ES2936715T3

ES2936715T3 - Métodos y productos de colágeno para reparación de tejidos

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Publication number: ES2936715T3
Application number: ES07867174T
Authority: ES
Inventors: Martha M Murray
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: US20130273017A1; WO2008060361A3; US20180207316A1; US20090254104A1; US20200009292A1; AU2007320018B2; CA2664866C; AU2007320018A1; CA2664866A1; US9308242B2; EP2073788B9; AU2007320018A2; EP4162936A1; EP2073788B1; US20190388582A1; EP2073788A2; JP2010509943A; US9849213B2; WO2008060361A2; US20160206779A1

Abstract

Se proporcionan métodos y dispositivos para la reparación de tejido articular utilizando material de colágeno. También se proporcionan composiciones de material de colágeno y kits relacionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y productos de colágeno para reparación de tejidos

Campo de la invención

La invención se refiere en general a métodos y dispositivos para la reparación de tejido articular utilizando materiales de colágeno.

Antecedentes

Los tejidos intraarticulares, tal como el ligamento cruzado anterior (LCA), no se curan después de la ruptura. Además, el menisco y el cartílago articular en las articulaciones humanas a menudo tampoco se curan después de una lesión. Los tejidos que se encuentran fuera de las articulaciones se curan formando un coágulo de fibrina, que conecta los extremos del tejido roto y posteriormente se remodela para formar una cicatriz, que cura el tejido. Dentro de una articulación sinovial, un coágulo de fibrina no se forma o se lisa rápidamente después de una lesión en la rodilla, lo que previene la artrosis y la rigidez articular después de una lesión menor. Las articulaciones contienen líquido sinovial que, como parte de la actividad articular normal, previene naturalmente la formación de coágulos en las articulaciones. Este proceso fibrinolítico da como resultado la pérdida prematura del andamiaje del coágulo de fibrina y la interrupción del proceso de curación de los tejidos dentro de la articulación o dentro de los tejidos intraarticulares.

La mejora de la cicatrización de los ligamentos utilizando factores de crecimiento ha sido un área de gran interés e investigación. Si bien la mayoría de los estudios se han centrado en el uso de un solo factor de crecimiento para estimular la cicatrización, el proceso natural de cicatrización de heridas es una orquestación de múltiples factores de crecimiento liberados por las plaquetas y otras células a lo largo del tiempo. Para tratar de reproducir esto en el entorno in vitro e in vivo, los investigadores anteriores han analizado los portadores de liberación sostenida y los vectores virales para la liberación de estas citocinas durante días o semanas, además de examinar las aplicaciones de múltiples factores de crecimiento. Estos estudios han mostrado algunos efectos aditivos de combinaciones aplicadas de factores de crecimiento en la cicatrización de heridas de ligamentos; sin embargo, incluso con técnicas de aplicación avanzadas, las combinaciones de factores de crecimiento, el momento de la liberación y la concentración de la liberación dificultan la optimización de estos sistemas.

Un método alternativo utilizado recientemente para estimular la cicatrización del ligamento cruzado anterior es la aplicación de plasma rico en plaquetas activado (PRP). El PRP es una combinación de las proteínas de la matriz extracelular que normalmente se encuentran en el plasma (incluidos el fibrinógeno y la fibronectina) y las plaquetas. Cuando las plaquetas son activadas por el colágeno expuesto de una lesión en un ligamento, comienzan a agregarse y a liberar múltiples factores de crecimiento, incluido el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFaa, PDGF ap, PDGF pp), factores de crecimiento transformantes-p (TGFpl, TGF p2), factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF2), IGF-1 y factor de crecimiento epitelial. La liberación del factor de crecimiento generalmente ocurre inmediatamente después de la activación de las plaquetas y se mantiene en niveles mucho más bajos durante la vida útil de las plaquetas, hasta 5 a 7 días.

El PRP se puede utilizar para aumentar las concentraciones locales de PDGF-ap y TGF-p1 activos en más del 300 % cuando las plaquetas se concentran en el plasma en un grado similar. Este grado de concentración de plaquetas puede lograrse mediante varios sistemas disponibles. Como se ve in vivo, estos niveles de citocinas liberados localmente por estos concentrados de plaquetas pueden resultar en un aumento de la síntesis de ADN de fibroblastos y una regulación positiva de la producción de colágeno tipo I y cambios en la organización del colágeno y, de hecho, el uso de concentraciones mucho más bajas (10 ng/ml de TGF-p1 y 20 ng/ml de PDGF-ap pueden influir en la proliferación de fibroblastos, la quimiotaxis de fibroblastos, la producción de colágeno y la organización del colágeno. El uso de PRP sobre concentrados de factor de crecimiento purificado proporciona el beneficio adicional de proteínas ECM adicionales que también estimulan la adhesión celular y la síntesis de colágeno, particularmente en presencia de fibrillas de colágeno.

WO01/66130A1 describe un producto que mejora la unión del tejido conjuntivo al hueso y un método para regenerar y reparar las uniones del tejido conjuntivo al hueso utilizando dicho producto. EP1273312A2 describe un material compuesto que se puede utilizar como andamio para soportar condrocitos o células progenitoras que se diferencian de los mismos y como implante para la regeneración de tejido cartilaginoso. EP0645149A1 describe una prótesis totalmente absorbible para la reparación de ligamentos y/o tendones dañados en forma de un rollo en espiral multicapa y un método para fabricar dicha prótesis. EP1254671A1 describe un instrumento para regenerar un tejido u órgano de un organismo vivo, caracterizado porque un soporte formado por un material biodegradable o un material bioabsorbible incluye una matriz fina similar a una esponja formada por un material biodegradable o un material bioabsorbible y un canal de guía lineal para un tejido u órgano de un organismo vivo. US5206028A describe membranas de colágeno, caracterizadas por tener una morfología de rugosidad superficial similar al cuero y son translúcidas. Además, las membranas no se hinchan apreciablemente al humedecerse para mantener su densidad aparente global. También se describen métodos para preparar estas membranas y aplicaciones para su uso. Donna Schulz Torres et al: "Effects of Modulus of Elasticity of Collagen Sponges on Their Cell-Mediated Contraction In Vitro" describe la síntesis y la reticulación de esponjas de colágeno-glicosaminoglicano altamente porosas, que finalmente se utilizarán como implantes de semillas celulares para facilitar la regeneración de tejidos blandos seleccionados.

Compendio

De acuerdo con la presente invención se proporciona un dispositivo de cicatrización de tejidos que comprende un andamio de colágeno capaz de comprimirse y expandirse y se prepara preparando una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración superior a 5 y menor o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000 a 200,000 centipoise (1 Pa.s a 200 Pa.s) y sometiendo la solución estéril de colágeno solubilizado a una temperatura de al menos 30°C, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado forma el andamio de colágeno y un ancla o sutura.

También se describe en este documento una composición de una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor de 5 y menor o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000-200,000 centipoises, hidroxiprolina en una concentración de 0,1-5,0 |jg/ml, un agente neutralizante en donde la solución tiene una osmolaridad de 280-350 mOs/kg, en donde la composición está libre de trombina.

También se describe en este documento una composición de una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 1 y menor que 5 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000-200,000 centipoises, hidroxiprolina en una concentración de 0,1-5,0 jg/ml, en donde la solución tiene una osmolaridad de 280-350 mOs/kg, en donde la composición está libre de trombina.

También se describe en este documento una composición de polvo seco de colágeno solubilizado estéril, al menos uno de decorina y biglicano, y sales amortiguadoras, en donde la composición está libre de trombina.

También se describe en este documento una composición de fraguado rápido de una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 5 y menor que o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000 200,000 centipoises y un pH de 6,8-8,0, en donde la solución tiene una osmolaridad de 280-350 mOs/kg, en donde la solución se asienta en un andamio dentro de los 10 minutos de exposición a temperaturas superiores a 30°C. La solución en algunas realizaciones puede ser un líquido o un gel.

En algunas realizaciones, la composición comprende además una solución amortiguadora. La composición puede tener un pH de 6,8-8,0. En algunas realizaciones, la composición tiene un pH de 7,4. En algunos ejemplos, la solución se mantiene a una temperatura de 4°C.

En algunas realizaciones, el colágeno solubilizado está presente en una concentración superior a 15 mg/ml. El colágeno puede ser colágeno de Tipo I, II o III en algunas realizaciones. El colágeno puede ser colágeno solubilizado con pepsina, colágeno solubilizado con enzima o puede ser atelocolágeno en ciertas realizaciones.

Las composiciones pueden incluir al menos una de decorina y biglicano. En otros ejemplos, cada una de las composiciones incluye tanto decorina como biglicano.

La composición puede incluir otros componentes, tales como un antibiótico, un agente antiplasmina, un inhibidor del activador del plasminógeno, fibrinógeno, un glicosaminoglicano, colágeno insoluble, un agente de reticulación no tóxico o un acelerador. La composición también puede incluir plaquetas o glóbulos blancos. En otras realizaciones, la composición puede incluir un agente neutralizante.

También se describe en este documento un método para preparar un andamio de colágeno, preparando una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 5 y menor que o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000-200,000 centipoises, y sometiendo la solución estéril de colágeno solubilizado a una temperatura de al menos 30°C en donde la solución estéril de colágeno solubilizado forma un andamio de colágeno.

En algunas realizaciones, el andamio de colágeno incluye cualquiera de los componentes opcionales o tiene cualquiera de las propiedades descritas anteriormente.

También se describe en este documento un método para preparar un andamio de colágeno, preparando una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 1 y menor que 5 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000-200,000 centipoises, y sometiendo la solución estéril de colágeno solubilizado a una temperatura de al menos 30°C en donde la solución estéril de colágeno solubilizado forma un andamio de colágeno.

En algunas realizaciones, el andamio de colágeno incluye cualquiera de los componentes opcionales o tiene cualquiera de las propiedades descritas anteriormente. En otras realizaciones el andamio de colágeno incluye un acelerador.

También se describe en este documento un kit, que incluye un primer recipiente que alberga una solución de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 5 y menor que o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000 200,000 centipoise, sales amortiguadoras alojadas en el primer recipiente o en un segundo recipiente, y se proporcionan instrucciones para preparar una solución a partir de la solución de colágeno solubilizado y las sales amortiguadoras.

También se describe en este documento un kit, que incluye un recipiente que contiene una solución de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 5 y menor que o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000 a 200,000 centipoises, un dispositivo para albergar sangre, e instrucciones para preparar un gel a partir de la solución de colágeno solubilizado y componentes sanguíneos aislados de la sangre alojada en el dispositivo.

También se describe en este documento un kit, que incluye un recipiente que aloja un polvo que comprende colágeno, un dispositivo para albergar sangre e instrucciones para preparar un gel a partir de la solución de colágeno solubilizado y componentes sanguíneos aislados de la sangre alojada en el dispositivo. En una realización el polvo incluye un agente de neutralización.

En algunas realizaciones, el andamio de colágeno incluye cualquiera de los componentes opcionales o tiene cualquiera de las propiedades descritas anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones la solución es un líquido o un gel. En ciertas realizaciones, las sales amortiguadoras se alojan en el primer recipiente y forman parte de la solución de colágeno solubilizado. En otras realizaciones las sales amortiguadoras se albergan en el segundo recipiente.

El kit también puede incluir un contenedor que aloja una solución de neutralización.

El kit también puede incluir un dispositivo para alojar sangre. En algunas realizaciones, el dispositivo para alojar la sangre es una jeringa que se puede utilizar para recoger sangre. En otras realizaciones, el dispositivo para alojar la sangre es un tubo de centrífuga. Se puede incluir opcionalmente un anticoagulante en el dispositivo para alojar la sangre o en un recipiente separado. En aún otras realizaciones, el kit incluye un tubo de vórtice.

También se describe en este documento un método que comprende poner en contacto los extremos de un tejido articular roto en un sujeto con una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración mayor que 5 y menor que o igual a 50 mg/ml y que tenga una viscosidad de 1,000-200,000 centipoises y un pH de 6,8- 8.0, e hidroxiprolina en una concentración de 0,1-5,0 |jg/ml, en donde la solución tiene una osmolaridad de 280-350 mOs/kg, en donde la composición no incluye trombina, y dejando que la solución fragüe para tratar el tejido articular roto.

En algunas realizaciones el tejido articular es tejido intraarticular. Una lesión intraarticular puede ser, por ejemplo, un desgarro de menisco, un desgarro de ligamentos o una lesión de cartílago.

En otras realizaciones el tejido articular es tejido extraarticular. Una lesión extraarticular puede ser, por ejemplo, una lesión de ligamentos, tendones o músculos.

El método puede implicar la unión mecánica de los extremos del tejido roto.

También se describe e este documento un método para reemplazar un tejido articular roto, asegurando mecánicamente un dispositivo protésico al tejido proximal a un sitio de tejido articular roto, en donde el dispositivo protésico tiene un núcleo inductivo y una zona adhesiva dispuesta en al menos una parte del núcleo inductivo y que está adaptado para proporcionar un microambiente entre el tejido proximal a un sitio de tejido articular roto y el núcleo inductivo para promover la migración celular desde el tejido proximal a un sitio de tejido articular roto en el núcleo inductivo; y permitiendo que se formen enlaces entre el tejido proximal a un sitio de tejido articular roto y la zona adhesiva del dispositivo protésico. En una realización, el tejido proximal a un sitio de tejido articular roto es el hueso. En otra realización, el núcleo inductivo es una esponja de colágeno.

También se describe en este documento un método que comprende poner en contacto los extremos de un tejido articular roto en un sujeto con una solución estéril de colágeno solubilizado y glóbulos blancos en una concentración de al menos 4 x 103 wbc/ml, y permitir que la solución fragüe para tratar el tejido articular roto.

Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar varias realizaciones de la invención. Por lo tanto, se anticipa que cada una de las limitaciones de la invención que involucran cualquier elemento o combinación de elementos puede incluirse en cada aspecto de la invención. Esta invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención es susceptible de otras realizaciones y de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras. Además, la fraseología y la terminología utilizadas en este documento son para fines descriptivos y no deben considerarse limitantes. El uso de "que incluye", "que comprende", o "que tiene", "que contiene", "que involucra" y variaciones de los mismos en este documento, pretende abarcar los elementos enumerados a continuación y sus equivalentes, así como elementos adicionales.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una gráfica que representa la liberación de PDGF-ap a lo largo del tiempo a partir de hidrogeles de PRP activados con trombina bovina (BT) y activados con colágeno (CENTR (PRP centrifugado), PC (concentrado de plaquetas) y concentrado de plaquetas reducido de RBC).

La figura 2 es una gráfica que representa la liberación de TGF-p1 a lo largo del tiempo a partir de hidrogeles de PRP activados por trombina bovina (BT) y activados por colágeno (CENTR, PC y concentrado de plaquetas reducido en RBC).

La figura 3 es una gráfica que representa la liberación de TGF-p1 en función de la concentración de plaquetas en el PRP 12 horas después de la activación plaquetaria.

La figura 4 es una gráfica que representa la liberación de PDGF-ap de los geles de PRP en función de la concentración de plaquetas en el PRP 12 horas después de la activación de las plaquetas.

La figura 5 es una gráfica que representa la elución de PDGF-ap a lo largo del tiempo a partir de los hidrogeles de PRP sembrados con células. Los valores negativos a lo largo del tiempo sugieren un consumo basado en células del PDGF-ap.

La figura 6 es una gráfica que representa la elución de VEGF a lo largo del tiempo a partir de los hidrogeles de PRP sembrados con células. La tendencia positiva a lo largo del tiempo sugiere que continúa una mayor producción que el consumo de VEGF por parte de las células del LCA.

La figura 7 es una gráfica que representa la proliferación celular dentro de los geles.

La figura 8 es una gráfica que representa los resultados de la contracción del gel mediada por células del LCA.

La figura 9 es una gráfica que representa los resultados de la transección total del LCA de cerdo in vivo tratada con suspensión/solución amortiguadora de colágeno mezclado con PRP del propio animal en el quirófano, en donde la mezcla se inyecta en el espacio entre los extremos del ligamento cortado.

La figura 10 es una gráfica que representa el número de células en función del tiempo de cultivo y la concentración de colágeno.

La figura 11 es una exploración de un gel SDS-PAGE que representa los componentes de una solución de colágeno de la invención.

La figura 12 es una gráfica que representa la liberación de VEGF en función de la concentración de granulocitos en el PRP 12 horas después de la activación plaquetaria.

La figura 13A: Módulo elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función del tiempo de mezcla. * representa una diferencia estadísticamente significativa entre 30 segundos y 120 segundos. ± representa una diferencia estadísticamente significativa entre 60 segundos y 120 segundos. Las barras de error representan 6 una desviación estándar.

La figura 13B: Módulo no elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función del tiempo de mezcla. * representa una diferencia estadísticamente significativa entre 30 segundos y 120 segundos. ± representa una diferencia estadísticamente significativa entre 60 segundos y 120 segundos. Las barras de error representan 6 una desviación estándar. buena

La figura 14A: Módulo elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la velocidad de mezcla. Las diferencias entre los tres grupos no fueron estadísticamente significativas. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 14B: Módulo no elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la velocidad de mezcla. Las diferencias entre los tres grupos no fueron estadísticamente significativas. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 15A: Módulo elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la tasa de calentamiento. Las diferencias entre los grupos no fueron estadísticamente significativas. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 15B: Módulo no elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la velocidad de mezcla. Las diferencias entre los grupos no fueron estadísticamente significativas. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 16A: Módulo elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la temperatura de inyección. * representa una diferencia estadísticamente significativa entre 24°C-26°C y todos los demás grupos. ± representa una diferencia estadísticamente significativa entre 26°C-28°C y todos los demás grupos. Las barras de error representan 6 una desviación estándar.

La figura 16B: Módulo no elástico medio para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la temperatura de inyección. A representa una diferencia estadísticamente significativa entre 24°C-26°C y todos los demás grupos. * representa una diferencia estadísticamente significativa entre 26°C-28°C y todos los demás grupos. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 17: Tiempo medio a 45° para los hidrogeles de colágeno-PRP en función de la temperatura de inyección. ± representa una diferencia estadísticamente significativa entre 24°C-26°C y todos los demás grupos. * representa una diferencia estadísticamente significativa entre 26°C-28°C y todos los demás grupos. ♦ representa una diferencia estadísticamente significativa entre 28°C-30°C y todos los demás grupos. Las barras de error representan una desviación estándar.

La figura 18 es una gráfica que representa los resultados in vivo de la resistencia al fallo frente a la temperatura en el momento de la inyección.

La figura 19: Vista coronal (A) de una rodilla caprina con un LCA intacto. Las flechas negras designan el propio LCA.

La figura 20: Cicatrización del injerto en el grupo colágeno (vista sagital). El injerto tiene un aspecto similar al de la implantación (flecha blanca); sin embargo, hay una masa cicatricial presente detrás del injerto (flecha negra).

La figura 21: Cicatrización del injerto en el grupo colágeno-plaquetas. El injerto es más grande que en el momento de la implantación y parece macroscópicamente sinovializado e infiltrado con tejido fibrovascular. Se observó una buena integración en los sitios de inserción. (21A = vista coronal, 21B = vista sagital).

La figura 22 es una gráfica que representa la fuerza de la articulación en función del recuento de plaquetas.

Las figuras 23A y 23B son diagramas de dispersión bivariados con bandas de confianza del 95 % de regresión.

La figura 23A representa la carga fallida en función del recuento de plaquetas. La figura 23B representa la rigidez en función del recuento de plaquetas.

La figura 24: Plantilla de laxitud AP ensamblada en Instron Machine. La diáfisis femoral se asegura en el accesorio superior que se puede girar para colocar la rodilla entre 0 y 90 grados de flexión para la prueba. Todas las pruebas en este experimento se realizaron con la rodilla a 60 grados de flexión.

La figura 25: Gráfica de muestra de la carga de prueba de laxitud AP frente a datos de desplazamiento. Esta prueba fue para las suturas atadas a través de los túneles anterior y medio con la rodilla flexionada 30 grados. La laxitud AP resultante es de 8,7 mm, medida como la distancia en el eje x entre las dos regiones verticales de la curva.

La figura 26: Anatomía de la inserción del LCA en la rodilla porcina. En el cerdo, hay dos sitios de inserción tibial discretos del LCA: uno es posterolateral, detrás de la unión del cuerno anterior del menisco medial (flecha blanca), y el segundo es anteromedial, ubicado entre la unión del cuerno anterior del menisco medial y la inserción de la asta anterior del menisco lateral (las pinzas retraen la inserción de la asta anterior del menisco lateral).

La figura 27: Fotografías de las posiciones del túnel tibial anterior, medio y posterior. Las flechas blancas enfatizan el sitio de salida de un pasador de sutura Hewson a través de los tres sitios respectivamente.

La figura 28: Valores individuales para cada una de las seis rodillas para las distintas posiciones de prueba. La laxitud de la rodilla intacta (columna 1) se restaura mejor en los grupos donde las suturas pasaron a través de los túneles anterior o medio y se ataron con la rodilla en 60 grados de flexión (columnas 6, 8 y 12).

La figura 29: Diferencias de la laxitud AP intacta de la rodilla para todas las condiciones de reparación. Las barras representan la media, las barras de error representan el error estándar de la media. N = 6 para todos los grupos. Los grupos que no difieren significativamente de los intactos están marcados con un asterisco.

La figura 30 es una gráfica que representa los recuentos de células dentro de las preparaciones de esponja/PRP medidos en el día 2 y el día 10.

Descripción de las realizaciones ejemplares

Los aspectos de la invención se refieren a composiciones y métodos para reparar tejido articular dañado. La invención implica nuevas composiciones y formulaciones a base de colágeno para reparar tejido articular, tal como por ejemplo un ligamento roto o desgarrado. Las composiciones se pueden usar solas o en combinación con andamios tridimensionales (3-D) u otros dispositivos de reparación tradicionales. El material proporciona una conexión entre los extremos rotos del ligamento y las fibras, o proporciona un reemplazo, solo o en combinación con otros dispositivos, para un ligamento desgarrado, después de una lesión, y fomenta la migración de células de curación apropiadas para formar cicatrices y tejido nuevo, facilitando así la curación y la regeneración.

Se pretende que el uso de las composiciones y métodos de la presente invención impliquen la reparación, sustitución, reconstrucción o aumento de tipos de tejido específicos. Las lesiones articulares incluyen tanto lesiones intraarticulares como extraarticulares. Las lesiones intraarticulares implican, por ejemplo, lesiones de meniscos, ligamentos y cartílagos. Las lesiones extraarticulares incluyen, entre otras, lesiones del ligamento, tendón o músculo. Por lo tanto, los métodos de la invención pueden usarse para tratar lesiones del ligamento cruzado anterior (LCA), ligamento colateral lateral (LCL), ligamento cruzado posterior (PCL), ligamento colateral medial (MCL), ligamento radiocarpiano volar, ligamento radiocarpiano dorsal , ligamento colateral cubital, ligamento colateral radial, menisco, labrum, por ejemplo, labrum glenoideo y labrum acetabular, cartílago, por ejemplo, y otros tejidos expuestos al líquido sinovial después de una lesión.

La lesión que se está tratando puede ser, por ejemplo, un ligamento desgarrado o roto. Un ligamento es una banda corta de tejido conectivo fibroso resistente compuesto de fibras de colágeno. Los ligamentos conectan huesos con otros huesos para formar una articulación. Un ligamento desgarrado es aquel en el que el ligamento permanece conectado, pero se ha dañado causando un desgarro en el ligamento. El desgarre puede tener cualquier longitud o forma. Un ligamento roto es aquel en el que el ligamento se ha cortado por completo proporcionando dos extremos separados del ligamento. Un ligamento roto puede proporcionar dos extremos de ligamento de longitudes similares o diferentes. La ruptura puede ser tal que se forme un muñón de ligamento en un extremo.

Un ejemplo de un ligamento cruzado anterior roto se describe únicamente con fines ilustrativos. El ligamento cruzado anterior (LCA) es uno de los cuatro ligamentos fuertes que conectan los huesos de la articulación de la rodilla. La función del LCA es proporcionar estabilidad a la rodilla y minimizar la tensión en la articulación de la rodilla. Restringe el movimiento hacia adelante excesivo del hueso de la parte inferior de la pierna, la tibia, en relación con el hueso del muslo, el fémur, y limita los movimientos de rotación de la rodilla. Se rompe un ligamento cruzado anterior de tal manera que ya no forma una conexión entre el hueso del fémur y el hueso de la tibia. Los extremos resultantes del LCA roto pueden tener cualquier longitud. Los extremos pueden tener una longitud similar, o un extremo puede ser más largo que el otro.

La reparación del tejido dañado se logra utilizando material de reparación a base de colágeno solo o en combinación con un dispositivo de curación de tejido. Un dispositivo de cicatrización de tejido es un dispositivo distinto del material de reparación que ayuda en la reparación del tejido dañado e incluye, por ejemplo, andamios, como esponjas e injertos y dispositivos mecánicos, tales como suturas y anclas.

El tejido dañado o lesionado se trata con una composición novedosa que es una solución estéril de colágeno solubilizado. El colágeno solubilizado, como se usa en este documento, es colágeno solubilizado con enzimas que incluye uno o más colágenos de Tipo I, II, III, IV, V, X. Preferiblemente, el colágeno solubilizado en enzima es tropocolágeno o atelocolágeno en lugar de colágeno fibrilar para reducir la antigenicidad del material. El colágeno se aísla de una fuente y se tritura y desmenuza mecánicamente en un medio ácido basado en enzimas en lugar de una solución acuosa o salina. Por ejemplo, el colágeno puede solubilizarse en pepsina. El paso de triturar mecánicamente el colágeno es importante para que la homogeneización produzca un material de consistencia uniforme que esté libre de agregados y grumos.

El pH de la solución durante la solubilización es muy ácido, por ejemplo, normalmente se obtiene un pH = 2,0 durante la solubilización con pepsina. Un pH preferido para el almacenamiento del material es de 2,0 a 6,5. Preferiblemente, el colágeno se mantiene frío (4 °C o en hielo) durante el almacenamiento y durante la preparación.

En una realización, el colágeno solubilizado es colágeno Tipo I. Tal como se utiliza en este documento, el término "colágeno de tipo I" se caracteriza por dos cadenas a1(I) y una cadena a2(1) (colágeno heterotrimérico). Las cadenas a l (I) tienen una longitud de aproximadamente 300 nm. El colágeno tipo I se encuentra predominantemente en los huesos, la piel (en estructuras similares a láminas) y los tendones (en estructuras similares a cuerdas). El colágeno tipo I se caracteriza además por su reacción con el núcleo proteico de otro componente del tejido conjuntivo conocido como proteoglicano. El colágeno tipo I contiene regiones de señalización que facilitan la migración celular.

El colágeno es sintético o de origen natural. Las fuentes naturales de colágeno pueden obtenerse de fuentes animales o humanas. Por ejemplo, puede derivarse de tejido de rata, cerdo, vaca o humano o tejido de cualquier otra especie. Son útiles los tendones, ligamentos, músculo, fascia, piel, cartílago, cola o cualquier fuente de tejido colágeno. A continuación, el material se implanta en un sujeto de la misma o diferente especie. Los términos "xenogénico" y "xenoinjerto" se refieren a células o tejidos que se originan o se derivan de una especie distinta a la del receptor. Alternativamente, el colágeno se puede obtener a partir de células autólogas. Por ejemplo, el colágeno puede derivarse de los fibroblastos de un paciente que han sido cultivados. El colágeno se puede usar entonces en ese paciente o en otros pacientes. Los términos "autólogo" y "autoinjerto" se refieren a tejidos o células que se originan o se derivan del receptor, mientras que los términos "alogénico" y "aloinjerto" se refieren a células y tejidos que se originan o se derivan de un donante de la misma especie que el receptor. El colágeno se puede aislar en cualquier momento antes de la cirugía.

El colágeno solubilizado puede estar en una concentración de 1-50 mg/ml en la solución. En algunas realizaciones, esa concentración de colágeno solubilizado es superior a 5 mg/ml e inferior o igual a 50 mg/ml. La concentración de colágeno puede ser, por ejemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 mg/ml. Tales altas concentraciones de colágeno son útiles para producir niveles de viscosidad que son deseables para los métodos de la invención. La mayoría de las soluciones de colágeno disponibles comercialmente tienen concentraciones más bajas. Se pueden hacer concentraciones más altas, por ejemplo, usando los métodos descritos en este documento. En otras realizaciones, la solución de colágeno solubilizado tiene una concentración de 1 mg/ml a menos de 5 mg/ml. Cuando se usan concentraciones de colágeno tan bajas, se toman componentes o pasos adicionales para aumentar la viscosidad del material para que sea útil de acuerdo con los métodos de la invención. En este documento se describen ejemplos de métodos o componentes que inducen la viscosidad.

La solución debe prepararse, variando el contenido de colágeno y otros componentes, para proporcionar las propiedades de fluidez deseadas de la composición final. En algunas realizaciones, la solución tiene una viscosidad de colágeno de 1,000 a 200,000 centipoises.

La solución de colágeno es estéril para uso in vivo. La solución se puede esterilizar y/o los componentes de la solución se pueden aislar en condiciones estériles usando técnicas estériles para producir una composición estéril. Las propiedades finales deseadas de la composición pueden determinar cómo se esteriliza la solución porque algunas técnicas de esterilización pueden afectar a propiedades tal como la viscosidad. Si ciertos componentes de la solución no se van a esterilizar, es decir, el colágeno aislado de fuentes naturales, los componentes restantes se pueden combinar y esterilizar antes de añadir el colágeno, o cada componente se puede esterilizar por separado. A continuación, la solución se puede preparar mezclando cada uno de los componentes esterilizados con el colágeno que se ha aislado utilizando técnicas estériles en condiciones estériles. La esterilización se puede lograr, por ejemplo, en autoclave a temperaturas del orden de alrededor de 115°C a 130°C, preferiblemente de alrededor de 120°C a 125°C durante alrededor de 30 minutos a 1 hora. La radiación gamma es otro método para esterilizar componentes. También es posible la filtración, así como la esterilización con óxido de etileno.

La solución de colágeno solubilizado puede contener componentes adicionales, tales como colágeno insoluble, otras proteínas de la matriz extracelular (ECM), tales como proteoglicanos y glicosaminoglicanos, fibronectina, laminina, entectina, decorina, lisil oxidasa, precursores de reticulación (reducibles y no reducibles), elastina, precursores de enlaces reticulados de elastina, componentes celulares tales como proteínas de membrana celular, proteínas mitocondriales, proteínas nucleares, proteínas citosómicas y receptores de superficie celular, factores de crecimiento, tales como PDGF, TGF, EGF y VEGF, e hidroxiprolina. En algunas realizaciones, la hidroxiprolina puede estar presente en la solución en una concentración de 1 a 3,0 |jg/ml, que puede ser del 8 al 9% de la proteína total en la solución de colágeno. En algunas realizaciones, la hidroxiprolina está presente en una concentración de 0,5 a 4,0 jg/m l en la solución de colágeno antes de la adición de cualquier solución amortiguadoran. En algunas realizaciones, la solución de colágeno está libre de trombina. “Libre de trombina”, tal como se usa en este documento, se refiere a una composición que tiene menos del 1% de trombina. En algunas realizaciones, libre de trombina se refiere a niveles indetectables. En otras realizaciones se refiere a 0 % de trombina.

El colágeno se mezcla con una o más realizaciones amortiguadoras para producir una solución que tenga un rango de pH deseable para la mezcla posterior con las células y la aplicación al cuerpo. Idealmente, la(s) solución(es) amortiguadora(s) no tiene componentes o residuos tóxicos, confiere osmolaridad fisiológica y tiene la capacidad de mantener la solución a pH fisiológico. Una solución amortiguadora preferida usada de acuerdo con la invención es una solución amortiguadora HEPES. Sin embargo, cualquier solución amortiguadora que no sea tóxico y sea capaz de regular el pH y/o la osmolaridad a los niveles descritos en este documento es útil de acuerdo con la invención. HEPES es ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (peso molecular y estructura = 238,31, C8H18N2O4S). Por ejemplo, los inventores han descubierto que la siguiente solución amortiguadora alcanza los valores de osmolaridad y pH apropiados:

0,1M HEPES

Medio F-10 de Ham 10X

Solución antibiótica/antimicótica 100X (10,000 U.I. Penicilina, 10000 mg/ml de estreptomicina, 25 jg/m l de anfotericina B de CellGro by Mediatech) Agua estéril ultrapura Bicarbonato de sodio al 7,5 %

NaHCOa

Los componentes de F-10 de Ham 10X, incluyen los siguientes:

Formulación (como 10X):

La solución amortiguadora descrita anteriormente es ejemplar. Muchos de los componentes no son imprescindibles, por ejemplo, no es imprescindible utilizar agua esterilizada, siempre que se mantenga la osmolaridad adecuada. La solución 10x F10 también es opcional. La solución amortiguadora se puede preparar sin 10x F10 o una solución equivalente. Además, se puede usar glucosa u otro azúcar en lugar del 10x F10.

La solución amortiguadora puede incluir o no un antibiótico. Por ejemplo, el antibiótico puede ser penicilina/estreptomicina como se describe anteriormente. Alternativamente, puede ser un antibiótico clínico, que se usa en pacientes humanos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, como cualquiera de las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton PA).

La solución amortiguadora puede ser un único componente o pueden ser múltiples componentes añadidos al mismo tiempo o en momentos diferentes. Si la solución amortiguadora es un componente único, debe tener propiedades que le permitan producir una solución que tenga un rango de pH y una osmolaridad deseables. En algunos casos, es deseable tener al menos dos componentes amortiguadores, una solución amortiguadora de colágeno y una solución amortiguadora neutralizante. La solución amortiguadora de colágeno se puede usar para preparar el colágeno en una solución. En algunos casos, la solución de colágeno preparada puede almacenarse durante largos períodos de tiempo.

Se puede agregar una solución amortiguadora neutralizante, también denominado agente neutralizante, como una solución o en forma de sales secas a una solución de colágeno. Una vez añadida la solución amortiguadora neutralizante, la solución debe conservarse en frío. Si los materiales se procesan a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo, se prefiere que la solución amortiguadora neutralizante se agregue a la solución de colágeno después del almacenamiento. Por lo tanto, una solución de colágeno sin un agente de neutralización puede prepararse con anticipación y almacenarse o puede prepararse durante la cirugía y usarse inmediatamente. El agente de neutralización se puede agregar en la cirugía o antes, pero una solución de colágeno neutralizado preferiblemente se debe mantener fría (4 °C o en hielo).

Después de añadir el agente neutralizante a la solución de colágeno, se alcanza preferiblemente una osmolaridad de 250 a 350 mOsm/kg. La osmolaridad es una cuenta del número total de partículas osmóticamente activas en una solución y es igual a la suma de las molaridades de todos los solutos presentes en esa solución. Se define como una medida de los osmoles de soluto por litro de solución. La osmolaridad es una medida de los osmoles de soluto por kilogramo de solvente. Un experto en la técnica puede determinar la osmolaridad de una solución obteniendo mediciones usando un osmómetro. Una ecuación utilizada para determinar la osmolaridad de una solución es:

en donde

• $ es el coeficiente osmótico y explica el grado de disociación del soluto. O está entre 0 y 1, donde 1 indica 100% de disociación.

• n es el número de partículas en las que se disocia una molécula.

• C es la concentración molar de la solución

Además, después de agregar el agente neutralizante, se logra preferiblemente un pH entre 6,8 y 9,0. En algunas realizaciones se prefiere un pH de 6,8-8,0. En otras realizaciones, se prefiere un pH de 7,2-7,6 o incluso 7,4.

Preferiblemente, la solución amortiguadora es estéril antes de añadirla a la solución de colágeno. Si no está esterilizada, debe esterilizarse antes de agregarla a la solución de colágeno o debe esterilizarse toda la solución de colágeno/solución amortiguadora como se describe en este documento. Los componentes de la solución amortiguadora pueden ser no estériles y luego filtrados en un punto antes de que se mezclen con el colágeno.

En ciertas realizaciones, la solución de colágeno se mezcla con células como plaquetas o glóbulos blancos. En algunas realizaciones, las células se derivan del sujeto a tratar. En otras realizaciones, las células se derivan de un donante que es alogénico para el sujeto.

En ciertas realizaciones, las plaquetas se pueden obtener como plasma rico en plaquetas (PRP). Este componente contiene fibrina y plaquetas, así como otras proteínas plasmáticas que se encuentran en la sangre. También se pueden encontrar algunos glóbulos blancos (WBC) y glóbulos rojos (RBC) en esta preparación. Preferentemente, la concentración de PRP en plaquetas es de al menos 100 K/ml, y preferentemente superior a 300 K/ml. Por ejemplo, la concentración de plaquetas puede ser al menos 1x la que hay en la sangre del paciente, y preferiblemente 1,5x o mayor Para mantener la estabilidad de las células, un pH fisiológico (es decir, 6,2 a 7,6) y un plasma fisiológico se utiliza la osmolaridad (es decir, 280-360 osms/kg). Para mejorar la función del PRP, preferiblemente el PRP se usa dentro de los 7 días posteriores a su extracción del paciente o donante. A menudo, el PRP se aísla del paciente en el momento de la cirugía. Preferiblemente, se almacena entre 20 y 24 °C (temperatura ambiente). Sin embargo, el aislamiento y el almacenamiento de las células pueden lograrse mediante cualquier método y durante cualquier período de tiempo conocido en la técnica para mantener la actividad de los componentes activos.

En un ejemplo no limitante, las plaquetas se pueden aislar de la sangre de un sujeto utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Como ejemplo, se puede centrifugar una muestra de sangre a 700 rpm durante 20 minutos y eliminar la capa superior de plasma rico en plaquetas. La densidad de plaquetas se puede determinar usando un recuento de células como saben los expertos en la técnica. El plasma rico en plaquetas puede mezclarse con colágeno y aplicarse al paciente.

En un ejemplo no limitante, los glóbulos blancos también pueden aislarse de la sangre de un sujeto utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Como ejemplo, se puede centrifugar una muestra de sangre a 700 rpm durante 20 minutos y eliminar la capa leucocítica que contiene glóbulos blancos. La densidad de globulos blancos se puede determinar usando un recuento de células como saben los expertos en la materia. Los glóbulos blancos pueden mezclarse con colágeno y aplicarse al paciente.

La solución de colágeno también puede incluir uno o más de un agente antiplasmina, una proteína de la matriz extracelular (ECM), otra proteína o inhibidores de enzimas, anticuerpos contra la plasmina, anticuerpos contra el activador del plasminógeno tisular o el activador del plasminógeno uroquinasa, reticuladores no tóxicos, calcio, dextrosa u otros azúcares y nutrientes celulares en concentraciones fisiológicas. Los agentes antiplasmina incluyen, pero no se limitan a, enzimas antifibrinolíticas tales como inactivador de plasminógeno, antiplasmina a2 que se une a plasminógeno, antiplasmina a2 que no se une a plasminógeno, macroglobulina a2, inhibidor de plasmina a2, antiplasmina a2 e inhibidor de fibrinólisis activable por trombina. Otros inhibidores de proteínas o enzimas incluyen, entre otros, proteínas antienzimáticas que incluyen inhibidores de colagenasa, tripsina, metaloproteinasas de matriz, elastasa e hialuronidasa. La ECM se compone de componentes fibrilares y no fibrilares. Las principales proteínas fibrilares son el colágeno y la elastina. La ECM incluye, por ejemplo, diversas combinaciones de colágenos, fibrinógeno, proteoglicanos, elastina, ácido hialurónico y varias glicoproteínas que incluyen laminina, fibronectina, proteoglicano de sulfato de heparán y entactina. Los reticuladores no tóxicos incluyen, pero no se limitan a transglutaminasas tisulares, lisil oxidasa, fibrina, fibronectina y moléculas precursoras de entrecruzamiento reducibles y no reducibles.

La solución de colágeno, con o sin cualquiera de los componentes adicionales descritos anteriormente, se puede almacenar como material líquido o gel o se puede secar y almacenar como un polvo. Por ejemplo, se puede liofilizar una solución de colágeno para producir un polvo. A continuación, el polvo se puede reconstituir en una solución amortiguadora. El agente neutralizante puede estar presente en la solución amortiguadora de reconstitución o puede agregarse como una solución amortiguadora separada o como sales.

La solución de colágeno final incluye colágeno, solución amortiguadora y células, como PRP o glóbulos blancos. Los componentes se mezclan a nivel microscópico, en lugar de capas. Preferentemente tiene un pH de 7,4 y una viscosidad mínima de aproximadamente 1,000 centipoises. Preferiblemente, la viscosidad está en el rango de 1,000 a 200,000 centipoises.

Si bien el grado de "solidez" puede variar de una aplicación a otra, en términos generales, las soluciones de colágeno de la presente invención exhibirán viscosidades en el rango completo de líquido a gel a sólido. Se puede obtener una solución de colágeno que tenga una viscosidad óptima directamente de la fuente de colágeno, dependiendo de la concentración del colágeno. Sin embargo, una solución de colágeno que no tenga una viscosidad óptima puede manipularse para crear la viscosidad correcta. La viscosidad de una solución de colágeno puede reducirse diluyendo la solución. La viscosidad de una solución de colágeno de menor viscosidad se puede aumentar para aumentar la gelificación. La gelificación es el cambio en la viscosidad de una composición similar a un fluido a una composición sólida o similar a un gel. La gelificación o la viscosidad de una solución se puede aumentar agregando uno o más de los siguientes: otras moléculas de ECM, que incluyen, entre otras, colágeno insoluble, fibrina, fibronectina y celulosa; adiciones de células, que incluyen pero no se limitan a, plaquetas y fibroblastos; agentes de reticulación no tóxicos, incluidos, entre otros, transglutaminasas tisulares, lisil oxidasa, fibrina y fibronectina; y otros materiales de alta viscosidad con baja osmolaridad, incluidos, entre otros, alginatos y materiales de relleno sintéticos.

Se proporciona un ejemplo de un método para preparar y usar la solución de colágeno de la invención. Los métodos de la invención no están tan limitados y la descripción se proporciona únicamente con fines de ejemplo. El colágeno se aísla de colas de rata y se procesa de 6 semanas a 6 meses antes del momento de la aplicación (cirugía). También se mezcla una solución amortiguadora con anticipación. La solución amortiguadora está diseñada para que la mezcla de colágeno y solución amortiguadora tenga un pH de 7,4 y sea isoosmótica con el plasma. El PRP se obtiene de la sangre extraída del paciente durante la anestesia para la cirugía utilizando una aguja de gran calibre y anticoagulante. La sangre se centrifuga para obtener un PRP con recuento de plaquetas de al menos 1x normal. Cuando el sitio quirúrgico está listo, el colágeno y la solución amortiguadora (que contiene el agente neutralizante) se mezclan primero usando un vórtice. A continuación, se añade el PRP a la mezcla neutralizada de colágeno y solución amortiguadora. El PRP y el colágeno se combinan mediante un proceso de mezcla para producir un material de reparación. El gel resultante se inyecta artroscópicamente en el sitio de la herida articular para promover el proceso de curación.

El término "material de reparación", como se usa en este documento, se refiere a la formulación final de la solución de colágeno con células para administrar al sujeto.

La solución de colágeno o material de reparación puede incluir materiales adicionales, tales como factores de crecimiento, antibióticos, colágeno insoluble o soluble, un agente de reticulación, trombina, células madre, un fibroblasto alterado genéticamente, plaquetas, agua, plasma, proteínas extracelulares y un suplemento de medios celulares. Alternativamente, la solución de colágeno o el material de reparación pueden excluir cualquiera de estos componentes y, en particular, la trombina. Los materiales adicionales pueden agregarse para afectar la proliferación celular, la producción de matriz extracelular, la consistencia, la inhibición de enfermedades o infecciones, la tonicidad, los nutrientes celulares hasta que se formen las rutas nutricionales y el pH de la solución de colágeno o material de reparación. Todos o una parte de estos materiales adicionales pueden mezclarse con la solución de colágeno o el material de reparación antes o durante la implantación o, alternativamente, los materiales adicionales pueden implantarse cerca del área del defecto después de colocar el material de reparación.

En general, la solución de colágeno se prepara con anticipación o en el momento de la cirugía. A una temperatura de preferiblemente 4 °C a alrededor de la temperatura ambiente, se agregan PRP o WBC. La mezcla de colágeno PRP/WBC se mantiene en hielo hasta su uso. Justo antes de su uso, la mezcla puede calentarse a una temperatura de 24-30 °C (preferiblemente 28 °C) y luego inyectarse inmediatamente en el sujeto. En el sujeto, el material se somete a temperaturas corporales superiores a 30 C para producir un gel. El material de reparación de la invención, como se discutió anteriormente, se puede aplicar directamente al tejido solo o se puede usar en combinación con un dispositivo de curación de tejido tal como un andamio. Los andamios pueden ser sintéticos o naturales, tal como en un injerto. Un dispositivo o andamio puede tener cualquier forma que sea útil para la implantación en un sujeto. El andamio, por ejemplo, puede ser tubular, semitubular, cilíndrico, incluyendo un cilindro sólido o un cilindro con cavidades huecas, un tubo, una hoja plana enrollada en un tubo para definir una cavidad hueca, líquido, forma que se ajuste a la del espacio de reparación, un diseño de "trampa para dedos china", una forma de canal o cuadrado. También se contemplan en la invención otras formas adecuadas para el andamiaje del dispositivo como es conocido por los expertos en la técnica.

El andamio puede tratarse previamente con el material de reparación antes de la implantación en un sujeto. Por ejemplo, el andamio se puede empapar en un material de reparación antes o durante la implantación en un sitio de reparación. El material de reparación se puede inyectar directamente en el andamio antes o durante la implantación. El material de reparación se puede inyectar dentro de un andamio en el momento de la reparación.

Un andamio es capaz de insertarse en un sitio de reparación y formar una conexión entre los extremos de un tejido roto o formar alrededor de un tejido desgarrado de modo que, en cualquier caso, se mantenga la integridad y estructura del tejido. Un andamio está hecho preferiblemente de un material elástico comprimible que tiene cierta resistencia a la degradación por el líquido sinovial. El líquido sinovial, como parte de la actividad articular normal, previene naturalmente la formación de coágulos. Este proceso fibrinolítico daría como resultado la degradación prematura del andamio e interrumpiría el proceso de curación del tejido. El material puede ser natural o sintético y puede ser material permanente o biodegradable, tales como polímeros y copolímeros. El andamio puede estar compuesto, por ejemplo, de fibras de colágeno, gel de colágeno, goma espuma, material natural, materiales sintéticos como goma, silicona y plástico, material triturado y compactado, material perforado o un material sólido comprimible.

Es particularmente deseable un andamio que sea capaz de comprimirse y expandirse. Por ejemplo, un andamio de esponja puede comprimirse antes o durante la implantación en un sitio de reparación. Un andamio de esponja comprimido permite que el andamio de esponja se expanda dentro del sitio de reparación. Los ejemplos de andamios útiles según la invención se encuentran en la Patente de EE.UU. N° 6.964.685 y las Solicitudes de Patente de EE.UU. N° 2004/0059416 y 2005/0261736.

Un subconjunto importante de matrices naturales es aquellas hechas predominantemente de colágeno, el principal componente estructural del ligamento. El colágeno puede ser del tipo soluble o insoluble. Preferiblemente, el colágeno es soluble, por ejemplo, ácido o básico. Por ejemplo, el colágeno puede ser de tipo I, II, III, IV, V, IX o X. Preferiblemente, el colágeno es de tipo I. Más preferiblemente, el colágeno es colágeno de tipo I soluble. El colágeno tipo I es el componente predominante de la matriz extracelular del ligamento cruzado anterior humano y proporciona un ejemplo de elección para la base de un andamio de bioingeniería. El colágeno se presenta predominantemente en forma fibrosa, lo que permite el diseño de materiales con propiedades mecánicas muy diferentes al alterar la fracción de volumen, la orientación de la fibra y el grado de reticulación del colágeno. Las propiedades biológicas de la tasa de infiltración celular y la degradación del andamio también pueden alterarse al variar el tamaño de los poros, el grado de reticulación y el uso de proteínas adicionales, tales como glicosaminoglicanos, factores de crecimiento y citocinas. Además, los biomateriales a base de colágeno se pueden fabricar a partir de la propia piel del paciente, minimizando así la antigenicidad del implante (Ford et al., 105 Laryngoscope 944-948 (1995)).

Se han investigado numerosas matrices hechas de componentes naturales o sintéticos para su uso en la reparación y reconstrucción de tejidos. Las matrices naturales están hechas de componentes de tejidos procesados o reconstituidos (como colágenos y GAG). Debido a que las matrices naturales imitan las estructuras normalmente responsables de la interacción recíproca entre las células y su entorno, actúan como reguladores celulares con modificaciones mínimas, dando a las células la capacidad de remodelar un material implantado, lo cual es un requisito previo para la regeneración.

Las matrices sintéticas están hechas predominantemente de materiales poliméricos. Las matrices sintéticas ofrecen la ventaja de una gama de composiciones químicas y arreglos estructurales cuidadosamente definidos. Algunas matrices sintéticas no son graduables. Si bien las matrices no degradables pueden ayudar en la reparación, las matrices no degradables no se reemplazan por remodelación y, por lo tanto, no se pueden usar para regenerar completamente el ligamento. Tampoco es deseable dejar materiales extraños de forma permanente en una junta debido a los problemas asociados con la generación de partículas de desgaste, por lo que se prefieren los materiales degradables para el trabajo de regeneración. Se pueden diseñar andamios sintéticos degradables para controlar la tasa de degradación.

Un andamio puede ser un material sólido de manera que se mantenga su forma, o un material semisólido capaz de alterar su forma y/o tamaño. Un andamio puede estar hecho de material expandible que le permita contraerse o expandirse según se requiera. El material puede ser capaz de absorber plasma, sangre, otros fluidos corporales, líquido, hidrogel u otro material con el que el andamio entre en contacto o se añada al andamio.

Un material de andamio puede ser proteína, material liofilizado o cualquier otro material adecuado. Una proteína puede ser sintética, bioabsorbible o natural. Una proteína incluye, pero no se limita a, fibrina, ácido hialurónico o colágeno. Un material de andamio puede incorporar proteínas terapéuticas que incluyen, entre otras, hormonas, citocinas, factores de crecimiento, factores de coagulación, proteínas antiproteasa (por ejemplo, alfa-antitripsina), proteínas angiogénicas (por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular, factores de crecimiento de fibroblastos), proteínas antiangiogénicas (por ejemplo, endostatina, angiostatina) y otras proteínas que están presentes en la sangre, proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor osteoinductivo (IFO), fibronectina (FN), factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF), extractos de unión de cemento (CAE), ketanserina, hormona de crecimiento humana (HGH), hormonas de crecimiento animal, factor de crecimiento epidérmico (EGF), interleucina-1 (IL-1), trombina alfa humana, factor de crecimiento transformante (TGF-beta), insulina -factor de crecimiento similar (IGF-1), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, bFGF, etc.) y factor quimiotáctico del ligamento periodontal (PDLGF), con fines terapéuticos. Un material liofilizado es aquel que es capaz de hincharse cuando se le añade líquido, gel u otro fluido o entra en contacto con él.

El material de reparación también se puede usar en combinación con un andamio que es un injerto, tal como un injerto de LCA. Hay varios tipos de injertos de LCA disponibles para que los utilice el cirujano en la reconstrucción de lCa . Los injertos pueden ser autoinjertos que se extraen del paciente, por ejemplo, injertos de hueso-tendón-hueso rotuliano, o injertos de isquiotibiales. Alternativamente, los injertos pueden ser xenoinjertos, aloinjertos o injertos de polímero sintético. Los aloinjertos incluyen tejido ligamentoso extraído de cadáveres y debidamente tratado y desinfectado, y preferiblemente esterilizado. Los xenoinjertos incluyen tejido conjuntivo recogido de fuentes animales como, por ejemplo, tejido porcino. Normalmente, los xenoinjertos deben tratarse adecuadamente para eliminar o minimizar una respuesta inmunitaria. Los injertos sintéticos incluyen injertos hechos de polímeros sintéticos tales como poliuretano, polietileno, poliéster y otros polímeros y compuestos biocompatibles bioabsorbibles o no absorbibles convencionales, tales como los andamios descritos en este documento.

Los dispositivos de curación de tejidos también incluyen dispositivos mecánicos tales como suturas y anclas. Un ancla es un dispositivo capaz de insertarse en un hueso o tejido de manera que forma una unión estable al hueso o tejido. En algunos casos, el ancla puede retirarse del hueso si se desea. Un ancla puede tener forma cónica con una punta afilada en un extremo y un cuerpo que tiene un eje longitudinal. El cuerpo de un ancla puede aumentar de diámetro a lo largo de su eje longitudinal. El cuerpo de un ancla puede incluir ranuras adecuadas para atornillar el ancla en su posición. Un ancla puede incluir un ojal en la base del cuerpo del ancla a través del cual se pueden pasar una o más suturas. El ojal puede ser ovalado o redondo y puede ser de cualquier tamaño adecuado para permitir que una o más suturas pasen y se mantengan dentro del ojal.

Se puede unir un ancla a un hueso o tejido mediante métodos físicos o mecánicos como conocen los expertos en la técnica. Un ancla incluye, pero no se limita a, un tornillo, una lengüeta, un ancla helicoidal, una grapa, un clip, un broche, un remache o un ancla de tipo engarce. El cuerpo de un ancla puede variar en longitud. Los ejemplos de ancla incluyen, entre otros, el sistema de tornillo óseo IN-FAST™ (Influence, Inc., San Francisco, CA), el sistema de ancla óseo IN-TAC™ (Influence, Inc., San Francisco, CA), el modelo 3000 Ancla óseo de titanio AXYALOOP™ (Axya Medical Inc., Beverly, MA), OPUS MAG-NUM® Ancla con insertador (Opus Medical, Inc., San Juan Capistrano, CA), ANCHRON™, HEXALON™, TRINION™ (todos disponibles de Inion Inc., Oklahoma City, OK) y endobotones y ancla de sutura absorbible TwinFix AB (Smith & Nephew, Inc., Andover, MA). Las anclas están disponibles comercialmente de fabricantes como Influence, Inc., San Francisco, CA, Axya Medical Inc., Beverly, MA, Opus Medical, Inc., San Juan Capistrano, CA, Inion Inc., Oklahoma City, OK y Smith & Nephew, Inc., Andover, ^mA.

Un ancla puede estar compuesto de un material no degradable, como metal, por ejemplo, acero inoxidable titanio 316 LVM, aleación de CoCrMo o aleación de Nitinol, o plástico. Un ancla es preferiblemente bioabsorbible de modo que el sujeto sea capaz de descomponer el ancla y absorberlo. Los ejemplos de material bioabsorbible incluyen, entre otros, MONOCRYL (poliglecaprona 25), PDS II (polidioxanona), sutura de intestino quirúrgico (SGS), tripa, VICRYL recubierto (poliglactina 910, poliglactina 910 trenzada), material de tendón de autoinjerto humano, fibra de colágeno, POLYSORB, ácido poli-L-láctico (PLLA), ácido poliláctico (PLA), polisulfona, polilactidas (Pla), forma racémica de polilactida (D,L-Pla), poli(L-lactida-co-D, L-lactida), 70/30 poli(L-lactida-co-D,L-lactida), poliglicólidos (PGa), ácido poliglicólico (PGA), policaprolactona (PCL), polidiox-anona (PDS), polihidroxiácidos y reabsorbibles material de la placa (ver, por ejemplo, Orthopaedics, octubre de 2002, Vol. 25, No. 10/Supp.). El ancla se puede bioabsorber durante un período de tiempo que incluye, pero no se limita a, días, semanas, meses o años.

Una sutura es preferiblemente bioabsorbible, de forma que el sujeto sea capaz de romper la sutura y absorberla, y sintética de forma que la sutura no puede ser de una fuente natural. Los ejemplos de suturas incluyen, entre otros, VICRYL™ poliglactina 910, sutura absorbible PANACRYL™, sutura de poliéster ETHIBOND® EXCEL, sutura de polidioxanona PDS® y sutura de polipropileno PROLENE®. Las suturas están disponibles comercialmente de fabricantes como la división MITEK PRODUCTS de ETHICON, INC. de Westwood, Massachusetts.

Una grapa es un tipo de ancla que tiene dos brazos que pueden insertarse en un hueso o tejido. En algunos casos, los brazos de la grapa se pliegan sobre sí mismos cuando se unen a un hueso o en algunos casos cuando se unen a otro tejido. Una grapa puede estar compuesta de metal, por ejemplo, titanio o acero inoxidable, plástico o cualquier material biodegradable. Una grapa incluye, pero no se limita a grapas lineales, grapas circulares, grapas curvas o grapas rectas. Las grapas están disponibles comercialmente de fabricantes tales como Johnson & Johnson Health Care Systems, Inc. Piscataway, NJ, and Ethicon, Inc., Somerville, NJ. Se puede unir una grapa utilizando cualquier dispositivo de grapas conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, un martillo y un colocador de grapas (soporte de grapas).

El dispositivo puede insertarse en un sitio de reparación del tejido roto o desgarrado. Un sitio de reparación es el área alrededor de un tejido roto o desgarrado en el que se puede insertar el material de la invención. Se puede colocar un dispositivo en un área del sitio de reparación durante la cirugía utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Si se usa un andamio en los métodos, el andamio puede llenar el sitio de reparación o llenar parcialmente el sitio de reparación. Un andamio puede llenar parcialmente el sitio de reparación cuando se inserta y expandirse para llenar el sitio de reparación en presencia de sangre, plasma u otros fluidos presentes dentro del sitio de reparación o agregados al sitio de reparación, tal como el material de reparación.

El andamio se puede colocar en combinación con una técnica quirúrgica. Por ejemplo, se puede perforar un agujero en un hueso en o cerca de un sitio de reparación de un tejido roto o desgarrado y el andamio se une mediante una sutura a través del agujero al hueso. Un hueso en o cerca de un sitio de reparación es uno que está muy cerca del sitio de reparación y puede utilizarse usando los métodos y dispositivos de la invención. Por ejemplo, un hueso en o cerca de un sitio de reparación de un ligamento cruzado anterior desgarrado es un hueso de fémur y/o un hueso de tibia. Se puede perforar un agujero en un hueso usando un dispositivo como un alambre de Kirschner (por ejemplo, un alambre de Kirschner pequeño) y un taladro, o picadores o punzones para microfracturas.

Se puede perforar un agujero en un hueso en el lado opuesto al sitio de reparación. Se puede pasar una sutura a través del orificio en el hueso y unirla al hueso. Se adjunta un andamio a la sutura para asegurar el andamio entre el hueso y el extremo de un tejido roto. Un tejido roto proporciona dos extremos del tejido que antes estaban conectados. Se puede unir un andamio a uno o ambos extremos de un tejido roto mediante una o más suturas. Se puede unir una sutura a un segundo sitio óseo en o cerca del sitio de reparación. La sutura se puede unir al segundo hueso utilizando una segunda ancla.

En un procedimiento artroscópico típico, por ejemplo, del LCA, el cirujano prepara al paciente para la cirugía insuflando la rodilla del paciente con solución salina estéril. Se insertan varias cánulas en la rodilla y se usan como portales de entrada al interior de la rodilla. Se inserta un artroscopio convencional a través de una de las cánulas para que el cirujano pueda ver la rodilla de forma remota.

En la reconstrucción quirúrgica de un tejido tal como ACL, el cirujano puede perforar un túnel tibial y un túnel femoral de acuerdo con técnicas quirúrgicas convencionales utilizando brocas quirúrgicas y guías de perforación convencionales. A continuación, se prepara un injerto de ligamento cruzado anterior de reemplazo y se monta en los túneles tibial y femoral, y se asegura usando técnicas convencionales y dispositivos conocidos para completar la reconstrucción de la rodilla.

El material de reparación se aplica a un sujeto. La aplicación al sujeto implica procedimientos quirúrgicos. El siguiente es un ejemplo de un procedimiento quirúrgico que se puede realizar usando los métodos de la invención. La extremidad afectada se prepara y se cubre de la manera estéril estándar. Se puede usar un torniquete si está indicado. Se identifica y define la lesión intraarticular, se pretratan los extremos del tejido, ya sea mecánica o químicamente, y si se utiliza un andamio, se introduce el andamio en el defecto del tejido. Si el andamio no se ha empapado previamente en el material de reparación o si se desea más material de reparación, entonces se agrega el material de reparación al andamio. El andamio puede reforzarse mediante la colocación de suturas o clips. Si no se utiliza andamio, el defecto tisular se recubre directamente con material de reparación. La rehabilitación postoperatoria depende de la articulación afectada, el tipo y tamaño de la lesión tratada y el tejido involucrado.

La temperatura del material de reparación se puede regular para optimizar la gelatina rápida in vivo. Por ejemplo, se muestra en los ejemplos que las diferentes temperaturas en el momento de la inyección del material de reparación en el cuerpo pueden influir en el tiempo necesario para que se produzca la gelatina. En algunas realizaciones, la temperatura de inyección está idealmente entre 24 °C y 30 °C. 28 °C puede ser una temperatura óptima en algunos entornos para producir el tiempo de gelatina más rápido. La temperatura de inyección se puede lograr calentando la solución a la temperatura óptima inmediatamente antes de la inyección.

Los métodos de la invención pueden lograrse utilizando procedimientos artroscópicos. Se puede utilizar equipo de artroscopia estándar. Inicialmente, se puede realizar una artroscopia diagnóstica para identificar el sitio de reparación apropiado. Si se utiliza un andamio, debe ser comprimible para permitir la introducción a través de portales, incisiones y equipos artroscópicos. El material de reparación se puede colocar en el sitio de reparación mediante inyección directa. Después del procedimiento se pueden cerrar los portales artroscópicos y colocar un vendaje estéril.

Un sujeto incluye, pero no se limita a, cualquier mamífero, como humanos, primates no humanos, ratones, ratas, perros, gatos, caballos o vacas. En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

Los materiales utilizados en la invención son preferentemente biocompatibles, farmacéuticamente aceptables y estériles. Como se usa en este documento, el término "biocompatible" se refiere a composiciones (por ejemplo, células, tejidos, matrices, etc.) que no alteran sustancialmente las funciones biológicas normales de otras composiciones con las que entran en contacto. En realizaciones seleccionadas, la presente invención también contempla materiales biocompatibles que son tanto biodegradables como no biodegradables.

Como se ha descrito anteriormente, cada uno de los componentes del material de reparación se puede preparar de forma estéril. Sin embargo, si uno o más componentes no se recuperan o procesan de manera estéril, entonces pueden esterilizarse antes de la aplicación al sujeto. Por ejemplo, el material (preferiblemente sin las células) puede esterilizarse después de la producción utilizando radiación gamma, etanol, esterilización en autoclave u otros métodos de esterilización conocidos.

Como se usa en este documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del material de andamiaje o material de reparación. El término "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo. Las características del portador dependerán de la vía de administración. Los portadores fisiológica y farmacéuticamente aceptables incluyen diluyentes, rellenos, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizadores, solubilizantes y otros materiales que son bien conocidos en la técnica. El término "portador" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el material de andamio para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también pueden mezclarse con el dispositivo de la presente invención, y entre sí, de manera que no haya interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

En algunas realizaciones, la composición del material de reparación es inyectable. Las composiciones inyectables pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Las formulaciones farmacéuticas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, los materiales también pueden contener estabilizadores adecuados.

La solución de colágeno puede estar en forma de líquido, gel o sólido, antes de la adición de las células. Una vez que se agregan las células, el material de reparación comenzará a aumentar en gelificación para su aplicación en el cuerpo. Si la solución de colágeno es un líquido o un gel, las células pueden agregarse directamente a la solución.

Alternativamente, la solución de colágeno puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. El agente de neutralización puede agregarse antes o después de la reconstitución. Una vez reconstituido el polvo, se mezcla con las células para formar el material de reparación.

Como se usa en este documento, el término "gel" se refiere al estado de la materia entre líquido y sólido. Como tal, un "gel" tiene algunas de las propiedades de un líquido (es decir, la forma es elástica y deformable) y algunas de las propiedades de un sólido (es decir, la forma es lo suficientemente discreta como para mantener tres dimensiones en una superficie bidimensional). Se puede proporcionar un gel en portadores farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la técnica, tal como solución salina o solución salina amortiguada con fosfato. Dichos portadores pueden contener habitualmente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes amortiguadores, conservantes, portadores compatibles y, opcionalmente, otros agentes terapéuticos.

Un ejemplo de un gel es un hidrogel. Un hidrogel es una sustancia que se forma cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula a través de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de celosía abierta tridimensional que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Un polímero se puede reticular para formar un hidrogel antes o después de la implantación en un sujeto. Por ejemplo, se puede formar un hidrogel in situ, por ejemplo, en el sitio de reparación. En ciertas realizaciones, el material de reparación forma un hidrogel dentro del sitio de reparación tras la exposición a la temperatura corporal.

El material de reparación, incluida la solución de colágeno y las células, comenzará a fraguar una vez creado. El proceso de fraguado puede retrasarse manteniendo temperaturas frías o puede acelerarse calentando la mezcla. En ciertas realizaciones, se proporciona una composición de fraguado rápido del material de reparación. La composición de fraguado rápido es capaz de formar una estructura de fraguado dentro de los 10 minutos de la mezcla cuando el material se expone a temperaturas superiores a 30°C. En algunas realizaciones, la formación del andamiaje tarda aproximadamente 5 minutos a tales temperaturas. Como se discutió anteriormente, los tiempos de fraguado se pueden acelerar aún más optimizando las temperaturas de inyección. La composición de fraguado rápido se logra preparando la solución de colágeno a las concentraciones y viscosidades que se describen en este documento. La naturaleza de fraguado rápido se puede mejorar aún más mediante la adición de agentes de reticulación no tóxicos. Dichas composiciones deben aplicarse rápidamente al defecto del tejido para que fragüen lo suficiente antes del cierre del defecto y del área quirúrgica.

También se describe en este documento un kit para la reparación de tejido articular roto o desgarrado. Un kit puede incluir uno o más recipientes que albergan los componentes de la invención y/o para recolectar o almacenar sangre o células e instrucciones de uso. El kit puede diseñarse para facilitar el uso de los métodos descritos en este documento por parte de los cirujanos y puede adoptar muchas formas. Cada una de las composiciones del kit, cuando corresponda, puede proporcionarse en forma líquida (por ejemplo, en solución) o en forma sólida (por ejemplo, un polvo seco). En ciertos casos, algunas de las composiciones pueden ser reconstituibles o procesables de otro modo (por ejemplo, a una forma activa), por ejemplo, mediante la adición de un solvente adecuado u otras especies (por ejemplo, agua o un medio de cultivo celular), que pueden o puede que no se suministre con el kit. Tal como se utiliza en este documento, "instrucciones" puede definir un componente de instrucción y/o promoción, y normalmente implica instrucciones escritas en el embalaje de la invención o asociadas con él. Las instrucciones también pueden incluir instrucciones orales o electrónicas proporcionadas de cualquier manera que un usuario reconozca claramente que las instrucciones deben asociarse con el kit, por ejemplo, audiovisuales (por ejemplo, cintas de video, DVD, etc.), Internet y/ o comunicaciones basadas en la web, etc. Las instrucciones escritas pueden estar en un formato prescrito por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyas instrucciones también pueden reflejar la aprobación de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

El kit puede contener uno cualquiera o más de los componentes descritos en este documento en uno o más contenedores. Como ejemplo, en una realización, el kit puede incluir instrucciones para mezclar uno o más componentes del kit y/o aislar y mezclar una muestra (por ejemplo, sangre extraída de un sujeto) y aplicarla a un sujeto. El kit puede incluir un contenedor que aloja colágeno. El colágeno puede estar en forma de líquido, gel o sólido (polvo). El colágeno puede prepararse de forma estéril, envasarse en una jeringa y enviarse refrigerado. Alternativamente, se puede alojar en un vial u otro recipiente para su almacenamiento. Un segundo recipiente puede tener solución amortiguadora premezclada preparada estérilmente o en forma de sales. Como alternativa, el kit puede incluir colágeno y algo de solución amortiguadora premezclados y enviados en una jeringa, vial, tubo u otro contenedor. La mezcla puede incluir o no un agente de neutralización. El agente de neutralización puede incluirse en un recipiente separado o puede no estar incluido en el kit.

El kit puede tener uno o más o todos los componentes necesarios para extraer sangre de un paciente, procesar la muestra en concentrado de plaquetas o glóbulos blancos y entregar el material de reparación en un sitio quirúrgico. Por ejemplo, un kit para extraer sangre de un paciente puede incluir uno o más de los elementos necesarios para dicho procedimiento. Por ejemplo, normalmente cuando se va a realizar una inyección, la piel del paciente se limpia con un agente desinfectante, tal como una toallita con alcohol; luego se puede aplicar a la piel un segundo agente desinfectante, tal como yodo o Betadina; generalmente se aísla un área con un torniquete para restringir el flujo de sangre dentro de la arteria o vena haciendo que el vaso sea más visible antes de insertar la aguja, se inyecta una aguja unida a un dispositivo de recolección, tal como un tubo vacutainer se inyecta a través de la piel del paciente para extraer la sangre; luego se retira la aguja y se limpia; y el sitio de punción se cubre con una almohadilla absorbente hasta después de la hemostasia.

Los accesorios incluidos pueden estar diseñados específicamente para permitir que el médico extraiga sangre del paciente. Por ejemplo, los accesorios pueden incluir uno o más de los siguientes: un torniquete, un instrumento de penetración en la piel, un dispositivo para albergar sangre, un tubo de recolección, agentes desinfectantes o parches para sangrado posterior a la inyección.

El instrumento de penetración en la piel para iniciar el flujo sanguíneo puede ser un dispositivo convencional tal como una aguja. La aguja puede tener un extremo simple o doble y puede ser de cualquier calibre, preferiblemente calibre 21 o 23. Opcionalmente, tiene un manguito de seguridad, se puede unir a un cubo de aguja y, preferiblemente, se usa con un soporte de tubo convencional. La aguja también puede ser parte de un conjunto de jeringa convencional que incluye cilindro y émbolo. La aguja puede ser parte de un conjunto de extracción de sangre convencional en el que una aguja penetrante que tiene un medio de agarre, tal como alas, se conecta a través de un cubo y un tubo a una aguja de suministro para perforar un tabique de un tubo de vacío.

El dispositivo para alojar la sangre puede ser cualquier tipo de recipiente para recibir la muestra de sangre, tal como, por ejemplo, un cilindro de jeringa o puede ser un dispositivo al que se transfiere la muestra de sangre después de la recolección, por ejemplo, un tubo. Los dispositivos preferidos para alojar la sangre son tubos o viales convencionales que tienen un extremo cerrado y un extremo abierto. Dichos tubos pueden tener un volumen interno de 100 |jl a 100 ml. Los dispositivos para alojar la sangre después de su recogida incluyen, por ejemplo, viales, tubos de centrífuga, tubos de vórtice o cualquier otro tipo de recipiente. El dispositivo para recibir la sangre puede ser un tubo de vacío en el que el extremo abierto está cubierto por un tabique o tapón perforable, tal como un tubo vacutainer. Los tubos al vacío se utilizan generalmente con un soporte de tubo convencional y un equipo de extracción de sangre para la extracción de múltiples muestras de sangre más grandes, y pueden contener cualquiera de una variedad de aditivos de análisis de sangre convencionales, tal como anticoagulantes. Los anticoagulantes preferidos son citrato y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

El plasma, que contiene las plaquetas, puede separarse de la sangre entera. Puede utilizarse cualquier técnica de separación, por ejemplo, sedimentación, centrifugación o filtración. La centrifugación se puede realizar a unos 500 g durante unos 20 minutos para obtener plaquetas. El sobrenadante, que contiene el plasma, puede eliminarse mediante técnicas estándar. La filtración se puede realizar pasando la sangre entera a través de un filtro adecuado que separa las células sanguíneas del plasma.

Opcionalmente, los kits pueden incluir agentes desinfectantes y parches de sangrado posterior a la inyección. Se puede proporcionar un medio para esterilizar la piel del paciente en el área de la punción prevista, tal como un agente desinfectante. Un agente desinfectante típico y convencional es una pieza de tela denominada comúnmente gasa combinada con un desinfectante. Algunos agentes desinfectantes típicos incluyen alcohol isopropílico, agentes antibacterianos, yodo y Betadina, que pueden o no proporcionarse con almohadillas de aplicación en paquetes sellados individualmente. El parche de sangrado posterior a la inyección también puede variar desde una gasa relativamente simple más tiras adhesivas hasta un vendaje.

Cuando se va a realizar una extracción de sangre, el médico puede abrir el kit sellado; aislar una región seleccionada del cuerpo del paciente, tal como la parte inferior del brazo, con el torniquete para restringir el flujo de sangre dentro de la región y hacer que los vasos sanguíneos sean más visibles; limpiar el lugar de la inyección con uno o más de los agentes esterilizantes; colocar la aguja en el tubo de recolección; inyectar la aguja en el vaso sanguíneo del paciente y recoger la muestra de sangre en el tubo; retirar la aguja de la piel; y cubrir el sitio de punción con una almohadilla absorbente. Luego, la sangre puede procesarse para producir un concentrado de plaquetas o glóbulos blancos.

El kit puede tener una variedad de formas, tal como una bolsa de blíster, una bolsa envuelta en plástico termoencogible, una bolsa sellable al vacío, una bandeja termoformada sellable o una forma similar de bolsa o bandeja, con los accesorios empaquetados libremente dentro de la bolsa, uno o más tubos, recipientes, una caja o una bolsa.

El kit se puede esterilizar después de agregar los accesorios, lo que permite desenvolver los accesorios individuales en el contenedor. Los kits se pueden esterilizar usando cualquier técnica de esterilización apropiada, tal como esterilización por radiación, esterilización por calor u otros métodos de esterilización conocidos en la técnica.

El kit también puede contener cualquier otro componente necesario para el propósito previsto del kit. Por lo tanto, otros componentes pueden ser un tejido, como una gasa, para eliminar el agente desinfectante después de la etapa de esterilización o para cubrir la herida punzante después de extraer la muestra. Otros componentes opcionales del kit son guantes desechables, un soporte para el dispositivo para retener la sangre después de que se toma la muestra, adhesivo u otro dispositivo para mantener la tela en su lugar sobre la herida punzante.

El kit puede incluir componentes desechables suministrados estériles en envases desechables. El kit también puede incluir otros componentes, según la aplicación específica, por ejemplo, contenedores, medios celulares, sales, solucione amortiguadoras, reactivos, jeringas, agujas, etc.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar ciertos aspectos de ciertas realizaciones de la presente invención.

Ejemplos

EJEMPLO 1: Preparación de solución de colágeno y prueba de propiedades

A. Gelificación mínima lograda con algunas formulaciones

1. Innocoll: Se prepararon alícuotas de Innocoll Collagen (pH inicial = 4,1). Los pesos de las alícuotas fueron 0,380 mg de colágeno, pH = 4,1. A la mitad de las muestras se les agregaron 5 microlitros de NaHCO3 para llevar el pH a entre 7,0 y 8,0 y la mitad no se neutralizaron. Se añadieron 300 microlitros de suero bovino fetal a cada alícuota. Se controló la gelificación de todas las soluciones a 37°C durante 30 minutos. Las soluciones permanecieron líquidas, con viscosidades similares a la del agua (aproximadamente 1 centipoise). No se observó ningún aumento de la viscosidad con el tiempo durante el período de una hora.

También se realizaron experimentos idénticos con alícuotas de Innocoll a un pH inicial = 2,5. Además, se realizaron experimentos utilizando proporciones de colágeno:FBS de 1:1,2:1 y 3:1. Ninguno de estos materiales produjo un producto gelificado a 37 °C. Las soluciones permanecieron líquidas, con viscosidades similares a la del agua (aproximadamente 1 centipoise). No se observó ningún aumento de la viscosidad con el tiempo durante el período de una hora.

2. EPC: La suspensión de colágeno se obtuvo de Elastin Products Company (Owensville, Missouri), número de producto C857, número de lote 698, colágeno soluble en ácido tipo I liofilizado de piel de ternero. Preparado según el método de Gallop y Seifter Meth. Enzymol., 6, 635, (1963). En el método, se extrae piel de ternera fresca con NaOAc 0,5 M para eliminar las proteínas que no son de colágeno. El colágeno soluble se extrae con citrato de sodio 0,075 M pH 3,7 y se precipita como fibrillas mediante diálisis frente a Na2HPO40,02 M. El producto fue soluble en ácido acético 0,01 M a 0,5 M de máximo 10 mg/ml y soluble en citrato de sodio 0,075 M pH 3,7 y en ácido acético diluido 0,01 M a 0,5 M.

Antes de combinarse con el componente de plaquetas del hidrogel, la suspensión de colágeno se mezcló con solución 1M de solución amortiguadora H^ePES 0,1 M (Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA), medio Ham's F-10 10X (MP Biomedicals, LCC, Aurora, OH) , solución antibiótica-antimicótica (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) y agua esterilizada. La suspensión de colágeno se neutralizó a un pH de 7,4 usando bicarbonato de sodio al 7,5% (Cambrex BioScience Walkersville, Inc., Walkersville, MD). Se ensayaron mezclas de colágeno-PRP utilizando proporciones de colágeno:FBS de 3:1. Ninguno de estos materiales produjo un producto gelificado a 37 °C. Las soluciones permanecieron líquidas, con viscosidades similares a la del agua (aproximadamente 1 centipoise). No se observó aumento de la viscosidad con el tiempo durante 1 hora o durante la noche.

3. SERVA: La suspensión de colágeno se obtuvo de Serva, número de producto 47256, número de lote 14902 Solución de colágeno de cola de rata tipo I a 4 mg/ml en ácido acético al 0,1% (Heidelberg, Alemania. La suspensión de colágeno se mezcló con solución 1M de solución amortiguadora HEPES 0,1 M (Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA), medio Ham's F-1010X (MP Biomedicals, LCC, Aurora, OH), solución de antibiótico-antimicótico (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) y agua esterilizada. La suspensión de colágeno se neutralizó a un pH de 7,4 usando bicarbonato de sodio al 7,5% (Cambrex BioScience Walkersville, Inc., Walkersville, MD).

Se ensayaron mezclas de colágeno-PRP utilizando proporciones de colágeno:FBS de 3:1. Este material no produjo un producto gelificado a 37 °C. Las soluciones permanecieron líquidas, con viscosidades similares a la del agua (aproximadamente 1 centipoise). No se observó aumento de la viscosidad con el tiempo durante 1 hora o durante la noche.

4. VITROGEN: La suspensión de colágeno se obtuvo de Cohesion Technologies (Palo Alto, CA). También se probó la suspensión Vitrogen 100, número de lote C101636 con una concentración de colágeno de 3,1 mg/ml. Vitrogen Collagen In Solution es 99,9 % de colágeno puro según lo determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS junto con sensibilidad a la colagenasa bacteriana y técnicas de tinción con plata. La solución es 95-98 % de colágeno tipo I y el resto está compuesto por colágeno tipo III. Vitrogen Collagen In Solution es un colágeno nativo a juzgar por la polarimetría y la sensibilidad a la tripsina, aunque contiene un bajo porcentaje de hélices melladas o acortadas.

La suspensión de colágeno se mezcló con solución 1M de solución amortiguadora HEPES 0,1 M (Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA), medio Ham's F-10 10X (MP Biomedicals, LCC, Aurora, OH), solución de antibiótico-antimicótico (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) y agua esterilizada. La suspensión de colágeno se neutralizó a un pH de 7,4 usando bicarbonato de sodio al 7,5% (Cambrex BioScience Walkersville, Inc., Walkersville, MD). Las mezclas de colágeno-PRP se probaron utilizando proporciones de colágeno:FBS de 3:1. Este material no produjo un producto gelificado a 37 °C. Durante los primeros treinta minutos, las soluciones permanecieron líquidas, con viscosidades similares a la del agua (aproximadamente 1 centipoise). No se observó un aumento significativo de la viscosidad con el tiempo hasta que hubo pasado una hora.

5. Pruebas de colágeno de Wake Forest: Las soluciones de colágeno se hicieron a partir de piel de cerdo. Se lavó la piel con agua y se eliminó el pelo y la grasa subcutánea. La piel se picó y se desgrasó adicionalmente con acetona y se lavó con agua desionizada. Los trozos picados se sumergieron en NaCl al 10 % a 4 °C durante 24 horas, luego se sumergieron en solución amortiguadora de citrato (pH 4,3) durante 48 horas y se homogeneizaron en ácido acético 0,5 M a 4 °C. A continuación, el homogeneizado se digirió con pepsina a 4 °C durante 24 horas y se centrifugó. Se añadió NaCl equivalente al 5% p/v al atelo-colágeno salificado y el colágeno se lavó con solución amortiguadora de fosfato y se disolvió en ácido acético 0,5 M y se dializó.

Las alícuotas de colágeno se mantuvieron en hielo hasta que se mezclaron con FBS y Ham's F12. Todas las soluciones tenían un pH entre 7,0 y 7,5. Se añadieron 150 microlitros de FBS y 50 microlitros de Hams F12 a cada tubo, se mezclaron con un agitador vorticial y se colocaron en un baño de agua a 37 °C. Una de las cinco alícuotas gelificó a los 7 minutos. Ninguno de los otros cuatro gelificó durante el período de tiempo de 30 minutos de la prueba. Las pruebas se repitieron para las 4 muestras de colágeno que no gelificaron. Ninguna de las muestras repetidas gelificó durante el marco de tiempo de 30 minutos.

Para confirmar la precisión de la gelificación de la única muestra que produjo un producto gelificado, se realizó una segunda prueba para repetir el estudio sobre el tipo de colágeno que se fijó en la primera prueba. En el segundo ensayo no se observó gelificación, incluso después de 3 horas a 37 °C. El experimento se intentó de nuevo solo con colágeno y FBS. Se observó lo siguiente: la proporción de colágeno:FBS 2:1 no produjo gelificación y la proporción de colágeno:FBS 3:1 gelificó cuando se colocó en un baño de agua a 37 °C (el gel se ablandó durante la hora restante). Las pruebas repetidas de este tipo de colágeno mostraron una gelificación inconsistente que se suavizó con el tiempo en lugar de continuar manteniendo su forma.

B. Rápida gelificación observada con formulaciones de la invención.

Los tendones rotulianos de cerdo se trituraron y se colocaron en una solución de NaCl al 10 % para obtener colágeno solubilizado con sal. El colágeno se homogeneizó y centrifugó. Se aspiró el sobrenadante y se añadió PRP. 5 de las 6 muestras analizadas dieron como resultado una gelificación rápida cuando se expusieron a temperaturas de 37 °C. En una muestra no se obtuvo gelificación.

Se recogieron tendones de cola de rata. Todos los pasos se llevaron a cabo usando técnicas y soluciones estériles. Se centrifugaron fascículos tendinosos solubilizados con sal, se eliminó el sobrenadante y se reemplazó con ácido acético y enzima para solubilizar más el colágeno. La suspensión de colágeno resultante tenía un pH = 3,0. Se prepararon alícuotas y se neutralizaron con NaHCO3 a pH = 7,0. Se añadieron 500 microlitros de PRP a alícuotas de 1 cc de suspensión de colágeno y se agitaron con vórtex (todo en hielo antes de mezclar). La mezcla se colocó en un baño de agua a 37 °C. Cada una de las muestras formó un gel de fraguado suave en 5 minutos (gelificación parcial).

Se probaron alícuotas adicionales con suspensión de colágeno y solución amortiguadora que contenía medio de cultivo F10 y antibióticos. Se añadieron 150 microlitros de suero después de la neutralización con NaHCO3 y NaOH. El gel de colágeno se endureció en 5 minutos a 37 °C en las cuatro pruebas iniciales. La quinta muestra no gelificó. Las pruebas repetidas mostraron que la mayoría de las suspensiones hechas con este protocolo se asentarían, pero no todas (aproximadamente el 60 %).

A continuación, se preparó la solución de colágeno utilizando diferentes componentes de la solución amortiguadora. Con la adición de solución amortiguadora HEPES para ayudar a mantener el pH entre 7,0 y 8,0 y ajustando otros componentes de la solución amortiguadora (antibióticos, F10 y agua esterilizada) para llevar la osmolaridad a un rango de 280 a 350 mOsm/kg, pudimos obtener una gelificación confiable en 10 minutos para más del 90% de las alícuotas analizadas en los ensayos.

C. Viabilidad celular en mezcla de colágeno/solución amortiguadora:

Prueba de gotas: Se tripsinizaron un millón de células ACL de crecimiento primario de cerdo y se añadieron a una suspensión de colágeno neutralizado para producir una densidad de células de 1 x 105 células/cc. Se añadió FBS para producir una proporción de colágeno:FBS de 3:1 y 4:1. Las gotas se colocaron en pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos. Al día siguiente, se observó algo de propagación celular en 2 de 3 geles. En el día 4, las células crecían en 1 de 3 geles.

D. Evaluación de si la proliferación de células ACL de cerdo sembradas en geles de colágeno se ve afectada por la concentración final de colágeno de los geles.

Se realizaron los siguientes métodos:

Las células objetivo se sembraron a 5 x 105 células/ml. Las concentraciones finales de colágeno en los geles fueron de 3,4, 1,7 y 0,8 mg/ml. Estas concentraciones finales se calcularon en función de la concentración de colágeno de la suspensión # 50 (10,5 mg/ml), el hecho de que la suspensión se utilizará con su concentración completa, © y % y cuánto se diluye la suspensión al hacer los geles. Se tomaron puntos de tiempo a los días 1, 5 y 10, lo que dio como resultado un total de 9 puntos de datos (tiempo/concentración de colágeno). Cada punto de datos se ejecutó por cuadruplicado con 2 controles sin células en cada punto de datos.

La cantidad total de geles sembrados con células fue de 36 ml. Se preparó suficiente gel para cada punto de datos utilizando 1,5 ml de suspensión y 1,5 ml de PRP. El PRP necesario para los puntos de datos fue de 13,5 ml (1,5 x 9) y el PRP necesario para los geles sin células fue de 2,2 ml. El PRP total necesario fue de 15,7 ml.

El número de células necesarias fue de 13,5 x 5 x 105 x 3 (ya que el PRP se diluye ~ 3 veces al hacer el gel) lo que da como resultado 202,5 x 105 (o 20,3 x 106) células.

Día 1 - Realización de geles con semillas celulares:

Las células se tripsinizaron, centrifugaron, resuspendieron en medio completo y se contaron para asegurarse de que hubiera suficientes células para el ensayo. La solución de células se centrifugó y las células se resuspendieron en PRP de modo que la concentración de células en (al menos) 13,5 ml de PRP fuera de 15 x 105 células/ml (PRP se diluyó ~ 3 veces al hacer geles).

Los geles se realizaron utilizando PRP con o sin células según el caso. Se tomaron alícuotas de 1 ml de gel en 42 pocillos de placas de 12 pocillos y se colocó en una incubadora. Después de 1 hora, se añadió el medio completo encima de los geles y las células se equilibraron en los geles durante -24 horas.

Días 2, 6 y 11: ensayo MTT en los días 1, 5 y 10:

Se retiraron las placas de la incubadora y se aspiró el medio. Con una espátula estéril, todos los geles se transfirieron a placas nuevas de 12 pocillos. Se añadió 1 ml de colorante MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a cada pocilio del punto de tiempo de 1 día. Los geles se incubaron durante 3 horas. La solución de MTT se aspiró y se descartó. Se añadió 1 ml de DPBS 1X estéril a cada pocillo. Las placas se colocaron en una plataforma giratoria y se dejaron enjuagar suavemente durante 30 minutos. Se extrajo una alícuota de 200 |jl de cada pocillo y se leyó la absorbancia para determinar la persistencia de la eliminación del color. Se eliminó el resto de DPBS y los pasos de DPBS se repitieron dos veces. Si los niveles de absorbancia de DPBS después del tercer enjuague todavía están por encima de 0.1, se puede realizar un cuarto enjuague. Utilizando una espátula estéril, los geles se separaron de los lados/fondo de los pocillos y se transfirieron a tubos nuevos de 3 ml. Se añadió 1 ml de detergente (20% SDS/Formamida). La mezcla se incubó durante 5 horas. Los tubos se retiraron de la incubadora, se sometieron a agitación vorticial breve durante ~ 5 segundos y las muestras se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos. Se transfirieron 200 j l de sobrenadante a una placa de 96 pocillos y se leyó la absorbancia.

RESULTADOS: Se observó proliferación celular in vitro en concentraciones finales de colágeno de 0,8 a 3,4 mg/ml (las concentraciones iniciales de colágeno fueron 10,5, 5,3 y 2,6 mg/ml). El número de células aumentó con el tiempo de cultivo para todos los grupos entre 1 y 10 días. Los resultados se muestran en la Figura 10.

E. Viscosidad de la mezcla de colágeno/solución amortiguadora:

A temperatura fría, la viscosidad fue de 70 cp y después de calentar a 37 °C, la viscosidad se evaluó en 3200 cp a una taza de cizallamiento de 1/seg. A una tasa de cizallamiento más lenta (0,3/s), se determinó que la viscosidad a 37 °C era de 6.000-11.000 cp.

F. Capacidad de la solución de colágeno/solución amortiguadora para estimular las plaquetas para que liberen factores de crecimiento:

La mezcla de colágeno/solución amortiguadora (descrita en (B) anterior) se añadió a una mezcla de plaquetas y la posterior liberación de factores de crecimiento de las plaquetas se midió usando un ensayo ELISA. Las preparaciones sin trombina se compararon con una preparación que utiliza trombina bovina para estimular la liberación de factores de crecimiento por parte de las plaquetas. Se observó una liberación similar del factor de crecimiento usando la suspensión de colágeno como activador de plaquetas que con la trombina bovina como activador. Los resultados se describen en el Ejemplo 2.

G. Esterilidad

Se han realizado múltiples ensayos in vitro utilizando la solución de colágeno/solución amortiguadora descrita anteriormente en (B) sin evidencia de contaminación o infección bacteriana o fúngica en ninguna de las muestras analizadas durante 10 días in vitro y hasta 9 semanas in vivo.

H. Pruebas in vivo de solución de colágeno/solución amortiguadora

Modelo: La transección total del LCA de cerdo se trató con suspensión/solución amortiguadora de colágeno mezclado con PRP propio del animal en el quirófano. La mezcla se inyectó en el espacio entre los extremos del ligamento cortado. La adición de la solución de colágeno/solución amortiguadora al PRP autólogo resultó en más del doble del límite elástico del ligamento en curación después de cuatro semanas in vivo en comparación con el uso de suturas solas para la reparación. La figura 9 es una gráfica que representa los resultados de la sección transversal del LCA total de cerdo in vivo tratada con suspensión/solución amortiguadora de colágeno.

EJEMPLO 2

En este Ejemplo, se usó colágeno tipo I para estimular la activación del mecanismo de coagulación de fibrina y la activación de plaquetas. Inicialmente, probamos el colágeno para determinar si daría como resultado una liberación más sostenida de dos factores de crecimiento utilizados como marcadores de la función plaquetaria, es decir, TGF-a1 y PDGF-ap, en comparación con el uso de trombina exógena. En segundo lugar, probamos si la cantidad de esta liberación dependería de la concentración de plaquetas en el PRP. Los perfiles de liberación de estos factores de crecimiento de tres tipos de geles de colágeno-PRP se compararon con el perfil de liberación de un coágulo de PRP creado con trombina bovina exógena durante 10 días. Además, determinamos si la liberación del factor de crecimiento de los hidrogeles de PRP activados por colágeno causaría cambios fisiológicos en las células del LCA en términos de 1) metabolismo celular de los factores de crecimiento, 2) proliferación celular dentro de los geles y 3) contracción del gel mediada por células.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de Plasma Rico en Plaquetas: Método de centrifugación

Se extrajeron trescientos mililitros de sangre entera de cada uno de cinco voluntarios hematológicamente normales que cumplían con todos los criterios de la Asociación Estadounidense de Bancos de Sangre (Administración de Alimentos y Medicamentos, Centro de Evaluación e Investigación Biológica). La sangre se recogió en una bolsa que contenía ácidocitrato dextrosa al 10% en el Center for Blood Research (Boston, MA). Se centrifugaron cuarenta y cinco ml de sangre completa de cada paciente durante 6 minutos a 200 g (centrífuga Beckman GS-6, Fullerton, CA). El sobrenadante se aspiró y se recogió como PRP. Se prepararon dos grupos adicionales de muestras de PRP utilizando el sistema Harvest Smart PreP2 (Harvest Technologies, Plymouth, MA) como se indica a continuación.

Preparación de PRP utilizando el sistema Smart PreP2:. Método de concentrado de plaquetas

El PRP también se produjo utilizando el sistema Harvest Smart PreP2 (Harvest Technologies, Plymouth, MA). El PRP fue producido por el método recomendado por el fabricante. Cincuenta y cuatro cc de sangre total se anticoagularon usando dextrosa de citrato ácido al 10% y se transfirieron a la cámara de sangre del dispositivo, y se colocaron 2 ml de ACD en la cámara de plasma del procesador de sangre desechable (DP). La sangre se centrifuga en un recipiente con un estante flotante diseñado para subir justo debajo de la interfaz de la capa leucocitaria/glóbulos rojos. Después de la separación del plasma de los glóbulos rojos, la centrífuga se ralentiza y las plaquetas, el plasma y los glóbulos blancos se decantan a la cámara de plasma. Cuando se completa la decantación de plasma, se usa un segundo paso de centrifugación para formar un gránulo de concentrado de plaquetas en el fondo de la cámara de plasma. La cámara de plasma contiene el concentrado de plaquetas (un precipitado similar a un botón) y el plasma pobre en plaquetas (sobrenadante). El proceso completo es completamente automático y se completa en aproximadamente 14 minutos. Se eliminan aproximadamente 2/3 del plasma pobre en plaquetas (PPP). A continuación, el concentrado de plaquetas (PC) se resuspende en el PPP restante.

Preparación de PRP utilizando el sistema Smart PreP2: Método de reducción de glóbulos rojos

El PRP en este grupo se preparó usando el concentrado de plaquetas como se indicó anteriormente con un paso adicional para eliminar la mayoría de los eritrocitos en el PRP. Para lograr esto, se centrifugaron 30 ml de concentrado de plaquetas de cada paciente en el sistema Smart PreP2 durante 2 minutos adicionales. A continuación, se aspira el sobrenadante y se conserva como PRP reducido en glóbulos rojos (rojo de glóbulos rojos).

Se analizaron muestras de preparaciones de sangre completa y plasma rico en plaquetas para hemograma completo con diferencial para determinar las concentraciones iniciales y finales de plaquetas y glóbulos blancos (Tabla 1 y Tabla 2)

T l 1. R n l r r r i n PRP.

Tabla 2. Diferencial en células totales/microlitro.

Fabricación de colágeno soluble en ácido utilizado en los hidrogeles:

Las colas de rata se obtuvieron de ratas reproductoras de control sometidas a eutanasia para otros estudios aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los tendones de cola de rata se cosecharon estérilmente, se picaron y se solubilizaron en una solución de pepsina acidificada para obtener el colágeno soluble en ácido. El contenido de colágeno dentro de la suspensión se ajustó a más de 5 mg/ml utilizando ácido clorhídrico 0,01 N. Antes de combinarse con el componente de plaquetas del hidrogel, la suspensión de colágeno se mezcló con solución 1M de solución amortiguadora HEPES 0,1 M (Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA), medio Ham's F-10 10X (MP Biomedicals, LCC, Aurora, OH), solución antibiótica-antimicótica (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) y agua esterilizada. La suspensión de colágeno se neutralizó a un pH de 7,4 usando bicarbonato de sodio al 7,5% (Cambrex BioScience Walkersville, Inc., Walkersville, MD).

Activación de plaquetas: Grupo de trombina exógena

Se añadieron cinco mililitros de cloruro de calcio (100 mg/ml) a 5,000 UI de trombina bovina (Bovine Thrombin - JMI, Jones Pharma Inc, Bristol, VA) para producir una solución de 1,000 UI/ml. Luego se agregaron 80 ml de la solución de trombina a 720 ml del grupo de Concentrado de Plaquetas para cada paciente. Se inyectaron muestras duplicadas de la mezcla en tubos de centrífuga de 2 ml y se permitió que se formara un coágulo. Los coágulos se pesaron y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos antes de transferirlos a placas estériles de 12 pocillos. Se añadió a cada coágulo un mililitro de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Cat# 10013CV, Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) con 2 % de antibióticos (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA). Las muestras se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C.

Activación de plaquetas: Grupos de colágeno

Para cada muestra, se mezcló un volumen igual de PRP e hidrogel de colágeno y se calentó a 30 °C durante 1 minuto. Se inyectaron muestras duplicadas de cada mezcla de colágeno-PRP en dos tubos de centrífuga de 2 ml. Esto se repitió para todos los grupos de prueba. Los geles se pesaron y se colocaron en una incubadora a 37 °C durante 20 minutos antes de transferirlos a placas estériles de 12 pocillos. Se añadió a cada gel un ml de DMEM con un 2 % de antibióticos (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA). Las muestras se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C.

Además, también se hizo un hidrogel de colágeno solo (sin PRP) y se evaluó la liberación a las 12 horas, 1 día, 3 días y 5 días.

Medición de los niveles del factor de crecimiento:

En cada punto de tiempo (12 horas, 1, 3, 5, 7 y 10 días) se aspiró el medio alrededor de cada muestra y se reemplazó con 1 ml de medio fresco (DMEM sin suero con 2 % de antibióticos agregados). Las muestras de medios se almacenaron en crioviales en un congelador a -80 °C hasta que se recogieron todas las muestras. Las concentraciones de PDGF ap humano, TGF p1 y VEGF se determinaron utilizando los kits de ELISA tipo sándwich colorimétrico Quantikine disponibles comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los ensayos se realizaron por duplicado en muestras de medios como se describe en las instrucciones del fabricante. Se usaron diluciones de 1:20 (muestras de 12 horas) y 1:10 (muestras del día 1, día 3, día 5, día 7 y día 10) para muestras en el ensayo PDGFap; se usó una dilución de 1:10 para todas las muestras en el ensayo TGF p1; y no se usó ninguna dilución para el ensayo de VEGF. Estas diluciones se tuvieron en cuenta en el análisis.

La concentración media de cada factor de crecimiento se determinó utilizando el kit ELISA después de realizar las diluciones descritas anteriormente. El TGF p1 total en plasma se ensayó después de la activación ácida del plasma añadiendo 20 microlitros de HCl IN a 40 microlitros de muestra de medio. La solución de reacción se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de neutralizarla con microlitros de NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M. Se diluyó aún más a 1:10 en diluyente de calibrador antes de agregarlo a la placa ELISA.

Para cada factor de crecimiento, la curva estándar se produjo mediante una dilución en serie doble de una concentración conocida de factor de crecimiento proporcionada en el kit para obtener concentraciones finales de 0, 31,2, 62,5, 125, 250, 500, 1000 y 2000 pg/ mililitros El cambio de color de la reacción final se midió a una longitud de onda de 450 nm para la densidad óptica y las concentraciones de la curva estándar frente a las absorbancias fueron lineales utilizando una curva de ajuste logístico de cuatro parámetros. El límite de detección mínimo informado de TGF-p1 fue de 4,61 pg/ml, 9,0 pg/ml para VEGF y 1,7 pg/ml para PDGF-ap.

Debido a la técnica de muestreo de medios descrita anteriormente, las concentraciones de factor de crecimiento informadas en la sección de resultados reflejan la liberación del factor de crecimiento en el período de tiempo desde el cambio de medio anterior. Para 12 horas y el día 1, esta es una versión de 12 horas y para los días 3, 5 y 7, es una versión de 48 horas.

Análisis: La liberación acumulativa de TGFb se midió después de 1, 5 y 10 días de cultivo de geles sembrados con 3 x 105 células ACL. El efecto de las células sembradas sobre la liberación de TGFb se calculó restando la liberación acumulada de TGFb de los geles libres de células en cada punto de tiempo de la liberación acumulada de TGFb de los geles sembrados con células en el mismo punto de tiempo (ambos valores calculados por ml de gel para tener en cuenta para posibles diferencias en los tamaños de gel durante la fabricación del gel).

La liberación acumulativa de PDGF se midió después de 1, 5 y 10 días de cultivo de geles sembrados con 3 x 105 células ACL. El efecto de las células sembradas sobre la liberación de PDGF se calculó restando la liberación acumulada de PDGF de los geles libres de células en cada punto de tiempo de la liberación acumulada de PDGF de los geles sembrados con células en el mismo punto de tiempo (ambos valores calculados por ml de gel para tener en cuenta para posibles diferencias en los tamaños de gel durante la fabricación del gel).

La liberación acumulativa de VEGF se midió después de 1, 5 y 10 días de cultivo de geles sembrados con 3 x 105 células ACL. El efecto de las células sembradas sobre la liberación de VEGF se calculó restando la liberación acumulada de VEGF de los geles libres de células en cada punto de tiempo de la liberación acumulada de PDGF de los geles sembrados con células en el mismo punto de tiempo (ambos valores calculados por ml de gel para tener en cuenta para posibles diferencias en los tamaños de gel durante la fabricación del gel).

Efecto sobre la proliferación celular: Ensayo MTT

Se prepararon hidrogeles de colágeno-PRP y coágulos de trombina-PRP que contenían 3 x 105 células/ml como sigue. Se cultivaron células ACL humanas de crecimiento primario a partir de explantes obtenidos de 2 mujeres (edades 15 y 22) que se sometieron a reconstrucción ACL. Los explantes se cultivaron en medios que contenían FBS al 10 % (HyClone Inc., Cat. # 16777-006, South Logan, UT), 1% AB/AM (Media Tech, Inc., Cat.# 30004067, Herndon, VA) y el medio se cambió 2 veces por semana hasta que se establecieron cultivos confluentes. Las células se tripsinizaron y se volvieron a sembrar una vez en matraces T-75 hasta su uso. Las células ACL del primer paso se tripsinizaron, se resuspendieron en medio completo, se contaron y se prepararon cuatro sedimentos que contenían 6 x 106 células en tubos de centrífuga de 15 cc. Cada sedimento se resuspendió en 6,5 cc de una de cuatro soluciones: PRP preparado por centrifugación, PC PRP, PRP reducido en glóbulos rojos o solución salina amortiguada con fosfato normal (e Md Chemicals, Cat. #: B10241-34, Gibbstown, NJ).

La proliferación celular se midió utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio); este ensayo mide la capacidad de las enzimas deshidrogenasa mitocondrial de una célula para convertir la sal de MTT soluble amarilla en sal de formazán púrpura. El MTT se preparó a una concentración de 1 mg/ml en DMEM sin suero a partir de la solución madre de MTT estéril (5 mg/ml de PBS). espués de retirar el medio de cada pocillo, se usó una espátula estéril para transferir cada gel a una placa estéril de 12 pocillos; esto permitió que el MTT marcara únicamente aquellas células que proliferaban en el gel. Se añadieron 1,2 ml de solución de MTT (1 mg/ml) a cada pocillo. Cada gel se sumergió completamente en la solución de MTT. Después de agregar el MTT, las placas se incubaron durante 3 horas (37 °C, 5 % de CO2). Posteriormente, se eliminó el exceso de solución de MTT y se agregó 1 ml de PBS 1X estéril a cada pocillo, se colocó en un agitador vertical (Fisher Scientific Clinical Rotator, 100 rpm) y se dejó enjuagar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, se extrajeron 150 microlitros de PBS de cada pocillo, se transfirieron a una placa estéril de 96 pocillos y se leyeron las absorbancias a 562 nm. Este enjuague se repitió hasta que todas las alícuotas de PBS leyeron absorbencias por debajo de 0,100 nm. Luego se eliminó todo el PBS y cada gel se transfirió con una espátula estéril a un tubo de centrífuga estéril de 3,0 ml. Los geles y? los cristales de formazán se disolvieron añadiendo 1 ml de un detergente que contenía SDS acuoso al 20%/formamida (proporción de volumen 1:1) a cada tubo e incubando durante 5 horas en un baño de agua a 37°C. Finalmente, los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a 1500 rpm y, a continuación, se transfirieron alícuotas del sobrenadante de cada tubo (200 microlitros) a una placa estéril de 96 pocillos. Las absorbencias se midieron a 562 nm y se determinaron las concentraciones celulares.

No pudimos evaluar el efecto de la PC en la proliferación celular ya que las lecturas de control para los geles libres de células fueron más altas que la tolerancia del lector de absorbancia, probablemente debido a la gran cantidad de glóbulos rojos en esta preparación de PRP.

Los controles de MTT se prepararon de manera idéntica al método anterior, difiriendo únicamente en su ausencia de células. El protocolo MTT se realizó nuevamente a los días 1, 5 y 10, lo que permitió determinar los controles y, cuando se aplicó a los resultados MTT de los hidrogeles sembrados con células, se aisló y comparó el efecto de las células de cada gel.

Ensayo de contracción de gel de colágeno:

Se evaluó la contracción del gel de colágeno mediada por fibroblastos y PRP. El grado de contracción de los geles de colágeno se determinó midiendo el área de cada gel a lo largo del tiempo en cultivo. Cada dos días (día 1, día 3, día 5 y día 7), se midió la longitud y la anchura en el punto medio del gel usando una regla milimétrica y se registró. Se realizaron comparaciones entre geles sembrados con fibroblastos con y sin PRP y geles libres de células con y sin PRP.

Análisis estadístico

Se utilizó ANOVA de dos factores para el grupo y el tiempo para comparar la liberación del factor de crecimiento de los hidrogeles de colágeno-PRP con los de los coágulos de trombina-PRP, con valores de p < 0,05 considerados estadísticamente significativos. Se utilizó la prueba post hoc de Bonferroni-Dunn para determinar la importancia de las diferencias observadas entre los grupos en un análisis por pares.

RESULTADOS

Hipótesis uno: Que el uso de colágeno como activador plaquetario daría como resultado una liberación más sostenida de factores de crecimiento de un gel de PRP

Tanto en los geles de PRP activados por colágeno como por trombina bovina, la mayor liberación de PDGF-ap y TGF-p1 se produjo en las primeras doce horas (Figuras 1 y 2). Para puntos de tiempo superiores a 3 días (liberación retardada), no hubo diferencia en la liberación de PDGF-ap o TGF-p1 entre los grupos activados con trombina bovina y activados con colágeno. En ambos grupos, la liberación de PDGF-ap a los 10 días fue superior a 1,9 ng/ml y para TGF-p1, la liberación a los 10 días fue superior a 15 ng/ml tanto para geles de PRP activados con colágeno como con bovino.

Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 es una gráfica que representa la liberación de PDGF-ap a lo largo del tiempo a partir de hidrogeles de PRP activados por trombina bovina (BT) y activados por colágeno (Centr, PC y RBC reducido). En la Figura 2 se muestra la liberación de TGF-p1 a lo largo del tiempo a partir de hidrogeles de PRP activados por trombina bovina (BT) y activados por colágeno (Centr, PC y RBC reducidos).

Hipótesis dos: Ese número de plaquetas en el PRP afectaría la liberación de factores de crecimiento de los geles de PRP.

Hubo una fuerte correlación positiva entre el recuento de plaquetas en la preparación de PRP y la liberación de TGF-p1 y PDGF-ap. Para TGF-b, esto fue más fuerte en el punto de tiempo de 12 horas (r2 = 0,608) y permaneció positivo en los puntos de tiempo de 10 y 12 días (r2 > 0,35 para ambas correlaciones). También se encontró una correlación positiva entre la concentración de plaquetas en el gel y la liberación de PDGF, particularmente en el punto de tiempo de 12 horas (r2> 0,35). Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4.

La liberación de TGF-p1 en función de la concentración de plaquetas en el PRP 12 horas después de la activación plaquetaria se muestra en la Figura 3. La Figura 4 muestra la liberación de PDGF-ap de los geles de PRP en función de la concentración de plaquetas en el PRP 12 horas después de la activación plaquetaria.

Hubo una fuerte correlación positiva entre la concentración de plaquetas en los geles y la contracción del gel en todos los puntos temporales (r2 > 0,64 en todos los puntos temporales), lo que sugiere que la contracción de los geles estuvo mediada por plaquetas. Se encontraron correlaciones mucho más bajas entre los recuentos de granulocitos y la contracción del gel (r2 < 0,30 para todas las correlaciones) y probablemente se debió a la correspondencia entre el contenido de plaquetas y granulocitos en el PRP (r2 = 0,35).

Hipótesis tres: Que la liberación del factor de crecimiento de los hidrogeles de PRP activados por colágeno causaría cambios fisiológicos en las células del LCA en términos de 1) metabolismo celular de los factores de crecimiento, 2) proliferación celular dentro de los geles y 3) contracción del gel mediada por células.

1) Metabolismo celular de los factores de crecimiento en geles de colágeno-PRP

Se eluyeron menos TGF-p1 y PDGF-ap de los geles sembrados con células que de los geles sin células, lo que sugiere que las células estaban metabolizando el TGF-p1 y el PDGF-ap. No hubo diferencia significativa entre los grupos (ANOVA de dos factores con p > 0,2 para el grupo y p > 0,4 para el tiempo). Por el contrario, se eluyó más VEGF de los geles sembrados con células, lo que sugiere que las células estaban produciendo VEGF adicional. No hubo diferencias significativas entre los grupos, sin embargo, la liberación de VEGF aumentó con el tiempo en el cultivo (ANOVA de dos factores con p > 0,15 para el grupo y p < 0,02 para el tiempo, prueba post-hoc de BFD p < 0,012 para la comparación entre valores de 1 y 10 días). En promedio, se eluyó más de 4 veces más VEGF de los geles sembrados con células que de los geles sin células.

La elución de PDGF-ap a lo largo del tiempo de los hidrogeles de PRP sembrados con células se muestra en la Figura 5. Los valores negativos a lo largo del tiempo sugieren un consumo basado en células del PDGF-ap. La elución de VEGF a lo largo del tiempo a partir de los hidrogeles de PRP sembrados con células se muestra en la Figura 6. La tendencia positiva a lo largo del tiempo sugiere que continúa una mayor producción que el consumo de VEGF por parte de las células del LCA.

2) Proliferación celular dentro de los geles.

La incorporación de plasma rico en plaquetas centrifugado o empobrecido en glóbulos rojos en el hidrogel de colágeno dio como resultado un aumento significativo en el número de células dentro de los geles durante 10 días de cultivo in vitro (ANOVA de un factor, p < 0,009) con un aumento de casi el doble en número de células entre los grupos de solución salina (0,165 /- 0,03 media /- sd) y centrifugados (0,316 /- 0,04) y una diferencia de más de 2 veces entre los grupos de solución salina y empobrecidos en glóbulos rojos (-0,359 /- 0,11). No se observaron diferencias significativas entre los grupos centrifugados y RBC-D (BFD, p > 0,40). Los resultados se muestran en la Figura 7.

3) Contracción de gel mediada por células ACL

La adición de células ACL a los geles dio como resultado una estabilización del tamaño del gel durante los 10 días de cultivo (ANOVA de dos factores, p < 0,006 para el tiempo y p < 0,001 para el grupo, BFD p > 0,003 para todas las comparaciones entre puntos temporales excepto entre días 0 y 1 donde p < 0,001). Los resultados se muestran en la Figura 8.

Efecto del consumo de factor de crecimiento en la contracción del gel

Hubo una correlación positiva entre la contracción del gel y el consumo de TGF-p 1, es decir, cuanto más TGF-p1 consumían las células, mayor era la contracción celular de los geles. Esto fue más significativo en el grupo reducido de glóbulos rojos (r2 = 0,38) y menos en los grupos PC (r2 = 0,24) y centrifugado (r2 = 0,11). También hubo una correlación positiva entre la contracción del gel y el consumo de PDGF, es decir, cuanto más PDGF consumían las células, mayor era la contracción celular de los geles. Esto fue más significativo en los grupos centrifugados (r2=0,46) y PC (r2=0,42) que en el grupo rojo de RBC (r2= 0,27). Por el contrario, cuanto más VEGF producen las células, mayor es la contracción celular de los geles (r2= 0,38). Esto solo fue significativo en el grupo centrifugado (r2 = 0,38) y no se observó en el grupo PC (r2 = 0,11) ni en el grupo reducido de glóbulos rojos (r2 = 0,004).

EJEMPLO 3

Se probaron los componentes de una solución de colágeno preferida de la invención para identificar los componentes.

MÉTODOS

Colágeno de varias fuentes (Cellagen, MP Biomedicals, Solon, OH (mostrado como carril 4 en la Figura 11); Elastin Products Company, Inc., Owensville, MO (mostrado como carril 5 en la Figura 11); StemCell Technologies (mostrado como carril 6 en la Figura 11), Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ (mostrado como carril 7 en la Figura 11); colágeno marcado con fluoresceína (mostrado como carril 8 en la Figura 11)) se prepararon en muestras alícuotas. El contenido de proteína total de cada muestra de colágeno se determinó utilizando un ensayo colorimétrico (BCA Protein Assay Kit, Rockford, IL) para alícuotas de muestras que contenían el mismo contenido de proteína. Las alícuotas se trataron con SDS y p-mercaptoetanol y se colocaron a 100 °C durante cinco minutos para su desnaturalización y luego se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 4-12 %. Los geles se tiñeron con Coomassie Blue (Bio-Rad, Hercules, CA) y se lavaron con una solución decolorante de ácido acético al 7,5 % y metanol al 5 %.

RESULTADOS

Los resultados de la tinción del gel SDS-PAGE se muestran en la Figura 11. Los resultados demostraron que los productos comercialmente disponibles contenían colágeno tipo I relativamente puro (carriles 4-8). Los carriles 1-2 sirven como controles negativos. l material que se muestra en el carril 3 del gel de la figura 11 se preparó de acuerdo con los métodos descritos en este documento, es decir, el ejemplo 1, "fabricación de colágeno soluble en ácido utilizado en los hidrogeles". La preparación de colágeno de la invención produjo bandas adicionales que migraban a alrededor de 39 KD, lo que significa proteínas adicionales presentes en esta preparación. Se observaron dos bandas adicionales a aproximadamente 39KD, consistentes con decorin y biglycan, así como varias otras bandas. Estas bandas solo se observaron en las preparaciones de colágeno preparadas de acuerdo con los métodos de la invención, y no en ninguno de los productos de colágeno comercialmente disponibles probados.

EJEMPLO 4

Un desafío para la estimulación de la cicatrización del LCA ha sido crear un sistema de suministro activado que proporcione la liberación de factores de crecimiento que se encuentran durante el proceso exitoso de cicatrización de heridas en otros tejidos conectivos blandos. Se probó la adición de glóbulos blancos (WBC) a las soluciones de colágeno. Sorprendentemente, se descubrió que las concentraciones detectables de glóbulos blancos en las soluciones de plasma y colágeno ricas en plaquetas descritas en este documento tenían un efecto significativo en la liberación inmediata de VEGF de los hidrogeles.

MÉTODOS

Métodos para la preparación de plasma rico en plaquetas, preparación de PRP utilizando el sistema Smart PreP2, método reducido en plaquetas y glóbulos rojos, fabricación de colágeno soluble en ácido utilizado en los hidrogeles y activación de plaquetas: Los grupos de colágeno se realizaron como se describe en el ejemplo 2.

Se analizaron muestras de preparaciones de sangre completa y plasma rico en plaquetas para hemograma completo con diferencial para determinar las concentraciones iniciales y finales de plaquetas y glóbulos blancos. Los datos se muestran en la Tabla 2 anterior.

Medición de los niveles del factor de crecimiento:

La liberación de VEGF de cada gel se midió a las 12 horas. Se aspiró el medio de alrededor de cada muestra y se reemplazó con 1 ml de medio fresco (DMEM sin suero con 2% de antibióticos). Las muestras de medios se almacenaron en crioviales de 1,3 ml en un congelador a -80 °C hasta que se recogieron todas las muestras. Las concentraciones de VEGF humano se determinaron usando los kits de ELISA tipo sándwich colorimétrico Quantikine disponibles en el mercado (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los ensayos se realizaron por duplicado en muestras de medios como se describe en las instrucciones del fabricante. No se utilizó ninguna dilución para el ensayo de VEGF.

RESULTADOS

Los resultados del estudio se muestran en la Figura 12. El análisis de regresión lineal demostró una correlación positiva entre WBC y, en particular, el recuento de granulocitos y la liberación de VEGF en el punto de tiempo de 12 horas, con r2 = 0,35. Los resultados demuestran que la inclusión de glóbulos blancos en los materiales de colágeno-PRP de la invención puede dar como resultado mejores condiciones para la cicatrización y reparación de tejidos.

EJEMPLO 5: La temperatura de inyección afecta significativamente el rendimiento in vitro e in vivo de los hidrogeles de colágeno-PRP.

Hemos demostrado la eficacia del uso de hidrogeles de colágeno-PRP para estimular la curación del ligamento cruzado anterior (LCA) después de la transección parcial y completa en modelos animales. Se cree que estos hidrogeles sirven como un andamio provisional sustituto en el sitio de la herida del LCA. Las propiedades reológicas importantes del andamio provisional incluyen sus características de gelificación (incluido el módulo final y el tiempo de gelificación). Como se describió anteriormente, el módulo del andamio provisional debe ser suficiente para mantener el análogo del andamio provisional en el sitio de la herida y permitir que se deforme de manera similar a los bordes circundantes de la herida. Es más probable que un hidrogel con un módulo demasiado bajo fluya fuera del sitio de la herida antes de que se pueda estimular la cicatrización de la herida. El tiempo de gelificación también es importante, ya que, en un procedimiento quirúrgico, un sustituto de andamio provisional que puede lograr la gelificación en cinco minutos es mucho más práctico que un hidrogel que requiere 60 minutos o más para volverse lo suficientemente firme como para permitir el cierre del sitio operatorio.

En este experimento, probamos la perturbación mecánica durante la acumulación de enlaces cruzados de colágeno, así como la temperatura a la que se produjo esta perturbación final y demostramos que tenían un efecto significativo en las propiedades mecánicas de los andamios provisionales in vitro y también, a su vez, afectó significativamente la función de estos materiales en un modelo in vivo de reparación de LCA.

Materiales y Métodos

Estudio in vitro: Diseño experimental

El colágeno soluble en ácido se neutralizó y se combinó con plasma rico en plaquetas para formar alícuotas de matriz de andamio provisional. Luego, cada alícuota se mezcló bajo parámetros específicos de calentamiento y mezcla utilizando un dispositivo automático que podía controlar con precisión el voltaje de calentamiento, la velocidad de mezcla y el tiempo de mezcla mientras registraba simultáneamente la temperatura dentro del gel. Después del procesamiento, se inyectaron partes alícuotas en la placa de un pequeño reómetro de oscilación y se registraron el módulo y el tiempo de gelificación.

Preparación de Plasma Rico en Plaquetas (PRP):

Se extrajo un total de mil dos mililitros de sangre entera de dos cerdos hematológicamente normales sometidos a otros estudios aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. La sangre se recogió en una bolsa que contenía 10 % en volumen de ácido-citrato dextrosa. La sangre se transfirió a tubos de centrífuga de quince mililitros, diez mililitros por tubo. Los tubos se centrifugaron durante seis minutos a 150 g (rotor GH 3.8, centrífuga Beckman GS-6, Fullerton CA). El sobrenadante se recogió como PRP y se tomaron hemogramas completos (CBC).

Fabricación de colágeno soluble en ácido utilizado en hidrogeles:

El colágeno utilizado en este estudio se derivó de colas de rata que se obtuvieron de ratas reproductoras de control sometidas a eutanasia para otros estudios aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Los tendones de cola de rata se recogieron, trituraron y solubilizaron de forma estéril. Se encontró que el contenido de colágeno en la suspensión resultante era > 5 mg/ml. Se usó la misma suspensión de colágeno en todos los experimentos.

La suspensión de colágeno se neutralizó usando solución amortiguadora HEPES (Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA), medio Ham's F-10 (MP Biomedicals, LCC, Aurora, OH), solución de antibiótico-antimicótico (Cellgro, Mediatech, Inc., Herndon, VA) y agua esterilizada. Se usó bicarbonato de sodio al 7,5% (Cambrex BioScience Walkersville, Inc., Walkersville, MD) para neutralizar la suspensión ácida a un pH de 7,4. Se crearon alícuotas de análogos de andamios provisionales mediante la combinación de cantidades iguales de PRP y el colágeno neutralizado y se mantuvieron en hielo hasta que se mezclaron como se describe a continuación.

Aparato para Mezclar y Calentar los Geles:

La velocidad de mezclado, el tiempo de mezclado y la tasa de calentamiento se controlaron usando una cuna diseñada y construida por TNCO Inc. (Whitman, MA). Se diseñó una barrena para encajar dentro de la jeringa de 6 cc sostenida en la cuna. Esto permitió mezclar los componentes del hidrogel de colágeno. Este dispositivo tenía un motor que estaba acoplado a la barrena para permitir el control de la velocidad y el tiempo de mezcla, y una almohadilla térmica debajo de la jeringa que permitía el control de la tasa de calentamiento. La cuna se conectó a una computadora portátil que ejecutaba una aplicación personalizada Lab View (Austin, TX) que permitía el control de las variables y el registro de datos de retroalimentación.

Los experimentos realizados probaron tres velocidades de mezcla diferentes (50 RPM, 100 RPM y 150 RPM), tres tiempos de mezcla diferentes (30 segundos, 60 segundos y 120 segundos) y tres tasas de calentamiento diferentes (9 mV, 11 mV y 13 mV). Todas las combinaciones de esos parámetros se probaron como se ve en la Tabla 3. Se registró la temperatura final de los geles para estas condiciones de mezclado. También se probaron geles por triplicado adicionales que tenían una temperatura de inyección de 24°C-26°C, 26°C-28°C, 28°C-30°C y 30°C-32°C. Los geles adicionales se prepararon mezclando a 100 RPM y calentando a 11 mV durante el tiempo necesario para que el gel alcanzara la temperatura final requerida.

Tabla 3 Parámetros de pr r i n l l

Preparación de geles:

Se midieron alícuotas de un mililitro del colágeno soluble en ácido en criotubos de 5 ml. Se añadió una cantidad adecuada de solución amortiguadora al tubo y se agitó durante cinco segundos. A continuación, se colocó la barrena en la jeringa y se usó para aspirar el colágeno neutralizado. A continuación, se aspiró en la misma jeringa una cantidad igual de PRp que de colágeno soluble en ácido. La jeringa se fijó en la cuna y se mezcló en consecuencia.

Pruebas Mecánicas

Las propiedades mecánicas de los geles se determinaron usando reometría de cizallamiento oscilatorio de pequeña amplitud de cono sobre placa usando un reómetro TA Instruments AR 1000 (New Castle, Delaware). El reómetro se equipó con un cono acrílico de 1° de 60 mm y la placa base se calentó a 25°C. Se preparó un gel como se describe anteriormente, y se dispensó un mililitro del gel de colágeno-PRP sobre la placa del reómetro. Se bajó el cono de modo que el gel se situara en una capa de 38 mm entre el cono y la placa, y se sometió a una tensión oscilatoria del 1 %. El módulo complejo viscoelástico del gel se registró a medida que avanzaba la gelificación. Se midieron el módulo elástico (G'), el módulo inelástico (G") y el ángulo de fase para todos los geles.

Estudios in vivo: Diseño experimental

En el estudio se utilizaron cinco cerdos Yorkshire hembras de 30 kg. Cuatro animales tuvieron transecciones de LCA bilaterales y para cada uno de estos, un lado fue tratado con una reparación de sutura aumentada con hidrogel de colágeno-PRp, mientras que, en el lado contralateral, la transección fue tratada con reparación de sutura sin hidrogel. En el animal restante, se realizó cirugía unilateral con la reparación aumentada y el lado contralateral se dejó como un control intacto contemporáneo. Uno de los animales desarrolló un seroma postoperatorio que fue tratado con antibióticos en el lado colágeno-PRP. Esta rodilla fue excluida del estudio. Por lo tanto, hubo un total de cuatro rodillas en el grupo de reparación aumentada y cuatro rodillas en el grupo sin aumento. Todos los animales sobrevivieron hasta 14 semanas y luego se sometieron a evaluación por resonancia magnética y eutanasia. Las rodillas se recogieron y congelaron inmediatamente hasta la prueba biomecánica. Se midieron la carga hasta la fluencia, la carga hasta la falla, la rigidez máxima y el desplazamiento hasta la rotura.

Procedimiento quirúrgico:

Se obtuvieron las aprobaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales para este estudio antes de cualquier procedimiento quirúrgico. En este estudio se utilizaron cinco cerdos Yorkshire hembras de 30 kg. Los cerdos fueron premedicados con telazol 4,4-6,6 mg/kg IM, xilazina 1,1-2,2 mg/kg IM y atropina 0,04 mg/kg. Fueron intubados y colocados en isoflurano 1-3% para el mantenimiento de la anestesia. Después de obtener la anestesia, los cerdos se pesaron y se colocaron en posición supina sobre la mesa de operaciones. Se afeitaron ambas extremidades traseras, se prepararon con clorhexidina seguido de pintura betadyne y se cubrieron estérilmente. No se utilizó torniquete. Para exponer el LCA, se realizó una incisión de cuatro centímetros sobre el borde medial del tendón rotuliano. La incisión se llevó a cabo de forma pronunciada a través de la membrana sinovial usando electrocauterio. La almohadilla grasa se liberó de su unión proximal y se resecó parcialmente para exponer el ligamento intermeniscal. Se liberó el ligamento intermeniscal para exponer la inserción tibial del LCA. Se realizó una maniobra de Lachman antes de liberar el LCA para verificar la estabilidad de la rodilla. Se aseguraron dos suturas de Vicryl # 1 en el muñón del LCA distal con un punto de Kessler modificado. El LCA se seccionó por completo en la unión de los tercios medio y proximal con una hoja del n.° 12. La sección completa se verificó visualmente y con una maniobra de Lachman repetida que se volvió positiva en todas las rodillas sin que se detectara un criterio de valoración significativo después de la sección completa. Todas las rodillas se irrigaron con solución salina estéril para eliminar el líquido sinovial antes de colocar el ancla de sutura. Se colocó un ancla de sutura absorbible (TwinFix AB 5.0 Ancla de sutura con sutura de DuraBraid (USP#2); Smith and Nephew, Inc, Andover MA) en la parte posterior de la muesca femoral. La rodilla fue irrigada con 500 cc de solución salina normal estéril para eliminar todo el líquido sinovial. Una vez que se logró la hemostasia, se empapó una esponja de colágeno en hidrogel de colágeno-PRP frío y se ensartó en las suturas y hacia arriba en la región del muñón del LCA proximal en la muesca. Las suturas se ataron utilizando la máxima tensión manual con las rodillas en flexión en reposo (aproximadamente 70° - 40° por debajo de la extensión completa en estos animales). Se mezcló un segundo lote de hidrogel de colágeno-PRP extrayendo secuencialmente alícuotas iguales de solución de colágeno neutralizado y PRP autólogo en el dispositivo de mezcla y calentamiento (FIGURA) y mezclando durante 1 minuto a 50 rpm y 13 mV, lo que resultó en temperaturas de inyección entre 28,9 y 32,4 °C. Esta mezcla se colocó entonces sobre la reparación del LCA para rellenar la muesca intercondílea. La rodilla se dejó en extensión de reposo mientras se realizaba la misma técnica de reparación del ancla de sutura con una esponja de colágeno idéntica, pero sin la adición del hidrogel de colágeno-PRP. Las incisiones se cerraron en múltiples capas con suturas absorbibles.

Los animales no se sujetaron después de la operación y se les permitió actividad ad lib. Una vez que los animales se recuperaron de la anestesia, se les permitió reanudar la actividad normal de la jaula y la nutrición ad lib. Buprenex 0,01 mg/kg IM una vez y un parche de Fentanyl 1-4 ug/kg transdérmico se administraron para la analgesia postoperatoria. Todos los animales soportaban peso sobre sus patas traseras 24 horas después de la cirugía. Después de catorce semanas in vivo, los animales se anestesiaron de nuevo y se sometieron a imágenes de RM in vivo utilizando el protocolo que se detalla a continuación.

Después de obtener las imágenes de resonancia magnética, los animales fueron sacrificados usando Fatal Plus a 1 cc/10 lb. Ningún animal tuvo complicaciones quirúrgicas de dificultad para caminar normalmente, enrojecimiento, calor e hinchazón de la rodilla, fiebre u otros signos de infección que hubieran requerido una eutanasia temprana.

Las seis rodillas de control intactas se obtuvieron de animales de la misma edad, sexo y peso después de la eutanasia después de procedimientos quirúrgicos en el tórax. Las patas traseras se congelaron a -20 °C durante tres meses y se descongelaron durante la noche a 4 °C antes de la prueba mecánica. Todas las demás condiciones de prueba para estas rodillas fueron idénticas a las de los grupos experimentales.

Formación de imágenes de resonancia magnética:

La formación de imágenes de resonancia magnética in vivo se realizó a 1,5 Tesla (GE Medical Systems, Milwaukee, WI) con una bobina de matriz en fase de ocho canales en los puntos de tiempo especificados. La exploración se realizó con las rodillas colocadas en máxima extensión (entre 30 y 45 grados de flexión). La RM convencional incluía imágenes potenciadas en T1, FSE PD y T2 en varios planos. Campo de visión (FOV): 16-18 cm, matriz: 256x256, (tiempo de repetición/ tiempo de eco) TR/TE: 400/16, 2500/32, 3000/66 mseg, longitud de tren de eco (ETL): 8, ancho de banda (BW): 15 kHz, espesor de corte: 3, espacio entre cortes: 1mm). La perfusión se evaluó utilizando una secuencia de eco de gradiente estropeada (TR/TE = 200/2 ms, ángulo de giro = 60, grosor de corte de 3 mm y resolución en el plano de 0,625 mm) con un agente de contraste intravenoso (Magnevist; Berlex, Wayne, NJ) 0,2 ml /kg inyectado 10 s después del inicio de la exploración. Se obtuvieron cinco imágenes por corte, con 78 s de diferencia. Se obtuvieron imágenes ponderadas en T1 poscontraste (FOV: 16 cm, matriz: 256x256,TR/TE: 400/9mseg, espesor de corte: 3 mm, espacio entre cortes: 1 mm ) en los planos coronal y sagital.

Pruebas biomecánicas:

El complejo LCA hueso-ligamento-hueso de ambas rodillas para cada cerdo se probó en tensión uniaxial. En resumen, la prueba se realizó con la rodilla flexionada a 30 grados de flexión ya temperatura ambiente. Inmediatamente después del preacondicionamiento, cada espécimen se ensayó hasta la falla en tensión uniaxial a 20 mm/min. Las imágenes digitales de corto alcance se adquirieron a 3 Hz usando una cámara digital de alta resolución con una lente macro (cámara Firewire de 662 megapíxeles PixeLINK PLA, PixeLINK, Ottawa ON, Canadá) para determinar el modo de falla. La carga de fluencia, el desplazamiento en la fluencia, el módulo tangente (pendiente máxima de la curva fuerza-desplazamiento), la carga máxima en la falla, el desplazamiento en la falla y el trabajo total hasta la falla (área bajo la curva fuerza-desplazamiento) se determinaron a partir de la curva fuerza-desplazamiento medida para cada complejo LCA hueso-ligamento-hueso. La carga de fluencia representó el punto a lo largo de la curva fuerza-desplazamiento normalizada donde el comportamiento mecánico del complejo LCA se apartó del comportamiento "lineal" y para los propósitos de este análisis se definió como el punto donde el módulo tangente disminuye en al menos un 2% de su valor máximo. El desplazamiento en fluencia fue el desplazamiento registrado en este mismo punto. La carga máxima es la carga normalizada máxima sostenida por el complejo LCA antes de la falla y el desplazamiento en la falla es el desplazamiento registrado a la carga máxima. La energía para la falla se derivó integrando el área total bajo la curva de fuerza-desplazamiento.

Análisis estadístico: Las mediciones de las pruebas mecánicas se compararon a las 4 semanas in vivo entre LCA intacto y LCA tratados solo con reparación de ancla de sutura y aquellos tratados con reparación de ancla de sutura más esponja de colágeno utilizando pruebas F del análisis multivariante de varianza (MANOVA) con intervalos de confianza del 95 % (IC). Una prueba F que supere el valor crítico de 3,84 se consideraría evidencia de significación estadística. Cada una de las seis variables (carga de fluencia, carga máxima, desplazamiento de fluencia, desplazamiento de falla, módulo tangente y energía de falla) siguió una distribución normal (de forma gaussiana) y, por lo tanto, los datos se presentan en términos de media y desviación estándar (DE). Se utilizaron pruebas t pareadas para evaluar las diferencias en los LCA tratados con reparación de ancla de sutura sola en comparación con el lado bilateral que recibió anclas de sutura con PRP. El análisis estadístico se realizó con SPSS versión 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Todos los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

RESULTADOS

Hematología

Se llevó una muestra de un mililitro de sangre completa de cada cerdo y una muestra de un mililitro de cada uno de los PRP al Instituto CBR para la Investigación Biomédica (Boston, MA) y se realizó un hemograma completo. Los resultados se sintetizan en la Tabla 4.

Pruebas Mecánicas

1.) El efecto del tiempo de mezcla

No hubo diferencia estadística entre mezclar los componentes de los geles durante 30 segundos o 60 segundos según lo medido por el módulo elástico máximo (112 34 Pa frente a 142 25 Pa). Los resultados se muestran en la Figura 13A. Sin embargo, la mezcla durante 120 segundos disminuyó significativamente el módulo elástico máximo a solo 5 2 Pa (ANOVA de variable única p<0,01). Se observaron hallazgos similares para el módulo inelástico (que se muestra en la Figura 13B). El módulo inelástico de las muestras mezcladas durante 30 segundos fue 27 8 Pa, y el módulo inelástico de las muestras mezcladas durante 60 segundos fue 35 7 Pa. Esto no representó una diferencia estadísticamente significativa. Sin embargo, el módulo inelástico fue significativamente menor para las muestras de mezcla de 120 segundos (2 0,4 Pa) en comparación con las muestras de tiempo de mezcla de 30 y 60 segundos (ANOVA de variable única p<0,001).

No hubo una diferencia estadísticamente significativa en la tasa de gelificación medida por el tiempo hasta 45°, el tiempo hasta G'max y el tiempo hasta G"max para las muestras mezcladas durante 30 o 60 segundos. Para las muestras mezcladas durante 30 segundos, el tiempo hasta 45° fue de 3,1 ± 0,0 min, el tiempo hasta Gmax fue de 16 ± 2,6 min y el tiempo hasta Gmax fue de 16 ± 2,8 min. Para las muestras mezcladas durante 60 segundos, el tiempo hasta 45° fue de 2,7 0,4 min, el tiempo G'max fue de 14,2 4,2 min y el tiempo hasta G”max fue de 14,2 4,3 min. Sin embargo, las muestras mezcladas durante 120 segundos tuvieron un tiempo a 45° de 0,3 ± 0,03 minutos, lo que representa una disminución estadísticamente significativa (ANOVA de variable única p<0,001) en comparación con las muestras mezcladas de 30 y 60 segundos. El tiempo hasta G'max (9,5 5,2 min) y G'max (8 6,8 min) no fue estadísticamente significativo al comparar las muestras de 30 segundos y 60 segundos con las muestras de 120 segundos.

2) El efecto de la velocidad de mezclado

Al examinar el efecto que tuvo la velocidad de mezcla en las propiedades reológicas de los hidrogeles de colágeno-PRP, no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre las tres velocidades de mezcla tanto para el módulo elástico (Figura 14A) como para el inelástico (Figura 14B) (ANOVA de variable única). La mezcla a 50 RPM dio como resultado un módulo elástico de 140 42 Pa y un módulo inelástico de 35 11 Pa. La mezcla a 100 RPM dio como resultado un módulo elástico de 112 41 Pa y un módulo inelástico de 27 10 Pa. La mezcla a 200 RPM dio como resultado un módulo elástico de 112 30 Pa y un módulo inelástico de 27 7 Pa.

Además, las distintas velocidades de mezcla no tuvieron un efecto estadístico sobre la velocidad a la que se produjo la gelificación medida por el tiempo hasta 45°, el tiempo hasta G'max y el tiempo hasta G"max. Para los geles mezclados a 50 RPM, el tiempo a 45° fue de 2,3 ± 0,0 min, el tiempo hasta Gmax fue de 16 ± 2,4 min y el tiempo hasta Gmax fue de 16 ± 2,5 min. Para los geles mezclados a 100 RPM, el tiempo hasta 45° fue de 2,8 ± 0,5 min, el tiempo hasta Gmax 16 ± 1,6 min y el tiempo hasta Gmax fue 16 ± 1,7 min. Para los geles mezclados a 200 RPM, el tiempo a 45° fue de 2,7 0,6 min, el tiempo a G'max 17 4,1 min y el tiempo a G'max fue de 16,7 3,6 min.

3) El efecto de la tasa de calentamiento

El aumento de la tasa de calentamiento de los hidrogeles de colágeno-PRP no tuvo un efecto estadístico sobre el módulo viscoelástico de los geles. Los geles calentados a 9 mV registraron un módulo elástico de 106 20 Pa (Figura 15A), y un módulo inelástico de 25 4 Pa (Figura 15B). Los geles calentados a 11 mV tenían un módulo elástico de 93 13 Pa y un módulo inelástico de 22 3,1 Pa. Los geles calentados a 13 mV tenían un módulo elástico de 89 56 Pa y un módulo inelástico de 22 16 Pa. Ninguno de estos representa diferencias estadísticamente significativas.

Para los geles calentados a 9 mV, el tiempo hasta 45° fue de 3,6 0,4 min, el tiempo hasta Gmax de 17,4 1,0 minutos y el tiempo hasta Gmax de 16,4 2,0 minutos. Los geles calentados a 11 mV tenían un tiempo a 45° de 2,4 0,6 minutos, un tiempo a G'max de 16 _,5 minutos y un tiempo a G'max de 15 0,8 minutos. Finalmente, los geles calentados a 13mV tuvieron un tiempo a 45° de 2.0 0,5 minutos, un tiempo a G'max de 17 1.2 minutos, y un tiempo a G'max de 16 1,5 minutos. Comparando estos valores, la única comparación estadísticamente significativa fue entre las tasas de calentamiento de 9 mV y 13 mV para el tiempo hasta 45° (ANOVA de variable única p<0,01).

4) El efecto de la temperatura de inyección

Un aumento en la temperatura de inyección resultó en una disminución de las propiedades mecánicas de los hidrogeles de colágeno-PRP. Los geles inyectados en la placa del reómetro entre 24°C y 26°C tenían un módulo elástico de 156 26 Pa (Figura 16A) y un módulo inelástico de 39,4 7,2 Pa (Figura 16B). Los geles inyectados en la placa del reómetro entre 26 °C y 28 °C tenían un módulo elástico de 128,7 15,7 Pa y un módulo inelástico de 32,3 2,7 Pa. Los geles inyectados en la placa del reómetro entre 28 °C y 30 °C tenían un módulo elástico de 90,3 11,4 Pa y un módulo inelástico de 22,3 3,6 Pa. Finalmente, los geles inyectados en la placa del reómetro entre 30 °C y 32 °C tenían un módulo elástico de 54,6 30,4 Pa y un módulo inelástico de 14,2 6,5 Pa. Para el módulo elástico, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los geles inyectados entre 24 °C y 26 °C, y todos los demás grupos (ANOVA de variable única p<0,01), y una diferencia estadísticamente significativa entre los geles inyectados entre 26 °C y 28°C, y los geles inyectados entre 30°C y 32°C. Para el módulo inelástico, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los geles inyectados a 24°C-26°C, y los geles inyectados a 28°C-30°C, y los geles inyectados a 30°C-32°C (ANOVA de variable única p<0,005). También hubo una diferencia estadísticamente significativa en el módulo inelástico entre los geles inyectados a 26°C-28°C y los geles inyectados a 30°C-32°C (ANOVA de variable única p<0,005).

La tasa de gelificación, medida por el tiempo hasta 45°, el tiempo hasta G'max y el tiempo hasta G"max, se vio afectada por el aumento de la temperatura de inyección. Para los geles inyectados entre 24°C y 26°C, se encontró que el tiempo hasta 45° fue de 2,3 ± 0,1 min, el tiempo hasta Gmax fue de 14,6 ± 4,5 min y el tiempo hasta Gmax fue de 14,5 ± 4,7 minutos. Para los geles inyectados entre 26°C y 28°C, el tiempo hasta 45° fue de 1,6 ± 0,3 min, el tiempo hasta Gmax fue de 10,5 ± 3,1 min y el tiempo hasta Gmax fue de 9,4 ± 2,1 min. Para los geles inyectados entre 28°C y 30°C, se encontró que el tiempo hasta 45° fue de 1,5 ± 0,0 min, el tiempo hasta Gmax fue de 10,6 ± 3,3 min y el tiempo hasta Gmax fue de 9.0 ± 2,1 minutos Finalmente, para los geles inyectados entre 30°C y 32°C, se encontró que el tiempo hasta 45° fue de 1.0 0,2 mins, el tiempo para G'max fue de 8,6 0,8 minutos, y el tiempo para G'max fue de 8,5 0,9 minutos Estadísticamente, no hubo diferencias significativas entre los grupos para el tiempo hasta la G'max y el tiempo hasta la G"max; sin embargo, hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para el tiempo hasta los 45°. Hubo una disminución significativa en el tiempo a 45° al comparar los geles inyectados entre 24°C y 26°C con todos los demás grupos de temperatura de inyección (ANOVA de variable única p<0,003) (Figura 17). También hubo una diferencia significativa para el tiempo a 45° entre el grupo de 26°C-28°C y el grupo de 30°C-32°C, y entre el grupo de 28°C-30°C y el de 30°C- Grupo de 32°C (ANOVA de variable única p>0,005).

Resultados in vivo: El efecto de la temperatura de inyección sobre la resistencia de reparación a las 14 semanas se muestra en la Figura 18. La fuerza promedio en el grupo de control de esponja sola fue de 206N. La temperatura del gel en el momento de la inyección afecta significativamente tanto a las propiedades mecánicas in vitro del hidrogel como a las propiedades in vivo de la cicatrización del tejido inducida por el hidrogel. Las temperaturas de menos de 26 °C produjeron los geles más fuertes in vitro y las temperaturas de 28 °C produjeron los ligamentos de curación in vivo más fuertes.

EJEMPLO 6 : Las plaquetas mejoran la resistencia del injerto de LCA y la toxicidad de rodilla posoperatoria en un modelo caprino.

Las lesiones de LCA afectan a más de 200,000 pacientes cada año en los EE.UU. Si bien la reconstrucción del LCA es un procedimiento confiable para restaurar macroscópicamente la estabilidad de la rodilla, la biomecánica normal de la rodilla no se restaura y un porcentaje clínicamente relevante de pacientes presenta una laxitud excesiva después de la operación. La curación temprana del injerto de reconstrucción de LCA con propiedades estructurales disminuidas podría explicar en parte el trabajo previo en humanos que muestra que la mayor parte del aumento en la laxitud de la rodilla después de la operación ocurre en los primeros meses después de la cirugía. Por lo tanto, las estrategias que podrían mejorar las propiedades estructurales tempranas (resistencia y rigidez) del injerto de LCA son deseables como una solución potencial para reducir el riesgo de laxitud anormal de la rodilla después de la cirugía reconstructiva de LCA.

Hemos demostrado mediante la evaluación histológica de la curación de un modelo de lesión del LCA parcial biomecánicamente estable el perfil del factor de crecimiento. En la curación extraarticular normal del ligamento colateral medial (MCL) y el tendón rotuliano (PT), la expresión y el momento fueron cualitativamente similares a la colocación de un hidrogel de plaquetas de colágeno en el LCA parcial. Esto contrasta con la falta de curación y la expresión severamente limitada del factor de crecimiento en la lesión parcial del LCA sin hidrogel de plaquetas de colágeno (control). Se han aplicado factores de crecimiento individuales específicos (PDGF frente a TGF y EGF frente a VEGF) a modelos de reconstrucción de LCA en ovejas o caninos. Ambos factores de crecimiento que abundan en las plaquetas (PDGF y TGF) demostraron una carga y rigidez mejoradas a las 12 semanas después de la operación. Sin embargo, la aplicación de un factor de crecimiento para estimular la revascularización (VEGF) debilitó el injerto a las 12 semanas. Se desconocen los puntos de tiempo anteriores (6 semanas), la dosis óptima, la combinación o el método de aplicación para mejorar las propiedades estructurales tempranas cuando el injerto de reconstrucción del LCA está cerca del punto más débil. Por lo tanto, la estrategia para aplicar los propios factores de crecimiento del cuerpo para promover el retorno de las propiedades estructurales del injerto de reconstrucción del LCA requiere más investigación.

Este estudio se realizó para demostrar que la colocación de un gel de plaquetas alrededor de un injerto de LCA en el momento de la cirugía mejoraría las propiedades mecánicas iniciales del injerto (máxima carga y rigidez). También se demostró que la concentración de plaquetas alrededor del injerto tendría una correlación directa con la carga temprana hasta el fracaso del injerto de LCA.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Modelo animal: Doce machos cabríos cruzados nubios castrados de 4 años de edad se sometieron a una reconstrucción cruzada anterior unilateral utilizando un autoinjerto de hueso-tendón rotuliano-hueso. En el grupo experimental, a seis cabras se les aumentó el injerto con un hidrogel de colágeno y plaquetas, mientras que a las seis cabras de control se les aumentó solo el hidrogel de colágeno. Las cirugías se realizaron alternativamente entre las rodillas derecha e izquierda dentro de cada grupo de tratamiento. A los animales se les permitió la actividad de la jaula sin restricciones mientras los injertos de reconstrucción del LCA cicatrizaban. A las seis semanas del postoperatorio fueron sacrificados con una sobredosis de solución de pentabarbitol (Euthasol; 1 cc/101bs). En el momento de la eutanasia, tanto las rodillas de control reconstruidas como las contralaterales se extrajeron y almacenaron a -20 °C antes de la prueba mecánica.

Procedimiento quirúrgico: Los animales fueron tranquilizados antes de la operación usando acepromacina (10 mg IM). A continuación, se indujo la anestesia con pentotal sódico (5-8 mg/Kg iv) y se mantuvo durante la cirugía con isofluorano.

Se usó una hoja de 15 para hacer una incisión desde la parte superior de la rótula hasta debajo de la tuberosidad tibial justo medial de la línea media. La bursa prerrotuliana se cortó en línea con la incisión de la piel para exponer el paratendón. Se realizó un corte longitudinal en el centro del paratendón para exponer el tendón rotuliano. Se palparon los bordes medial y lateral del tendón rotuliano y se marcó un injerto de 6 mm de ancho con el electrocauterio. El bloqueo patelar fue de 15 x 6 mm, dejando intactos 10 mm de rótula superiormente. El bloque de hueso tibial era de 10 x 6 mm. El injerto extraído se moldeó para encajar en bloques óseos de 6 mm de diámetro y se colocaron orificios perforados de 1,5 mm en el bloque óseo a cada lado. Debido a que la longitud del tendón rotuliano es mayor que el LCA, el bloque de hueso tibial se dobló sobre el tendón rotuliano y se suturó en su lugar para hacer un bloque de hueso-tendón de 8 mm en este lado para acortarlo. Se colocaron dos suturas Ethibond #2 en cada bloque óseo. La muesca intracondílea se expuso a través del defecto central en el tendón rotuliano al seccionar la almohadilla de grasa. El ligamento intermeniscal no se cortó. Se verificó una prueba de Lachman para determinar la estabilidad inicial de la rodilla. Se usó una hoja #11 para liberar el LCA de la parte posterior de la muesca, y el LCA se extrajo liberando el ligamento de su inserción tibial. Se realizó un Lachman manual para verificar la pérdida funcional completa del LCA. El túnel tibial se perforó utilizando la guía tibial fijada a 65°. El pasador se perforó en exceso con una broca de 8 mm y se eliminó todo el tejido blando. Se realizó muescaplastía con cureta. Se hiperflexionó la rodilla y se colocó una guía de broca femoral desplazada de 6 mm (Arthrex Inc, Naples FL) en la parte posterior de la muesca en la posición de las 10:30. l pasador de paso se perforó a través del fémur y luego se sobreperforó con una broca de 7 mm hasta 20 a 25 mm. En todos los casos se verificó la integridad de la pared posterior del túnel femoral. El injerto se colocó en el túnel femoral primero con suturas de Ethibond y luego se aseguró en el fémur con un tornillo de interferencia de 5x20 mm (Arthex, Inc.). Luego, el injerto se tiró retrógrado hacia el túnel tibial. Con la rodilla a 60 grados de flexión, el injerto se tensó firmemente y se aseguró en el túnel tibial con un tornillo de interferencia de 6x20 mm (Arthex, Inc.). La fijación tibial se aumentó con suturas al periostio si la fijación tibial no se consideraba lo suficientemente estable.

Para el grupo experimental, el injerto se aumentó con una esponja de colágeno colocada entre el LCA y el LFC utilizando un elevador más libre, con parte de la esponja colocada en la parte anterior del injerto. Se colocaron dos centímetros cúbicos de un hidrogel de plaquetas de colágeno (n = 6) sobre la esponja. El grupo de control era idéntico excepto que no se añadieron plaquetas al hidrogel de colágeno. Después de diez minutos, la rodilla se cerró en capas. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante 1 hora después de la colocación del gel para mantener las rodillas en la posición de reposo y permitir la gelificación completa.

La analgesia postoperatoria se controló con Buprenorfina (0,01 mg/Kg IM, dos veces al día) y Ketoprofeno (1 mg/Kg IM, una vez al día) durante cinco días. Se administró ampicilina (10 mg/Kg SC, dos veces al día) durante 10 días para reducir el riesgo de infección.

Fabricación de Gel de Colágeno y Gel de Colágeno-Plaquetas: El colágeno de cola de rata se solubilizó en ácido como se describe en este documento. Para el grupo de colágeno, el colágeno se neutralizó a un pH de 7,4 y se agregó al sitio quirúrgico justo después de la neutralización. Para agregar plaquetas al gel, inicialmente se intentó la producción de plasma rico en plaquetas; sin embargo, debido a la similitud en el tamaño y el peso de las plaquetas caprinas y los glóbulos rojos, los protocolos de centrifugación que usaron de 150 a 250 g entre 20 y 30 minutos dieron como resultado una disminución efectiva de los glóbulos rojos en el PRP, pero los recuentos de plaquetas en la fracción de PRP fueron menos del 100% de la sangre completa con todos los protocolos. Usando el protocolo más efectivo determinado ex vivo, 250 g durante 30 minutos, el rendimiento de plaquetas en el PRP caprino promedió 102 % /- 68 % (media /- desviación estándar) para las 12 cabras en este estudio cuando se usó el MPV medido para calcular el número de plaquetas. Además, se observaron grandes variaciones en el enriquecimiento dentro del grupo. Por lo tanto, elegimos usar sangre autóloga caprina completa para el grupo de colágeno y plaquetas. Esto dio como resultado que la concentración de plaquetas en sangre periférica determinara la concentración de plaquetas administradas en el hidrogel de colágeno-plaquetas. Además, medimos la concentración de plaquetas en sangre periférica de todos los animales, tanto del grupo experimental como del control. Se extrajeron cincuenta y cuatro cc de sangre de cada animal en una jeringa que contenía 6 cc de ácidocitrato-dextrosa como un anticoagulante. En el momento de la colocación del gel, el colágeno se neutralizó y se mezcló con la sangre en una proporción de colágeno:sangre de 4:1 y se añadió el gel de colágeno-plaquetas al injerto.

Pruebas Mecánicas: Después de recolectar todos los especímenes, las rodillas se descongelaron y se prepararon para las pruebas de laxitud y falla. Los tejidos blandos que rodean la tibia y el fémur se disecaron dejando intacta la cápsula articular. Luego, la tibia distal y el fémur proximal se encapsularon en tubos de PVC utilizando un material de encapsulado (SmoothCast 200; Smooth-On, Easton PA) para que pudieran montarse para las pruebas mecánicas.

Las respuestas de desplazamiento de carga anteroposterior de las articulaciones intactas se midieron utilizando un accesorio diseñado a medida con la rodilla bloqueada a 30° y 60° de flexión (Figura 19) (Fleming et al JOR 19: 841,2001). Se aplicaron cargas de cizallamiento dirigidas anterior y posterior de ±60 Newton al fémur con respecto a la tibia utilizando un sistema de prueba de materiales MTS 810 (MTS, Prairie Eden, MN) mientras se medía el desplazamiento AP. La rotación axial de la tibia se bloqueó en la posición neutra y todos los demás movimientos se dejaron sin restricciones.

Después de completar las pruebas de laxitud AP, la tibia y el fémur se colocaron de manera que el eje mecánico del LCA fuera colineal con el eje de carga del sistema de prueba de materiales (Woo et al; AJSM 19: 217, 1991; Tohyama et al; AJSM 24: 608, 1996). El ángulo de flexión de la rodilla se fijó en 30°. La tibia se montó en la base del MTS a través de una plataforma X-Y deslizante. El fémur no estaba restringido a la rotación. Esto permitió que la muestra buscara su propia posición para que la carga se distribuyera sobre la sección transversal del injerto de cicatrización cuando se aplicó la carga de tracción.

La cápsula articular, los meniscos, los ligamentos colaterales y el LCP se disecaron de la articulación dejando intactos el injerto del LCA y la masa cicatricial. A continuación, los complejos de fémur-injerto-tibia se cargaron en tensión hasta la falla a 20 mm/min mientras se registraban los datos de carga-desplazamiento de la falla. Se realizaron protocolos idénticos en las rodillas contralaterales con ACL intacto. A partir del trazado de desplazamiento de carga de ^mT^s, se determinaron la carga de falla, el desplazamiento de falla y la rigidez lineal.

Exclusión: El primer animal operado fue asignado al grupo colágeno-plaquetas. Hubo dificultades técnicas con la recolección del injerto en este animal y al final de la cirugía, se decidió excluir a este animal del análisis. Además, uno de los animales del grupo de colágeno solo tenía un injerto con una resistencia a la falla más de tres veces mayor que cualquier otro animal de cualquier grupo, por lo que se excluyó del análisis restante debido a la regla de 3 sigma. Por lo tanto, ningún animal está representado en ninguna estadística de grupo ni tampoco están representados gráficamente en ninguna figura.

Análisis estadístico: Se realizaron comparaciones de valores de laxitud AP, resistencia a la falla y valores de rigidez entre los grupos de colágeno (solo portador) y colágeno plaquetario. Se calcularon las diferencias para cada uno de estos parámetros entre la rodilla tratada y la rodilla de control contralateral. Se realizaron pruebas t no pareadas para determinar si las diferencias eran significativas (p < 0,05). Se realizaron análisis de correlación para determinar la asociación entre el recuento de plaquetas sistémicas y la resistencia del injerto después de 6 semanas de cicatrización.

RESULTADOS

Resultado quirúrgico: Once de los 12 animales se recuperaron bien de la cirugía. Sin embargo, una cabra del grupo de solo colágeno murió un día después de la cirugía. La autopsia reveló aterosclerosis extensa y se pensó que la causa de la muerte estaba relacionada con el corazón. En el momento de la eutanasia, todos los animales parecían caminar normalmente.

Apariencia bruta: Los observadores estaban cegados al grupo al recolectar y clasificar los especímenes. No hubo diferencias entre los grupos de colágeno y colágeno-plaquetas en cuanto a la apariencia macroscópica en términos de tasa de reforma del ligamento mucoso, tasa de cicatrización o formación de adherencias desde la masa de la cicatriz de muesca hasta el defecto de cosecha del tendón rotuliano o cantidad de adherencias articulares observadas. No hubo diferencia entre los grupos en cuanto a si la masa cicatricial infiltraba solo la sección más craneal del injerto o si se extendía desde el fémur hasta la tibia; ambos hallazgos se observaron en los ligamentos de ambos grupos.

Biomecánica: Con un ángulo de flexión de la rodilla de 60 grados de flexión, la laxitud AP de las rodillas fue un 34 % menor en el grupo de colágeno y plaquetas que en el grupo de colágeno, una diferencia que fue estadísticamente significativa (17,2 /- 3,3 mm frente a 23,1 / - 4,0 mm; media /- DE; p < 0,05). A 30 grados de flexión, también hubo una disminución del 40% en la laxitud AP de las rodillas en el grupo de plaquetas de colágeno; sin embargo, la diferencia se acercó a la significación estadística, pero no la alcanzó, debido en parte a las grandes desviaciones estándar observadas dentro de cada grupo (grupo de colágeno y plaquetas 14,3 /- 4,0 mm frente al grupo de colágeno 20 /- 4,5 mm; p < 0,09).

La fuerza del grupo colágeno-plaquetas fue un 30 % mayor que la del grupo colágeno (139 /- 41N frente a 108 /- 47N; ambas medias /- DE), una diferencia que no fue estadísticamente significativa (p > 0,30). Los valores en ambos grupos fueron aproximadamente el 10 % de la fuerza del LCA intacto. No se encontró que el tamaño del túnel femoral, el tamaño de la esponja de colágeno y la cantidad de gel de colágeno fueran predictores significativos de la resistencia a la falla.

No hubo diferencia significativa entre los grupos en términos de desplazamiento de falla. El grupo de colágeno falló en 9,3 /- 5,1 mm (media /- SD) y el grupo de colágeno y plaquetas falló en 8,4 /- 4,4 mm (p > 0,80). Curiosamente, ambos valores fueron mucho más bajos que el desplazamiento de falla en los ligamentos intactos contralaterales, que promediaron 20,8 /- 1,8 mm. Tampoco hubo diferencias significativas en la rigidez lineal entre los grupos, con el grupo de colágeno con una rigidez de 22 /- 15 N/mm y el grupo colágeno-plaqueta que tiene una rigidez de 26 /- 14 N/mm (media /- DE; p > 0,60). Ambos grupos tenían menos de un tercio de la rigidez promedio del ligamento intacto (90 /- 34 N/mm; media /- SD)

Los recuentos de plaquetas sistémicas más altos se correlacionaron significativamente con una carga de falla más alta (Figura 20: RA2>0,67) y mayor rigidez lineal del ligamento (Figura 21: RA2 > 0,80) utilizando un modelo de regresión lineal. No hubo una correlación significativa entre la concentración de plaquetas y el desplazamiento de falla (RA2 = 0,40) o la laxitud AP a 60 grados (RA2 = 0,44) con el número de animales probados. Los datos se representan gráficamente en las Figuras 22 y 23. La figura 22 es una gráfica que representa la fuerza de la articulación en función del recuento de plaquetas. Las figuras 23A y 23B son diagramas de dispersión bivariados con bandas de confianza del 95 % de regresión. La figura 23A representa la carga fallida en función del recuento de plaquetas. La figura 23B representa la rigidez en función del recuento de plaquetas.

Por lo tanto, la laxitud AP medida a 30 grados de flexión de la rodilla mejoró significativamente en el grupo experimental de plaquetas en comparación con el tratado con el portador solo (154 % /- 44 % frente a 355 % /- 55 %; p = 0,03). No hubo diferencia significativa entre la carga máxima del injerto de LCA en los dos grupos; sin embargo, la carga máxima del injerto se correlacionó directamente con el recuento de plaquetas sistémicas tanto en el grupo experimental (R2 = 0,95) como en el de control (R2 = 0,85). La adición de plaquetas al hidrogel de colágeno mejoró la laxitud AP en comparación con informes anteriores de rodillas reconstruidas del LCA a las seis semanas.

La adición de plaquetas sanguíneas al hidrogel de colágeno (grupo experimental) resultó en una reducción clínicamente significativa de la laxitud de la rodilla seis semanas después de la reconstrucción del LCA con tendón rotuliano con autoinjerto. Además, el recuento de plaquetas sistémicas de los animales se correlacionó directamente con la carga máxima tanto para el grupo experimental (hidrogel de colágeno-plaquetas) como para el grupo de control (hidrogel de colágeno). Ambos hallazgos destacan la función que desempeñan las plaquetas sanguíneas en la cicatrización del injerto de reconstrucción del LCA con una reducción probablemente clínicamente relevante en la laxitud AP postoperatoria temprana no deseada.

La mejora en la laxitud AP fue evidente cuando las rodillas se probaron en 30 grados de flexión (extensión completa en la rodilla caprina). En esta posición, las rodillas tratadas con hidrogel de colágeno y plaquetas tenían solo un 54 % más de laxitud AP que las rodillas contralaterales con LCA intactos, mientras que las rodillas tratadas con hidrogel de colágeno solo tenían un 200 % más de laxitud que las rodillas intactas. A 60 grados de flexión, la diferencia entre los grupos fue menor e insignificante. Este hallazgo sugiere una función potencial para reducir la laxitud clínica temprana no deseada. Se desconoce si el efecto de las plaquetas fue sobre la cicatrización del injerto o sobre las estructuras capsulares. Se necesita una mayor optimización de la concentración de plaquetas, así como del momento de la administración. Los grandes aumentos en la laxitud AP observados en el grupo de hidrogel de colágeno solo son consistentes con los de estudios previos de reconstrucción de LCA con injertos autógenos de tendón rotuliano utilizando el modelo de cabra (Abramowitch JOR 21:707, 2003; Cummings JOR 20:1003, 2002; Papageorgiou AJSM 29:620, 2001; Jackson AJSM 21:176, 1993). Papageorgiou et al informaron aumentos del 238% y 285% en la laxitud AP con la rodilla a 30 grados y 60 grados de flexión, respectivamente, después de 6 semanas de curación. La mejora observada en el grupo de colágeno y plaquetas es también una mejora notable de los resultados publicados previamente sobre ACLR en ovejas, donde la laxitud AP de la rodilla aumentó de 2,0 /- 0,7 mm en la rodilla intacta a 8,3 /- 2,3 mm seis semanas en un modelo usando fijación con tornillo de interferencia femoral y tibial como lo hicimos en este estudio (HUNT et al Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2006 Dec;14(12): 1245-51.).

El punto de tiempo de seis semanas es bien reconocido como el punto más bajo de la fuerza en la reconstrucción de ACL para modelos animales. Los valores de fuerza en ambos grupos fueron de aproximadamente el 10 % del LCA intacto, que es ligeramente más alto que los informes anteriores del 3 % en el modelo de oveja (Hunt et al Knee Surg Sports T raumatol Arthrosc. 2006 Dec;14(12): 1245-51.), y típico para el modelo de cabra después de 6 semanas de curación (Papgeorgiou AJSM 29:620, 2001; Abramowitch 21:708, 2003). Mediante la aplicación de plaquetas en un hidrogel de colágeno estabilizado, hemos simulado el entorno "natural" que se encuentra cuando las plaquetas se depositan en un coágulo de fibrina para la curación extraarticular. Además, las plaquetas contienen una multitud de factores de crecimiento además de TGF-p y PDGF en la concentración adecuada para la curación extraarticular. Además, el costo del TGF, PDGF o EGF recombinante supera con creces el costo de aplicar plaquetas de sangre para autoinjerto.

Las limitaciones del estudio incluyen la incapacidad para controlar la rehabilitación en los animales y la incapacidad en el modelo caprino para proporcionar concentrados de plaquetas aumentados de dos a cuatro veces en el hidrogel de colágeno. Los rumiantes deben estar de pie en el período posoperatorio muy temprano, por lo que en este modelo es difícil proteger el injerto de LCA de las cargas que soportan el peso. El vendaje y la inmovilización no son prácticos ni efectivos en este modelo animal. La incapacidad para concentrar las plaquetas de la sangre limita la capacidad de descubrir si el aumento del recuento de plaquetas por encima del de la sangre completa continuaría mejorando la cicatrización del injerto de LCA y reduciendo aún más la laxitud posoperatoria. Sin embargo, independientemente de las limitaciones del modelo, los datos demuestran claramente que la adición de plaquetas mejora la cicatrización del injerto y mejora la estabilidad AP de la rodilla después de la reconstrucción del LCA en un momento temprano en el modelo caprino.

EJEMPLO 7 : Técnicas de sutura que restauran la laxitud AP normal de la rodilla después de la sección del LCA

Los datos descritos en este documento demuestran que las técnicas de sutura que van del fémur a la tibia pueden restaurar la laxitud anteroposterior normal de la rodilla en el momento cero, especialmente si se atan con una pequeña flexión y el punto de unión tibial se encuentra dentro de la huella normal del LCA. Como se muestra a continuación, la reparación del muñón tibial del LCA (técnica de Marshall) resultó en rodillas con más de 5 mm de laxitud AP mayor que las rodillas con un LCA intacto. La reparación con suturas en el hueso usando puntos de fijación dentro de la huella normal del LCA resultó en laxitud de la rodilla dentro de los 0,5 mm de las rodillas con un LCA intacto cuando las suturas se ataron con la rodilla flexionada a 60 grados. Se observaron aumentos de laxitud de 1 a 3 mm si las suturas se anudaban con la rodilla en 30 grados de flexión o en túneles más posteriores.

La reparación primaria del LCA fue iniciada por John Marshall in the 1960's (Marshall JL, Warren RF, Wickiewicz TL, Clin Orthop. 1979;143:97-106, Marshall JL, Warren RF, Wickiewicz TL. Am J Sports Med. 1982;10:103-107.). Se perdió el favor de esta técnica debido a la alta tasa de ruptura (Feagin JA, Jr., Curl ^wW. Am J Sports Med. 1976;4(3):95-100.) y la mejora limitada sobre el tratamiento no quirúrgico observado en pacientes sometidos a reparación primaria (Engebretsen L, Benum P, Fasting O, Molster A, Strand T. American Journal of Sports Medicine. 1990;18(6):585-590, Grontvedt T, Engebretsen L, Benum P, Fasting o, Molster A, Strand T. Journal of Bone & Joint Surgery -American Volume.

1996;78(2):159-168.). Sin embargo, los descubrimientos recientes del inventor han sugerido que la amplificación de la respuesta de reparación del LCA desgarrado mediante un andamiaje de bioingeniería para administrar factores de crecimiento en el sitio de la herida puede resultar en la curación funcional del LCA cortado (Murray MM, Spindler KP, Devin C, et al. J Orthop Res. Apr 2006;24(4):820-830, Murray MM, Spindler KP, Ballard P, Welch TP, Zurakowski D, Nanney LB. J Orthop Res. Apr 52007).

Desde el trabajo de Marshall que describe su técnica de reparación primaria, no ha habido mucho interés ni trabajo publicado sobre la comparación de técnicas de sutura para la reparación primaria del LCA. Esto contrasta marcadamente con la cantidad de artículos publicados cada año sobre la técnica de reconstrucción del LCA, incluidos artículos sobre tipos de fijación, colocación de túneles y número de haces para reconstruir. Con el reciente interés renovado en la reparación primaria, se necesita trabajo adicional para definir la laxitud AP de la rodilla después de la reparación con sutura del LCA utilizando diversas técnicas. La definición de estas variables quirúrgicas permitirá realizar pruebas más precisas de nuevas construcciones de ingeniería tisular en modelos animales, y también comenzará a definir las técnicas más apropiadas para su eventual uso en humanos.

En este estudio se probaron dos hipótesis. Una primera hipótesis fue que la reparación con suturas podría restaurar la laxitud AP normal de la rodilla en el tiempo cero, y una segunda hipótesis fue que el ángulo de flexión en el que se anudaron las suturas tendría un efecto significativo en la laxitud AP resultante de la rodilla.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se recuperaron seis patas traseras de cerdos Yorkshire hembra de 30 kg en el momento de la eutanasia para otros estudios aprobados por IACUC. Las extremidades se congelaron hasta el momento de la prueba (aproximadamente 3 semanas). Las extremidades se descongelaron en agua tibia la mañana de la prueba. Las rodillas se aislaron seccionando el fémur justo por debajo del trocánter menor y seccionando la tibia 2 cm por encima de la articulación del tobillo. Se retiraron las uniones musculares de la tibia y el fémur con cuidado de no violar la cápsula articular de la rodilla. También se eliminó todo el músculo extracapsular. El fémur y la tibia tenían tornillos para paneles de yeso colocados a intervalos a lo largo del hueso (cuatro tornillos en cada hueso) para ayudar con la sujeción en el material de encapsulado, luego los huesos se encapsularon secuencialmente en tuberías de cloruro de polivinilo de 2" de diámetro utilizando material de fundición Smooth-On. Las rodillas se envolvieron en toallas humedecidas con solución salina normal hasta la prueba.

La prueba de laxitud AP se realizó utilizando una plantilla personalizada montada en una máquina de prueba Instron (Figura 24). El fémur se montó en un dispositivo móvil, lo que permitió posicionar la rodilla en 60 grados de flexión. La rodilla de cerdo se extiende solo 30 grados por debajo de la extensión completa, por lo que se pensó que la posición de 60 grados correspondía a la posición de 30 grados en los humanos. Un estudio piloto demostró que la posición de 30 grados era menos sensible a los cambios en la laxitud AP de la rodilla y, por lo tanto, en este estudio solo se utilizó la posición de 60 grados. Una vez posicionada la rodilla en el dispositivo, se aplicó una carga cíclica de 30N al fémur. Esto resultó en un desplazamiento femoral anterior a 30 N seguido de un desplazamiento femoral posterior con respecto a la tibia a 30 N. La magnitud de los desplazamientos a medida que se aplicó la carga se midió para cada ciclo a 100 Hz y se graficó usando Excel para dar una curva de carga-desplazamiento (Figura 25).

Cada una de las seis rodillas se probó en estado intacto (INTACT). Después de esa prueba, se realizó una disección para retirar la rótula y el tendón rotuliano y exponer la muesca y se repitió la prueba (PAT DEFICIENT). La muestra se volvió a llevar a la mesa de disección y el LCA se seccionó por completo y se repitió la prueba (ACL DEFICIENT).

Luego se prepararon las rodillas para varias técnicas de reparación primaria. En primer lugar, se colocó un ancla de titanio TwinFix de 3,5 mm (Smith-Nephew, etc.) en la muesca posterolateral del fémur, en la posición de las 11:00 para las rodillas derechas y la posición de las 1:00 para las rodillas izquierdas. Esta ancla tenía dos suturas Durabraid pasadas a través del ojal del ancla, lo que resultó en cuatro hebras disponibles para reparación. Estas suturas se utilizaron para todas las pruebas. Se realizó una técnica de reparación Marshall de cuatro hilos pasando dos suturas Vicryl n.° 1 en bucle a través del muñón tibial a varias profundidades y asegurando estos cuatro extremos a los cuatro extremos del Durabraid para una reparación Marshall de cuatro hebras. Las suturas se ataron primero con la rodilla primero en 30 grados de flexión (MARSHALL 30) y luego en 60 grados de flexión (MARSHALL 60). Se desanudaron las suturas y se resecó el muñón tibial del LCA para revelar los sitios de inserción tibial. En el cerdo, hay dos sitios discretos de inserción tibial del LCA: uno es posterolateral, detrás de la unión de la asta anterior del menisco medial, y el segundo es anteromedial, ubicado entre la unión de la asta anterior del menisco medial y la unión del asta anterior del menisco lateral (Figura 26). Se utilizó un puntero tibial (ACUFEX) para colocar un pin guía de 2,4 mm desde el borde anteromedial de la tibia hasta cada uno de estos sitios de inserción. Se tuvo cuidado de mantener un mínimo de 5 mm entre cada uno de los sitios de perforación en la tibia anteromedial. Se hizo un tercer orificio justo medial al vértice de la espina tibial lateral. Estos sitios de perforación tibial se etiquetaron como ANTERIOR para la inserción del paquete AM, MEDIO para la inserción del paquete PL y POSTERIOR para el sitio de la columna tibial lateral. En cuatro de las rodillas, la perforación realmente atravesó el material del relleno para llegar al sitio adecuado.

Luego se realizó la prueba de laxitud AP con suturas pasadas a través de los orificios óseos anterior, medio o posterior y atadas sobre un endobotón. Las suturas a través de cada túnel se ataron primero en 30 grados de flexión y luego en 60 grados de flexión y luego se sometieron a pruebas de laxitud AP en la posición de 60 grados. Por ejemplo, cada rodilla tenía las cuatro suturas colocadas a través del túnel anterior y unidas sobre un endobotón con la rodilla a 30 grados de flexión. Esta prueba fue etiquetada (ANTERIOR 30). Luego se desataron las suturas y se volvieron a atar con la rodilla en 60 grados de flexión y se midió la laxitud AP de la rodilla (ANTERIOR 60). A continuación, se desataron las suturas, se pasaron por el túnel medio, se ataron a 30 grados y se probaron (MEDIO 30), y así sucesivamente. Además de las cuatro suturas que pasan por los túneles anterior, medio y posterior, también se probó una posición final con dos suturas que pasan por el túnel anterior y dos suturas que pasan por el túnel medio (ANT-MID 30 y ANT-MID 60).

Después de cada prueba, se inspeccionó la rodilla para asegurarse de que el ancla de sutura aún estaba segura y esto se verificó. No hubo evidencia de extracción del ancla de sutura para ninguna de las pruebas.

Análisis estadístico: Se usó un modelo mixto ANOVA con la ubicación de la sutura y el ángulo de flexión de la rodilla como términos de medidas repetidas y factores del sujeto incluidos para rastrear especímenes individuales para determinar la importancia de las diferencias entre los grupos. Se seleccionó una estructura de covarianza de simetría compuesta (que demostró un buen ajuste según el criterio de información de Akaike (AIC)).

RESULTADOS

Las rodillas intactas tenían una laxitud AP de 4,9 mm /- 0,4 mm (media /- SEM). La extracción de la rótula, el tendón rotuliano, el ligamento mucoso y la almohadilla grasa tuvo un efecto insignificante en la laxitud AP de la rodilla, con valores para ese grupo de 5,2 /- 0,3 mm y prueba t p > 0,79 para la comparación entre los dos grupos). Cuando se seccionó el LCA, la laxitud de la rodilla excedió el nivel máximo establecido por el dispositivo de prueba (32 mm), e incluso en esos desplazamientos, no se colocó carga en la celda de carga. Por lo tanto, a este grupo se le asignó un desplazamiento de 32 mm.

La reparación primaria con la técnica de Marshall resultó en una mejora de la laxitud en comparación con la rodilla con deficiencia del LCA, pero aumentó la laxitud AP en comparación con la rodilla intacta y con deficiencia patelar cuando la reparación se realizó con 30 grados de flexión y 60 grados de flexión (Tabla 5). Estas diferencias entre la laxitud de la rodilla del ligamento intacto y la técnica de Marshall fueron estadísticamente significativas tanto a 30 como a 60 grados (p < 0,002 para ambas comparaciones).

La laxitud AP de la rodilla después de la reparación con suturas dependía de la ubicación de la sutura tibial (F = 35; p < 0,001). Las suturas colocadas en el túnel óseo medio, ubicado dentro del sitio de inserción tibial del LCA, restauraron la laxitud AP de la rodilla a valores similares a los de las rodillas del LCA intactas sin la rótula (5,2 /- 0,6 mm frente a 5,2 /- 0,4 mm)., p>0,99; media /-SEM). Las suturas colocadas en el túnel óseo anterior dieron como resultado reparaciones con un promedio de 1,2 mm más de laxitud que las suturas colocadas en la ubicación media (6,4 /- 0,4 mm), una diferencia que se acercó, pero no alcanzó significación estadística en este modelo de comparación múltiple (p>0,05). La colocación de la sutura en una ubicación más posterior en la columna tibial o en el remanente tibial del LCA resultó en rodillas con una laxitud significativamente mayor que las rodillas con un LCA intacto o las rodillas reparadas en los túneles anterior o medio (p < 0,05 para todas las comparaciones).

La figura 27 son fotografías de las posiciones del túnel tibial anterior (27A), medio (27B) y posterior (27C). La Figura 28 es una gráfica que representa los valores de laxitud AP para todos los especímenes. La Figura 29 es una gráfica que representa las diferencias con respecto a los valores de laxitud del AP intacto.

La laxitud AP de la rodilla después de la reparación con suturas también dependía del ángulo de flexión de la rodilla cuando se ataron las suturas (F = 30, p<0,001). La laxitud fue mayor cuando las reparaciones se ataron a 30 grados de flexión, y se observó menos laxitud cuando las reparaciones se ataron a 60 grados (p < 0,001); sin embargo, la laxitud en ambos grupos permaneció más alta que la de las rodillas intactas del LCA (p < 0,02).

No hubo interacción entre la ubicación de la sutura tibial y el ángulo de flexión de la rodilla (p = 0,67).

Las técnicas de sutura que van desde el fémur hasta la tibia pueden restaurar la laxitud anteroposterior normal de la rodilla en el momento cero, especialmente si se atan con una pequeña flexión y el punto de unión tibial se encuentra dentro de la huella normal del LCA. Los datos demuestran que la reparación con suturas del muñón tibial, como en la técnica de Marshall, no restaura la laxitud anteroposterior normal de la rodilla, un hallazgo que puede ser una de las razones por las que esta técnica de reparación del LCA dio lugar a que un gran porcentaje de pacientes tengan laxitud anormal de la rodilla después de la operación.

Sin embargo, en varios de los grupos, hubo algunas rodillas que tenían menos laxitud AP después de la reparación con sutura que en la condición de ACL intacto. Esto podría resultar en una constricción excesiva de la rodilla. Todavía no está claro si la sobreconstricción o el exceso de laxitud conducen a cambios articulares degenerativos tempranos, pero es probable que las reparaciones que dan como resultado grandes cambios en la laxitud de la rodilla no sean ideales.

Tabla 5.

Ejemplo 8 : Uso de esponjas de alta densidad de 40 mg/ml (esponjas HDBC)

Se realizó un estudio que comparó la efectividad de las esponjas de colágeno de densidad estándar (Gelfoam) y las esponjas de colágeno de alta densidad (HDBC). Se usaron esponjas de 1 cm de diámetro tanto de Gelfoam como de HDBC (aumento de 3x en la concentración de colágeno) como andamio.

La esponja HDBC se preparó liofilizando una suspensión de colágeno y reconstituyéndola a una densidad de 40 mg/ml de colágeno. La suspensión se neutralizó y se dejó gelificar a 38 °C. A continuación, los geles resultantes se liofilizaron. Tanto las esponjas GELFOAM como las HDBC se sembraron con células suspendidas en plasma rico en plaquetas (PR o células suspendidas en suspensión de colágeno PRP (concentración 1x106 células/ml para ambos grupos). Se permitió que ambas soluciones de células se absorbieran en las esponjas durante 30 minutos en la incubadora y luego se colocaron 2 gotas de medio completo encima de las esponjas para mantenerlas húmedas durante la noche. Después de 12 horas, se añadió 1 ml de medio completo a cada pocillo.

RESULTADOS: Las esponjas de densidad estándar (GELFOAM) no absorbieron el PRP o la suspensión de colágeno de manera muy eficiente. Se midieron los recuentos de células dentro de las esponjas el Día 2 y el Día 10 (Figura 30). La mayor proliferación celular ocurrió en el grupo HDBC+PRP y la menor proliferación en el grupo Gelfoam+PRP.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de cicatrización de tejido que comprende:

un andamio de colágeno capaz de compresión y expansión y preparado mediante la preparación de una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración de más de 5 y menos de o igual a 50 mg/ml y que tiene una viscosidad de 1,000 a 200,000 centipoises (1 Pa.s a 200 Pa.s) y sometiendo la solución estéril de colágeno solubilizado a una temperatura de al menos 30°C, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado forma el andamio de colágeno; y un ancla o sutura.

2. El dispositivo de cicatrización de tejido de la reivindicación 1, en donde las suturas o anclas son bioabsorbibles.

3. El dispositivo de cicatrización de tejido de la reivindicación 1, en donde el colágeno es un colágeno de tipo I, II o III.

4. El dispositivo de cicatrización de tejido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en un método para reparar tejido articular

dañado.

5. El dispositivo de cicatrización de tejidos de la reivindicación 4, en donde el tejido articular se selecciona del grupo que consiste en ligamento cruzado anterior, ligamento colateral lateral, ligamento cruzado posterior, ligamento colateral medial, ligamento radiocarpiano volar, ligamento radiocarpiano dorsal, ligamento colateral cubital y ligamento colateral radial.

6. El dispositivo de cicatrización de tejido de la reivindicación 1, en donde el colágeno solubilizado está presente en una concentración de más de 15 mg/ml y menos de 50 mg/ml.

7. El dispositivo de cicatrización de tejido de la reivindicación 1, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado comprende, además:

plaquetas; y/o

células blancas de la sangre; y/o una solución amortiguadora.

8. El dispositivo de cicatrización de tejido de la reivindicación 1, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado tiene un pH de 6,8 - 8,0.

9. Un método para preparar un andamio de colágeno, que comprende:

preparar una solución estéril de colágeno solubilizado en una concentración de más de 5 y menos de o igual a 50 mg/ml y que tenga una viscosidad de 1.000-200.000 centipoises, y someter la solución estéril de colágeno solubilizado a una temperatura de al menos 30° C, en el que la solución estéril de colágeno solubilizado forma un andamio de colágeno.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el colágeno es un colágeno de tipo I, II o III.

11. El método de la reivindicación 9, en donde el colágeno solubilizado está presente en una concentración de más de 15 mg/ml y menos de 50 mg/ml.

12. El método de la reivindicación 9, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado comprende, además: plaquetas; y/o

células blancas de la sangre; y/o una solución amortiguadora.

13. El método de la reivindicación 9, en donde la solución estéril de colágeno solubilizado tiene un pH de 6,8 - 8,0.