JP2001122799A - プレイオトロフィンを含む結合組織修復促進組成物および該組成物の調製におけるプレイオトロフィンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 損傷又は病気の骨、軟骨等の結合組織とイン
ビボで接触させることにより当該損傷又は病気の組織の
修復又は成長を誘発する組成物を提供する。 【解決手段】 この組成物は損傷又は病気の状態の結合
組織の修復を促進するために有効な量のほぼ純粋なプレ
イオトロフィンから成る。この組成物はさらに、薬剤的
に許容可能な送達（デリバリー）担体から成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は損傷または病気の
骨、軟骨等の結合組織とインビボで接触させることによ
り当該損傷または病気の組織の修復または成長を誘発す
る移植可能で生体許容性の組成物に関する。さらに、本
発明は修復を誘発する方法に関する。特に、本発明は損
傷または病気の結合組織の修復または成長を誘発するの
に有効な量のプレイオトロフィン（pleiotrophin）から
成る組成物、および該組成物の調製における単離したプ
レイオトロフィンの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日において、骨の欠損部は自己移植片
または外部の預けられたバンク骨（banked bone）によ
り修復されるのが一般的である。自己移植片は骨を一体
化する能力が優れており、医者は腸骨稜のような供給源
からの骨を好んで使用する場合が多い。しかしながら、
自己移植片を使用する処置には幾つかの欠陥がある。ま
ず、自己移植片は別個の採取処理を必要とし、処理時間
が長くなって輸血が必要となる。第２に、患者は採取に
要する適当な量の材料が賄えない場合が多く、採取した
部位において罹病する場合がある。一方、バンク骨の移
植はこの採取処理を必要としないが、骨の治癒能力が自
己移植片ほど高くない。それゆえ、癒着欠如のような重
い症状においてバンク骨を使用することは望ましくな
い。

【０００３】これらの欠陥のために、研究者は自己移植
片またはバンク骨の使用を必要せずに骨の成長を促進す
るための組成物および方法をこれまで探究してきた。こ
のような骨の成長促進因子として可能性のある供給源の
一例として、健康な骨および軟骨組織の細胞外マトリッ
クスがある。この細胞外骨マトリックスは主にミネラル
（ヒドロキシアパタイト）および有機マトリックスを含
んでおり、この有機マトリックスの主成分はI型コラー
ゲンである。さらに、この骨マトリックスの残りの成分
として、多数の比較的少量の非コラーゲン蛋白質および
成長因子が含まれる。例えば、１９６０年代の中頃か
ら、脱ミネラル骨マトリックス（ＤＢＭ）および骨形態
形成蛋白質（ＢＭＰ）の両方の骨誘導活性が研究されて
いる（Ijiri、１９９２年）。さらに、これらのＤＭＢ
およびＢＭＰに加えて、多くの非コラーゲン骨マトリッ
クス蛋白質成分が生物活性を有しており、プロテーゼ装
置、薬物、血液成分等のような医療用途において広く使
用されるようになった。

【０００４】骨マトリックスにおいて見出された非コラ
ーゲン蛋白質の一例としてプレイオトロフィン（ＨＢ−
ＧＡＭ、ＨＡＲＰ、Ｐ１８およびＯＳＦ−１として知ら
れている）がある。このプレイオトロフィンは発生調節
にされたサイトカインの最近報告されたファミリー（系
統群）に属するヘパリン結合性蛋白質である。このプレ
イオトロフィンは培養における胚性ラット脳ニューロン
における神経突起伸展促進活性およびラットおよびマウ
スの繊維芽細胞に対するマイトジェン活性（mitogenic
activity）の両方を示すことが報告されている。また、
組換え型のヒトのプレイオトロフィンの生物活性がその
Ｅ１０チキン胚の大脳皮質神経の神経突起伸展を促進す
る能力により測定される。なお、ＥＣ₅₀はＥ１０チキン
胚から神経突起伸展を５０％増加させる成長因子の有効
濃度として定義される。

【０００５】プレイオトロフィン蛋白質は初期の頃は生
後間もないラットの脳およびウシの子宮から単離してい
たが、塩酸グアニジンによる抽出を含む当該技術分野に
おける熟練者において既知の標準的な抽出技法により温
血脊椎動物の骨および軟骨組織から単離できるようにな
った。ヒトのプレイオトロフィン蛋白質は初期において
１６８アミノ酸残基から成る前駆体として生成され、こ
の前駆体はプロセッシングにより３２アミノ酸残基から
成るシグナルペプチドが除かれて、１３６アミノ酸の成
熟蛋白質が生成される。この蛋白質をコード化するＤＮ
Ａ配列は最近クローン化されて、組換え型のプレイオト
ロフィン蛋白質がシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）
社（ミズーリー州、セントルイス）から販売されてい
る。また、プレイオトロフィンに対応してコード化する
遺伝子配列（ｃＤＮＡクローン）がラット、ウシおよび
ヒトの細胞のｍＲＮＡから調製されている。予想された
アミノ酸配列はこれら３種の動物種の間で高度に維持さ
れており、各コード化された蛋白質はシグナル配列を含
有していて、この蛋白質が分泌されることを示してい
る。

【０００６】プレイオトロフィンはインビトロで骨の細
胞外マトリックスに強く結合し、オートクリン（自己分
泌）またはパラクリン（傍分泌）作用を有している可能
性がある。また、プレイオトロフィンは繊維芽細胞成長
因子（ＦＧＦ）のファミリーに対して特定の化学的類似
性、すなわち、ヘパリン結合性を有しているが、当該Ｆ
ＧＦファミリーには化学的に属していない。すなわち、
導出されたプレイオトロフィンのアミノ酸配列は他のい
ずれの既知の成長因子ファミリーとも異なるものであ
る。プレイオトロフィンは骨芽細胞、軟骨および骨肉腫
細胞により発現されることが知られており、骨および軟
骨から単離されていた。このプレイオトロフィンの発現
は、骨および軟骨の前駆細胞、並びに、肺、腸、腎臓、
および発育中のラットの組織における生殖路の間葉に関
連して行われる。

【０００７】多数の化合物が生物源から単離されてお
り、これらの化合物に対する培養した細胞の応答に基づ
いて有効な骨成長促進活性を有することが同定されてい
る。特に、動物組織内において発育中の骨にプレイオト
ロフィンが伴うこと、およびインビトロでのプレイオト
ロフィンに対する種々の培養した細胞の応答により、こ
の分子が骨および／または軟骨の発育に一定の役割を果
たし得ると考えられるようになった。しかしながら、イ
ンビトロでの結果は細胞種、細胞密度、細胞単離手順、
および成長培地の種類等の種々の因子により変化し得
る。それゆえ、インビトロでの研究は有用ではあるが、
インビボでの活性に対して必ずしも予測的な妥当性を示
すとは言えない。

【０００８】例えば、最近の２０年間において、プロス
タグランジンが骨の吸収を増大すると共に骨の形成を増
加するものとして報告されている。このようなプロスタ
グランジンの相反する作用を報告している参考文献を調
べて見ると、骨の吸収についての報告のほとんど全てが
インビトロで行われていて、骨の形成について報告して
いるほとんど全ての研究がインビボで行われていること
が分かる（MarkおよびMiller、１９９３年）。これまで
のインビトロでの骨成長の研究は骨の組織／器官培養物
または比較的純粋に単離された骨細胞集団を用いて行っ
ていた。従って、上記のプロスタグランジンの主要な作
用についての明らかに相反する報告はこれらの作用を研
究するために用いた細胞培養系における制限に基づいて
説明することができる。同様に、細胞培養アッセイに基
づくＴＧＦ活性についての初期的な報告も観察されたイ
ンビボでの活性に対して相関していない。それゆえ、当
該技術分野における熟練者であればインビトロ活性が必
ずしもインビトロでの結果を示さないことが分かる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】したがって、インビボ
での結合組織の修復または成長促進に有用な組成物が求
められている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、プレイ
オトロフィンから成る組成物が修復を必要とするインビ
ボ部位での結合組織（骨、軟骨を含む）の成長を誘発す
るために使用される。この開示の組成物は、修復を必要
とする部位にインビボで接触させるために、当該組成物
の移植または注射のいずれかにより温血動物種に投与さ
れる。本発明はプレイオトロフィンが単独で内因性の組
織による骨または軟骨組織の修復を促進できることを最
初に実証するものである。

【００１１】本発明の別の態様は、脊椎動物種における
所定のインビボ部位での新しい骨または軟骨の成長を誘
発するための方法であり、当該方法は上記部位に内因性
の組織成長を誘発するのに有効な量のほぼ純粋なプレイ
オトロフィンおよび薬剤的に許容可能な担体から成る組
成物を接触させる工程から成る。好ましい実施形態にお
いて、上記の組成物は液体の形態であり、上記部位はこ
の組成物の注射により当該組成物に接触する。別の好ま
しい実施形態において、上記担体はポリエステル、イオ
ノマー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテート、ポ
リアクリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物（ポ
リ酸無水物、ポリエステル酸無水物を含む）、コラーゲ
ン、フィブリン、スターチ、アルギネート（アルギン酸
塩を含む）、およびヒアルロン酸から成る群から選択さ
れるポリマーから成るポリマーマトリックスである。あ
るいはこの担体は金属、ガラス、またはミネラル塩でも
よい。なお、好ましいミネラル塩としては、リン酸トリ
カルシウム、ヒドロキシアパタイトおよび石膏が含まれ
る。

【００１２】本発明のさらに別の態様は、組成物を温血
脊椎動物に全身的に投与することにより当該温血脊椎動
物内の骨または軟骨の病原性の状態を治療する方法であ
り、上記の組成物は内因性の組織の成長を誘発するのに
有効な量のほぼ純粋なプレイオトロフィンおよび薬剤的
に許容可能な担体から成る。

【００１３】本発明のさらに別の特徴が以下の本発明を
実施する最良の態様を例示するものを含む実施形態の詳
細な説明を考察することにより当該技術分野における熟
練者において明らかになる。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明はほぼ純粋な形態のプレイ
オトロフィンから成る組成物、およびインビボでの骨お
よび軟骨の欠損部の修復を促進するための当該組成物の
使用方法、ならびに当該組成物の調製における単離した
プレイオトロフィンの使用に関する。本明細書において
使用する用語の「プレイオトロフィン（pleiotrophi
n）」は、ヒトまたはその他の温血脊椎動物から単離さ
れる天然のプレイオトロフィン蛋白質、プレイオトロフ
ィンをコードする核酸配列により生成される組換え型の
蛋白質、およびプレイオトロフィン蛋白質の蛋白質フラ
グメント／ペプチドを含むものである。また、本明細書
において「プレイオトロフィン遺伝子」は、ヒトまたは
その他の温血脊椎動物から単離される天然の遺伝子配列
を含む、プレイオトロフィンをコードするあらゆる核酸
配列、プレイオトロフィンの活性フラグメントをコード
するあらゆる核酸配列、またはこれらのあらゆる組換え
型誘導体を含むものと定義される。また、本明細書にお
いて使用する用語の「ほぼ純粋（substantially pur
e）」は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動またはア
ミノ酸分析により決定される場合に、少なくとも９０％
の純度、好ましくは９５％の純度まで精製された状態を
意味する。

【００１５】本発明の組成物は温血脊椎動物における損
傷または欠損組織の修復を誘発するための方法において
使用できる。特に、プレイオトロフィンは骨、軟骨、靭
帯、筋肉、皮膚、およびその他の軟組織を含む整形外科
および非整形外科の損傷部位の組織を修復するために使
用できる。実施形態の一例において、本発明の組成物は
骨折部を効果的に修復し、例えば、頭蓋および顔面の欠
損部または歯周欠損部、関節骨折部、軟骨欠損部、表層
軟骨欠損部、全厚欠損部、骨軟骨切開部、微小裂傷部、
靭帯裂傷部、筋肉損傷部、腱炎関節損傷部、感染または
腫瘍に至る二次的な骨の損失に続く骨格再構成、および
欠損部を生じる種々の骨や軟骨の病気の治療を含む骨の
欠損部を充填または架橋するために使用できる。

【００１６】結合組織から単離された多くの化合物がイ
ンビトロでのこれらの化合物に対する細胞の応答に基づ
き骨形成特性を有するものとして報告されている。しか
しながら、このようなインビトロで確立された活性はイ
ンビボでの骨および軟骨の修復促進活性を示す化合物を
選択するための十分な指針にならない場合が多い。従っ
て、本発明は骨および軟骨組織の修復を誘発する生物活
性薬剤を同定するためのインビボ・アッセイ技法を採用
する。有利なことに、本発明のインビボ・アッセイは、
骨形成特性をそれ自身が示すことが知られているコラー
ゲンのような送達担体の使用を回避する。

【００１７】この特異なインビボ・アッセイは骨の修復
を促進する化合物を同定するために使用した。特に、実
施例１に記載するインビボ・アッセイはプレイオトロフ
ィンがインビボでの骨の修復を促進することを実証して
いる。

【００１８】プレイオトロフィンは上記各組織の修復を
直接的または間接的に促進できる。例えば、プレイオト
ロフィンは骨芽細胞活性を直接刺激すること（すなわ
ち、マトリックス生成の促進または付加的な骨芽細胞の
補充）、新脈管形成の増加、あるいは、破骨細胞の吸収
作用の阻害により局在化した部位における新しい骨の形
成を増加できる。さらに、本発明の組成物はプレイオト
ロフィンの骨前駆細胞または生物活性薬剤のいずれかへ
の選択的結合により局在化した部位に対する骨前駆細胞
または生物活性薬剤の補充に関与でき、あるいは、プレ
イオトロフィンは走化性による細胞の補充に関与するこ
とができる。また、プレイオトロフィンが担体物質とし
てのコラーゲンのような蛋白質の使用を含むセラミック
やポリマーのような担体物質との組み合わせにおける傷
の修復処理において使用できることが予想される。さら
に、プレイオトロフィンは自己細胞（骨または軟骨の前
駆細胞等）または自己蛋白質（フィブリン等）と組み合
わせることが可能である。

【００１９】実施形態の一例において、本発明の組成物
は送達担体（delivery vehicle）と、有効量のほぼ純粋
なプレイオトロフィンから成る生物活性混合物とから成
る。また別の実施形態においては、本発明の組成物は送
達担体と、プレイオトロフィン遺伝子を含む生物活性混
合物とから成る。インビボで骨および軟骨に生物活性薬
剤を送達するのに適する送達担体は当該技術分野におけ
る熟練者において周知である。実施形態の一例におい
て、この送達担体はポリマーマトリックスにより構成さ
れており、このポリマーマトリックスは１種類以上の生
体許容性のポリマーにより形成されている。なお、本明
細書において使用する用語の「生体許容性（biocompati
ble）」とは、上記のポリマーが無毒性および非変異原
性であって、最少乃至適度の炎症反応性を示すことを意
味する。好ましくは、この生体許容性ポリマーは生体分
解性であって、制御された様式において無毒性の残留物
に完全に分解する。このような実施形態において、上記
のポリマーマトリックスは生物活性混合物用の送達担体
として作用して、生物活性薬剤を投与の局在化部位に集
中すると共に生物活性組成物の放出を制御する。このよ
うな局在化した骨および軟骨の部位へのプレイオトロフ
ィンの制御された送達および放出は生物活性分子と生体
分解性、生体許容性ポリマーとの組み合わせの使用に基
づくものであり、このような使用方法により、生理学的
に有効な時間内における効果的な生物活性分子の放出お
よび治療部位からのポリマーの除去の両方が実現でき
る。

【００２０】ポリエステル、ポリビニルアセテート、ポ
リアクリレート、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ
エチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）およびポリ無水
物等を含む種々のポリマーが、所定のインビボ部位への
生物活性分子の送達を目的とする移植材料（インプラン
ト）の形成に使用できる。このような用途におけるポリ
エステルの利点の一つは当該材料が生体分解性および生
体許容性であることである。とりわけ、脂肪族ポリエス
テルは損傷または手術後に移植可能な薬物送達装置、縫
合線、および一般の組織支持体のための生物材料の領域
においてこれまで広く使用されている。このような従来
から化合物の局所的送達に最も大きく関係するポリエス
テルはラクチド、グリコリド、およびカプロラクトンモ
ノマーから誘導されたもので、種々のターモノマー（三
元モノマー）の組み合わせにより到達可能なかなり広範
囲の分解プロファイルを有する。これらの脂肪族ポリエ
ステルにおけるエステル結合部分は加水分解的および／
または酵素的に不安定であって、水性環境内においてポ
リマー分解を生じる。

【００２１】好ましい実施形態において、ポリマーマト
リックスを形成するために、ポリ酸無水物、ポリエステ
ル酸無水物、またはイオノマーのようなポリマーが使用
される。あるいは、ポリ乳酸およびポリオルトエステル
のような別のポリマーも使用できる。また、別の実施形
態において、上記のポリマーマトリックスはコラーゲン
繊維により構成されている。コラーゲンは生物活性を示
すことが報告されており、インビボでの骨および軟骨の
修復を促進する。従って、コラーゲン繊維は送達システ
ムの成分および本発明の骨および軟骨の修復組成物にお
ける活性薬剤の両方の機能を果たすことができる。さら
に上記ポリマーマトリックスを形成するのに適する別の
ポリマーはフィブリン、スターチ、アルギネート、ヒア
ルロン酸により構成されている。

【００２２】上記の送達担体マトリックスを形成するの
に使用するポリマーの組成、および当該ポリマーの分子
量および物性は用途に応じて変えることができる。例え
ば、分解時間を増大することが望ましい場合に疎水性の
ポリ酸無水物が使用できる。さらに、付加的な強度また
はその他の所望な物性が必要とされる場合に、ポリマー
化学分野または材料学分野の熟練者において既知の材料
を用いて、各種化合物を上記ポリマー内に混合したり、
当該ポリマーと重合することができる。例えば、組成物
に優れた物理的取扱性を賦与するリン酸トリカルシウム
またはヒドロキシアパタイト粒子を添加することができ
る。

【００２３】一般に、骨折の修復のために、上記ポリマ
ーは活性薬剤を約３日乃至４２日（一般に、骨が体重を
支持できるようになるまでヒトにおいて十分な修復が行
えるのに６週間必要である）かけて放出する必要があ
る。さらに、このポリマーは約１６週間乃至２０週間よ
りも短い一定期間において完全に分解する必要がある。
これらの放出および分解の時間は使用するポリマーおよ
び放出される生物活性薬剤に部分的に依存する。さら
に、ポリマーの他に、種々の別の経時放出型担体が知ら
れている。例えば、非経口投与法の一例において、徐放
性または持続放出型のシステムから成るインプラントを
用いてほぼ一定な速度の薬物放出が維持される。例え
ば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照されたい。
さらに別の手法として実施例１において説明するような
浸透ポンプ（osmotic pump）の使用がある。

【００２４】本発明の実施形態の一例によれば、上記の
送達担体はポリエステル・イオノマー（カルボキシ末端
型ポリエステルの塩）により構成されている。このよう
なポリエステル・イオノマーは、インプラントの構造的
／機能的な必要条件により決まる比較的高い分子量の場
合においても良好な溶解性を示す。これらのポリエステ
ルは改善された生体許容性に対応して、天然代謝産物か
ら調製され、また、当該代謝産物に分解される。このよ
うなポリエステル・イオノマーは対応するカルボキシ末
端型ポリエステルから、生体許容性で薬剤的に許容可能
な塩形成用塩基物質による中和または部分中和により調
製される。実施形態の一例において、上記の送達担体は
生体分解性のカルボキシ末端型ポリエステルと、これに
対応するイオノマーとの組み合わせにより構成されてい
る。このようなポリエステル・イオノマーの物性は対応
するカルボキシ末端型ポリエステルの中和の程度により
調整することができ、中和用の塩基物質の選択によって
もある程度制御することができる。上記のポリエステル
・イオノマーは単独またはそれらのカルボキシ末端型ポ
リエステル前駆体との組み合わせで用いられて、組織修
復用の生体許容性担体の構成および／または生物活性化
合物の経時放出のために使用できる。

【００２５】送達担体としてのポリエステル・イオノマ
ーの使用が米国特許第５，６６８，２８８号に記載され
ており、当該文献における開示は本明細書に参考文献と
して含まれる。一般に、これらのポリエステル・イオノ
マーはポリエステルの二価の残基である。さらに、この
ポリエステルは、例えば、乳酸、グリコール酸、ヒドロ
キシカプロン酸、ヒドロキシ吉草酸等の生体許容性のヒ
ドロキシ酸のホモポリマー、コポリマー、またはターポ
リマーにより構成できる。あるいは、このポリエステル
は多価アルコールおよび生体許容性のポリカルボン酸の
共重合により形成できる。最も典型的な例として、この
ようなコポリマーは例えば生体許容性に対応するプロピ
レングリコールのような多価アルコールと生体許容性の
ジカルボン酸との間の共重合反応により形成される。

【００２６】本発明の組成物における生物活性成分は、
必要に応じて、薬剤的に許容可能な担体、可溶化剤、ま
たは充填材と組み合わされたプレイオトロフィンから成
る。骨成長形成を誘発するために、プレイオトロフィン
は約５０ｎｇ乃至約１０ｍｇ／ｍｌ欠損部領域の範囲の
濃度で投与される必要がある。実施形態の一例におい
て、プレイオトロフィンは約５μｇ乃至約１ｍｇ／ｍｌ
欠損部領域の範囲の濃度で投与される。加えて、リン酸
トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、石膏、または
その他の適当な生理学的なミネラル供給源を上記組成物
に組み合わせて損傷状態または病気の骨の修復を補助す
ることができる。実施形態の一例によれば、生理学的に
許容性のミネラルは本発明の組成物の生物活性混合物の
８０％までにより構成されている。あるいは、この生理
学に許容性のミネラルは上記生物活性混合物の約５％乃
至約５０％により構成されており、さらに好ましくは当
該生物活性混合物の約５％乃至約３０％により構成され
ている。加えて、本発明の組成物は既知の薬剤および生
物活性薬剤と組み合わせて骨の異常症状または病気の局
所的治療のための送達システムを形成できる。

【００２７】さらに、本発明の組成物における生物活性
成分は成長因子、成長因子結合性蛋白質または真核細胞
と組み合わせることができる。適当な成長因子の例とし
ては繊維芽細胞成長因子、トランスフォーミング増殖因
子（例えば、ＴＧＦ類）、骨形態形成因子、上皮細胞成
長因子または血小板由来成長因子が含まれる。また、成
長因子結合性蛋白質の例はＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢ
Ｐ５のようなインシュリン様成長因子結合性蛋白質（Ｉ
ＧＦＢＰ類）である。さらに、適当な真核細胞の例は骨
髄細胞、骨芽細胞、および間葉幹細胞を含む。本発明の
生物活性組成物はさらに骨形成薬剤を含むことができ、
当該薬剤は骨の欠損部位内への移植時に骨の発生を刺激
して加速する。このような骨形成薬剤の例として、脱ミ
ネラル骨粉剤、小片化した網状骨、吸引した骨髄、骨ま
たは軟骨の形成細胞、およびその他の骨供給源が含まれ
る。

【００２８】本発明の生物活性組成物は温血脊椎動物に
おける所定の局所的部位における骨および軟骨組織の成
長を刺激するために有用である。本発明の方法は修復を
必要とする部位をほぼ純粋なプレイオトロフィンから成
る組成物に接触させることから成る。実施形態の一例に
おいて、この組成物は修復を必要とする部位に外科的に
移植され、当該組成物がプレイオトロフィンおよびポリ
マーマトリックスから成り、当該ポリマーマトリックス
がプレイオトロフィンの放出を制御して所望の部位にプ
レイオトロフィンを集中する。あるいは、上記組成物は
注射可能な形態であり、上記修復を必要とする部位を接
触させる方法が当該部位内またはその近傍に組成物を注
射することから成る。このような本発明の組成物の注射
可能な形態は一般にプレイオトロフィンと薬剤的に許容
可能な担体との組合せから成る。このような組成物の粘
度は当該組成物の含水量を制御するか、当該技術分野の
熟練者において既知の薬剤的に許容可能な充填材または
増粘剤を添加することにより調節できる。実施形態の一
例において、上記の注射可能な形態はコラーゲン繊維を
含み、上記の組成物の粘度が当該組成物のｐＨ値を約
６．０乃至約７．５に調節することにより制御される。

【００２９】さらに、本発明の組成物は有効量の抗生物
質、化学療法剤、付加的な成長因子、抗原、抗体、酵
素、またはホルモンと組み合わせることができる。例え
ば、プレイオトロフィンおよび抗生物質から成る組成物
は骨髄炎の治療において有用であり、非経口投与の抗生
物質の必要および危険性を減少することができる。さら
に、プレイオトロフィンおよび抗腫瘍剤から成る組成物
は骨の腫瘍の局所的治療に使用でき、プレイオトロフィ
ンおよび骨形成またはその他の成長因子（例えば、骨形
成原、骨形態形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、またはＴ
ＧＦ類）から成る組成物は過度の損傷および骨形成不全
のような骨格的欠損異常により生じる骨格的欠損部の修
復を加速するために使用できる。

【００３０】既に説明したように、本発明の組成物は温
血脊椎等物内への注射用に流体の形態で調製できる。実
施形態の一例において、この注射可能な形態は温血脊椎
動物を治療するために全身的に投与されて、骨および／
または軟骨を含む関節炎またはその他の病因性の状態に
対して治療効果を示す。このような注射可能な薬剤配合
物は皮下、腹膜内、筋肉内および静脈内を含む非経口の
経路を介して投与できる。このような非経口の投与形態
の例として、等張塩類溶液、５％グルコース溶液、また
はその他の周知の薬剤的に許容可能な液体担体中におけ
る活性薬剤の水溶液が含まれる。さらに、実施形態の一
例において、上記の注射可能な組成物はプレイオトロフ
ィンおよび薬剤的に許容可能な担体から成り、当該組成
物が静脈を介して投与される。

【００３１】好ましい実施形態において、上記のプレイ
オトロフィンは５％のジメチルスルホキシドおよび１０
％のCremphor EL（シグマ・ケミカル社）を含有する塩
類溶液中に溶解されている。さらに別の可溶化剤が当該
技術分野に精通した者において周知であり、プレイオト
ロフィン化合物の送達のための薬物賦形剤として利用で
きる。さらに、別の送達担体が本発明に従う使用方法に
適用可能であり、本発明の流体の形態の物質を温血脊椎
動物に対して全身的に投与するために使用できる。例え
ば、この送達担体は経口投与形態、表皮パッチまたはそ
の他の当該技術分野の熟練者において既知の送達担体と
することができる。

【００３２】実施例１：プレイオトロフィンによるイン
ビボでの新骨形成の促進 Ａ．インビボでのプレイオトロフィンの骨形成能力の試
験：ラット頭蓋冠欠損モデル プレイオトロフィンの骨形成能力を決定するために、十
分に確立されたモデルを使用して骨組織の内因性の成長
のインビボでの誘発量を測定した。一般に、このモデル
は成育した（生後６ヶ月以上の）スプラーグ・ダウリー
・ラット（Sprague Dawley rats）の頭頂骨に円形（直
径約６ミリ乃至８ミリ）の欠損部が形成されている。こ
の欠損部は骨内傷が動物の寿命中に骨形成により自然に
治癒することがない程の重大な大きさに形成されてい
る。

【００３３】この外科手術は滅菌処理した技法、キャッ
プ、マスク、ガウン、およびグローブを用いて行われ
る。動物体を１００ｍｇ／ｍｌのキシラジン（Xylazin
e）０．１５ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌのアセプロマジ
ン（acepromarzine）０．３ｍｌを加えたケトセット（K
etoset）１０ｍｌのカクテルにより鎮静した。この投与
量は０．１ｍｌ／１００ｇ体重とした。さらに、付加的
な鎮静処理が必要な場合にケトセットのみをさらに０．
０５ｍｌずつ増加した。ラットが鎮静した後に、これら
の頭部を耳の後ろから鼻の先端部まで剃毛し、さらに耳
よりも腹側まで横方向に剃毛した。３回の擦り洗いをベ
タジン（betadine）およびアルコールを替えながら行っ
た。この擦り洗いに先立って軟膏を目に塗った。動物体
の表面を擦り洗いした後に、動物体の頭部を４×４ガー
ゼの小さい堆積層上に載せて外科手術部位の高さにした
状態で当該動物体をＶ型トレイ上に配置した。さらに、
動物体の鼻、耳、および背中を跨いでテープ片を渡して
トレイにテープ留めすることによりこれらを不動状態に
維持した。

【００３４】不動状態の動物体を載置したトレイを手術
台上において滅菌した布で覆った。その後、頭蓋の中央
に皮膚切開部を形成し、骨膜を引き剥がして正中部位を
露出させた。４０ポンド（約１８ｋｇ）以下の圧力下で
６ｍｍまたは８ｍｍのトレフィンをマイクロ・ドリル中
において使用した。ドリル処理中におけるこの部位の灌
注が熱的壊死を避けるために必要である。また、骨の切
断中は、硬膜および矢状洞を損傷しないように注意を払
う必要がある。さらに、可能であれば、硬膜には触らな
いことが望ましい。出血が生じた場合は、ゲルフォーム
（gelfoam）により数分間この領域を包容して、出血の
停止後に除去する。次に、欠損端部を滑らかにする。

【００３５】さらに、プレイオトロフィンから成る組成
物と脳との間に６ミリ乃至８ミリの円形のゲルフィルム
を配置した。欠損部内に組成物を配置した後に、骨膜傍
層を５−０プロリン連続縫合パターンにより当該欠損部
領域上を閉じた状態で縫合した。さらに、皮膚をステー
プルにより閉じた。その後、低体温症を防ぐために動物
体を保温器内で回復させて、動物体が歩行を始めた段階
でこれらを各ケージの中に戻した。

【００３６】Ｂ．生物活性組成物のインビボ試験方法 ラット頭頂骨欠損モデルの新規な変更部分において、本
発明の組成物はALZET浸透ポンプにより成育ラットの局
在化したインビボの欠損部位（上記のラット頭頂骨欠損
モデルにおける頭頂骨欠損部位）に直接的に投与され
る。このALZET浸透ポンプ（ALZA Scientific Products
社（カリフォルニア州、パロ・アルト））は各スプラー
グ・ダウリー・ラットの背中の肩甲骨よりも僅かに後方
の部分の中に皮下的に移植される。さらに、これらのポ
ンプはカテーテルに接続していて、このカテーテルが各
ポンプの内容物（プレイオトロフィン）を頭頂骨欠損部
内に送達して全欠損部の容積に対して約７．１４μｇ／
ｍｌ乃至約７１４μｇ／ｍｌの範囲の局所的な投与を行
う。

【００３７】上記の浸透ポンプは移植の前に組み立て
る。その後、カテーテル・チューブに送達溶液を収容す
る注射器を取り付けて送達溶液で浸透ポンプを満たすこ
とにより、このポンプ組立体にプレイオトロフィンを充
填する。さらに、充填した浸透ポンプをその流量調節器
に取り付ける。その後、このポンプ組立体を少なくとも
４時間乃至６時間３７℃で滅菌処理した塩類溶液（sali
ne）(０．９％)中に保管する。一晩保管して充填するこ
とにより最適の結果が得られる。この処理工程により、
確実に浸透ポンプが移植前に継続的にポンプ処理する状
態になり、かつ、カニューレ内の凝固の発生や試験用薬
剤の送達中の組織による閉塞の発生を最少にできる。そ
の後、この組立体を宿主動物体に移植する。

【００３８】ラットを麻酔処理して、上記のポンプ装置
を肩甲骨の中央部の中の皮下ポケット（嚢部）の中に移
植する。この移植部位を準備するために、当該移植部位
上の皮膚を剃毛して洗浄し、動物体の背中の肩甲骨中央
部に切開部を形成した。この切開部に止血材料を挿入
し、この止血材料を開口することにより、皮下組織を広
げてポンプに適応するポケットを形成した。なお、この
ポケットはポンプの移動がある程度自由に行えるのに十
分な大きさ（例えば、ポンプよりも１ｃｍほど長い）を
有することが必要である。次に、充填したポンプをこの
ポケットの中に挿入してカテーテルに接続する。さら
に、カテーテルの先端部を頭頂骨の欠損部の中に入れて
当該欠損部にプレイオトロフィン組成物が直接に送達で
きるようにする。その後、ポンプの挿入部位を傷クリッ
プまたは縫合線により閉じる。

【００３９】あらゆる栄養障害ストレスまたは正常行動
からの乱れを最少にするために、製造者の案内書に従っ
て最大薬物送達速度および時間を決めた。ポンプ処理の
寿命の終了後に、上記のALZET浸透ポンプを取り外し
た。

【００４０】結果 各実験はALZET浸透ポンプモデル２００１Ｄを用いて行
い、当該ポンプは欠損部位に２４時間の期間にわたり内
容物（２００μｌの容量）を送達した。この実験はポン
プの移植後全部で２８日間継続した。ラットを２８日目
に殺して、欠損部の（頭部から尾にかけて延在する）中
心線を通る断面を組織学的に観察して骨の成長度を調べ
た。２つの対照動物体群を使用し、これらの対照動物体
群において、欠損部領域には塩類溶液のみが送達される
か、全く何も送達されなかった（すなわち、ポンプは
「空」であった）。０乃至５の評価点（この評価点は以
下に説明する各評価点に従って観察された新しい骨の成
長の量に基づく）を用いて、各断面をその骨の成長度に
ついて無作為に評価した。 ０＝既存の骨の成長または吸収が全く見られない。 １＝０％より大きく約１０％までの骨により架橋された
空隙部が見られる。 ２＝約１０％乃至約３３％の骨により架橋された空隙部
が見られる。 ３＝約３３％乃至約６６％の骨により架橋された空隙部
が見られる。 ４＝約６６％以上の骨により架橋された空隙部が見られ
る。 ５＝空隙部が完全に架橋している。

【００４１】表１はプレイオトロフィンに対するラット
のインビボでの骨成長応答についての分析結果を示して
いる。 表１ ラット頭頂骨欠損モデルにおける処理および組織学的評価結果 処理 濃度(μg/ml 投与量(μg/ml 動物体 平均 標準 塩類溶液) 欠損部) の数 評価点 偏差 自己移植片 分析せず 分析せず ６ ２．５ １ フ゜レイオトロフィン ２５０ ７１４ ６ １．９ １ フ゜レイオトロフィン ２５ ７１ ６ ２ １．３ フ゜レイオトロフィン ２．５ ７．１ ６ ２．２ １．３ 塩類溶液 ０ ０ ６ １．３ ０．５

【００４２】ここで注目すべきことは、処理を受けた動
物体の一部の欠損部において軟骨の島が見られたことで
ある。このことは、軟骨内骨形成が頭蓋において通常生
じないことから極めて意義深い結果と考えられる。

【００４３】結果を総括すると、浸透ポンプ法によるラ
ット頭蓋冠欠損部内への組換え型のヒトのプレイオトロ
フィン蛋白質の導入により新骨形成が促進できることが
分かった。さらに、新しく形成された骨の少なくとも一
部分が骨軟骨機構（軟骨が通常は形成しないモデルにお
いて）を介して生じているために、プレイオトロフィン
が軟骨並びに骨の修復に使用できると考えられる。

【００４４】実施例２：外部頸静脈を介する静脈内注入 本発明のプレイオトロフィン組成物はまた、静脈を介す
る投与により組成物の全身的な投与を行うことができ
る。このような全身的投与は骨または軟骨に関する整形
外科的または病原的な状態に対して治療効果を示すこと
ができる。実施例１において説明したように、ALZETポ
ンプはカテーテルを介して静脈または動脈の循環系内に
直接的に流体組成物を送達することができる。また、こ
のALZETポンプは流量を減少することなく動脈圧に対し
て有効にポンプ処理できることが知られている。以下に
述べる処理手順は外部頸動脈内におけるカテーテルの配
置を詳細に説明するものである。多くの場合において、
この部位はその大きさおよび接近の容易さのために好ま
しいが、別の部位でも有効に使用できる。

【００４５】浸透ポンプの流量調節器をカテーテル（内
径≦０．０３０インチ）の一端部に接続する。このカテ
ーテルは皮下のポンプ移植部位（肩甲骨中央領域）とカ
テーテルを外部頸静脈内に入れる部位との間の距離より
も２５％長いことが必要である。次に、流量調節器およ
びカテーテルを、当該カテーテルの自由端部にプレイオ
トロフィン組成物を充填した注射器を取り付けることに
より充填する。その後、浸透ポンプにプレイオトロフィ
ン組成物を満たして、流量調節器上に固定する。この状
態で、カテーテルを充填するために使用した注射器は取
り外すことができ、流量調節器をその白いフランジ部が
ポンプの表面と同一面になるまで挿入する。この時、ポ
ンプおよびカテーテルは完全に充填されていて気泡が全
く無い状態であることが必要である。その後、この充填
したポンプおよびカテーテルを少なくとも４時間乃至６
時間３７℃で滅菌処理した塩類溶液（０．９％）中に保
管する。この処理工程により、確実に浸透ポンプが移植
前に継続的にポンプ処理する状態になり、かつ、凝固の
発生や試験用薬剤の送達中のカテーテルの閉塞の発生を
最少にできる。

【００４６】その後、上記の完全な組立体を以下のよう
にして動物体内に移植した。動物体の首の腹側の部分を
剃毛して洗浄してから、この首をその正中線の一方の側
まで切開して、その組織を頭部から尾部の軸に沿って広
げた。鋭利でない切開により、外部頸静脈をこの皮膚の
真下に配置して、持ち上げて１．５ｃｍの距離だけ洗浄
した。次に、絹の結紮（３．０）をこの洗浄した静脈の
頭部側の端部の周りに巻いて結び、静脈の全ての太い分
岐部を切断しないように結び締めた。さらに、２個の一
重結び目をこの静脈の心臓側の端部に形成した。鋭利な
湾曲したアイリス鋏の腹部を用いて、この静脈の中央部
分を把持して持ち上げて切断して、この静脈の壁部から
楕円形の切片を取り除いた。（この技法は鋏の先端部に
より切り目を形成するのが好ましい。）その後、カテー
テルの自由端部をこの静脈壁の穴の中に挿入して、心臓
の高さ（成育したラットにおいて約２ｃｍ）まで緩やか
に進入させる。近位端側（心臓側端部）の結紮をカテー
テルの周囲に当該カテーテルを縮まらせないように注意
を払いながら形よく結びつけた。さらに、遠位端側（頭
部側端部）の結紮をカテーテルの周囲に結びつけた。そ
の後、これら３本の結紮の端部をそれらの結び目の近く
において切断した。

【００４７】その後、止血材料を用いて首部の上に穴を
設けて肩甲骨の中央部分における動物体の背中にポケッ
トを形成した。さらに、ポンプをこのポケットの中に配
置して、カテーテルが頭部および首部の移動を可能にす
るのに十分な緩さで当該首部の上から外部頸静脈に到達
できるようにした。その後、この首部における切開部を
２個乃至３個の傷クリップまたは縫合線により閉じた。

【００４８】以上、本発明を好ましい実施形態に基づい
て詳細に説明したが、種々の変更および変形が特許請求
の範囲に記載され定められる本発明の範囲および趣旨に
逸脱しない限りにおいて可能である。

【００４９】参考文献リスト Ijiri, S.「不妊手術の骨形態形成性蛋白質への影響（I
nfluence of Sterilization on Bone Morphogenetic Pr
otein）」、Fourth World Biomaterials Congress、４
月 ２４頁乃至２８頁、（１９９２年）） Mark, S.およびMiller, S.、Journal of Endocrinolog
y、第１巻、（１９９３年） 米国特許第３，７１０，７９５号 米国特許第５，６６８，２８８号

【００５０】なお、本発明の実施態様は以下の通りであ
る。 （１）前記結合組織が骨である請求項１に記載の組成
物。 （２）前記送達担体が生体許容性ポリマーにより形成さ
れたポリマーマトリックスから成る請求項１に記載の組
成物。 （３）前記ポリマーマトリックスがポリエステル、イオ
ノマー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテート、ポ
リアクリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物、コ
ラーゲン、フィブリン、スターチ、アルギネート、およ
びヒアルロン酸から成る群から選択される請求項１に記
載の組成物。 （４）さらに、リン酸トリカルシウム、ヒドロキシアパ
タイト、および石膏により実質的に構成される群から選
択されるミネラル塩から成る請求項１に記載の組成物。 （５）前記ポリマーマトリックスが生体分解性ポリマー
から成る請求項１に記載の組成物。

【００５１】（６）前記生体分解性ポリマーがコラーゲ
ンおよびポリエステル・イオノマーから成る群から選択
される実施態様（５）に記載の組成物。 （７）さらに、付加的な成長因子、成長因子結合性蛋白
質、または真核細胞から成る請求項１に記載の組成物。 （８）前記プレイオトロフィンが生体許容性のマトリッ
クスと組み合わされて移植可能な組成物を形成する請求
項２に記載の単離したプレイオトロフィンの使用方法。 （９）前記結合組織が骨である請求項２に記載の単離し
たプレイオトロフィンの使用方法。 （１０）脊椎動物種の所定のインビボ部位での局在化し
た結合組織の成長を誘発するための方法において、前記
部位を、結合組織の成長を誘発するために有効な量のほ
ぼ純粋なプレイオトロフィンと、薬剤的に許容可能な担
体とから成る組成物に接触させる工程から成る方法。

【００５２】（１１）前記組成物が液体の形態であり、
前記部位が当該組成物の注射によりこの組成物に接触す
る実施態様（１０）に記載の方法。 （１２）前記組成物がさらに生体許容性のポリマーマト
リックスから成る実施態様（１０）に記載の方法。 （１３）前記ポリマーマトリックスがポリエステル、イ
オノマー、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルアセテート、
ポリアクリレート、ポリオルトエステル、ポリ無水物、
コラーゲン、フィブリン、スターチ、アルギネート、お
よびヒアルロン酸から成る群から選択される実施態様
（１２）に記載の方法。 （１４）前記薬剤的に許容可能な担体がミネラル塩、ま
たは金属またはガラス化合物から成る実施態様（１０）
に記載の方法。 （１５）前記ミネラル塩がリン酸トリカルシウム、ヒド
ロキシアパタイト、および石膏により実質的に構成され
る群から選択される実施態様（１４）に記載の方法。

【００５３】（１６）前記ポリマーマトリックスが生体
分解性ポリマーから成る実施態様（１２）に記載の方
法。 （１７）前記生体分解性ポリマーがコラーゲンおよびポ
リエステル・イオノマーから成る群から選択される実施
態様（１６）に記載の方法。（１８）前記組成物が前記
部位において外科的に移植される実施態様（１２）に記
載の方法。 （１９）前記組成物が経時放出型送達担体内において送
達される実施態様（１０）に記載の方法。 （２０）前記結合組織が骨である実施態様（１０）に記
載の方法。

【００５４】（２１）温血脊椎動物における結合組織内
の病原性の状態を治療するための方法において、前記温
血脊椎動物に対して組成物を全身的に投与する工程から
成り、当該組成物が内因性の組織成長を誘発するために
有効な量のほぼ純粋なプレイオトロフィンと薬剤的に許
容可能な担体とから成る方法。 （２２）前記組成物が非経口の注射により投与される実
施態様（２１）に記載の方法。 （２３）前記結合組織が骨である実施態様（２１）に記
載の方法。 （２４）前記病原性の状態が骨粗鬆症である実施態様
（２１）に記載の方法。

【００５５】

【発明の効果】以上に述べたように、本発明によれば、
インビボでの結合組織の修復または成長を促進する組成
物が提供できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599134034 700 Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｄｒｉｖ ｅ， Ｗａｒｓａｗ， ＩＮ 46581， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ナンシー・ヌーセク−ゴーブル アメリカ合衆国、46038 インディアナ州、 フィッシャーズ、カンバーランド・リッ ジ・コート 10416

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 送達担体と、 有効量のほぼ純粋なプレイオトロフィンから成る生物活
   性混合物とから成る、結合組織の成長を促進するための
   組成物。
2. 【請求項２】 結合組織の成長を必要とするインビボ部
   位での当該成長を誘発するために有用な組成物の調製に
   おける単離したプレイオトロフィンの使用方法。