ES2272452T3

ES2272452T3 - Producto de anclaje biologico de tejido conectivo al hueso.

Info

Publication number: ES2272452T3
Application number: ES01918377T
Authority: ES
Inventors: Brent Atkinson; James J. Benedict
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: DE60123218D1; WO2001066130A1; AU2001245461A1; EP1261365A4; DE60123218T2; EP1261365B1; EP1704866A2; EP1261365A1; EP1704866A3

Abstract

El uso de una mezcla de proteínas para la fabricación de un medicamento para la mejora de una ligadura del hueso con el tejido conectivo seleccionado entre el grupo constituido por tendón, ligamento y cemento, comprendiendo la mezcla de proteínas: factor de crecimiento transformante a1 (TGFa1), proteína morfogenética de hueso BMP-2, BMP-3, y BMP-7; en el que la cantidad de dicha TGFa1 en dicha mezcla está entre un 0, 01 % y un 10 % de las proteínas totales en dicha mezcla; en el que la cantidad de dicha BMP-2 en dicha mezcla está entre un 0, 01 % y un 10 % de proteínas totales en dicha mezcla; en el que la cantidad de dicha BMP-3 en dicha mezcla está entre un 0, 1 % y un 15 % de las proteínas totales en dicha mezcla; y, en el que la cantidad de dicha BMP-7 en dicha mezcla está entre un 0, 01 % y un 10 % de la proteínas totales en dicha mezcla.

Description

Producto de anclaje biológico de tejido conectivo al hueso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un medicamento para mejorar la ligadura del tejido conectivo al hueso, en el que el producto induce la formación de una interfase de hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo al hueso.

Antecedentes de la invención

Los procedimientos actuales para la fijación de un tendón o ligamento al hueso emplean la fijación mecánica, sin embargo, ninguno de estos procedimientos controla o mejora la respuesta de curación biológica, y ninguno de estos procedimientos optimiza el componente biológico de fijación. Más aún, no existe en la actualidad ningún procedimiento de reconstrucción que recree la morfología normal del tendón o el ligamento respecto del hueso. Las diferentes técnicas operativas no recrean la compleja morfología en abanico o las zonas de transición del fibrocartílago y el cartílago calcificado entre el tendón o el ligamento y el hueso. En el tiempo de ocio, se ha incrementado la asistencia a fitness y a deportes de impacto elevado, tales como fútbol y esquí, se ha observado un aumento significativo de lesiones que implican el tendón y las adherencias del ligamento. Entre los tejidos se dañan frecuentemente y/o gravemente por este tipo de lesiones se incluye el ligamento cruzado anterior (ACL) y los tendones del manguito rotatorio del hombro.

El ligamento cruzado anterior (ACL) se localiza en el centro de la articulación de la rodilla, entre la tibia y los cóndilos del fémur. Funcionalmente, el ACL evita la dislocación hacia atrás del fémur, dislocación hacia delante de la tibia, y los movimientos excesivos de extensión y rotación. Se ha observado un aumento significativo en las lesiones ACL en las últimas décadas, ya que han aumentado las actividades que tensionan este ligamento. Jackson ha descrito los procedimientos quirúrgicos que se utilizan en la actualidad (DW Jackson y PR Kurzweil, Capítulo 8 en el Master Techniques in Orthopaedic Surgery, Reconstructive knee surgery, Raven Press, NY, 1995). En breve, se crean los canales femoral y tibial, y se cosecha el injerto y se fija a ambos canales femoral y tibial. En la mayor parte de las reconstrucciones, se cosecha un injerto autólogo procedente del tendón del gemelo, cuádriceps o patelar, aunque también se usa en un pequeño porcentaje de los casos material de aloinjerto. Se ha usado también material sintético (es decir, no derivado de ser humano) para sustituir el ACL (Bolton y col., Clin. Orthop., 196: 202-213, 1985). Además, las reconstrucciones han usado injertos derivados de material de xenoinjerto y/o mucosa subintestinal y/o injertos derivados de colágeno. Entre los procedimientos de fijación usados en la actualidad se incluyen tuercas de interferencia, endobutton, sutura, tuerca de compresión, anclaje, y otros procedimientos que pueden estar constituidos por materiales reabsorbibles o no reabsorbibles.

Los tendones del manguito rotatorio del hombro, supraspinatus, infraspinatus, subscapularis, y teres minor, soportan la cápsula de la articulación, y limitan el abanico de movimientos del manguito rotatorio del hombro. Estos tendones se insertan alrededor de la cabeza del húmero, con los tendones supraspinatus, infraspinatus, y teres minor adhiriéndose a la tuberosidad mayor y el tendón subscapularis a la tuberosidad menor. A menudo se encuentra fibrocartílago en el emplazamiento de inserción del tendón en el hueso. Se ha teorizado que la función del fibrocartílago podría ser similar a la función de la eslinga que se coloca alrededor de un cable eléctrico para evitar daños por cizalladura al alambre cuando se inserta en el enchufe (Benjamin y col., "Functional and Developmental Anatomy of Tendons and Ligaments." In Gordon SL, Blair SJ, Fine LJ (eds): Repetitive Motion Disorders of the Upper Extremity; Rosemont, IL, American Academy of Orthopaedic Surgery, 1995). Los procedimientos actuales para la reparación del manguito rotatorio del hombro se describen ampliamente en Fu (Operative Techniques in Orthopaedics, "Treatment of Rotator Cuff Injuries"; Editor F. H. Fu, editor asociado GR Williams, vol. 8, nº. 4, 1998). Por lo general se realiza un orificio en el hueso esponjoso, justo en el centro de la cavidad tuberosa, se perforan canales a lo largo del orificio, y se utilizan suturas transóseas para asegurar el tendón al hueso. Además, el modelo de puntos se puede modificar. Se pueden usar anclas/grapas de sutura como alternativa a las suturas transóseas (Operative Techniques in Orthopaedics, 1998, ibid.).

En los años 60, se observó que la matriz de hueso desmineralizada inducía la formación de cartílago y hueso nuevos cuando se implantaba en emplazamientos ectópicos (Urist, Science, 150: 893-899, 1965). Los componentes responsables de las actividades osteoinductivas se denominaron proteínas morfogenéticas del hueso (BMP). Se han identificado posteriormente al menos siete BMP individuales a partir de hueso, y se han identificado como BMP 1-7. El análisis de los aminoácidos reveló que seis de las siete BMP estaban relacionadas entre sí y con otros miembros de la superfamilia TGF-\beta (Celeste y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9843-9847, 1990; Wozney y col., Science, 242: 1528-1534, 1988). Durante la formación del hueso endocóndrico, los miembros de la familia TGF-\beta dirigen una cascada de sucesos entre los que se incluye la quimiotaxis, diferenciación de células pluripotentes a la línea del cartílago, maduración de los condrocitos al estado hipertrófico, mineralización del cartílago, sustitución de cartílago con células de hueso, y la formación de una matriz calcificada (Reddi, Cytokine & Growth Factor Reviews, 8: 11-20,1997). Aunque los BMP individuales recombinantes pueden inducir estos sucesos, la presencia de múltiples miembros de la familia TGF-\beta en el hueso subraya la complejidad implicada en la osteogénesis natural.

De manera más reciente se han descubierto otros miembros de la familia BMP, algunos de los cuales se han asignado a la familia de los factores de crecimiento y diferenciación (GDF). Para clarificar la nomenclatura, las BMP-12, BMP-13, y BMP-14 se conocen también como GDF-7, -6, y -5, de manera respectiva (AH Reddi, Nat. Biotech., 16: 247-252, 1998). También, las GDF-5, -6, y-7 se conocen como CDMP-1, -2, y -3, de manera respectiva. Además, la MP-52 es la misma molécula que la GDF-5.

La Proteína de Hueso (Sulzer Orthopedics-Biologics, Denver, CO), BP, es una mezcla de proteínas derivadas de manera natural, aisladas a partir de hueso bovino desmineralizado que tiene actividad osteogénica in vitro e in vivo. En el modelo ectópico de roedores, la BP induce formación de hueso endocóndrico o la formación de hueso a partir de un intermedio de cartílago (Damien y col., J. Biomed. Mater. Res., 24: 639-654, 1990). In vitro, la BP promueve la diferenciación de células madre a cartílago (Atkinson y col., J. Cell. Biochem., 65: 325-339, 1997). El procedimiento de purificación de la BP y el procedimiento de formación de hueso en el cuerpo, en combinación con carbonato de calcio se describe en las Patentes de los Estados Unidos con números 5.290.763, 5.371.191. y 5.563.124.

Se puede usar un modelo subcutáneo de rata para demostrar las similitudes entre las moléculas BMP recombinantes y/o composiciones derivadas de hueso. En el ensayo con roedores de Sampath - Reddi modificado por Rosen (Operative Techniques in Orthopaedics, 1998, supra), las BMP-12, BMP-13 y MP-52 no inducen cartílago ni hueso tras 10 días. En su lugar, estos factores producen tejidos que se parecen a tendones de embrión (Wolfman y col., Clin. Invest., 100(2): 321-30,1997). Celeste y col. describen un procedimiento para usar BMP-12, BMP-13, y/o MP-52 (es decir, BMP-14) para inducir la formación de tejido de tendón y/o ligamento (Patente de los Estados Unidos Nº 5.658.882 y Documento W095/16035). Usando un ensayo de implante ectópico modificado en ratas, Celeste y col. demostraron que el BMP-12 recombinante induce la formación de tejidos que se parecen a tendones de embrión, sin la formación de cartílago ni hueso. Por el contrario, los implantes que contienen BMP-2 en dicho ensayo ectópico en roedores demostró la formación de hueso y cartílago, pero no contiene tejidos parecidos a tendón/ligamento, (Celeste y col., Patente de los Estados Unidos Nº 5.658.882).

El modelo del canal óseo es un modelo conveniente para estudiar la ligadura del tendón o ligamento al hueso (Rodeo y col., 1993, J Bone Joint Surgery 75-A (12): 1795-1803). En este modelo, el tendón extensor digital largo se despega del cóndilo femoral, se crea un canal en la tibia, se hace pasar el tendón a través de un canal en la parte proximal de la tibia, y se fija al periostio. En este modelo, Wozney y col., describen el uso de una proteína morfogenética de hueso purificada para la regeneración de la adherencia funcional entre el tejido conectivo y el hueso (Documento W096/39169). El progreso natural de la cicatrización con el tiempo entre tendón y hueso se observó por medios histológicos y mecánicos. Sin embargo, aunque el análisis histológico demostró que la BMP-2 induce una interfase hueso-tendón, la zona fibrocartilaginosa preferida no estaba presente. En una publicación de experimentos que usaron la BMP-2 para mejorar la cicatrización de tendón en un canal óseo, Rodeo y col. informaron que dosis más elevadas de la BMP-2 inducía la resorción del hueso lamelar que rodea el canal óseo, lo que no es deseable, con la formación concomitante de nuevo hueso trabecular fino (Rodeo y col., 1999, Amer. J Orthopaedic Society for Sports Medicine 27: 476-488). Además, este informa india, como en el Documento WO 96/39169, que aunque se forma una interfase hueso-tendón, no se observa la formación de cartílago en la interfase.

Otros estudios han demostrado el efecto de los factores de crecimiento sobre la cicatrización de tendón sobre tendón o de ligamento sobre ligamento. Woo y col. utilizaron un modelo de ligamento in vitro para demostrar que el factor de crecimiento epidérmico -\beta1 (TGF-\beta1) promueve la síntesis de matriz extracelular (Woo y col., Med Biol. Eng. Comput., 36 (3): 359-64, 1998). Usando un modelo MCL de conejo interrumpido, el ensayo de tracción reveló que el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) incrementaba de forma significativa la carga final, elongación final y energía absorbida en valores de rotura en comparación con los controles (Woo y col., 1998, ibid.). Además, Aspenberg y Forslund demostraron que GDF 5 y 6 (es decir, BMP-13 y BMP-14) incrementaron la resistencia a la tracción en un modelo de tendón de Aquiles trans-seccionado en ratas. (Woo y col., 1998, ibid.). Además, la adición exógena de proteína morfogenética de hueso provocó la osificación del ligamentum flavum en ratones (Woo y col., 1998, ibid). Sin embargo, tal como se ha descrito más arriba, estos estudios no han sido capaces de demostrar una reconstrucción/reparación de la interfase tejido conectivo-cartílago-hueso que replique la ontogénesis natural de dicha interfase hasta un grado adecuado para uso en la reparación in vivo de tendón/ligamento.

En resumen, a pesar de la considerable investigación dirigida a la reparación de lesiones de ligadura entre el tendón y/o ligamento y el hueso, sigue existiendo una necesidad en la técnica de un producto y procedimiento que no solo produzca la adherencia funcional entre el tendón y/o ligamento y el hueso, sino que induzca también la formación de una adherencia entre el tendón y/o ligamento y el hueso que replique de forma más representativa la ontogénesis natural (es decir, endógena) de la ligadura. La replicación de la ontogénesis natural entre el tendón y/o ligamento y el hueso proporcionaría un resultado que incluiría la inducción de una cantidad mayor de hueso que aparecería más rápido y en proximidad cercana con el tejido conectivo, un incremento en la resistencia de fijación de la ligadura en los momentos iniciales, y un aumento en la resistencia de fijación en pacientes con patologías degenerativas de tendón y/o hueso.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona el uso de una mezcla de proteínas para la fabricación de un medicamento para mejorar una ligadura entre hueso y tejido conectivo, seleccionada entre el grupo que consiste de tendón, ligamento y cemento, comprendiendo la mezcla de proteínas:

el factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), proteína morfogenética de hueso BMP-2, BMP-3 y BMP-7;

en la que la cantidad de dicho TGF\beta1 en dicha mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 10% de proteínas totales en dicha mezcla;

en la que la cantidad de dicho BMP-2 en dicha mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 10% de proteínas totales en dicha mezcla;

en la que la cantidad de dicho BMP-3 en dicha mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 15% de proteínas totales en dicha mezcla;

en la que la cantidad de dicho BMP-7 en dicha mezcla está comprendida entre 0,01% y 10% de proteínas totales en dicha mezcla.

En una forma de realización, la cantidad de TGF\beta1 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,05% y aproximadamente 1% de proteínas totales en dicha mezcla. En una forma de realización, la cantidad de BMP-2 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 5% de proteínas totales en dicha mezcla. En otra forma de realización, la cantidad de BMP-3 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 10% de proteínas totales en dicha mezcla. En otra forma de realización adicional, la cantidad de BMP-7 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 5% de proteínas totales en dicha mezcla.

En una forma de realización, la mezcla de proteínas comprende de manera adicional una proteína seleccionada entre el grupo de TGF\beta2, TGF\beta3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, y morfogenética derivada de cartílago (CDMP). En un aspecto de esta forma de realización, la TGF\beta2 comprende entre 0,5% y 12% de la mezcla de proteínas; la TGF\beta3 comprende entre 0,01% y 15% de la mezcla de proteínas; la BMP-4 comprende entre 0,01% y 1% de la mezcla de proteínas; la BMP-5 comprende entre 0,01% y 1% de la mezcla de proteínas; la BMP-6 comprende entre 0,01% y 1% de la mezcla de proteínas; y/o la CDMP comprende entre 0,01% y 1% de la mezcla de proteínas. En una forma de realización, la mezcla de proteínas comprende de manera adicional una proteína CDMP en una cantidad comprendida entre 0,01% y 10% de proteínas totales en la mezcla.

En una forma de realización, la mezcla de proteínas comprende de manera adicional al menos una proteína de la matriz de hueso seleccionada entre el grupo que consiste de osteocalcina, osteonectina, sialoproteina de hueso (BSP), lisiloxidasa, catepsina L pre, osteopontina, proteína de la matriz GLA (MGP), biglicano, decorina, sulfato III proteoglicano-condroitina (PG-CS III), glicoproteina ácida de hueso (BAG75), trombospondina (TSP) y fibronectina. La proteína de la matriz de hueso comprende habitualmente entre 20% y 98% de la mezcla de proteínas; en una forma de realización, la proteína de la matriz de hueso comprende entre 40% y 98% de la mezcla de proteínas. En una forma de realización preferida, la proteína de la matriz de huesos comprende: osteocalcina, osteonectina, sialoproteina de hueso (BSP), lisiloxidasa y catepsina L pre.

En una forma de realización, la mezcla de proteínas comprende de manera adicional al menos una proteína del factor de crecimiento seleccionada entre el grupo que consiste de factor de crecimiento del fibroblasto-I (FGF-1), FGT-II, FGF-9, factor inhibitorio del leucocito (LIF), insulina, factor de crecimiento de la insulina I (IGF-I), IGF-II, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, factor derivado de estromas-2 (SDF-2), hormona tiroidea de la pituitaria (PTH), hormona del crecimiento, factor de crecimiento del hepatocito (HGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento de transformación-\alpha (TGF\alpha) y proteínas de gamuza. La proteína del factor de crecimiento comprende de manera habitual entre 0,01% y 50% de la mezcla de proteínas, y en una forma de realización, la proteína del factor de crecimiento comprende entre 0,05% y 25% de la mezcla de proteínas, y en otra forma de realización, la proteína del factor de crecimiento comprende entre 0,1% y 10% de la mezcla de proteínas.

De manera preferible, la proteína del factor de crecimiento es un factor de crecimiento del fibroblasto-I (FGF-1). En esta forma de realización, el FGF-I comprende entre 0,001% y 10% de la mezcla de proteínas.

En otra forma de realización, la composición comprende de manera adicional una o más. De manera preferible, las proteínas del suero se seleccionan entre el grupo que consiste de albúmina, transferrina, \alpha2-Hs GlycoP, IgG, \alphal-antitripsina, \beta2-microglobulina, Apo Al lipoproteina (LP) y Factor XIIIb. De manera incluso más preferible, las proteínas del suero se seleccionan entre el grupo que consiste de albúmina, transferrina, Apo Al LP y Factor XIIIb.

En una forma de realización de la presente invención, la mezcla de proteínas comprende TGE \beta1, TGF \beta2, TGF \beta3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, osteocalcina, osteonectina, BSP, lisiloxidasa, catepsina L pre, albúmina, transferrina, Apo Al LP y Factor XIIIb. En otra forma de realización, la mezcla de proteínas comprende Proteína de Hueso (BP).

El medicamento puede comprender de manera adicional una matriz configurada como interfase entre tejido conectivo y hueso.

De manera preferible, la composición tiene una característica identificatoria seleccionada entre el grupo que consiste de una capacidad para inducir la infiltración celular en el emplazamiento de ligadura, una capacidad para inducir la proliferación celular en el emplazamiento de ligadura, una capacidad para inducir la formación del hueso, una capacidad para inducir la formación del tendón, y una capacidad para inducir la formación del cartílago. En una forma de realización preferida, el producto no incluye sustancialmente la resorción del hueso en el emplazamiento de ligadura. En otra forma de realización, la composición en un ensayo subcutáneo en ratas, induce un anillo ordenado de formación de hueso en la periferia alrededor de colágeno poroso implantado, e induce un anillo ordenado de formación de colágeno interior al anillo ordenado de formación de hueso. En otra forma de realización adicional, la mezcla de proteínas de ligadura, cuando se usa a una concentración de 10 \mug por 6,5-7,3 mg de colágeno de tendón bovino en un ensayo subcutáneo en ratas induce una puntuación de hueso de al menos aproximadamente de 2,0, usando una escala de clasificación de hueso definida en la Tabla 1, e induce una puntuación de cartílago de al menos aproximadamente de 1,5, usando una escala de clasificación de cartílago definida en la Tabla 8.

En la presente invención, la composición está de manera habitual a una concentración entre 0,5% y 33% en peso del producto, y en una forma de realización, está a una concentración entre 1% y 20% en peso del producto.

El componente de matriz de la presente invención es, en una forma de realización, bioresorbible. De manera preferible, la matriz es porosa. La matriz comprende de manera preferible un material seleccionado entre el grupo que consiste de un material polimérico sintético y una sustancia de crecimiento. En un aspecto, la matriz comprende un material seleccionado entre el grupo que consiste de una esponja, una membrana, una película y un gel. En una forma de realización preferida, la matriz comprende colágeno procedente de tendón bovino. En una forma de realización, la matriz conforma en un emplazamiento la ligadura de un tendón o ligamento a una concavidad de hueso.

Se usa la presente invención para mejorar una ligadura entre hueso y tejido conectivo seleccionado entre el grupo de tendón, ligamento y cemento. Esto puede incluir las etapas de implantar y fijar a un emplazamiento de ligadura entre hueso y tejido conectivo un medicamento de la presente invención tal como se ha descrito más arriba. La presente invención resulta particularmente útil cuando el emplazamiento de ligadura es un emplazamiento de ligadura de un ligamento cruzado anterior con el hueso, cuando el emplazamiento de ligadura es un emplazamiento de ligadura de un tendón seleccionado entre el grupo que consiste de supraspinatus, infraspinatus, subscapularis y teres minor, con el hueso; cuando el emplazamiento de ligadura es un emplazamiento de ligadura de un ligamento cubital colateral con el hueso, cuando el emplazamiento de ligadura es un emplazamiento de ligadura de un ligamento lateral del maléolo con el hueso; y/o cuando el emplazamiento de ligadura es un emplazamiento de ligadura de cemento anterior con el alvelolar.

De manera preferible, el producto se fija en la lesión mediante un medio de ligadura seleccionado entre el grupo de tuerca de interferencia, endobutton, suturas bioresorbibles, tuerca de compresión, suturas no resorbibles, montaje por presión, clavos, y dispositivos de sutura con grapas en T.

En una forma de realización, la matriz de ligadura se configura como una hoja. En esta forma de realización, la etapa de fijación comprende de manera preferible enrollar la hoja alrededor del tendón o ligamento a ligar con el hueso. En otra forma de realización, cuando el tejido conectivo es un tendón, la matriz de ligadura es un gel que se inyecta alrededor del tendón en canales de tendón y entre el tendón y el hueso. De forma preferible, el gel está tamponado.

En una forma de realización preferida, la presente invención incrementa la resistencia biomecánica de la ligadura entre el hueso y el tejido conectivo al menos en aproximadamente un 20%, y de manera más preferible en al menos aproximadamente un 50%, y de manera más preferible en al menos aproximadamente un 75%, e incluso de manera más preferible en al menos en aproximadamente un 100%, por encima de la anterior resistencia biomecánica de la ligadura entre el hueso y el tejido conectivo en ausencia del producto.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la resistencia de fijación de grapas usadas para la reconstrucción de ACL tratado con Proteína de Hueso, en comparación con los controles, en diferentes momentos.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la resistencia de fijación de grapas usadas para la reconstrucción de ACL tratado con Proteína de Hueso, en comparación con los controles tratados con material esponjoso sólo a las 8 semanas tras el tratamiento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a por lo general a la mejora de la ligadura entre hueso y tejido conectivo, que incluye la reparación o regeneración de dichas ligaduras, en las que la ligadura se dañado de forma parcial o total como resultado de un lesión o procedimiento quirúrgico, o se ha deteriorado bebido a una dolencia o enfermedad degenerativa, por ejemplo. La presente invención es útil para preparar cual ligadura entre cualquier tejido conectivo y el hueso, incluyendo, pero sin limitarse a, la ligadura de tendón, ligamentos y/o cemento con el hueso.

Una forma de realización de la presente invención se refiere a un medicamento para mejorar una ligadura entre hueso y tejido conectivo. El medicamento de la presente invención incluye: (a) una matriz configurada como interfase entre el hueso y el tejido conectivo; y (b) una composición que comprende una mezcla de proteínas asociada con la matriz, siendo dicha mezcla efectiva para inducir la formación de una interfase hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo con el hueso. La mezcla de proteínas incluye: factor de crecimiento de transformación \beta1 (TGF\beta1), proteína morfogenética de hueso (BMP)-2, BMP-3, y BMP-7. La cantidad de TGF\beta1 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 10% de proteínas totales en dicha mezcla; la cantidad de BMP-2 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,01% y aproximadamente 10% de proteínas totales en dicha mezcla; la cantidad de BMP-3 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 15% de proteínas totales en dicha mezcla; y la cantidad de BMP-3 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 15% de proteínas totales en dicha mezcla. A no ser que se especifique otra cosa, la referencia a los porcentajes de proteínas está basada en relaciones ponderales (p/p).

Tal como se ha descrito más arriba, antes de la presente invención, se han estudiado una variedad de procedimientos quirúrgicos y/o composiciones en relación a la readhesión y cicatrización del tendón o ligamento con el hueso. Sin embargo, las composiciones que se han usado con anterioridad in vivo para la readhesión y cicatrización del tendón o ligamento con el hueso han fallado en la reproducción de la ontogénesis natural de la ligadura entre hueso y tejido conectivo. Aunque los resultados de dichos estudios han producido a veces una ligadura funcional del tendón o ligamento con el hueso, no se ha demostrado el desarrollo de una ligadura entre tejido conectivo y hueso fisiológicamente natural. En la ligadura entre tejido conectivo y hueso que se produce de forma natural, tal como ocurre en un organismo vertebrado en desarrollo, existe una morfología natural del tejido conectivo con el hueso que incluye un abanico complejo de morfologías y zonas de transición de fibrocartílago y cartílago calcificado entre el tejido conectivo y el hueso. Ver, por ejemplo, Benjamin y col., 1995, supra.

Los presentes inventores creen que una morfología más natural entre el tejido conectivo y el hueso proporciona varios beneficios, entre los que se incluyen un aumento en el intervalo de movimiento y resistencia, que, por ejemplo, mejoraría la calidad de vida en pacientes que han experimentado cirugía del manguito rotatorio del hombro. Como otro ejemplo, en aplicaciones de reconstrucción de ACL, una morfología más natural del tejido conectivo y el hueso puede disminuir la laxitud de la rodilla. La disminución en la laxitud de la rodilla está asociada con índices menores de osteoartritis. Además, para reconstrucciones que incluyen reconstrucciones tanto de ACL como del manguito rotatorio del hombro, el producto de la presente invención puede disminuir el índice de fallo quirúrgico. Igualmente, el tejido biológico correcto puede absorber más correctamente la tensión física y el esfuerzo asociado con el movimiento del musculoesquelético normal. Además, se cree que el uso del producto de la presente invención mejora la velocidad de cicatrización, lo que puede disminuir los tiempos de rehabilitación. Esta ventaja es particularmente valiosa, porque permite a los atletas volver a la competición rápidamente, y a los trabajadores volver al trabajo más rápidamente.

La inducción fisiológica de hueso requiere factores de estimulación e inhibición para la inducción de hueso. Una composición que comprenda únicamente un estimulador de la inducción de hueso (por ejemplo, un único BMP recombinante o estimuladores múltiples, como han descrito anteriores investigadores), puede regenerar de forma subóptima el tejido en la interfase de hueso-tendón (o menisco/otros tejidos). Puesto que BP es una mezcla de proteínas derivada de forma natural que contiene tanto estimuladores como inhibidores de la inducción de hueso, induce más formación de hueso similar a la fisiológica que otras composiciones que se describen en el presente documento, que se han desarrollado a partir del conocimiento basado en BP. La inducción fisiológica de hueso incluye también otra clase de moléculas que, cuando se combinan con otras proteínas osteogénicas o condrogénicas tales como las contenidas en BP son inductores condrogénicos (TGF\beta1, TGF\beta2, TGF\beta3). La TGF\beta3 se encuentra en BP. Aunque estas proteínas inducen cartílago in vitro, no pueden inducir cartílago (o hueso) en el ensayo subcutáneo con roedores (Wozney y col., 1993, "Bone Morphogenetic proteins and their Gene Expression", Cell Mol. Biol. Bone 131-167). Se cree que la inducción subcutánea de cartílago/hueso es indicativa de las proteínas morfogenéticas, ya que se requiere la diferenciación de las células madre pluripotentes. La actividad condrogénica in vitro puede en su lugar únicamente incrementar la producción de matriz de las células condrogénicas comprometidas. La presente invención describe un intervalo de mezclas BMP/TGF\beta1 que optimizan la formación de la interfase hueso-tendón, y produce resultados in vivo que nos se han observado usando otras composiciones descritas con anterioridad a la presente invención.

La frase "ontogenia natural de la ligadura tejido conectivo-a-hueso", y frases similares a esta, se usan por tanto en el presente documento para referirse a un desarrollo de la ligadura tejido conectivo-a-hueso tal como se produce de manera natural en un organismo, como durante la embriogénesis. Antes de la presente invención, las compasiones usadas para mejorar la ligadura o reparación del tejido conectivo al hueso han fallado en la inducción de la formación de dicha morfología natural, y en particular, una zona preferida de transición entre fibrocartílago y cartílago calcificado.

A diferencia de los estudios anteriores, los presentes inventores han descubierto el uso de un producto para la mejora de la ligadura tejido conectivo-a-hueso que incluye una mezcla compleja de proteínas derivada de Proteína de Hueso (BP), describiéndose BP con más detalle a continuación. Los presentes inventores han encontrado que el producto de la presente invención, a diferencia de las composiciones descritas con anterioridad para uso en la ligadura tejido conectivo-a-hueso puede recapitular la ontogenia natural de tejido conectivo-a-hueso. De manera específica, el producto de la presente invención es efectivo para inducir una interfase hueso-fibrocartílago/cartílago calcificado-tejido conectivo, que también se denomina en el presente documento de manera general como interfase hueso-cartílago-tejido conectivo, en un emplazamiento de ligadura entre el tejido conectivo y el hueso (es decir, un tejido fisiológicamente natural en el emplazamiento). Más aún, el producto induce una mayor cantidad de hueso y el hueso aparece más rápido y en cercanía próxima con el tejido conectivo. Esta cicatrización fisiológicamente precisa incrementa la resistencia de la fijación en los puntos iniciales, y puede incrementar de manera específica la resistencia de la fijación en pacientes con patologías degenerativas de tendón y/o hueso. Sin desear quedar ligado por la teoría, los presentes inventores creen que la reparación de la ligadura tejido conectivo-a-hueso, y de manera particular cuando el tejido natural se ha destruido o deteriorado completamente, requiere el mantenimiento de una concentración suficiente de una mezcla compleja concreta de factores de reparación en el emplazamiento durante un tiempo suficiente para inducir una formación correcta de la ligadura que imite con fiabilidad la ontogenia natural, esta ontogenia natural esta basada en un sistema muy complicado de diferentes factores, combinaciones de factores y concentraciones de factores con gradientes temporales y locales. Un único factor recombinante o unos cuantos factores recombinantes pueden carecer de la complejidad inductiva que imite la ontogenia natural en un grado suficiente. De manera similar, el sistema usado para proporcionar uno o varios factores recombinantes puede no ser capaz de imitar la complejidad de gradiente del sistema natural en grado satisfactorio o para mantener una concentración de factor durante el tiempo que sea suficiente para permitir una diferenciación completa y permanente de las células precursoras hasta el tipo apropiado de células en la localización apropiada. Por tanto, los presentes inventores han descubierto un producto y un procedimiento que produce un resultado cualitativo y cuantitativo superior a cualquier otro descrito para la ligadura tejido conectivo-a-hueso.

Se reconoce que el término "tejido conectivo" se entiende en la técnica para referirse al tejido que une y es el soporte de varias estructuras del cuerpo, y que está formado por fibroblastos, fibroglía, fibrillas de colágeno y fibrillas elásticas. Se deriva a partir del mesodermo, y en un sentido amplio incluye los tejidos coleginoso, elástico, mucoso, reticular, óseo y cartilaginoso (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27ª Edición, 1988, W.B. Saunders Company). Para conveniencia en la discusión de las formas de realización de la presente invención, sin embargo, el término "tejido conectivo" tal como se usa en el presente documento se refiere al tejido conectivo que conecta con el hueso, tal como el tejido conectivo que conecta hueso o cartílago a hueso o músculo a hueso, y de manera particular se selecciona entre el grupo de tendón y ligamento. En una forma de realización, el término "tejido conectivo" se usa para referirse al cemento, que se define como la capa fina de tejido calcificado que recubre la dentina de la raíz de un diente y ancla el diente en su alvéolo óseo. De acuerdo con la presente invención, los términos "ligamento" y "tendón" se definen de acuerdo con la definición del Dorland's Illustrated Medical Dictionary, ibid. De manera específica, el término "ligamento" se define como una banda de tejido conectivo fibroso que conecta los huesos y el cartílago, que soporta y refuerza las articulaciones. El término "tendón" se define como un cordón fibroso de tejido conectivo en el que terminan las fibras musculares, y mediante el cual el músculo está ligado al hueso o a otra estructura.

La composición de la presente invención proporciona el uso de una mezcla de proteínas mejorantes de la ligadura. De acuerdo con la presente invención, el término "mejorar", de manera particular en relación a la mejora de la ligadura entre tejido conectivo y hueso, se refiere a cualquier forma de aumentar, amplificar, mejorar, aumentar o suplementar la ligadura entre tejido conectivo y hueso de manera que imite de la forma más cercana posible la ontogenia natural de la ligadura tejido conectivo-a-hueso, según se compara por la ligadura entre tejido conectivo y hueso que se produciría en ausencia del producto, o en ausencia de la porción compuesta del producto. De manera más particular, una mejora mensurable del índice de la ligadura entre tejido conectivo y hueso es cualquier mejora mensurable en el tiempo comprendido entre el Día 0 de la ligadura (es decir, el día en el que el producto se implanta en el paciente) y el día en el que se determina que se ha desarrollado una interfase adecuada hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de la ligadura, en comparación con una ligadura sustancialmente similar entre tejido conectivo y hueso que se ha llevado a cabo en ausencia del producto de la presente invención o en ausencia de la porción compuesta del producto de la presente invención. Se define el desarrollo de una interfase adecuada hueso-cartílago-tejido conectivo como una indicación inicial de una mejor resistencia biomecánica del la ligadura. En una forma de realización preferida, el producto de la presente invención mejora de forma mensurable el índice de la ligadura entre tejido conectivo y hueso según se compara por la ligadura entre tejido conectivo y hueso que se produciría en ausencia del producto de la presente invención, o en ausencia de la porción compuesta del producto en al menos un 20%, y de manera más preferible, en al menos aproximadamente un 50%, y de manera más preferible, en al menos aproximadamente un 100%.

Además, el uso del producto de ligadura para ligar el tejido conectivo al hueso da como resultado una mejora mensurable de la calidad de la ligadura entre tejido conectivo y hueso según se compara con la calidad de la ligadura que se produce en ausencia del producto de la presente invención, o en ausencia de la porción compuesta del producto de la presente invención. Se define una mejora mensurable de la calidad de la ligadura entre tejido conectivo y hueso como cualquier mejora mensurable en la calidad de la ligadura y, de manera particular, en la formación de una interfase hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de la ligadura, definiéndose la mejora como el desarrollo de una ontogenia más natura de la ligadura tejido conectivo-a-hueso, que se puede indicar mediante un complejo abanico de morfologías y de zonas de transición de fibrocartílago y cartílago calcificado entre el tejido conectivo y el hueso, la inducción de infiltración celular en el interior del producto, la inducción de proliferación celular, y la producción de organización espacial y celular para forma un tejido tridimensional que represente más cercanamente la ligadura entre tejido conectivo y hueso.

Se describen con más detalle a continuación varias formas de realización de la composición. Para referencia general, sin embargo, se proporciona la siguiente descripción. Las proteínas que se pueden incluir en la mezcla de proteínas de la composición, también denominada en el presente documento como "proteínas estimulantes de la ligadura", son proteínas que, solas y/o en combinación con otras proteínas, son efectivas para mejorar la ligadura entre tejido conectivo y hueso. Son ejemplos de proteínas estimulantes de la ligadura, pero no se limitan a, los miembros de la superfamilia de las TGF\beta, factores de crecimiento, proteínas de la matriz ósea, y proteínas de suero.

Tal como se usa en el presente documento, una "proteína de la superfamilia de las TGF\beta" puede ser cualquier proteína de la superfamilia conocida en la técnica de proteínas de la transducción de la señal extracelular que estén estructuralmente relacionadas con la TGF\beta1-5, e incluye los equivalentes funcionales de dichas proteínas naturales, tales como los fragmentos de dichas proteínas que retengan la actividad biológica de la proteína natural. De acuerdo con el uso de la presente invención, la mezcla de proteínas en la composición incluye al menos dos miembros diferentes de la superfamilia de las TGF\beta. En otras formas de realización, la mezcla de proteínas en la composición incluye al menos tres miembros diferentes de la superfamilia de las TGF\beta, y en formas de realización alternativas, al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve y de manera más preferible, diez miembros diferentes de la superfamilia de las TGF\beta. De manera preferible, una proteína de la superfamilia de las TGF\beta adecuada para uso en la presente invención se selecciona entre las siguientes proteínas: TGE \beta1, TGF \beta2, TGF \beta3, proteína morfogenética de hueso BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, proteína morfogenética derivada de cartílago (CDMP-1) BMP-12, (CDMP-2) BMP-13, y/o (CDMP-3) BMP-14. De manera más preferible, las proteínas de la superfamilia de las TGF\beta se seleccionan entre el grupo de TGE \beta1, TGF \beta2, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP-1, CDMP-2 y/o CDMP-3. En una forma de realización, la superfamilia de las TGF\beta en una composición de Proteína de Hueso incluye al menos una de BMP-2-8, y de manera más preferible, al menos una de TGE \beta1-5, e incluso de manera más preferible al menos una de CDMP1-3. En una forma de realización preferida, la mezcla de proteínas incluye al menos BMP-2, BMP-3, y BMP-7. En otra forma de realización preferida, la mezcla de proteínas incluye al menos una proteína TGF\beta (y de manera más preferible TGE \beta1), BMP-2, BMP-3, y BMP-7, y al menos una de CDMP1-3.

Tal como se usa en el presente documento, "proteínas de la matriz del hueso" son cualquier grupo de proteínas conocidas en la técnica por ser componentes de, o estar asociadas con, las fibras colagenosas y sustancias base que forman la matriz del hueso, e incluye los equivalentes funcionales de dichas proteínas que se encuentran de manera natural; dichos fragmentos de dichas proteínas retienen la actividad biológica de las proteínas que se encuentran de manera natural. Tal como se usa en el presente documento, una proteína de la matriz del hueso no es un miembro de la superfamilia de las TGF\beta tal como se usa en el presente documento, ni un factor de crecimiento tal como se define en el presente documento. Entre las proteínas de la matriz del hueso se pueden incluir, pero sin limitarse a, osteocalcina, osteonectina, sialoproteina de hueso (BSP), lisiloxidasa, catepsina L pre, osteopontina, proteína de la matriz GLA (MGP), biglicano, decorina, sulfato III proteoglicano-condroitina (PG-CS III), glicoproteina ácida de hueso (BAG75), trombospondina (TSP) y/o fibronectina. De manera preferible, las proteínas de la matriz del hueso de la presente invención incluye una o más de: osteocalcina, osteonectina, MGP, TSP, BSP, lisiloxidasa y catepsina L pre. En una forma de realización, las proteínas de la matriz del hueso incluyen osteocalcina, osteonectina, BSP, lisiloxidasa, y catepsina L pre.

Tal como se usa en el presente documento, "proteínas del factor de crecimiento" son cualquier grupo de proteínas caracterizadas por una molécula indicadora que es un polipéptido extracelular es estimula una célula a crecer y proliferar, e incluye los equivalentes funcionales de dichas proteínas que se encuentran de manera natural; dichos fragmentos de dichas proteínas retienen la actividad biológica de las proteínas que se encuentran de manera natural. Dichos factores de crecimiento pueden tener otras acciones además de la inducción del crecimiento o proliferación celular. Tal como se usa en el presente documento, un factor de crecimiento no es un miembro de la superfamilia de las TGF\beta tal como se usa en el presente documento, ni un proteína de la matriz del hueso Tal como se define en el presente documento. De manera preferible, las proteínas del factor de crecimiento adecuadas para uso con el producto de la presente invención incluye uno o más de: factor de crecimiento del fibroblasto-I (FGF-I), FGT-II, FGF-9, factor inhibitorio del leucocito (LIF), insulina, factor de crecimiento de la insulina I (IGF-I), IGF-II, factor de crecimiento derivado de plaquetas AA (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, factor derivado de estromas-2 (SDF-2), hormona tiroidea de la pituitaria (PTH), hormona del crecimiento, factor de crecimiento del hepatocito (HGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento de transformación-\alpha (TGF\alpha) y proteínas de gamuza. Una proteína del factor de crecimiento más preferida para uso con el producto de la presente invención es FGF-L.

En una forma de realización, una composición que incluye una mezcla de proteínas de ligadura-estimulación puede incluir una o más proteínas de suero. Tal como se usa en el presente documento, las proteínas de suero son cualquier grupo de proteínas de las que se sabe que son componentes del suero, e incluye los equivalentes funcionales de dichas proteínas que se encuentran de manera natural; dichos fragmentos de dichas proteínas retienen la actividad biológica de las proteínas que se encuentran de manera natural. Una proteína de suero no es un miembro de la superfamilia de las TGF\beta ni una proteína de la matriz del hueso ni un factor de crecimiento, tal como se describen en el presente documento. De manera preferible entre las proteínas de ligadura-estimulación se incluyen, en preferencia creciente, al menos una, dos, tres y de manera más preferible cuatro proteínas de suero diferentes. Entre las proteínas de suero adecuadas para uso con el pronto de la presente invención se incluyen una o más de albúmina, transferrina, \alpha2-Hs GlycoP, IgG, \alphal-antitripsina, \beta2-microglobulina, Apo Al lipoproteina (LP) y Factor XIIIb. De manera más preferible, las proteínas del suero adecuadas para uso con el producto de la presente invención incluyen una o más albúmina, transferrina, Apo Al LP y Factor XIIIb.

Una composición usada en la presente invención incluye una mezcla de proteínas que incluye factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), proteína morfogenética de hueso (BMP)-2, BMP-3, y BMP-7. La cantidad del TGF\beta1 en la mezcla está comprendida entre aproximadamente 0,01% y 10% de proteínas totales en dicha mezcla; o comprendida entre aproximadamente 0,01% y 1%, o comprendida entre 0,01% y 0,5%, o comprendida entre 0,01% y 0,1% o comprendida entre 0,05% y 1%, o comprendida entre 0,05% y 10%, o comprendida entre 0,1% y 1%, o comprendida entre 0,1% y 10% de proteínas totales. En una forma de realización, la relación entre TGF\beta1 y al resto de proteínas en la mezcla es de hasta 1:10. La cantidad de la BMP-2 en la mezcla está comprendida normalmente entre 0,01% y 10% de proteínas totales en dicha mezcla; o comprendida entre aproximadamente 0,01% y 1%, o comprendida entre 0,01% y 0,1%, o comprendida entre 0,1% y 1% o comprendida entre 0,1% y 10%, de proteínas totales, y en una forma de realización, está presente en una cantidad comprendida entre 0,1 y 5% de proteínas totales en la muestra. La cantidad de la BMP-3 en la mezcla está comprendida normalmente entre 0,1% y 15% de proteínas totales en la mezcla; o comprendida entre 0,1% y 1%, o comprendida entre 0,01% y 15%, o comprendida entre 0,01% y 1% o comprendida entre 0,01% y 0,1%, y en una forma de realización, está presente en una cantidad comprendida entre 0,1 y 10% de proteínas totales en la muestra. La cantidad de la BMP-7 en la mezcla está comprendida normalmente entre 0,01% y 10% de proteínas totales en la mezcla; o comprendida entre 0,01% y 1%, o comprendida entre 0,01% y 0,1%, o comprendida entre 0,1% y 1% o comprendida entre 0,1% y 10%, de proteínas totales, y en una forma de realización, está presente en una cantidad comprendida entre 0,1 y 5% de proteínas totales en la muestra. La secuencia de de aminoácidos y de ácidos nucleicos de cada una de las proteínas citadas más arriba son conocidas en la técnica y se puede acceder a ellas públicamente, por ejemplo, a través de una base de datos como GenBank. De manera adicional, estas proteínas se pueden purificar, si se desea, a partir de una fuente apropiada, tal como hueso desmineralizado. Por ejemplo, se puede aislar el TGF\beta1 de alta pureza a partir de hueso bovino usando los procedimientos descritos por Seyedin (Ogawa y col., Meth. Enzymol., 198:317-327 (1991); Seyedin y col., PNAS, 82:2267-71 (1985)). De manera adicional, se pueden preparar mezclas de proteínas derivadas de hueso que contienen estas proteínas en los intervalos citados a partir de hueso desmineralizado usando procedimientos conocidos en la técnica, y descritos con cierto detalle en el presente documento.

En un aspecto de esta forma de realización, la mezcla de proteínas comprende la superfamilia de las TGF\beta: TGF\beta1, proteína morfogenética de hueso BMP-2, BMP-3, y BMP-7, en la que las proteínas de la superfamilia TGF\beta comprenden conjuntamente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente el 100% de la mezcla de proteínas. De forma alternativa, la las proteínas de la superfamilia TGF\beta pueden estar comprendidas en un porcentaje entre 0,5 y 50%, o comprendidas entre 0,5% y 25% de la mezcla de proteínas, o comprendidas entre 1% y 10% de la mezcla de proteínas.

En un aspecto de esta forma de realización, la mezcla de proteínas comprende de manera adicional una o más de las siguientes proteínas de la superfamilia TGF\beta; TGF \beta2, TGF \beta3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, y BMP-9, así como proteína morfogenética derivada de cartílago (CDMP), que puede incluir una o más de entre CDMP-1 (es decir, BMP-12), CDMP-2 (es decir, BMP-13), o CDMP-3 (es decir, BMP-14). La cantidad de TGF\beta2 en dicha mezcla está comprendida típicamente entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 12% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de TGF\beta2 para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 20% de la mezcla total. La cantidad de TGF\beta3 en dicha mezcla está comprendida típicamente entre 0,01% y 15% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de TGF\beta3 para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 25% de la mezcla total. La cantidad de BMP-4 en dicha mezcla está comprendida típicamente entre 0,01% y 1% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de BMP-4 para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 10% de la mezcla total. La cantidad de BMP-5 en dicha mezcla está comprendida típicamente entre 0,01% y 1% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de BMP-4 para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 10% de la mezcla total. La cantidad de BMP-6 en dicha mezcla está comprendida típicamente entre 0,01% y 1% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de BMP-4 para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 10% de la mezcla total. La cantidad de CDMP en la mezcla de proteínas está comprendida típicamente entre 0,01% y 1% de la mezcla total de proteínas, aunque se puede añadir, si se desea, más cantidad de CDMP para mejorar la eficacia de la composición para mejorar la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, hasta un 10% de la mezcla total de proteínas.

En un aspecto de esta forma de realización, la mezcla de proteínas puede incluir de manera adicional una proteína de la matriz del hueso. Las proteínas de la matriz del hueso, entre las que se incluyen las proteínas de la matriz del hueso preferidas para uso en la composición de la presente invención, se han descrito por lo general más arriba. Las proteínas de la matriz del hueso están presentes típicamente en la mezcla en una cantidad comprendida entre 20% y 98% de la mezcla total de proteínas, aunque cantidad de proteínas de la matriz del hueso puede ser menor del 20%, si se desea. En una forma de realización, las proteínas de la matriz del hueso están presentes en la mezcla en una cantidad comprendida entre 40% y 98% de la mezcla total de proteínas.

En otro aspecto de esta forma de realización, la mezcla de proteínas puede incluir de manera adicional al menos una proteína del factor de crecimiento. Las proteínas del factor de crecimiento se han descrito por lo general más arriba, entre las que se incluyen las proteínas del factor de crecimiento preferidas para uso en la composición de la presente invención. Típicamente, la proteína del factor de crecimiento está presente en la mezcla de proteínas en una cantidad comprendida entre 0,01% y 50% de la mezcla total de proteínas. En otras formas de realización, la cantidad de proteínas del factor de crecimiento en la mezcla está comprendida entre 0,5% y 25% de la mezcla total de proteínas; o comprendida entre 0,1% y 10% de la mezcla total de proteínas. Cuando el factor de crecimiento es FGF-I, la cantidad de FGF-I en la mezcla de proteínas está comprendida entre 0,001% y 10% de la mezcla total de proteínas.

En otro aspecto adicional de esta forma de realización, la mezcla de proteínas puede incluir una o más proteínas de suero. Las proteínas de suero se han descrito por lo general más arriba, entre las que se incluyen las proteínas de suero preferidas para uso en la composición de la presente invención. Las proteínas de suero están típicamente presenten presente en la mezcla de proteínas en una cantidad comprendida entre 20% y 98% de la mezcla total de proteínas, aunque si se desea, la cantidad de proteínas de suero puede ser inferior al 20%. En una forma de realización, las proteínas de suero están presentes en la mezcla de proteínas en una cantidad comprendida entre 40% y 98% de la mezcla total de proteínas.

En un aspecto de esta forma de realización, una mezcla de proteínas adecuada para uso en la parte de composición de un producto incluye las siguientes proteínas: TGE \beta1, TGF \beta2, TGF \beta3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, osteocalcina, osteonectina, BSP, lisiloxidasa, catepsina L pre, albúmina, transferrina, Apo Al lipoproteina (LP) y Factor XIIIb. En otra forma de realización, una mezcla de proteínas adecuada incluye la mezcla de proteínas que en el presente documento se denomina como Proteína de Hueso (BP), que se define en el presente documento como una mezcla de proteínas purificada de forma parcial procedente de huesos largos de bovino, tal como describen Poser y Benedict en el Documento WO 95/13767.

En otro aspecto de esta forma de realización, la composición tiene una o más de las siguientes características: (1) una capacidad para inducir la infiltración celular en el emplazamiento de una ligadura entre tejido conectivo y hueso; (2) una capacidad para inducir la proliferación celular en el emplazamiento de una ligadura entre tejido conectivo y hueso; (3); una capacidad para inducir la formación de hueso en el emplazamiento de una ligadura entre tejido conectivo y hueso; (4) una capacidad para inducir la formación de un tejido conectivo seleccionado entre tendón y/o ligamento en el emplazamiento de la ligadura entre tejido conectivo y hueso; y (5) una capacidad para inducir la formación de fibrocartílago y cartílago calcificado en el emplazamiento de una ligadura entre tejido conectivo y hueso. En una forma de realización preferida, la composición de manera preferible no induce la resorción del hueso en el emplazamiento de la ligadura.

En otro aspecto adicional de esta forma de realización, la mezcla de proteínas, cuando se usa a una concentración de al menos 10 \mug por 6,5-7,3 mg de colágeno de tendón bovino en un ensayo subcutáneo en ratas, induce una puntuación de hueso de al menos aproximadamente 1,0 y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,25, y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,5, y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,75, e incluso más preferible de al menos aproximadamente 2,0, usando la escala de puntuación de hueso que se define en la Tabla 1 (Ejemplos 1 y 6), e induce una puntuación de cartílago de al menos aproximadamente 1,0 y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,25, y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,5, y de manera más preferible de al menos aproximadamente 1,75, e incluso más preferible de al menos aproximadamente 2,0, usando la escala de puntuación de hueso que se define en la Tabla 8 (Ejemplo 6). Se describe con más detalle en la sección de Ejemplos un ensayo subcutáneo en ratas adecuado para determinar las puntuaciones de hueso y cartílago de acuerdo con este aspecto, y las escalas se puntuación de las Tablas 1 y 8.

En una forma de realización, una composición adecuada para uso en la presente invención se puede caracterizar por su capacidad, cuando se combina con una matriz de ligadura (por ejemplo, un material esponjoso de colágeno), y usado en un ensayo subcutáneo en ratas tal como se describe en el Ejemplo 6, induce un anillo ordenado de formación de hueso alrededor de la periferia del material esponjoso de colágeno. De manera más particular, una composición adecuada para uso en la presente invención, cuando se usa en un ensayo subcutáneo en ratas tal como se describe en el Ejemplo 6, induce un anillo ordenado de en el exterior del material esponjoso de colágeno y justo por dentro de dicho anillo produce un anillo ordenado de cartílago. Sin desear quedar ligado por la teoría, los presentes inventores creen que esta característica es indicativa de composiciones que producirán una fijación superior entre tendón y hueso.

En una forma de realización, una composición incluye una mezcla de proteínas que incluye una formulación derivada de hueso con actividad condrogénica y osteogénica. De manera preferible, una composición que comprende dicha formulación derivada de hueso tiene una o más características, que incluyen: (1) una capacidad para inducir la infiltración celular en el emplazamiento de ligadura entre tejido conectivo y hueso; (3); una capacidad para; (2) una capacidad para inducir la proliferación celular en el emplazamiento de ligadura entre tejido conectivo y hueso; (3); una capacidad para inducir la formación de hueso en el emplazamiento de ligadura entre tejido conectivo y hueso; (4) una capacidad para inducir la formación de un tejido conectivo seleccionado entre tendón y/o ligamento en el emplazamiento de la ligadura entre tejido conectivo y hueso; y (5) una capacidad para inducir la formación de fibrocartílago y cartílago calcificado en el emplazamiento de una ligadura entre tejido conectivo y hueso. En una forma de realización preferida, la composición que comprende una formulación derivada de hueso no induce de manera preferible la resorción del hueso en el emplazamiento de la ligadura. En una forma de realización, una composición derivada de hueso, cuando se usa a una concentración de al menos de 10 \mug por 6,5-7,3 mg de colágeno de tendón bovino en un ensayo subcutáneo en ratas induce una puntuación de hueso de al menos aproximadamente de 1,0, y de forma más preferible de al menos 1,5, y de forma más preferible de al menos 1,75, e incluso de forma más preferible de al menos 2,0 usando una escala de clasificación de cartílago definida en la Tabla 8 (Ejemplo 6). En otra forma de realización, una composición que comprende una formulación derivada de hueso se caracteriza por su capacidad, cuando se combina con una matriz de ligadura (por ejemplo, un material esponjoso de colágeno) y se usa en un ensayo subcutáneo en ratas como el que se describe en el ejemplo 6, produce un anillo ordenado en el exterior del material esponjoso de colágeno y justo por el interior de dicho anillo produce un anillo ordenado de cartílago.

Una "formulación derivada de hueso que tenga actividad condrogénica y osteogénica" define cualquier mezcla de proteínas que contenga una mezcla compleja de proteínas que se aislan o derivan (por ejemplo, mediante al menos una, típicamente, mediante múltiples etapas de purificación) a partir de un material de partida de hueso, y que es condrogénico y osteogénico in vivo. De manera preferible, la formulación derivada de hueso es capaz de inducir la formación de hueso y cartílago en un ensayo subcutáneo en ratas in vivo tal como el que se describe en el apartado de Ejemplos del ensayo con roedores de Sampath-Reddi modificado por Rosen (Sampath y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80(21):6591-5 (1983)). Las formulaciones derivadas de hueso particularmente preferidas para uso en la presente invención incluyen Proteína de Hueso (BP) y las subfracciones y derivados relacionados con la anterior. La sección de ejemplos describe ejemplos de BP (Ejemplos 5 y 8), y derivados relacionados con la anterior (Ejemplo 7).

El material de partida de hueso puede ser una muestra de hueso de cualquier origen, entre las que se incluyen, pero sin limitarse a, hueso bovino y humano. El hueso se puede procesar mediante cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica para producir composiciones que tengan actividad condrogénica y osteogénica (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.563.489 concedida a Urist; la Patente de los Estados Unidos Nº 5.629.009 concedida a Laurencin y col, el Documento PCT Publication Nº WO95/13767), y refinado en etapas de proceso posteriores, si es necesario, para mejorar la capacidad de dicha composición para mejorar la ligadura entre tejido conectivo y hueso (por ejemplo, una etapa adicional de purificación para aumentar los niveles relativos de proteínas seleccionadas). No se usa "formulación derivada de hueso" para definir mezclas de una o más proteínas recombinantes, ya que las proteínas recombinantes no se producen usando hueso como material de partida.

Por ejemplo, un procedimiento para producir Proteína de Hueso, y descrita, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Nº 5.290.763, titulada "Mezclas de proteínas osteoinductivas y procedimientos de purificación", que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad, incluye típicamente las etapas de llevar a cabo cromatografía de intercambio de aniones de una solución de extracto de hueso desmineralizada, un procedimiento de intercambio de cationes, y un procedimiento de HPLC en fase reversa.

De acuerdo con la presente invención, las proteínas se pueden añadir a la composición, y de manera particular, a una composición derivada de hueso, en forma de proteínas exógenas adicionales. Una "proteína exógena" define una proteína que está en forma sustancialmente pura, y que no forma parte de una formulación de proteínas condrogénicas y osteogénicas derivadas de hueso, por ejemplo (es decir, la proteína exógena no se aisló con la formulación de proteínas condrogénicas y osteogénicas derivadas de hueso). La proteína exógena se añade en su lugar a la formulación como una proteína adicional procedente de una fuente distinta. Debe entenderse que la formulación de proteínas condrogénicas y osteogénicas derivadas de hueso puede contener de manera natural las misma proteínas (es decir, proteínas "endógenas") que se pueden añadir de forma adicional como una fuente exógena. Sin embargo, se pretenda la adición de una proteína exógena como forma de incrementar la cantidad total de una proteína concreta, más allá de la que se encuentra de manera natural en los huesos y en las mezclas derivadas de los mismos. La proteína exógena puede ser una proteína recombinante o una proteína sustancialmente purificada procedente de cualquier fuente adecuada, tal como hueso.

En una forma de realización, cada una de las proteínas estimulantes de la ligadura se proporciona mediante la composición tanto (1) directamente, en forma de una proteína asociada con la matriz, como (2), en forma de una molécula de ácido nucleico recombinante asociada con la matriz dicha molécula de ácido nucleico recombinante codifica la proteína, y de manera optativa puede estar ligada de forma operativa con una secuencia de control de la trascripción de forma que la proteína puede expresarse en condiciones adecuadas. Por tanto, una composición puede incluir proteínas, moléculas de ácido nucleico recombinante, o una combinación de proteínas y moléculas de ácido nucleico recombinante, dicha combinación proporciona las proteínas estimulantes de la ligadura descrita más arriba.

Se puede obtener una proteína estimulante de la ligadura a partir de su fuente natural, producir usando tecnología del ADN recombinante, o sintetizarse por procedimientos químicos. Tal como se usa en el presente documento, una proteína estimulante de la ligadura puede ser una proteína de longitud completa (es decir, en su forma de aparición natural de longitud completa), cualquier homólogo de dicha proteína, cualquier proteína de fusión que tenga dicha proteína, o cualquier mimotopo de dicha proteína. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas estimulantes de la ligadura que se describen en el presente documento, así como las secuencias de ácido nucleico que codifican los mismos se conocen en la técnica, y están públicamente disponibles, por ejemplo en bases de datos de secuencias tales como GenBak. Dichas secuencias pueden por tanto obtenerse y usarse para producir proteínas y moléculas de ácido nucleico recombinante de la presente invención.

Un homólogo se define como una proteína en la que los aminoácidos se han borrado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palpitación, amidación y/o adición de glicosilfosfatidil inositol). Un homólogo de una proteína estimulante de la ligadura es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que es suficientemente similar a secuencia de aminoácidos de la proteína estimulante de la ligadura de aparición natural tal que el homólogo tienen sustancialmente la misma o mejorada actividad biológica, comparada con la proteína correspondiente de aparición natural. Los homólogos de proteínas pueden ser el resultado de una variación alélica natural o de una mutación natural. En una forma de realización, un homólogo estimulante de la ligadura comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente 6, y de forma más preferible al menos aproximadamente 12 y de forma más preferible al menos aproximadamente 24 residuos de aminoácido contiguos de una secuencia de aminoácidos de una proteína estimulante de la ligadura de aparición natural (es decir, de tipo salvaje). En otra forma de realización, una homólogo estimulante de la ligadura se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos aproximadamente 18, y de forma más preferible al menos aproximadamente 36 y de forma más preferible al menos aproximadamente 72 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estimulante de la ligadura de aparición natural.

Tal como se usa en el presente documento, un mimotopo (también denominado como un mímico sintético) de una proteína estimulante de la ligadura de acuerdo con la invención define cualquier compuesto que es capaz de mimetizar la actividad de una proteína estimulante de la ligadura de aparición natural, a menudo porque el mimotopo tiene una estructura que imita la proteína estimulante de la ligadura. En una forma de realización, se identifica un mimotopo por ser capaz de enlazarse con un anticuerpo que de manera selectiva se enlaza con la proteína de aparición natural en la que se basa el mimotopo. Los mimotopos pueden ser, pero no se limitan a, péptidos que se han modificado para disminuir sus susceptibilidad a la degradación; anticuerpos anti-idiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; porciones inmunogénicas no proteínicas de una proteína aislada (por ejemplo, estructuras de carbohidrato); y moléculas orgánicas de aparición natural o sintética, incluyendo ácidos nucleicos. Dichos mimotopos se pueden diseñar usando estructuras generadas por ordenador o proteína estimulante de la ligadura de aparición natural. Se pueden obtener también los mimotopos por generación aleatoria de muestras de moléculas, tales como oligonucleótidos, péptidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas, y seleccionar dichas muestras mediante técnicas de cromatografía por afinidad usando el correspondiente compañero de enlace. Se pueden diseñar los mimotopos usando estructuras tridimensionales generadas por ordenador de las proteínas estimulantes de la ligadura

El péptido y los mimotopos sintéticos de las proteínas se pueden diseñar creando un nuevo compuesto químico o biológico (por ejemplo, proteína, péptido, anticuerpo, antisentido, ribozima), o buscando en las bases de datos de bibliotecas de compuestos conocidos (por ejemplo, un compuesto relacionado en una base de datos de selección por ordenador que contenga estructuras tridimensionales de compuestos conocidos). El diseño se puede realizar también estimulando compuestos químicos o biológicos que tengan fracciones sustituidas en ciertas características estructurales. La etapa de diseño puede incluir la selección de un compuesto basado en una función conocida del compuesto. Una etapa preferida del diseño comprende la selección por ordenador de una o más bases de datos de compuestos de los que se conoce su estructura tridimensional, y que se hace interactuar (por ejemplo, anclar, alinear, emparejar, intersectar) con la estructura tridimensional (o estructura tridimensional prevista) de la proteína por ordenador 8 por ejemplo, tal como se describe en Humblet y Dumbar, Animal Reports in Medical Chemistry, vol 28, pp 275-283, 1993, M Venuti, ed, Academic Press). Los procedimientos para sintetizar los compuestos químicos o biológicos son conocidos por aquellas personas expertas en la técnica, y dependen de la estructura de la molécula u otra molécula que se vaya a sintetizar. Los procedimientos para evaluar la bioactividad del compuesto sintetizado dependen de la bioactividad del compuesto (por ejemplo, inhibitoria o estimulante), y se describen en el presente documento.

Se describen diferentes procedimientos de diseño de fármacos en Mauilik y col., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss Inc., que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Mauilik y col. describen, por ejemplo, procedimientos de diseño directo, en el que el usuario dirige el procedimiento de creación de moléculas nuevas a partir de un fragmento de biblioteca de fragmentos correctamente seleccionados; el diseño aleatorio, en el que el usuario emplea un algoritmo genético o de otro tipo para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones a la vez que se aplica de forma simultánea un criterio de selección para evaluar la adecuación de los ligandos candidato; y una solución basada en una cuadrícula, en la que el usuario calcula la energía de interacción entre estructuras tridimensionales de receptor y pequeños fragmentos de sondas, seguido por el enlace conjunto de las sondas de emplazamiento favorables.

En un procedimiento de diseño de fármacos, no es siempre necesario alinear un compuesto candidato (es decir, un compuesto que está siendo analizado, por ejemplo, en un procedimiento de selección por ordenador) respecto de cada residuo en un emplazamiento de enlace. Los compuestos candidato adecuados pueden alinearse respecto de un subconjunto de residuos descritos para un emplazamiento objetivo. De manera preferible, un compuesto candidato comprende una conformación que promueve la formación de entrecruzamiento, covalente o no covalente, entre el emplazamiento de enlace y el compuesto candidato. De manera preferible, un compuesto candidato se enlaza con la superficie adyacente a un emplazamiento de enlace para proporcionan un emplazamiento adicional de interacción en un compuesto. Aquellas personas expertas en la técnica apreciarán que no es necesario que la complementariedad entre un compuesto candidato y el emplazamiento diana se extienda a todos los residuos especificados aquí con el fin de inhibir o estimular el enlace de un ligando.

En general, el diseño de un compuesto químico o biológico que tenga complementariedad estereoquímica se puede realizar mediante técnicas que optimicen, de manera química o geométrica, el "ajuste" entre un compuesto y el emplazamiento diana. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sheridan y Venkataraghavan, Acc. Chem Res., vol. 20, p. 322, 1987; Goodford, J. Med. Chem., vol. 27, p 557, 1984; Beddell, Chem. Soc. Reviews, vol. 279, 1985; Hol, Angew. Chem., vol 25, p. 767, 1986, y Verlinde y Hol, Structure, vol. 2 p. 577, 1994.

Una proteína de fusión es una proteína que incluye un emplazamiento que contiene una proteína estimulante de la ligadura ligado a uno o más segmentos de fusión. Los segmentos de fusión adecuado para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, segmentos que pueden: mejorar la estabilidad de una proteína; mejorar la actividad biológica de una proteína estimulante de la ligadura; y/o simplifica la purificación de una proteína. Un segmento de fusión adecuado puede ser un emplazamiento de cualquier tamaño que tiene la función deseada (por ejemplo, proporciona el incremento de estabilidad, imparte la mejora de la actividad biológica de una proteína, y/o simplifica la purificación de una proteína). Los segmentos de fusión se pueden juntar al término de aminoácido o de carboxilo del emplazamiento que contiene una proteína estimulante de la ligadura de la proteína, y puede ser susceptible de ruptura con el fin de permitir la recuperación directa de la proteína estimulante de la ligadura. Las proteínas de fusión se produce de manera preferible mediante el cultivo de una célula recombinante transformada mediante una molécula de ácido nucleico de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión enlazado al extremo tanto de carboxilo y/o de amino de un emplazamiento que contiene una proteína estimulante de la ligadura. Los segmentos de fusión preferidos incluyen un emplazamiento de enlace metálico (por ejemplo, un segmento de poli-histidina); un emplazamiento de enlace de inmunoglobulina (por ejemplo, Proteína a, Proteína, G, célula T; célula B, receptor Fc o regiones complementarias de proteína de anticuerpo-emplazamientos de enlace); un emplazamiento de enlace de azúcar (por ejemplo, un emplazamiento de enlace de maltosa); estreptavidina, avidita, biotina, y/o un emplazamiento "marcador" (por ejemplo, al menos una porción de \beta-galactosidasa, un péptido de marca lineal, otros emplazamientos que se pueden purificar usando compuestos que enlazan con el emplazamiento, tales como anticuerpos monoclonales.

Tal como se ha descrito más arriba, se puede proporcionar una o más proteínas estimulantes de la ligadura mediante una composición en forma de una molécula de ácido nucleico recombinante asociada con la matriz de ligadura, dicha molécula de ácido nucleico recombinante codifica una proteína estimulante de la ligadura y está ligada de manera operativa con una secuencia de control de trascripción de forma que la proteína se pueda expresar en condiciones adecuadas. Una molécula de ácido nucleico recombinante útil en la presente invención puede incluir una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína estimulante de la ligadura o un homólogo de dicha molécula de ácido nucleico, la última de estas se describe con más detalle a continuación. Una molécula de ácido nucleico útil en la presente invención puede incluir una o más regiones de regulación, regiones de codificación de longitud parcial o completa, o combinaciones de las mismas.

Una molécula aislada de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que se ha eliminado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), y puede incluir ADN, ARN, o derivados tanto de ADN como de ARN. Como tal "aislado" no refleja la extensión en la cual la molécula de ácido nucleico ha sido purificada. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína estimulante de la ligadura se puede aislar de su fuente natural, o producirse usando tecnología del ADN recombinante (por ejemplo, amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación), o síntesis química. Entre las moléculas de ácido nucleico aisladas se pueden incluir, por ejemplo, variantes alélicos naturales y homólogos de la molécula de ácido nucleico modificados mediante inserciones, delecciones, sustituciones y/o inversiones de nucleótido de forma que las modificaciones no interfieran de manera sustancial con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar una proteína estimulante de la ligadura de la presente invención, o para formar híbridos estables en condiciones restrictivas con aislados de gen naturales. Una de la presente invención aislada puede incluir degeneraciones. Tal como se usa en el presente documento, las degeneraciones de nucleótidos hacer referencia al fenómeno en el que se puede codificar una aminoácido mediante diferentes codones de nucleótido. De esta forma, la secuencia de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína estimulante de la ligadura puede variar debido a las degeneraciones.

Un homólogo de una molécula de ácido nucleico se puede producir usando diferentes procedimientos conocidos de aquellas personas expertas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., ibid). Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar usando diferentes técnicas entre las que se incluyen, pero sin limitarse a, a las técnicas clásicas de mutagénesis y ADN recombinante (por ejemplo, mutagénesis dirigida al emplazamiento, tratamiento químico, rotura mediante enzimas de restricción, ligadura de fragmentos de ácido nucleico y/o amplificación mediante PCR), o síntesis de mezclas de oligonucleótidos y ligadura de grupos mixtos para "construir" una mezcla de moléculas de ácido nucleico y combinaciones de las mismas. Los homólogos de una molécula de ácido nucleico se pueden seleccionar por hibridación con un gen de aparición natural o mediante selección respecto de la función de una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de aparición natural. Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se refiera en primer lugar a la molécula de molécula de ácido nucleico física y la frase "secuencia de ácido nucleico" se refiera en primer lugar a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico, ambas frases pueden usarse de forma intercambiable, especialmente en referencia a la molécula de ácido nucleico, o a una secuencia de ácido nucleico, que sea capaz de codificar una proteína estimulante de la ligadura.

El conocimiento de la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína estimulante de la ligadura de aparición natural de acuerdo con la presente invención permite a una persona experta en la técnica, por ejemplo (a) hacer copias de dichas moléculas de ácido nucleico, y (b) obtener moléculas de ácido nucleico que incluyan al menos una porción de dichas moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que incluyan genes de longitud completa, regiones de codificación de longitud completa, secuencias reguladoras de control, regiones truncadas de codificación). Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden obtener de diferentes formas, entre las que se incluye la selección de bibliotecas adecuadas de expresión con anticuerpos; técnicas tradicionales de clonación que usan sondas de oligonucleótidos para seleccionar bibliotecas o ADN adecuados; y amplificación mediante PCR de bibliotecas o ADN adecuados usando cebadores de oligonucleótido. Las técnicas de clonación y amplificación de genes se describen en, por ejemplo, Sambrook y col., ibid.

Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína estimulante de la ligadura se liga de manera operativa a una o más secuencias de control de la trascripción para formar una molécula recombinante. La frase "se liga de manera operativa" se refiere al enlace de una molécula de ácido nucleico con una secuencia de control de la trascripción de forma que la molécula sea capaz de expresarse cuando se transfecte (es decir, transforme, transduzca o transfecte) una célula huésped. Una molécula de ácido nucleico recombinante incluye un vector recombinante, que es cualquier secuencia de ácido nucleico, normalmente una secuencia heteróloga, que esté ligada de manera operativa con la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína estimulante de la ligadura, que es capaz de permitir la producción recombinante de la proteína, y que es capaz de administrar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped de acuerdo con la presente invención. Dicho vector puede contener secuencias de ácido nucleico que no se encuentran de forma natural adyacentes a las moléculas de ácido nucleico aisladas a insertar en el vector. El vector puede ser tanto de ADN como de ARN, tanto procariota como eucariota, y de manera preferible es un virus o un plásmido. Se pueden usar vectores recombinantes en la clonación, secuenciación, y cualquier otra manipulación de las moléculas de ácido nucleico. Se usan de forma preferible vectores recombinantes en la expresión de las moléculas de ácido nucleico, y se denominan también vectores de expresión. Los vectores recombinantes preferidos son capaces de ser expresados en una célula huésped transformada, y de manera particular, en una célula huésped de mamífero transfectada in vivo.

Un tipo de vector recombinante útil en una molécula de ácido nucleico recombinante es un vector recombinante vírico. Dicho vector está enlazado de forma operativa a una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína, y la resultante molécula de ácido nucleico recombinante se empaqueta con un recubrimiento vírico para formar un virus recombinante. La proteína puede expresarse mediante el visura recombinante en una célula huésped de un animal in vivo y/o ex vivo tras la administración. Cuando se administra a un animal, un virus recombinante infecta las células en el emplazamiento de ligadura entre el tejido conectivo y el hueso, y dirige la producción de una proteína estimulante de la ligadura. Se pueden usar numerosos vectores víricos recombinantes, entre los que se incluyen, sin limitarse a, aquellos basados en alfavirus, virus de la viruela, adenovirus, herpesvirus, lentivirus, virus adenoasociados y retrovirus. Se prefieren de manera particular los vectores víricos basados en adenovirus y virus adenoasociados. Los vectores víricos adecuados para la administración de genes son bien conocidos en la técnica, y el técnico experimentado puede seleccionarlos para uso en la presente invención. Se proporciona una descripción detallada de los vectores víricos actuales de "Molecular Biotechnology", Segunda edición, de Glick y Pasternak, ASM Press, Washington D.C., 1998, pp. 555-590.

Un vector adenovírico infecta un amplio intervalo de células humanas que no se dividen, y se ha usado de manera extensa en vacunas vivas sin efectos secundarios adversos. Los vectores adenovíricos no es integran en el genoma del huésped, y por tanto, la terapia génica que usa este sistema requiere administración periódica, aunque se han descrito procedimientos que prolongan el tiempo de expresión de los genes adenovíricos transferidos, tales como la administración de anticuerpos dirigidos contra los receptores de las células T en el emplazamiento de expresión (Sawchuk y col., Hum. Gene. Ther. 7:499-506). La expresión a largo plazo puede no ser deseable, ya que una vez se ha formado completamente la ligadura entre tejido conectivo y el hueso, la expresión continuada de las proteínas estimulante de la ligadura puede no ser ya necesaria. Por tanto, los vectores adenovíricos resultan particularmente adecuados. La eficiencia de la administración de genes mediada por adenovirus puede mejorarse desarrollando un virus que, de manera preferente, infecte una célula diana concreta. Por ejemplo, se puede diseñar un gen para la ligadura de fibras y adenovirus para incluir un elemento de ADN que codifique una región de proteína que se enlace con un receptor celular específico. Se han demostrado ejemplos de administración in vivo con éxito y se ha demostrado la expresión de genes mediante receptores adenovíricos, y se describe con más detalle más adelante.

Otro tipo adicional de vectores víricos esta baso en virus adenoasociados, que son virus humanos de cadena única no patógenos y pequeños. El virus se puede integrar en un emplazamiento específico del cromosoma 19. Este virus puede transponer un inserto clonado de aproximadamente 4,5 kb, y se ha usado habitualmente con éxito para expresar proteínas in vivo durante entre 70 días y al menos 5 meses. Demostrando que la técnica está avanzando mucho en el área de la terapia génica, son embargo, una publicación reciente de Bennett y col., informó de la expresión transgen estable y eficiente mediante un a transferencia in vivo de un vector adenoasociado durante más de un año (Bennett y col., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 96:9920-9925).

Tal como se ha descrito más arriba, una molécula recombinante incluye una secuencia de ácido nucleico aislada enlazada de manera operativa con una secuencia de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan la iniciación, elongación, y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes con aquellas que controlan la iniciación de la transcripción, tales como las secuencias de promotor, mejorador, operador y represor. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en al menos una de las células huésped útiles en el producto y procedimiento de la presente invención. Las personas expertas en la técnica conocen una amplia variedad de secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción preferidas incluyen las que funcionan en células de mamífero, bacteria o insecto, y de manera preferible, en células de mamífero. Una molécula de ácido nucleico recombinante puede expresar de forma selectiva (es decir, de manera preferible, sustancialmente exclusiva) en una célula diana seleccionando una secuencia de control de la transcripción, y de manera preferible, un promotor, que se induce de manera selectiva en la célula diana y permanece sustancialmente inactivo en células no diana.

Una o más moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican una proteína estimulante de la ligadura se pueden usar para producir la proteína. En una forma de realización, la proteína se produce mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico recombinante en condiciones efectivas para producir la proteína. Un procedimiento preferido para producir una proteína codificada es la transfección de una célula huésped con una o más moléculas recombinantes para formar una célula recombinante. Las células huésped adecuadas para transfección incluyen cualquier célula de mamífero que se pueda transfectar. Las células huésped pueden ser tanto células no transfectadas o células que ya se hayan transfectado con al menos una molécula de ácido nucleico. Las células huésped útiles en la presente invención pueden ser cualquier célula capaz de producir una proteína estimulante de la ligadura. En una forma de realización preferida, la propia célula huésped es útil para estimular la ligadura entre tejido conectivo y el hueso. Entre las células huésped particularmente preferidas se incluyen un fibrocondrocito, un condrocito, una célula precursora mesenquimal, un osteoblasto, un fibroblasto, una célula de tendón, una célula de ligamento, o cualquier otra célula que actúe como precursor de condrocitos, osteoblastos, células de tendón o células de ligamento.

Tal como se describe en detalle más adelante, una composición para proveer proteínas estimulantes de la ligadura asociadas con una matriz de ligadura, tal como actúa la matriz de ligadura, en una capacidad, como vehículo de administración para la composición a administrar en el emplazamiento de ligadura entre tejido conectivo y el hueso. Los procedimientos adecuados para asociar una composición que contiene proteínas estimulante de la ligadura y/o moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican dichas proteínas con una matriz de ligadura incluyen cualquier procedimiento que permita que las proteínas y/o las moléculas de ácido nucleico recombinantes se administren en el emplazamiento de ligadura junto con una matriz de ligadura, de forma que el producto de ligadura sea efectiva para mejorar la reparación y/o regeneración de la ligadura entre tejido conectivo y el hueso en el emplazamiento, incluyendo procedimientos tanto ex vivo como in vivo. Entre dichos procedimientos de asociación se incluyen, pero no se limitan a, suspensión de la composición en el interior de la matriz de ligadura, criodesecación de la composición sobre una superficie de la matriz y suspensión en el interior de la matriz de una formulación de vehículo/administración que contiene la composición. De manera adicional, la composición puede asociarse con la matriz antes de la colocación del producto en el emplazamiento de ligadura (es decir, la asociación de la composición con la matriz se produce ex vivo) o de manera alternativa, una matriz de ligadura se puede implantar en primer lugar en el emplazamiento in vivo, seguido por la asociación de la composición con la matriz, tal como mediante inyección en la parte superior de la matiz (es decir, la asociación de la composición con la matriz se produce in vivo). Una composición puede contener formulaciones o vehículos de administración adicionales que estimulen la asociación de la composición con la matriz, que estimulen la administración de la composición a las células y tejidos adecuados en el emplazamiento de la lesión, y que ayuden en el control de la liberación de los factores de la composición en el emplazamiento de la lesión. Entre las formulaciones de administración adecuadas se incluyen vehículos de administración que, tal como se usan en el presente documento, incluye compuestos que aumentan la vida media de la composición en el animal tratado. Los vehículos de administración adecuados se describen con más detalle a continuación.

"Ex vivo" hace referencia a realizar parte de la etapa de regulación en el exterior del paciente, tal como mediante la asociación de una composición que comprende proteínas estimulantes de la ligadura con una matriz, y a continuación transplantar la matriz en el paciente. De manera alternativa, o adicional, un procedimiento ex vivo de proporcionar proteínas estimulantes de la ligadura al paciente es mediante la transfección de una población de células (por ejemplo, células retiradas de un paciente) con una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas estimulantes de la ligadura en condiciones tales que la molécula recombinante se expresa posteriormente en la célula transfectada. La célula transfectada se asocia a continuación con la matriz de ligadura, y las células transfectadas se devuelven al paciente. Entre los procedimientos para conseguir dicha transfección se incluyen, pero no se limitan a, transfección, infección vírica, electroporación, lipofección, transferencia bacteriana, fusión con esferoplastos, y adsorción.

De manera alternativa, se puede transplantar una matriz de ligadura en el emplazamiento de ligadura del paciente, y se puede administrar la composición de forma que las proteínas y/o las moléculas de ácido nucleico recombinantes se administren y asocien con la matriz in vivo. Entre los procedimientos de administración in vivo se incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intra-articular, inhalación (por ejemplo, aerosol), oral, impregnación de un catéter, e inyección directa en un tejido. Entre los procedimientos preferidos de administración in vivo se incluyen administración intra-articular, impregnación con un catéter e inyección directa en la matriz implantada.

De acuerdo con el uso de la presente invención, cuando las proteínas estimulantes de la ligadura se proporcionan en forma de una molécula de ácido nucleico recombinante, se transfecta una célula huésped de manera preferible in vivo (es decir, en un mamífero), como resultado de la administración al mamífero de una molécula de ácido nucleico recombinante, o ex vivo, retirando células de un mamífero y transfectando las células con una molécula de ácido nucleico recombinante ex vivo. La transfección de una molécula de ácido nucleico en una célula huésped se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento por el cual se pueda administrar una molécula de ácido nucleico a la célula, in vivo o ex vivo, e incluye, pero no se limita a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción e infección vírica. La célula huésped recombinante puede asociarse a continuación con la matriz de ligadura, si ya no está asociada con dicha matriz, mediante cualquier procedimiento adecuado para proporcionar (en este caso, expresar, las proteínas estimulantes de la ligadura.

Con el fin de transfectar una molécula de ácido nucleico recombinante en una célula huésped, la molécula huésped se suministra a la célula huésped diana. Tal como se ha descrito más arriba, las moléculas de ácido nucleico recombinante se puede suministrar a una célula huésped tanto ex vivo, en la que la célula huésped se asocia continuación con la matriz de ligadura, o in vivo, en la que la célula huésped es una célula que está en el entorno local de la matriz de ligadura. Entre los procedimientos de suministro in vivo y/o ex vivo, para una molécula de ácido nucleico recombinante incluyen, pero no se limitan a: (a) administrar una molécula de ácido nucleico desnuda (es decir, no empaquetada con un recubrimiento vírico o membrana celular) (por ejemplo, en forma de una molécula de ADN o ARN desnudo, tal como enseña, por ejemplo Wolf y col., 1990, Science, 247, 1465-1468); (b) administrar una molécula de ácido nucleico empaquetada en forma de un virus recombinante o célula recombinante (es decir, la molécula de ácido nucleico se suministra mediante un vehículo vírico o celular), en el que el virus o célula se asocia con la matriz de ligadura; o (c), administrar una molécula de ácido nucleico recombinante asociada con la matriz de ligadura mediante un vehículo de administración tal como un sistemas de administración de liposoma o nanosfera descrito en el presente documento. Otros vehículos adecuados de suministro útiles en la presente invención incluyen partículas de oro, conjugados moleculares de poli-L-lisina/ADN, y cromosomas artificiales. Algunos de los vehículos de suministro descritos más arriba se pueden usar también para suministrar una proteína a una matriz de ligadura y/o asociar una proteína con la matriz de ligadura. Entre dichos vehículos de suministro se incluyen, por ejemplo, un vehículo de administración de liposoma o nanosfera.

El suministro de moléculas recombinantes en un vehículo no diana (por ejemplo, tales como ADN desnudo, tal como enseña, por ejemplo Wolff y col., 1990, Science, 247, 1465-1468). Dichas moléculas de ácido nucleico recombinante se inyectan típicamente mediante administración directa o intramuscular. Las moléculas de ácido nucleico recombinante a administrar mediante ADN desnudo incluyen una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína estimulantes de la ligadura, y de manera preferible incluyen una molécula recombinante de la presente invención puede comprender una o más moléculas de ácido nucleico en la forma de, por ejemplo, una molécula recombinante discitrónica. El suministro de ácido nucleico desnudo puede incluir las rutas de administración intramuscular, subcutánea, transdérmica, intranasal u oral, siendo lo más preferido la inyección directa en el interior del tejido diana. Una dosis única preferida de una vacuna de ácido nucleico desnudo oscila entre aproximadamente 1 nanogramo (ng) hasta aproximadamente 100 \mug, dependiendo de la ruta de administración y/o del procedimiento de suministro, según puede determinar una persona experta en la técnica. En una forma de realización, los constructos de ADN puro cubren la superficie de partículas de oro (1 a 3 \mum de diámetro) u se impulsan en el interior de células de la piel o músculo con una "pistola de genes". Algunas publicaciones de Dzau y colaboradores demuestran el éxito de la administración y expresión in vivo con éxito en células del corazón, incluyendo miocitos cardiacos, fibroblastos y células de la musculatura lisa vascular usando ADN desnude o virus Hemoglutinante de administración de liposomas japoneses, administrados tanto mediante incubación en el pericardio e infusión en la arteria coronaria (suministro intracoronario) (ver, por ejemplo, Auki y col., 1997, J. Mol. Cell Cardiol. 29:949-959; Kaneda y col., 1997, Ann N.Y. Acad. Sci. 811:299-308; y von der Leyen y col., 1995, Proc. Natl. Adad. Sci. USA 92:1137-1141).

El suministro de numerosas secuencias de ácido nucleico se ha llevado a cabo mediante la administración de vectores víricos que codifican las secuencias de ácido nucleico. Usando dichos vectores, se ha conseguido la administración satisfactoria y la expresión usando administración ex vivo. (Ver, de muchos ejemplos, vectores retrovíricos, Blaese y col., Science, 270:475-480; Bordignon y col., Science, 270:470-475;) administración nasal (vector asociado con el adenovirus CFTC), administración intracoronaria (vector adenovírico y virus Hemoglutinante japonés, ver Dzau y colaboradores más arriba), administración intravenosa (vector vírico adenoasociado; Koeberl y col., 1997, Proc. Natl. Adad. Sci. USA 94:1426-1431). Se ha documentado el éxito del suministro de genes a líneas celulares sinoviales y uniones articulares. Oligino y colaboradores informan del uso de un vector vírico del herpes simples que es deficiente en los primerísimos genes, ICP4, 22 y 27, para administrar y expresar dos receptores diferentes en líneas celulares sinoviales in vivo (Oligino y col., 1999, Gene Ther. 6:1713-1720). Los vectores del herpes se administraron en una inyección intraarticular. Kuboki y col. usaron transferencia de gen mediada por un vector adenovírico para expresar de manera específica y con éxito un gen en las articulaciones temporomandibulares de cobayas de laboratorio in vivo (Kuboki y col., 1999 Arch. Oral. Biol. 44:701-709). Appairilly y colaboradores administraron sistémicamente vectores adenovíricos que codificaban IL-10 a ratones, y demostraron la expresión con éxito del producto de gen u los profundos efectos terapéuticos en el tratamiento de la artritis experimentalmente inducida (Appairilly y col., 1998 J. Immunol. 160:5213-5220). En otro estudio, se usó un vector retrovírico basado en el virus de la leucemia de la murina para suministrar (mediante inyección intraarticular) y expresar un gen de hormona de crecimiento humana tanto in vivo como ex vivo. (Ghivizzani y col., 1997, Gene Ther. 6:977-982). Estos estudios demostraron que la expresión mediante transferencia de genes in vivo era por lo menos equivalente a la de la transferencia de genes ex vivo. Tal como se ha descrito más arriba, Sawchuk y col., han informado del suministro con éxito in vivo de un vector adenovírico de un gen mediante inyección intraarticular, y la prolongada expresión del gen en el sinovio mediante pretratamiento de la articulación con un anticuerpo monolonal anti receptor de célula T (Sawchuk y col., ibid). Finalmente, se anota que la transferencia de genes ex vivo del antagonista del receptor de la interleuquina-1 usando un retrovirus ha producido un elevado nivel de expresión intraarticular y eficacia terapéutica en el tratamiento de la artritis, y en la actualidad está accediendo a los ensayos de terapia génica humana aprobados por la FDA (Evans y Robbins, 1996, Curr. Opin. Rheumatol. 8:230-234). Por tanto, el estado de la técnica en la terapia génica a llevado a la FDA a considerar la terapia génica humana como una estrategia correcta para el tratamiento de, al menos, la artritis. Tomados en su conjunto, todos los estudios anteriores indican que es factible el suministro y expresión de una proteína codificada mediante una molécula de ácido nucleico recombinante.

Otro modo de suministrar una molécula de ácido nucleico recombinante o en una forma de realización hasta un emplazamiento o célula diana deseado es mediante el suministro de liposomas. En esta forma de realización, una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención se administra a un paciente en un vehículo para el suministro de liposomas, mediante el cual la molécula de ácido nucleico recombinante penetra en la célula huésped (es decir, la célula diana) mediante lipofección. Un vehículo para el suministro de liposomas comprende una composición de lípido que es capaz de suministrar una molécula de ácido nucleico recombinante, incluyendo tanto plásmidos como vectores víricos, a una célula y/o tejido adecuado en un paciente. Un vehículo para el suministro de liposomas comprende una composición lípida que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para suministrar la molécula de ácido nucleico recombinante en el interior de una célula.

Un vehículo para el suministro de liposomas puede modificarse para apuntar un emplazamiento concreto en un mamífero (es decir, un liposoma dirigido), dirigiendo y haciendo uso, de esta manera de una molécula de ácido nucleico. Entre las modificaciones adecuadas se incluye la manipulación de la fórmula química de la porción lípida del vehículo de administración. La manipulación de la fórmula química de la porción lípida del vehículo de administración puede elicitar la dirección extracelular o intracelular del vehículo de suministro. Por ejemplo, se puede añadir un producto químico a la formula lípida de un liposoma que altere la capa de la bicapa lípida del liposoma, de forma que el liposoma se fusione que células concretas que tengan características de carga concretas. Otros mecanismos de dirección incluyen apuntar a un emplazamiento mediante la adición de moléculas de direccionamiento exógenas (es decir, agentes de direccionamiento entre los que se incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, receptores solubles o ligandos), incorporados en el liposoma, para apuntar a una determinada célula o tejido al que puede ligarse la molécula dirigida. Los liposomas dirigidos se describen en, por ejemplo, Ho y col., 1986, Biochemistry 25:5500-6; Ho y col., 1987a, J Biol Chem 261:13979-84; Ho y col., 1987b, J Biol Chem 262:13973-8: y Patente de los Estados Unidos Nº 4.957.735 de Huang y col.

Un vehículo para el suministro de liposomas es capaz de manera preferible de permanecer estable en un paciente durante la suficiente cantidad de tiempo para suministrar una molécula de ácido nucleico en un emplazamiento preferido del paciente (es decir, una célula diana), Un vehículo para el suministro de liposomas es de manera preferible estable en un paciente al cual se ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, de manera más preferible durante al menos aproximadamente 1 hora, e incluso de manera más preferible durante al menos aproximadamente 24 horas. Un vehículo para el suministro de liposomas preferido tiene un tamaño comprendido entre 0,01 micrómetros y 1 micrómetro.

Los liposomas adecuados para uso en la presente invención incluyen cualquier liposoma. Los liposomas preferidos de la presente invención incluyen aquellos liposomas que se usan habitualmente en, por ejemplo procedimientos de suministro de genes conocidos por las personas expertas en la técnica. Los vehículos para el suministro de liposomas preferidos comprenden vesículas multilamelares (MLV) de lípidos y lípidos extrudidos. Los procedimientos para la preparación de MLV son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la sección de Ejemplos. De acuerdo con la presente invención, "lípidos extrudidos" son lípidos que se preparan de manera similar a los lípidos MLV, que pero que posteriormente se extruden a través de filtros de tamaño decreciente, tal como se describe en Templeton y col., 1997, Nature Biotech., 15: 647-652, que por referencia se incorpora en su totalidad en el presente documento. También se pueden usar las vesículas unilamelares pequeñas (SUV) en la presente invención. En una forma de realización, los vehículos para el suministro de liposomas comprenden liposomas que tienen un esqueleto de colesterol conjugado con polietilén glicol. En una forma de realización preferida, los vehículos para el suministro de liposomas útiles en la presente invención comprenden uno o más lípidos seleccionados entre el grupo de DOTMA. DOTAP, DOTIM, DDAB, y colesterol.

De manera preferible, la eficiencia de transfección de un complejo ácido nucleico: liposoma de la presente invención es de al menos aproximadamente 1 picogramo (pg) de proteína expresada por miligramo (mg) de proteína tejido total por microgramo (\mug) de ácido nucleico suministrada. De manera más preferible, la eficiencia de transfección de un complejo ácido nucleico: liposoma de la presente invención es de al menos aproximadamente 10 pg de proteína expresada por mg de proteína tejido total por mg de ácido nucleico suministrado; e incluso de manera más preferible, de al menos aproximadamente 50 pg de proteína expresada por mg de proteína tejido total por mg de ácido nucleico suministrado; y lo más preferible, de al menos aproximadamente 50 pg de proteína expresada por mg de proteína tejido total por \mug de ácido nucleico suministrado.

La complejación del liposoma con una molécula de ácido nucleico puede conseguirse usando procedimientos convencionales en la técnica. Una concentración adecuada de una molécula de ácido nucleico para añadir a un liposoma incluye una concentración efectiva para suministrar una cantidad suficiente de molécula de ácido nucleico recombinante en una célula diana de un paciente de forma que la proteína estimulantes de la ligadura codificada por la molécula de ácido nucleico se pueda expresar en una cantidad efectiva para contribuir a la mejora de la ligadura entre tejido conectivo y hueso en un paciente. De manera preferible, se combinan entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 10 \mug de molécula de ácido nucleico de la presente invención con 8 nmol de liposomas. En una forma de realización, la relación de ácidos nucleicos a lípidos (\mug de ácido nucleico; nmol de lípido) en una composición de la presente invención está comprendida de manera preferible al menos entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 6:1 ácido nucleico; lípido en peso (es decir 1:10 = 1 \mug de ácido nucleico: 10 nmol de lípido).

Usando la administración de liposomas, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.705.151 publicada el 6 de enero de 1998 de Dow y col. demostró el suministro intravenoso in vivo con éxito de una molécula de ácido nucleico que codifica un superantígeno, y de una molécula de ácido nucleico que codificaba una citoquina en un vehículo de suministro liposoma catiónico, en donde las proteínas codificadas se expresaban en tejidos del animal, y de manera particular en los tejidos pulmonares. Como se ha descrito más arriba, Liu y col., ibid, demostraron que el suministro intravenosos de liposomas catiónicos que contenían colesterol que contenían genes que de manera preferente apuntaban a tejidos pulmonares, y mediaban de manera efectiva en la transferencia y expresión de los genes in vivo. Más aún, como se ha descrito más arriba, Dzau y colaboradores han demostrado el suministro in vivo con éxito y la expresión de un gen en células del corazón usando virus Hemoglutinante de administración de liposomas japoneses, administrada tanto mediante incubación en el interior del pericardio como infusión en la arteria coronaria.

Otro procedimiento más para suministrar tanto una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína estimulantes de la ligadura como una proteína estimulantes de la ligadura aislada a una célula huésped es usando un vehículo de suministro por nanosferas. Un vehículo de suministro por nanosferas de acuerdo con la presente invención incluye el vehículo de suministro por nanosferas que se describe en la Solicitud de Patente Europea Nº 0 896 825 A1, publicado el 17 de febrero de 1997. En una forma de realización preferida, dicho vehículo de suministro incluye partículas de polímero que tienen una tamaño inferior a 1000 nm y que se carga con entre 0,001% y 17% en peso con la composición estimulante de la ligadura. Las nanosferas tienen un perfil del índice de dosificación, determinado analíticamente in vitro, con un disparo inicial de aproximadamente entre un 10% y aproximadamente un 20% de la cantidad total de la composición durante el primer periodo de 24 horas, y una larga duración de la velocidad de liberación de al menos un 0,1% diario durante al menos los siete días siguientes. Se considera que un vehículo de suministro por nanosferas es un tipo de vehículo de dosificación controlada que es capaz de dosificar lentamente una composición (proteínas y/o moléculas de ácido nucleico recombinante) de la presente invención, en el interior de un animal. Tal como se usa en el presente documento, una formulación para dosificación controlada comprende una molécula de ácido nucleico recombinante en un vehículo de dosificación controlada. Otros vehículos de dosificación controlada incluyen, pero no se limitan a, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, capsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en forma de pastilla gruesa, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, y sistemas de dosificación transdérmica. Las formulaciones de dosificación controlada pueden incluir líquidos que, tras la asociación con la matriz o tras la administración a un animal forman un sólido o gel in situ. Dichos vehículos de dosificación controlada se asocian de forma preferible con una matriz de ligadura mediante uno de los procedimientos descritos más arriba. Las formulaciones de dosificación controlada preferibles son biodegradables (es decir, bioerosionable).

Una formulación de dosificación controlada preferida es capaz de dosificar una composición de la presente invención en el emplazamiento de ligadura entre el tejido conectivo y el hueso a una velocidad suficiente para alcanzar dosis terapéuticas de las proteínas estimulantes de la ligadura proporcionadas por la composición para dar como resultado la estimulación de la ligadura entre el tejido conectivo y el hueso. Un vehículo de dosificación controlada particularmente preferido es el vehículo de suministro por nanosferas descrito más arriba.

De manera adicional a los vehículos de de administración descritos anteriormente, una composición puede incluir también un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes adecuados incluyen excipientes o formularios que transportan o ayudan al transporte, pero que no se dirigen de manera específica a una molécula de ácido nucleico de una célula (denominados también en el presente documento como vehículos no dirigidos). Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a agua, fosfato, solución salina tamponada, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, aceites, esteres y glicoles. Los vehículos acuosos pueden contener sustancias auxiliares necesarias para aproximar las condiciones fisiológicas del huésped, por ejemplo, mejorando la estabilidad química e isotonicidad.

Las sustancias auxiliares incluyen, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, y otras sustancias usadas para producir tampón fosfato, tampón Tris, y tampón bicarbonato. Las sustancias auxiliares pueden incluir también, conservantes, tales como timerosal, -u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Se pueden esterilizar las composiciones mediante procedimientos convencionales y/o liofilizarse.

Una composición está presente en el producto de ligadura a una concentración que es efectiva para inducir, en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo al hueso, uno o más de: un abanico de morfologías de complejos y zonas de transición de fibrocartílago y cartílago calcificado entre el tejido conectivo y el hueso, inducción de infiltración celular y organización espacial para formar un tejido tridimensional que representa de manera más cercana la ligadura endógena entre tejido conectivo y hueso. De manera preferible, una composición está presente en el producto de ligadura a una concentración que es efectiva para inducir la formación de la interfase hueso-cartílago-tejido conectivo en un emplazamiento de ligadura. Cuando se proporcionan las proteínas que estimulan la ligadura mediante la composición de manera directa como una proteína, se proporciona normalmente la composición a una concentración de entre un 0,5% a un 33% en peso del producto de ligadura. De manera más preferible, se proporciona la composición a una concentración de entre un 1% a un 20% en peso del producto de ligadura. Cuando se proporcionan una o más de las proteínas que estimulan la ligadura mediante la composición como una molécula de ácido nucleico recombinante, una concentración apropiada de una molécula de ácido nucleico que expresa una proteína que estimula la ligadura es una cantidad es una cantidad que da como resultado al menos aproximadamente 1 pg de proteína expresada por mg de proteína total de tejido en el emplazamiento de administración por \mug de ácido nucleico administrado, y de manera más preferible, una cantidad que da como resultado al menos 10 pg de proteína expresada por mg de proteína total de tejido por \mug de ácido nucleico administrado; e incluso de manera más preferible, al menos aproximadamente 50 pg de proteína expresada por mg de proteína total del tejido por \mug de ácido nucleico administrado; y de manera más preferible, al menos aproximadamente 100 pg de proteína expresada por mg de proteína total de tejido por \mug de ácido nucleico administrado. Una persona experta en la técnica será capaz de ajustar la concentración de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico en la composición dependiendo de los tipos y número de proteínas que se van a proporcionar en la composición, y el vehículo de administración usado.

En otra forma de realización del producto, una composición puede contener también un factor que se enlaza de manera no covalente a una o más de cualquiera de las proteínas que estimulan la ligadura o a las moléculas de ácido nucleico recombinante en la composición y, de esta manera, modifican la velocidad de liberación del factor. Dichos factores incluyen, pero no se limitan a cualquier sustancia de fondo o una sustancia polimérica sintética. Tal como se usa en el presente documento, se define una sustancia de fondo como la matriz no viva de tejido conectivo, que incluye polímeros naturales y proteoglicanos. De acuerdo con esto, una sustancia de fondo es una sustancia que se produce de manera natural, aunque dicha sustancia se pueda producir de manera sintética, una vez que se conoce la fórmula y estructura. Los polímeros naturales incluyen, pero no se limitan a colágeno, elastina, reticulita y análogos de los mismos. Los proteoglicanos incluyen, pero no se limitan a cualquier molécula que contiene glicosiaminoglicano, e incluyen sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de heparan, sulfato de keratan e hialuronano. Las sustancias de fondo preferidas incluyen, pero no se limitan a, colágeno de tipo I, colágeno de tipo II, colágeno de tipo III, colágeno de tipo IV y ácido hialurónico. Las sustancias poliméricas sintéticas preferidas incluyen, pero no se limitan a, ácido poli(láctico) y ácido poli(glicólico). En una forma de realización preferida, el factor es un glicosiamino-
glicano.

En una forma de realización adicional, la composición puede incluir uno o más tipos de células que se proporcionan para estimular de manera adicional la ligadura del tejido conectivo al hueso en el emplazamiento de la ligadura. Dicha células incluyen, pero no se limitan a, fibrocondrocito, un condrocito, una célula precursora del mesénquima, un osteoblasto, un fibroblasto, una célula de tendón, una célula de ligamento o cualquier otra célula que sirva como precursor de condrocitos, osteoblastos, células de tendón o células de ligamento. Se pueden asociar dichas células con la composición y la matriz mediante cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. En una forma de realización, se transforman al menos algunas de las células con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína estimuladora de la ligadura para formar una célula recombinante. En esta forma de realización, la célula recombinante se asocia con la matriz de ligadura ex vivo o in vivo mediante cualquier procedimiento adecuado tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. De manera adicional, o alternativamente, el producto incluye células que se han cultivado con una mezcla de proteínas que estimulan la ligadura tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

De manera preferible, las células que se van a cultivar con la mezcla de proteínas son células que se implican en la formación de una interfase de hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo (es decir, tendón y/o ligamento) al hueso, e incluir, pero no limitarse a, fibrocondrocitos, condrocitos precursores del mesénquima, osteoblastos, fibroblastos, y cualquier otra célula que pueda servir como un precursor de condrocitos. Dichas células se cultivan de manera preferible in vitro (es decir, ex vivo) antes de su asociación con una matriz de ligadura, bajo condiciones efectivas para permitir a las células interactuar con las proteínas e iniciar la diferenciación en las células. Las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, medio efectivo, bioreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permitan la interacción de las proteínas y las células y la iniciación de los procesos de diferenciación y proliferación por las células. Un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el que una célula que se cultiva proporciona dicho resultado. Dicho medio comprende normalmente un medio acuoso que tienen fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato y las sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes tales como vitaminas. Se pueden cultivar las células en bioreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microvaloración, y placas petri. Se puede llevar a cabo el cultivo, a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para la célula: Dichas condiciones de cultivo están dentro de los conocimientos de una persona normalmente experta en la técnica. En otro aspecto de esta forma de realización de la presente invención, se cultiva una matriz de ligadura in vitro (es decir, ex vivo) conjuntamente con las células y la mezcla de proteínas antes del implante en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo con el hueso in vivo. En una forma de realización adicional, se pueden asociar las células que se han cultivado con la mezcla de proteínas con la matriz de ligadura en conjunción con las proteínas que estimulan la ligadura adicional y/o las moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican dichas proteínas tal como se ha descrito anteriormente.

El producto para estimular la ligadura del tejido conectivo con el hueso incluye también una matriz de ligadura configurada en la interfase entre el tejido conectivo y el hueso. La matriz de ligadura es el componente del producto que proporciona un vehículo para administrar la composición en el emplazamiento de ligadura del tejido conectivo con el hueso, y la matriz proporciona también un andamio adecuado tras el cual se puede formar la ligadura entre tejido conectivo y hueso y la formación de una interfase hueso-cartílago-tejido conectivo sustancial y fisiológicamente normal. En una forma de realización preferida, la matriz de ligadura es bioresorbible.

Una matriz que se "configura en interfase entre el tejido conectivo y el hueso", bien antes o en el momento de implantar la matriz en el paciente, es de una forma o se manipula de una forma, que es adecuada para el objetivo de ligar un tendón o ligamento con el hueso. Por ejemplo, en una forma de realización, la matriz está en forma de lámina, que se configura en interfase entre el tejido conectivo y el hueso enrollando la lámina alrededor del tendón o ligamento base de tal manera que la lámina pueda formar una interfase con el hueso en el emplazamiento de ligadura en el hueso. En otra forma de realización, la matriz se configura para tener las dimensiones de un tendón o ligamento base que está en contacto con una depresión del hueso. En otra forma de realización, la matriz es un gel que se inyecta alrededor de un tendón en túneles de tendón y entre el tendón y el hueso, conformando por tanto el emplazamiento de ligadura de tal manera que se aplica la matriz en el emplazamiento de ligadura. En esta forma de realización, de manera preferible, se tampona el gel que se produce la mínima necrosis de células o tejido cuando el producto se implanta en el cuerpo.

Se puede formar una matriz de ligadura a partir de cualquier material que sea adecuado para uso in vivo, y que proporcione las características anteriormente descritas de una matriz de ligadura para uso con una composición de la presente invención. Se puede formar la matriz de materiales que incluyen, pero no se limitan a, material polimérico sintético y/o sustancia de fondo (definida anteriormente en el presente documento. Las sustancias de fondo preferidas incluyen polímeros naturales y proteoglicanos. Los polímeros naturales incluyen, pero no se limitan a, colágeno, elastina, reticulita y los homólogos de los mismos. Los proteoglicanos incluyen, pero no se limitan a, cualquier molécula que contenga glicosaminoglicano. Los glicosaminoglicanos particularmente preferidos incluyen sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de heparan, sulfato de keratan, y hialuronano. Otras sustancias de fondo preferidas incluyen, pero no se limitan a, colágeno de tipo I, colágeno de tipo II, colágeno de tipo III, colágeno de tipo IV y ácido hialurónico. Los polímeros sintéticos preferidos incluyen ácido poli(láctico) y ácido poli(glicólico).

En una forma de realización, la matriz de ligadura incluye colágeno. De manera preferible, la matriz contiene entre un 20% y un 100% de colágeno en peso seco de la matriz, y de manera más preferible, entre un 50% y un 100% de colágeno en peso seco de la matriz, e incluso de manera más preferible, entre un 75% y un 100% de colágeno en peso seco de la matriz. En una forma de realización, una matriz de ligadura adecuada incluye colágeno de tendón bovino.

Una matriz de ligadura adecuada para uso en la presente invención puede incluir un material tal como se ha descrito anteriormente que cualquier forma adecuada para uso en el tejido conectivo de ligadura con el hueso, que incluye un material esponjoso, una membrana, una película o un gel. En una forma de realización, una matriz de ligadura adecuada incluye tejido de autoinjerto, tejido de aloinjerto y/o tejido de xenoinjerto.

Un producto de ligadura es útil para reparar o regenerar las ligaduras de tejido conectivo con hueso en las que la ligadura se ha dañado completa o parcialmente como resultado de una lesión o procedimiento quirúrgico, o se ha deteriorado debido a una dolencia o enfermedad degenerativa, por ejemplo. El producto es particularmente útil para ligar a una estructura ósea un ligamento seleccionado entre el grupo de un ligamento anterior cruzado, un ligamento colateral lunar o un o un ligamento lateral del tobillo. El producto es también particularmente útil para ligar a una estructura ósea un tendón seleccionado entre el grupo de tendón supraspinatus, tendón infraspinatus, tendón subescapularis y tendón teres minor.

Se han definido bien en la técnica diversos defectos en tendones y ligamentos, Por ejemplo, Arriman y col. definieron el estatus del manguito rotatorio del hombro con respecto a la integridad del tendón (Harryman y col., 1991, "Repairs of the Rotator Cuff", J. Bone Joint Surgery 982-989). El tipo 0 se refiere a un mangito rotatorio intacto, el tipo 1B se refiere a un defecto de espesor completo del tendón supraspinatus, el tipo 2 a un defecto de espesor completo que implica a los tendones supraspinatus e infraspinatus, y el tipo 3 a un defecto de espesor completo que implica los tendones supraspinatus, infraspinatus y subescapularis. La etiología del tendón implica también desgarros parciales en espesor de estos tendones.

Por tanto, puesto que los defectos o lesiones que se pueden producir en una variedad de formas, tamaños, y localizaciones, una matriz de ligadura para uso en un producto de ligadura de la presente invención es de una forma y tamaño suficiente para conformar una ligadura específica del tejido conectivo con el hueso en el paciente que se va a tratar. De manera preferible, la matriz de ligadura, cuando se usa en la ligadura del tejido conectivo con el hueso, alcanza una geometría (es decir, tiene dimensiones) que es adecuada para proporcionar un beneficio terapéutico en el paciente. Dicho beneficio terapéutico puede ser cualquier mejora en la salud y bienestar del paciente que esté relacionada con una corrección del defecto en la ligadura, y, de manera preferible, el beneficio terapéutico incluye la readherencia del tejido conectivo con el hueso de tal manera que se restaura al menos de manera parcial la configuración natural de la ligadura.

Tal como se ha descrito anteriormente, en una forma de realización, la matriz de ligadura tiene dimensiones que corresponden a un tendón o ligamento base que está en contacto con una depresión del hueso. En otra forma de realización, la matriz de ligadura se configura como una lámina. La lámina es de manera preferible de una forma y tamaño adecuada para enrollar alrededor de un tendón o ligamento que se va a readherir con un hueso. De manera preferible, la matriz proporciona o estimula una ligadura mecánica inmediata del tejido conectivo con el hueso, y proporciona también un andamio tras cuya formación se puede producir una interfase de tejido conectivo-fibrocartílago/cartílago calcificado-hueso. De manera adicional, la matriz imparte de forma preferible sobre el producto una estabilidad mecánica suficiente para permitir al producto que se ancle en el emplazamiento de ligadura. La matriz puede ser no entrecruzada o entrecruzada con procedimientos de entrecruzamiento químicos y/o físicos conocidos por aquellas personas expertas en la técnica. Se lleva a cabo un entrecruzamiento suficiente de tal manera que este confiera estabilidad mecánica, pero no impida de manera sustancial la infiltración celular. En una forma de realización, cuando se usa el producto para ligar el ligamento cruzado anterior (ACL) a los túneles femoral y tibial, la matriz de ligadura se configura de manera preferible como una lámina, y de manera preferible tiene las dimensiones para enrollarse de manera completa alrededor del ACL. En otra forma de realización, cuando se usa el producto para reparar una lesión del manguito rotatorio del hombro, la matriz de ligadura tiene de manera preferible las dimensiones correspondientes del tendón base que está en contacto con la depresión del hueso del húmero.

En una forma de realización, la matriz de ligadura tiene un espesor de entre aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 3 mm, y de manera más preferible, de entre aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 2 mm. El espesor puede, por supuesto, variarse dependiendo de la configuración del tejido conectivo y el emplazamiento de ligadura del hueso. En esta forma de realización, se puede preparar la matriz aplicando una dispersión acuosa de material de matriz en un molde, por ejemplo, en el que el molde ajusta el espesor apropiado para la lámina. Dicho procedimiento se describe en el Ejemplo 1. En una forma de realización preferida, se prepara la matriz a partir de una dispersión acuosa de entre un 0,2% a un 4% de colágeno en peso, y de manera más preferible, se prepara la matriz a partir de una dispersión acuosa de entre un 0,5% a un 3% en peso. Para un material esponjoso de colágeno al 2% en peso, se fabrica una dispersión de colágeno al 2% y se liofiliza.

En una forma de realización preferida, la matriz de ligadura de la presente invención es porosa, lo que estimula la capacidad de la matriz para servir como un vehículo de administración para la composición de estimulación de la ligadura y de manera particular, como un andamio sobre cuyos procesos celulares puede producirse que conduzca a la formación de una interfase de tejido conectivo-fibrocartílago/cartílago calcificado-hueso, tales como permitiendo el crecimiento interno de la células en la matriz, permitiendo a la vez un crecimiento interno de las células para la regeneración de la interfase deseada en el emplazamiento de la ligadura. La porosidad de la matriz puede variar dependiendo de la configuración de la matriz, pero normalmente la matriz tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 500 \mum. En una forma de realización, y de manera particular cuando la matriz se configura como una lámina, la matriz tiene un tamaño de poro preferido de entre aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 100 \mum.

Una forma de realización se refiere a un procedimiento para usar el producto de la presente invención para estimular una ligadura de tejido conectivo con el hueso. Este procedimiento incluye las etapas de implantar y fijar a un emplazamiento de ligadura de tejido conectivo con el hueso, un producto que comprende: (a) una matriz de ligadura; y, (b) una composición asociada con la matriz de ligadura para la producción de proteínas estimulantes de la ligadura. Se han descrito con detalle anteriormente las composiciones adecuadas para uso en un producto de la presente invención, y se pueden usar todas las composiciones en el presente procedimiento. El uso del producto de la presente invención en el procedimiento para estimular la ligadura es efectivo para inducir la formación de una interfase hueso-cartílago-tejido conectivo en el emplazamiento de la ligadura del tejido conectivo con el hueso. También, tal como se ha descrito anteriormente, tal como se usa en el presente documento, el término "tejido conectivo" se refiere al tejido conectivo seleccionado entre el grupo de tendón y ligamento.

El procedimiento es útil para ligar cualquier tejido conectivo seleccionado entre el grupo de tendón y ligamento con el hueso, incluyendo la ligadura del ligamento cruzado anterior con los túneles femoral y tibial, ligando el ligamento colateral lunar con la luna, o ligando el ligamento lateral del tobillo con la tibia. El procedimiento es también particularmente útil para ligar un tendón supraspinatus con la tuberosidad mayor del húmero, un tendón infraspinatus con la tuberosidad mayor del húmero, un tendón subescapularis con la tuberosidad menor del húmero, o un tendón teres minor con la tuberosidad mayor del húmero. Se lleva a cabo la etapa de implantación usando técnicas quirúrgicas conocidas en la técnica, e implica normalmente enrollar el producto alrededor del tejido conectivo que se va a ligar con el hueso cuando la matriz se configura como una lámina, y/o implica un procedimiento más complejo de eliminar el tejido dañado y/o implantar el producto que se configura para corresponder con un tendón o ligamento base que está en contacto con una depresión del hueso para fijar el producto al músculo y/hueso.

En una forma de realización, el procedimiento es útil para regenerar la ligadura del hueso alveolar al cemento. En esta forma de realización, el uso del producto de la presente invención es efectivo para inducir la formación de una interfase de hueso-fibrocartílago/cartílago calcificado-cemento, que imita la ontogenia natural de esta conexión y es una ontogenia preferida. Esto es útil en pacientes en los que se ha producido la degeneración del hueso alveolar y el cemento ligado para restaurar esta ligadura de tejido conectivo son el hueso, y/o como medida preventiva para retardar o reducir la degeneración adicional de este tejido conectivo con la ligadura del hueso.

De manera preferible, el uso de un producto en un procedimiento de la presente invención da como resultado una fuerza biomecánica mejorada significativamente de la ligadura del tejido conectivo con el hueso que se ha reparado o regenerado, en comparación con dicha ligadura que se lleva a cabo en ausencia de un producto de la presente invención (es decir, una ligadura formada usando medios convencionales, tales como mediante sutura, o con matrices en ausencia de una composición de la presente invención). De manera preferible, el uso del procedimiento da como resultado una fuerza biomecánica de la ligadura del tejido conectivo con el hueso que es al menos aproximadamente un 20%, y de manera más preferible al menos de aproximadamente un 50%, y de manera más preferible al menos aproximadamente un 75%, e incluso lo más preferible mayor de un 100% mayor que la fuerza biomecánica de una ligadura de tejido conectivo con hueso llevada a cabo en ausencia del producto de la presente invención, o, de manera alternativa, en ausencia de una composición.

Por ejemplo, una hipótesis quirúrgica para la reparación del ACL es una incisión única, por procedimiento endoscópico (DW Jackson y PR Kurzweil, Capítulo 8 en el Master Techniques in Orthopaedic Surgery, Reconstructive knee surgery, Raven Press, NY, 1995). En breve, en esta técnica, el injerto se cosecha y se sutura un material esponjoso de colágeno al extremo tibial del injerto. A continuación, se realiza la notchplastia, y se marca el túnel femoral. El túnel tibial se prepara seguido de la perforación del túnel femoral. Usando guías, se coloca un cilindro de colágeno delgado y hueco en el túnel femoral. Las dimensiones del cilindro (cerca de un extremo) son similares a las dimensiones del túnel con el cual el cilindro está en contacto con el hueso y no extrude de forma sustancial en el interior del espacio articular. A continuación se implanta el injerto. Se emplean procedimientos de fijación de injerto tibial y femoral habituales.

La etapa de fijación puede incluir la ligadura del producto con el hueso, tejido conectivo existente, y/o músculo por cualquier procedimiento adecuado, entre los que se encuentran los procedimientos quirúrgicos descritos con anterioridad para la reparación de tendones y ligamentos dañados o lesionados. Entre dichos medios de adherencia se incluyen, pero no se limitan a suturas bioresorbibles, aplicación de tuercas de interferencia, endobutton, suturas bioabsorbibles, tuerca de compresión, suturas no bioabsorbibles, accesorios de presión, grapas, clavos y dispositivos de anclado con suturas en forma de T.

Se debe tener en cuenta que el término de "una" o "unas" entidad(es) se refiere enteramente a una o más de dichas entidades, por ejemplo, una proteína se refiere a una o más proteínas. Así, los términos "un" (o "unos"), "uno o más" y "al menos uno" se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento. Se debe tener en cuenta también que los términos "comprende", "incluye", y "tiene" se pueden usar de manera intercambiable.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a efectos de ilustración, y no se pretende que limiten de manera alguna el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Los siguientes ejemplos muestran una caracterización del tejido derivado in vivo mediante el implante de un producto de ligadura que incluye Proteína de Hueso (BP) en el ensayo subcutáneo en roedores.

En este experimento, se implantaron las muestras usando el modelo subcutáneo de rata (es decir, una versión modificada del ensayo de implante ectópico en rata descrito en Sampath y Reddi, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591-6595). De manera breve, se prepararon esponjas de colágeno fabricando una dispersión de colágeno de Tipo I de Tendón bovino al 4% en ácido acético al 1% (v/v). Se incubó esta dispersión a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas. Se colocó la dispersión en los huecos de una lámina de moldeo y se eliminó el exceso de colágeno. Se colocó una lámina de vidrio sobre la lámina de moldeo y esta se colocó a -70ºC durante una hora. A continuación se criocongeló la lámina de moldeo durante más de 12 horas. Los discos resultantes se presionaron hacia afuera de la lámina de moldeo, se recortaron los bordes y se pesaron los discos. Para añadir BP a los discos de colágeno, se colocaron los discos en una placa de sujeción y se colocaron 100 microlitros de la solución BP bajo el disco. Después que el material esponjoso se humedeció completamente, se colocaron los materiales esponjosos de colágeno en un humidificador durante 30 minutos, a continuación se congelaron a -70ºC durante más de una horas, y finalmente se criocongelaron durante más de 12 horas.

Se anestesiaron ratas Long-Evans con una dosis no letal de fenobarbital de sodio. Tras afeitar la región ventral, se hicieron dos pequeñas incisiones justo por encima de los músculos pectorales. Se colocaron las muestras que contenían BP en las bolsas de cada animal.

Se sacrificaron los animales mediante asfixia por CO_{2} después de tres semanas. En el explante se pesaron las muestras y se examinaron someramente. Se colocaron en metanol al 100% embebido en metacrilato de glicol, se seccionaron y se tiñeron con H&E, Von Kossa y Azul de Toluidina.

En la Tabla 1 se muestra la escala de graduación para la formación del hueso usada para evaluar este experimento:

TABLA 1

1

2

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BP contiene explantes que producen de manera rutinaria una puntuación histológica de 2-3. La tinción de Von Kossa revela un hueso tejido organizado alrededor de la periferia del explante. Justo en el interior es la médula hamatopoiética que está constituida por sinusoides y glóbulos rojos. Revistiendo las trabéculas está la presencia de 6-10 a más de 10 osteoblastos alineados. Más del 50% del tinte de planta es de origen celular (por ejemplo, no es distrófico). La cantidad de hueso tejido continuo oscila entre un 0 y un 50%.

Ejemplo 2

El siguiente ejemplo demuestra que un producto que incluye Proteína de Hueso mejora la velocidad de cicatrización de una ligadura del tendón extensor digital longitudinal en hueso en conejos, en comparación con la ausencia de producto o en ausencia de la porción de composición del producto.

Para las preparaciones del dispositivo, se añadió colágeno de tipo I de tendón bovino a HCl 10 mM para producir una suspensión de colágeno al 2%. Se mezcló la suspensión extensivamente en jeringas acopladas. Tras la incubación durante la noche a temperatura ambiente, se inyectó la mezcla en un molde de aproximadamente 1,2 mm de espesor. A continuación se colocó el molde a -70ºC durante una hora y a continuación se liofilizó durante la noche. A continuación se cortaron los materiales esponjosos en dimensiones apropiadas (6 x 10 mm). Los materiales esponjosos resultantes podrían abarcar de manera completa el tendón en circunferencia. También, las dimensiones fueron tales que la longitud del colágeno dio la vuelta a la distancia del túnel (por ejemplo, no quedó colágeno externo al túnel). Para la dosis baja, BP se contuvo en un 1,75% (35 \mug) del peso en seco de el material esponjoso. Para la dosis alta, BP se contuvo en aproximadamente un 7,5% (150 \mug) del peso en seco del material esponjoso.

Para determinar si la BP mejora la velocidad de cicatrización del tendón en el hueso, se llevó a cabo el siguiente estudio usando doce conejos blancos de Nueva Zelanda esqueléticamente maduros de acuerdo con un modelo publicado (Rodeo y col., 1993, J. Bone Joint Surgery 75-A (12): 1795-1803; o Rodeo y col., 1999, Am. J. Sports Med. 27 (4): 476-488). De manera breve, se llevó a cabo una incisión en la línea media para exponer la rodilla, se llevó a cabo una artrotomía lateral, y se retrajo el mecanismo extensor medialmente para exponer el tendón extensor digital longitudinal. A continuación se separó el tendón extensor digital longitudinal del cóndilo femoral lateral. A continuación se separó el músculo tibial anterior de la tibia lateral proximal y se perforó un agujero de 2,0 mm en un ángulo de 45 grados en el eje longitudinal de la metáfisis tibial proximal. A continuación se estiró el tendón extensor digital longitudinal a través del túnel y se suturó con el aspecto medial de la metáfisis tibial proximal. Cada conejo recibió un material esponjoso de colágeno que contenía BP en una extremidad mientras que la extremidad contralateral recibió bien el material esponjoso de colágeno únicamente o el no implante como controles. El material de colágeno se humedeció, se enrolló alrededor, y se suturó al tendón. Se usaron dos dosis diferentes de BP. Seis conejos recibieron cada dosis. Se aleatorizaron la dosis y la extremidad que recibieron el agente de ensayo. Los animales se dejaron con actividad libre en la jaula. Se sacrificaron los animales a las 2 semanas y se prepararon los tejidos para el análisis histológico. Se fijaron los espécimenes en formalina tamponada neutra al 10% y se embebieron en metilmetacrilato sin descalcificación. Se tiñeron las secciones histológicas con H&E y mediante el procedimiento Von Kossa. En la Tabla 2 se muestran los grupos de tratamiento.

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TABLA 2

Extremidad uno	Extremidad dos	# animales
35 \mug de BP + colágeno	colágeno	3
35 \mug de BP + colágeno	Sin implante	-3
150 \mug de BP + colágeno	Colágeno	3
150 \mug de BP + colágeno	Sin implante	3

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El análisis histológico demostró que las muestras que contenían dosis de BP altas o bajas mostraron hueso formado de nuevo en proximidad mayor que la del tendón de los controles (no se muestran los datos). Además, las zonas tratadas con BP contenían fibrocartílago en yuxtaposición cercana con el tendón, mientras que los controles mostraron únicamente tejido fibroso yuxtapuesto con el tendón.

Se llevó a cabo también el análisis histomorfométrico. Se midieron el área del tendón, la circunferencia del tendón, el área del hueso, el área de la médula ósea, y el perímetro del hueso. No existieron diferencias estadísticas entre la dosis alta, la dosis baja, el colágeno control, o el control no tratado para el área del tendón o la circunferencia del tendón. En contraste, para el área de la médula ósea, el área del hueso, y el perímetro del hueso, la dosis baja fue estadísticamente mayor que el colágeno control usando el análisis de la varianza (p < 0,05), y los ensayos del valor Z mediante Kruskal-Wallis One-Way Anova, y el Kruskal-Wallis de comparación múltiple. De manera adicional, los tratamientos BP de dosis alta y baja mostraron un área de médula ósea, perímetro del hueso, y área del hueso mayores que el control no tratado, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas. El BP de dosis baja puntuó también más que el BP de dosis alta para estos parámetros, aunque estas diferencias no fueron también estadísticamente significativas.

Ejemplo 3

El siguiente ejemplo muestra que un producto que incluye Proteína de Hueso mejora la velocidad y calidad de la cicatrización de la ligadura del injerto (tendón semitendinoso) al hueso en una cirugía de reconstrucción del ligamento cruzado anterior, en comparación con la ausencia del producto o en ausencia de la porción de composición del producto.

Para la preparación del dispositivo se añadió colágeno de tipo I de tendón bovino a HCl 10 mM para producir una suspensión de colágeno al 2% (en peso). Se mezcló la suspensión de manera extensiva en jeringas acopladas. Tras una incubación durante la noche a temperatura ambiente, se inyectó la mezcla en un molde de aproximadamente 1,2 mm de espesor. A continuación se colocó el molde a -70ºC durante una hora y a continuación se liofilizó durante la noche. A continuación se cortaron los materiales esponjosos en las dimensiones apropiadas (7 x 11 mm). El tamaño del material esponjoso resultante abarcó de manera completa el tendón en circunferencia. También, las dimensiones fueron tales que la longitud del colágeno dio la vuelta a la distancia del túnel (por ejemplo, no quedó colágeno fuera del túnel). Se añadió Proteína de Hueso (BP) a los materiales esponjosos en una dosis de aproximadamente 2,4% (55 \mug) del peso en seco de el material esponjoso. Se suturaron los materiales esponjosos con los injertos tibial
y femoral.

Todos los conejos se obtuvieron de un proveedor con licencia USDA y se cuidaron de acuerdo con los estándares del National Institutes of Health. Se premeditaron setenta y cinco conejos con atropina (0,05 mg/kg), ketamina (35 mg/kg), y acetilpromazina (0,5 mg/kg) y a continuación se intubaron. Tras la inducción de la anestesia general, se afeitaron ambas extremidades posteriores, se limpiaron con betadine, y se cubrieron asépticamente. Se hizo una incisión vertical en la línea media sobre la rodilla y se llevó a cabo una artrotomía parapatelar medial para proporcionar la exposición de la articulación de la rodilla.

Se dislocó lateralmente el mecanismo extensor. Se identificó el tendón semitendinoso ipsilateral en su inserción con la tibia medial proximal y se expuso hasta su articulación músculo-tendón. Se transectó el tendón en la articulación músculo-tendón. Esto proporciona aproximadamente 35-40 mm de longitud de tendón para el procedimiento quirúrgico planeado. No se observaron efectos adversos debido a la cosecha de tendón semitendinoso.

Tras la cosecha del injerto se escindió el ligamento cruzado anterior. Se uso un taladro para colocar un túnel de taladro (1,7 mm) en la tibia medial proximal que entra en la articulación por la ligadura del ACL. Se hizo otro túnel de taladro (1,7 mm) en el cóndilo femoral lateral, que entra en la articulación por la ligadura del ACL. Se suturó el material esponjoso que contenía BP en la porción del tendón que se colocó en los túneles del hueso en el fémur y la tibia. Se aleatorizaron los tratamientos y el cirujano estaba ciego en el grupo de tratamiento. En cada animal, una extremidad recibió BP y la extremidad contralateral recibió bien el vehículo o no BP. Se colocó una sutura pasante a través de un extremo del injerto de tendón y se usó para empujar el injerto en los túneles del hueso. Se colocó el injerto bajo tensión y se suturó al periostio y los tejidos blandos que lo rodean sobre el cóndilo femoral lateral y la tibia proximal. Se cerró la herida en capas, y se permitió a los animales actividad normal durante el postoperatorio. Se llevó a cabo el procedimiento bilateralmente. No se observaron complicaciones significativas. Los animales se monitorizaron en el período postoperatorio por el personal veterinario. Se administraron antibióticos (25 mg/kg IM o SQ de ampicilina) durante las primeras 48 horas postoperatorias, y se administraron analgésicos (0,05-0,075 mg/kg SQ de buprenorfina) según necesidad. Se usaron nueve animales para la evaluación histológica y 16 para el ensayo biomecánico en cada uno de los tres puntos temporales (2, 4, 8 semanas). Se sacrificaron los conejos mediante una sobredosis de pentobarbital intravenoso.

Análisis histológico

En el momento del sacrificio, se examinó someramente cada espécimen respecto de cualquier evidencia de cambios degenerativos en la articulación, inflamación sinovial, y efusión. Se cosecharon las tibias y fémures y se colocaron en formalina tamponada neutra al 10%. Se embebieron los espécimenes en polimetilmetacrilato sin descalcificación. Se cortaron secciones de cinco micrómetros de espesor en perpendicular a los túneles del hueso dando como resultado secciones transversales de la interfase injerto de tendón-hueso de los túneles femoral y tibial. Se tiñeron las secciones con H+E, Von Kossa, y tricoma de Masson, a continuación se examinaron con microscopía de luz y luz polarizada en un microscopio Olympus BH-2. Se evaluó la cicatrización entre el tendón y el túnel del hueso mediante la formación de tejido nuevo (fibrovascular, tejido de granulación, cartílago, y hueso) entre el tendón y el hueso. Se evaluó la continuidad de las fibras de colágeno entre el tendón y el hueso con microscopía de luz polarizada. Con el fin de detectar cualquier efecto adverso del tratamiento BP, se evaluaron también la presencia de degeneración del cartílago articular, la hiperplasia sinovial, y la respuesta de las células gigantes ajenas al cuerpo. Se llevaron a cabo comparaciones entre los grupos (extremidades tratadas con BP y control), así como entre los diferentes puntos
temporales.

Las observaciones someras no demostraron efectos adversos del tratamiento BP sobre el tejido de la articulación. Se observó la formación de hueso heterotrópico ocasional en la entrada del túnel extra articular en los especímenes tratados y control, con formación de hueso más extensa en los especímenes tratados con BP. No se observó osificación en la apertura intra articular del túnel perforado. Ningún espécimen de menisco mostró evidencia de osificación.

La histología demostró que, en los especímenes de dos semanas tratados con BP, hubo formación extensa de trabéculas y cartílago de hueso nuevo en la interfase tendón-hueso. Fue mucho más la formación de hueso nuevo que en el espécimen control contralateral y este nuevo hueso estuvo en aposición más cercana con el tendón. Globalmente, la cantidad de cartílago en la interfase tendón-hueso fue similar entre las extremidades tratadas y control. Sin embargo, existió menos variabilidad en la cicatrización en las extremidades tratadas con BP que en las extremidades control. De manera adicional no hubo evidencia de respuesta de células gigantes ajenas al cuerpo en las extremidades tratadas con BP. Finalmente, no hubo evidencia de efecto adverso sobre el cartílago articular de la tibia o el fémur en las extremidades tratadas con BP.

En especímenes de cuatro semanas hubo una maduración progresiva del tejido de la interfase entre el tendón y el hueso en los especímenes control y tratados. Hubo generalmente más cartílago en las interfases tendón-hueso en los especímenes tratados con BP en comparación con los controles, y el cartílago en las interfases tendón-hueso fue más maduro en los especímenes tratados con BP. La incorporación del tendón con el establecimiento de la continuidad de la fibra de colágeno entre el tendón y el hueso fue a menudo más avanzada en los especímenes tratados con BP. Fue aparente la proliferación de células a lo largo del borde del tendón en alguno de los especímenes control y tratados sin diferencias obvias entre los grupos.

En especímenes de 8 semanas, los especímenes tratados con BP demostraron más cartílago y formación de hueso nuevo alrededor del injerto de tendón que en los controles.

Ensayo biomecánico

Se cosechó el constructo fémur-injerto ACL-tibia de cada extremidad y se congeló a -80ºC hasta el ensayo. Antes del ensayo, se diseccionaron las tibias y los fémures libres de tejido blando proximal y distal en los emplazamientos de ligadura del injerto femoral y tibial, de manera respectiva. Los huesos se conservaron en cemento de unión justo por encima de las suturas femorales y por debajo de las suturas tibiales, permitiendo una fijación segura en el dispositivo de sujeción de la pieza de ensayo. Se usó un aparato especialmente diseñado que permitió a los especímenes orientarse de tal manera que se aplicó una carga de tracción uniaxial a lo largo del eje del ligamento reconstruido en el plano sagital. Se cargó el constructo en una máquina MTS con una velocidad de conformación de 40 mm/s. se registró el fracaso de la carga final.

Un análisis de energía reveló que se requirieron 8 especímenes en cada punto temporal del análisis biomecánico para alcanzar una energía de 0,8 con \alpha = 0,05. Se comparó el fracaso de la carga final entre las extremidades experimentales y control usando el análisis de la varianza. Se llevaron a cabo las comparaciones de los grupos en diferentes puntos temporales y entre los grupos control usando el ensayo de la t de Student. En las Figs. 1-2 se ilustran los resultados.

La carga media hasta el fallo en los especímenes tratados con BP fue significativamente mayor que la de los controles para la población completa del estudio (p < 0,001) y en cada punto temporal de 2, 4, 8 semanas, individual (p = 0,04, 0,01, < 0,001, de manera respectiva) (Véase Fig. 1). También, el lado tratado con BP fue significativamente más fuerte (p = 0,001) en comparación con el material esponjoso no tratado (grupo I) para la población completa. En los puntos temporales individuales, se señaló que la extremidad experimental fue significativamente más fuerte únicamente a las 8 semanas (p = 0,0003) (Fig. 2). De manera adicional, el lado tratado con BP fue significativamente más fuerte (p = 0,02) en comparación con sin material esponjoso (grupo II), aunque cuando se la comparó en cada punto temporal, la extremidad experimental fue significativamente más fuerte únicamente a las 8 semanas (p = 0,05). No existieron diferencias significativas entre el grupo control I (material esponjoso de colágeno no tratado) y el grupo control II (sin material esponjoso)

Ejemplo 4

El siguiente ejemplo demuestra que un producto que incluye Proteína de Hueso mejora la velocidad de cicatrización de una ligadura del tendón infraspinatus en el hueso en la oveja, en comparación con la ausencia de producto o la ausencia de la porción de composición del producto.

Para la preparación del dispositivo, se añadió colágeno de tipo I de tendón bovino a HCl 10 mM para producir una suspensión de colágeno al 2% (en peso). Se mezcló la suspensión de manera extensiva en jeringas acopladas. Tras una incubación durante la noche a temperatura ambiente, se inyectó la mezcla en un molde de aproximadamente 1,2 mm de espesor. A continuación se colocó el molde a -70ºC durante una hora y a continuación se liofilizó durante la noche. A continuación se cortaron los materiales esponjosos en dimensiones apropiadas (10 x 25 mm). El tamaño del material esponjoso resultante abarcó de manera completa la base del tendón infraspinatus. También, las dimensiones fueron tales que quedó poco o nada de colágeno en el exterior del tendón. La dosis de BP fue aproximadamente de 1,7% (170 \mug) y 5,7% (570 \mug) de peso seco de material esponjoso.

Se indujo la anestesia con Ketamine (4 mg/kg) y Valium (7,5 mg total) y se mantuvo en halotano (1,5-3%) en oxígeno al 100% (2 L/min). bajo condiciones asépticas usando anestesia general, se llevó a cabo una incisión de 6 cm en la piel sobre la articulación del lomo derecho y se diseccionó el cabezal del craneal con el acromial del músculo deltoides y se separó el tendón infraspinatus desde el punto de inserción. Se preparó una depresión de 1,5 cm de longitud y 0,5 cm de profundidad en el húmero proximal usando un trépano ortopédico Hall. Se crearon cuatro agujeros de taladro separados en el hueso del húmero que rodea la depresión. Se suturó el tendón infraspinatus en la depresión usando una sutura # 2 no absorbible (Ethibond; Ethicon, Inc) en una técnica Mason-Allen modificada. Bajo la sutura, se insertó un material esponjoso que contenía BP. De manera alternativa, no se colocó nada (no colágeno o BP) bajo la sutura (control). Se ligaron las suturas de manera separada sobre el puente cortical. Se cerraron los tejidos subcutáneos y la piel usando los procedimientos de rutina. Tras la cirugía, se monitorizaron las ovejas hasta que se observó un reflejo de deglución y a continuación se transportaron al pasto. Allí, se las hizo recostar en apoyos duros y se monitorizaron a lo largo del día. Al final del día todas las ovejas volvieron a los rediles. Al final del día los analgésicos postoperatorios consistieron en 1 gramo de fármaco de fenilbutazona antiinflamatorio no esteroideo (p. o). De manera adicional, todas las ovejas tuvieron 2 parches de Fentanyl (Duragesic, (50 Ag/h) transdermal System, Janssen Pharmaceutic; Titusvill, NJ) aplicados en la región torácica lateral preoperativamente para el dolor postoperatorio. De manera adicional a los parches de Fentanyl, se administró diariamente fenilbutazona (1 g p. o.) durante los 3 días postoperatorios.

En la Tabla 3 se muestran los grupos de animales.

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TABLA 3

Animal	Implante
1	Ninguno
2	570 \mug de BP + colágeno
3	570 \mug de BP + colágeno
4	170 \mug de BP + colágeno
5	170 \mug de BP + colágeno
6	Ninguno

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Para calcular el porcentaje de hueso o cartílago, se llevó a cabo el siguiente procedimiento. Utilizando el porta histológico, que se tiñó con Azul de Toluidina, se usó el objetivo 4X para la visión. Se alineó a continuación la línea superior de la caja rectangular fotográfica con borde inferior del hueso preexistente. El área por debajo del hueso preexistente es tejido de nueva reparación. Se estimó el porcentaje de área de hueso y cartílago que rellena la caja. El porcentaje que se informa en la Tabla 4 es el promedio de los tres campos independientes. Los resultados demuestran que las muestras tratadas con BP indujeron un porcentaje mayor de hueso sintetizado de nuevo en comparación con las de control.

TABLA 4

3

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo demuestra que la proteína de hueso (BP) es una mezcla compleja de proteínas que incluye al menos: TGF\beta1, TGF\beta2, TGF\beta3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, osteocalcina, osteonectina, BSP, lisiloxidasa, catepsina L pre, albúmina, transferrina, Apo A1 LP y Factor XIIIb.

Los presentes inventores usaron técnicas y reactivos estándar disponibles en la técnica para identificar estas proteínas dentro de la proteína de hueso (Véase por ejemplo, "Current Protocols in Protein Science", Ed. JE Coligan y col.; 1995-1998, John Wiley and Sons, Inc.; "Protein Purification: Principles and Practice" Scopes y Verlas; 1982). En la Tabla 5 se detallan las proteínas que se han identificado como presentes en BP mediante al menos uno de estos ensayos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Composición de BP

4

5

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De manera adicional, las proteínas intracelulares identificadas en la Proteína de Hueso incluyen las proteínas intracelulares: proteína asociada con dineína, protamina II, proteína similar a histona, L6 (proteína ribosómica), y L32 (proteína ribosómica). Otras proteínas de suero que se han identificado en BP incluyen \alpha2 microglobulina. Otras proteínas de matriz extracelular (matriz ósea) que se han identificado incluyen proteínas relacionadas con Frizzled. Se pueden incluir dicha proteínas, si se desea, en una composición de la presente invención.

Se examinaron varias preparaciones de mezclas de proteínas o proteína de Hueso o los derivados de las mismas para proporcionar una estimación somera de la cantidad de varias proteínas en la Tabla 6. De manera específica, se examinaron varios lotes diferentes de BP y fracciones AX que se extrajeron a pH 9,0, 9,5 y 10,0 (Véase Ejemplo 11) mediante el análisis Western Blot usando anticuerpos frente a TGF\beta1, TGF\beta2, BMP-3 y BMP-7. Se escaneó la radiografía resultante usando un escáner Sharp JX-330 y se calculó el volumen de banda usando el software Imagemaster ID. Para cuantificar la cantidad de TGF\beta1 en BP y sus derivados, se tomó como estándar TGF\beta1 bovino recombinante (2, 4, 8 y 16 ng; Promega) y se usó TGF\beta1 anti bovino. Para calcular la cantidad de TGF\beta1, TGF\beta2, BMP-3, ó BMP-7 en cualquier muestra dada, se utilizó la siguiente fórmula: (volumen de banda de la muestra/volumen de banda de TGF\beta1 estándar) X (cantidad de TGF\beta1 estándar cargado). Se usó anticuerpo TGF\beta anti bovino. Este procedimiento es un estimador específico de la cantidad de TGF\beta1 en las muestras y un estimador somero de las cantidades de TGF\beta2, BMP-3 y BMP-7 en las mezclas. Únicamente se puede llevar a cabo la estimación somera de TGF\beta2, BMP-3 y BMP-7, debido a que no están disponibles los estándares bovinos y los anticuerpos bovinos de cada una de estas tres proteínas (se usaron anticuerpos humanos para estas proteínas, y se estimaron las cantidades en función del estándar de TGF\beta1). En la Tabla 6 se muestra la cantidad baja y alta estimadas para cada una de las cuatro proteínas sobre las de todas las composiciones ensayadas. Para estas composiciones, la relación (p/p) de TGF\beta1 a todas las proteínas de la mezcla es de aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1:100.

TABLA 6

6

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En otro experimento, se examinaron varias preparaciones (6 lotes) de Proteína de Hueso (BP) para proporcionar una estimación somera de la cantidad de las diversas proteínas de la Tabla 5. De manera específica, se examinaron varios lotes diferentes de BP mediante el análisis Western Blot estándar usando anticuerpos frente a TGF\beta1, TGF\beta2 y BMP-2. Se escaneó la radiografía resultante usando un escáner Sharp JX-330 y se cuantificaron los volúmenes de banda usando el software Imagemaster ID (Pharmacia Biotech), seleccionando únicamente las bandas específicas del escanéo del gel. Se calculó la cantidad de proteína usando una ecuación de la curva lineal a partir de las curvas estándar. Para cuantificar la cantidad de TGF\beta1 en BP, se tomó como estándar TGF\beta1 humana recombinante (1, 2, 4 y 8 ng; Promega). Para detectar TGF\beta1, se utilizaron TGF\beta1 anti-humana y un anticuerpo ALP conjugado como anticuerpos primario y secundario, de manera respectiva. Para cuantificar la cantidad de TGF\beta2 en BP, se tomó como estándar TGF\beta2 humana recombinante (2, 4, 8 y 16 ng; Promega) y se usó TGF\beta2 anti humana. Para cuantificar la cantidad de BMP-2 en BP, se tomó como estándar BMP-2 humana recombinante (2, 4, 8 y 16 ng; Promega). Para detectar TGF\beta2, se utilizaron TGF\beta2 anti humana y un anticuerpo ALP conjugado como anticuerpos primario y secundario, de manera respectiva.

Este procedimiento es un estimador específico de la cantidad de TGF\beta1 y TGF\beta2 en las muestras y un estimador somero de las cantidades de BMP-2 en las mezclas. Únicamente se puede llevar a cabo la estimación somera de BMP-2 debido a que no están disponibles los estándares bovinos y los anticuerpos bovinos, y las secuencias de BMP-2 humana y bovina pueden diferir. Aquellas personas expertas en la técnica reconocen que la TGF\beta-1 bovina y humana tienen secuencias de aminoácidos idénticas y que la TGF\beta2 bovina y humana tiene secuencias de aminoácidos idénticas y, por tanto, la TGF\beta-1 y la rh TGF\beta-1 deberán tener actividades idénticas, como se muestran la TGF\beta2 bovina y la rh TGF\beta2. Aquellas persona expertas en la técnica reconocen que se puede aislar TGF\beta-1 de alta pureza a partir de hueso bovino usando los procedimientos descritos por Seyedin (Ogawa y col., Meth. Enzymol., 198:317-327 (1991); Seyedin y col., PNAS, 82:2267-71 (1985)).

En la Tabla 7 se muestran los resultados.

TABLA 7

7

Ejemplo 6

El siguiente ejemplo demuestra la actividad inductiva del hueso y el cartílago de la proteína de hueso (BP) y las mezclas de proteína derivadas de la mezcla compleja de proteínas en BP en comparación con los componentes de la proteína recombinante individual, tal como se determinó usando un ensayo subcutáneo de roedores in vivo estándar

A. En el siguiente experimento, se usaron un ensayo subcutáneo en roedores y un sistema de clasificación desarrollado por Sulzer Biologics, Inc. (Denver, Colorado), para evaluar las capacidades inductivas en cartílago y hueso del BMP-2 recombinante (proporcionado para Sulzer Biologics, Inc por el Genetics Institute). A continuación se compararon los resultados con los datos de BP que se generaron en el mismo ensayo y usando el mismo sistema de clasificación.

Para llevar a cabo el ensayo subcutáneo en ratas de Sulzer Biologics, Inc, se preparó una matriz a partir de un material adecuado. Cuando el material fue colágeno de tipo I, se preparó una dispersión de colágeno al 4 & p/p usando colágeno de tipo I bovino y ácido acético glacial al 1%. Los discos/materiales esponjosos de colágeno se formaron en moldes, y a continuación se congelaron y liofilizaron. Para el ensayo, los discos se cargaron con la composición (por ejemplo, proteína de hueso, un subconjunto de proteína de hueso, un factor de crecimiento) mediante la incubación del disco con la composición a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, seguido por la congelación y liofilización de los discos. Se implantaron los discos en ratas Long-Evans en posiciones subcutáneas. En todos los experimentos descritos en este ejemplo y otros ejemplos a continuación, se usaron 5-10 ratas por tratamiento y se implantó la composición de disco de colágeno tratado/material esponjoso (u otro material en el Ejemplo 14) durante tres semanas. Al final de las tres semanas, se eutanizaron las ratas, y se retiraron los explantes quirúrgicamente, se procesaron histológicamente, y se clasificaron. En la Tabla 1 (Véase Ejemplo 1) se muestra la escala de clasificación utilizada para la actividad inductiva del hueso en el ensayo subcutáneo en roedores, que se desarrolló por Sulzer Biologics, Inc. En la Tabla 8 se muestra la escala de clasificación utilizada para la actividad inductiva del cartílago en el ensayo subcutáneo en roedores, que se desarrolló también por Sulzer Biologics, Inc.

TABLA 8

8

Clave:

A = Puntuación; B = Presencia de tejido mineralizado; C = Algún cartílago no mineralizado; D = el área del cartílago no mineralizado es comparable al área del hueso; el cartílago está en el anillo de > 50% de circunferencia del explante; a menudo cartílago duro teñido; E = el área del cartílago no mineralizado es mayor que el área del hueso, a menudo muy poca o ninguna mineralización resultante del hueso o cartílago.

Se administró BP en una dosis de 10 \mug sobre un material esponjoso de colágeno, las puntuaciones fueron, de manera rutinaria, entre 1,5 y 2,2 para el cartílago, y entre 2,0 y 2,5 para el hueso. De manera más específica, en el ensayo subcutáneo en ratas, BP induce un anillo ordenado de formación de hueso alrededor de la periferia del material esponjoso de colágeno. BP y los derivados de BP descritos en los ejemplos a continuación (Véanse los Ejemplos 7 y 8) producen un anillo ordenado de hueso en la parte interna y justo en el interior, un anillo ordenado de cartílago. Algunos derivados son más eficientes en la producción de este anillo de cartílago interno que otros. Las fracciones AX que se eluyeron a pH 9,0, 9,5 y 10,0, y BP son eficientes en la inducción de este anillo de cartílago interno. De manera adicional, BP con TGF\beta añadida de manera exógena, tal como TGF\beta1-3 y, de manera preferible, TGF\beta1, en el que la relación de TGF\beta1 a BP es tan alta como 1:10 (por ejemplo, 1 \mug de TGF\beta1 añadida de manera exógena a 10 \mug de BP), es también eficiente en la producción de este anillo ordenado de hueso en la parte externa y justo en el interior, un anillo de cartílago ordenado. Sin querer quedar ligados por la teoría, los presentes inventores creen que estas características proporcionan un tendón superior para la fijación del hueso.

En contraste, la BMP-2 humana recombinante proporcionó los resultados que se muestran en la Tabla 9, revelando que el BMP-2 tiene una puntuación más baja para el hueso y el cartílago en comparación con BP. Es de señalar que el BMP-2 no induce el anillo ordenado de formación de hueso alrededor de la periferia del material esponjoso de colágeno, ni, un anillo de cartílago ordenado justo en el interior.

TABLA 9 Ensayo subcutáneo en ratas con BMP-2

9

B. TGF\beta-1 y -2 se identificaron de manera inicial por la capacidad de estimular la condrogénesis in vitro. Sin embargo, se conoce en la técnica que TGF\beta1-5, y los factores de crecimiento tales como FGF y PDGF, no inducen el hueso o el cartílago en el ensayo subcutáneo en ratas, tal como en el ensayo ectópico de roedores in vivo (por ejemplo, TGF\beta-1 y -2 son incapaces de iniciar la formación de cartílago o hueso, únicamente se observa tejido fibroso). Esto se confirma por los resultados que se muestran a continuación con TGF\beta1 recombinante. Se llevó a cabo el ensayo usando el ensayo subcutáneo en ratas y el sistema de clasificación de Sulzer Biologics, Inc tal como se ha descrito en la sección (A) anterior. La Tabla 10 muestra que la TGF\beta1 humana recombinante no induce hueso o cartílago en este ensayo. En contraste, la Proteína de Hueso (BP), administrada a una dosis de 10 \mug, puntúa de manera rutinaria entre 1,5 y 2,2 para el cartílago, y entre 2,0 y 2,5 para el hueso (véase ejemplos a continuación).

TABLA 10 Ensayo subcutáneo en ratas con TGF\beta1

10

Ejemplo 7

El siguiente ejemplo demuestra que las mezclas de proteínas derivadas de un procedimiento de purificación modificado por BP que contienen BMP-2, BMP-3, BMP-7, y TGF\beta-1 producen hueso y cartílago.

BP se purifica normalmente usando etapas de intercambio aniónico (AX), intercambio catiónico (CX) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Publicación PCT Nº WO 95/13767, incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad). Dicho procedimiento se ha descrito con detalle anteriormente en la Patente de los Estados unidos Nº 5.290.763, incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad.

Normalmente, se eluyen las proteínas de la columna AX a pH = 8,5. Para este experimento, se eluyeron las proteínas de la columna AX a pH 9,0, 9,5, y 10,0. A continuación se purificaron las muestras a través de las columnas CX y HPLC tal como se ha descrito anteriormente (Publicación PCT Nº WO 95/13767). A continuación cada fracción que se eluyó a los pH anteriores se evaluó mediante Western blot para la presencia de BMP-2, BMP-3, BMP-7, TGF\beta-1, y TGF\beta-2.

La elución de la columna AX con pH creciente dio como resultado una cantidad aumentada de BMP-2, BMP-7, y TGF\beta-1 en BP. A un pH de 9,0, las cantidades de BMP-2 y BMP-7 muestran un aumento más grande, mientras que TGF\beta-1 y BMP-3 muestran limitado o sin aumento en comparación con el pH 8,5. El aumento de las cantidades de estos factores no tiene efecto significativo en la puntuación del hueso y un aumento ligero en la puntuación del cartílago (Tabla 12). A pH 10, la cantidad de TGF\beta-1 aumenta mucho más que el aumento de BMP-2, -3, y -7, y la fracción de pH 10 muestra la puntuación del cartílago más alta. Se ensayaron las fracciones purificadas de HPLC (10 \mug) en el modelo subcutáneo de rata, los resultados del cual se muestran en la Tabla 11.

TABLA 11

11

Ejemplo 8

El siguiente ejemplo demuestra que una composición purificada de BP y que incluye BMP-2, BMP-3, BMP-7 y TGF\beta-1, contiene los componentes necesarios para la formación del hueso y el cartílago.

Para obtener subconjuntos de proteína específica de BP, se separaron las proteínas dentro de BP en una columna de hidroxiapatita. El material hueco contenía proteínas que eluyeron con tampón KPO_{4} < 120 mM. Durante la elución, el gradiente de pH osciló entre 6,0-7,4. Se añadieron 10 \mug de cada fracción a los materiales esponjosos de colágeno y se llevó a cabo el ensayo subcutáneo en roedores tal como se ha descrito en el Ejemplo 6 anterior. De manera adicional, se cargó una cantidad equivalente de cada fracción sobre un gel de proteínas y se llevó a cabo un Western blot con anticuerpos frente a BMP-2, BMP-3, BMP-7, y TGF\beta-1 (Tabla 12). Un (-) indica señal no detectada y un (+) indica que se detectó una señal.

TABLA 12

12

Los datos de la Tabla 14 demuestran que una fracción BP que contenía BMP-2, 3, 7 y TGF\beta-1, contiene las proteínas que son componentes necesarios para la actividad inductiva del cartílago y el hueso por BP

TABLA 14

13

Ejemplo 9

El siguiente ejemplo demuestra que diferentes matrices de reparación del cartílago combinadas con BP inducen la formación de hueso y cartílago in vivo de acuerdo con la presente invención.

A. Este ejemplo demuestra el uso de material de ácido poliláctico: ácido poliglicólico que contiene BP para la formación del hueso y el cartílago.

Se fabricó una solución al 60% (v/v) de ácido poliláctico: ácido poliglicólico (PLGA) (50:50) en N-Metil Pirrilidona. Se presionó colágeno (6 mg) en un molde Delrin. Se añadió el PLGA (140 mg) y se mezcló. Se añadió BP (100 \mug) contenido en una solución de HCl 10 mM (100 microlitros) y se mezclaron todos los componentes conjuntamente para formar un disco sólido. Se presionó esta mezcla en un molde y se incubó a temperatura ambiente durante una hora y a continuación se implantó en ratas en el ensayo subcutáneo en ratas tal como se ha descrito en la sección 5. Se llevó a cabo la histología tras un mes de implante. La Tabla 15 muestra que BP combinado con la matriz PLGA induce la formación de hueso y cartílago en este modelo in vivo.

TABLA 15

14

B. En este ensayo, se fabricó un material esponjoso compuesto de colágeno de Tipo I al 3%/colágeno de Tipo IV al 1% (Sigma) usando el procedimiento de preparación normal tal como se ha descrito en el Ejemplo 4 de la aplicación. Se implanto esta matriz, que contenía 10 \mug de BP, en ratas en el ensayo subcutáneo en ratas tal como se ha descrito en la sección 5, y se llevó a cabo la histología tras tres semanas. La Tabla 16 muestra que BP combinado con la matriz que contenía colágeno de tipo I y tipo IV induce la formación del hueso y el cartílago en este modelo in vivo.

TABLA 16

15

C. Este experimento demuestra que las matrices de reparación del cartílago que contienen trietanolamina y colágeno en forma de un gel (pH básico), combinadas con BP, inducen la formación de cartílago in vivo.

Para la preparación de colágeno básico, se añadieron 0,5 gramos de TEA a 99,5 gramos de agua desionizada hasta pH 9,9. Para fabricar un gel de colágeno al 2%, se añadieron 2,0 gramos de colágeno hasta pH 8,8. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante una hora y a continuación se congeló y liofilizó 48 horas. Se reconstituyó la mezcla en HCl 10 mM (que contenía 35 microgramos de BP como materiales esponjosos de colágeno al 3 y 6%. Se liberó el gel a través de una aguja de #18 o #20 en un volumen de 100 microlitros. Tras el secado, los materiales esponjosos resultantes fueron colágeno al 80% y TEA al 20% en peso. La Tabla 17 demuestra que ambos materiales esponjosos de colágeno TEA al 3 y al 6% combinados con BP inducen el hueso y el cartílago en este sistema in vivo.

TABLA 17

16

D. Este experimento demuestra que las matrices de reparación del cartílago que contienen colágeno a pH ácido en forma de un gel inyectable, combinadas con BP, inducen la formación del cartílago in vivo. Se añadió una solución BP (1 mg/ml) contenida en HVl 10 mM (5 ml) a colágeno (30 mg/ml). Se mezclaron las soluciones hasta una consistencia similar a la gelatinosa y se incubaron a 4ºC durante la noche. En ausencia de incisión, se inyectaron 100 microlitros de gel por vía subcutánea en la rata. La Tabla 18 demuestra que BP en una matriz en forma de gel induce la formación de hueso y cartílago en este modelo in vivo.

TABLA 18

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E. Este experimento demuestra que las matrices de reparación del cartílago que contiene colágeno a pH ácido en forma de un gel inyectable, combinadas con BP, induce la formación del cartílago in vivo. Este experimento difiere de la parte D anterior en que se usó H_{3}PO_{4} 1 M, en vez de HCl. Para preparar el gel de colágeno con pH ácido, se añadieron a 995 ml de agua desionizada, 5,0 ml de H_{3}PO_{4} 1 M, seguido por 1,75 ml de NaOH 1,00 N (pH de la mezcla = 2,49). Se añadieron 10,0 g de colágeno a BP y se mezclaron durante 2 horas (pH final = 3,61). Esto hace un gel de colágeno al 1%, que se congeló y liofilizó. Se cargaron 60 mg de material esponjoso de colágeno con 2 ml de agua desionizada y se incubaron 2 horas a temperatura ambiente. El gel de colágeno al 3% resultante tenía un pH de 3,7. El material fue inyectable usando agujas de calibre #18 y #20, pero no agujas de calibre #22 o #25. Un volumen de 100 microlitros contenía 35 \mug de BP. La Tabla 19 demuestra que las matrices de colágeno ácido al 3% en forma de gel y combinadas con BP inducen el hueso y el cartílago en este sistema in vivo.

TABLA 19

18

Aunque se han descrito en detalle diversas formas de realización de la presente invención, es aparente que se producirán modificaciones y adaptaciones de aquellas formas de realización por aquellas personas expertas en la técnica. Se comprende de manera expresa, sin embargo, que dichas modificaciones y adaptaciones están dentro del alcance de la presente invención, tal como se muestra en las siguientes reivindicaciones:

Claims

1. El uso de una mezcla de proteínas para la fabricación de un medicamento para la mejora de una ligadura del hueso con el tejido conectivo seleccionado entre el grupo constituido por tendón, ligamento y cemento, comprendiendo la mezcla de proteínas:

factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), proteína morfogenética de hueso BMP-2, BMP-3, y BMP-7;

en el que la cantidad de dicha TGF\beta1 en dicha mezcla está entre un 0,01% y un 10% de las proteínas totales en dicha mezcla;

en el que la cantidad de dicha BMP-2 en dicha mezcla está entre un 0,01% y un 10% de proteínas totales en dicha mezcla;

en el que la cantidad de dicha BMP-3 en dicha mezcla está entre un 0,1% y un 15% de las proteínas totales en dicha mezcla; y,

en el que la cantidad de dicha BMP-7 en dicha mezcla está entre un 0,01% y un 10% de la proteínas totales en dicha mezcla.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cantidad de dicha TGF\beta1 en dicha mezcla está comprendida entre un 0,05% y un 1% de las proteínas totales en dicha mezcla.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la cantidad de dicha BMP-2 en dicha mezcla está comprendida entre un 0,1% y un 5% de las proteínas totales en dicha mezcla.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la cantidad de BMP-3 en dicha mezcla está comprendida entre un 0,1% y un 10% de las proteínas totales de dicha mezcla.

5. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la cantidad de dicha BMP-7 en dicha mezcla está comprendida entre un 0,1% y un 5% de las proteínas totales en dicha mezcla.

6. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mezcla de proteínas comprende de manera adicional una proteína seleccionada entre el grupo constituido por TGF\beta2, TGF\beta3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, y la proteína morfogenética derivada del cartílago (CDMP).

7. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mezcla de proteínas comprende de manera adicional al menos una proteína de matriz de hueso seleccionada entre el grupo constituido por osteocalcina, osteonectina, sialoproteína de hueso (BSP), lisiloxidasa, catepsina L pre, osteopontina, proteína GLA de matriz, biglicano, decorin, sulfato III de proteoglicano-condroitina (PG-CS III), glicoproteína ácida de hueso (BAF-75), trombospodina (TSP) y fibronectina; en el que dicha proteína de matriz ósea comprende entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 98% de dicha mezcla de proteínas.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha proteína de matriz de hueso comprende entre un 40% y un 98% de dicha mezcla de proteínas.

9. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mezcla de proteínas comprende de manera adicional al menos una proteína de factor de crecimiento seleccionada entre el grupo constituido por factor I de crecimiento del fibroblasto (FGF-I), FGF-II, FGF-9, factor inhibitorio del leucocito (LIF), insulina, factor I de crecimiento de la insulina (IGF-I), IGF-II, factor AA de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, factor 2 derivado del estroma (SDF-2), hormona tiroidea pituitaria (PTH), hormona del crecimiento, factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor-\alpha de crecimiento de la transformación (TGF\alpha) y las proteínas del erizo; en el que dicha proteína del factor de crecimiento comprende entre aproximadamente un 0,01% y aproximadamente un 50% de dicha mezcla de proteí-
nas.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha proteína del factor de crecimiento comprende entre un 0,1% y un 10% de dicha mezcla de proteínas.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en el que dicha proteína del factor de crecimiento es el factor-I de crecimiento del fibroblasto (FGF-I).

12. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha composición comprende de manera adicional una o más proteínas de suero seleccionadas entre el grupo constituido por: albúmina, transferrina, \alpha2-Hs GlycoP, IgG, \alpha1-antitripsina, \beta2-microglobulina, lipoproteína Apo A1 (LP) y el Factor XIIIb.

\newpage

13. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicha mezcla de proteínas comprende TGF\beta1, TGF\beta2, TGF\beta3, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, osteocalcina, osteonectina, BSP, lisiloxidasa, catepsina L pre, albúmina, transferrina, Apo A1 LP y el Factor XIIIb.

14. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho medicamento comprende de manera adicional una matriz configurada como interfase entre el tejido conectivo y el hueso.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicha matriz es bioreabsorbible.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, en el que dicha matriz es porosa.

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que dicha matriz comprende un material seleccionado entre el grupo constituido por un material de polímero sintético y una sustancia de fondo.

18. El uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 14 a 17, en el que dicha matriz comprende un material seleccionado entre el grupo constituido por un material esponjoso, una membrana, una película y un gel.

19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que dicha matriz comprende colágeno de tendón bovino.