 2.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 3.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.01 miligramos/mililitro a alrededor de 4.0 miligramos/mililitro, de desde alrededor de 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 5.0 miligramos/mililitro, a alrededor de 0.01 miligramos/mililitro a alrededor de 0.4 miligramos/mililitro, alrededor de 0.9 miligramos/mililitro alrededor de 1.5 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB a una concentración de alrededor de 3.4 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB a una concentración de alrededor de 1.0 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB a una concentración de alrededor de 0.34 miligramos/mililitro. En algunas incorporaciones, la composición comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB a una cualquiera de las siguientes concentraciones: 0.05 mg/ml; alrededor de 0.1 mg/ml; alrededor de 0.15 mg/ml; alrededor de 0.2 mg/ml; alrededor de 0.25 mg/ml; alrededor de 0.3 mg/ml; alrededor de 0.35 mg/ml; alrededor de 0.4 mg/ml; alrededor de 0.45 mg/ml; alrededor de 0.5 mg/ml, alrededor de 0.55 mg/ml, alrededor de 0.6 mg/ml, alrededor de 0.65 mg/ml, alrededor de 0.7 mg/ml; alrededor de 0.75 mg/ml; alrededor de 0.8 mg/ml; alrededor de 0.85 mg/ml; alrededor de 0.9 mg/ml; alrededor de 0.95 mg/ml; alrededor de 1.0 mg/ml; alrededor de 1.5 mg/ml; alrededor de 2.0 mg/ml; alrededor de 2.5 mg/ml; alrededor de 3.0 mg/ml; alrededor de 3.5 mg/ml; alrededor de 4.0 mg/ml; alrededor de 4.5 mg/ml, o alrededor de 5.0 mg/ml . Deberá entenderse que estas concentraciones son simplemente ejemplos de incorporaciones particulares y que la concentración del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB puede estar dentro de cualquiera de los rangos de concentración indicados anteriormente.
En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD. Varias cantidades del factor de crecimiento derivado de plaquetas pueden ser usadas en las composiciones de la presente invención. Las cantidades de factor de crecimiento derivado de plaquetas que pueden ser usadas incluyen, pero no se limitan a cantidades en los siguientes rangos, alrededor de 1 pg a alrededor de 50 mg, alrededor de 10 ]iq a alrededor de 25 mg, alrededor de 100 pg a alrededor de 10 mg, alrededor de 250 g a alrededor de 5 mg, y alrededor de 450 g a alrededor de 3 mg. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB . Varias cantidades del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB pueden ser usadas en las composiciones de la presente invención. Las cantidades del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB que pueden usarse, incluyen, pero no se limitan a cantidades en los siguientes rangos: alrededor de 1 g a alrededor de 50 mg, alrededor de 10 g a alrededor de 25 mg, alrededor de 100 g a alrededor de 10 mg, alrededor de 250 g a alrededor de 5 mg y alrededor de 450 g a alrededor de 3 mg.
La concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplos factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante) , incluyendo PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD, en algunas incorporaciones de la presente invención puede ser determinada, por ejemplo, mediante el usar un inmunoensayo enlazado con enzima como se describe en la Patente de los Estados Unidos de América No. 6,221,625; en la Patente de los Estados Unidos de América No. 5,747,273; y en la Patente de los Estados Unidos de América No. 5,290,708, o en cualquier otro ensayo conocido en el arte para determinar la concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas.
Cuando se proporciona aquí, la concentración molar del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante es determinada con base en el peso molecular de un homodímero de factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB) , peso molecular 25 kDa) .
En algunas incorporaciones de la presente invención, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante) puede estar en una forma altamente purificada. El factor de crecimiento derivado de plaquetas purificado como se uso aquí, comprende composiciones que tienen más de alrededor del 95 por ciento por peso de factor de crecimiento derivado de plaquetas antes de la incorporación en soluciones de la presente invención. La solución puede ser preparada usando cualquier amortiguador farmacéuticamente aceptable o diluente farmacéuticamente aceptable. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas puede estar esencialmente purificado. El factor de crecimiento derivado de plaquetas esencialmente purificado, como se uso aquí, comprende composiciones teniendo alrededor del 5 por ciento a alrededor de 95 por ciento por peso del factor de crecimiento derivado de plaquetas antes de la incorporación en las soluciones de la presente invención. En una incorporación, el factor de crecimiento derivado de plaquetas esencialmente purificado comprende composiciones teniendo alrededor del 65 por ciento a alrededor de 95 por ciento por peso de factor de crecimiento derivado de plaquetas antes de la incorporación en las soluciones de la presente invención. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas esencialmente purificado comprende composiciones que tienen alrededor de 70 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 75 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 80 por ciento a alrededor de 95 por ciento, alrededor de 85 por ciento a alrededor de 95 por ciento o alrededor de 90 por ciento a alrededor de 95 por ciento, por peso del factor de crecimiento derivado de plaquetas, antes de la incorporación adentro de las soluciones de la presente invención. El factor de crecimiento derivado de plaquetas purificado y el factor de crecimiento derivado de plaquetas esencialmente purificado pueden ser incorporados dentro de las composiciones.
En una incorporación adicional, el factor general de crecimiento derivado de plaquetas puede ser parcialmente purificado. Por factor de crecimiento derivado de plaquetas parcialmente purificado, como se uso aquí, se comprenden composiciones teniendo un factor de crecimiento derivado de plaquetas en el contexto de un plasma rico en plaquetas, plasma congelado fresco, o cualquier otro producto de sangre que requiera la recolección y separación para producir el factor de crecimiento derivado de plaquetas. Las incorporaciones de la presente invención contemplan que cualquiera de las isoformas de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionadas aquí, incluyendo los homodímeros y los heterodímeros , pueden ser purificadas o parcialmente purificadas. Las composiciones de la presente invención comprendiendo mezclas de factor de crecimiento derivado de plaquetas pueden comprender isoformas de factor de crecimiento derivado de plaquetas o fragmentos de factor de crecimiento derivado de plaquetas en proporciones parcialmente purificadas. El factor de crecimiento derivado de plaquetas parcialmente purificado y purificado, en algunas incorporaciones, puede ser preparado como se describe en la solicitud de Patente de los Estados Unidos de América Serie No. 11/159,533 (publicación de la solicitud de Patente de los Estados Unidos de América No. 2006/0084602A1) .
En cualquiera de las incorporaciones descritas aquí, el factor de crecimiento derivado de plaquetas altamente purificado y parcialmente purificado es seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD. En cualquiera de las incorporaciones descritas aquí, el factor de crecimiento derivado de plaquetas altamente purificado o parcialmente purificado es el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB .
Amortiguadores
En algunas incorporaciones, las composiciones comprenden un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador, preferiblemente un amortiguador farmacéuticamente aceptable. Los amortiguadores adecuados para usarse en las soluciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas de la presente invención pueden comprender, pero no se limitan a carbonatos, fosfatos (por ejemplo, agua salada amortiguada con fosfato) , agua salada, histidina, acetatos (por ejemplo, acetato de sodio o acetato de amonio) , amortiguadores acídicos tal como ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio y HCI, y amortiguadores orgánicos tal como lisina, amortiguadores Tris (por ejemplo tris (hidroximetilo) aminoetano) , N-2-hidroxietilpiperazina- ' -2-ácido etanosulfónico (HEPES) , 3-(N-morfolino) ácido propanosulfónico (MOPS) , 2- (N-morfolino) ácido etanosulfónico (MES), N- (2 -acetamido) ácido iminodiacético ("ADA"), piperazina-N, N'-bis (2-ácido etanosulfónico) (PIPES), y N- (2-acetamido) -2-ácido aminoetanosulfónico (ACES) .
Los amortiguadores pueden ser seleccionados con base en la biocompatibidad con el factor de crecimiento derivado de plaquetas y la habilidad del amortiguador para impedir una modificación de proteína no deseable. Los amortiguadores pueden adicionalmente ser seleccionados con base en la compatibilidad con los tejidos anfitriones y la aceptabilidad farmacéutica. En algunas incorporaciones, las composiciones del factor de crecimiento derivado de plaquetas comprenden factor de crecimiento derivado de plaquetas en amortiguador de acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas en amortiguador de acetato de sodio es seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas en amortiguador de acetato de sodio es factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB .
Los amortiguadores pueden ser empleados a diferentes molaridades, por ejemplo entre alrededor de 0.1 mM a alrededor 100 mM, alrededor de 1 mM a alrededor de 100 mM, alrededor de 10 mM hasta alrededor de 100 mM, alrededor de 1 mM a alrededor de 50 mM, alrededor de 5 mM a alrededor de 40 mM, alrededor de 10 mM a alrededor de 30 mM, o alrededor de 15 mM a alrededor de 25 mM, o cualquier molaridad dentro de estos rangos. En algunas incorporaciones, un amortiguador de acetato es empleado a una molaridad de alrededor de 20 mM. Los amortiguadores pueden ser empleados a diferentes concentraciones, por ejemplo, de entre alrededor de 0.01 miligramos/mililitro a alrededor de 10 miligramos/mililitros, 0.05 miligramos/mililitro a alrededor 5 miligramos/mililitro, alrededor 0.5 miligramos/mililitro a alrededor de 5 miligramos/mililitro, 0.1 miligramos/mililitro a alrededor de 1 miligramos/mililitro, y alrededor de 0.5 miligramos/mililitro a alrededor de 1 miligramos/mililitro, o cualquier concentración dentro de estos rangos .
En otras incorporaciones, las soluciones comprendiendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas también pueden ser formadas mediante solubilizar el factor de crecimiento derivado de plaquetas liofilizado en agua, en donde antes de la solubilización el factor de crecimiento derivado de plaquetas es liofilizado desde un amortiguador apropiado.
Las composiciones que comprenden el factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador de acuerdo a algunas incorporaciones de la presente invención pueden tener un pH variando de desde alrededor de 3.0 a alrededor de 8.0 o de desde alrededor de 4.0 a alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, la composición que comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas y el amortiguador tiene un pH variando de desde alrededor de 5.0 a alrededor de 8.0, más preferiblemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 7.0, más preferiblemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5 o cualquier valor dentro de estos rangos. En algunas incorporaciones descritas aquí, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas esta a un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones descritas aquí, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas esta a un pH de entre alrededor de 5.0 y alrededor de 7.0 En algunas incorporaciones descritas aquí, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas esta a un pH de alrededor de 4.0, de alrededor de 5.0, de alrededor de 6.0 ó alrededor de 7.0. El pH de las composiciones comprendiendo un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador, en algunas incorporaciones, puede ser compatible con la estabilidad prolongada y la eficacia del factor de crecimiento derivado de plaquetas o cualquier otro agente activo biológicamente deseado.
El factor de crecimiento derivado de plaquetas es generalmente más estable en un ambiente acídico. Por tanto, de acuerdo con algunas incorporaciones, se proporciona aquí una formulación de almacenamiento acídico de una composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas . De acuerdo con algunas incorporaciones, la composición comprendiendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador preferiblemente tiene un pH de desde alrededor de 3.0 a alrededor de 7.0 y más preferiblemente de desde alrededor de 4.0 a alrededor de 6.5. La actividad biológica del factor de crecimiento derivado de plaquetas, sin embargo, puede ser optimizada en una solución teniendo un rango de pH neutral. Por tanto, en algunas incorporaciones, proporcionadas aquí esta una formulación de pH neutral de una composición comprendiendo un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. De acuerdo con esta incorporación, la composición preferiblemente tiene un pH de desde alrededor de 5.0 a alrededor de 8.0, más preferiblemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 7.0, más preferiblemente de alrededor de 5.5 a alrededor de 6.5.
El pH de la solución es comprendiendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas, en algunas incorporaciones, puede ser controlado mediante los amortiguadores recitados aquí. Varias proteínas demuestran diferentes rangos de pH en los cuales estas son estables. Las estabilidades de la proteína son primariamente reflejadas por los puntos iso eléctricos y las cargas sobre las proteínas. El rango de pH puede afectar la estructura conformacional de una proteína y la susceptibilidad de una proteína a la degradación proteolítica, hidrólisis, oxidación y otros procesos que pueden resultar en la modificación a la estructura y/o a la actividad biológica de la proteína.
En algunas incorporaciones, las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionadas aquí comprenden un factor de crecimiento derivado de plaquetas seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, y PDGF-AB, y un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de PBS, acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano, HEPES, MOPS, MES , ADA, tuberías y ACES . En algunas incorporaciones, las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionada aquí comprenden un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y amortiguador seleccionado del grupo que consiste de PBS, acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano, HEPES, MOPS, MES, ADA, tuberías y ACES. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende rhPDGF-BB y PBS. En algunas incorporaciones la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y el acetato de sodio. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y acetato de amonio. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y ácido acético. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y el ácido cítrico. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y el citrato de sodio. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y tris (hidroximetilo) aminoetano . En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante comprende PDGF-BB y HEPES. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y MOPS . En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y MES. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y ADA. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y PIPES. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y ACES .
En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 1 mM y 1000 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 10 mM y 1000 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 100 mM y 1000 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 5 mM y 500 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 50 mM y 500 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 10 mM y 100 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de entre 20 mM y 200 mM. En algunas incorporaciones descritas aquí, el amortiguador esta a una concentración de 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM o 100 mM.
En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento de plaquetas humano recombinante-AA y 20 mM de acetato de sodio a alrededor de un pH de = 6.0. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivad de plaquetas humano recombinante-AB y 20 mM de acetato de sodio a alrededor de un pH=6.0. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y 20 mM de acetato de sodio a un pH=6.0. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-CC y 20 mM de acetato de sodio a alrededor de un pH=6.0. En algunas incorporaciones, la composición de factor de crecimiento derivado de plaquetas comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-DD y 20 mM de acetato de sodio a alrededor de un pH=6.0.
Dosis y Regímenes de Dosificación
Las dosis efectivas de factor de crecimiento derivado de plaquetas identificadas en un modelo de tendón de rata pueden ser extrapoladas a cantidades efectivas para otros individuos, tal como los humano, con base en el tamaño relativo del área de tratamiento del tendón. Por ejemplo, el área de tratamiento de un tendón de Aquiles humano es aproximadamente 69 veces más grande que el área de tratamiento de un tendón de Aquiles de una rata, de manera que una cantidad efectiva o dosis del factor de crecimiento derivado de plaquetas para un paciente humano puede ser de aproximadamente 69 veces la cantidad efectiva o dosis de un factor de crecimiento derivado de plaquetas determinado en un modelo de tendón de rata.
Las cantidades efectivas de ejemplo o las dosis derivadas para la administración de las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionadas aquí, incluyen, pero no se limitan a alrededor de 450 pg a alrededor de 3,000 pg por dosis, alrededor de 1 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, incluyendo por ejemplo cualquiera de alrededor de 1 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, alrededor de 1 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, a alrededor de 1 pg a alrededor de 2,500 pg por dosis, a alrededor de 1 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 1 a alrededor de 500 pg por dosis, alrededor de 1 pg a alrededor de 250 pg por dosis, a alrededor de 1 pg a alrededor de 100 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 2,500 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 500 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 250 pg por dosis, a alrededor de 10 pg a alrededor de 100 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 5,, 00 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 2.500 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 500 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 250 pg por dosis, a alrededor de 25 pg a alrededor de 100 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 2,500 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 500 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 250 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 100 pg por dosis, a alrededor de 50 pg a alrededor de 100 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 2,500 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 500 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 250 pg por dosis, a alrededor de 75 pg a alrededor de 125 pg por dosis, a alrededor de 100 pg a alrededor de 200 pg por dosis, a alrededor de 200 pg a alrededor de 300 pg por dosis, a alrededor de 300 pg a alrededor de 500 pg por dosis, a alrededor de 500 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, alrededor de 1.000 pg a alrededor de 2,500 pg por dosis, a alrededor de 1,000 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, a alrededor de 1,000 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 1,000 pg a alrededor de 10,000 pg por dosis, alrededor de 2,500 pg a alrededor de 5,000 pg por dosis, alrededor de 2,500 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 5,000 pg a alrededor de 7,500 pg por dosis, a alrededor de 10,000 pg a alrededor de 50,000 pg por dosis, a alrededor de 50,000 pg a alrededor de 100,000 pg por dosis, a alrededor de 100,000 pg a alrededor de 200,000 pg por dosis, a alrededor de 200,000 pg a alrededor de 300,000 µg por dosis, a alrededor de 300,000 pg a alrededor de 400,000 pg por dosis a alrededor de 400,000 pg a alrededor de 500,000 pg por dosis.
En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es administrado a alrededor de 400 pg a alrededor de 1,000 pg por dosis, a alrededor de 500 pg a alrededor de 900 pg por dosis, a alrededor de 600 pg a alrededor de 800 pg, alrededor de 650 pg a alrededor de 750 pg por dosis, a alrededor de 700 pg por dosis.
En algunas incorporaciones, las dosis proporcionadas aquí son administradas en un volumen de 50 pL, 100 pL, 150 pL, 200 pL, 250 pL, 300 pL, 350 pL, 400 pL, 450 pL, 500 pL, 550 pL, 600 pL, 650 pL, 700 pL, 750 pL, 800 pL, 850 pL, 900 pL, 950 pL, 1000 pL o más. En algunas incorporaciones, las dosis proporcionadas aquí son administradas en un volumen de 100 pL, 200 pL, 300 pL, 400 pL, 500 pL, 600 pL, 700 pL, 800 pL, 900 pL, 1000 pL, 1100 pL, 1200 pL, 1300 pL, 1400 pL, 1500 pL, 1600 pL, 1700 pL, 1800 pL, 1900 pL, 2000 pL, o más. En algunas incorporaciones, las dosis proporcionadas aquí son administradas en un volumen de alrededor de 1000 pL, a alrededor de 2000 pL, alrededor de 1250 pL, a alrededor de 1750 pL, alrededor de 1300 pL, a alrededor de 1600 pL, o alrededor de 1500 pL.
Las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionadas aquí pueden ser administradas en una dosis diaria única, o la dosis diaria total puede ser administrada en dosis divididas, por ejemplo, dos, tres o cuatro veces al día. En algunas incorporaciones, una dosis diaria única de las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas proporcionadas aquí puede administrarse una vez al día por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o más días. Las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas también pueden ser administradas menos frecuentemente que en forma diaria, por ejemplo, seis veces a la semana, cinco veces a la semana, cuatro veces a la semana, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada mes, y una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses o una vez cada seis meses.
En algunas incorporaciones, las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas son administradas a intervalos sobre un periodo de tiempo. En algunas incorporaciones, las composiciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas son administradas una vez a la semana por una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más meses. En algunas incorporaciones, las composiciones de factor de crecimiento derivadas de plaquetas son administradas dos veces al mes por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más meses. En algunas incorporaciones, las composiciones del factor de crecimiento derivado de plaquetas son administradas mensualmente por uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más meses.
Métodos para Tratar las Tendinopatías
Como se uso aquí, el término "tendinopatías" se refiere a lesiones de tendón crónicas tal como la tendinosis, la tendinitis y la tenosinovitis . Las tendinopatías de ejemplo, incluyen, pero no se limitan a la tendinopatía de Aquiles, la tendinopatía rotuliana, la epicondilitis lateral o "codo de tenista", la epicondilitis media, la fascitis plantar y la tendinopatía de puño giratorio.
Como se uso aquí, el termino "tendinosis" se refiere a una lesión no inflamatoria del tendón caracterizada por una degeneración intratendinosa del tendón usualmente en la forma de micro rasgados en el tejido en y alrededor del tendón causados por el sobre uso, que lleva a un aumento en el número de células de reparación del tendón alrededor del área del daño. La degeneración del tendón es causada por el daño a o por la desorganización de las fibras de colágeno, células y componentes vasculares del tendón, las cuales pueden reducir la resistencia de tensión del tendón y pueden llevar a una ruptura del tendón si no se tratan. En algunos casos, la tendinosis esta acompañada por una necrosis focal o calcificación del tendón.
Como se usó aquí, el término "tendinitis" se refiere a una lesión inflamatoria del tendón, caracterizada por la degeneración como aquella observada en la tendinosis, pero también acompañada por la inflamación del tendón, la disrupción vascular y una respuesta de reparación inflamatoria. La tendinitis esta frecuentemente asociada con la proliferación fibroblástica y miofibroblástica, así como con la hemorragia y te ido de granulación organizante. La tendinitis esta generalmente esta referida a la parte del cuerpo involucrada, tal como la tendinitis de Aquiles (afectando el tendón de Aquiles) o la tendinitis rotuliana (también conocida como "rodilla de saltador" que afecta el tendón rotuliano) aún cuando hay ciertas excepciones, tal como la epicondilitis lateral (también conocida como el "codo de tenis" que afecta el tendón extensor Carpí Radialis Brevis) .
Las tendinopatías las cuales pueden ser tratadas por los métodos de la invención incluyen las tendinopatías de cualquier tendón en el cuerpo humano o de un mamífero. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es la tendinosis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es la tendinitis. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es la tenosinovitis .
Los tendones los cuales pueden ser tratados por los métodos de la invención incluyen cualquier tendón del cuerpo humano o de un mamífero. Los ejemplos no limitantes de los tendones incluyen el tendón rotuliano, el tendón de tibia anterior, el tendón de Aquiles, el tendón de corva, el tendón semitendinoso, el tendón gracilis, el tendón del abductor, el tendón aductor, el tendón supraespinoso, el tendón infraespinoso, el tendón subescapular, el tendón menor, el tendón flexor, el tendón del recto anterior del muslo, el tendón tibial posterior, y el tendón del cuadríceps femoral.
En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón del pie o del tobillo. En algunas incorporaciones, el tendón del pie o del tobillo es seleccionado del grupo que consiste de el tendón largo gordo extensor, del tendón largo flexor, del tendón largo común de los dedos extensor, del tendón breve común de los dedos extensor, del tendón largo peroneo, del tendón breve peroneo, del tendón breve gordo flexor, del tendón largo común de los dedos flexor, del tendón de tibia posterior, el tendón de Aquiles y de fascia plantar.
En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón de la pierna. En algunas incorporaciones, el tendón de la pierna es seleccionado del grupo que consiste de un tendón rotuliano, el tendón de tibia anterior, el tendón de Aquiles, el tendón de la corva, el tendón casi tendinoso, el tendón gracilis, el tendón secuestrador y el tendón abductor. En algunas incorporaciones, el tendón es seleccionado del grupo que consiste del tendón flexor, el tendón del músculo recto femoral, el tendón posterior de tibia, y el tendón de femoral de los cuadríceps.
En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón del hombro. En algunas incorporaciones, el tendón del hombro es seleccionado del grupo que consiste del tendón supraespinoso, el tendón infraespinoso, el tendón del subescapular, y el tendón menor tere (complejo de puño rotatorio) .
En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón del codo. En algunas incorporaciones, el tendón del codo es seleccionado del grupo que consiste del tendón de bíceps, el tendón de tríceps, el tendón breve radialis carpí extensor, el tendón extensor común, el tendón común de los dedos extensor, el tendón de minimización de digitación extensor, el tendón del carpo carpí extensor, el supinador, el tendón flexor común, el tendón teres pronador, el radialis carpí flexor, el longus palmaris, el tendón del carpo carpi flexor y el superficialis digital. En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón de la muñeca. En algunas incorporaciones, el tendón de la muñeca es seleccionado del grupo que consiste del tendón de bíceps, el tendón de tríceps, el breve radialis carpi extensor, el tendón extensor común, el común de los dedos extensor, el tendón de minimización digitalización extensor, del carpo carpi extensor, el supinador, el tendón flexor común, el teres pronador, el radial carpi flexor, el palmar largo, el carpo carpi flexor, el superficial común de los dedos, el breve del pulgar flexor, el largo del pulgar flexor, el breve pulgar aductor, el largo pulgar abductor, el profundo común de los dedos, el superficial común de los dedos flexor, el superficial común de los dedos flexor, el breve del pulgar extensor, y el largo del pulgar extensor. En algunas incorporaciones, el tendón es un tendón de la mano. Algunas incorporaciones, el tendón de la mano es seleccionado del grupo que consiste del breve del pulgar flexor, el largo del pulgar flexor, el breve del pulgar abductor, el largo del pulgar abductor, el profundo común de los dedos flexor, el superficial común de los dedos flexor, el breve del pulgar extensor y el largo del pulgar extensor.
En algunas incorporaciones, la tendinopatía es tendinopatía de puño rotatorio. En algunas incorporaciones, la tendinopatía de puño rotatorio es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía supraespinosa, tendinopatía infraespinosa, tendinopatía subescapular, y tendinopatía menor teres .
En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una epicondilitis lateral o "codo de tenista" en el origen del grupo de músculo extensor en la inserción de cóndilo de húmero lateral, principalmente en el tendón breve radial del carpo extensor (ECRB) . En algunas incorporaciones, el sujeto teniendo epicondilitis lateral tiene un dolor asociado (por ejemplo, por lo menos de alrededor de seis meses) como se evidencia por el dolor reportado como siendo de =50 sobre una calificación análoga visual (VAS) . En algunas incorporaciones, el sujeto teniendo epicondilitis lateral tiene un dolor asociado que aumenta con la presión sobre el epicóndilo lateral y/o extensión resistida de la muñeca, por ejemplo, por lo menos por alrededor de seis meses. En algunos casos, la tendinopatía es la epicondilitis media o "codo de golfista" en la interfase entre el teres pronador y el origen radialis del carpo flexor del cóndilo humeral medio.
En algunas incorporaciones, la tendinopatía es una tendinopatía rotuliana. En algunas incorporaciones la tendinopatía es tendinopatía de Aquiles. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es fascitis plantar media. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es fascitis plantar lateral .
En otro aspecto, se proporcionan aquí métodos para tratar la tendinopatía comprendiendo administrar una cantidad efectiva de la composición que completar el factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador a un sitio afectado. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD. En algunas incorporaciones, el factor de crecimiento derivado de plaquetas es un factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB . En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 75 pg y alrededor de 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 500 pg a alrededor de 1,000 pg del factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 450 g a alrededor de 3,000 ug del factor de crecimiento derivado de plaquetas por dosis. En algunas incorporaciones, la cantidad efectiva de la composición comprende entre alrededor de 5,000 pg a alrededor de 7,500 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis.
En algunas incorporaciones, el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato ("PBS"), acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetilo) amino etano ("tris"), ?-2-hidroxietilpirazina-N' 2-ácido etano sulfónico ("HEPES"), 3 - (N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2- (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-acetamido) ácido iminodiacético ("ADA"), piperazina-N-N' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2-acetamido) -2 -ácido amonioetanosulfónico ("ACES"). En algunas incorporaciones, el amortiguador es acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de alrededor de 20 mM.
En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a alrededor de un pH de 6.
En algunas incorporaciones, la administración es mediante inyección directa al sitio afectado. En algunas incorporaciones, la inyección directa es lograda usando la técnica de "salpicado" con o sin una guía de ultrasonido. La "técnica de salpicado" es un método de inyección por el que después de que la aguja es insertada adentro del área del tendón, se llevan a cabo múltiples inyecciones pequeñas mediante el retiro, redirección y reinserción de la aguja sin emerger desde la piel.
En algunas incorporaciones, el sitio afectado es una coyuntura ósea-tendón. En algunas incorporaciones, el sitio afectado es un tendón. En algunas incorporaciones, la tendinopatía es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía de Aquiles, tendinopatía rotuliana, epicondilitis lateral, epicondilitis media, fascitis plantar y tendinopatía de puño rotatorio. En algunas incorporaciones, la composición es administrada mediante una inyección única. En algunas incorporaciones, la composición es administrada mediante una inyección única una vez a la semana por cuatro semanas.
En algunas incorporaciones, la tendinopatía es tendinosis . En algunas incorporaciones, la tendinosis es selecciona del grupo que consiste de tendinosis larga gordo extensor, tendinosis larga gordo flexor, tendinosis larga común de los dedos extensor, tendinosis breve común de los dedos extensor, tendinosis larga de peroneo, tendinosis breve y de peroneo, tendinosis breve de gordo flexor, tendinosis larga común de los dedos flexor, tendinosis tibial posterior, tendinosis de tendón de Aquiles, y tendinosis de fascia plantar. En algunas incorporaciones, la tendinosis es selecciona del grupo que consiste de tendinosis rotuliana, la tendinosis de tibia anterior, la tendinosis de tendón de corva, la tendinosis semitendinosa, la tendinosis gracilis, la tendinosis abductora, la tendinosis abductora. En algunas incorporaciones, la tendinosis es selecciona del grupo que consiste de tendinosis flexor, tendinosis de femó recto, tendinosis posterior de tibia y tendinosis cuadríceps femoral. En algunas incorporaciones, la tendinosis es selecciona del grupo que consiste de tendinosis supraespinosa, tendinosis infraespinosa, la tendinosis subescapular y la tendinosis menor teres .
En algunas incorporaciones, la tendinosis es seleccionada del grupo que consiste de tendinosis de bíceps, tendinosis de tríceps, tendinosis breve radial de carpo extensor, tendinosis extensora común, tendinosis común de los dedos extensor, tendinosis minimizada de digitación extensor, tendinosis de carpo carpi extensor, tendinosis supinador, tendinosis flexor común, tendinosis teres pronador, tendinosis radial carpi flexor, tendinosis larga palmar, tendinosis del carpo, carpi flexor y tendinosis superficial común de los dedos. En algunas incorporaciones, la tendinosis es seleccionada del grupo que consiste de tendinosis de bíceps, tendinosis de tríceps, tendinosis breve radial de carpi extensor, tendinosis extensora común, tendinosis común de los dedos extensor, tendinosis minimizada digitalizada extensor, tendinosis del carpo carpi extensor, tendinosis supinador, tendinosis flexor común, tendinosis teres pronador, tendinosis radial carpi flexor, tendinosis larga palmar, tendinosis del carpo carpi flexor, tendinosis superficial común de los dedos, tendinosis breve de pulgar flexor, tendinosis larga de pulgar flexor, tendinosis breve de pulgar abductor, tendinosis larga de pulgar abductor, tendinosis profunda común de los dedos flexor, tendinosis superficial común de los dedos flexor, tendinosis breve pulgar extensor, y tendinosis larga pulgar extensor. En algunas incorporaciones, la tendinosis es seleccionada del grupo que consiste de tendinosis breve de pulgar flexor, tendinosis larga de pulgar flexor, tendinosis breve de pulgar abductor, tendinosis larga de pulgar abductor, tendinosis profunda común de los dedos flexor, tendinosis superficial común de los dedos flexor, tendinosis breve de pulgar extensor y tendinosis larga de pulgar extensor.
En algunas incorporaciones, la tendinopatía es tendinitis. En algunas incorporaciones, la tendinitis es selecciona del grupo que consiste de tendinitis larga gordo extensor, tendinitis larga gordo flexor, tendinitis larga común de los dedos extensor, tendinitis breve común de los dedos extensor, tendinitis larga de peroneo, tendinitis breve de peroneo, tendinitis breve gordo flexor, tendinitis larga común de los dedos flexor, tendinitis tibial posterior, tendinitis de tendón de Aquiles, y tendinitis de fascia plantar. En algunas incorporaciones, la tendinitis es seleccionada del grupo que consiste de tendinitis rotuliana, la tendinitis de tibia anterior, la tendinitis de tendón de corva, la tendinitis semitendinosa, la tendinitis gracilis, la tendinitis abductora, la tendinitis abductora. En algunas incorporaciones, la tendinitis es selecciona del grupo que consiste de tendinitis flexor, tendinitis femoral recta, tendinitis posterior de tibia y tendinitis femoral de cuadríceps. En algunas incorporaciones, la tendinitis es seleccionada del grupo que consiste de tendinitis supraespinosa, tendinitis infraespinosa, tendinitis subescapular, y tendinitis menor teres.
En algunas incorporaciones, la tendinitis es seleccionada del grupo que consiste de tendinitis de bíceps, tendinitis de tríceps, tendinitis breve radial de carpi extensor, tendinitis de extensor común, tendinitis común de los dedos extensor, tendinitis minimizada de dígitos extensor, tendinitis del carpo carpi extensor, tendinitis supinador, tendinitis flexor común, tendinitis teres pronador, tendinitis radial carpi flexor, tendinitis larga palmar, tendinitis del carpo, carpi flexor y tendinitis superficial común de los dedos. En algunas incorporaciones, la tendinitis es seleccionada del grupo que consiste de tendinitis de bíceps, tendinitis de tríceps, tendinitis breve radial carpi extensor, tendinitis de extensor común, tendinitis común de los dedos extensor, tendinitis minimizada digital extensor, tendinitis ulnaris carpi extensor, tendinitis supinador, tendinitis flexor común, tendinitis teres pronador, tendinitis radial carpi flexor, tendinitis larga palmar, tendinitis del carpo carpi flexor, tendinitis superficial común de los dedos, tendinitis breve pulgar flexor, tendinitis larga pulgar flexor, tendinitis breve pulgar abductor, tendinitis larga pulgar abductor, tendinitis profunda común de los dedos flexor, tendinitis superficial común de los dedos flexor, tendinitis breve pulgar extensor, y tendinitis larga pulgar extensor. En algunas incorporaciones, la tendinitis es seleccionada del grupo que consiste de tendinitis breve pulgar flexor, tendinitis larga pulgar flexor, tendinitis breve pulgar abductor, tendinitis larga pulgar abductor, tendinitis profunda común de los dedos flexores, tendinitis superficial común de los dedos flexores, tendinitis breve pulgar extensor y tendinitis larga de pulgar extensor.
El método de la invención puede resultar en la mejora en una o más de los siguientes: disminución del dolor de la coyuntura o miembro afectado, disminución de la rigidez de la coyuntura o miembro afectado, resistencia incrementada de la coyuntura o miembro afectado, disminución de la tasa de progresión de tendinopatía, inflamación disminuida, aumento de la resistencia del tendón o mejora de la tasa de recuperación de la resistencia del tendón. Varios métodos para medir la efectividad del tratamiento incluyen, pero no se limitan a incapacidades del brazo, hombro y calificación de la mano (DASH) , calificación análoga visual, (VAS), y prueba de resistencia de agarre. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en por lo menos una reducción de 25 por ciento en la calificación de tratamiento previo para DASH. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en por lo menos una reducción de 25 por ciento en calificación de tratamiento previo para calificación análoga visual. En algunas incorporaciones, el tratamiento produce una disminución en el dolor con presión aplicada y/o flexión de coyuntura. En algunas incorporaciones, el tratamiento produce una disminución en el dolor con presión aplicada y/o flexión de coyuntura y un aumento en la movilidad de la coyuntura. En algunas incorporaciones, el tratamiento no resulta en ningún crecimiento de hueso a normal. En algunas incorporaciones, el tratamiento no resulta en ningún crecimiento de tendón anormal. En algunas incorporaciones, el tratamiento es seguro y tolerado por el sujeto. En algunas incorporaciones, la seguridad y la tolerancia de la composición es evaluada por la falta de cualquier evento adverso o una anormalidad identificada por uno o más de los siguientes exámenes físico, medición de señal visual, prueba de laboratorio, rayos X y/o formación de imágenes MRI.
En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en una resistencia incrementada del tendón. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en una tasa más rápida de recuperación de resistencia del tendón. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 30 por ciento, de por lo menos de 40 por ciento, de por lo menos de alrededor de 50 por ciento, de por lo menos de alrededor de 60 por ciento, de por lo menos de alrededor de 70 por ciento dentro de alrededor de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ó 21 días de administración de una composición de la invención, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 30 por ciento, de por lo menos de alrededor de 40 por ciento, de por lo menos de alrededor del 50 por ciento, de por lo menos de alrededor del 60 por ciento, de por lo menos de alrededor del 70 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración de una composición de la invención, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor de 60 por ciento dentro de alrededor de 7 días de administración de una composición de la invención, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 65 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración de una composición de la invención, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tratamiento resulta en un aumento en la resistencia del tendón de por lo menos de alrededor del 70 por ciento dentro de alrededor de 7 días de la administración de una composición de la invención, en comparación a una línea de base. En algunas incorporaciones, el tendón logra por lo menos alrededor del 60 por ciento, por lo menos alrededor del 70 por ciento, por lo menos alrededor del 80 por ciento, por lo menos alrededor del 90 por ciento, por lo menos alrededor del 95 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 días de la administración de una composición de la invención, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después del tratamiento. En algunas incorporaciones, el tendón logra por lo menos alrededor del 80 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de administración de una composición de la invención, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después del tratamiento. En algunas incorporaciones, el tendón logra por lo menos alrededor del 85 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración de una composición de la invención, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después del tratamiento. En algunas incorporaciones, el tendón logra por lo menos alrededor del 90 por ciento de su resistencia final dentro de alrededor de 7 días de la administración de una composición de la invención, en donde la resistencia final es medida a alrededor de 21 días después del tratamiento. La resistencia al tendón puede ser medida, por ejemplo, en un modelo animal, por ejemplo, en un modelo de colagenasa de rata, en donde la resistencia del tendón es la carga medida a la ruptura. Un ejemplo de la medición de la resistencia del tendón esta descrita en mayor detalle en el Ej emplo 3.
Equipos
En otro aspecto, se proporcionan aquí equipos que comprenden un recipiente que contiene un compuesto que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. En algunas incorporaciones, los equipos comprenden un primer recipiente que contiene un factor de crecimiento derivado de plaquetas liofilizado y un segundo recipiente que contiene un amortiguador para solubilizar el factor de crecimiento derivado de plaqueta liofilizado. En algunas incorporaciones, los equipos comprenden un primer recipiente conteniendo un factor de crecimiento de derivado de plaquetas liofilizado y un amortiguador, y un segundo recipiente conteniendo agua para solubilizar el factor de crecimiento derivado de plaquetas liofilizado del amortiguador. En algunas incorporaciones, el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato ("PBS"), acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, ("tris") hidroximetilo amino etano, ?-2-hidroxietilopirazina-N' 2-ácido etano sulfónico ( "HEPES" ) , 3 - (N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2 - (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-Acetamido) ácido iminodiacetico ("ADA"), piperazina-N-N' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2 -acetamido) -2-ácido aminoetanosulfónico (ACES"). En algunas incorporaciones, el amortiguador es acetato de sodio. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a una concentración de alrededor de 20 mM. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a un pH de entre alrededor de 4.0 y alrededor de 7.0. En algunas incorporaciones, el acetato de sodio esta a alrededor de un pH de 6.
En algunas incorporaciones, los equipos además incluyen otros materiales deseables desde una terapéutica comercial, y desde un punto de vista de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquete con instrucciones para el uso. Como se empleo aquí el término "inserto de paquete se refiere a las instrucciones acostumbradas incluidas en paquetes comerciales de medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones acostumbradas incluidas en los paquetes comerciales de medicamentos que contienen información acerca del uso, indicaciones de dosis, administración contra indicaciones, otros medicamentos que pueden ser combinados con el producto empacado y/o advertencias en relación al uso de tales medicamentos .
Suturas
Como se proporcionan son suturas recubiertas de factor de crecimiento derivado de plaquetas y métodos para hacer tales suturas. Las suturas pueden ser usadas, por ejemplo, para tratar un tendón en un individuo (por ejemplo, tratar un rasgado de tendón o ruptura de tendón) . La suturas adecuadas incluyen por ejemplo, aquellas hechas de co-polímeros de láctico y glicólico (tal como suturas de Vicryl (por ejemplo suturas 4-0 Vicryl) ) . Los métodos de recubierto adecuados incluyen por ejemplo, los métodos de recubrimiento con embebido tal como el método de recubrimiento de embebido descrito por Diñes J, L Weber, Razzano P, y otros. "El Efecto de Diferenciación de Crecimiento de Suturas Recubiertas con Factor-5 sobre la Reparación del Tendón en un Modelo de Rata. J Shoulder Elbow Surg 2007; 16 : 215S-221S) , que pueden opcionalmente ser alterados para eliminar la gelatina. Los solicitantes han encontrado sorprendentemente que las altas dosis de factor de crecimiento derivado de plaquetas pueden ser recubiertas sobre ciertos tipos de suturas en ausencia de gelatina. En algunas incorporaciones, la sutura no comprende gelatina. En algunas incorporaciones, el recubrimiento de sutura no comprende gelatina. En algunas incorporaciones, el recubrimiento de sutura no comprende ácido poli láctico, poliglicólico o poli (láctico-co-glicólico) . En algunas incorporaciones, el método de recubrimiento de sutura no comprende el utilizar gelatina. En algunas incorporaciones, el recubrimiento de sutura consiste esencialmente de factor de crecimiento derivado de plaquetas. En algunas incorporaciones, el recubrimiento de sutura consiste de un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador. En algunas incorporaciones, el recubrimiento de sutura consiste de un factor de crecimiento derivado de plaquetas. Las suturas pueden ser usadas para tratar un individuo por ejemplo, un mamífero. Los ejemplos, no limitantes de los mamíferos los cuales pueden ser tratados usando una sutura de la invención incluyen los humanos, los animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos, conejos, hámster, etcétera) los animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas) animales de campo (por ejemplo, caballos, vacas, ovejas, cabras, etcétera) .
En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre las suturas de por lo menos de alrededor de 10 ng de sutura de factor de crecimiento derivado de plaquetas/centímetro. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de por lo menos de alrededor de 100 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas/centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargado sobre la sutura es de por lo menos de alrededor de 1000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas/centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre las suturas de por lo menos de alrededor de 5,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas/centímetro. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de por lo menos de alrededor de 6,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por sentimiento de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de alrededor de 10 a alrededor de 20,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de alrededor de 100 a alrededor de 10,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargada sobre la sutura es de alrededor de 500 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargada sobre la sutura es de alrededor de 1,000 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de alrededor de 4,000 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas cargadas sobre la sutura es de alrededor de 6,000 a alrededor de 7,000 ng de factor derivado de crecimiento de plaquetas por centímetro de sutura.
En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberado desde la estructura sobre 48 horas como se midió in Vitro es de por lo menos de alrededor de 10 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberado desde la sutura sobre 48 horas como se midió en Vitro es de por lo menos de alrededor de 100 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada de la sutura sobre 48 horas, como se midió in Vitro es de por lo menos de alrededor de 1,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada desde la sutura sobre 48 horas como se midió en Vitro es de por lo menos de alrededor de 5,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada desde la sutura sobre 48 horas como se midió en Vitro es de por lo menos de alrededor de 6,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. El algunas incorporaciones, la cantidad anulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberado desde la sutura sobre 48 horas como se midió in Vitro es de alrededor de 10 a alrededor de 20,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada desde la sutura sobre 48 horas como se midió in Vitro es de alrededor de 100 a alrededor de 10,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada sobre la sutura sobre 48 horas como se midió in Vitro es de alrededor de 500 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberado sobre la sutura sobre 48 horas como se midió en Vitro es de alrededor de 1,000 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada de la sutura sobre 48 horas como se midió in Vitro es de alrededor de 4,000 a alrededor de 8,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. En algunas incorporaciones, la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas liberada desde la sutura sobre 48 horas como se midió en Vitro es de alrededor de 6,000 a alrededor de 7,000 ng de factor de crecimiento derivado de plaquetas por centímetro de sutura. Los métodos adecuados para medir la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas que puede liberarse in Vitro incluyen, por ejemplo, el método descrito en el Ejemplo 7. Las suturas recubiertas de la invención pueden ser proporcionadas ventajosamente para una dosificación consistente en vivo .
Los siguientes ejemplos se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no se intentan para limitar el alcance de la invención en ninguna manera.
E J E M P L O S
Ejemplo 1: Tenocitos Humanos Primarios Normal y de Enfermedad Proliferan en Respuesta al Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB
Este estudio determino si el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB directamente activo la proliferación y/o la quimiotaxis de los tenocitos primarios derivados de pacientes con tendinopatías . Tales hallazgos pueden soportar la noción del potencial terapéutico del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en las tendinopatías .
Pacientes y Métodos
Los pacientes
Diez pacientes con tendinopatías fueron involucrados en este estudio, incluyendo cinco pacientes con tendinopatías de Aquiles y cinco pacientes con tendinopatía del tendón de tibia posterior (PTT) . Cinco pacientes adicionales fueron involucrados los cuales sufrieron un reemplazo de coyuntura completa de la rodilla.
Cultivos Primarios de Tenocitos
El tejido del tendón el cual de otra manera será descartado fue obtenido de tendones normales y lesionados durante procedimientos de cirugía reconstructivos llevados a cabo por indicaciones clínicas. Estos tejidos incluyendo la parte de tendinopatía de los tendón de Aquiles o PTT, así como la parte saludable (no tendinopática) del tejido de tendón largo común de los dedos flexor, del tejido de tendón de Aquiles y del tejido de tendón rotuliano. Los cultivos de tenocito primario fueron obtenidos de testos tejidos y se probaron en pasadas de tres a cinco. La identidad del tenocito fue confirmada mediante evaluar la expresión de los genes y esclerosis de gen específica de tenocito para colágenos al (I) , a2 (I) y al (III) en ensayos PCR de tiempo real con imprimadores específicos.
Proliferación de la célula
Las monocapas de tenocitos fueron tripsinizadas , resuspendidas en un medio de DMEM/F12 contiendo 0.5 por ciento de suero bovino fetal dializado, se dejan sujetar durante la noche y después son incubadas con concentraciones dosificadas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB por 24 horas. Los cambios en las tasas de proliferación de célula fueron evaluados con base en la incorporación de Brdü durante la síntesis de ADN en células usando un ensayo comercialmente disponible (Roche Applied Science, Indianápolis , Estados Unidos de América) . Cada cultivo fue probado en triplicado para cada dosis de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB .
Migración de Célula
Las monocapas de tenocito fueron tripsinizadas , resuspendidas en un medio DMEM/F12 contiendo 0.5 por ciento de suero bovino fetal dializado, se colocaron en una cámara superior de un sistema de migración de células desechable de 96 -pozos CHemoTxMARCA REGISTRADA (de Neuro Probé, de Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos de América) . Las cámaras inferiores contuvieron concentraciones dosificadas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Los tenocitos se dejaron migrara a través de la membrana separando las cámaras por 48 horas. Las placas de 96 pozos fueron entonces desespumadas y congeladas y descongeladas tres veces para lisar las células migradas. La cantidad de células migradas viables fueron medidas con base en la de hidrogenasa de lactato citoplásmico (LDH) usando un estuche comercialmente disponible de Promega (de Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América) .
Análisis Estadístico
Un ANOVA de una vía fue usado para determinar si el estimulo con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB afecta la proliferación de tenocitos en una forma dependiente de la dosis.
Resultados
Solo los cultivos de tenocito pero no los cultivos de fibroblasto pulmonar de control o los cultivos de T linfocito primario de control expresaron esclerosis, mRNA, en donde los tenocitos y fibroblastos pero no los linfocitos expresaron el gen de colágeno mRNAs .
En todos los casos los tenocitos del tejido de tendón involucrados o no involucrados en el proceso de enfermedad respondieron al estimulo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB mediante el acelerar la incorporación de BrdU (p <0. 05, ANOVA de una vía) . Las respuestas fueron dependientes de la dosis y fueron observadas a 10.50 y 150 ng/mL del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Aún cuando todos los cultivos de célula respondieron al estimulo del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, hubo una variación significante entre los pacientes en la magnitud de la incorporación de BrdU después del estimulo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. La incorporación del BrdU aumento desde un mínimo de 2.1 ± 0.2 veces aún máximo de 10.7 ± 0.5 veces en comparación a los cultivos no estimulados de control . Los tenocitos de cinco pacientes respondieron paradójicamente, con un aumento mayor en la incorporación de BrdU a una tasa más baja (10 ng/mL) , que las concentraciones superiores (50 y 150 ng/mL) de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . Tal respuesta paradójica fue observada en tenocitos derivados de ambos tejidos tendinopáticos y normales de estos pacientes. Los tenocitos derivados de tendones saludables de 4 pacientes incorporados dos veces más el BrdU en respuesta al estimulo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB que lo que lo hicieron los tenocitos derivados de tejidos enfermos. En un paciente, los tenocitos del tejido enfermo incorporaron cuatro veces más BrdU en respuesta al estimulo del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante que lo que lo hicieron los tenocitos del tejido no involucrado en el proceso de enfermedad. La figura 2 muestra la incorporación de BrdU (absorbencia eje-x) para 0, 10, 50 y 150 ng/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas agregado al medio de cultivo a un día, al día 4 y al día 8 para tenocitos saludables y enfermos. Un aumento en la absorbencia que corresponde con la proliferación incrementada, con ambos los tenocidos saludables y enfermos respondieron al factor de crecimiento derivado de plaquetas sobre el día 1.
En todos los casos, los tenocidos respondieron quimotácticamente al factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB a 50 ng/ml y 150 ng/ml . Los tenocidos no fueron expuestos a 10 ng/mL. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB para los experimentos de quimiotaxis, debido a la baja respuesta en los experimentos piloto. De nuevo, las respuestas fueron dependientes de la dosis con mayor quimiotaxis a 150 ng/mL, que a 50 ng/mL de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Sin embargo los tenocitos de cinco pacientes respondieron con una quimiotaxis mayor a 50 ng/mL que a 150 ng/mL del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, con una declinación significante en el número de células migradas (p <0. 05, prueba-t de Estudiante de dos- lados) . Hubo una variabilidad entre los pacientes en la repuesta quimo táctica máxima al factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, desde un aumento de 1.4 + 0.1 a 4.0 ± 0.5 veces en comparación al control no estimulado. No hubo una diferencia estadísticamente significante (p > 0.05) en la quimiotaxis de tenocito a el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB dentro de los cultivos de tenocito que hacen juego derivados de tejido de tendón saludables o tendinopáticos . La Figura 1 muestra la quimiotaxis de células (el eje-x muestra una densidad óptica incrementada) cultiva a concentraciones de 0, 50 ó 150 ng/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas . La migración fue evaluada a 1,250, 2,500, 5,000 y 10,000 células iniciales.
Conclusión
Los resultados de estos experimentos sugieren que los tenocitos derivados de tejidos saludables y tendipáticos responden al factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB debieron aumentar la proliferación y las tasas de quimiotaxis. En forma importante, los tenocitos de algunos pacientes mostraron una respuesta paradójica al factor de crecimiento derivado de plaquetas, en la cual las dosis superiores provocaron menos efecto que las dosis inferiores. En forma igualmente importante, los tenocitos de los tendones enfermos respondieron en algunos casos en forma diferente al factor de crecimiento derivado de plaquetas en contra de los tenocitos de tendones saludables, implicando que la dosis adecuada puede ser de una importancia fundamental en el ambiente clínico.
Ejemplo 2: Estudios de Seguridad con Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB
Prueba de Inyección Local
El propósito de este estudio fue el determinar la toxicidad local del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB después de la entrega de intra-tendón de Aquiles a ratas. La administración de tendón intra-Aquiles imita la ruta de administración del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en la clínica para el tratamiento de epicondilitis lateral. El sitio de inyección en la coyuntura de tendón de Aquiles-calcánea imita el sitio de inserción del tendón breve radiales del carpo extensor y del hueso epicondilo lateral.
El estudio uso las ratas Sprague Dawley. Los animales fueron albergados en la misma instalación de laboratorio por la duración del estudio. Todo el albergue y crianza fueron de acuerdo con la ley de cuidado de los animales y la "guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio" . Las ratas fueron alimentadas y se les dio agua de acuerdo con protocolos estándar. El agua y los alimentos se retuvieron para los eventos relacionados al estudio y apropiados tal como la anestesia. Los animales fueron aclimatados a la instalación por un mínimo de cinco días antes del estudio. Este periodo de aclimatación permitió a los animales el acostumbrarse al ambiente del cuarto de estudio.
Tres cargas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante estéril-BB a diferentes concentraciones fueron usadas en el estudio: (1) 10.3 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5; (2) 5.2 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, un amortiguador de acetato de sodio de 20mM, pH 6.0+0.5; y (3) 1.7 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5. La muestra de control de vehículo fue estéril a 20mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5, y se preparó de acuerdo a los procedimientos estándar.
Los procedimientos de seguridad de laboratorio estándar fueron empleados para el manejo de la prueba y de los artículos de control. Específicamente, se usaron los guantes, las mascaras para la cara, las batas (o trajes de laboratorio) y la protección para los ojos mientras que se prepararon y administraron las dosis.
Los animales fueron puestos al azar en cuatro grupos, con n=60 por grupo, con cada grupo teniendo 30 machos y 30 hembras. Cada uno de los grupos recibió una inyección intra-tendón única en la coyuntura osteotendinosa del músculo cuadríceps de los siguientes compuestos: (1)20 mM de acetato de sodio; (2) 51 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio; (3) 156 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio; o (4) 515 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio. Las inyecciones se llevaron a cabo con jeringas de insulina equipadas con una aguja de 28.5G. Todos los animales recibieron el artículo de prueba sobre el día 1 a través de una inyección de tendón de intra-Aquiles única. Los animales del Grupo I recibieron acetato de sodio (NaOAc) , mientras que los animales del Grupo 2-4 recibieron el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB a niveles de dosis de 36.69 y 112.23 y 370.50 g/mm2, respectivamente.
Un tercio de cada grupo fue sacrificado en el día 1, en 2 semanas y 6 semanas después de la inyección del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . Al completarse los grupos de tratamiento en vida, los animales fueron sometidos a eutanasia y los tejidos se cosecharon de acuerdo con la Ley del Cuidado de Animales USDA, la Guía para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio (publicación ILAR 1996, Prensa de la Academia Nacional) y los procedimientos veterinarios HSS. Los animales fueron sometidos a eutanasia mediante una sobre dosis de C02, la muerte fue confirmada por falta de reflejos (guiños, retiro, etcétera) .
Los criterios para la evaluación incluyeron observaciones clínicas, evaluaciones físicas, mediciones de consumo de alimentos y peso del cuerpo, patología clínica, necropsia, pesos de órganos y evaluación de histopatología de los tobillos de pierna trasera inyectados y no inyectados, incluyendo un examen de la toxicidad del tendón y la toxicidad del hueso.
Los animales sufrieron una evaluación hematológica, un estudio de coagulación, y una variedad de estudios químicos clínicos. La evaluación hematológica incluyo las siguientes mediciones: una cuenta de leucocito (WBC) ,· una cuenta de eritrocito (glóbulos rojos) , una determinación de hemoglobina (Hb) , niveles de hemoglobina corpuscular medios (MCH) ; hematocrito (HCT) , y concentración Hb corpuscular media (MCHC) ; una cuenta de plaquetas; determinación del volumen corpuscular medio (MCV) , y una evaluación del diferencial de leucocito, incluyendo neutrófilo, linfocito, monocito, eosinófilo, basófilo, por ciento de neutrófilo, por ciento de linfocito; por ciento de monocito, y por ciento de eosinófilo) . El estudio de coagulación midió el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y tiempo de protrombina (PT) . Los estudios químicos clínicos incluyeron el análisis de lo siguiente.- fosfatasa alcalina (ALP) , glucosa (GLU) , albúmina (ALB) , alanina aminotransferasa (ALT) , bilirrubina total (TBIL) , globulina (Glob) , aspartato aminotransferasa (AST) , colesterol (CHOL) , potasio (K) , gama glutamiltransferasa (GGT) , triglicéridos (TRIG) , cloruro (Cl) , creatinina (CREAT) , nitrógeno de urea de sangre (BUN) , sodio (Na) , fósforo inorgánico (PHOS) , calcio (Ca) , proporción de A/G, y proteína total (TPROT) .
Resultados
La inyección de intra-tendón Alquiles única de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB a las ratas a niveles de dosis de 36.69 g/mm2 , 112.23 g/mm2 , 370.50 g/mm2 no tuvo efectos sobre la mortalidad. Además, no hubo diferencias significantes biológicamente asociadas con el artículo de prueba en las observaciones clínicas, efectos sobre el peso del cuerpo o consumo de alimentos.
El día 2, no hubo diferencias estadísticamente o biológicamente significantes en cualquiera de los parámetros de hematología o de análisis de orina analizada para cualquiera de los grupos de ratas tratadas cuando se compararon a los controles (Grupo I) . Los cambios fueron observados en el leucocito y en los parámetros de ovulación, pero estos cambios fueron consistentes con la respuesta inflamatoria aguada mínima para la inyección de una proteína ajena. En adición, los cambios mínimos también fueron observados en varios parámetros de química de suero. Sin embargo, estos cambios fueron considerados como siendo el resultado de la variación de animal individual, no fueron considerados como siendo biológicamente significantes, y no estuvieron asociados con ninguna toxicidad específica de órgano.
En los días 16 y 43, no hubo diferencias biológicamente significantes en cualquiera de los parámetros de hematología, leucocito, coagulación o análisis de orina analizados para cualquiera de los grupos de ratas tratadas cuando se compararon a los controles (Grupo I) .
No hubo observaciones macroscópicas asociadas con el artículo de prueba; todas las observaciones macroscópicas fueron consideradas como siendo incidentales.
La hemorragia aguda y la inflamación subcutánea fueron observadas el día 2 en los controles y los grupos tratados de ratas, aún cuando la frecuencia y la severidad aparecieron siendo mayor en los grupos tratados de ratas. El día 16, la hemorragia aguda había cedido y la inflamación sub aguda fue no frecuente. Los grupos tratados a ratas demostraron fibroplasia y neovascularización de los paratendones del tendón flexor superficial y del tendón calcáneo en adición a la hipertrofia y la hiperplasia de los tenocitos de los tendones antes mencionados. En el día 43, la severidad de la fibroplasia y de la neovascularización había cedido. Los tenocitos aún demostraron hipertrofia e hiperplasia en la mayoría de las ratas tratadas.
Prueba de Inyección Local de Segundas Especies
El objetivo de este estudio es la determinación de la toxicidad local del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante (rhPDGF-BB) después de la entrega intra al tendón de Aquiles a los perros.
El estudio usa perros Beagle. Los animales son albergados en la misma instalación de laboratorio para la duración del estudio. Todo el alberge y crianza es de acuerdo con la ley de cuidado de animales y la "guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio" . Los perros son alimentados y se les dio agua de acuerdo con los protocolos estándar. El agua y los alimentos fueron retirados para los estudios apropiados a los eventos relacionados tal como la anestesia. Los animales fueron aclimatados a la instalación por un mínimo de cinco días antes del estudio. Este periodo de aclimatación permite a los animales el acostumbrarse al ambiente del cuarto de estudio.
Tres cargas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante estéril-BB a diferentes concentraciones son usadas para el estudio: (1) 10 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH de 6.0+0.5; (2) 3 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, en 20mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5; y (3) 1 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5. La muestra de control de vehículo es amortiguador de acetato de sodio de 20 mM estéril, de un pH de 6.0±0.5, y se preparó de acuerdo a los procedimientos estándar.
Los procedimientos de seguridad de laboratorio estándar son empleados para el manejo de la prueba y los artículos de control. Específicamente, son usados los guantes, la mascara para la cara, las batas (o trajes de laboratorio) y las protecciones para los ojos mientras que se prepararon y administraron las dosis.
Los animales son puestos al azar en cuatro grupos, con n=24 por grupo, con cada grupo teniendo 12 machos y 12 hembras. Los grupos cada uno recibieron una inyección única intra-tendón en la coyuntura osteotendinosa del músculo de cuadríceps de las siguientes composiciones: (1)20 mM de acetato de sodio; (2) 1.5 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio; (3) 4.5 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio; o (4) 15 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato sodio. Las inyecciones se llevan a cabo con jeringas de insulina equipadas con una aguja de 28.5G con un volumen de dosis fijo de 1.5 mililitros.
Un tercio de cada grupo es sacrificado en el día 1, a 2 semanas y a 6 semanas después de la inyección del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Al completarse los grupos de tratamiento en vida, los animales fueron sometidos a eutanasia y los tejidos fueron cosechados de acuerdo con la Ley del Cuidado de Animales (USDA) , la guia para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicación ILAR, 1996, Prensa de la Academia Nacional), y en los procedimientos veterinarios HSS . Los animales fueron sometidos a eutanasia mediante exanguinación bajo una anestesia profunda inducida con pentobarbital de sodio (Fatal-Plus"""* REGISTRADA o una alternativa apropiada) .
Los animales sufrieron una evaluación hematológica, un estudio de coagulación, y una variedad de estudios químicos clínicos .
La evolución hematológica incluye las siguientes medidas: cuenta de leucocitos (WBC) ; cuenta de eritrocitos (RBC) ; determinación de hemoglobina (Hb) , niveles de hemoglobina corpuscular media (MCH) ; hematocrito (HCT) , y concentración de Hb corpuscular media (MCHC) ; cuenta de plaquetas; determinación de volumen corpuscular medio (MCV) , y una evaluación del diferencial de leucocito, incluyendo neutrófilo, linfocito, monocito, eosinófilo, basófilo, por ciento de neutrófilo, por ciento de linfocito; por ciento de monocito, y por ciento de eosinófilo) . El estudio de coagulación mide el tiempo de tromboplastxna parcial activado (APTT) y el tiempo de protrombina
(PT) . Los estudios químicos clínicos incluyen análisis de lo siguiente: fosfatasa alcalina (ALP) , glucosa (GLU) , albúmina
(ALB) , aminotransferasa alanina (ALT) , bilirrubina total (TBIL) , globulina (Glob) , aspartato aminotransferasa (AST) , colesterol
(CHOL) , potasio (K) , gama glutamiltransferasa (GGT) , triglicéridos (TRIG) , cloruro (Cl) , creatinina (CREAT) , nitrógeno de urea sangre (BUN) , sodio (Na) , fósforo inorgánico (PHOS) , calcio (Ca) , proporción de A/G, y proteína total (TPROT) .
La histopatología de tejido local es también evaluada incluyendo un examen de la toxicidad de tendón y de la toxicidad de hueso.
El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante no es toxico para los perros.
Toxicidad sistémica aguda. El objetivo de este estudio es determinar la toxicidad sistémica del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB administrado mediante inyección intravenosa.
El estudio usa las ratas Sprague-Dawley . Los animales son albergados en la misma instalación de laboratorio por la duración del estudio. Todo el albergue y crianza es de acuerdo con la ley del cuidado de animales y la "Guía para el Cuidado y el Uso de Animales de Laboratorio" . Los animales son alimentados y se les da agua de acuerdo con los protocolos estándar. Los alimentos y el agua son retirados para los eventos relacionados con el estudio apropiado tal como la anestesia. Los animales son aclimatados a la instalación por un mínimo de cinco días antes del estudio. Este periodo de aclimatación permite a los animales el acostumbrarse al ambiente del cuarto de estudio.
El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante estéril-BB a 3.0 mg/mililitro y 0.3 mg/mililitro en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0±0.5 se uso en el estudio. En el día de dosificación, una parte de la solución de 0.3 miligramos/mL se diluyo en 1:10 en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio para crear una solución de 0.03 miligramos/mililitro la cual también se uso en el estudio. La muestra de control es 20 mM de amortiguador de acetato de sodio estéril, pH 6.0+0.5, y se preparó de acuerdo a procedimientos estándar.
Los procedimientos de seguridad de laboratorio estándar son empleados para el manejo de la prueba y los artículos de control. Específicamente, los guantes, la mascara para la cara, las batas (o trajes de laboratorio) y los protectores para ojos son empleados mientras que se preparan y administran las dosis.
Los animales son puestos al azar en cuatro grupos, con n=40 por grupo (20) machos y 20 hembras por grupo. El grupo de dosis I recibe una inyección intravenosa única de 20 mM de acetato de sodio, pH 6.0±0.5 a un volumen de 1.4 mililitros/kilogramo; el grupo de dosis 2 recibe una inyección intravenosa única de 3.0 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20mM de acetato de sodio, pH 6.0±0.5, a un volumen de 1.4 mililitros por kilogramo; el grupo de dosis 3 recibe una inyección intravenosa única de 0.3 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato de sodio, pH de 6.0±0.5, a un volumen de 1.4 mililitros por kilogramo; el grupo de dosis 4 recibe una inyección intravenosa única de 0.3 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de acetato de sodio, pH de 6.0+0.5 a un volumen de 1.4 mililitro por kilogramo.
Los animales son evaluados para la muerte y otros signos de toxicidad severa. Durante la duración del estudio, los animales fueron observados respecto de la viabilidad, los exámenes clínicos, los pesos del cuerpo, el consumo de alimentos, el examen oftálmico, y la patología clínica. Con la necropsia en el día 2 y en el día 14 (10 machos y 10 hembras/grupo/punto de tiempo) , los animales sufrieron una evaluación de patología clínica, incluyendo hematología, coagulación, química de suero y análisis de orina, así como una necropsia completa.
Ejemplo 3: Respuesta de Dosis de Aplicación Intra-Tendón (IT) del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB en el Modelo de Inyección de Tendón de Aquiles de Rata Inducido por Colágeno
El objetivo del estudio fue el determinar la respuesta de dosis en una aplicación intra tendón del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en un modelo de colagenasa de tendón de rata para valuar los efectos de reparación del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre la lesión de tendón de Aquiles y la remodelación. Nosotros tenemos la teoría de que la entrega intra-tendón del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB resultara en la reparación del tendón mediante el regular hacia arriba la proliferación de células y el restaurar la resistencia biomecánica del tendón.
El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (rhPDGF-BB) es mitogénico y quimiotáctico para las células de origen mesenquimal, tal como osteoblastos , tenocitos, células madre mesenquimales y condrocitos. Por tanto, cuando se introducen en los sitios musculoesqueléticos de la lesión, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante atrae las células del tejido conector y los progenitores al sitio de tratamiento, estimulando su proliferación, resultando en números incrementados de células las cuales subsecuentemente depositan la matriz para regenerar el tejido o te idos lesionados. En adición, como se muestro en el Ejemplo 1 dado arriba, los tenocitos expuestos al factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB mostraron un aumento en la síntesis de ADN y en la quimiotaxis.
Modelo de lesión de tendón de Aquiles de rata inducido- colagenasa
No hay un modelo bien establecido único para la evaluación de la tendinopatía . Sin embargo, el modelo de lesión de tendón de Aquiles de rata inducido por colagenasa se ha usado ampliamente para la lesión de tendón de Aquiles. Este modelo inicia una respuesta de tendón degenerativa en relación al ser equivalente a la tendinitis, y desarrolla la lesión de tendinitis rápidamente (dentro de 3 días) en comparación a el modelo de sobre uso de molino camino arriba (4 meses) . Por tanto, es un modelo rápido para analizar el efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre la lesión de tendón. Por tanto, el modelo goza un periodo de inducción relativamente rápido y es altamente adecuado y representativo de la tendinitis clínica como un análisis para el efecto terapéutico del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB .
Un total de ciento sesenta y cinco (165) ratas de Sprague Dawley macho fueron usadas en este estudio. A estas se les administró una inyección de colágeno en su tendón de Aquiles derecho seguido por un tratamiento único de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB o un control (amortiguador solamente) en el sitio de la lesión de 7 días después de la inyección de colágeno. La colagenasa y el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB o el control (amortiguador solamente) fueron inyectados dentro de los tendones de Aquiles derechos de las ratas cerca de la coyuntura ósea-Tendón usando jeringas de insulina con agujas de 28.5G.
Los animales fueron divididos en 11 grupos con n=15 en cada grupo, como se delineo en la Tabla 1. Los estudios reportados en la literatura utilizando este modelo han usado históricamente 8-9 animales para el grupo de tratamiento para la prueba biomecánica y 3-6 animales para el análisis histológico.
Artículos de Prueba y de Control
El grupo de control de estudio utilizo la respuesta de reparación natural del tendón de rata en el tendón de Aquiles de rata tratado con colagenasa sin el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB como un control para aproximar la respuesta de sanado natural de un tendón lesionado. El artículo de prueba de estudio uso el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB como una droga que puede ser inyectada para ayudar en la regeneración del tendón. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante BB (rhPDGF-BB) es mitogénico y quimiotáctico para las células de origen mesenquimal, tal como los osteoblastos , los tenocitos, los condrocitos y las células mesenquimales . Por tanto, cuando se introduce dentro de los sitios músculo esqueléticos de la lesión, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB a trae las células de tejido conector y los progenitores para el sitio tratamiento, estimulando su proliferación, resultando en números incrementados de células las cuales subsecuentemente depositan la matriz para regenerar el tejido o tejidos lesionados. En adición, como se mostró en el Ejemplo 1 dado arriba, los tenocitos expuestos al factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB mostraron un aumento en la síntesis de ADN y en la quimiotaxis.
Dos cargas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB estéril a diferentes concentraciones fueron usadas en el estudio: (1) 3.4 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH de 6.0±0.5; y (2) 0.34 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH de 6.0±0.5. La muestra de control de vehículo fue 20 mM de amortiguador de acetato de sodio estéril, pH 6.0+0.5, preparado de acuerdo a los procedimientos estándar. Las dosis incluyen 1.02 pg, 10.2 g y 102 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . Dos concentraciones del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en amortiguador de NaOAc fueron preparadas: 3.4 miligramos/mililitro y 0.34 miligramos/mililitro. Cuando se entrego a 30 µ? intratendón, 102 xg y 10.2 g a niveles de dosis fueron logrados. Para la dosis de 1.02 µg< la solución de 0.34 mg/mL fue diluida 1:10 con 20 mM de NaOAc de amortiguador. La colagenasa fue comprada en forma de polvo de Sigma-Aldrich (Catalogo No. C-6885; de Saint Louis, Missouri, Estados Unidos de América) y se le constituyo a la concentración deseada (10 miligramos/mililitro) en PBS conteniendo 50 mM de NaH2P04 y 150 mM de NaCl a un pH de 7.4±0.5.
En la iniciación del estudio, por lo menos dos recipientes no usados y no abiertos de 3.4 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, 0.34 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y 20 mM de amortiguador de acetato de sodio artículos de prueba fueron retenidos bajo las mismas condiciones de almacenamiento (4 grados centígrados) como los recipientes usados para la dosificación, estabilidad y análisis de concentración. La estabilidad y el análisis de verificación de dosis se llevaron a cabo usando la espectrofotometría UV/Vis y el análisis HPLC de fase inversa.
Los procedimientos de seguridad de laboratorio estándar fueron empleados para el manejo de la prueba y de los artículos de control de vehículo. Específicamente, fueron usados los guantes, mascara para la cara, batas (o batas de laboratorio) y protectores para los ojos mientras que se prepararon y administraron las dosis.
Sistema de Pruejba (Cuidado de Animal y Animales)
Ciento sesenta y cinco (165) ratas Sprague Dawley machos (de Charles River Laboratorios, Int'l, de Wilmington, Massachussets, Estados Unidos de América, fueron usadas en este estudio. Antes de la selección del estudio, todos los animales fueron evaluados mediante examen visual para asegurarse de la salud y normalidad. Todos los animales fueron seleccionados para el estudio con base en su peso (aproximadamente 315 gramos al momento de la inyección de colágeno) . Cada rata fue identificada por un número único escrito sobre sus colas . Las ratas fueron asignadas al azar a cada grupo de acuerdo a sus pesos del cuerpo.
Las ratas fueron albergadas en la misma instalación del laboratorio por la duración del estudio. Todo el albergue y crianza fue de acuerdo con la Ley del Cuidado de Animales y la "Guía para el Cuidado y el uso de Animales de Laboratorio" . Los alimentos y el agua se retiraron para los eventos relacionados al estudio apropiado tal como la anestesia pero de otra manera se proporcionaron como se desea. Los animales fueron aclimatados a la instalación por un mínimo de cinco días antes del estudio. El periodo de aclimatación permitió a los animales el acostumbrarse al ambiente del cuarto de estudio.
Diseño Experimental
Los animales (15 por grupo) , albergados 4 por jaula, fueron anestesiados con isoflurano y el área del jarrete se sujeto y se limpio para la inyección. La colagenasa (50 µ? de 10 mg/mililitros se disolvió en solución amortiguada con fosfato conteniendo 50 mM de NaH2P04 y 150 mM de NaCl a un pH de 7.4) fue inyectada en los tendones de Aquiles derechos de todas las ratas cerca de la unión óseo- tendón usando las jeringas de insulina con agujas de 28.5G (Figura 3). Siete días después de la inyección de colagenasa, los tratamientos con vehículo o 1.02 g, 10.2 g o 102 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 30 µ? de volumen total se administraron usando jeringas de insulina con agujas de 28.5G. Los animales se terminaron a 7 días (línea de base) 14 días y 28 días para la evaluación histopatológica del daño de tendón y biomecánicas. En cada grupo de 15 animales, 6 de los animales fueron usados para la histopatología y las patas traseras de 9 animales (ambos miembros traseros tratados y no tratados) fueron removidas, se sometieron a disección y se congelaron para la evaluación biomecánica subsiguiente. La descripción de la evaluación biomecánica se proporciona abajo.
Observaciones y Mediciones en Vida
Los animales fueron observados por los menos diariamente hasta el sacrificio. El tratamiento de los animales fue de acuerdo con la regulaciones delineadas en la Ley para el bienestar de animales USDA (9 CFR, Partes I, 2 y 3) y las condiciones especificadas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación ILAR, 1996, Prensa de la Academia Nacional) y Procedimientos Veterinarios HSS.
Los pesos del cuerpo fueron registrados antes de la inyección de colagenasa y antes del sacrificio. El consumo de alimentos fue cualitativo.
Todos los animales fueron sacrificados en los puntos de extremo de estudio apropiados . No se observaron ningunas muertes de animales no programadas . Al completarse los grupos de tratamiento en vida, los animales fueron sometidos a eutanasia y los tejidos se cosecharon de acuerdo con la Ley del Bienestar de Animales USDA. La Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación ILAR, 1996, Prensa de la Academia Nacional) y Procedimiento Veterinario HSS. Los animales fueron sometidos a eutanasia mediante sobre dosis de CC½ . La muerte fue confirmada por falta de reflejos (guiños, retiro, etcétera) .
Tamaño de Tendón Grueso
Inmediatamente antes de la necropsia, los tobillos fueron calificados por el grosor de acuerdo a los siguientes sistemas: 0= sin crecimiento; 1 = crecimiento ligero; 2= crecimiento moderado; 3 = crecimiento severo.
Histología
En la necropsia, la piel fue removida cuidadosamente del área de jarrete con la pata completa sumergida en 10 por ciento de formalina amortiguada neutral (NBF) y fijada en flexión. Después de un mínimo de 12 horas en 10 por ciento de formalina amortiguada neutral y 4-5 días en 10 por ciento de ácido fórmico para descalcificación, el tobillo, con énfasis especial en la coyuntura de tendón-ósea fue recortado ambos medianamente y lateralmente para lograr un tej ido de aproximadamente de un cuarto de pulgada de grosor (parte central del tobillo con inserción del tendón) y se coloco en casetes de tejido etiquetados. El bloque de tejido de tobillo recortado fue procesado por sumergimiento de parafina en la orientación sagital. Usando un micrótomo rotatorio, las secciones representativas de 4-6 mieras de grosor fueron tomadas en secciones de paso de 200 mieras hasta que una visualización adecuada de la coyuntura ósea-tendón fue lograda y esas secciones fueron entonces manchadas con hematoxilina y eosina (H&E) , de Masson tricroma y para la detección immunohistoquimistica (IHC) de antígeno nuclear de célula proliferante (PCNA) .
Todos los animales fueron sangrados para el suero terminalmente mediante la aorta descendiente mientras que están bajo anestesia de Isoflurano (se recolectaron 10 mis de sangre) . La sangre fue centrifugada a 1,800 g a la temperatura ambiente por 10 minutos para obtener el suero. Hasta un 1 mililitro de suero fue proporcionado en tubos de 2 mi Eppendorf^" R*018™"» . El suero fue almacenado a menos 70 grados centígrados antes del análisis .
La evaluación histopatológica fue llevada a cabo como se describió abajo. Las mediciones para los diferentes parámetros se hicieron mediante el evaluar tres columnas de campo aquí distantes desde cada espécimen histológico (platina) usando la microscopía ligera.
Los parámetros medidos para la histopatología incluyeron :
(1) Inflamación. Los tipos de célula inflamatoria (neutrofilis , linfocitos y macrófagos) fueron determinados mediante manchado H&E . La inflamación fue marcada como sigue: (a) 0= sin inflamación; (b) 1 = inflamación mínima (100 por ciento mononuclear; sin neutrófilos) ; (c) 2 inflamación moderada (neutrófilos = 19 por ciento; resto de células mononuclear) ; y (d) 3= inflamación marcada (neutrófilos = 20 por ciento; resto de células mononuclear) .
(2) Organización de Colágeno. La organización de fibrilos de colágeno fue evaluada mediante manchado H&E y Trocromo. La organización de colágeno fue marcada como sigue: (a) 0= fibrillas de colágeno están completamente desorganizadas; (b) 1= alguna alineación de las fibrillas de colágeno pero la mayoría de los manojos están altamente desorganizados; (c) 2= las fibrillas de colágeno están altamente alineadas sin embargo, los manojos están aún algo desorganizados; y (d) 3= las fibrillas de colágeno presentes en el tejido están completamente alineadas y no hay desorganización de los manojos de colágeno.
(3) Densidad de Fibra de Colágeno. La densidad de fibra de colágeno en el tejido de reparación fue evaluada mediante manchado H&E y Tricromo. La densidad de fibra de colágeno fue marcada como sigue: (a) 0= manojos de colágeno de densidad baja; (b) 1= manojos de colágeno de densidad media; y (c) 2= manojos de colágeno de alta densidad.
(4) Vascularización de Tendón en sitio de reparación. La vascularización en el tejido de reparación fue determinada mediante manchado H&E y Tricromo. La vascularización fue calificada como sigue: (a) 0= ninguno (ninguna vascularización presente) ; (b) 1= moderada; y (c) 2 = abundantemente .
(5) Proliferación de Célula. La proliferación de célula fue evaluada usando la inmunohistoquímica (IHC) para PCNA (anfígeno nuclear de célula proliferante) . Un micrómetro ocular fue usado para delinear un área que fue de 39.4 x 197 µ?? (7,762 µp?2) o 10 x 50 unidades sobre el micrómetro. Tres campos teniendo las mediciones fueron contadas para cada espécimen. Las células proliferantes fueron contadas para estos tres campos equidistantes .
(6) mediciones de ancho de tendón. Las mediciones del tendón en dos lugares diferentes fueron tomadas bajo microscopio y usando un micrómetro ocular. Las mediciones fueron tomadas del punto de sujeción calcáneo (área no tangencial pensada como que representa mejor el grosor del sitio de sujeción) y el tendón mismo (área no tangencial más gruesa del cuerpo de tendón remota desde el sitio de sujeción con la respuesta proliferativa asociada) .
Los datos de histopatología casi cuantitativos fueron analizados usando la Prueba Mann-Whitney U o la prueba Kruskal-Wallis (no paramétrica) . Los datos aplicables fueron analizados a través de todos los grupos usando un análisis de una vía de variación (ANOVA de 1 vía) , junto con la prueba posterior de comparación múltiple apropiada.
Prueba Biomecánica
99 animales fueron utilizados para esta parte del estudio. El tendón inducido con lesión fue evaluado en adición a los tendones tratados sin colágeno contra laterales. Un total de 123 especímenes biomecánicos fueron evaluados. Los lugares de tratamiento están delineados en la Tabla 1 dada arriba.
La pata fue desprendida del fémur y desmangada a la mitad del pie. Usando un escalpelo, el complejo Aquiles-gastrocnemios fue separado de la tibia. Brevemente, empezando en la inserción calcaneal el escápelo fue corrido a o largo de la tibia para separar el complejo y una mayoría del músculo se dejó sujetada al tendón para permitir el agarre para la prueba biomecánica. Después de la separación del tendón, la tibia fue removida en la coyuntura con el metatarso, dejando el pie sujetado para agarrar el extremo distal para la prueba biomecánicas (Figura 4) . El espécimen de metatarso-Achilles-gastrocnemios completo fue envuelto en una gasa empapada en agua salada y se congelo a -20 grados centígrados para almacenamiento antes de llevar a cabo el análisis biomecánico.
Las muestras fueron congeladas en agua salada amortiguada con fosfato conteniendo inhibidores de proteinaza a 4 grados centígrados hasta por 4 horas antes de la prueba mecánica. Las muestras de tendón fueron secadas y el músculo de acceso fue removido para facilitar el montaje de las muestras en las agarraderas. El hueso fue recortado con unas tijeras para facilitar el montaje.
Toda la prueba mecánica se llevo a cabo sobre un cuadro de prueba Instron (Modelo 5566) todas las muestras fueron probadas mientras que se sumergieron en un baño contenido agua salada amortiguada con fosfato. El control de desplazamiento preciso fue aplicado a cada espécimen, y la carga resultante fue medida usando una celda de carga de 100N con una exactitud de carga de ± 0.5 por ciento. Todos los datos de adquisición y el dispositivo de control se realizaron con una computadora personal, en donde los datos serán adquiridos a 10 Hz .
Los especímenes fueron montados en agarraderas hidráulicas entre dos placas de superficie áspera y papel lija a fin de evitar el resbalado de la muestra durante la prueba de jalado. Una carga previa de 0.1 N fue aplicada a los especímenes, y la longitud del espécimen fue registrada seguido por el precíelo por diez ciclos entre las cargas de 0.1 y 1N. Un desplazamiento de tensión uniaxial fue aplicado a las construcciones a una tasa de tensión de 0.1 por ciento por segundo, y la carga resultante fue registrada. Las muestras serán probadas a la falla en tensión, hasta que la fractura es alcanzada y la carga medida es observada como siendo de <0.05N. Antes de la prueba, el área en sección transversal del espécimen fue medida. Todos los especímenes fueron probados a ciegas sin indicación de clasificación de grupo identificable .
Después de la prueba, los datos recolectaron fueron analizados para determinar (1) la rigidez lineal y (2) el modulo elástico desde la parte lineal de la curva de esfuerzo- ensión o desplazamiento-carga respectivamente. La carga máxima y la resistencia a la tensión última fueron también determinadas de los datos de carga. La fuerza elástica definida como el área bajo la curva de desplazamiento de fuerza hasta la carga pico, será calculada numéricamente usando el método de suma Reimann.
Un A OVA de dos vías con interacción y una Prueba post-hoc LSD de Fisher's (p<0.05) fue usada para el análisis de los datos biomecánicos. Los datos aplicables fueron analizados a través de todos los grupos, usando un análisis y una vía de variación (ANOVA de 1 vía) junto con la prueba posterior de comparación múltiple apropiada.
El esfuerzo es la carga sobre el espécimen normalizado al área en sección transversal de la muestra. La tensión representa la carga en longitud del espécimen normalizado a la longitud original de la muestra. Consecuentemente, la curva de esfuerza contra tensión es una versión normalizada de la curva de carga contra desplazamiento (elimina el efecto de variación en las dimensiones de espécimen) . Por ejemplo, un tendón mas largo tendrá un desplazamiento total mayor. Por otro lado, un tendón más ancho puede soportar más carga que uno más estrecho. Estas variaciones ligeras en las dimensiones de espécimen a espécimen afectan significativamente la magnitud de la carga y el desplazamiento que pueden suportar. Cuando estas variables son normalizadas por sus dimensiones a esfuerzo y tensión, el análisis ya no dependerá del tamaño del espécimen. Todas las propiedades extraídas directamente de las curvas de carga contra desplazamiento son referidas a propiedades estructurales. Todas las propiedades extraídas de las cuervas de esfuerzo contra tensión normalizadas son referidas a propiedades materiales.
La rigidez lineal es la propiedad estructural que es determinada de un ajuste menos-cuadrado de la porción lineal de la curva de carga contra desplazamiento. Esto representa la rigidez de tensión del espécimen.
El modulo elástico es una propiedad material que es determinada de un ajuste menos-cuadrado de la porción lineal de la curva de esfuerzo contra tensión. Esto representa la rigidez de tensión del material de tendón.
La carga máxima es la carga más grande que el espécimen puede soportar durante el jalado.
El esfuerzo de tensión último es la carga máxima normalizada por el área en sección transversal del espécimen.
La dureza es la resistencia de un material a la fractura o al rompimiento. Esta es usualmente medida en unidades de energía, y se calcula como el área bajo la curva de carga-desplazamiento hasta la falla.
Resultados
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre el grosor de tobillo o grueso.
Un aumento dependiente de la dosis en el grosor del tobillo grueso fue observado siete días posteriores a la inyección intra-tendón única del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (Figura 6A y Figura 7, día 7 Post Tx) , con la dosis media (10.2 pg) y la dosis alta (102 g produciendo una aumento significante el tamaño del tendón a siete días después de la inyección. En el día 21 Post Tx, todos los grupos, excepto el grupo de control de vehículo (el amortiguador de acetato de sodio) exhibieron una disminución en el grosor del tobillo grueso, sugiriendo la remodelación de tejido a el día 21 después del tratamiento (Figura 6B y Figura 7, día 21 Post Tx) . Los datos en las Figuras 6A, 6B y 7 fueron basados sobre una escala análoga a 7 y 21 días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (0= sin crecimiento a 3= crecimiento severo. Los datos reportaron son medios del grosor de tobillo (± SEM) de n=6 animales por grupo. Efecto del factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre los Pesos del Cuerpo
En el tiempo del tratamiento, el peso del cuerpo promedio de los animales fue de 314.48 gramos. A 7 y 21 días después del tratamiento los pesos de cuerpo promedio fueron de 396.4 y de 467.0 gramos respectivamente. No hubo cambios relaciones al tratamiento en el peso del cuerpo en cualquier punto del tiempo.
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre el hueso.
Ningún crecimiento de hueso a normal o reabsorción fueron identificados.
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre el ancho del tendón en la unión Calcánea.
La Figura 8 muestra el ancho de tendón medido ( m +
SEM) en la inserción calcánea al día 7 y al día 21 después del tratamiento. Los datos reportados son medios del ancho del tendón (+ SEM) en la inserción calcánea de n=6 animales por grupo; *p=0.01 contra grupo de control de vehículo. El ancho del tendón fue medido por microscopía usando un micro metro ocular.
Siete días después del tratamiento (Día 7 Post Tx) fue observado un aumento significante (-137 por ciento de aumento) en el ancho del tendón en la inserción calcánea con 32.4 g/kilogramo de grupo de dosis de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en comparación a el vehículo se observo (Figura 8, Día 7 Post Tx) . Los animales tratados con 3.24 y 324 g/kg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB no demostraron un aumento significante en el ancho del tendón, pero tendieron en forma superior en comparación al control de vehículo. Ninguna diferencia significante entre los anchos del tendón de los animales tratados con o sin factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue determinada al Día 21 después del Tratamiento (Figura 8, Día 21 Post Tx) . Al día 21 después del tratamiento (Figura 8, Día 21 Post Tx) , el grupo de dosis de 32.4 g/kilogramos de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB exhibió una disminución de 40 por ciento en el acho del tendón en comparación a el Día 7 después del tratamiento, sugiriendo que el tendón se remodelo (Figura 8) .
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de
Plaquetas Humano Recombinante-BB Sobre el Ancho del Tendón en el Cuerpo Medio del Tendón
La Figura 9 representa el ancho de tendón medido (pm + SEM) en el cuerpo medio del tendón al Día 7 y al Día 21 después del tratamiento. Los datos reportados son medios del ancho del tendón (+ SEM) en el cuerpo del tendón de n=6 animales por grupo; * p<0.05 contra grupo de vehículo) . El ancho del tendón fue medido mediante microscopía usando un micrómetro ocular.
Un aumento de ~ 97 por ciento en el ancho del tendón fue observado con la dosis de 32.4 pg/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB contra el grupo de control de vehículo a el Día 7 después del Tratamiento (Figura 8, Día 7 Post Tx) . Un aumento dependiente de la dosis no significante fue observado en los grupos de dosis de 3.24 y 324 µg/kilogramo contra los grupos de vehículo y de no tratamiento (Tx) . Al día 21, no fueron observadas diferencias significantes en los anchos del tendón a través de los grupos (Figura 9, Día 21 Post Tx) . Sin embargo, al Día 21, el grupo de dosis de 32.4 g/kilogramos de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB exhibió una disminución de 116 por ciento en el ancho del tendón en comparación al Día 7 después del tratamiento, sugiriendo que el tendón se remodelo.
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre la Proliferación de Células
La cuantificación de la Proliferación de Células se hizo mediante cuantas de célula inmunomanchadas PCNA positivo (Figura 10) . Los datos reportados son medios de las cuentas de células (± SEM) de n=6 animales por grupo; *p<0.05 contra vehículo. Tres campos teniendo una medición igual fueron contados para cada espécimen.
Un aumento dependiente de dosis en la densidad celular fue observado en los grupos de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB . Un aumento dependiente de la dosis en el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en la proliferación de células fue observado en el Día 7 después del tratamiento (Figura 10, Día 7, Post x) , un aumento significante en la proliferación de células fue observado en los grupos de dosis de 32.4 y 324 pg/kilogramos contra el control de vehículo (Figura 10, Día 7 , Post Tx) , representando un aumento de ~ 60 por ciento y de -72 por ciento respectivamente. Sin embargo, por el Día 21, ninguna diferencia significante en la proliferación de células fue observada (Figura 10, Día 21 Post Tx) . Un retorno al nivel de proliferación de control de vehículo fue observado para los grupos de dosis de 32.4 y de 324 g/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, indicando que la respuesta de proliferación de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue reversible (Figura 10, Día 21, Post Tx) .
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre la Inflamación.
La inflación media a moderada consistente de macrófagos y mononucleares fue observada a través de todos los grupos en todos los puntos de tiempo (Tabla 2) .
Tabla 2 : Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas
Humano Recombinante-BB sobre la Inflamación Usando una Escala
Análoga (0 = no inflamación a 3 = inflamación severa a 7 y 21 días después del tratamiento.
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano i?ecombinante-SB sob e la Vascularización.
Ningún cambio significante en la vascularización fue observada través de los grupos y de los puntos de tiempo (Tabla 3) .
Tabla 3 : Efecto de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre la vascularización usando una escala análoga (0) - ninguna a 2= severa a 7- y 21-días después días del tratamiento .
Efecto del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre la Densidad de Colágeno
Ningún cambio significante de la densidad de colágeno fue observado a través de todos los grupos y de todos los puntos de tiempo (Tabla 4) .
Tabla 4 : Efecto de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre densidad de colágeno usando una escala análoga (0= ninguna a 2= severas a 7- y 21- días después del tratamiento
Efecto del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre organización de colágeno.
Ningún cambio significante en la organización de colágeno fue observado a través de todos los grupos y todos los puntos de tiempo (Tabla 5) .
Tabla 5 : Efecto de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante sobre la organización de colágeno usando una escala análoga (0= ninguna a 3= altamente organizada) a 7- y 21-días después del tratamiento.
Biomecánicas: Efecto de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre carga máxima a la ruptura .
En este modelo, el grupo no tratado espontáneamente reparo como una función de tiempo basada sobre los valores de carga máxima a ruptura (Figura 11) . Los valores de carga máxima media ruptura a 7 días depuse del tratamiento fuero aumentados significativamente (~ 43 por ciento y 27 por ciento, respectivamente) en el grupo de dosis de 32.4 pg/kilogramo contra el control de vehículo y los grupos de no tratamiento (Figura 11, Día 7 Post Tx) . Por el día 21 del tratamiento posterior, la carga máxima a ruptura fue un significativamente aumentado en comparación al control de vehículo (Figura 11, Día 21 Post Tx) . Al día 21 después del tratamiento, la carga máxima media para el grupo de dosis de 32.4 pg/kilogramo y los grupos de no tratamiento fue similar, indicando que el tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB aumento la tasa de reparación sobre la de no tratamiento. Sin embargo, los grupos de vehículo y de 324 pg/kilogramo de factor humano y crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB tuvo valores de carga máxima a ruptura significativamente mas bajos que el grupo de dosis de 32.4 µg/kilogramo y del grupo de no tratamiento a 21 días después de la dosis. Los datos reportados son medios de carga Máxima ruptura (+ SEM) de n=9 animales por grupo; +p<0.05 contra grupo de "vehículo", **p<0.05 contra grupo de "sin tratamiento" . La tabla 6 representa la resistencia mecánica de los tendones contra laterales no dañados y de los tendones tratados con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y no tratados.
Tabla 6 : Valores de Carga Máxima a Ruptura (N+ SEM) para tendones de Aquiles a 7-, 14- y 28- días después de la inyección de colagenasa.
Los datos reportados son medios de carga máxima o ruptura (± SEM de n= 9 animales por grupo) .
El valor de ruptura a carga máxima principal en el grupo de 32.4 pg/kilogramo en el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (26.8 N) en el día 14 posterior a la inyección de colagenasa fue aumentado por 41 por ciento sobre los tendones no dañados (19.03 N) en el día 14 después de la inyección de colagenasa. Esto sugiere que las propiedades biomecánicas en el grupo de 32.4 pg/kilogramo del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB valora más rápido que el tendón que se desarrolla normal. Además, la carga máxima media a ruptura del grupo de 32.4 pg/kilogramo del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (26.8 N) en el Día 14 después de la inyección de colagenasa se acerco aquel de los tendones no dañados (27.98 N) en el Día 28 posterior la inyección de colágenas. Los valores de carga máxima a ruptura en los grupos no dañados y sin tratamiento (inyectados con colagenasa) a 7 días, 14 días y 28 días fueron similares. En el día 14 (Día 7 Post Tx) , el grupo de 32.4 pg/kilogramo del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB tuvo valores de ruptura a carga máxima superiores que los grupos de vehículo, no daños y sin tratamientos, con aumentos de 43 por ciento, 41 por ciento, y 27 por ciento respectivamente. Sin embargo, en el día 28 (Día 21 Post Tx) la carga máxima a ruptura en los grupos no dañados, sin tratamiento y de 32.4 pg/kilogramo factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue similar (Tabla 6) .
Conclusiones
Parámetros en Vida
Los resultados de grosor de tobillo demostraron que siete días después del tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB no hay un aumento dependiente de dosis en el tamaño de tendón pero a los 21 días el crecimiento se ha detenido y el tejido se remodela a un tamaño disminuido .
No hubo una diferencia significante en los pesos de cuerpo a través de los grupos y puntos de tiempo.
Evaluación Microscópica
El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB aumento proliferación celular específicamente fibroblástica en naturaleza. Los aumentos en la proliferación celular y los anchos de tendón microscopio fueron reversibles, indicando una fase de adaptación posible para remodelar el tejido.
No fueron observados efectos adversos locales del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB después de una entrega intra- endón de una única vez sobre un periodo de tiempo de tres semanas bajo las condiciones de este estudio. No hubo un crecimiento de hueso o tendón anormal, y no hubo una reabsorción de hueco identificada. La información fue mononuclear en naturaleza. La morfología de las células fue fibroblástica en naturaleza.
Biomecánicas
Los datos de carga biomecánica a ruptura indicaron que el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB inicio una respuesta de reparación más rápida en la resistencia mecánica del tendón cuando se compara en los cohortes no tratados con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Aún cuando hubo algún retorno a la línea de base para la proliferación de células y ancho de tendón por el día 21 después del tratamiento, esto no resulto en una perdida biomecánica de la resistencia del tendón.
Síntesis
El resultado biológico y biomecánico este estudio valido la seguridad local del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB inyectado en el tendón. Después de una inyección de una sola vez de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, hubo una fase inicial de crecimiento de tendón que abatió sobre el periodo de tiempo de 21 días. Este estudio mide el ancho de tendón bajo microcopio usando un micrómetro ocular y proliferación de células usando inmunomanchado PCNA. Los resultados de estas mediciones indicaron que los animales tratados con 32.4 pg/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB tuvo un aumento en anchos de tendón microscópico y proliferación celular a 7 días después del tratamiento. Sin embargo, por el día 21 después del tratamiento, los anchos de tendón y proliferación regresaron a niveles de control. Ni hueso ectopico ni anormal, ni crecimiento de tendón aberrante fue observado sobre el periodo de tiempo de 21 días después de la inyección del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB dentro del tendón.
Los aumentos iniciales en ancho de tendón microscópico y la proliferación de células corresponden a un aumento en la resistencia mecánica del tendón. Aún cuando hubo un retorno a la línea de base para la proliferación de células y ancho de tendón por el día 21 después del tratamiento, esto no resulto en una pérdida biomecánica de la resistencia del tendón, más bien, la mejora biomecánica del tendón fue sostenida.
El resultado de este estudio puede ser especialmente interesante en la clínica para tratar los pacientes con epicondilitis lateral. En la epicondilitis lateral hay cambios degenarativos al tendón brevis radialis-carpi extensor (ECRB) que se manifiestan como dolor y disminución funcional del brazo y de la mano involucrados a la carga tolerada. Se espera que el aumento de resistencia biomecánica y modificaciones estructurales den tendón como una consecuencia de la terapia de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB que fue mostrado en el modelo de tendinopatía de Aquiles de rata descrito en este estudio, se traducirá clínicamente en abrogación del dolor y restauración de función para paciente que sufren de epicondilitis lateral.
Ejemplo 4. Farmacocinéticas de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB (rhPDGP-BB) en ratas Sprague-Dawley Después de la Administración Intravenosa del factor de crecimiento derivado de plaquetas Humano Recombinante-BB.
El propósito de este estudio fue devaluar las farmacocinéticas del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB administrado como una dosis intravenosa única a las ratas Sprague-Dawley macho. Este estudio fue diseñado para evaluar la clarificación del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB inocente desde el fluido del cuerpo (suero) seguido de la administración intravenosa. Para entender mejor la naturaleza farmacocinética y farmacodinámica del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante, el despeje sistémico seguido a la exposición intravenosa fue determinado .
Nosotros tenemos la teoría de que el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB exhibirá una tasa más rápida de despeje después de la administración intravenosa .
Diseño de Estudio
Modelo de Rata
La rata es un modelo de roedor usado comúnmente para evaluar la farmacocinética y toxicidad de varias clases de químicos y existe una base de datos histórica grande para la rata. Un total de cuarenta y ocho (48) ratas Sprague Dawley macho fueron usadas en este estudio. Los animales fueron divididos en dos grupos con seis animales por grupo por un punto de tiempo (Tabla 7) . Este estudio fue diseñado para usar el número más pequeño de animales posible, consistente con el objetivo del estudio, las necesidades científicas de los inventores y los estándares científicos contemporáneos. El diseño proporciono tamaños de grupos suficientes para permitir el análisis significante de los datos. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue administrado a través de entrega intravenosa con jeringas de insulina (28.5 G) dentro de la vena de cola lateral .
Artículos de Pruejba y de Control
El artículo de prueba fue 0.4 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH: 6.0 +/-0.5. El artículo de control fue 20mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0 +/-0.5.
En la iniciación del estudio, por lo menos dos recipientes no usados y no abiertos del 0.4 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y 20 mM de artículos de pruebas de amortiguador de acetato de sodio (Acetato) fueron retenidos bajo las mismas condiciones de almacenamiento (4 grados centígrados) al ser usados los recipientes para la dosificación, estabilidad y concentración de análisis. La estabilidad y los análisis de verificación de dosis se llevaron a cabo, los cuales consistieron de espectrofotometría UV/Vis y análisis HPLC de fase inversa (Apéndices II) .
Los procedimientos de seguridad de laboratorio estándar fueron empleados para manejar la prueba y los artículos de control. Específicamente, fueron usados los guantes, las mascaras para la cara, las batas (o trajes de laboratorio) y protectores para los ojos mientras que se prepararon y administraron las dosis.
Sistema de Prueba
Fueron usadas cuarenta y ocho (48) ratas Sprague Dawley macho en este estudio. Las ratas usadas en este estudio fueron seleccionadas con base en sus pesos . El peso promedio f e de aproximadamente de 227 gramos en el momento del tratamiento. Cada rata fue identificad por un número de cola único que fue escrito con un marcador permanente. Los alimentos y el agua fueron retenidos para eventos relacionados al estudio apropiado tal como la anestesia pero de otra manera fueron previstos ad libitum. Antes de la selección de estudio, todos los animales fueron analizados respecto de un examen visual.
Administración de Artículo de Prueba
La entrega intra venosa fue escogida para lograr 100 por ciento de biodisponibilidad y de propiedades farmacocinéticas del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante en suero. El nivel de dosis fue seleccionado con base en el estudio de eficacia de respuesta-dosis previo de la aplicación intra-tendón del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el modelo de colagenasa de tendón de rata (vea el Ejemplo 3) . La concentración de dosis máxima que va ser usada en este estudio es de 100 pg ó 0.44 mg/kilogramo, con base en las ratas que pesan 0.227 kilogramos.
Cuarenta y ocho ratas fueron pesadas y distribuidas al azar en dos grupos de veinticuatro ratas por grupo. Las ratas fueron asignadas al azar a cada grupo de acuerdo a sus pesos de cuerpo .
Los pesos de cuerpo fueron registrados a una dosis previa. Los animales del Grupo 1 recibieron una dosis intravenosa única de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB a 0.44 mg/kilogramo (440 g/kilogramo a un volumen de dosis de objetivo de 1.1 mL/kilogramo. Los animales del Grupo 2 recibieron el control de vehículo (amortiguador NaOAc) a un volumen de dosis de objetivo de 1.1 mL/kilogramo. La inyección intra venosa fue lograda por acercamiento de vena de cola lateral usando jeringas de insulina (28.5 G) . Aproximadamente 300 µ? de suero fueron recolectados.
Tabla 7. Grupos de Tratamiento
*Veces de Recolección de Sangre :
Animales de 1-6 en todos los grupos = Línea de Base, 1 minuto, 1 hora, 48 horas
Animales de 7-12 en todos los grupos = Línea de Base, 5 minutos, 4 horas, 72 horas
Animales de 13-18 en todos los grupos = Línea de Base, 10 minutos, 8 horas, 96 horas Animales de 19-24 en todos los grupos = Línea de Base, 20 minutos, 24 horas, 168 horas Observaciones Clínicas
Los animales fueron observados por lo menos diariamente hasta el sacrificio. Los pesos de cuerpo fueron registrados antes de la inyección del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y antes del sacrificio. El consumo de alimentos fue cualitativo.
Todos los animales fueron sacrificados en los puntos finales de estudio apropiados. Al completarse los grupos de tratamiento en vida, los animales fueron sometidos a eutanasia a través de una sobre dosis de C02. La muerte fue confirma por la falta de reflejos (guiño, retiro, etcétera) . No se condujo una histopatología o grande en este estudio. No fueron registradas muertes de animales no programadas.
Colección de Suero
Aproximadamente 600 µ? de sangre fueron recolectados en tubos de suero y se centrifugaron a 1,800 gramos a la temperatura ambiente por 10 minutos para obtener el suero. Aproximadamente 300 µ? de suero fueron proporcionados en tubos eppendorf de 2 mililitros. El suero fue almacenado a -70 grados C antes del análisis.
Análisis de Suero
Las concentraciones de suero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fueron medidas en cada punto de tiempo. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue cuantificado usando el equipo Quantikine ELISA de R&D systems .
Análisis Farmacocinético
Un modulo no compartamental de WinNonlin fue usado para calcular los siguientes parámetros: vida media terminal (tl/2) , Tmax, Cmax, AUCO-último y CL. El análisis fue llevado a cabo usando la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB presente en diferentes puntos de tiempo como se determino en el suero usando el ensayo de equipo Quantikine ELISA.
Estadísticas
Los análisis estadísticos fueron limitados a paramentos descriptivos tales como desviaciones estándar y medias y coeficiente de variación como sea apropiado.
Resultados
El peso de cuerpo promedio de todos los animales en el momento del tratamiento fue de 227 gramos. Los animales recibieron una dosis promedio de 440.53 g/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
Los valores de tiempo y concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de suero principal están ilustrados en la Figura 12. El Cmax (6161.2 ng/mL) fue logrado a un 1 minuto de dosis posterior. Después hubo una disminución de la concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB entre 5 minutos y 1 hora. Las concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB estuvieron debajo del nivel de cuantificación (<0.156 ng/mL) desde 1 a 168 horas.
La Tabla 8 representa la disposición farmacocinética de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB administrado IV en ratas Sprague-Dawley macho. La dosis promedio entregada fue de 440 g/kilogramo . Tmax fue observado a 0.0167 horas (1 minuto) con un Cmax de 6161.2 ng/mL. El AUCO-último fue de 375.64 horas*ng/mL y el despeje (CL) fue de 17.5 mL/minuto por kilogramo.
Tabla 8 Análisis de Datos Farmacocinéticos para Dosis IV
Conclusión
La administración (IV) intravenosa del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB resulto en una exposición sistémica inicial alta. Esta es una molécula de despeje intermedio que es rápidamente eliminada de la sangre sobre los primeros 10 minutos después de la dosificación.
Ejemplo 5. Farmacocinéticas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en ratas Sprague Dawley después de la administración intra-tendón del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
El propósito de este estudio fue el evaluar las farmacocinéticas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB administradas como una dosis intra-tendón única a las ratas Sprague Dawley macho. Este estudio fue diseñado para evaluar la exposición sistémica de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y el despeje después de la entrega intra-tendón.
Diseño de Estudio
Modelo de Rata
La rata es un roedor usado comúnmente para evaluar las farmacocinéticas y toxicidad de varias clases de químicos y existe una base de datos histórica granda para la rata. Un total de treinta dos (2) ratas Sprague Da ley macho son usadas en este estudio. Los animales fueron distribuidos al azar en cuatro grupos de 8 animales por grupo (Tabla 9) . Este estudio fue diseñado para usar el número menor de animales posibles, consistente con el objetivo del estudio, las necesidades científicas de los inventores y los estándares científicos contemporáneos. El diseño proporciona tamaños de grupos suficientes para permitir un análisis significante de datos.
Artículos de Prueba y de Control
Los artículos de prueba fueron como sigue: (1) 3.4 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH: 6.0 +/-0.5; y (2) 0.34 miligramos/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH: 6.0 +/-0.5. El artículo de control fue 20 mM de amortiguador de acetato de sodio, pH 6.0 +/-0.5.
En la iniciación del estudio, por lo menos dos recipientes no usados y no abiertos de 3.4 y de 0.34 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y 20 mM de artículos de prueba y de control de amortiguador de acetato de sodio (Acetato) fueron retenidos bajo las mismas condiciones de almacenamiento (4 grados centígrados) como los recipientes usados para el análisis de dosificación, estabilidad y concentración. Los análisis de verificación de estabilidad y dosis se llevaron a cabo, los cuales consistieron de análisis de espectrofotometría UV/Vis y HPLC de fase inversa.
Las dosis incluidas en este estudio fueron de 1.02, 10.2 y 102 ig de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Las dosis 102 y de 10.2 g fueron logradas por la inyección de 30 µ? de 3.4 miligramos/mililitro y 0.34 miligramos/mililitro, respectivamente. Para la dosis de 1.02 g, 0.34 miligramos/mililitro fueron diluidos en 1:10 con amortiguador de NaOAc .
Los procedimientos de seguridad y laboratorio estándar fueron empleados para el manejo de los artículos de prueba y de control. Específicamente, los guantes, la mascara para la cara, la bata (o traje de laboratorio) y los protectores para ojos fueron usados mientras se prepararon y administraron las dosis.
Sistema de Prueba
Treinta dos (32) ratas Sprague Dawley machos fueron usadas en este estudio, y fueron seleccionadas con base en sus pesos (aproximadamente 294 gramos al momento de la inyección) . Las ratas fueron asignadas al azar a cada grupo de acuerdo a sus pesos del cuerpo.
Cada rata fue identificada por un número único que fue escrito sobre sus colas. Los alimentos y el agua fueron retenidos para los eventos relacionados al estudio apropiado tal como la anestesia, pero de otra manera se proporcionaron ad limitum. Antes de la selección de estudio, todos los animales fueron verificados mediante examen visual.
El tratamiento de los animales fue de acuerdo con los procedimientos estándar CCP de FIMR' s que se adhirieron a las regulaciones delineadas en la Ley de Cuidado de Animales USDA (9 CFR, Partes 1, 2 y 3) y las condiciones especificadas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación ILAR, 1996, Prensa de la Academia Nacional) .
Administración de Artículo de Prueba
La administración de Tendón- intra-Aquiles imita la administración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en la clínica. La inyección en sitio en la coyuntura de tendón calcáneo imita el sitio de inserción de tendón y hueso.
Los niveles de dosis fueron seleccionados con base en el estudio de eficacia de respuesta de dosis previo de la aplicación de intra-Tendón de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el modelo de colagenasa de tendón de rata (vea Ejemplo 3) . La concentración de dosis máxima usada en este estudio fue de 102 pg ó de 0.347 mg/kilogramo con base en las ratas pesando 0.294 kilogramos.
Treinta dos ratas Sprague-Dawley macho con un peso promedio de 294 gramos fueron distribuidos al azar adentro de cuatro grupos de 8 animales por grupo. Los Grupos 1, 2 y 3 recibieron la dosis de bolo promedio intra tendón única de 347 pg/kilogramo, 34.7 pg/kilogramo y 3.47 pg/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, respectivamente, en un volumen de entrega de objetivo de 30 pL por animal (0.102 mL/kilogramo) en el tendón de Aquiles derecho cerca de la junta osteotendinosa . El grupo 4 recibió una inyección intra-tendón única de 20 mM de amortiguador de acetato de sodio en el volumen de entrega de objetivo de 30 pL por animal. El tratamiento fue inyectado en el tendón de Aquiles derecho cerca de la junta de osteotendinosa usando jeringas de insulina (28.5 G) . Los animales fueron sangrados a través de la vena de la cola con jeringas de Ice (26G) (~400µ1 sangre completa, -200 µ? de suero) para suero en los tiempos de sangrado listados abajo. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el suero fue medido usando Quantikine ELISA.
La Tabla 9. Grupos de Tratamiento
*Los tiempos de Recolección de Sangre fueron:
Animales 1-4 en todos los grupos = Línea de Base, 1 minuto, 10 minutos, 20 minutos, 4 horas, 24 horas y 72 horas.
Animales 5-8 en todos los grupos = Línea de Base, 5 minutos, 8 horas, 48 horas, 96 horas y 168 horas
Aproximadamente 400 µ? de sangre fueron recolectados en tubos de suero y se centrifugaron a 1,800 gramos a la temperatura ambiente por 10 minutos para obtener el suero.
Aproximadamente 200 µ? de suero fueron proporcionados en tubos eppendorf de 2mL. El suero fue almacenado a -70 grados C antes de los análisis para la medición de la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre las muestras de suero almacenadas.
Observaciones Clínicas
Los animales fueron observados por lo menos diariamente hasta el sacrificio. Los pesos del cuerpo fueron registrados antes de la inyección de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. El consumo de alimentos fue cualitativo. No fueron registradas las muertes de animales no programadas .
Todos los animales fueron sacrificados en los puntos de extremo de estudio apropiados . El completarse los grupos de tratamiento en vida, los animales fueron sometidos a eutanasia a través de una sobre dosis de C02. La muerte fue confirmada por falta de reflejos (guiños, retiro, etcétera) . Ninguna histopatología o grande fue lleva a cabo en este estudio.
Análisis de Suero
Las concentraciones de suero de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fueron medidas en cada punto de tiempo. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue cuantificado usando el inmunoensayo de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB humano Quantikine1™^ REGISTRADA para la determinación cuantitativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano-BB equipo ELISA de concertación de R&D Systems (Minneapolis , Minnesota, Estados Unidos de América) como sigue.
Primero, todos los reactivos en el equipo fueron puestos a la temperatura ambiente antes del uso. Después, una curva estándar del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue preparada usando el mismo lote de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB usado en las muestras de prueba. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue diluido a 10 n/ml usando el amortiguador diluente proporcionado con el equipo. Esa solución fue entonces diluida en serie 1:2 a una concentración de 0.15625 ng/ml. Las muestras que van a ser probadas fueron diluidas usando el mismo amortiguador diluente, de manera que los valores de concentración caen dentro de la curva estándar de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de 0.15625 ng/ml a 10 ng/ml.
El numero de pozos necesario para ensayar todas las muestras en duplicado fue determinado, y cada tira de 8 pozos sobre las placas de micro concentración fueron numeradas apropiadamente. 100 µ? por pozo de diluente de ensayo RDIX fueron agregados a cada pozo, seguido por 100 µ? de estándares y muestras . La placa fue entonces cubierta con una cubierta de adhesivo y se incubo la temperatura ambiente por aproximadamente dos horas sobre un agitador orbital (puesto a entre 50-70 rotaciones por minuto) . Cada pozo fue aspirado y lavado con 300 de amortiguador de lavado. Repetir cuatro veces. Enseguida,
200 µ? de conjugado anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (suministrado con el equipo R & D, ninguna dilución fue necesaria) se agregaron a cada pozo. La placa fue cubierta con una nueva cubierta de adhesivo y se incubo a la temperatura ambiente por aproximadamente 1.5 horas sobre un agitador orbital puesto a entre 50-70 rotaciones por minuto. Los pasos de aspiración y lavado fueron repetidos, y entonces 200 µ? de solución de sustrato (suministrada con el equipo R & D, ninguna dilución fue necesaria) se agregaron a cada pozo. Las muestras fueron entonces incubadas a la temperatura ambiente en la oscuridad por aproximadamente 30 minutos sobre el agitador orbital. Unos 50 µ? de solución de tope (suministrada con el equipo R & D, ninguna dilución fue necesaria) se agregaron a cada pozo y la solución fue mezclada mediante pipeta hacia arriba y hacia abajo 2-4 veces con una pipeta de canales múltiples de 8 canales si el desarrollo de color fue disparejo. La densidad óptica de cada pozo fue determinada en un lector de micro placa puesto a 450 nm (con una corrección de longitud de onda de 540 nm) dentro de 30 minutos de la adición de la solución de tope. Las lecturas de densidad óptica fueron exportadas a Microsoft de Excel para análisis.
Los valores principales fueron calculados para cada una de las muestras . Las concentraciones de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fueron evaluadas para cada muestra de prueba usando la curva estándar sobre cada placa. La cantidad total de proteína presente en cada muestra fue calculada usando la concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB y el volumen total de cada muestra.
Análisis Farmacocinético
Un modulo no compartamental de WinNonlin fue usado para calcular los siguientes parámetros: vida media terminal (ti/2) / tiempo de concentración observada máxima (Tmax), concentración observada máxima (Cmax), que ocurre a Tmax, área bajo la concentración de droga contra curva de tiempo de t=0 horas a t=0 tiempo de la última observación (AUC0-úitimo) / y biodisponibilidad (por ciento F) . El análisis se llevo a cabo usando la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB presente en diferentes puntos de tiempo como se determino en el suero usando el ensayo de equipo Quantikine ELISA.
Otros parámetros pueden ser calculados, tal como: área bajo la curva de tiempo contra concentración de droga desde tiempo =0, extrapolada a infinidad, basada sobre las últimas concentraciones observadas (AUCinf) , despeje de cuerpo total para administración intravenosa (CL) , y despe e de cuerpo total para administración intra-tendón (CL/F) .
Estadísticas
Los análisis estadísticos fueron limitados a parámetros descriptivos tal como medios, desviaciones estándar, y coeficiente de variación, según sea apropiado.
Resultados
El peso de cuerpo promedio de todos los animales en el momento del tratamiento fue de 294 gramos. Los animales recibieron una dosis promedio de 347 pg/kilogramo (102 pg) , 34.7 pg/kilogramo (10.2 pg) , ó 3.47 pg/kilogramo (1.02 pg) , de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB .
Los valores de tiempo-concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de suero medio para el grupo de dosis de 347 pg/kilogramo se ilustran en la Figura 13. Una disminución en la concentración del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el suero entre 5 minutos y 8 horas fue observada. Desde 8 a 168 horas la concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el suero estuvo bajo del nivel de cuantificación (<0.156 ng/mL) para el ELISA. La concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el suero para los grupos de dosis de 34.7 g/kilogramo y 3.47 pg/kilogramo estuvieron abajo del nivel de cuantificación (<0.156 ng/mL) en todos los puntos de tiempo.
La tabla 10 representa el análisis farmacocinético de los parámetros para la dosificación intra-tendón (IT) del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante en ratas macho Sprague-Dawley para el grupo de dosis de 347 pg/kilogramo, y la dosificación intravenosa (IV) para el grupo de dosis de 440 pg/kilogramo descrito en ejemplo 4. El Tmax fue observado a 0.083 horas (4.98 minutos) con una concentración Cmax de 16.3 ng/mL. El AUCO-último fue de 12.58 ng*hora/mL, y la biodisponibilidad fue de 3.34 por ciento. La concentración de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en el suero para los grupos de dosis de 34.7 pg/kilogramo y 3.47 pg/kilogramo estuvieron abajo del nivel de cuantificación (<0.156 ng/mL) en todos los puntos de tiempo y por tanto los parámetros farmacocinéticos no fueron calculados.
Tabla 10: Análisis de datos farmacocinéticos para dosificación intra-tendón (grupo de dosis de 347 g/kilogramo) y dosificación intravenosa (grupo de dosificación de 440 g/kilogramo) .
Conclusión
La administración intra-tendón (IT) del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB resulto en una exposición sistémica baja inicial rápida. Ningunas concentraciones de suero detectables de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fueron observadas en dosis abajo de 347 pg/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB.
A la dosis de 347 g/kilogramo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, aproximadamente 3.34 por ciento de la circulación sistema alcanza la dosis administrada, mientras que los valores Cmax son solo de 0.26 por ciento de valores vistos después de la dosificación intravenosa. Por tanto, el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB que sigue a la administración intra- tendón es rápidamente clarificada después de la absorción en el suero. Dada la biodisponibilidad baja (-3.34 por ciento) de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB después de la administración intra tendón, éstos son predecidos sorprendentemente que el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB es retenido en el sitio de acción.
Ejemplo 6: Estudio de Fase II al azar, de Dosis Ascendente Única Segado Doble, Controlado de Placebo de Centro Múltiple de los Efectos de la Inyección de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre la Epincodilitis Lateral.
El propósito de este estudio es el de evaluar la efectividad de la inyección de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB como un tratamiento para la epicondilitis lateral, también conocido como "codo de tenis".
Grupos de Sitios de Estudio/Estudio. El estudio se llevo a cabo en hasta seis sitios clínicos. La población de estudio es de cien sujetos (100) puestos al azar en cuatro grupos con veinticinco (25) sujetos por grupo. Cada cohorte incluye 5 pacientes con placebo y 20 pacientes con tratamiento activo.
Población de Estudio:
Los sujetos que presentan un diagnostico clínico de epicondilitis lateral teniendo un tratamiento conservador fallido por tres (3) meses.
Diseño de Estudio. El estudio es un estudio de centros múltiples controlado con Placebo, ciego doble, de dosis ascendente única al azar Fase II. Los sujetos elegibles que satisfacen el criterio de inclusión para la inscripción de estudio son inscritos después de obtener consentimiento informado para la participación de estudio. Los sujetos son seguidos por 24 semanas después del procedimiento. La asignación al azar después de la inscripción al estudio asigna al sujeto a uno de los siguientes grupos de tratamiento siguientes: esquema 1:1:1:1:1: (1) Dosis A: Grupo de Amortiguador solo-Control; (2) Dosis B: Amortiguador + 0.45 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB; (3) Dosis C: Amortiguador + 0.75 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB; (4) Dosis D: Amortiguador + 1.5 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB; y (5) Dosis E: Amortiguador + 3.0 mg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. El volumen total para todas las dosis desde 1.5 mililitros de solución de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB por dosis (correspondiendo a los grupos de tratamiento de 0.3 miligramos/mililitro, 0.05 miligramos/mililitro, 1.0 miligramos/mililitro, y 2.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB , respectivamente, y correspondiendo a 6.4, 10.7, 21.4, y 42.9 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB/kilogramo con base sobre un humano de 70 kilogramos respectivamente) . El amortiguador es 20 mM de acetato de sodio, pH=6.0.
La puesta al azar se hace usando un acercamiento de escala en hileras. La puesta al azar inicial sigue un esquema de progresividad estadísticamente activa asignado sujetos a los grupos de tratamiento utilizando el siguiente patrón: el predeterminado, número activado estadísticamente de sujetos son puestos al azar para cualquier dosis A (Amortiguador solo-grupo de control) o dosis B (Amortiguador +0.3 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB) . Una vez que el número predeterminado es alcanzado para esta tolerancia de dosis inicial (Dosis B) , la puesta al azar en hilera segunda agrega el número activado estadísticamente predeterminado de sujetados que van a ser puestos al azar a ya sea la dosis A, la dosis B o la opción adicional de la dosis C (Amortiguador + 0.5 mg/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB) . Este mismo patrón, agregando el número activado estadísticamente de sujetos dentro de cada hilara del esquema al azar se repite hasta la dosis D (Amortiguador + 1.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB) y la dosis E (Amortiguador + 2.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB son introducidos dentro del esquema de puesta al azar y los objetivos de enlistado de estudio son alcanzados.
Una inyección única de la dosis asignada es administrada al tendón usando la "técnica de pipeta" . La "técnica de pipeta" es un método de inyección por el que después del que la aguja es insertada dentro del área tierna, múltiples inyecciones pequeñas son llevadas a cabo mediante el retiro, redirección e reinserción de la aguja sin emerger desde la piel.
Los sujetos son evaluados para la reacción local al sitio de inyección (rojez, hinchamiento, comezón, dolor) , cualquier aumento en el dolor en el área de lesión crónica y cualquier signo de reacción alérgica. Si los sujetos reportan un incidencia de los síntomas anteriores, la severidad y la relación a la droga del estudio se determinada siguiendo la evaluación del sujeto y la determinación por el investigador y se documenta en el estudio asignado eCRF. Si la severidad del síntoma y la asociación es determinada como estando relacionada al tratamiento de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, la información es inmediatamente enviada al patrocinador así como a los cuerpos reguladores apropiados. Una determinación es entonces hecha de si continuar la inscripción o de tener la inscripción de sujetos en ese momento.
Un procedimiento previo anterior-posterior (AP) y de rayos x lateral es obtenido para la formación de imágenes de línea de base y se hace por hasta cuatro (4) semanas antes del procedimiento. Un AP adicional y rayos x lateral son obtenidos para el protocolo de estudio a veinte cuatro (24) semanas posteriores al procedimiento. La evaluación final de la seguridad de hace cuando todos los sujetos han completado la visita de seguimiento de veinte cuatro (24) seman s.
Criterio de Inclusión. Los sujetos incluidos en este estudio son aquellos cuyos síntomas pueden ser reproducidos con una supinación resistida o dorsiflexión de muñeca y que tienen un diagnostico clínico de epincondilitis lateral y tienen 21 años de edad.
Criterio de Exclusió . Los sujetos excluidos de este estudio son aquellos que han tenido una terapia de inacción corticosterioide previa dentro de tres (3) meses pasados o que han sufrido una intervención quirúrgica para el tratamiento de epicondilitis lateral. Los sujetos con alergia a los productos derivados de yema; los sujetos con historia de síndrome de túnel de carpo; los sujetos con historia de radiculopatía servial; los sujetos que han tenido un trauma que afecta el codo dentro de los seis (6) meses del tratamiento.
Duración del Estudio. El enlistado es de aproximadamente 9 meses . Después de las visitas se incluyen la prueba de resistencia-agarre y un examen físico de esta extremidad por hasta un procedimiento de veinte cuatro (24) semanas después del procedimiento. Los puntos de extremo de seguridad son vigilados hasta la última visita en las veinte cuatro (24) semanas.
Medidas de Resultado Primario. (1) Seguridad. La seguridad y tolerancia del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB son evaluadas mediante el determinar la ocurrencia de eventos adversos. El factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB es seguro y tolerado por los sujetos.
Medidas de Resultado Secundario. Las siguiente evaluaciones son completadas en la visita dos antes del procedimiento de estudio y en las visitas de estudio posteriores al procedimiento de cuatro (4) semanas, ocho (8) semanas, doce (12) semanas y veinte cuadro (24) semanas: (1) Incapacidades y calificación de brazo, hombro y mano (DASH) , (2) Calificación Análoga Visual (VAS) , (3) Sinceridad de esfuerzo medido mediante prueba de resistencia de agarre. Tratamiento con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB resulta en uno más cambios benéficos en el resultado clínico para el tendón, tal como un cambio mejorado de la calificación de tratamiento previo (DASH y VAS) , una disminución en el dolor con presión aplicada y/O una flexión de muñeca, una movilidad incrementada de la extremidad afectada, y/o un aumento en la resistencia de agarre.
Ejemplo 7: Efecto de las Suturas Recubiertas de Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB sobre Sanado de Tendón en un Modelo de Rata: Un Estudio Histológico y Biomecánico
Síntesis
Introducción. Las rasgaduras de Tendón de Aquiles son lesiones comunes que frecuentemente requieren una reparación quirúrgica. El objetivo de este estudio fue de dos maneras: (1) determinar si las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB pueden exitosamente entregar cantidades de producto del factor al sitio de reparación, y (2) determinar si las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB mejoraran el sanado en un tendón de Aquiles de Rata con base en biomecánica y en la histología.
Métodos. Una sutura Vicryl 4-0 fue recubierta con concentraciones variables del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante (0, 0.3, 1.0 y 10.0 miligramos/mililitro) usando un proceso de recubrimiento-embebido previamente descrito. El grupo de 0 de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante sirve como el control .
El ELISA fue usado para determinar las concentraciones resultantes del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre la sutura después de haber sido recubierto en las varias soluciones de capa embebida.
Los tendones de Aquiles de Rata fueron intervenidos y reparados usando uno de los cuatro tipos de sutura. Los tendones fueron cosechados a cuatro semanas después de la operación. Las secciones de histología de cada espécimen fueron calificadas respecto de la organización de colágeno y a la angiogénesis . El análisis biomecánico de tensión uniaxial se llevo a cabo sobre cada espécimen proporcionado datos de carga y extensión. Los datos sin procesar fueron analizados para el módulo Young's, la resistencia de tensión última y la dureza elástica de cada espécimen.
Resultados . Las suturas fueron exitosamente recubiertas con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB con concentraciones de embebido-recubierto superiores resultando en cantidades más grandes de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB sobre las suturas. El análisis histológico demostró que no hubo diferencias significantes en calificación de colágeno o de angiogénesis entre los grupos de control y de factor de crecimiento derivado de plaquetas. Los resultados biomecánicos demostraron una diferencia significante en las resistencia a la tensión final entre el control (1.0 ± 0.2 MPa) y los grupos de factor de crecimiento derivado de plaquetas de dosis altas (1.9 ± 0.5 MPa y 2.1 ± 0.5 MPa) . El modulo Young de tensión fue significativamente superior en el grupo de 10 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas (7.22, SD 3.79) que en todos los otros grupos . Esto demostró una repuesta de dosis positiva y una resistencia mejorada con las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas.
Conclusión. Este estudio probo la hipótesis de que las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante pueden mejorar las propiedades materiales de los tendones reparados en una forma dependiente de la dosis positiva.
Introducción
En el estudio actual, nosotros tenemos la teoría de que las suturas de 4-0 Vicryl pueden ser exitosamente recubiertas con cantidades reproducibles de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, y que el aumento de la reparación de tendón de Aquiles de Rata con las suturas recubiertas de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB pueden mejorar la reparación en una manera dependiente de la dosis como se evaluó biomecánicamente e histológicamente.
Materiales y Métodos
El estudio se llevo a cabo en dos partes: 1) recubrimiento de sutura in vitro y análisis y 2) reparación de tendón de Aquiles en vivo en un modelo de rata. El procedimiento fue aprobado por la IUCAC.
Parte 1: Recubrimiento de Sutura: Cuatro grupos de suturas de 4-0 Vicryl (de Ethicon, de Somerville, Nueva Jersey, Estados Unidos de América) , fueron recubiertos con: (1) 20 mM de amortiguador de acetato de sodio (control de portador), (2) 0.3 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en amortiguador, (3) 1.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en amortiguador y (4) 10.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en amortiguador usando un proceso de recubrimiento-embebido, como se describió previamente (Diñes J, Weber L., Razzano P., y otros, el efecto del factor de diferenciación de crecimiento- 5- de suturas recubiertas sobre la separación de tendón en un Modelo de Rata. J Shoulder Elbow Surg
2007; 16 : 215S-221 S) . Brevemente, después del tratamiento con 70 por ciento de etanol las suturas (con agujas fueron sumergidas en amortiguador de acetato de sodio, con o sin el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (0, 0.3, 1.0, y 10.0 miligramos/mililitro), por 30 minutos y después se seco al aire. A diferencia del proceso descrito por Diñes y otros, no fue usada una gelatina en la solución de recubrimiento. Las suturas fueron recortadas a 15 centímetros de tramos para usarse en el estudio en vivo. Los tramos restantes de las suturas cortadas fueron usados para el análisis in vitro.
Liberación del Factor de Crecimiento derivado de Plaquetas Humano Recombinante-BB in Vitro: Las suturas (n=5/grupo) recubiertas en soluciones de amortiguador de acetato (grupos 1) o factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (Grupo 2-4) fueron colocados en un amortiguador de elución (Medio esencial mínimo con 2 por ciento de suero bovino fetal, 1 por ciento de penicilina-estreptomicina, 1 por ciento de L-Glutamina, y 1 por ciento de amortiguador HEPES) y se incubaron a 37 grados centígrados como una plataforma oscilante. El amortiguador de elución fue completamente intercambio en los puntos de tiempo de 1, 6, 24 y 48 horas. El total de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado en cada punto de tiempo fue determinado usando el factor de crecimiento derivado de plaquetas -BB ELISA (factor de crecimiento derivado de plaquetas humano-BB de DuoSet, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, Estados Unidos de América) .
Parte II: Diseño de Estudio: 48 Ratas Sprague-Dawley (de 350-400 gramos) fueron puestas al azar en una forma cegada a uno de los cuatro grupos de tratamiento (n=12 por grupo) . Los grupos fueron compuestos de cuatro concentraciones diferentes de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en la solución de embebido-recubrimiento descrito anteriormente con el grupo de control (0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB) y 3 grupos experimentales (0.3, 1.0 y 10.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB concentración de recubrimiento inicial) .
Procedimiento Quirúrgico: Todas las cirugías fueron realizadas bajo condiciones estériles. Una incisión de piel de 1.5 centímetros fue hecha sobre el tendón de Aquiles. La disección fue usada para exponer el tendón de Aquiles. En este punto, el tendón fue seccionado con una escuchilla de escalpelo próxima a la inserción sobre el calcáneo. El tendón fue inmediatamente reparado usando una puntada Masón-Alien modificada y una puntada interrumpida simple usando suturas uno de los cuatro grupos .
No hubo dificultad en ejecutar cualquier puntada debido al tamaño pequeño del tendón de Aquiles de Rata. La piel fue cerrada con suturas de Vicryl no recubiertas interrumpidas . Los animales se les dejaron el caminar normalmente después de la reparación quirúrgica. Después de cuatro semanas las ratas fueron sacrificadas y los tendones, incluyendo el bloque de hueso del calcáneo y el complejo de músculo gastro-soleus próximo fueron cosechados. Los especímenes fueron asignados al azar al análisis biomecánico (n=8 grupos, fresco-congelado) o al análisis histológico (n=4/grupo, formalina-fijo) .
Biomecánicas: El análisis biomecánico de tensión uniaxial se llevo a cabo sobre cada espécimen usando un sistema Instron (Modelo No. 5566) dotado con una celda de carga de 100N con una exactitud de carga de +/-0.5 por ciento. Después del congelado a 4 grados centígrados por hasta 4 horas en agua salada amortiguada con fosfato (PBS) conteniendo inhibidores de proteasa, las muestras fueron cortadas para remover el exceso de músculo y los extremos calcáneo y gastro-soleus fueron envueltos en un papel de lija 220. El espécimen fue asegurado entre agarraderas neumáticas y se sumergió en un baño de agua salada amortiguada con fosfato. Las muestras fueron cargadas previamente (1N) en tensión y las dimensiones de muestra fueron medidas. El tendón fue entonces sometido a una extensión de tensión a una tasa de tensión de 0.25 por ciento/segundo . Los especímenes fueron jalados a la falla y la carga resultante y los datos de extensión fueron recolectados con una computadora personal, con los datos adquiridos a 10 Hz . Después de la prueba, los datos recolectados fueron analizados para determinar (1) rigidez lineal y (2) modulo elástico desde la porción lineal de la curva de esfuerzo-tensión o de desplazamiento de carga, respectivamente. La carga máxima y la resistencia a la tensión última también fueron calculadas de las curvas de carga.
Histología: Los espécimen de tendón fueron desprendidos del calcáneo, del sitio de inserción de tendón de Aquiles y los tendones de Alquiles reparados fueron procesados y embebidos en parafina. Las secciones sagitales de cada espécimen fueron manchas con rojo Sirius o tricromo Mallory. Las platinas fueron formadas en imágenes y calificadas por tres observadores ciegos usando un sistema de calificación para organización de colágeno y grado de angiogénesis , como se describo previamente (Diñes J, Weber, L, azzano P, y otros. El efecto del factor de Diferenciación Crecimiento-5-Suturas Recubiertas sobre la Reparación de Tendón en un Modelo de Rata. J. Shoulder Elbow Surg 2007; 16 : 215S-2221S) . Tres observadores independientes quienes estuvieron para el grupo de tratamiento evaluaron cada platina. Las calificaciones totales fueron computadas para cada grupo de tratamiento y se compararon en relación con el significado estadístico .
Análisis Estadístico La cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado en vivo se analizo usando medidas repetidas ANOVA, con el tiempo como la medida repetida. Las cantidades acumulativas del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado y la dosis total entregada en contra de la concentración de recubrimiento inicial fueron ajustadas con un ajuste de cuadrados menos no lineales (escala-log-log) . Un ANOVA de una vía con una prueba de comparación múltiple Bonferroni se uso para determinar las diferencias entre los grupos para los parámetros biomecánicos. El análisis estadístico sobre las calificaciones de histología se llevo a cabo usando una prueba Kruskal-Wallis con la prueba de post-hoc de comparación múltiple Duna. Los datos de biomecánica son presentados como calificación + SEM y histología como se presentaron como una media (rango) . El significado fue determinado a p <0.05.
RESULTADOS
Liberación del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas Humano Recombinante In Vitro: Los datos de liberación in Vitro son presentados como la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado, normalizado por la longitud de la sutura (ng/cm) Figuras 14A y 14B) . La liberación In Vitro fue medida en todos los grupos incluyen el Grupo I (0 miligramos/mililitro) el cual fue considerado como la medición de línea de base para los otros grupos (liberación acumulativa: 1.3 + 0.1 ng/centímetro) . Una liberación de bolo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB desde las suturas fue observada después de la primera hora de incubación (Grupo 2: 6.29 ± 3.0 ng/centímetro; Grupo 3: 68.81 + 9.3 ng/centímetro; y Grupo 4: 5809.42 ± 541.6 ng/centímetro) (Figura 14A) . El bolo inicial liberado fue seguido por una liberación gradual continua de un factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante adicional -BB a través del punto de tiempo de 48 horas. La cantidad acumulativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado sobre la incubación de 48 horas fue dependiente de dosis con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado con concentraciones superiores de la solución de embebido-recubrimiento; el Grupo 4 (10 miligramos/mililitro; 6495.9±552.6 ng/centímetro fue significativamente incrementado (p<0.001) en relación al Grupo 2 (0.3 mg/mililitro; 14.0+5.7 ng/centímetro) y el Grupo 3 (1.0 mg/ml; 126.8+18.8 ng/centímetro) (Figura 14B) . La cantidad acumulativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberada no fue significativamente diferente (p>0.05) entre el Grupo 2 y el Grupo 3. La cantidad acumulativa del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberada (Y, ng/centímetro) fue logarítmicamente proporcional (R2=0.9575) a la concentración de recubrimiento inicial (X, mg/ml) por la ecuación:
Y = ??(1·7? 1 *'°9(?) + 2·102)
Observaciones Quirúrgicas y Grandes: Todos respondieron bien a la cirugía con la excepción de un animal en el grupo 3 (asignado a histología) el cual murió durante la noche después de la cirugía debido a complicaciones de la anestesia. La longitud de la sutura usada para la reparación fue consistente entre los grupos (Grupo 1: 4.8 ± 0.1 cm; Grupo 2: 4.7 ± 0.2 cm; Grupo 3: 4.8 ± 0.1 cm; y Grupo 4: 4.8 ± 0.1 cm; p=0.94) (Figura 14D) . Con base en la cantidad media del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado in vi tro y los tramos de sutura, las dosis en vivo (media + SD) para cada grupo fueron calculadas como siendo: Grupo 1:0 ng; Grupo 2: 66.0 ± 61.2 ng; Grupo 3: 602.5 ± 190.9 ng; y Grupo 4: 31,342.6 ± 6774.5 ng. Similar a la cantidad acumulativa de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberada, la dosis in vivo entregada (Y, ng) fue logarítmicamente proporcional (R2=0.9859) a la concentración de recubrimiento inicial (X, mg/ml) (Figura 14C) con la ecuación:
Y = io(1-732*log(X) + 2·757)
Biomecánica: Cinco especímenes fueron incapaces de ser usados para el análisis biomecánico debido a un error con la máquina de prueba Instron en ese día de la prueba. Los números de espécimen resultantes para el análisis biomecánico fueron: n=7, (grupos 1, 2 y 3) y n=6 (grupo 4) .
Ningunas diferencias significantes (p>0.16) en las propiedades estructurales de los tendones reparados (carga última y rigidez) fueron observadas, sin embargo, los valores principales para la carga última (Grupo 1: 22.1 + 1.8 N; Grupo 2 : 31.6 + 3.5 N; Grupo 3: 28.0 + 3.7 N; Grupo 4: 27.6 + 1.8 N) y rigidez (Grupo 1: 6.7 + 0.4 N/mm; Grupo 2: 8.9 + 0.8 N/mm; Grupo 3: 8.0 ± 1.0 N/mm; Grupo 4: 7.9 + 0.7 N/mm) fueron consistentemente superiores en los grupos que recibieron el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en relación al grupo de control (Grupo 1) .
Una disminución significante (p<0.05) en el área en sección transversal (CSA) fue observada en el Grupo 4 (0.14 + 0.05 cm2) en comparación al Grupo 1 (0.21 + 0.03 cm2) y el Grupo 2 (0.23 + 0.04 cm2) . El área en sección transversal también fue significativamente disminuida (p<0.05) en el Grupo 3 (0.17 + 0.02 cm2) en relación al Grupo 2. La disminución en el área en sección transversal resulto en diferencias significantes en las propiedades de material de los tendones reparados (resistencia a la tensión última y modulo elástico) . Hubo un aumento significante (p<0.05) en la resistencia a la tensión última en el grupo de 10.0 miligramos/mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB (2.1 ± 0.2 MPa) , en relación a los grupos de 0 mg/ml (1.0 + 0.1 MPa) y de 0.3 mg/ml (1.4 + 0.1 MPa) de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB, y en el grupo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de 1.0 mg/ml (1.9 + 0.2 MPa) en comparación al grupo de 0 mg/ml. El modulo elástico fue observado como siendo significativamente incrementado (p<0.05) en el grupo de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de 10.0 mg/ml (7.22 + 1.5 MPa) en comparación a todos los otros grupos (0 mg/ml: 3.5 + 0.4 MPa; 0.3 mg/ml: 4.4 + 0.4 MPa; 1.0 mg/ml de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de 4.9 + 0.7 MPa).
Los grupos de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB de 0.3 y de 1.0 mg/ml no fueron estadísticamente diferentes uno de otro.
Histología: La histología se llevo a cabo sobre cuatro animales para cada grupo (n= 3 para el grupo 3) . Cada sección fue calificada por tres calificadores y una calificación media fue determinada. Las calificaciones principales son presentadas como una media (rango) . El análisis histológico demostró que no hubo unas diferencias significantes en las calificaciones de organización de colágeno o de angiogénesis entre los grupos. Sin embargo, una corriente hacia una apariencia más normal fue observada en los grupos de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en comparación a los grupos de control, particularmente en las calificaciones de organización de colágeno.
Discusión
En este estudio fue demostrado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB puede ser exitosamente recubierto sobre suturas Vicryl con la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberada de la suturas in vi tro dependientes de la concentración de recubrimiento inicial. No fueron observadas diferencias significantes en las propiedades mecánicas estructurales (carga y rigidez última) o mediante histología, aún cuando hubo una corriente para la mejora en estas proporciones en los grupos tratados con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB. Una respuesta dependiente de dosis a las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue observada para las propiedades biomecánicas del material, como se exhibió por las propiedades mecánicas de material incrementadas (modulo elástico y esfuerzo de tensión último) .
Biomecánicamente, Las diferencias significantes fueron observadas con la dosis más alta de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB para el modulo elástico y de resistencia última. La resistencia última (también mencionada como la resistencia a la tensión última o el esfuerzo a la tensión última) y el modulo elástico (también mencionado como el modulo Young) representan las propiedades estructurales (carga última y rigidez) , normalizadas por las propiedades dimensionales del tendón (desplazamiento y área en sección transversal), y son una medida de la calidad del tejido. En este estudio, la disminución en el área en sección transversal con una dosis incrementada de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB dio cuenta para el aumento en las propiedades materiales. Una disminución en el área en sección transversal es sugerente de un tendón más organizado. Aún cuando una corriente hacia una organización de colágeno mejorada con el factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue observada histológicamente, esta calificación no alcanzo un significado estadístico como se observo por el área en sección transversal, potencialmente debido al tamaño de muestra pequeño dotado para la histología. Sin importar esto, la corriente para una organización de colágeno mejorada combinada con la disminución en área en sección transversal, sugiere que la dosis más alta de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB promovió una mejor calidad de tejido de tendón (resistencia final incrementada y modulo elástico) en relación a las suturas de control .
Cuantificación de la dosis aplicada del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB se requiere para evaluar la eficiencia del proceso de recubrimiento de sutura y el efecto dependiente de dosis sobre el sanado del tendón. En el análisis in vi tro demostró un aumento significante en la cantidad de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberado de la concentración de recubrimiento más alta (10 mg/ml) , sin embargo, no hubo una diferencia significante notada en las dos concentraciones de recubrimiento más bajas (0.3 y 1.0 mg/ml) aún con una diferencia de nueve veces en la cantidad acumulativa promedio de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB liberada (14.0 ± 5.7 ng/centímetro contra 126.8 ± 18.8 ng/centímetro , respectivamente. Esto fue consistente con la observación de que el modulo elástico y de resistencia última no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos de dosis más baja.
El estudio mostró que la entrega de factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB fue capaz de aumentar la reparación biológica del tendón de Aquiles de rata. Una limitación en este estudio es de como la interpretación de estos resultados es afectada por el tamaño de muestra usado en este estudio. Este estudio fue diseñado con ocho animales por grupo para biomecánica y 4 animales para histología debido a un error con el dispositivo de prueba Instron en un día de la prueba mecánica, cinco especímenes no fueron incluidos en el análisis, reduciendo la potencia estadística. Como un resultado las diferencias más pequeñas en las propiedades tal como la carga final y rigidez pueden no ser consideradas insignificantes para los grupos experimentales aún cuando estos aparecieron como ser aumentados, en promedio, en relación al grupo de control .
En la aplicación de factores de crecimiento, en donde los resultados son frecuentemente dependientes de droga, la entrega de cantidades más grandes puede ser requerida cuando el tamaño del animal aumenta. Las investigaciones preliminares (datos no mostrados) han exhibido una dependencia de la dosis entregada sobre ambas la concentración de recubrimiento inicial y el área de superficie de la sutura, sugiriendo que la escalada de la dosis para un animal más grande puede ser lograda.
Los resultados demostrados sugieren que el uso de las suturas recubiertas con factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante-BB en las aplicaciones clínicas puede tener potencial para mejorar el sanado del tendón y una función incrementada para el paciente.
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Claims (15)
1. Una composición que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas y un amortiguador para uso en el tratamiento de una tendinopatía .
2. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 1, caracterizada porque la tendinopatía es una tendinosis, tendinitis o una tenosinovitis .
3. La composición tal y como se reivindica en las cláusulas 1 ó 2, caracterizada porque el factor de crecimiento derivado de plaquetas es seleccionado del grupo que consiste de PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, y PDGF-DD, preferiblemente PDGF-BB, más preferiblemente factor de crecimiento derivado de plaquetas humano recombinante (rh)-BB.
4. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 3, caracterizada porque la cantidad efectiva de la composición comprende entre 75 pg a 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 500 g a 1,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 5,000 pg a 7,500 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 450 pg a 3,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 400 pg a 1,000 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 500 pg a 900 pg de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 600 a 800 de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 650 pg y alrededor de 750 g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis, 700 \g de factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB por dosis.
5. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-4, caracterizada porque la composición tiene un volumen de 1.0 a 2.0 mililitros por dosis, preferiblemente 1.5 mililitros por dosis.
6. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de. las cláusulas 1-5, caracterizada porque el amortiguador es seleccionado del grupo que consiste de agua salada amortiguada con fosfato ("PBS"), acetato de sodio, acetato de amonio, ácido acético, ácido cítrico, citrato de sodio, tris (hidroximetil) aminoetano ("tris"), N-2-hidroxietilpiperazina-N' -2-ácido etanosulfónico ("HEPES"), 3- (N-morfolino) ácido propanosulfónico ("MOPS"), 2- (N-morfolino) ácido etanosulfónico ("MES"), N- (2-acetamido) ácido iminodiacético ("ADA"), piperazina-N, ' -bis (2-ácido etanosulfónico) ("PIPES"), y N- (2-acetamido) -2-ácido aminoetanosulfónico ( "ACES" ) , preferiblemente acetato de sodio.
7. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 6, caracterizada porque el acetato de sodio está a una concentración de entre 10 mM y 100 mM, preferiblemente 20 mM.
8. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-7, caracterizada porque la composición tiene un pH de entre 4.0 y 7.0, preferiblemente de 6.
9. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-8, caracterizada porque la composición es administrada es mediante inyección directa a un sitio afectado.
10. La composición tal y como se reivindica en la cláusula 9, caracterizada porque el sitio afectado es una coyuntura ósea-tendón, un tendón.
11. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-10, caracterizada porque la tendinopatía es seleccionada del grupo que consiste de tendinopatía de Aquiles, tendinopatía rotuliana, epicondilitis lateral, epicondilitis media, fascitis plantar, y tendinopatía de puño giratorio, preferiblemente epicondilitis lateral.
12. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-12, caracterizada porque la composición es administrada como una dosis única, preferiblemente mediante una inyección única.
13. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-12, caracterizada porque la composición es administrada en más de una dosis, preferiblemente mediante una inyección única una vez a la semana por 4 semanas.
14. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-13, caracterizada porque la composición resulta en un aumento en la resistencia al tendón de por lo menos de 60%, 65% ó 70% dentro de 7 días de administración en comparación a una línea de base.
15. La composición tal y como se reivindica en una cualquiera de las cláusulas 1-14, caracterizada porque la composición resulta en que el tendón logra por lo menos 80%, 85%, ó 90% de su resistencia final dentro de 7 días de la administración, en donde la resistencia final es medida a 21 días después de la administración. R E S U M E N Se proporcionan aquí composiciones y métodos para el tratamiento de tendinopatías , tal como la tenosinovitis , la tendinosis o tendinitis, incluyendo la tendinopatía de Aquiles, la tendinopatía rotuliana, la epicondilitis lateral o "codo de tenis" , la epicondilitis media o "codo de golfista" , la fascitis plantar, y tendinopatía de puño giratorio, y en particular a los métodos para el tratamiento de las tendinopatías mediante el administrar composiciones que comprenden el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) .
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