DE60123218T2

DE60123218T2 - Produkt zur biologischen bindegewebsverankerung an knochen

Info

Publication number: DE60123218T2
Application number: DE60123218T
Authority: DE
Inventors: Brent Lakewood ATKINSON; J. James Arvada BENEDICT
Original assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Current assignee: Zimmer Orthobiologics Inc
Priority date: 2000-03-09
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2021-03-08
Also published as: DE60123218D1; AU2001245461A1; WO2001066130A1; EP1261365A1; EP1704866A3; EP1261365A4; ES2272452T3; EP1261365B1; EP1704866A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, wobei das Produkt die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen induziert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Derzeitige Methoden zur Fixierung einer Sehne oder eines Ligamentes an Knochen nutzen eine mechanische Fixierung. Keine dieser Methoden kontrolliert oder verstärkt jedoch die biologische Heilreaktion und keine dieser Methoden optimiert die biologische Komponente der Fixierung. Ferner existiert gegenwärtig keine Methode der Rekonstruktion, die die normale Morphologie der Sehne oder des Ligamentes an dem Knochen wieder herstellt. Verschiedene Operationstechniken stellen die komplexe Fächermorphologie der Übergangsbereiche von Faserknorpel und kalkhaltigem Knorpel zwischen der Sehne oder dem Ligament und dem Knochen nicht wieder her. Da Freizeit, Wohlstand und ein Bewusstsein für Fitness und hochbelastende Sportarten, wie bspw. Fußball und Skifahren, zugenommen haben, wurde ein signifikanter Anstieg von Verletzungen, in die die Anhaftung der Sehne und des Ligamentes an den Knochen involviert ist, beobachtet. Gewebe, die häufig durch solche Verletzungen geschädigt und/oder abgetrennt werden, umfassen das vordere Kreuzband (ACL) und die Sehnen der Rotatorenmanschette.
Das vordere Kreuzband (ACL) ist im Zentrum des Kniegelenkes zwischen der Tibia und den Gelenkköpfen des Femurs lokalisiert. In funktioneller Hinsicht verhindert das ACL die rückwärtsgerichtete Dislokation des Femurs, die vorwärtsgerichtete Dislokation der Tibia, und übermäßige Extensor- oder Rotationsbewegungen. Über die letzten Jahrzehnte wurde ein signifikanter Anstieg der Verletzungen des ACL beobachtet, da die Aktivitäten zugenommen haben, die das Ligament belasten. Gegenwärtig genutzte chirurgische Verfahren zur Wiederherstellung des ACL werden beschrieben von Jackson (DW Jackson and PR Kurzweil, Chapter 8 in Master Techniques in Orthopaedic Surgery, Reconstructive knee surgery, Raven Press, NY, 1995). Kurzgesagt, es werden Femoral- und Tibialtunnel geschaffen, und das Transplantat wird entnommen und sowohl an den Femoral- als auch den Tibialtunnel fixiert. In der Mehrzahl der Rekonstruktionen wird ein autologes Transplantat aus der Kniesehne, dem Quadrizeps oder der Patellasehne gewonnen, obwohl bei einem geringen prozentualen Anteil der Fälle auch allogenisches Transplantatmaterial verwendet wird. Synthetisches (z.B. nicht vom Menschen stammendes) Material wurde ebenfalls dazu verwendet, um das ACL zu ersetzen (Bolton et al., Clin. Orthop., 196:202–213, 1985). Außerdem wurden in Rekonstruktionen Transplantate, die sich von Xenotransplantatmaterial, und/oder subintestinaler Submucosa ableiten und/oder kollagenabgeleitete Transplantate verwendet. Gegenwärtig verwendete Fixierungsmethoden umfassen die Interferenzschraube, Endobutton, Nähmaterial, die Kompressionsschraube, den Anker, und andere Methoden, die resorbierbare oder nicht-resorbierbare Materialien aufweisen.
Die Sehnen der Rotatoarenmanschette, des Supraspinatus, Infraspinatus, der Subscapularis, und des Teres minus stützen die Gelenkkapsel und begrenzen den Bewegungsbereich der Rotatorenmanschette. Diese Sehnen inserieren um den Kopf des Humerus herum, wobei die Sehnen des Supraspinatus, Infraspinatus und des Teres minus an dem Tuberculum majus und die Sehnen des Subscapularis an dem Tuberculum minus ansetzen. An der Stelle der Insertion der Sehne an den Knochen wird häufig ein Faserknorpel gefunden. Hinsichtlich der Funktion des Faserknorpels wird vermutet, dass diese ähnlich zu der Funktion eines Gummiringes ist, der um eine elektrische Leitung platziert wird, um eine Beschädigung der Kabel an der Stelle zu verhindern, wo diese in den Stecker eintreten (Benjamin et al., „Functional and Developmental Anatomy of Tendons and Ligaments." In Gordon SL, Blair SJ, Fine LJ (eds): Repetitive Motion Disorders of the Upper Extremity; Rosemont, IL, American Academy of Orthopaedic Surgery, 1995). Die derzeitigen Methoden für die Reparatur der Rotatorenmanschette sind im Detail beschrieben in Fu (Operative Techniques in Orthopaedics, „Treatment of Rotator Cuff Injuries"; Editor F.H. Fu, guest editor GR Williams, vol. 8, no. 4, 1998). Im Allgemeinen wird direkt medial zu dem Tuberculum majus eine Rinne in der Spongiosa geschaffen, Knochentunnel werden entlang der Rinne gebohrt, und transossäre Fixierungen werden dazu verwendet, um die Sehne an dem Knochen zu befestigen. Zusätzlich kann das Verknotungsmuster modifiziert werden. Als Alternative zu den transossären Fixierungen können Nahtanker/Harpunen verwendet werden (Operative Techniques in Orthopaedics, 1998, a.a.O.).
In den 1960ern wurde beobachtet, dass eine demineralisierte Knochenmatrix die Bildung von neuem Knorpel und Knochen induziert, wenn diese in ektopische Stellen implantiert wird (Urist, Science, 150:893–899, 1965). Die Komponenten, die für die osteoinduktiven Aktivitäten verantwortlich sind, wurden als knochenmorphogenetische Proteine (engl.: „Bone Morphogenetic Proteins", (BMP)) bezeichnet. Zumindest sieben individuelle BMPs aus den Knochen wurden daraufhin identifiziert und als BMP 1-7 bezeichnet. Aminosäureanalysen ergaben, dass sechs der sieben BMPs miteinander und mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie verwandt sind (Celeste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9843–9847, 1990; Wozney et al., Science, 242:1528–1534, 1988). Während der endochondralen Knochenbildung steuern Mitglieder der TGF-β-Familie eine direkte Kaskade von Ereignissen, die Chemotaxis, Differenzierung von pluripotenten Zellen in die Knorpellinie, Reifung von Chondrozyten in das hypertrophe Stadium, Mineralisierung von Knorpel, Ersetzen von Knorpel durch Knochenzellen und die Bildung von kalkhaltiger Matrix umfassen (Reddi, Cytokine & Growth Factor Reviews, 8:11–20, 1997). Obwohl individuelle, rekombinante BMPs diese Ereignisse induzieren können, unterstreicht das Vorhandensein von multiplen Mitgliedern der TGF-β-Familie im Knochen die Komplexität, die mit der natürlichen Osteogenese einhergeht.
Vor Kurzem wurden weitere Mitglieder der BMP-Familie entdeckt, wovon einige zu der Familie der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (engl.: „growth and differentiation factor"; (GDF)) gezählt werden. Um die Nomenklatur klarzustellen, BMP-12, BMP-13 und BMP-14 sind auch als GDF-7, -6 bzw. -5 bekannt (AH Reddi, Nat. Biotech., 16:247–252, 1998). Ferner sind GDF-5, -6 und -7 als CDMP-1, -2 bzw. -3 bekannt. Außerdem ist MP-52 dasselbe Molekül wie GDF-5.
Knochenprotein (Sulzer Orthopedics-Biologics, Denver, CO) (engl.: „bone protein"; (BP)) ist eine aus natürlicher Quelle stammende Mischung von Proteinen, die aus demineralisierten Rinderknochen isoliert werden, und eine osteogenetische Aktivität in vitro und in vivo zeigen. Im ektopischen Nagermodell induziert BP die endochondrale Knochenbildung oder die Knochenbildung über ein Knorpelintermediat (Damien et al., J. Biomed. Mater. Res., 24:639–654, 1990). In vitro fördert BP die Stammzelldifferenzierung zum Knorpel (Atkinson et al., J. Cell. Biochem., 65:325–339, 1997). Das Verfahren zur Reinigung von BP und die Methode zur Bildung von Knochen im Körper in Kombination mit Calciumcarbonat wird in den US-Patenten mit den Nummern 5,290,763, 5,371,191 und 5,563,124 beschrieben.
Ein subkutanes Rattenmodell kann dazu verwendet werden, um Gemeinsamkeiten und Unterschiede unter den BMP-Molekülen und/oder knochenabgeleiteten Zusammensetzungen zu demonstrieren. In dem Nager-Assay von Sampath-Reddi, der von Rosen modifiziert wurde (Operative Techniques in Orthopaedics, 1998, s.o.) induzieren BMP-12, BMP-13 und MP-52 nach 10 Tagen kein Knochen und keine Sehne. Anstelle dessen produzieren diese Faktoren Gewebe, die der embryonalen Sehne ähneln (Wolfman et al., Clin. Invest., 100(2):321–30, 1997). Celeste et al. beschreiben eine Methode zur Verwendung von BMP-12, BMP-13 und/oder MP-52 (d.h. BMP-14), um die Bildung von Sehnen- und/oder Ligamentgewebe zu induzieren (U.S. Patent mit der Nummer 5,658,882 und WO95/16035). Unter Verwendung eines modifizierten ektopischen Implantatassays in der Ratte, zeigen Celeste et al., dass rekombinates BMP-12 die Bildung von Gewebe, das embryonaler Sehne ähnelt, nicht jedoch die Knorpel- oder Knochenbildung induziert. Hierzu im Gegensatz zeigten BMP-2 enthaltenden Implantate in diesem ektopischen Nager-Assay eine Knorpel- und Knochenbildung, enthielten jedoch kein Sehnen/Ligament-ähnliches Gewebe (Celeste et al., U.S. Patent mit der Nummer 5,658,882).
Das Knochentunnelmodell ist ein geeignetes Modell, um die Anhaftung der Sehne oder des Ligamentes an den Knochen zu untersuchen (Rodeo et al., 1993, J. Bone Joint Surgery 75-A(12):1795–1803). In diesem Modell wird die Sehne des Extensor digitorum Iongus von dem femoralen Gelenkkopf gelöst, ein Tunnel in die Tibia geschaffen, die Sehne wird durch den Tunnel in dem proximalen Teil der Tibia gezogen, und an das Periosteum fixiert. In diesem Modell beschreiben Wozney et al. die Verwendung von gereinigtem knochenmorphogenetischem Protein zur Regenerierung und funktionalen Anhaftung von Bindegewebe an Knochen (WO96/39169). Der natürliche Heilungsprozess der Sehne an dem Knochen wurde über die Zeit hinweg histologisch und mechanisch beobachtet. Obwohl die histologische Analyse demonstrierte, dass BMP-2 eine Knochen-Sehne-Zwischenschicht induziert, war die bevorzugte faserknorpelige Zone nicht vorhanden. In einer Publikation von Experimenten, bei den BMP-2 dazu verwendet wurde, um die Heilung der Sehne in einem Knochentunnel zu verstärken, berichten Rodeo et al., dass höhere Dosen von BMP-2 die Resorption des Lamellenknochens induziert, der den Knochentunnel umgibt, was unerwünscht ist, mit der gleichzeitigen Bildung von feinen Trabekeln neuer Knochen (Rodeo et al., 1999, Amer. J. Orthopaedic Society for Sports Medicine 27:476–488). Außerdem deutet dieser Bericht, wie bereits die WO96/39169, darauf hin, dass eine Sehnenbildung in der Zwischenschicht nicht beobachtet wird, obwohl sich eine Knochen-Sehnen-Zwischenschicht bildet.
Zusätzliche Untersuchungen haben den Effekt von Wachstumsfaktoren auf die Heilung von Sehnen an Sehnen oder von Ligament an Ligament demonstriert. Woo et al. nutzten ein in vitro Ligamentmodell, um zu zeigen, dass der epidermiale Wachstumsfaktor-β 1 (TGF-β1) die Synthese der extrazellulären Matrix fördert (Woo et al., Med. Biol. Eng. Comput., 36(3):359–64, 1998). Unter Verwendung eines Ruptur-MCL-Kaninchenmodells ergab ein Dehnungstest, dass der plättchenabgeleitete Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB) die Werte betreffend die Traglast, Bruchdehnung und Energieabsorption bis zum Versagen im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht (Woo et al., 1998, a.a.O.). Ferner demonstrierten Aspenberg und Forslund, dass GDF 5 und 6 (d.h. BMP-13 und BMP14) die Zugfestigkeit der regenerierten Sehne in einem Rattenmodell mit durchtrennter Achilles-Sehne erhöhen (Woo et al., 1998, a.a.O.).
Zusätzlich verursacht exogen hinzugegebenes knochenmorphogenetisches Protein die Verknöcherung des Ligamentum flavum in Mäusen (Woo et al., 1998, a.a.O). Wie oben diskutiert, konnte mit diesen Untersuchungen jedoch nicht eine Rekonstruktion/Reparatur der Zwischenschicht zwischen Bindegewebe, Knorpel und Knochen demonstriert werden, die die natürliche Ontogenese einer solchen Zwischenschicht in einem solchen Ausmaß kopiert, dass diese zur Verwendung in der klinischen Reparatur einer Sehne oder eines Ligamentes in vivo geeignet ist.
Zusammengefasst, trotz beträchtlicher Forschung, die auf die Reparatur von Verletzungen der Anhaftung der Sehne und/oder Ligamentes an den Knochen gerichtet ist, verbleibt im Stand der Technik der Bedarf für ein Produkt und eine Methode, mit dem bzw. der nicht nur eine funktionelle Anhaftung der Sehne oder des Ligamentes an den Knochen erzielt, sondern auch die Bildung einer solchen Anhaftung der Sehne bzw. des Ligamentes an den Knochen induziert werden kann, die die natürliche (d.h. endogene) Ontogenese der Anhaftung getreuer widerspiegelt. Die Widerspiegelung der natürlichen Ontogenese der Sehne und/oder des Ligamentes an dem Knochen würde ein Ergebnis liefern, das Folgendes umfasst, nämlich die Induktion einer größeren Menge von Knochen, die schneller vorhanden und in näherer Umgebung zu dem Bindegewebe steht, ein Anstieg der Fixierungsstärke der Anhaftung zu früheren Zeitpunkten, und ein Anstieg der Fixierungsstärke im Patienten mit degenerativer Sehnen- und/oder Knochenpathologie.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird die Verwendung einer Mischung von Proteinen zur Herstellung eines Arzneimittels bereitgestellt, um eine Anhaftung des Knochens an Bindegewebe zu verstärken, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sehne, einem Ligament und einem Cementum, wobei die Mischung von Proteinen Folgendes aufweist, nämlich:
transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1), knochenmorphogenetisches Protein BMP-2, BMP-3, und BMP-7;
wobei die Menge von TGFβ1 in der Mischung bei etwa 0,01 % bis etwa 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt;
wobei die Menge von BMP-2 in der Mischung bei etwa 0,01 % bis etwa 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt;
wobei die Menge von BMP-3 in der Mischung bei etwa 0,1 % bis etwa 15 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt; und
wobei die Menge von BMP-7 in der Mischung bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
In einem Ausführungsbeispiel liegt die Menge von TGFβ1 in der Mischung bei etwa 0,05 % bis etwa 1 % des Gesamtproteins in der Mischung. In einem Ausführungsbeispiel liegt die Menge von BMP-2 in der Mischung bei 0,1 % bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung. In einem anderen Ausführungsbeispiel liegt die Menge von BMP-3 in der Mischung bei 0,1 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung. In einem weiteren Ausführungsbeispiel liegt die Menge von BMP-7 in der Mischung bei 0,1 % bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung.
In einem Ausführungsbeispiel weist die Mischung von Proteinen ferner ein Protein auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TGFβ2, TGFβ3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9 und knorpelabgeleitetes morphogenetisches Protein (CDMP). In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispiels umfasst TGFβ2 0,5 % bis 12 % der Mischung von Proteinen; TGFβ3 umfasst 0,01 % bis 15 % der Mischung von Proteinen; BMP-4 umfasst 0,01 % bis 1 % der Mischung von Proteinen; BMP-5 umfasst 0,01 % bis 1 % der Mischung von Proteinen; BMP-6 umfasst 0,01 % bis 1 % der Mischung von Proteinen; und/oder CDMP umfasst 0,01 % bis 1 % der Mischung von Proteinen. In einem Ausführungsbeispiel umfasst die Mischung von Proteinen ferner ein CDMP-Protein in einer Menge von 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung.
In einem Ausführungsbeispiel weist die Mischung von Proteinen ferner zumindest ein Knochenmatrixprotein auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Osteocalcin, Osteonectin, Knochensialoprotein (BSP), Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Osteopontin, Matrix-GLA-Protein (MGP), Biglycan, Decorin, Proteoglycan-Chondroitin-Sulfat III (PG-CS III), Knochen-Acidisches-Glycoprotein (BAG-75), Thrombospondin (TSP) und Fibronectin. Das Knochenmatrixprotein umfasst typischerweise 20 % bis 98 % der Mischung von Proteinen; in einem Ausführungsbeispiel umfasst das Knochenmatrixprotein 40 % bis 98 % der Mischung von Proteinen. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weisen die Knochenmatrixproteine Folgendes auf: Osteocalcin, Osteonectin, Knochensialoprotein (BSP), Lysyloxidase und Cathepsin L pre.
In einem Ausführungsbeispiel weist die Mischung von Proteinen ferner zumindest ein Wachstumsfaktorprotein auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten-Wachstumsfaktor I (FGF-I), FGF-II, FGF-9, Leukozyten-Inhibitorischer-Faktor (LIF), Insulin, Insulin-Wachstumsfaktor I (IGF-I), IGF-II, plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor AA (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, stromaabgeleiteter-Faktor-2 (SDF-2), Hypophysen-Thyroid-Hormon (PTH), Wachstumshormon, Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), epithelialer Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor-α (TGFα) und Hedgehog-Proteine. Das Wachstumsfaktorprotein umfasst typischerweise 0,01 % bis 50 % der Mischung von Proteinen, und in einem Ausführungsbeispiel umfasst das Wachstumsfaktorpootein 0,05 % bis 25 % der Mischung von Proteinen, und in einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst das Wachstumsfaktorprotein 0,1 % bis 10 % der Mischung von Proteinen.
Vorzugsweise ist das Wachstumsfaktorprotein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-I (FGF-I). In diesem Ausführungsbeispiel umfasst FGF-I 0,001 % bis 10 % der Mischung von Proteinen.
In einem anderen Ausführungsbeispiel umfasst die Zusammensetzung ferner ein oder mehrere Serumproteine. Vorzugsweise sind die Serumproteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Albumin, Transferrin, α2-Hs GlycoP, IgG, α1-Antitrypsin, β2-Mikroglobulin, Apo A1 Lipoprotein (LP) und Faktor XIIIb. Höchst bevorzugt sind die Serumproteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Albumin, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIB.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung weist die Mischung von Proteinen TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, Osteocalcin, Osteonectin, BSP, Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Albumin, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIb auf. In einem anderen Ausführungsbeispiel weist die Mischung von Proteinen Knochenprotein (BP) auf.
Das Arzneimittel kann ferner eine Matrix aufweisen, die dafür konfiguriert ist, eine Zwischenschicht zwischen dem Bindegewebe und dem Knochen zu bilden.
Vorzugsweise weist die Zusammensetzung eine Identifizierungseigenschaft auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Fähigkeit, die zelluläre Infiltration an der Anhaftungsstelle zu induzieren, einer Fähigkeit, um zelluläre Proliferation an der Anhaftungsstelle zu induzieren, einer Fähigkeit, um die Knochenbildung zu induzieren, einer Fähigkeit, um die Sehnenbildung zu induzieren, und einer Fähigkeit, um die Knorpelbildung zu induzieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel induziert das Produkt im Wesentlichen nicht die Knochenresorption an der Stelle der Anhaftung. In einem anderen Ausführungsbeispiel induziert die Zusammensetzung in einem Subkutan-Assay in der Ratte eine geordnete Knochenringbildung peripher um einen implantierten Kollagenschwamm herum, und induziert eine geordnete Kollagenringbildung im Inneren der geordneten Knochenringbildung. In einem weiteren Ausführungsbeispiel induziert die Mischung von Anhaftungsproteinen, wenn diese bei einer Konzentration von etwa 10 μg pro 6,5 bis 7,3 mg von Rindersehnenkollagen in einem Subkutan-Assay in der Ratte verwendet werden, einen Knochenwert von zumindest etwa 2,0, wenn eine Knocheneinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 1 dargestellt ist, und induziert einen Knorpelwert von zumindest etwa 1,5, wenn eine Knorpeleinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 8 dargestellt ist.
In der vorliegenden Erfindung liegt die Zusammensetzung typischerweise bei einer Konzentration von 0,5 Gew.-% bis 33 Gew.-% des Produktes, und in einem Ausführungsbeispiel bei einer Konzentration von 1 Gew.-% bis 20 Gew.-% des Produktes.
Die Matrixkomponente der vorliegenden Erfindung ist in einem Ausführungsbeispiel bioresorbierbar. Vorzugsweise ist die Matrix porös. Die Matrix weist vorzugsweise ein Material auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem synthetischen Polymermaterial und einer Grundsubstanz. In einem Aspekt weist die Matrix ein Material auf, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Schwamm, einer Membran, einem Film und einem Gel. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist die Matrix Kollagen aus der Rindersehne auf. In einem Ausführungsbeispiel passt sich die Matrix an eine Anhaftungsstelle einer Sehne oder eines Ligamentes an eine Knochenhöhle an.
Die vorliegende Erfindung wird dazu verwendet, um eine Anhaftung eines Knochens an Bindegewebe zu verstärken, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sehne, Ligament und Cementum. Diese kann die Schritte des Implantierens und Fixierens eines Arzneimittels der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, an eine Stelle der Anhaftung von Knochen an Bindegewebe beinhalten. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere nützlich, wenn die Stelle der Anhaftung die Stelle der Anhaftung eines vorderen Kreuzbandes an einen Knochen ist, wenn die Stelle der Anhaftung die Stelle der Anhaftung einer Sehne, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Supraspinatus, Infraspinatus, Subscapularis und Teres minus, an Knochen ist; wenn die Stelle der Anhaftung die Stelle der Anhaftung eines ulnaren Kollateralbandes an Knochen ist; wenn die Stelle der Anhaftung die Stelle der Anhaftung eines Sprunggelenkaußenbandes an den Knochen ist; und/oder wenn die Stelle der Anhaftung die Stelle der Anhaftung des Cementums an den Alveolarknochen ist.
Vorzugsweise wird die Matrix in der Läsion durch ein Anhaftungsmittel fixiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interferenzschraube, Endobutton, bioresorbierbares Nähmaterial, Kompressionsschraube, nicht-resorbierbares Nähmaterial, Press-Fitting, Pfeile, Nägel und T-fix-Nähmaterial-Ankervorrichtungen.
In einem Ausführungsbeispiel ist die Anhaftungsmatrix als eine Folie konfiguriert. In diesem Ausführungsbeispiel umfasst der Schritt der Fixierung vorzugsweise das Wickeln der Folie um eine an den Knochen anzuhaftende Sehne bzw. eines Ligamentes. In einem anderen Ausführungsbeispiel, wenn es sich bei dem Bindegewebe um eine Sehne handelt, ist die Anhaftungsmatrix ein Gel, das um die Sehne herum in Sehnentunnel und zwischen die Sehne und den Knochen injiziert wird. Vorzugsweise ist das Gel gepuffert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel erhöht sich die biomechanische Stärke der Anhaftung des Knochens an Bindegewebe um zumindest etwa 20 %, weiter bevorzugt um zumindest 50 %, und weiter bevorzugt um zumindest etwa 75 %, und höchst bevorzugt um zumindest etwa 100 % über die biomechanische Fixierungsstärke des Knochens an Bindegewebe in Abwesenheit des Produktes.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Grafik, die die Fixierungsstärke von Transplantaten zeigt, die für die ACL-Wiederherstellung verwendet wurden, welche mit Knochenprotein behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollen zu verschiedenen Zeitpunkten.
2 ist eine Grafik, die die Fixierungsstärke von Transplantaten zeigt, die für ACL-Wiederherstellungen verwendet wurden, welche mit Knochenprotein behandelt wurden, im Vergleich zu Kontrollen, die mit einem Schwamm allein behandelt wurden, und zwar 8 Wochen nach der Behandlung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, einschließlich das Reparieren oder Regenerieren solcher Anhaftungen, wenn die Anhaftung als Ergebnis einer Verletzung oder eines chirurgischen Verfahrens vollständig oder teilweise abgetrennt wurde, oder, bspw., aufgrund eines degenerativen Zustandes oder einer degenerativen Krankheit verschlechtert wurde. Die vorliegende Erfindung ist nützlich, um eine beliebige Anhaftung eines beliebigen Bindegewebes an Knochen zu reparieren, einschließlich, aber nicht einschränkend hierauf, die Anhaftung einer Sehne, eines Ligamentes und/oder eines Cementums an Knochen.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Verstärkung einer Anhaftung von Bindegewebe an Knochen. Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung umfasst: (a) eine Matrix, die als Zwischenschicht zwischen Bindegewebe und Knochen konfiguriert ist; und (b) eine Zusammensetzung, die eine Mischung von mit der Matrix assoziierten Proteinen aufweist, wobei eine solche Mischung wirksam ist, um die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Sehne und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen zu induzieren. Die Mischung von Proteinen beinhaltet: transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1), knochenmorphogenetisches Protein BMP-2, BMP-3 und BMP-7. Die Menge von TGFβ1 in der Mischung liegt bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung; die Menge von BMP-2 in der Mischung liegt bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung; die Menge von BMP-3 in der Mischung liegt bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung; und die Menge von BMP-7 in der Mischung liegt bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung. Sofern nicht anders angegeben basieren die Bezugnahmen auf Prozentangaben von Proteinen auf Gewicht pro Gewicht (w/w).
Wie oben diskutiert, vor der vorliegenden Erfindung wurde eine Vielzahl von chirurgischen Verfahren und/oder Zusammensetzungen verwendet und im Hinblick auf die Wiederanhaftung und Heilung der Sehne oder des Ligamentes an Knochen untersucht. Die Zusammensetzungen, die bislang in vivo für die Wiederanhaftung der Sehne oder des Ligamentes an den Knochen verwendet wurden, waren jedoch nicht in der Lage die natürliche Ontogenese der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen zu reproduzieren. Obwohl die Ergebnisse solcher Studien gelegentlich eine funktionelle Anhaftung der Sehne oder des Ligamentes an den Knochen lieferten, welche sogar eine Anhaftungsstelle beinhaltet, die eine Entwicklung von der Sehne oder des Ligamentes zum Knochen zeigte, konnte die Entwicklung einer physiologisch natürlichen Anhaftung von Bindegewebe an Knochen unter Verwendung solcher Zusammensetzungen nicht demonstriert werden. In der natürlich vorkommenden Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, wie diese in der Entwicklung von Vertebraten-Organismen vorkommen, existiert eine natürliche Morphologie von Bindegewebe an Knochen, die eine komplexe Fächermorphologie und Übergangsbereiche von faser-, knorpel- und kalkhaltigem Knochen zwischen dem Bindegewebe und Knochen beinhaltet. Siehe bspw. Benjamin et al., 1995, s.o.
Die in Rede stehenden Erfinder nehmen an, dass eine natürlichere Morphologie des Bindegewebes an dem Knochen verschiedene Vorteile mit sich bringt, einschließlich ein erhöhter Bewegungsbereich und eine erhöhte Festigkeit, was bspw. die Lebensqualität in Patienten erhöht, die sich einer Rotatorenmanschettenoperation unterzogen haben. Als weiteres Beispiel kann bei ACL-Rekonstruktionsanwendungen eine natürlichere Morphologie des Bindegewebes am Knochen die Knielockerheit reduzieren. Reduzierte Knielockerheit ist mit einer reduzierten Rate von Osteoarthritis verbunden. Ferner kann das Produkt der vorliegenden Erfindung bei Rekonstruktionen, die sowohl ACL- als auch Rotatorenmanschetten-Rekonstruktionen umfassen, die Rate von Operationsfehlschlägen reduzieren. Ferner kann ein passendes biologisches Gewebe besser physikalischen Stress und Belastungen absorbieren, die mit der normalen musculoskeletalen Bewegung einhergehen. Zusätzlich wird angenommen, dass die Verwendung des Produktes der vorliegenden Erfindung die Heilungsraten erhöht, was die Rehabilitationszeiten verkürzen kann. Dieser Vorteil ist besonders wertvoll, da er es Athleten ermöglicht rasch in den Wettkampf zurückzukehren und es Arbeitskräften ermöglicht rascher zur Arbeit zurückzukehren.
Die physiologische Knocheninduktion erfordert stimulierende und inhibierende Faktoren zur Knocheninduktion. Eine Zusammensetzung, die nur einen Stimulator der Knocheninduktion aufweist (z.B. ein einzelnes rekombinantes BMP oder multiple Stimulatoren, wie von früheren Forschern beschrieben), kann das Gewebe an der Zwischenschicht zwischen Knochen und Sehne (oder Meniskus/andere Gewebe) suboptimal regenerieren. Da BP eine aus einer natürlichen Quelle stammende Mischung von Proteinen ist, die sowohl Stimulatoren als auch Inhibitoren zur Knocheninduktion enthalten, induziert es eine eher physiologische Knochenbildung, als die anderen hier beschriebenen Zusammensetzungen, basierend auf dem von BP stammenden Wissen. Physiologische Knocheninduktion beinhaltet eine andere Klasse von Molekülen, die, wenn sie mit anderen osteogenetischen und chondrogenetischen Proteinen, wie bspw. jenen in BP kombiniert werden, chondrogenetische Induktoren sind (TGFβ-1, TGFβ-2, TGFβ-3). TGFβ1-3 werden in BP gefunden. Obwohl diese Proteine Knorpel in vitro induzieren, können sie in dem Subkutan-Assay im Nager keinen Knorpel (und keinen Knochen) induzieren (Wozney et al., 1993, Bone Morphogenetic proteins and their Gene Expression", Cell Mol. Biol. Bone 131–167). Es wird angenommen, dass die subkutane Induktion von Knorpel/Knochen indikativ für morphogenetische Proteine ist, da die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen erforderlich ist. Chondrogenetische Aktivität in vitro kann anstelle dessen lediglich die Matrixproduktion von chondrogenetischen Folgezellen erhöhen. Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Auswahl von BMP/TGFβ-Mischungen, die die Bildung einer physiologischen Sehnen-Knochen-Zwischenschicht optimieren, und in vivo Ergebnisse liefern, die unter Verwendung anderer Zusammensetzungen, die im Stand der Technik vor der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, nicht beobachtet wurden.
Die Formulierung „natürliche Ontogenese der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen" und ähnliche Formulierungen werden deshalb hier dazu verwendet, um solche Entwicklungen von Anhaftungen von Bindegewebe an Knochen zu beschreiben, die natürlicherweise in einem Organismus ablaufen, wie bspw. während der Embryogenese. Vor der vorliegenden Erfindung, konnte mit Zusammensetzungen, die zur Verstärkung der Wiederanhaftung oder Reparatur von Bindegewebe an Knochen verwendet wurden, die Bildung einer solchen natürlichen Morphologie, und insbesondere eines bevorzugten Faserknorpels und einer kalkhaltigen Knorpelübergangszone, nicht erzielt werden.
Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen haben die in Rede stehenden Erfinder die Verwendung eines Produktes zur Stärkung einer Anhaftung von Bindegewebe an Knochen erkannt, das eine komplexe Mischung von Proteinen des Knochenproteins (BP) beinhaltet, wobei BP weiter unten im Detail beschrieben wird. Die in Rede stehenden Erfinder haben herausgefunden, dass das Produkt der vorliegenden Erfindung, im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Zusammensetzungen zur Verwendung in einer Anhaftung von Bindegewebe an Knochen eine natürliche Bindegewebe-an-Knochen-Ontogenese rekapitulieren kann. Im Speziellen ist das Produkt der vorliegenden Erfindung effektiv, um die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen-Faserknorpel/kalkhalrigem Knorpel-Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen (d.h. einen physiologisch natürlichen Gewebetyp an dieser Stelle) zu induzieren, was hier im Allgemeinen auch als Knochen-Knorpel-Bindegewebe-Zwischenschicht bezeichnet wird. Ferner induziert das Produkt eine größere Menge von Knochen und der Knochen entsteht schneller und in näherer Umgebung zu dem Bindegewebe. Diese physiologische akkurate Heilung erhöht die Fixierungsstärke zu früheren Zeitpunkten, und kann im Speziellen die Fixierungsstärke in Patienten mit degenerativer Knorpel- und/oder Knochenpathologie erhöhen. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, nehmen die in Rede stehenden Erfinder an, dass zur Reparatur von Anhaftungen von Bindegewebe an Knochen und insbesondere bei einer vollständigen Zerstörung oder Verschlechterung des natürlichen Bindegewebes die Aufrechterhaltung einer ausreichenden Konzentration einer besonderen komplexen Mischung von Reparaturfaktoren an der Stelle für eine Zeit erforderlich ist, die ausreichend ist, um eine geeignete Bildung der Anhaftung zu induzieren, die der natürlichen Ontogenese genau entspricht, wobei diese natürliche Ontogenese auf einem sehr komplizierten System von verschiedenen Faktoren, Faktorkombinationen und Faktorkonzentrationen mit zeitlichen und lokalen Gradienten basiert. Einem einzelnen rekombinanten Faktor oder wenigen rekombinanten Faktoren kann die induktive Komplexität fehlen, um der natürlichen Ontogenese der Anhaftung in einem ausreichenden Ausmaß zu entsprechen. Gleichermaßen kann ein System, das einen oder wenige rekombinante Faktoren bereitstellt, nicht in der Lage sein, der Gradientenkomplexität des natürlichen Systems in einem ausreichenden Maß zu entsprechen, oder um eine Faktorkonzentration für eine Zeit aufrecht zu erhalten, die ausreichend ist, um eine volle und permanente Differenzierung von Vorläuferzellen in den richtigen Zelltyp an der richtigen Stelle zu ermöglichen. Deshalb haben die in Rede stehenden Erfinder ein Produkt und ein Verfahren entwickelt, die ein quantitatives und qualitatives Ergebnis liefern, das gegenüber jedem zuvor für die Anhaftung von Bindegewebe an Knochen Beschriebenen überlegen ist.
Es versteht sich, dass der Begriff „Bindegewebe" im Stand der Technik bekannt ist und sich auf Gewebe bezieht, das verschiedene Strukturen des Körpers verbindet und stützt, und welches aus Fibroblasten, Fibroglia, Kollagen-Fibrillen und elastischen Fibrillen besteht. Es leitet sich aus dem Mesoderm ab und beinhaltet im weiteren Sinne die Kollagen-, elastischen, mukosen, retikulären, ossalen und knorpeligen Gewebe (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 27^th Edition. 1988, W.B. Saunders Company). Um die Diskussion der Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, bezieht sich der Begriff "Bindegewebe", wie dieser hier verwendet wird, jedoch auf Bindegewebe, das an Knochen bindet, wie bspw. Bindegewebe, das Knochen oder Knorpel an den Knochen, oder Muskel an den Knochen bindet, und ist insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sehne und Ligament. In einem Ausführungsbeispiel wird der Begriff „Bindegewebe" dazu verwendet, um sich auf Cementum zu beziehen, welches als eine dünne Schicht von kalkhaltigem Gewebe definiert wird, das das Dentin der Wurzel eines Zahnes bedeckt und den Zahn in dessen Knochentasche verankert. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „Ligament" und „Sehne" gemäß der Definition in Dorland's Illustrated Medical Dictionary, a.a.O., definiert. Im Speziellen wird der Begriff „Ligament" als ein Band von fibrösem Bindegewebe definiert, das Knochen mit Knorpel verbindet, und dazu dient, Gelenke zu stützen und zu stärken. Der Begriff „Sehne" wird als ein fibröser Strang von Bindegewebe definiert, in dem die Fasern eines Muskels enden, und durch die der Muskel an einem Knochen oder einer anderen Struktur befestigt wird.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung einer Mischung von anhaftungsverstärkenden Proteinen bereit. Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Verstärken", insbesondere im Hinblick auf die Verstärkung einer Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, auf jede Maßnahme des Vergrößerns, Amplifizierens, Verbesserns, Erhöhens oder Ergänzens der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen, so dass sich die Anhaftung in einer Weise bildet, dass die natürliche Ontogenese der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen stärker nachgeahmt wird, im Vergleich zu der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, die in Abwesenheit des Produktes oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes stattfinden würde. Eine messbare Verstärkung der Anhaftungsrate von Bindegewebe an Knochen ist insbesondere jede messbare Verbesserung während der Zeit zwischen dem Tag 0 der Anhaftung (d.h. dem Tag, an dem das Produkt in den Patienten implantiert wird) und dem Tag, an dem festgestellt wird, dass sich eine geeignete Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung entwickelt hat, im Vergleich zu einer im Wesentlichen entsprechen Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, die sich in Abwesenheit des Produktes der vorliegenden Erfindung oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes der vorliegenden Erfindung gebildet hat. Die Entwicklung einer geeigneten Zwischenschicht von Knochen-Knorpel-Bindegewebe ist definiert als ein erstes Anzeichen einer besseren biomechanischen Stärke der Anhaftung. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel verstärkt das Produkt der vorliegenden Erfindung messbar die Rate der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, im Vergleich zu einer Rate der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, die in Abwesenheit des Produktes der vorliegenden Erfindung oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes erfolgt, und zwar um zumindest 20 %, weiter bevorzugt um zumindest 80 %, und weiter bevorzugt um zumindest etwa 100 %.
Zusätzlich resultiert die Verwendung des Anhaftungsproduktes, um Bindegewebe an Knochen anzuhaften, in einer messbaren Erhöhung der Qualität der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, im Vergleich zu der Qualität der Anhaftung, die in Abwesenheit des Produktes der vorliegenden Erfindung oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes der vorliegenden Erfindung erzielt werden kann. Eine messbare Erhöhung in der Qualität der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen wird definiert als jede messbare Verbesserung in der Qualität der Anhaftung, und insbesondere in der Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung, wobei eine Verbesserung definiert ist als die Entwicklung einer natürlicheren Ontogenese der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen, die feststellbar ist durch eine komplexe Fächermorphologie und Übergangszonen von Faserknorpel und kalkhaltigem Knorpel zwischen dem Bindegewebe und Knochen, der Induktion von zellulärer Infiltration in das Produkt, der Induktion von zellulärer Proliferation und der Produktion von zellulärer und räumlicher Organisation, um ein dreidimensionales Gewebe zu bilden, das noch mehr die endogene Anhaftung von Bindegewebe an Knochen widerspiegelt.
Nachfolgend werden verschiedene Ausführungsbeispiele der Zusammensetzung im Detail beschrieben. Zur allgemeinen Bezugnahme wird jedoch die folgende Beschreibung bereitgestellt. Proteine, die in die Mischung der Proteine in einer Zusammensetzung eingebracht werden können, die hier auch als „anhaftungsverstärkende Proteine" bezeichnet werden, sind alle beliebigen Proteine, die allein oder in Kombination mit anderen Proteinen wirksam sind, um die Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verstärken. Beispiele von anhaftungsverstärkenden Proteinen beinhalten Mitglieder der TGFβ-Superfamilie, Wachstumsfaktoren, Knochen-Matrix-Proteine und Serumproteine, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt.
Wie hier verwendet, kann ein „TGFβ-Superfamilie-Protein" jedes Protein der im Stand der Technik bekannten Superfamilie von extrazellulären Signaltransduktionsproteinen sein, das strukturell mit TGFβ1-5 verwandt ist, und umfasst funktionelle Äquivalente solcher natürlich vorkommenden Proteine, wie bspw. Fragmente von solchen Proteinen, die die biologische Aktivität des natürlich vorkommenden Proteins aufweisen. Gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Mischung von Proteinen in der Zusammensetzung typischerweise zumindest zwei verschiedene Mitglieder der TGFβ-Superfamilie-Proteine. In anderen Ausführungsbeispielen beinhaltet die Mischung von Proteinen zumindest drei verschiedene Mitglie der von TGFβ-Superfamilie-Proteinen, und in alternativen Ausführungsbeispielen zumindest vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun und höchst vorzugsweise zehn verschiedene Mitglieder von TGFβ-Superfamilie-Proteinen. Vorzugsweise ist ein TGFβ-Superfamilie-Protein, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ausgewählt aus den folgenden Proteinen: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, knochenmorphogenetisches Protein, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, knorpelabgeleitetes morphogenetisches Protein (CDMP)-1 (BMP-12), CDMP-2 (BMP-13) und/oder CDMP-3 (BMP-14). Weiter vorzugsweise ist das TGFβ-Superfamilie-Protein ausgewählt aus der Gruppe aus: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP-1, CDMP-2 und/oder CDMP-3. In einem Ausführungsbeispiel beinhalten die TGFβ-Superfamilie-Proteine in einer Knochenproteinzusammensetzung zumindest eines von BMP2-8, und weiter vorzugsweise zumindest eines von TGFβ1-5, und weiter bevorzugt zumindest eines von CDMP1-3. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhaltet die Mischung von Proteinen zumindest TGFβ1, BMP-2, BMP-3 und BMP-7. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhaltet die Mischung von Proteinen zumindest ein TGFβ-Protein (und höchst bevorzugt TGFβ1), BMP-2, BMP-3 und BMP-7, und zumindest eines von CDMP-1-3.
Wie hier verwendet, kann ein „Knochenmatrixprotein" jedes aus einer Gruppe von Proteinen sein, das im Stand der Technik als eine Komponente der kleinen Kollagenfasern und Grundsubstanzen, die die Knochenmatrix bilden, oder als eine Komponente, die mit diesen verbunden ist, beschrieben wird, und beinhaltet funktionelle Äquivalente von solchen natürlich vorkommenden Proteinen, wie bspw. Fragmente von solchen Proteinen, die die biologische Aktivität des natürlich vorkommenden Proteins beibehalten. Wie hier verwendet, ist ein Knochenmatrixprotein weder ein Mitglied der TGFβ-Superfamilie, wie dies hier beschrieben ist, noch ein Wachstumsfaktorprotein, wie dies hier beschrieben ist. Knochenmatrixproteine können umfassen, ohne dass dies einschränkend ist, Osteocalcin, Osteonectin, Knochensialoprotein (BSP), Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Osteopontin, Matrix-GLA-Protein (MGP), Biglycan, Decorin, Proteoglycan-Chondroitin-Sulfat III (PG-CS III), Knochen-Acidisches-Glycoprotein (BAG-75), Thrombospondin (TSP) und/oder Fibronectin. Vorzugsweise beinhalten Knochenmatrixproteine, die in einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorliegen, eines oder mehrere von: Osteocalcin, Osteonectin, MGP, TSP, BSP, Lysyloxidase und Cathepsin L pre. In einem Ausführungsbeispiel beinhalten die Knochenmatrixproteine Osteocalcin, Osteonectin, BSP, Lysyloxidase und Cathepsin L pre.
Wie hier verwendet, kann ein „Wachstumsfaktorprotein" jedes aus einer Gruppe von Proteinen sein, das als ein extrazelluläres Polypeptidsignalmolekül definiert ist, das eine Zelle dazu stimuliert, zu wachsen oder zu proliferieren, und beinhaltet funktionelle Äquivalente von solchen natürlich vorkommenden Proteinen, wie bspw. Fragmente von solchen Proteinen, die die biologische Aktivität des natürlich vorkommenden Proteins beibehalten. Solche Wachstumsfaktoren können auch andere Aktivitäten neben der Induktion des Zellwachstums oder der Proliferation haben. Wie hier verwendet, ist ein Wachstumsfaktor weder ein Mitglied der TGFβ-Superfamilie, wie diese hier definiert ist, noch ist es ein Knochenmatrixprotein, wie dies hier definiert ist. Vorzugsweise beinhalten Wachstumsfaktorproteine, die zur Verwendung mit dem Produkt der vorliegenden Erfindung geeignet sind, einen oder mehrere von: Fibroblasten-Wachstumsfaktor I (FGF-I), FGF-II, FGF-9, Leukozyten-Inhibierender-Faktor (LIF), Insulin, Insulin-Wachstumsfaktor I (IGF-I), IGF-II, plättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor AA (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, stromal abgeleiteter Faktor-2 (SDF-2), Hypophysen-Thyroidhormon (PTH), Wachstumshormon, Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF), epithelialer Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor α (TGFα) und Hedgehog-Proteine. Ein höchst bevorzugtes Wachstumsfaktorprotein zur Verwendung mit dem Produkt der vorliegenden Erfindung ist FGF-I.
In einem Ausführungsbeispiel kann eine Zusammensetzung einschließlich eine Mischung von anhaftungsverstärkenden Proteinen ein oder mehrere Serumproteine beinhalten. Wie hier verwendet, kann ein Serumprotein jedes aus einer Gruppe von Proteinen sein, für das bekannt ist, dass es eine Komponente des Serums ist, und beinhaltet funktionelle Äquivalente von solch natürlich vorkommenden Komponen ten, wie bspw. Fragmente von solchen Proteinen, die die biologische Aktivität des natürlich vorkommenden Proteins beibehalten. Ein Serumprotein ist kein Mitglied der TGFβ-Superfamilie, kein Knochenmatrixprotein und kein Wachstumsfaktor, wie diese hier beschrieben sind. Vorzugsweise beinhalten die anhaftungsverstärkenden Proteine mit zunehmender Präferenz zumindest ein, zwei, drei und höchst vorzugsweise vier verschiedene Serumproteine. Serumproteine, die geeignet sind zur Verwendung mit dem Produkt der vorliegenden Erfindung beinhalten ein oder mehr Albumine, Transferrin, α2-Hs GlycoP, IgG, α1-Antitrypsin, β2-Mikroglobulin, Apo A1 Lipoprotein (LP) und Faktor XIIIb. Vorzugsweise beinhalten Serumproteine, die geeignet sind, um mit dem Produkt der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, ein oder mehrere Albumine, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIb.
Eine in der vorliegenden Erfindung verwendete Zusammensetzung beinhaltet eine Mischung von Proteinen, die beinhaltet: transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1), knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-2, BMP-3 und BMP-7. Die Menge von TGFβ1 in der Mischung liegt bei etwa 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung, oder bei etwa 0,01 bis 1 %, oder bei 0,01 bis 0,5 %, oder bei 0,01 % bis 0,1 %, oder bei 0,05 bis 1 %, oder bei 0,05 bis 10 %, oder bei 0,1 bis 1 % oder bei 0,1 bis 10 % des Gesamtproteins. In einem Ausführungsbeispiel beträgt das Verhältnis von TGFβ1 zu allen anderen Proteinen in der Mischung bis zu 1:10. Die Menge von BMP-2 in der Mischung liegt typischerweise bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung, oder bei 0,01 bis 1 %, oder bei 0,01 bis 0,1 %, oder bei 0,1 bis 1 %, oder bei 0,1 bis 10 % des Gesamtproteins, und in einem Ausführungsbeispiel liegt sie in einer Menge von 0,1 % bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung. Die Menge von BMP-3 der Mischung liegt typischerweise bei 0,1 % bis 15 % des Gesamtproteins in der Mischung, oder bei 0,1 bis 1 %, oder bei 0,01 bis 15 %, oder bei 0,01 bis 1 % oder bei 0,01 bis 0,1 %, und in einem Ausführungsbeispiel liegt sie in einer Menge von 0,1 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung. Die Menge von BMP-7 in der Mischung liegt typischerweise bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung, oder bei 0,01 bis 1 %, oder bei 0,01 bis 0,1 %, oder bei 0,1 bis 1 %, oder bei 0,1 bis 10 % des Gesamtproteins, und in einem Ausführungsbeispiel liegt sie in einer Menge von 0,1 bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung. Die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen für jedes der oben bezeichneten Proteine sind im Stand der Technik bekannt und öffentlich zugänglich, bspw. durch eine Datenbank, wie bspw. GenBank. Zusätzlich können diese Proteine, sofern gewünscht, aus einer geeigneten Quelle, wie bspw. einem demineralisierten Knochen, gereinigt werden. Beispielsweise kann hochreines TGFβ-1 aus Rinderknochen isoliert werden, indem Methoden verwendet werden, die von Seyedin offenbart wurden (Ogawa et al., Meth. Enzymol., 198:317–327 (1991); Seyedin et al., PNAS, 82:2267–71 (1985)). Zusätzlich können aus Knochen stammende Mischungen von Proteinen, die diese Proteine in den wiedergegebenen Bereichen enthalten, aus demineralisiertem Knochen präpariert werden, indem Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind und hier in einigen Details diskutiert werden.
In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispiels weist die Mischung von Proteinen TGFβ-Superfamilie-Protein auf: TGFβ1, knochenmorphogenetisches Protein BMP-2, BMP-3 und BMP-7, wobei die TGFβ-Superfamilie-Proteine zusammen etwa 0,5 % bis etwa 100 % der Mischung von Proteinen umfassen. Alternativ können die TGFβ-Superfamilie-Proteine in einem prozentualen Anteil von 0,5 % bis 50 %, oder von 0,5 % bis 25 % der Mischung von Proteinen, oder von 1 % bis 10 % der Mischung von Proteinen vorliegen.
In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispiels beinhaltet die Mischung von Proteinen ferner eines oder mehrere der folgenden TGFβ-Superfamilie-Proteine: TGFβ2, TGFβ3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9 und knorpelabgeleitetes morphogenetisches Protein (CDMP), das ein oder mehrere von CDMP-1 (z.B. BMP-12), CDMP-2 (z.B. BMP-13) oder CDMP-3 (z.B. BMP-14) beinhalten kann. Die Menge von TGFβ2 in solch einer Mischung liegt typischerweise bei etwa 0,5 % bis etwa 12 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliches TGFβ2 hinzugegeben werden kann, sofern erwünscht, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zur Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu erhöhen, nämlich bis zu 20 % der Mischung. Die Menge von TGFβ3 in solch einer Mischung liegt typischerweise bei 0,01 % bis 15 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliches TGFβ3 hinzugegeben werden kann, sofern gewünscht, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zur Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu erhöhen, nämlich bis zu 25 % der Gesamtmischung. Die Menge von BMP-4 in solch einer Mischung umfasst typischerweise 0,01 % bis 1 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliches BMP-4 hinzugegeben werden kann, um die Anhaftung des Bindegewebes an Knochen zu erhöhen, sofern gewünscht, nämlich bis zu 10 % der Gesamtmischung von Proteinen. Die Menge von BMP-5 in der Mischung von Proteinen liegt typischerweise bei 0,01 % bis 1 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliches BMP-5 hinzugegeben werden kann, um die Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verstärken, sofern gewünscht, nämlich bis zu 10 % der Gesamtmischung von Proteinen. Die Menge von BMP-6 in der Mischung von Proteinen liegt typischerweise bei 0,01 % bis 1 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliches BMP-6 hinzugegeben werden kann, um die Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verstärken, sofern gewünscht, nämlich bis zu 10 % der Gesamtmischung von Proteinen. Die Menge von CDMPs in der Mischung von Proteinen liegt typischerweise bei 0,01 % bis 1 % der Gesamtmischung von Proteinen, obwohl zusätzliche CDMPs hinzugegeben werden können, um die Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verstärken, sofern gewünscht, nämlich bis zu 10 % der Gesamtmischung von Proteinen.
In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispieles kann die Mischung von Proteinen zusätzlich zumindest ein Knochenmatrixprotein beinhalten. Knochenmatrixproteine, einschließlich bevorzugte Knochenmatrixproteine zur Verwendung in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, werden weiter oben allgemein beschrieben. Die Knochenmatrixproteine liegen in der Mischung typischerweise in einer Menge von 20 % bis 98 % der Gesamtmischung von Proteinen vor, obwohl die Menge von Knochenmatrixproteinen niedriger als 20 % sein kann, sofern gewünscht. In einem Ausführungsbeispiel liegen die Knochenmatrixproteine in der Mischung in einer Menge von 40 % bis 98 % der Gesamtmischung von Proteinen vor.
In einem weiteren Aspekt dieses Ausführungsbeispiels kann die Mischung von Proteinen zusätzlich zumindest ein Wachstumsfaktorprotein beinhalten. Wachstumsfaktorproteine werden allgemein weiter oben beschrieben, einschließlich bevorzugte Wachstumsfaktorproteine zur Verwendung in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Typischerweise liegt das Wachstumsfaktorprotein in der Mischung von Proteinen in einer Menge von 0,01 % bis 50 % der Gesamtmischung von Proteinen. In anderen Ausführungsbeispielen liegt die Menge von Wachstumsfaktorprotein in der Mischung bei 0,5 % bis 25 % der Gesamtmischung von Proteinen; oder bei 0,1 % bis 10 % der Gesamtmischung von Proteinen. Wenn der Wachstumsfaktor FGF-I ist, liegt die Menge von FGF-I in der Mischung von Proteinen typischerweise bei 0,001 % bis 10 % der Gesamtmischung von Proteinen.
In einem anderen Aspekt dieses Ausführungsbeispiels kann die Mischung von Proteinen ein oder mehrere Serumproteine beinhalten. Solche Serumproteine werden allgemein oben beschrieben, einschließlich bevorzugte Serumproteine zur Verwendung in einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Serumproteine liegen typischerweise in der Mischung von Proteinen in einer Menge von 20 % bis 98 % der Gesamtmischung von Proteinen vor, obwohl die Menge von Serumproteinen kleiner sein kann als 20 %, sofern gewünscht. In einem Ausführungsbeispiel liegen die Serumproteine in der Mischung in einer Menge von 40 % bis 98 % der Gesamtmischung von Proteinen vor.
In einem Aspekt dieses Ausführungsbeispiels beinhaltet eine Mischung von Proteinen, die für eine Verwendung in einem Zusammensetzungsanteil eines Produktes geeignet ist, die folgenden Proteine: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, Osteocalcin, Osteonectin, BSP, Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Albumin, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIb. In einem anderen Ausführungsbeispiel beinhaltet eine geeignete Mischung von Proteinen die Mischung von Proteinen, die hier als Knochenprotein (BP) bezeichnet wird, die hier als eine teilweise gereinigte Proteinmischung aus Rinderröhrenknochen bezeichnet wird, wie beschrieben in Poser und Benedict, WO 95/13767.
In einem anderen Aspekt dieses Ausführungsbeispiels weist die Zusammensetzung eine oder mehrere der folgenden identifizierenden Eigenschaften auf: (1) eine Fähigkeit, die zelluläre Infiltration an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu induzieren; (2) eine Fähigkeit, die zelluläre Proliferation an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen zu induzieren; (3) eine Fähigkeit, die Bildung von Knochen an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu induzieren; (4) eine Fähigkeit, die Bildung von Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu induzieren, das ausgewählt ist aus Sehne und/oder Ligament; und (5) eine Fähigkeit, die Bildung von Faserknorpel und kalkhaltigem Knorpel an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu induzieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel induziert die Zusammensetzung im Wesentlichen nicht die Knochenresorption an der Stelle der Anhaftung.
In einem anderen Aspekt des Ausführungsbeispiels induziert die Mischung von Protein, wenn diese bei einer Konzentration von zumindest 10 μg pro 6,5–7,3 mg von Rindersehnenkollagen verwendet wird, in einem Subkutan-Assay in der Ratte einen Knochenwert von zumindest etwa 1,0, und weiter vorzugsweise von zumindest 1,25, und weiter vorzugsweise von zumindest 1,5, und weiter vorzugsweise von zumindest etwa 1,75, und weiter vorzugsweise von zumindest etwa 2,0, wobei die Knocheneinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 1 gezeigt ist (Beispiele 1 und 6), und induziert einen Knorpelwert von zumindest etwa 1,0, und weiter vorzugsweise von zumindest etwa 1,25, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,5 und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,75, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 2,0, wobei eine Knorpeleinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 8 dargestellt ist (Beispiel 6). Ein Subkutan-Assay in der Ratte, der zur Bestimmung der Knochen- und Knorpelwerte gemäß diesem Aspekt geeignet ist, und Einstufungsskalen der Tabellen 1 und 8 werden im Beispielabschnitt im Detail beschrieben.
In einem Ausführungsbeispiel kann eine geeignete Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durch deren Fähigkeit charakterisiert werden in Kombination mit einer Anhaftungsmatrix (z.B. einem Kollagenschwamm) und der Verwendung in einem Subkutan-Assay in der Ratte, wie in Beispiel 6 be schrieben, einen geordneten Ring einer Knochenbildung um die Peripherie des Kollagenschwammes zu induzieren. Eine geeignete Zusammensetzung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wenn diese in einem Subkutan-Assay in der Ratte verwendet wird, wie beschrieben in Beispiel 6, produziert insbesondere einen geordneten Ring an der Außenseite des Kollagenschwammes und direkt im Inneren des Ringes produziert diese einen geordneten Knorpelring. Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nehmen die Erfinder an, dass diese Eigenschaft auf Zusammensetzungen hinweist, die eine vorteilhafte Fixierung der Sehne an den Knochen ermöglichen.
In einem anderen Ausführungsbeispiel beinhaltet die Zusammensetzung eine Mischung von Proteinen, die eine aus dem Knochen stammende Formulierung mit chondrogenetischer und osteogenetischer Aktivität beinhaltet. Vorzugsweise weist eine Zusammensetzung, die eine solche aus dem Knochen stammende Formulierung aufweist, eine oder mehrere Eigenschaften auf, die folgende umfassen: (1) eine Fähigkeit an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen zelluläre Infiltration zu induzieren; (2) eine Fähigkeit an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zelluläre Proliferation zu induzieren; (3) eine Fähigkeit an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen die Bildung von Knochen zu induzieren; (4) eine Fähigkeit an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen die Bildung von Bindegewebe zu induzieren, das ausgewählt ist aus Sehne und/oder Ligament; und (5) eine Fähigkeit an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen die Bildung von Faserknorpel und kalkhaltigem Knorpel zu induzieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel induziert eine aus dem Knochen stammende Zusammensetzung, wenn diese bei einer Konzentration von zumindest etwa 10 μg pro 6,5–7,3 mg von Rindersehnenkollagen in einem Subkutan-Assay in der Ratte verwendet wird, einen Knochenwert von zumindest etwa 1,0, weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,25, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,5, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,75, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 2,0, wobei eine Knocheneinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 1 dargestellt ist (Beispiele 1 und 6), und induziert einen Knorpeleinstufungswert von zumindest etwa 1,0, weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,25, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,5 und weiter bevorzugt von zumindest etwa 1,75, und weiter bevorzugt von zumindest etwa 2,0, wobei eine Knorpeleinstufungsskala verwendet wird, die in Tabelle 8 dargestellt ist (Beispiel 6). In einem anderen Ausführungsbeispiel wird eine Zusammensetzung, die eine aus Knochen stammende Formulierung aufweist, durch deren Fähigkeit charakterisiert, wenn diese mit einer Anhaftungsmatrix (z.B. einem Kollagenschwamm) kombiniert und in einem Subkutan-Assay in der Ratte verwendet wird, wie in Beispiel 6, eine geordnete Knochenringbildung um die Peripherie des Kollagenschwammes zu induzieren. Eine geeignete Zusammensetzung für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wenn diese in einem Subkutan-Assay in der Ratte verwendet wird, wie beschrieben in Beispiel 6, produziert insbesondere einen geordneten Ring an der Außenseite des Kollagenschwammes und direkt im Inneren dieses Ringes einen geordneten Knorpelring.
Als eine „aus Knochen stammenden Formulierung mit osteogenetischer und chondrogenetischer Aktivität" wird eine beliebige Mischung von Proteinen bezeichnet, die eine komplexe Mischung von Proteinen enthält, die isoliert wird aus oder sich ableitet (z.B. durch zumindest einen und typischerweise mehrere Reinigungsschritte) von Anfangsmaterial aus Knochen, und die in vivo osteogenetisch und chondrogenetisch ist. Vorzugsweise ist die aus Knochen stammende Formulierung in der Lage Knochen- und Knorpelbildung in einem Subkutan-Assay in der Ratte in vivo zu induzieren, wie bspw. beschrieben in dem Beispielabschnitt des von Rosen modifizierten Nager-Assay von Sampath-Reddi (Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(21):6591–5 (1983)). Bevorzugte aus Knochen stammende Formulierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten insbesondere Knochenproteine (BP) und Unterfraktionen und damit verwandte Derivate. Der Beispielabschnitt beschreibt Beispiele von BP (Beispiele 5 und 6), Subfraktionen davon (Beispiele 5 und 8) und verwandte Derivate davon (Beispiel 7).
Das Ausgangsmaterial des Knochens kann eine Knochenprobe aus einer beliebigen Quelle sein, einschließlich Rinderknochen und humaner Knochen, ohne hierauf beschränkt zu sein. Der Knochen kann durch die Verwendung einer beliebigen Methode aus einer Anzahl von Methoden bearbeitet werden, die im Stand der Technik zur Herstellung von Zusammensetzungen, die osteogenetische und/oder chondrogenetische Aktivität aufweisen, bekannt sind (siehe bspw. US-Patent mit der Nummer 4,563,489 von Urist; US-Patent mit der Nummer 5,629,009 von Laurencin et al.; PCT-Veröffentlichung mit der Nummer WO 92/09697 von Bentz et al.; und Poser und Benedict, PCT-Veröffentlichung mit der Nummer WO 95/13767), und durch zusätzliche Verarbeitungsschritte verbessert werden, sofern erforderlich, um die Fähigkeit einer solchen Zusammensetzung zur Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verbessern (z.B. weitere Reinigung, um die relativen Spiegel ausgewählter Proteine zu erhöhen). Von einer „aus Knochen stammenden Formulierung" wird nicht gesprochen, um Mischungen aus einem oder mehreren rekombinanten Proteinen zu bezeichnen, da rekombinante Proteine nicht hergestellt werden, indem Knochen als Ausgangsmaterial verwendet wird.
Beispielsweise beinhaltet eine Methode zur Herstellung von Knochenproteinen, das bspw. beschrieben ist in dem US-Patent mit der Nr. 5,290,763 und der Bezeichnung „Osteoinductive Protein Mixtures and Purification Processes", und das durch Inbezugnahme hier vollständig inkorporiert ist, typischerweise die Schritte des Durchführens einer Anionenaustauschchromatographie mit einer Lösung aus demineralisiertem Knochenextrakt, eines Kationenaustauschverfahrens, und eines Umkehrphasen-HPLC-Verfahrens.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Proteine zu der Zusammensetzung als zusätzliche exogene Proteine hinzugegeben werden, und insbesondere zu einer aus Knochen stammenden Zusammensetzung. Als „exogenes Protein" wird ein solches Protein bezeichnet, das in im Wesentlichen reiner Form vorliegt und welches keinen Teil der aus Knochen stammenden osteogenetischen oder chondrogenetischen Formulierungen von Proteinen darstellt (d.h. das exogene Protein wurde nicht mit der aus Knochen stammenden osteogenetischen oder chondrogenetischen Formulierung von Proteinen isoliert). Das exogene Protein wird stattdessen zu der Formulierung als ein zusätzliches Protein aus einer unterschiedlichen Quelle hinzugegeben. Es versteht sich, dass die aus Knochen stammende osteogenetische oder chondrogenetische Formulierung von Proteinen natürlicherweise die gleichen Proteine (d.h. „endogene" Proteine) enthalten kann, die zusätzlich als eine exogene Quelle hinzugegeben werden können. Die Zugabe eines exogenen Proteins ist jedoch als Mittel zur Erhöhung der Gesamtmenge eines Proteins in der Zusammensetzung jenseits dessen gedacht, was natürlicherweise im Knochen und daraus stammenden Mischungen gefunden wird. Das exogene Protein kann ein rekombinantes Protein oder ein im Wesentlichen gereinigtes Protein aus jeder beliebigen Quelle sein, wie bspw. aus Knochen.
In einem Ausführungsbeispiel wird jedes der anhaftungsverstärkenden Proteine in der Zusammensetzung durch die Zusammensetzung bereitgestellt, und zwar entweder: (1) direkt als Protein, das mit der Matrix assoziiert ist, oder (2) als rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das mit der Matrix assoziiert ist, wobei ein solches rekombinantes Nucleinsäuremolekül für das Protein codiert und operativ mit einer Transkriptionskontrollsequenz verbunden ist, so dass das Protein unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden kann. Deshalb kann eine Zusammensetzung Proteine, rekombinante Nucleinsäuremoleküle oder eine Kombination von Proteinen und rekombinanten Nucleinsäuremolekülen beinhalten, wobei eine solche Zusammensetzung die anhaftungsverstärkenden oben beschriebenen Proteine bereitstellt.
Ein anhaftungsverstärkendes Protein kann aus dessen natürlicher Quelle erhalten werden, unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie produziert oder chemisch synthetisiert werden. Wie hier verwendet, kann ein anhaftungsverstärkendes Protein ein Protein mit voller Länge sein (d.h. in seiner natürlich vorkommenden Form mit voller Länge), ein Homolog eines solchen Proteins, ein beliebiges Fusionsprotein, das solch ein Protein enthält, oder ein Mimetop eines solchen Proteins. Die Aminosäuresequenzen für anhaftungsverstärkende Proteine, die hier offenbart sind, als auch Nucleinsäuresequenzen, die dieselben codieren, sind im Stand der Technik und öffentlich zugänglich, bspw. in Sequenzdatenbanken, wie bspw. GenBank. Solche Sequenzen können deshalb erhalten und dazu verwendet werden, um Proteine und rekombinante Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Ein Homolog ist als ein solches Protein definiert, in dem Aminosäuren deletiert (d.h. eine trunkierte Version des Proteins, wie bspw. ein Peptid oder Fragment), invertiert, invertiert, substituiert und/oder derivatisiert (z.B. durch Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Myristoylierung, Prenylierung, Palmitierung, Amidbildung und/oder Addition von Glycosylphosphatidylinositol) wurden. Ein Homolog eines anhaftungsverstärkenden Proteins ist ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausreichend ähnlich zu einer Aminosäuresequenz eines natürlicherweise vorkommenden anhaftungsverstärkenden Proteins ist, so dass das Homolog im Wesentlichen die gleichen oder verstärkte biologische Aktivität im Vergleich zu dem entsprechenden natürlicherweise vorkommenden Protein aufweist. Proteinhomologe können das Ergebnis einer natürlichen allelischen Variation oder natürlichen Mutation sein. In einem Ausführungsbeispiel weist ein anhaftungsverstärkendes Homolog eine Aminosäuresequenz auf, die zumindest etwa 6, weiter vorzugsweise zumindest etwa 12 und weiter bevorzugt zumindest etwa 24 aneinandergrenzende Aminosäurereste einer Aminosäuresequenz eines natürlicherweise vorkommenden (d.h. des Wildtyps) anhaftungsverstärkenden Proteins auf. In einem anderen Ausführungsbeispiel wird ein anhaftungsverstärkendes Homolog durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die zumindest etwa 18, und weiter vorzugsweise zumindest etwa 36, und weiter bevorzugt zumindest etwa 72 aneinendergrenzende Nucleotide einer Nucleinsäuresequenz aufweist, die für ein natürlicherweise vorkommendes anhaftungsverstärkendes Protein codiert.
Wie hier verwendet, bezeichnet ein Mimetop (auch als ein synthetischer Nachahmer bezeichnet) eines anhaftungsverstärkendes Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung eines beliebige Komponente, die in der Lage ist, die Aktivität eines natürlicherweise vorkommenden anhaftungsverstärkendes Protein nachzuahmen, häufig deshalb, da das Mimetop eine Struktur aufweist, die das anhaftungsverstärkende Protein nachahmt. In einem Ausführungsbeispiel wird ein Mimetop dahingehend identifiziert, dass dieses in der Lage ist von einem Antikörper gebunden zu werden, der selektiv an das natürlicherweise vorkommende Protein, auf dem das Mimetop basiert, bindet. Mimetope können, ohne dass dies beschränkend ist, Folgendes sein: Peptide, die modifiziert wurden, um deren Zugänglichkeit zur Degrada tion zu reduzieren; anti-idiotypische und/oder katalytische Antikörper oder Fragmente hiervon; nicht-proteinöse immunogene Anteile eines isolierten Proteins (z.B. Kohlenhydratestrukturen); und synthetische oder natürliche organische Moleküle, einschließlich Nucleinsäuren. Solche Mimetope können unter Verwendung von computergenerierten Strukturen von natürlicherweise vorkommenden anhaftungsverstärkenden Proteinen konstruiert werden. Mimetope können auch durch die Generierung von zufälligen Proben von Molekülen erhalten werden, wie bspw. Oligonucleotiden, Peptiden und anderen organischen oder anorganischen Molekülen, und durch Screenen solcher Proben durch Affinitätschromatographietechniken unter Verwendung der entsprechenden Bindungspartner. Mimetope können bspw. unter Verwendung computergenerierten dreidimensionalen Strukturen von anhaftungsverstärkenden Proteinen konstruiert werden. Mimetope können auch erhalten werden, indem zufällige Proben von Molekülen, wie bspw. Oligonucleotide, Peptide oder andere organische oder anorganische Moleküle generiert werden, und solche Proben auf die biologische Aktivität eines anhaftungsverstärkenden Proteins oder Affinität für einen Bindungspartner eines natürlicherweise vorkommenden anhaftungsverstärkenden Proteins gescreent werden.
Das Peptid und synthetische Mimetope von Proteinen können konstruiert werden, indem eine neue chemische oder biologische (z.B. Protein, Peptid, Antikörper, Gegensinn, Ribozym) Verdingungen geschaffen wird oder Datenbanken von Bibliotheken von bekannten Verbindungen gescreent werden (z.B. eine Komponente, die in einer rechentechnisch screenbaren Datenbank gelistet ist, die dreidimensionale Strukturen von bekannten Verbindungen enthält). Die Konstruktion kann auch durchgeführt werden, indem chemische oder biologische Komponenten simuliert werden, die substituierte Anteile an bestimmten strukturellen Merkmalen aufweisen. Der Schritt des Designens kann das Auswählen einer Komponente basierend auf einer bekannten Funktion der Komponente beinhalten. Ein bevorzugter Schritt des Designens umfasst das rechentechnische Screenen von einer oder mehreren Datenbanken von Komponenten, für die die dreidimensionale Struktur der Komponente bekannt ist und mit der dreidimensionalen Struktur (oder einer vorhergesagten dreidimensionalen Struktur) des Proteins durch den Computer interagiert (z.B. angekoppelt, ausgerichtet, gepaart, verbunden) wird (z.B. beschrieben von Humblet and Dunbar, Animal Reports in Medicinal Chemistry, Band 28, Seiten 275, 283, 1993, M. Venuti, ed., Academic Press). Methoden zur Synthese von geeigneten chemischen oder biologischen Verbindungen sind dem Fachmann bekannt und hängen von der Struktur des synthetisierten chemischen oder anderen Moleküls ab. Methoden, um die Bioaktivität der synthetisierten Verbindungen zu evaluieren, hängen von der Bioaktivität der Verbindung ab (z.B. inhibitorisch oder stimulatorisch) und sind hier offenbart.
Verschiedene Methoden des Arzneimitteldesigns sind offenbart in Maulik et al., 1997 Molecular Biotechnology; Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., die Publikation ist vollständig durch Inbezugnahme in die Anmeldung inkorporiert. Maulik et al. offenbaren bspw. Methoden des direkten Designs, in dem der Nutzer das Verfahren zur Herstellung von neuen Molekülen aus einer Fragmentbibliothek von geeignet ausgewählten Fragmenten steuert; randomisiertes Design, bei dem der Nutzer genetische oder andere Algorithmen verwendet, um Fragmente und deren Kombinationen zu mutieren, während gleichzeitig ein Selektionskriterium angewendet wird, um die Fitness der Kandidatenliganden zu evaluieren; und einen gitterbasierenden Ansatz, in dem der Nutzer die Interaktionsenergie zwischen dreidimensionalen Rezeptorstrukturen und Proben kleiner Fragmente berechnet, gefolgt durch ein miteinander Verbinden von bevorzugten Probenstellen.
In einer Methode des Arzneimitteldesigns ist es nicht immer erforderlich, eine Kandidatenverbindung (d.h. eine bspw. in einer rechentechnischen Screening-Methode analysierte Verbindung) an jeden Rest einer Zielstelle anzupassen. Geeignete Kandidatenverbindungen können sich an einer Untermenge von Resten, die für eine Zielstelle beschrieben sind, anpassen. Vorzugsweise weist eine Kandidatenverbindung eine Konformation auf, die die Bildung einer kovalenten oder nicht kovalenten Quervernetzung zwischen der Zielstelle und der Kandidatenverbindung fördert. Vorzugsweise bindet eine Kandidatenverbindung an die Oberfläche, die an die Zielstelle angrenzt, um eine zusätzliche Interaktionsstelle in einem Komplex bereitzustellen. Es versteht sich für einen Fachmann, dass es nicht erforderlich ist, dass sich die Komplementarität zwischen einer Kandidatenverbindung und einer Zielstelle über sämtliche Reste erstreckt, die hier beschrieben sind, um die Bindung eines Liganden zu inhibieren oder zu fördern.
Im Allgemeinen kann das Design einer chemischen oder biologischen Verbindung, die stereochemische Komplementarität aufweist, mittels Techniken bewerkstelligt werden, die chemisch oder geometrisch die „Passform" zwischen einer Verbindung und der Zielstelle optimieren. Solche Techniken sind bspw. offenbart in Sheridan und Venkataraghavan, Acc. Chem Res., Band 20, Seite 322, 1987; Goodford, J. Med. Chem, Band 27, Seite 557, 1984; Beddell; Chem. Soc. Reviews, Band 279, 1985; Hol, Angew. Chem, Band 25, Seite 767, 1986; und Verlinde und Hol, Structure, Band 2, Seite 577, 1994.
Ein Fusionsprotein ist ein Protein, das eine anhaftungsverstärkende proteinenthaltende Domäne beinhaltet, die an ein oder mehrere Fusionssegmente angebracht ist. Geeignete Fusionssegmente zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Segmente, die Folgendes können, nämlich: Die Stabilität eines Proteins verstärken; die biologische Aktivität eines anhaftungsverstärkenden Proteins verstärken; und/oder die Reinigung eines anhaftungsverstärkenden Proteins (z.B. Affinitätschromatographie) unterstützen. Ein geeignetes Fusionssegment kann eine Domäne mit einer beliebigen Größe sein, die die gewünschte Funktion aufweist (z.B. erhöhte Stabilität verleiht, dem Protein verstärkte biologische Aktivität verleiht, und/oder die Reinigung eines Proteins erleichtert). Fusionssegmente können mit den Amino- und/oder Carboxyltermini der anhaftungsverstärkenden proteinenthaltenden Domäne des Proteins verbunden werden, und können einer Spaltung zugänglich sein, um eine vereinfachte Rückgewinnung eines anhaftungsverstärkenden Proteins zu ermöglichen. Fusionsproteine werden vorzugsweise durch Kultivieren einer rekombinanten Zelle produziert, die mit einem Fusionsnucleinsäuremolekül transformiert wurde, das für ein Protein einschließlich dem Fusionssegmente codiert, das entweder an das Carboxyl- und/oder aminoterminale Ende einer anhaftungsverstärkenden proteinenthaltenden Domäne angebracht ist. Bevorzugte Fusionssegmente beinhalten eine metallbindende Domä ne (z.B. ein Polyhistidinsegment); eine immunglobulinbindende Domäne (z.B. Protein A; Protein G; T-Zelle, B-Zelle, Fc-Rezeptor oder komplementproteinantikörperbindende Domänen); eine zuckerbindende Domäne (z.B. eine maltosebindende Domäne; Streptavidin, Avidin, Biotin und/oder eine „Tag"-Domäne (zumindest einen Anteil einer β-Galactosidase, ein Strep-Tag-Peptid, oder andere Domänen, die gereinigt werden können, indem Verbindungen verwendet werden, die an die Domäne binden, wie bspw. monoklonale Antikörper).
Wie oben diskutiert, kann eines oder mehrere der anhaftungsverstärkenden Proteine in der Zusammensetzung durch die Zusammensetzung als ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt werden, das mit der Anhaftungsmatrix verbunden ist, wobei ein solches rekombinantes Nucleinsäuremolekül für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert und so operativ mit einer Transkriptionskontrollsequenz verbunden ist, dass das Protein unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden kann. Ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, kann ein isoliertes Nucleinsäuremolekül beinhalten, das für ein natürlicherweise vorkommendes anhaftungsverstärkendes Protein codiert, oder ein Homolog eines solchen Nucleinsäuremoleküls, wobei das Letztere weiter unten in näherem Detail beschrieben wird. Ein Nucleinsäuremolekül, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, kann eine oder mehrere regulatorische Regionen, Codierungsregionen mit voller Länge der Teile hiervon, oder Kombinationen davon beinhalten.
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus dessen natürlicher Umgebung entfernt wurde (d.h. welches menschlicher Manipulation unterzogen wurde) und kann DNA, RNA oder Derivate entweder von DNA oder RNA beinhalten. Als solches gibt „isoliert" nicht wieder, in welchem Ausmaß das Nucleinsäuremolekül gereinigt wurde. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert, kann aus dessen natürlicher Quelle isoliert werden oder unter Verwendung der rekombinanten DNA Technologie (z.B. Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Klonierung) oder chemische Synthese hergestellt werden. Isolierte Nucleinsäuremoleküle können bspw. natürliche allelische Varianten und homologe Nucleinsäuremoleküle beinhalten, die durch Nucleo tidinsertionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen auf eine Art und Weise modifiziert wurden, dass die Modifikationen nicht wesentlich mit der Fähigkeit des Nucleinsäuremoleküls interferieren, ein anhaftungsverstärkendes Protein der vorliegenden Erfindung zu codieren, oder stabile Hybride unter stringenten Bedingungen mit natürlichen Genisolaten zu bilden. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül kann Degenerationen beinhalten. Wie hier verwendet, beziehen sich Nucleotiddegenerationen auf das Phänomen, dass eine Aminosäure durch verschiedene Nucleotidcodons codiert werden kann. Deshalb kann die Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert, aufgrund von Degenerationen variieren.
Ein homologes Nucleinsäuremolekül kann unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden hergestellt werden, die für einen Fachmann bekannt sind (siehe bspw. Sambrook et al., a.a.O.). Beispielsweise können Nucleinsäuremoleküle modifiziert werden, indem eine Vielfalt von Techniken verwendet wird, einschließlich, jedoch nicht einschränkend hierauf, durch klassische Mutagenese und rekombinante DNA-Techniken (z.B. ortsgerichtete Mutagenese, chemische Behandlung, Spaltung mit Restriktionsenzymen, Ligation von Nucleinsäurefragmenten und/oder PCR-Amplifikation), oder Synthese von Oligonucleotidmischungen und Ligation von Gruppen der Mischung, um eine Mischung von Nucleinsäuremolekülen und Kombinationen hiervon „zu schaffen". Homologe Nucleinsäuremoleküle können durch Hybridisierung mit einem natürlich vorkommenden Gen oder durch Screenen nach der Funktion eines Proteins selektiert werden, das von den natürlicherweise vorkommenden Nucleinsäuremolekül codiert wird. Obwohl der Begriff „Nucleinsäuremolekül" sich zunächst auf das physikalische Nucleinsäuremolekül bezieht, und sich der Begriff „Nucleinsäuresequenz" zunächst auf die Sequenz von Nucleotiden in dem Nucleinsäuremolekül bezieht, können die beiden Begriffe austauschbar verwendet werden, insbesondere in Bezug auf ein Nucleinsäuremolekül, eine Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, für ein anhaftungsverstärkendes Protein zu codieren.
Bei Kenntnis der Nucleinsäuresequenz, die für ein natürlicherweise vorkommendes anhaftungsverstärkendes Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, ist es für einen Fachmann möglich, bspw. (a) Kopien dieser Nucleinsäuremoleküle herzustellen, und (b) Nucleinsäuremoleküle einschließlich zumindest einem Teil eines solchen Nucleinsäuremoleküls zu erhalten (z.B. Nucleinsäuremoleküle einschließlich Gene in voller Länge, Codierungsregionen in voller Länge, regulatorische Kontrollsequenzen, trunkierte Codierungsregionen). Solche Nucleinsäuremoleküle können auf eine Vielzahl von Wegen erhalten werden, einschließlich durch Screening von geeigneten Expressionsbibliotheken mit Antikörpern; traditionelle Klonierungstechniken unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, um geeignete Bibliotheken oder DNA zu screenen; und PCR-Amplifizierung von geeigneten Bibliotheken oder DNA unter Verwendung von Oligonucleotidprimern. Techniken zum Klonieren und Amplifizieren von Genen sind bspw. in Sambrook et al., a.a.O., offenbart.
Ein Nucleinsäuremolekül, das für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert, wird operativ mit einer oder mehreren Transkriptionskontrollsequenzen verbunden, um ein rekombinantes Molekül zu bilden. Die Bezeichnung „operativ verbunden" bezieht sich auf das Verbinden eines Nucleinsäuremoleküls mit einer Transkriptionskontrollsequenz auf die Art und Weise, dass das Molekül in der Lage ist, exprimiert zu werden, wenn es in eine Wirtszelle transfiziert (transformiert, transduziert oder transfiziert) wird. Ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül beinhaltet einen rekombinanten Vektor, bei dem es sich um eine beliebige Nucleinsäuresequenz, typischerweise eine heterologe Sequenz handelt, die operativ mit dem isolierten Nucleinsäuremolekül verbunden ist, das für das anhaftungsverstärkende Protein codiert, das in der Lage ist die rekombinante Herstellung des Proteins zu ermöglichen, und das in der Lage ist, die Nucleinsäuremoleküle in eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung einzubringen. Solch ein Vektor kann angrenzend an die isolierten Nucleinsäuremoleküle, die in den Vektor einzubringen sind, Nucleinsäuresequenzen enthalten, die nicht natürlicherweise gefunden werden. Der Vektor kann entweder RNA oder DNA sein, entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein, und ist vorzugsweise ein Virus oder ein Plasmid. Rekombinante Vektoren können in der Klonierung, Sequenzierung und/oder einer Manipulation von Nucleinsäuremolekülen auf andere Weise verwendet werden. Rekombinante Vektoren werden vorzugsweise zur Expression von Nucleinsäuremolekülen verwendet und können auch als Expressionsvektoren bezeichnet werden. Bevorzugte rekombinante Vektoren sind in der Lage in einer transfizierten Wirtszelle, und insbesondere in einer transfizierten Säugetierwirtszelle in vivo exprimiert zu werden.
Ein Typ eines rekombinanten Vektors, der für ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül nützlich ist, ist ein rekombinanter viraler Vektor. Solch ein Vektor ist operativ mit einer rekombinanten Nucleinsäuresequenz verbunden, die für ein Protein codiert, und das resultierende rekombinante Nucleinsäuremolekül ist in einer Virushülle verpackt, um einen rekombinanten Virus zu bilden. Das Protein kann durch den rekombinanten Virus in einer Wirtszelle in einem Tier in vivo und/oder ex vivo nach der Verabreichung exprimiert werden. Wenn das rekombinante Virus einem Tier verabreicht wird, infiziert es an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an den Knochen Zellen und steuert die Herstellung eines anhaftungsverstärkenden Proteins. Eine Vielzahl von rekombinanten viralen Vektoren kann verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt hierauf, jene, die auf Alphaviren basieren, Pockenviren, Adenoviren, Herpesviren, Lentiviren, adenoassoziierte Viren und Retroviren. Besonders bevorzugte virale Vektoren sind jene, die auf Adenoviren und adenoassoziierten Viren basieren. Virale Vektoren, die für das Einbringen von Genen geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt und können von dem Fachmann zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Eine detaillierte Diskussion von derzeitigen viralen Vektoren findet sich in „Molecular Biotechnolgy", zweite Ausgabe von Glick und Pasternak, ASM Press, Washington D.C., 1998, Seiten 555–590.
Ein adenoviraler Vektor infiziert ein großes Spektrum von sich nicht teilenden humanen Zellen und wurde umfangreich in Lebendimpfstoffen ohne schädliche Nebenwirkungen verwendet. Adenovirale Vektoren integrieren sich nicht in das Wirtsgenom, so dass in der Gentherapie, in der dieses System verwendet wird, eine periodische Verabreichung erforderlich ist, obwohl Methoden beschrieben wurden, die die Expressionszeit von adenoviral transferierten Genen verlängern, wie bspw. die Verabreichung von Antikörpern, die gegen T-Zellrezeptoren an der Expressionsstelle gerichtet sind (Sawchuk et al., 1996, Hum. Gene. Ther. 7:499–506). Eine Langzeitex pression mag nicht wünschenswert sein, da nach einer vollständigen Bildung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen eine anhaltende Expression von anhaftungsverstärkenden Proteinen nicht notwendig sein kann. Deshalb sind adenovirale Vektoren besonders geeignet. Die Effizienz der Adenovirus-vermittelten Einbringung von Genen kann verstärkt werden, indem ein Virus entwickelt wird, das vorzugsweise eine bestimmte Zielzelle infiziert. Beispielsweise kann ein Gen für die Anhaftungsfasern des Adenovirus konstruiert werden, um ein DNA-Element einzubringen, das für eine Proteindomäne codiert, die an einen zellspezifischen Rezeptor bindet. Beispiele einer erfolgreichen Einbringung und Expression von Genen durch adenovirale Vektoren in vivo sind gezeigt worden und werden unten in näherem Detail diskutiert.
Ein weiterer Typ von viralem Vektor basiert auf adenoassoziierten Viren, bei denen es sich um kleine, nicht pathogene, einzelsträngige humane Viren handelt. Dieses Virus kann sich in eine spezifische Stelle auf dem Chromosom 19 integrieren. Dieses Virus kann ein geklontes Insert von etwa 4,5 kb tragen, und wurde typischerweise erfolgreich dazu verwendet, um Proteine in vivo 70 Tage bis zumindest 5 Monate zu exprimieren. Eine vor kurzem erfolgte Publikation von Bennett et al. zeigte eine effiziente und stabile transgene Expression durch einen adenoassoziierten viralen Vektortransfer in vivo für mehr als 1 Jahr (Bennett et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9920–9925), wodurch demonstriert wird, dass der Stand der Technik auf dem Gebiet der Gentherapie rasch voranschreitet.
Wie oben diskutiert, beinhaltet ein rekombinantes Molekül eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die operativ mit einer Transkriptionskontrollsequenz verbunden ist. Transkriptionskontrollsequenzen sind Sequenzen, die die Initiation, Elongation und Termination der Transkription kontrollieren. Besonders wichtige Transkriptionskontrollsequenzen sind jene, die in zumindest einer der Wirtszellen funktionieren, die in dem Produkt und der Methode der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Ein Fachmann kennt eine Vielzahl von solchen Transkriptionskontrollsequenzen. Bevorzugte Transkriptionskontrollsequenzen beinhalten jene, die in Säugetier-, bakteriellen, Insektenzellen und vorzugsweise in Säugetierzellen funktionieren. Ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül kann selektiv (d.h. vorzugsweise, im Wesentli chen ausschließlich) in einer Zielzelle exprimiert werden, indem eine Transkriptionskontrollsequenz, und vorzugsweise ein Promoter ausgewählt wird, die bzw. der selektiv in der Zielzelle induziert wird und im Wesentlichen inaktiv in Nicht-Zielzellen bleibt.
Um das Protein herzustellen, können ein oder mehrere rekombinante Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die für ein anhaftungsverstärkendes Protein codieren. In einem Ausführungsbeispiel wird das Protein hergestellt, indem ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül unter Bedingungen exprimiert wird, die effektiv sind, um das Protein herzustellen. Eine bevorzugte Methode, um ein codiertes Protein herzustellen, besteht in dem Transfizieren einer Wirtszelle mit einem oder mehreren rekombinanten Molekülen, um eine rekombinante Zelle zu bilden. Geeignete Wirtszellen, um zu transfizieren, beinhalten jede beliebige Säugetierzelle, die transfiziert werden kann. Wirtszellen können entweder nicht transfizierte Zellen sein, oder Zellen, die bereits mit zumindest einem Nucleinsäuremolekül transfiziert wurden. Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können jede beliebige Zelle sein, die in der Lage ist, ein anhaftungsverstärkendes Protein zu produzieren. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Wirtszelle selber nützlich für die Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen. Eine besonders bevorzugte Wirtszelle beinhaltet eine fibrochondrozytäre, eine chondrozytäre, eine mesenchymale Vorläuferzelle, einen Osteoblasten, einen Fibroblasten, eine Sehnenzelle, eine Ligamentzelle oder jede andere Zelle, die als Vorläufer von Chondrozyten, Osteoblasten, Sehnenzellen oder Ligamentzellen dienen kann.
Wie unten im Detail beschrieben, ist eine Zusammensetzung zur Bereitstellung von anhaftungsverstärkenden Proteinen mit einer Anhaftungsmatrix assoziiert, so dass die Anhaftungsmatrix in einer Funktion als Einbringungsvehikel für die Zusammensetzung dient, die an die Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an den Knochen eingebracht werden soll. Geeignete Methoden, um eine Zusammensetzung, die anhaftungsverstärkende Proteine und/oder rekombinante Nucleinsäuremoleküle, die für solche Proteine codieren, enthalten, mit einer Anhaftungsmatrix zu assoziieren, beinhalten jede Methode, die es ermöglicht, die Proteine und/oder rekombinanten Nucleinsäuremoleküle, der Stelle der Anhaftung zusammen mit einer Anhaftungsmatrix zuzuführen, sodass das Anhaftungsprodukt wirksam ist, um die Reparatur und/oder Regeneration der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen an dieser Stelle zu verstärken, einschließlich sowohl ex-vivo- als auch in-vivo-Methoden. Solche Methoden der Assoziierung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das Suspendieren der Zusammensetzung im Inneren der Anhaftungsmatrix, das Gefriertrocknen der Zusammensetzung auf der Oberfläche der Matrix und das Suspendieren eines Trägers bzw. einer zuführenden Formulierung im Inneren der Matrix, die die Zusammensetzung enthält. Zusätzlich kann die Zusammensetzung mit der Matrix assoziiert sein, bevor das Produkt an der Anhaftungsstelle platziert wird (d.h. die Assoziierung der Zusammensetzung mit der Matrix erfolgt ex vivo) oder alternativ, eine Anhaftungsmatrix kann zuerst in die in-vivo-Stelle implantiert werden, gefolgt von der Assoziierung der Zusammensetzung mit der Matrix durch Injektion in oder auf die Oberseite der Matrix (d.h. die Assoziierung der Zusammensetzung mit der Matrix erfolgt in vivo). Eine Zusammensetzung kann zusätzliche Zuführungsformulierungen oder Träger enthalten, die die Assoziierung der Zusammensetzung mit der Matrix verstärken, die die Zuführung der Zusammensetzung zu den geeigneten Zellen und dem Gewebe an der Stelle der Läsion verstärken, und die das Kontrollieren der Freisetzung der Faktoren in der Zusammensetzung an der Stelle der Läsion unterstützen. Geeignete Zuführungsformulierungen beinhalten Zuführungsvehikel, die, wie hier verwendet, Verbindungen beinhalten, die die Halbwertszeit einer Verbindung in dem behandelten Tier erhöhen. Geeignete Zufuhrvehikel werden unten im Detail beschrieben.
„Ex vivo" bezieht sich auf das Durchführen eines Teils des regulatorischen Schrittes außerhalb des Patienten, wie bspw. das Assoziieren einer Zusammensetzung, die die anhaftungsverstärkenden Proteine aufweist, mit einer Matrix, und dem anschließenden Transplantieren der Matrix in den Patienten. Alternativ oder zusätzlich betrifft eine ex-vivo-Methode das Bereitstellen der anhaftungsverstärkenden Proteine gegenüber dem Patienten durch Transfizieren einer Population von Zellen (z.B. Zellen, die einem Patienten entnommen wurden) mit einem rekombinanten Molekül, das eine Nucleinsäuresequenz aufweist, die für anhaftungsverstärkende Proteine codiert, und zwar unter Bedingungen, die ein anschließendes Exprimieren des rekombinanten Moleküls durch die transfizierte Zelle ermöglichen. Die transfizierte Zelle wird dann mit der Anhaftungsmatrix assoziiert und die transfizierten Zellen werden in den Patienten zurückgegeben. Methoden, um eine solche Transfektion zu erzielen, beinhalten, ohne herauf beschränkt zu sein, Transfektion, virale Infektion, Elektroporation, Lipofektion, bakterieller Transfer, Sphäroplastenfusion und Adsorption.
Alternativ kann eine Anhaftungsmatrix in die Stelle der Anhaftung in den Patienten transplantiert werden, und die Zusammensetzung kann derart verabreicht werden, dass die Proteine und/oder rekombinanten Nucleinsäuremoleküle der Matrix zugeführt und mit dieser in vivo assoziieren. Methoden, um in vivo zu verabreichen, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, intravenöse Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, subkutane Verabreichung, transdermale Zufuhr, intraartikuläre Verabreichung, Inhalation (z.B. Aerosol), oral, Imprägnierung eines Katheters, und direkte Injektion in ein Gewebe. Bevorzugte Methoden der Verabreichung in vivo beinhalten intraartikuläre Injektion, Imprägnierung unter Verwendung eines Katheters, und direkte Injektion in die implantierte Matrix.
Gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird, wenn die anhaftungsverstärkenden Proteine als ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt werden, die Wirtszelle vorzugsweise in vivo transfiziert (d.h. in ein Säugetier), und zwar als Ergebnis der Verabreichung eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls in ein Säugetier, oder ex vivo, indem einem Säugetier Zellen entnommen und die Zellen mit einem rekombinanten Nucleinsäuremolekül ex vivo transfiziert werden. Die Transfektion eines Nucleinsäuremoleküls in eine Wirtszelle kann durch eine beliebige Methode bewerkstelligt werden, bei der ein Nucleinsäuremolekül in die Zelle in vivo oder ex vivo verabreicht werden kann, und beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion, Adsorption und virale Infektion. Die resultierende rekombinante Wirtszelle kann dann mit der Anhaftungsmatrix assoziiert sein, wenn sie nicht bereits mit einer solchen Matrix assoziiert ist, und zwar durch jede geeignete Methode, um die anhaftungsverstärkende Proteine bereitzustellen (in diesem Fall zu exprimieren).
Um ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül in eine Wirtszelle zu transfizieren, wird das rekombinante Molekül der Zielwirtszelle zugeführt. Wie oben diskutiert, können rekombinante Nucleinsäuremoleküle einer Wirtszelle entweder ex vivo zugeführt werden, wobei die Wirtszelle dann mit der Anhaftungsmatrix assoziiert ist, oder in vivo, wobei die Wirtszelle eine Zelle ist, die sich in der lokalen Umgebung der Anhaftungsmatrix befindet. Geeignete in-vivo- und/oder ex-vivo-Zuführungsmethoden für ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, folgende: (a) Zuführung eines nackten (d.h. nicht in eine Virushülle oder Zellmembran verpackten) Nucleinsäuremoleküls (z.B. als nackte DNA- oder RNA-Moleküle, wie bspw. in Wolff et al., 1990, Science 247, 1465–1468 beschrieben); (b) Verabreichung eines als rekombinantes Virus oder rekombinante Zelle verpackten Nucleinsäuremoleküls (d.h. das Nucleinsäuremolekül wird durch ein virales oder zelluläres Vehikel zugeführt), wobei das Virus oder die Zelle mit der Anhaftungsmatrix assoziiert ist; oder (c) Verabreichung eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls, das mit der Anhaftungsmatrix assoziiert ist, und zwar über ein Zufuhrvehikel, wie bspw. ein Liposom oder ein hier beschriebenes Nanosphären-Zufuhrsystem. Andere geeignete Zufuhrvehikel, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, beinhalten Goldpartikel, Poly-L-Lysin/DNA-Molekular-Konjugate, und künstliche Chromosomen. Einige der oben beschriebenen Zufuhrvehikel können auch dazu verwendet werden, um ein Protein einer Anhaftungsmatrix zuzuführen und/oder ein Protein mit der Anhaftungsmatrix zu assoziieren. Solche Zufuhrvehikel beinhalten bspw. ein Liposom und ein Nanosphären-Zufuhrvehikel.
Die Zufuhr von rekombinanten Molekülen in einem nicht zielgerichteten Träger, z.B. als „nackte" DNA-Moleküle, wird bspw. von Wolf et al., 1990 Science 247, 1465–1468, beschrieben. Solche rekombinanten Nucleinsäuremoleküle werden typischerweise über direkte oder intramuskuläre Verabreichung injiziert. Rekombinante Nucleinsäuremoleküle, die durch nackte DNA-Verabreichung verabreicht werden sollen, beinhalten ein Nucleinsäuremolekül, das für ein anhaftungsverstär kendes Protein codiert, und beinhalten vorzugsweise ein rekombinantes Molekül der vorliegenden Erfindung, das replikations- oder anderwertig amplifikationskompetent ist. Ein nacktes Nucleinsäurereagens der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere Nucleinsäuremoleküle enthalten, bspw. in Form eines dicistronischen rekombinanten Moleküls. Die Zufuhr von nackter Nucleinsäure kann intramuskuläre, subkutane, intradermale, transdermale, intranasale und andere Wege der Verabreichung beinhalten, wobei die direkte Injektion in das Zielgewebe am meisten bevorzugt ist. Eine bevorzugte einzelne Dosis eines Impfstoffes mit nackter DNA bewegt sich von etwa 1 Nanogramm (ng) bis etwa 100 μg, und zwar abhängig von dem Verabreichungsweg und/oder der Zufuhrmethode, und lässt sich von einem Fachmann bestimmen. In einem Ausführungsbeispiel bedecken reine DNA-Konstrukte die Oberfläche von Goldpartikeln (1 bis 3 μm im Durchmesser) und werden mit einer „Genkanone" in Hautzellen oder in den Muskel getrieben. Einige Publikationen von Dzau und Mitarbeitern demonstrieren die erfolgreiche Zufuhr und Expression eines Genes in vivo in Zellen des Herzens, einschließlich Kardialmyozyten, Fibroblasten und vaskuläre Glattmuskelzellen, und zwar unter Verwendung von nackter DNA oder Parainfluenzavirus-I-Liposomen-Zufuhr, verabreicht sowohl durch Inkubation in dem Pericard als auch Infusion in eine Koronararterie (Intrakoronar-Zufuhr) (siehe bspw. Aoki et al., 1997, J. Mol. Cell, Cardiol. 29:949–959; Kaneda et al., 1997, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811:299–308; und von der Leyen et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1137-1141).
Die Zufuhr einer Vielzahl von Nucleinsäuresequenzen wurde durch die Verabreichung von viralen Vektoren bewerkstelligt, die für die Nucleinsäuresequenzen codieren. Unter Verwendung solcher Vektoren wurde die erfolgreiche Zufuhr und Expression unter Verwendung der ex-vivo-Zufuhr (siehe als einen von vielen Beispielen, retroviraler Vektor; Blaese et al., 1995, Science 270:475–480; Bordignon et al., 1995, Science 270:470–475), der nasalen Verabreichung (CFTR-Adenovirus-assoziierter Vektor), der intrakoronaren Verabreichung (adenoviraler Vektor und Parainfluenzavirus I, siehe Dzau und Mitarbeiter, oben), der intravenösen Verabreichung (Adeno-assozüerter viraler Vektor; Koeberl et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1426–1431) erreicht. Die Genzufuhr in Synoviagrenzzellen war nachweislich erfolgreich. Oligino und Kollegen berichten über die Verwendung eines viralen Herpes-Simplex-Vektors, der für die sehr frühen Gene ICP4, 22 und 27 defekt war, um zwei verschiedene Rezeptoren Synoviagrenzzellen in vivo zuzuführen und darin zu exprimieren (Oligino et al., 1999, Gene Ther. 6:1713–1720). Die Herpes-Vektoren wurden durch intraartikuläre Injektion verabreicht. Kuboki et al. verwendeten einen Gentransfer über die Vermittlung durch einen adenoviralen Vektor und intraartikuläre Injektion, um erfolgreich und spezifisch ein Gen in den Kiefergelenken von Meerschweinchen in vivo zu exprimieren (Kuboki et al., 1999, Arch. Oral. Biol. 44:701–709). Apparailly und Kollegen verabreichen systemisch Mäusen adenovirale Vektoren, die für IL-10 codierten, und demonstrierten die erfolgreiche Expression des Genproduktes und deutliche therapeutische Effekte in der Behandlung von experimentell induzierter Arthritis (Apparailly et al., 1998, J. Immunol. 160:5213–5220). In einer weiteren Studie wurde ein auf dem Mausleukämievirus basierender retroviraler Vektor dazu verwendet, um (durch intraartikuläre Injektion) das Gen für das humane Wachstumshormon sowohl ex vivo als auch in vivo zuzuführen und zu exprimieren durch intraartikuläre Injektion. Diese Studie zeigte, dass die Expression durch Gentransfer in vivo zumindest äquivalent zu dem Gentransfer ex vivo ist. Wie oben diskutiert, berichteten Sawchuk et al. die erfolgreiche Zufuhr eines Genes mittels einem adenoviralen Vektor durch intraartikuläre Injektion, und die anhaltende Expression des Genes im Synovium durch Vorbehandlung des Gelenkes mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen den T-Zell-Rezeptor gerichtet war (Sawchuk et al., 1996, ibid.). Letztlich ist festzustellen, dass der Gentransfer ex vivo von humanem Interleukin-I-Rezeptor-Antagonisten unter Verwendung eines Retrovirus hohe Spiegel von intraartikulärer Expression und therapeutische Effizienz in der Behandlung von Arthritis liefert, und nun einer von der FDA genehmigten Studie zur humanen Gentherapie unterzogen wird (Evans and Robbins, 1996, Curr. Opin. Rheumatol. 8:230–234). Deshalb hat der Stand der Technik zur Gentherapie die FDA dazu veranlasst, die humane Gentherapie als geeignete Strategie zumindest für die Behandlung von Arthritis in Erwägung zu ziehen. Zusammengefasst, sämtliche der oben genannten Studien liefern Hinweise, dass die Zufuhr und Expression von Protein, das durch ein rekombinates Nucleinsäuremolekül codiert wird, realisierbar ist.
Eine weitere Form oder ein Ausführungsbeispiel zur Zufuhr eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls zu einer gewünschten Zielstelle oder Zelle betrifft die Liposomenzufuhr. In diesem Ausführungsbeispiel wird ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung einem Patienten in einem Liposomenzufuhrvehikel verabreicht, wobei das rekombinante Nucleinsäuremolekül in die Wirtszelle (d.h. die Zielzelle) durch Lipofektion eindringt. Ein Liposomenzufuhrvehikel weist eine Lipidzusammensetzung auf, die in der Lage ist, rekombinante Nucleinsäuremoleküle, einschließlich sowohl Plasmide als auch virale Vektoren, einer geeigneten Zelle und/oder einem Gewebe in einem Patienten zuzuführen. Ein Liposomenzufuhrvehikel weist eine Lipidzusammensetzung auf, die in der Lage ist, mit der Plasmamembran der Zielzelle zu fusionieren, um das rekombinante Nucleinsäuremolekül einer Zelle zuzuführen.
Ein Liposomenzufuhrvehikel kann modifiziert sein, um eine bestimmte Stelle in einem Säugetier zielgerichtet zu erreichen (d.h. ein zielausgerichtetes Liposom), wobei ein Nucleinsäuremolekül dieser Stelle zielgerichtet zugeführt wird und Letztere das Nucleinsäuremolekül nutzt. Geeignete Modifizierungen beinhalten das Manipulieren der chemischen Formel des Lipidanteils des Zufuhrvehikels. Das Manipulieren der chemischen Formel des Lipidanteils des Zufuhrvehikels kann dem Zufuhrvehikel eine extrazelluläre oder intrazelluläre Zielausrichtung verleihen. Beispielsweise kann eine Chemikalie der Lipidformel eines Liposoms hinzugegeben werden, die die Ladung der Lipiddoppelschicht des Liposoms so verändert, dass das Liposom mit besonderen Zellen, die besondere Ladungseigenschaften aufweisen, fusioniert. Weitere Zielausrichtungsmechanismen beinhalten das zielgerichtete Zuführen zu einer Stelle durch das Hinzufügung von exogenen Zielausrichtungsmolekülen (d.h. Zielausrichtungsagenzien, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Antikörper, lösliche Rezeptoren oder Liganden), die mit dem Liposom inkorporiert werden, um auf eine besondere Zelle oder ein Gewebe zielausgerichtet zu werden, an die bzw. an das das zielausgerichtete Molekül binden kann. Zielausgerichtete Liposomen werden bspw. beschrieben in Ho et al., 1986, Biochemistry 25: 5500–6; Ho et al., 1987a, J. Biol. Chem. 262: 13979–84; Ho et al., 1987b, J. Biol. Chem. 262:13973–8; and U.S. Patent No. 4,957,735 to Huang et al.
Ein Liposomenzufuhrvehikel ist vorzugsweise in der Lage in einem Patienten für eine bestimmte Zeit stabil zu bleiben, die ausreichend ist, um ein Nucleinsäuremolekül einer bevorzugten Stelle in dem Patienten (d.h. einer Zielzelle) zuzuführen. Ein Liposomenzufuhrvehikel ist vorzugsweise für zumindest etwa 30 Min., weiter bevorzugt für zumindest etwa 1 Std., und weiter bevorzugt für zumindest etwa 24 Std. in dem Patienten stabil, dem es verabreicht wurde. Ein bevorzugtes Liposomenzufuhrvehikel weist eine Größe von 0,01 μm bis 1 μm auf.
Geeignete Liposomen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten jedes beliebige Liposom. Bevorzugte Liposomen der vorliegenden Erfindung beinhalten jene Liposomen, die üblicherweise bspw. in Genzufuhrmethoden verwendet werden, die einem Fachmann bekannt sind. Bevorzugte Liposomenzufuhrvehikel weisen multilamellare Vesikel(MLV)-Lipide und extrudierte Lipide auf. Methoden zur Herstellung von MLVs sind im Stand der Technik gut bekannt und werden bspw. in dem Beispielabschnitt beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind „extrudierte Lipide" Lipide, die entsprechend MLV-Lipiden hergestellt werden, die jedoch anschließend durch Filter von zunehmender Größe extrudiert werden, wie beschrieben in Templeton et al., 1997, Nature Biotech., 15:647–652, die Publikation ist vollständig durch Inbezugnahme Bestandteil der Anmeldung. Kleine unilamellare Vesikel(SUV)-Lipide können ebenfalls für die vorliegende Erfindung verwendet werden. In einem Ausführungsbeispiel weisen die Liposomenzufuhrvehikel Liposome auf, die eine polykationische Lipidzusammensetzung haben (d.h. kationische Liposomen), und/oder Liposomen, die ein Cholesterinrückgrat haben, das mit einem Polyethylenglykol konjugiert ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weisen die Liposomenzufuhrvehikel, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, ein oder mehrere Lipide auf, die ausgewählt sind aus der Gruppe von DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB, und Cholesterin.
Vorzugsweise beträgt die Transfektionseffizienz eines Nucleinsäure-Liposomenkomplexes der vorliegenden Erfindung zumindest etwa 1 Pikogramm (pg) von Protein, das pro Milligramm (mg) des Gewebegesamtproteins pro Mikrogramm (μg) von zugeführter Nucleinsäure exprimiert wird. Weiter bevorzugt ist die Transfek tionseffizienz eines Nucleinsäure-Liposomenkomplexes der vorliegenden Erfindung zumindest etwa 10 pg von Protein, das pro mg von Gewebegesamtprotein pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert wird; und weiter bevorzugt zumindest etwa 50 pg von Protein, das pro mg von Gewebegesamtprotein pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert wird; und höchst bevorzugt zumindest etwa 100 pg von Protein, das pro mg von Gewebegesamtprotein pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert wird.
Das Komplexieren eines Liposoms mit einem Nucleinsäuremolekül kann unter Verwendung von Standardmethoden aus dem Stand der Technik erreicht werden. Eine geeignete Konzentration eines zu einem Liposom zuzugebenden Nucleinsäuremoleküls beinhaltet eine Konzentration, die effektiv ist, um eine ausreichende Menge eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls einer Zielzelle eines Patienten zuzuführen, so dass das anhaftungsverstärkende Protein, das von dem Nucleinsäuremolekül codiert wird, in einer Menge exprimiert wird, die effektiv ist, um zu der Verstärkung der Anhaftung des Bindegewebes an den Knochen in einem Patienten beizutragen. Vorzugsweise wird etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg des Nucleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung mit etwa 8 nmol Liposomen kombiniert. In einem Ausführungsbeispiel ist das Verhältnis von Nucleinsäuren zu Lipiden (μg Nucleinsäure:nmol Lipide) in einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zumindest etwa 1:10 bis etwa 6:1 Nucleinsäure:Lipid bezogen auf das Gewicht (d.h. 1:10 = 1 μg Nucleinsäure:10 nmol Lipid).
Unter Verwendung der Liposomenzufuhr wird in dem US-Patent mit der Nummer 5,705,151, das am 6. Januar 1998 für Dow et al. erteilt wurde, die erfolgreiche intravenöse Zufuhr eines Nucleinsäuremoleküls in vivo, das für ein Superantigen codiert und eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein Zytokin codiert, in einem kationischen Liposomenzufuhrvehikel beschrieben, wobei die codierten Proteine in Geweben des Tieres, und insbesondere in den Lungengeweben, exprimiert wurden. Wie oben diskutiert, demonstrierten Liu et al., 1997, a.a.O., dass die intravenöse Zufuhr von cholesterinenthaltenden kationischen Liposomen, die Gene enthielten, vorzugsweise auf Lungengewebe zielausgerichtet waren und effektiv den Transfer und die Expression der Gene in vivo vermittelt. Ferner, wie oben diskutiert, konnten Dzau und Mitarbeiter die erfolgreiche Zufuhr und Expression eines Genes in vivo in Zellen des Herzens demonstrieren, wozu die Zufuhr eines Parainfluenzavirus-I-Liposoms verwendet wurde, wobei sowohl eine Inkubation im Perikard als auch eine Infusion in eine Koronararterie verabreicht wurde.
Eine weitere Methode der Zufuhr von entweder einem rekombinanten Nucleinsäuremolekül, das für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert, oder einem isolierten anhaftungsverstärkenden Protein in eine Wirtszelle, betrifft die Verwendung eines Nanosphären-Zufuhrvehikels. Ein Nanosphären-Zufuhrvehikel gemäß der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Nanosphären-Zufuhrvehikel, das in der europäischen Patentanmeldung mit der Nummer 0 896 825 81, die am 17. Februar 1999 veröffentlicht wurde, beschrieben wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel beinhaltet ein solches Zufuhrvehikel Polymerpartikel, die eine Größe von weniger als 1000 nm aufweisen und mit 0,001 Gew. % bis 17 Gew.-% der anhaftungsverstärkenden Zusammensetzung beladen werden. Die Nanosphären haben ein Freisetzungsratenprofil, das analytisch in vitro bestimmt werden kann, mit einem anfänglichen Aktivitätsschub von etwa 10 % bis etwa 20 % der Gesamtmenge der Zusammensetzung über eine Zeitraum der ersten 24 Stunden, und eine Langzeitfreisetzungsrate von zumindest 0,1 % pro Tag, zumindest während der sieben folgenden Tage. Als ein Nanosphären-Zufuhrvehikel wird ein einziger Typ eines Vehikels mit kontrollierter Freisetzung bezeichnet, das in der Lage ist, eine Zusammensetzung (Proteine und/oder rekombinante Nucleinsäuremoleküle) der vorliegenden Erfindung in ein Tier langsam freizusetzen. Wie hier verwendet, weist eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül in einem Vehikel zur kontrollierten Freisetzung auf. Andere geeignete Vehikel zur kontrollierten Freisetzung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, biokompatible Polymere, andere Polymere Matrices, Kapseln, Mikrokapseln, Mikropartikel, Boluspräparationen, osmotische Pumpen, Diffusionsvorrichtungen, Liposomen, Liposphären und transdermale Zufuhrsysteme. Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung können Flüssigkeiten beinhalten, die nach der Assoziierung mit der Matrix oder der Verabreichung in ein Tier in situ einen Feststoff oder ein Gel bilden. Solche Vehikel zur kontrollierten Freisetzung werden vorzugsweise mit der Anhaftungsmatrix durch eine der oben beschriebenen Methoden assoziiert. Bevorzugte Formulierungen zur kontrollierten Freisetzung sind biodegradierbar (d.h. bioerodierbar).
Eine bevorzugte Formulierung zur kontrollierten Freisetzung ist in der Lage eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen mit einer konstanten Rate freizusetzen, die ausreichend ist, um therapeutische Dosisspiegel der anhaftungsverstärkenden Proteine zu erzielen, die durch die Zusammensetzung bereitgestellt werden, um eine Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu erreichen. Ein besonders bevorzugtes Vehikel zur kontrollierten Freisetzung ist ein Nanosphären-Zufuhrvehikel, wie oben beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Zufuhrvehikeln kann eine Zusammensetzung ebenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhalten. Geeignete Träger beinhalten Träger oder Formulierungen, die transportieren oder bei dem Transport assistieren, jedoch ein Nucleinsäuremolekül nicht spezifisch auf eine Zelle zielausrichten (diese werden hier auch als nicht-zielausrichtende Träger bezeichnet). Beispiele von pharmazeutisch akzeptablen Trägern beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Wasser, phosphatgepufferte Saline, Ringer-Lösung, Dextroselösung, serumenthaltende Lösungen, Hanks-Lösung, andere wässrige physiologisch ausgeglichene Lösungen, Öle, Ester und Glykole. Wässrige Träger können geeignete Hilfssubstanzen enthalten, die dazu erforderlich sind, um sich an die physiologischen Bedingungen des Empfängers anzugleichen, bspw. um die chemische Stabilität und Isotonizität zu verstärken.
Geeignete Hilfssubstanzen beinhalten bspw. Natriumacetat, Natriumchlorid, Natriumlactat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, und andere Substanzen, die dazu verwendet werden, um Phosphatpuffer, Trispuffer und Bicarbonatpuffer herzustellen. Hilfssubstanzen können auch Konservierungsstoffe beinhalten, wie bspw. Thimerosal, oder O-cresol, Formalin und Benzolalkohol. Die Zusammensetzungen können durch übliche Methoden sterilisiert und/oder lyophilisiert werden.
In dem Anhaftungsprodukt liegt eine Zusammensetzung in einer Konzentration vor, die effektiv ist, um an der Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an den Knochen etwas oder mehreres des Folgenden zu induzieren: eine komplexe Fächermorphologie und Übergangszonen von Faserknorpel und kalkhaltigem Knorpel zwischen dem Bindegewebe und dem Knochen, die Induktion von zellulärer Infiltration in das Produkt, die Induktion von zellulärer Proliferation, und die Produktion von zellulärer und räumlicher Organisation, um ein dreidimensionales Gebilde zu bilden, das annähernd die endogene Anhaftung von Bindegewebe an Knochen wiedergibt. Vorzugsweise liegt eine Zusammensetzung in dem Anhaftungsprodukt bei einer Konzentration vor, die effektiv ist, um die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung zu induzieren. Wenn die anhaftungsverstärkenden Proteine durch die Zusammensetzung direkt als Protein bereitgestellt werden, wird die Zusammensetzung typischerweise bei einer Konzentration von 0,5 Gew. % bis 33 Gew.-% des Anhaftungsproduktes bereitgestellt. Weiter bevorzugt wird die Zusammensetzung bei einer Konzentration von 1 Gew. % bis 20 Gew.-% des Anhaftungsproduktes bereitgestellt. Wenn ein oder mehrere der anhaftungsverstärkenden Proteine durch die Zusammensetzung als rekombinantes Nucleinsäuremolekül bereitgestellt werden, beträgt eine geeignete Konzentration eines Nucleinsäuremoleküls, das ein anhaftungsverstärkendes Protein exprimiert, eine Menge, die in zumindest einem Pikogramm von Proteinen resultiert, das pro mg von Gewebegesamtprotein an der Zufuhrstelle pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert wird, und weiter bevorzugt eine Menge, die zu zumindest etwa 10 pg Protein führt, die pro mg von Gewebegesamtprotein pro mg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert werden; und weiter bevorzugt zu zumindest etwa 50 pg Protein führen, die pro mg von Gewebegesamtprotein pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert werden; und höchst bevorzugt zu zumindest etwa 100 pg Protein führen, die pro mg von Gewebegesamtprotein pro μg von zugeführter Nucleinsäure exprimiert werden. Ein Fachmann ist in der Lage, die Konzentration von Proteinen und/oder Nucleinsäuremolekülen in der Zusammensetzung in Abhängigkeit der Typen und Anzahl von Proteinen, die durch die Zusammensetzung bereitgestellt werden sollen, und von dem verwendeten Zufuhrvehikel, einzustellen.
In einem anderen Ausführungsbeispiel des Produktes kann eine Zusammensetzung auch einen Faktor enthalten, der nicht-kovalent an eines oder mehrere eines beliebigen anhaftungsverstärkenden Proteins oder rekombinanten Nucleinsäuremoleküls in der Zusammensetzung angebracht ist, und dadurch die Freisetzungsrate des Faktors modifiziert. Solche Faktoren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, jede beliebige Grundsubstanz oder synthetische Polymersubstanz. Wie hier verwendet, wird eine Grundsubstanz als eine nicht-lebende Matrix von Bindegewebe definiert, die natürliche Polymere und Proteoglycane beinhaltet. Dementsprechend ist eine Grundsubstanz eine natürlicherweise vorkommende Substanz, obwohl eine solche Substanz synthetisch produziert werden kann, wenn einmal die Formel und Struktur bekannt ist. Natürlich Polymere beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Kollagen, Elastin, Reticulin und Analoge hiervon. Proteoglycane beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, jedes Glycosaminoglycan-enthaltende Molekül, und beinhalten Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat und Hyaluronan. Bevorzugte Grundsubstanzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Typ-I-Kollagen, Typ-II-Kollagen, Typ-III-Kollagen, Typ-IV-Kollagen und Hyaluronsäure. Bevorzugte synthetische Polymersubstanzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Poly(Milchsäure) und Poly(Glycolsäure). In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist der Faktor ein Glycosaminoglycan.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann die Zusammensetzung einen oder mehrere Typen von Zellen beinhalten, die bereitgestellt werden, um die Anhaftung des Bindegewebes an Knochen an der Stelle der Anhaftung weiter zu verstärken. Solche Zellen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine Fibrochondrocyte, eine Chondrocyte, eine mesenchymale Vorläuferzelle, einen Osteoblasten, einen Fibroblasten, eine Sehnenzelle, eine Ligamentzelle und jede beliebige andere Zelle, die als Vorläufer von Chondrocyten, Osteoblasten, Sehnenzellen oder Ligamentzellen dienen kann. Solche Zellen können mit der Zusammensetzung und der Matrix durch eine beliebige der oben beschriebenen Methoden assoziiert werden. In einem Ausführungsbeispiel sind zumindest einige der Zellen mit einem rekombinanten Nucleinsäuremolekül transformiert, das für ein anhaftungsverstärkendes Protein codiert, um eine rekombinante Zelle zu bilden. In diesem Ausführungsbeispiel wird die rekombi nante Zelle mit der Anhaftungsmatrix „ex vivo" oder „in vivo" durch jede geeignete wie zuvor hier beschriebene Methode assoziiert. Zusätzlich oder alternativ kann das Produkt Zellen beinhalten, die mit einer Mischung von anhaftungsverstärkenden Proteinen kultiviert wurden, wie hier zuvor beschrieben.
Vorzugsweise sind die Zellen, die mit der Mischung von Proteinen kultiviert werden können, solche Zellen, die in die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe (d.h. von Sehne und/oder Ligament) an den Knochen involviert sind, und beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Fibrochondrocyten, Chondrocyten, mesenchymale Vorläufer, Osteoblasten, Fibroblasten und jede andere beliebige Zelle, die als ein Chondrocyten-Vorläufer dienen kann. Solche Zellen werden vorzugsweise in vitro (d.h. ex vivo) vor deren Assoziierung mit einer Matrix unter Bedingungen kultiviert, die effektiv sind, um es zu ermöglichen, dass die Zellen mit den Proteinen interagieren und die Differenzierung in den Zellen initiieren. Effektive Kulturbedingungen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, effektives Medium, Bioreaktor, Temperatur, pH und Sauerstoffbedingungen, die die Interaktion der Proteine und Zellen und die Initiation von Differenzierungs- und Proliferationsprozesse der Zellen ermöglichen. Unter einem effektiven Medium wird ein beliebiges Medium verstanden, in dem eine Zelle kultiviert wird und die ein solches Ergebnis liefert. Ein solches Medium weist typischerweise ein wässriges Medium mit assimilierbarem Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphatquellen, und geeigneten Salzen, Mineralien, Metallen und anderen Nährstoffen, wie bspw. Vitaminen, auf. Die Zellen können in üblichen Fermentierungsbioreaktoren, Schüttelflaschen, Teströhrchen, Mikrotiterplatten und Petri-Schalen kultiviert werden. Die Kultivierung kann bei einer Temperatur, einem pH und einem Sauerstoffgehalt durchgeführt werden, die bzw. der für die Zelle geeignet ist. Solche Kulturbedingungen gehören zu dem Fachwissen des Fachmannes. In einem anderen Aspekt dieses Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung wird die Anhaftungsmatrix in vitro (d.h. ex vivo) zusammen mit den Zellen und der Mischung von Proteinen vor der Implantation an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen in vivo kultiviert. In einem weiteren Ausführungsbeispiel können die Zellen, die mit der Mischung von Proteinen kultiviert wurden, mit der Anhaftungsmatrix in Verbindung mit weiteren anhaftungsverstärkenden Proteinen und/oder rekombinanten Nucleinsäuremolekülen, die für solche Proteine codieren, assoziiert sein, wie oben beschrieben.
Das Produkt zur Verstärkung der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen beinhaltet auch eine Anhaftungsmatrix, die dazu ausgestaltet ist, eine Zwischenschicht zwischen dem Bindegewebe und dem Knochen zu bilden. Die Anhaftungsmatrix ist die Komponente des Produktes, die ein Vehikel zur Zufuhr der Zusammensetzung an die Stelle der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen bereitstellt, und die Matrix stellt ferner ein geeignetes Gerüst bereit, an dem sich die Anhaftung des Bindegewebes an Knochen und die Bildung einer im Wesentlichen physiologischen normalen Zwischenschicht zwischen Knochen, Knorpel, und Bindegewebe bilden kann. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Anhaftungsmatrix bioresorbierbar.
Eine Matrix, die als „Zwischenschicht zwischen Bindegewebe und Knochen ausgestaltet ist" ist eine Matrix, die entweder vor oder zum Zeitpunkt des Implantierens der Matrix in den Patienten eine Form aufweist oder in eine solche Form gebracht wird, die für die Zwecke des Anhaftens einer Sehne oder eines Ligamentes an den Knochen geeignet ist. Beispielsweise liegt die Matrix in einem Ausführungsbeispiel in Form einer Schicht vor, die dazu ausgebildet ist, um zwischen dem Bindegewebe und dem Knochen eine Zwischenschicht zu bilden, in dem die Schicht um den Sehnen- oder Ligamentansatz auf solch einer Weise herumgewickelt wird, dass die Schicht eine Zwischenschicht mit dem Knochen und der Anhaftungsstelle des Knochens bilden kann. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Matrix ausgebildet, um die Maße eines Sehnen- oder Ligamentansatzes aufzuweisen, der mit der Knochenpfanne in Kontakt ist. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Matrix ein Gel, das um den Knorpel herum in Knorpeltunnel und zwischen Knorpel und Knochen injiziert wird, wodurch eine Anhaftungsstelle gebildet wird, sowie die Matrix der Anhaftungsstelle zugeführt wird. In diesem Ausführungsbeispiel ist das Gel vorzugsweise gepuffert, so dass eine minimale Zell- oder Gewebenekrose stattfindet, wenn das Produkt in den Körper implantiert wird.
Eine Anhaftungsmatrix kann aus jedem beliebigen Material gebildet werden, das geeignet ist für eine Verwendung in vivo, und das die oben beschriebenen Eigenschaften der Anhaftungsmatrix zur Verwendung mit einer Zusammensetzung für die vorliegende Erfindung liefert. Die Matrix kann aus Materialien gebildet sein, die Folgendes beinhalten, aber nicht hierauf beschränkt sind, nämlich synthetisches Polymermaterial und/oder eine Grundsubstanz (wie hier zuvor definiert). Bevorzugte Grundsubstanzen beinhalten natürliche Polymere und Proteoglycane. Natürliche Polymere beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Kollagen, Elastin, Reticulin und Homologe hiervon. Proteoglycane beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, jedes beliebige Glycosaminoglycan-enthaltende Molekül. Besonders bevorzugte Glycosaminoglycane beinhalten Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Heparansulfat, Keratansulfat und Hyaluronan. Andere bevorzugte Grundsubstanzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Typ-I-Kollagen, Typ-II-Kollagen, Typ-III-Kollagen, Typ-IV-Kollagen und Hyaluronsäure. Bevorzugte synthetische Polymere beinhalten Poly(Milchsäure) und Poly(Glycolsäure).
In einem Ausführungsbeispiel beinhaltet die Anhaftungsmatrix Kollagen. Vorzugsweise enthält die Matrix 20 % bis 100 % Kollagen des Trockengewichts der Matrix, und weiter bevorzugt 50 % bis 100 % Kollagen des Trockengewichts der Matrix, und weiter bevorzugt 75 % bis 100 % Kollagen des Trockengewichts der Matrix. In einem Ausführungsbeispiel beinhaltet eine geeignete Anhaftungsmatrix Kollagen aus der Rindersehne.
Eine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Anhaftungsmatrix kann ein wie oben beschriebenes Material beinhalten, das in jeder Form vorliegt, die geeignet ist zur Verwendung bei der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, einschließlich in Form eines Schwammes, einer Membran, eines Films oder eines Gels. In einem Ausführungsbeispiel beinhaltet eine geeignete Anhaftungsmatrix Autotransplantatgewebe, Fremdtransplantatgewebe und/oder Xenotransplantatgewebe.
Ein Anhaftungsprodukt ist nützlich, um Bindegewebe an Knochenanhaftungen zu reparieren oder zu regenerieren, wo die Anhaftung bspw. vollständig oder teilweise als Ergebnis einer Verletzung oder eines chirurgischen Eingriffes durchtrennt wurde, oder sich aufgrund einer degenerativen Bedingung oder Krankheit verschlechtert hat. Das Produkt ist besonders nützlich, um an eine Knochenstruktur ein Ligament anzubringen, das ausgewählt ist aus der Gruppe aus dem vorderen Kreuzband, dem ulnaren Kollateralband, oder dem Sprunggelenkaußenband. Das Produkt ist auch insbesondere nützlich, um an einen Knochen eine Sehne anzubringen, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Sehne des Supraspinatus, der Sehne des Infraspinatus, der Sehne des Subscapularis und der Sehne des Teres minus.
Im Stand der Technik ist eine Vielzahl von Defekten der Sehnen und Ligamente definiert. Beispielsweise definiert Harryman et al. den Status der Rotatorenmanschette in Bezug auf die Integrität der Sehne (Harryman et al., 1991, „Repairs of the Rotator Cuff", J. Bone Joint Surgery 982–989). Typ 0 bezieht sich auf eine intakte Rotatorenmanschette, Typ 1B bezieht sich auf einen Defekt der Sehne des Supraspinatus in voller Stärke, Typ 2 auf einen Defekt in voller Stärke, der die Sehnen des Supraspinatus und Infraspinatus involviert, Typ 3 auf einen Defekt in voller Stärke, der die Sehnen des Supraspinatus, Infraspinatus und Subscapularis involviert. Die Ätiologie der Sehne involviert auch Abrisse dieser Sehnen, die nicht in voller Stärke erfolgen.
Da Defekte und Verletzungen in einer Vielzahl von Formen, Größen und Lokalisierungen erfolgen können, liegt eine Anhaftungsmatrix, die zur Verwendung in einem Anhaftungsprodukt der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, in einer Form und Größe vor, die ausreichend ist, um eine spezifische Anhaftung von Bindegewebe an Knochen in dem zu behandelnden Patienten zu ermöglichen. Vorzugsweise nimmt die Anhaftungsmatrix, wenn diese zur Anhaftung von Bindegewebe an Knochen verwendet wird, eine Geometrie ein (d.h. weist Maße auf), die geeignet ist, um dem Patienten einen therapeutischen Nutzen zu bringen. Solch ein therapeutischer Nutzen kann jede beliebige Verbesserung der Gesundheit und des Wohlbefindens des Patienten darstellen, die sich auf eine Korrektur eines Defektes in der Anhaftung bezieht, und vorzugsweise beinhaltet der therapeutische Nutzen die Wiederanhaftung des Bindegewebes an den Knochen, so dass die natürliche Konfiguration der Anhaftung zumindest teilweise wieder hergestellt wird.
Wie oben diskutiert, weist in einem Ausführungsbeispiel die Anhaftungsmatrix Maße auf, die einem Sehnen- oder Ligamentansatz entsprechen, der in Kontakt mit einer Knochenpfanne steht. In einem anderen Ausführungsbeispiel ist die Anhaftungsmatrix als eine Schicht ausgestaltet. Die Schicht hat vorzugsweise eine Form und Größe, die dazu geeignet ist, um um eine Sehne oder ein Ligament gewickelt zu werden, das wieder an einen Knochen befestigt werden soll. Vorzugsweise liefert oder verstärkt die Matrix eine mechanische Zwischenanhaftung des Bindegewebes an den Knochen, und stellt ferner ein Gerüst bereit, an dem die Bildung einer Zwischenschicht von Bindegewebe, Faserknorpel/kalkhaltigem Knorpel und Knochen erfolgen kann. Zusätzlich verleiht die Matrix vorzugsweise dem Produkt eine mechanische Stabilität, die ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass das Produkt an der Anhaftungsstelle verankert wird. Die Matrix kann nicht-quervernetzt oder quervernetzt unter Verwendung von chemischen und/oder physikalischen Quervernetzungsmethoden vorliegen, die einem Fachmann bekannt sind. Eine ausreichende Quervernetzung erfolgt auf die Art und Weise, so dass diese mechanische Stabilität verleiht, die zelluläre Infiltration jedoch nicht wesentlich behindert wird. In einem Ausführungsbeispiel ist die Anhaftungsmatrix, wenn das Produkt dazu verwendet wird, um das vordere Kreuzband (ACL) an den Femur- und Tibiatunnel zu befestigen, vorzugsweise als Schicht ausgebildet, und weist vorzugsweise Maße auf, dass diese vollständig um das ACL gewickelt werden kann. In einem anderen Ausführungsbeispiel weist die Anhaftungsmatrix, wenn das Produkt dazu verwendet wird, um eine Verletzung der Rotatorenmanschette zu reparieren, vorzugsweise entsprechende Maße des Sehnenansatzes auf, der in Kontakt mit der Knochenpfanne des Humerus steht.
In einem Ausführungsbeispiel weist die Anhaftungsmatrix eine Dicke von etwa 0,1 mm bis etwa 3 mm, und weiter bevorzugt von etwa 0,5 mm bis etwa 2 mm auf. Die Dicke kann bspw. in Abhängigkeit der Konfiguration des Bindegewebes und der Knochenanhaftungsstelle variiert werden. In diesem Ausführungsbeispiel kann die Matrix bspw. hergestellt werden, indem eine wässrige Dispersion von Matrixmaterial in eine Form gegeben wird, wobei die Form der Schicht die geeignete Dicke verleiht. Eine solche Methode ist in Beispiel 1 beschrieben. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Matrix aus einer wässrigen Dispersion von 0,2 Gew. % bis 4 Gew. % Kollagen hergestellt, und weiter bevorzugt wird die Matrix aus einer wässrigen Dispersion mit 0,5 Gew.-% bis 3 Gew.-% Kollagen hergestellt. Um einen Schwamm aus 2 Gew. % Kollagen zu erhalten, wird eine 2%ige Kollagendispersion hergestellt und lyophilisiert.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Anhaftungsmatrix der vorliegenden Erfindung porös, was die Fähigkeit der Matrix erhöht, als ein Zufuhrvehikel für die anhaftungsverstärkende Zusammensetzung und insbesondere als ein Gerüst zu fungieren, an dem zelluläre Prozesse stattfinden können, die zur Bildung einer Zwischenschicht aus Bindegewebe, Faserknorpel/kalkhaltiger Knorpel und Knochen führen, wie bspw. durch das Ermöglichen des Einwachsens von Zellen in die Matrix. Vorzugsweise ist die Porengröße ausreichend, um die gewünschte mechanische Stärke der Matrix aufrechtzuerhalten, während ein ausreichendes Einwachsen von Zellen zur Regeneration der gewünschten Zwischenschicht an der Anhaftungsstelle ermöglicht wird. Die Porosität der Matrix kann in Abhängigkeit der Konfiguration der Matrix variieren, wobei jedoch die Matrix typischerweise eine Porengröße von etwa 10 μm bis etwa 500 μm aufweist. In einem Ausführungsbeispiel weist die Matrix, insbesondere wenn die Matrix als Schicht ausgebildet ist, eine bevorzugte Porengröße von etwa 10 μm bis etwa 100 μm auf.
Ein Ausführungsbeispiel bezieht sich auf eine Methode zur Verwendung des Produktes der vorliegenden Erfindung, um eine Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verstärken. Diese Methode beinhaltet Schritte des Implantierens und Fixierens eines Produktes an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, das Folgendes aufweist: (a) eine Anhaftungsmatrix; und (b) eine Zusammensetzung, die mit der Anhaftungsmatrix zur Bereitstellung von anhaftungsverstärkenden Proteinen assoziiert ist. Geeignete Zusammensetzungen zur Verwendung in einem Produkt der vorliegenden Erfindung wurden oben im Detail beschrieben, und sämtli che dieser Zusammensetzungen können in der vorliegenden Methode verwendet werden. Die Verwendung des Produktes der vorliegenden Erfindung in der Methode zur Verstärkung der Anhaftung ist effektiv, um die Bildung einer Zwischenschicht aus Knochen, Knorpel und Bindegewebe an der Stelle der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu induzieren. Wie bereits oben diskutiert, bezieht sich der Begriff „Bindegewebe", wie dieser hier verwendet wird, auf Bindegewebe, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Sehne und Ligament.
Die Methode ist nützlich, um jedes beliebige Bindegewebe, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Sehne und Ligament, an Knochen anzuhaften, einschließlich das Anhaften des vorderen Kreuzbandes an Femur- und Tibiatunnel, das Anhaften des ulnaren Kollateralbandes an die Ulna, oder das Anhaften des Sprunggelenkaußenbandes an die Tibia. Die Methode ist auch besonders nützlich, um die Sehne des Supraspinatus an den Tuberculum majus humeri, eine Sehne des Infraspinatus an den Tuberculum majus humeri, eine Sehne des Subscapularis an den Tuberculum minus humeri, oder eine Sehne des Teres minus an den Tuberculum majus humeri anzuhaften. Der Schritt des Implantierens erfolgt unter Verwendung von chirurgischen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, und involviert typischerweise das Wickeln des Produktes um das Bindegewebe, das an den Knochen angehaftet werden soll, wenn die Matrix als Schicht ausgebildet ist, und/oder involviert einen komplexeren Prozess des Entfernens des beschädigten Gewebes und/oder des Implantierens des Produktes, das entsprechend eines Sehnen- oder Ligamentansatzes konfiguriert ist, der in Kontakt mit einer Knochenpfanne steht, um das Produkt an dem Muskel und/oder Knochen zu fixieren.
In einem Ausführungsbeispiel ist die Methode nützlich, um die Anhaftung des Alveolar-Knochens an Cementum zu regenerieren. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Verwendung des Produktes der vorliegenden Erfindung effektiv, um die Bildung einer Zwischenschicht zwischen Knochen, Faserknorpel/kalkhaltigem Knorpel und Cementum zu induzieren, die die natürliche Ontogenese dieser Verbindung nachbildet, und wobei es sich um eine bevorzugte Ontogenese handelt. Dies ist nützlich in Patienten, in denen eine Degeneration des Alveolar-Knochens und angehafteten Cementums stattgefunden hat, um diese Anhaftung von Bindegewebe an Knochen wieder herzustellen, und/oder als präventive Maßnahme, um eine weitere Degeneration dieser Anhaftung von Bindegewebe an Knochen zu verzögern oder zu reduzieren.
Vorzugsweise führt die Verwendung eines Produktes in einer Methode der vorliegenden Erfindung zu einer signifikant verbesserten biomechanischen Stärke der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, die repariert oder wieder hergestellt wurde, im Vergleich zu solch einer Anhaftung, die in Abwesenheit des Produktes der vorliegenden Erfindung gebildet wurde (d.h. eine Anhaftung, die unter Verwendung von konventionellen Mitteln gebildet wurde, wie bspw. durch Nähen, oder mit Matrices in Abwesenheit einer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung). Vorzugsweise führt die Verwendung der Methode zu einer biomechanischen Stärke der Anhaftung des Bindegewebes an Knochen, die zumindest um etwa 20 %, und weiter bevorzugt um zumindest etwa 50 %, und weiter bevorzugt um zumindest 75 %, und weiter bevorzugt um mehr als 100 % größer ist, als die biomechanische Stärke der Anhaftung von Bindegewebe an Knochen, die in Abwesenheit des Produktes der vorliegenden Erfindung, oder alternativ in Abwesenheit einer Zusammensetzung gebildet wurde.
Ein Beispiel eines chirurgischen Ansatzes für die Reparatur des ACL betrifft eine endoskopische Methode mit einem einzigen Einschnitt (DW Jackson und PR Kurzweil, Kapitel 8 in Master Techniques in Orthopaedic Surgery, Reconstructive Knee Surgery, Raven Press, NY, 1995). Kurz gesagt, bei dieser Technik wird das Implantat entnommen und ein Kollagenschwamm wird an das Tibiaende des Transplantates genäht. Anschließend erfolgt eine Notch-Plastik und der Femurtunnel wird markiert. Der Tibiatunnel wird hergestellt, gefolgt von dem Bohren des Femurtunnels. Unter Verwendung von Führungen wird ein dünner hohler Kollagenzylinder in den Femurtunnel platziert. Die Maße des Zylinders (an einem Ende geschlossen) entsprechen den Maßen des Tunnels, so dass der Zylinder mit dem Knochen in Kontakt steht und im Wesentlichen nicht in den Gelenkraum hineinragt. Das Trans plantat wird dann implantiert. Es werden übliche Methoden zur Fixierung von Unterschenkel- und Oberschenkeltransplantaten verwendet.
Der Schritt des Fixierens kann das Anhaften des Produktes an dem Knochen, existierendem Bindegewebe, und/oder Muskel durch jedes geeignete Mittel beinhalten, einschließlich den zuvor beschriebenen chirurgischen Techniken zur Reparatur von geschädigtem oder abgetrennten Sehnen und Ligamenten. Solch ein Mittel zur Anhaftung kann beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verwendung von bioresorbierbarem Nähmaterial, die Anwendung einer Interferenzschraube, eines Endobuttons, von bioresorbierbarem Nähmaterial, einer Kompressionsschraube, von nicht-resorbierbarem Nähmaterial, Press-Fittings, Pfeilen, Nägeln und T-fix Nähmaterial-Ankervorrichtungen.
Es bleibt festzuhalten, dass der Begriff „ein" oder „eine" Einheit sich auf eine oder mehrere dieser Einheiten bezieht; bspw. bezieht sich ein Protein auf ein oder mehrere Proteine, oder zumindest auf ein Protein. Die Begriffe „ein" (oder „eine"), „ein oder mehrere" und „zumindest ein" können hier austauschbar verwendet werden. Es ist ebenfalls festzuhalten, dass die Begriffe „aufweisen", „beinhalten" und „haben" austauschbar verwendet werden können.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Illustrierung verwendet und es ist nicht beabsichtigt, damit den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Das folgende Beispiel zeigt die Charakterisierung von solchem Gewebe im Subkutan-Assay im Nager, das in vivo durch Implantation eines Anhaftungsproduktes gewonnen wurde und Knochenprotein (BP) beinhaltet.
In diesem Experiment wurden Proben unter Verwendung des Subkutanmodells in der Ratte implantiert (das heißt, eine modifizierte Version des ektopischen Implantatassays in der Ratte, das in Sampath und Reddi, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591–6595, beschrieben wird). Kurz gesagt, Kollagenschwämme wurden hergestellt, indem eine 4 %ige Dispersion von Typ-I-Kollagen aus der Rindersehne in 1 % (v/v) Essigsäure hergestellt wurde. Diese Dispersion wurde bei Raumtemperatur für 12 bis 24 Stunden inkubiert. Die Dispersion wurde in die Löcher einer Formplatte gegeben und der Kollagenüberschuss wurde entfernt. Eine Glasschicht wurde über der Formplatte platziert und dies wurde bei –70°C für eine Stunde inkubiert. Die Formplatte wurde anschließend für mehr als 12 Stunden gefriergetrocknet. Die resultierenden Scheiben wurden aus der Formplatte herausgedrückt, die Kanten bearbeitet und die Scheiben wurden gewogen. Um zu den Kollagenscheiben BP hinzuzugeben, wurden die Scheiben in eine Halteplatte platziert und 100 μl der BP-Lösung wurde unter der Scheibe platziert. Nachdem der Schwamm gründlich befeuchtet war, wurden die Kollagenschwämme für 30 Minuten in einen Befeuchter platziert und bei –70°C für mehr als eine Stunde eingefroren und schließlich für mehr als 12 Stunden gefriergetrocknet.
Long-Evans-Ratten wurden mit einer nicht-lethalen Dosis von Natriumphenobarbital anästhetisiert. Nach dem Rasieren der ventralen Region wurden zwei kleine Einschnitte direkt über den Pectoralismuskeln vorgenommen. Proben, die BP enthielten, wurden in den Taschen eines jeden Tieres platziert.
Die Tiere wurden nach drei Wochen durch CO₂-Asphyxation getötet. Zum Zeitpunkt der Explantation wurden die Proben gewogen und grob untersucht. Sie wurden in 100 % Methanol platziert, in Glykolmethacrylat eingebettet, geschnitten und mit H&E, Von Kossa und Toluidin Blau angefärbt.
Die Einstufungsskala für die Knochenbildung, die dazu verwendet wurde, um dieses Experiment zu evaluieren, ist in Tabelle 1 dargestellt: TABELLE 1
BP-enthaltende Explantate liefern routinemäßig einen Histologiewert von 2–3. Von Kossa-Färbungen zeigen einen organisierten Geflechtknochen um die Peripherie des Explantates. Direkt im Inneren befindet sich hämatopoetisches Mark, das aus Sinusoiden und roten Blutzellen besteht. Entlang der Trabekel finden sich 6–10 oder mehr als 10 regelmäßig angeordnete Osteoblasten. Mehr als 50 % der Silberfärbung ist von zellulärem Ursprung (z.B. ist nicht dystrophisch). Die Menge von durchgehendem Geflechtknochen bewegt sich zwischen 0 und 50 %.
Beispiel 2
Das folgende Beispiel demonstriert, dass ein Produkt, welches Knochenprotein beinhaltet, die Heilungsrate einer Anhaftung des Extensor digitalis longus an den Knochen in Kaninchen, im Vergleich zur Abwesenheit des Produktes oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes verstärkt.
Für Vorrichtungspräparationen wurde Kollagen Typ I aus der Rindersehne zu 10 mM HCl hinzugegeben, um eine 2 %ige Kollagenschlämme herzustellen. Die Schlämme wurde gründlich in angekoppelten Spritzen gemischt. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Mischung in eine Form von ungefähr 1,2 mm Dicke injiziert. Die Form wurde dann bei –70°C für eine Stunde inkubiert und über Nacht lyophilisiert. Die Schwämme wurden dann in die geeigneten Maße geschnitten (6 × 10 mm). Die resultierenden Schwämme konnten die Sehne in ihrem Umfang vollständig umfassen. Ferner waren die Maße so, dass sich die Länge des Kollagens über die Tunnellänge erstreckte (z.B. gab es kein Kollagen außerhalb des Tunnels). Bei der niedrigen Dosis war BP zu 1,7 % (35 μg) des Trockengewichtes des Schwammes enthalten. Bei der hohen Dosis war BP zu 7,5 % (150 μg) des Trockengewichtes des Schwammes enthalten.
Um zu bestimmen, ob BP die Rate der Heilung der Sehne an den Knochen erhöht, wurde die folgende Studie durchgeführt, bei der 12 weiße Neuseelandkaninchen mit reifem Skelett gemäß einem publizierten Modell verwendet wurden (Rodeo et al., 1993, Am. J. Sports Med. 27(4):476–488). Kurz gesagt, ein Einschnitt in der Mittellinie erfolgte, um das Knie freizulegen, eine laterale Arthrotomie wurde durchgeführt, der Streckmuskelmechanismus wurde medial zurückgezogen, um die Sehne des Extensor digitalis longus zu exponieren. Der Extensor digitalis longus wurde dann von dem lateralen Femurgelenkkopf entfernt. Der vordere Tibiamuskel wurde dann von der proximalen lateralen Tibia entfernt und es wurde ein Loch von 2 mm in einem 45°-Winkel zu der Längsachse der proximalen Metaphyse der Tibia gebohrt. Die Sehne des Extensor digitalis longus wurde dann manuell in bzw. durch den Tunnel gezogen und an den medialen Teil der proximalen Metaphyse der Tibia genäht. Jedes Kaninchen erhielt einen Kollagenschwamm, der BP enthielt, und zwar in eine Extremität, während die kontralaterale Extremität entweder nur den Kollagenschwamm oder kein Implantat als Kontrolle erhielt. Das Kollagenmaterial wurde befeuchtet, darumgewickelt und an die Sehne genäht. Zwei verschiedene Dosen von BP wurden verwendet. Jede Dosis erhielten 6 Kaninchen. Sowohl die Dosis als auch die Extremität, die das Testagens erhielt, wurden randomisiert. Die Tiere konnten sich im Käfig frei bewegen. Die Tiere wurden nach zwei Wochen getötet und die Gewebe wurden für die histologische Analyse präpariert. Die Proben wurden in 10 %igem neutralem gepuffertem Formalin fixiert und in Methylmethacrylat ohne Decalcifizierung eingebettet. Histologische Schnitte wurden mit der H&E- und der Von-Kossa-Methode angefärbt. Die behandelten Gruppen sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
Die histologische Analyse zeigte, dass die Proben, die entweder eine hohe oder eine niedrige Dosis von BP enthielten, einen neugebildeten Knochen in engerer Nähe zu den Sehnen zeigte, als jede der Kontrollproben (Daten nicht gezeigt). Ferner enthielten die BP-behandelten Bereiche Faserknorpel in enger Nähe zu der Sehne, während die Kontrollen lediglich fibröses Gewebe neben der Sehne zeigten.
Eine histomorphometrische Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Der Sehnenbereich, Sehnenumfang, Knochenbereich, Knochenmarksbereich und Knochenumfang wurden gemessen. Für den Sehnenbereich oder Sehnenumfang gab es keine statistischen Unterschiede für die hohe Dosis, niedrige Dosis, Kollagenkontrolle oder unbehandelte Kontrolle. Hierzu im Gegensatz war für den Knochenmarksbereich, Knochenbereich und Knochenumfang die niedrige Dosis statistisch größer als die Kollagenkontrolle, unter Verwendung der Varianzanalyse (p < 0,05), des Kruskal-Wallis-One-Way-Anova- und des Kruskal-Wallis-Mehrfachvergleich-Z-Wert-Tests. Zusätzlich zeigten sowohl die Behandlungen mit hoher und niedriger BP-Dosis einen größeren Knochenmarksbereich, Knochenumfang und Knochenbereich als die unbehandelte Kontrolle, obwohl die Unterschiede nicht statistisch signifikant waren. Die niedrige BP-Dosis zeigte ebenfalls höhere Werte, als die hohe BP-Dosis für diese Parameter, obwohl diese Parameter ebenfalls nicht statistisch signifikant waren.
Beispiel 3
Das folgende Beispiel zeigt, dass ein Produkt, das Knochenprotein beinhaltet, die Quote und Qualität der Heilung der Anhaftung des Transplantates (Sehne des Semitendinosus) an dem Knochen in einer Rekonstruktions-Operation des vorderen Kreuzbandes erhöht, und zwar im Vergleich zur Abwesenheit des Produktes oder Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes.
Für die Vorrichtungspräparation wurde Kollagen Typ I aus der Rindersehne zu 10 mM HCl hinzugegeben, um eine 2 Gew.-%ige Kollagenschlämme herzustellen. Die Schlämme wurde gründlich in den angeschlossenen Spritzen gemischt. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Mischung in eine Form mit ungefähr 1,2 mm Dicke injiziert. Die Mischung wurde bei –70°C für eine Stunde inkubiert und über Nacht lyophilisiert. Die Schwämme wurden dann in geeignete Maße geschnitten (7 × 11 mm). Die Größe der resultierenden Schwämme umfasste die Sehne in ihrem Umfang vollständig. Auch waren die Maße so, dass sich die Länge des Kollagens über die Länge des Tunnels erstreckte (z.B. war kein Kollagen außerhalb des Tunnels). Knochenprotein (BP) wurde zu den Schwämmen bei einer Dosis von ungefähr 2,4 % (55 μg) des Trockengewichtes des Schwammes hinzugegeben. Die Schwämme wurden sowohl an die Femur- als auch Tibiatransplantate genäht.
Sämtliche Kaninchen wurden von einem lizenzierten USDA-Händler erhalten und gemäß der Standards des Nationalen Gesundheitsinstitutes behandelt. 75 Kaninchen wurden medikamentös mit Atropin (0,05 mg/kg), Ketamin (35 mg/kg) und Acetylpromazin (0,5 mg/kg) vorbehandelt und dann intubiert. Nach der Einleitung der allgemeinen Anästhesie wurden beide Hinterextremitäten rasiert, mit Betadin gereinigt und aseptisch drapiert. Ein vertikaler Einschnitt in der Mittellinie erfolgte über das Knie und eine mediale parapatellare Arthrotomie erfolgte, um eine Exposition des Kniegelenkes zu ermöglichen. Der Streckmuskelmechanismus wurde lateral verschoben. Die ipsilaterale Sehne des Semitendinosus wurde an ihrer Insertion in die proximale, mediale Tibia identifiziert und bis zu der Verbindung von Muskel und Sehne exponiert. Die Sehne wurde an der Verbindung von Muskel und Sehne durchtrennt. Dadurch wurden ungefähr 35 bis 40 mm der Sehnenlänge für das geplante chirurgische Verfahren bereitgestellt. Es wurden keine Nebeneffekte aufgrund der Gewinnung der Sehne des Semitendinosus beobachtet.
Nach der Gewinnung des Transplantates wurde das vordere Kreuzband abgetrennt. Ein Bohrer wurde dazu verwendet, um einen Bohrtunnel (1,7 mm) in der proximalen, medialen Tibia zu platzieren, wobei in die Verbindung an der ACL-Anhaftung eingedrungen wurde. Ein anderer Bohrtunnel (1,7 mm) erfolgte in den lateralen Femurgelenkkopf, wodurch in das Gelenk an der Femuranhaftung des ACL eingedrungen wurde. Der BP enthaltende Schwamm wurde an den Teil der Sehne genäht, der in den Knochentunnel in dem Femur und der Tibia platziert wurde. Die Behandlungen waren randomisiert und der Chirurg war nicht über die Behandlungsgruppe informiert. In jedem Tier erhielt eine Extremität BP und die kontralaterale Extremität erhielt entweder Träger oder kein BP. Eine Zugnaht wurde durch ein Ende des Sehnentransplantates angebracht und dazu verwendet, um das Transplantat in die Knochentunnel zu ziehen. Das Transplantat wurde unter Spannung gesetzt und an das Periost und die umgebenden Weichgewebe über den lateralen Femurgelenkkopf und die proximale Tibia genäht. Die Wunde wurde in Schichten geschlossen und die Tiere konnten sich nach der Operation frei bewegen. Die Prozedur erfolgte bilateral. Es wurden keine signifikanten Komplikationen beobachtet. Die Tiere wurden während der postoperativen Zeit durch tierärztliches Personal beobachtet. Für die ersten 40 Stunden nach der Operation wurden Antibiotika (Ampicillin 25 mg/kg IM oder SQ verabreicht, und Analgetika (Buprenorphin 0,05–0,075 mg/kg SQ wurden verabreicht, sofern erforderlich. Neun Tiere wurden für histologische Evaluierungen und 16 für biomechanische Tests verwendet, jeweils zu drei Zeitpunkten (2, 4, 8 Wochen). Die Kaninchen wurden durch eine Überdosis von intravenösem Pentobarbital getötet.
Histologische Analyse:
Zum Tötungszeitpunkt wurde jede Probe grob auf einen Hinweis von degenerativen Veränderungen in den Gelenken, Gelenkentzündungen und Blutergüssen untersucht. Die Tibia und der Femur wurden entnommen und in 10 %igem neutralgepuffertem Formalin platziert. Die Proben wurden in Polymethylmethacrylat ohne Decalcifizierung eingebettet. Fünf Mikrometer dicke Schnitte wurden senkrecht zu den Knochentunneln geschnitten, wodurch Querschnitte der Zwischenschicht zwischen Sehnentransplantat und Knochen sowohl der Femur- als auch Tibiatunnel erhalten wurde. Die Schnitte wurden mit H&E, Von-Kossa und Massons-Trichom angefärbt, anschließend mikroskopisch mit Licht und polarisiertem Licht auf einem Olympus BH-2-Mikroskop untersucht. Die Heilung zwischen der Sehne und dem Knochentunnel wurde über die Bildung von neuem Gewebe (fibrovaskulär, Granulierungsgewebe, Knorpel und Knochen) zwischen der Sehne und dem Knochen beurteilt. Die Kontinuität der Kollagenfaser zwischen Sehne und Knochen wurde über Mikroskopie mit polarisiertem Licht beurteilt. Um mögliche Nebenwirkungen der BP-Behandlung zu detektieren, wurde auch das Vorhandensein von artikulärer Knorpel degeneration, Synovialhyperplasie und Fremdkörperriesenzellen-Antwort bewertet. Es erfolgten Vergleiche zwischen den Gruppen (BP-behandelte und Kontrollextremitäten), sowie zwischen den verschiedenen Zeitpunkten.
Kursorische Beobachtungen ergaben keine Nebenwirkungen der BP-Behandlung auf das Gelenkgewebe. Sowohl in behandelten als auch Kontrollproben wurde vereinzelt eine heterotrophe Knochenbildung beobachtet, wobei die Knochenbildung in den BP-behandelten Proben stärker war. Keine Ossifikation wurde an der intraartikulären Öffnung des Bohrtunnels festgestellt. Keinerlei meniskalen Proben zeigten Anzeichen von Ossifikation.
Die Histologie zeigte, dass die Zwei-Wochen-Proben, die mit BP behandelt wurden, eine starke Bildung von Neuknochen-Trabekeln und Knorpel in der Knorpel-Knochen-Zwischenschicht aufwiesen. Es wurde wesentlich mehr Knochenneubildung als in den kontralateralen Kontrollproben festgestellt, und der neue Knochen war in engerer Apposition zu der Sehne. Insgesamt war die Menge von Knorpel in der Sehnen-Knochen-Zwischenschicht bei den behandelten und den Kontrollextremitäten gleich. Allerdings zeigte sich weniger Variabilität in der Heilung in den BP-behandelten Extremitäten als in den Kontroll-Extremitäten. Außerdem zeigten sich keine Anzeichen einer Fremdkörper-Riesenzellenantwort in den BP-behandelten Extremitäten. Schließlich zeigten sich keine Anzeichen von Nebenwirkungen auf dem artikulären Knorpel der Tibia oder des Femurs in den BP-behandelten Extremitäten.
In Vier-Wochen-Proben gab es keine fortschreitende Reifung des Gewebes der Zwischenschicht zwischen der Sehne und dem Knochen, weder in den Kontrollnoch in den behandelten Proben. Es gab allgemein mehr Knorpel in den Zwischenschichten zwischen Knorpel und Knochen in den BP-behandelten Proben im Vergleich zu den Kontrollen, und der Knorpel in den Zwischenschichten zwischen Sehne und Knochen war in den BP-behandelten Proben reifer. Die Inkorporation von Sehne mit der Errichtung einer Kollagenfaserkontinuität zwischen Sehne und Knochen war in den BP-behandelten Proben häufig weiter fortgeschritten. Die Proliferation der Zellen entlang der Kante der Sehne war in einigen der Kontroll- und behandelten Proben erkennbar, und zwar ohne sichtbare Unterschiede zwischen den Gruppen.
In den Acht-Wochen-Proben zeigten die BP-behandelten Proben mehr Knorpel und Neuknochenbildung um das Sehnentransplantat als die Kontrollen.
Biomechanischer Test:
Ein Femur-ACL-Transplantat-Tibia-Konstrukt wurde aus jeder Extremität gewonnen und bei –80°C bis zum Test eingefroren. Vor dem Test wurde die Tibia und der Femur von Weichgewebe proximal und distal zu den Anhaftungsstellen für das Transplantat an dem Femur und der Tibia befreit. Die Knochen wurden in Klebkit direkt oberhalb der Femurnähte und unterhalb der Tibianähte eingesetzt, wodurch eine sichere Fixierung in der Testvorrichtung ermöglicht wurde. Es wurde ein speziell konstruierter Apparat verwendet, der es ermöglichte, dass die Proben so orientiert werden, dass eine uniaxiale Zugbelastung entlang der Achse des wiederhergestellten Ligamentes in der Sagittalebene ausgeübt wurde. Das Konstrukt wurde auf eine MTS-Maschine mit einer Dehnungsrate von 40 mm/sec geladen. Die Endbelastung bei Versagen wurde aufgezeichnet.
Eine Leistungsanalyse ergab, dass 8 Proben für jeden Zeitpunkt für die biomechanische Analyse erforderlich waren, um eine Leistung von 0,8 mit α = 0,05 zu erreichen. Die Endbelastung bei Versagen wurde zwischen den experimentellen und Kontrollextremitäten verglichen, indem eine Varianzanalyse durchgeführt wurde. Es wurden Vergleiche zwischen den Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten und den Kontrollgruppen unter Verwendung des Students-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den 1 bis 2 dargestellt.
Die durchschnittliche Belastung bei Versagen in BP-behandelten Proben war signifikant höher als die bei den Kontrollen für die gesamte Population der Untersuchung (p < 0,001) und für jeden einzelnen Zeitpunkt von 2, 4 und 8 Wochen. (p = 0,04, 0,01 bzw. < 0,001) (siehe 1). Auch die BP-behandelte Seite war signifikant stärker (p = 0,001) im Vergleich zu unbehandeltem Schwamm (Gruppe I) für die gesamte Population. Zu einzelnen Zeitpunkten wird festgestellt, dass die experimentelle Extremität nur nach 8 Wochen signifikant stärker war (p = 0,0003) (2). Außerdem war die BP-behandelte Seite im Vergleich zum Ansatz ohne Schwamm (Gruppe II) signifikant stärker (p = 0,02), obwohl bei einem Vergleich mit dem jeweiligen Zeitpunkt die experimentelle Extremität nur nach 8 Wochen signifikant stärker war (p = 0,05). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe I (unbehandelter Kollagenschwamm) und der Kontrollgruppe II (kein Schwamm).
Beispiel 4
Das folgende Beispiel demonstriert, dass ein Produkt, das ein Knochenprotein beinhaltet, die Heilungsrate der Anhaftung der Sehne des Infraspinatus an den Knochen in einem Schaf im Vergleich zur Abwesenheit des Produktes oder in Abwesenheit des Zusammensetzungsanteils des Produktes erhöht.
Für die Vorrichtungspräparation wurde Kollagen Typ I aus der Rindersehne zu 10 mM HCl hinzugegeben, um eine 2 Gew.-%ige Kollagenschlämme herzustellen. Die Schlämme wurde gründlich in den angeschlossenen Spritzen gemischt. Nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Mischung in eine Form mit ungefähr 1,2 mm Dicke injiziert. Die Form wurde dann bei –70°C für eine Stunde inkubiert und dann über Nacht lyophilisiert. Die Schwämme wurden dann in geeignete Maße (10 × 25 mm) geschnitten. Die Größe des resultierenden Schwammes umfasste vollständig den Ansatz der Sehne des Infraspinatus. Die Maße waren so, dass kein oder wenig Kollagen außerhalb der Sehne lag. Die BP-Dosis betrug ungefähr 1,7 % (170 μg) und 5,7 % (570 μg) des Trockengewichts des Schwammes.
Die Anästhesie wurde mit Ketamin (1 mg/kg) und Valium (7,5 mg insgesamt) induziert und mit Halothan (2,5–3 %) in 100 % Sauerstoff (2 l/min) aufrechterhalten. Unter allgemeiner Anästhesie unter Verwendung von aseptischen Bedingungen wurde ein 6-cm-Hauteinschnitt über dem rechten Schultergelenk vorgenommen, der craniale bis akromiale Kopf des Deltoideus-Muskels wurde zerschnitten, und die Sehne des Infraspinatus wurde von dem Insertionspunkt getrennt. Eine Rinne mit 1,5 cm Länge und 0,5 cm Tiefe wurde in den proximalen Humerus präpariert, indem ein orthopädischer Hall-Grat verwendet wurde. Vier separate Bohrlöcher wurden in dem Knochen des Humerus geschaffen, die den Grat umgeben. Die Sehne des Infraspinatus wurde in die Rinne genäht, indem eine #2-nicht-absorbierbare Naht (Ethibond; Ethicon, Inc.) in einer modifizierten Mason-Allen-Technik verwendet wurde. Unter der Naht wurde ein Kollagenschwamm eingeführt, der BP enthielt. Alternativ wurde unter die Naht nichts (kein Kollagen oder BP) eingeführt (Kontrolle). Die Nähte wurden separat über der Kortikalis-Brücke verknotet. Die subkutanen Gewebe und Haut wurden unter Verwendung von Routinemethoden verschlossen. Nach der Operation wurden die Schafe beobachtet, bis ein Schluckreflex festgestellt wurde, und wurden dann in sternaler, liegender Stellung gestützt und über den Tag beobachtet. Am Ende des Tages wurden alle Schafe zur Hürde zurückgebracht. Die postoperativen Analgetika bestanden aus 1 Gramm des nicht-steriodalen, antiinflammatorischen Arzneimittel Phenylbutazon (p.o.). Zusätzlich erhielten alle Schafe zwei Fentanyl-Pflaster (Duragesic (50 Ag/h), Transdermal System, Janssen Pharmaceutic; Titusville, NJ), das postoperativ auf die laterale thorakale Region wegen dem postoperativen Schmerz angebracht wurde. Zusätzlich zu den Fentanyl-Pflastern wurde Phenylbutazon (1 gm p.o.) während 3 postoperativen Tagen verabreicht.
Die Tiergruppen sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
Um den prozentualen Anteil von Knochen oder Knorpel zu berechnen, wurde das folgende Verfahren durchgeführt. Unter Verwendung des histologischen Objektträgers, der mit Toluidin-Blau gefärbt wurde, wurde das 4 × Objektiv zur Betrachtung verwendet. Die obere Linie des rechtwinkligen Fotografiekastens wurde dann mit der unteren Kante des bereits existierenden Knochens ausgerichtet. Der Bereich unterhalb des bereits existierenden Knochens ist das neue Reparaturgewebe. Der prozentuale Anteil des Bereiches von Knochen und Knorpel, der den Kasten füllt, wurde abgeschätzt. Der prozentuale Anteil, der in Tabelle 4 dargestellt ist, ist der Durchschnitt von 3 unabhängigen Feldern. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die BP-behandelten Proben einen höheren prozentualen Anteil von neusynthetisiertem Knochen und Knorpel im Vergleich zu der Kontrolle induzieren. TABELLE 4

*% Knochen oder Knorpel: Durchschnitt von drei Bereichen in vierfacher Vergrößerung. Zur besseren Orientierung sollte der obere Rand jedes Bereichs mit dem bereits existierenden Knochen ausgerichtet werden.

Beispiel 5
Das folgende Beispiel demonstriert, dass Knochenprotein (BP) eine komplexe Mischung von Proteinen ist, die zumindest Folgendes beinhalten: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, Osteocalcin, Osteonectin, BSP, Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Albumin, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIb.
Die vorliegenden Erfinder verwendeten Standardtechniken und Reagenzien, die im Stand der Technik zur Verfügung stehen, um diese Proteine in dem Knochenprotein zu identifizieren (siehe bspw. „Current Protocols in Protein Science", Ed. J.E. Coligan et al.; 1995–1998, John Wiley and Sons, Inc.; „Protein Purification: Principles and Practice", Scopes and Verlas; 1982). Die Proteine, die als in BP vorhanden durch zumindest einen dieser Assays identifiziert wurden, sind in Tabelle 5 angegeben. TABELLE 5 BP-ZUSAMMENSETZUNG
Zusätzlich beinhalten die intrazellulären Proteine, die in dem Knochenprotein identifiziert wurden, intrazelluläre Proteine: Dynein-assoziiertes Protein, Protamin II, Histon-ähnliches Protein, L6 (ribosomales Protein) und L32 (ribosomales Protein). Weitere Serumproteine, die in BP identifiziert wurden, beinhalten α2-Microglobulin. Weitere extrazelluläre Matrix-(Knochenmatrix)Proteine, die identifiziert wurden, beinhalten das Frizzled-verwandte Protein. Sämtliche dieser Proteine können, sofern gewünscht, in eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebracht werden.
Verschiedene Präparationen von Proteinmischungen oder Knochenprotein oder Derivaten davon wurden untersucht, um eine grobe Schätzung der Menge von einigen der Proteine in Tabelle 6 zu erhalten. Im Speziellen wurden einige unterschiedliche Ansätze von BP- und AX-Fraktionen, die bei pH 9,0, 9,5 und 10,0 (siehe Beispiel 11) extrahiert wurden, durch Standard-Westernblot-Analyse untersucht, in der Antikörper gegen TGFβ1, TGFβ2, BMP-3 und BMP-7 verwendet wurden. Das resultierende Radiogramm wurde mit einem Sharp JX-330-Scanner gescannt und das Spurvolumen wurde unter Verwendung der ImageMaster-ID-Software berechnet. Um die Menge von TGFβ1 in BP und deren Derivaten zu quantifizieren, wurde rekombinantes Rinder-TGFβ1 als Standard (2, 4, 8 und 16 ng; Promega) laufen gelassen, und Anti-Rinder-TGFβ1 wurde verwendet. Um die Menge von TGFβ1, TGFβ2, BMP-3 oder BMP-7 in jeder gegebenen Probe zu berechnen, wurde die folgende Formel verwendet: (Spurvolumen der Probe/Spurvolumen von Standard-TGFβ1) × (Menge von geladenem Standard-TGFβ1). Anti-Rinder-TGFβ-Antikörper wurde verwendet. Mit dieser Methode kann die Menge von TGFβ in den Proben spezifisch abgeschätzt werden und es wird eine grobe Schätzung der Mengen von TGFβ2, BMP-3 und BMP-7 in den Mischungen ermöglicht. Es können lediglich grobe Schätzungen von TGFβ2, BMP-3 und BMP-7 erfolgen, da die Rinderstandards und Rinderantikörper für jedes dieser drei Proteine nicht zur Verfügung stehen (für diese Proteine wurden humane Antikörper verwendet und die Mengen wurde basierend auf dem TGFβ1-Standard abgeschätzt). Die Schätzungen für die niedrigen und hohen Mengen für jedes der vier Proteine für alle der getesteten Zusammensetzungen sind in Tabelle 6 dargestellt. Für diese Zusammensetzungen beträgt das Verhältnis (w/w) von TGFβ1 zu allen anderen Proteinen in der Mischung etwa 1:1000 bis etwa 1:100. TABELLE 6
In einem anderen Experiment wurden verschiedene Präparationen (6 Ansätze) von Knochenprotein (BP) untersucht, um eine grobe Schätzung der Menge von einigen der Proteine in Tabelle 5 zu erhalten. Im Speziellen wurden einige verschiedene Ansätze von BP durch Standard-Westernblot-Analyse untersucht, bei der Antikörper gegen TGFβ1, TGFβ2 und BMP-2 verwendet wurden. Das resultierende Radiogramm wurde unter Verwendung eines Sharp JX-330-Scanner gescannt und die Bandenvolumina wurden unter Verwendung der ImageMaster-ID-Software (Pharmacia Biotech) quantifiziert, indem nur die spezifischen Banden auf dem Gelscan selektiert wurden. Die Proteinmenge wurde unter Verwendung einer linearen Kurvengleichung von Standardkurven berechnet. Um die Menge von TGFβ1 in BP zu quantifizieren, wurde rekombinantes humanes TGFβ1 als Standard laufen gelassen (1, 2, 4 und 8 ng; Promega). Um TGFβ1 zu detektieren, wurde Anti-humaner-TGFβ1- und ein ALP-konjugierter Antikörper als Primär- bzw. Sekundärantikörper verwendet. Um die Menge von TGFβ2 in BP zu quantifizieren, wurde rekombinanter humaner TGFβ2 als ein Standard (2, 4, 8 und 16 ng; Promega) laufen gelassen, und Antihumaner-TGFβ2 wurde verwendet. Um die Menge von BMP-2 in BP zu quantifizie ren, wurde rekombinantes BMP-2 als ein Standard (2, 4, 8 und 16 ng; Promega) laufen gelassen. Um TGFβ2 zu detektieren, wurde Anti-humaner-TGFβ2- und ein ALP-konjugierter Antikörper als primärer bzw. sekundärer Antikörper verwendet. Um die Menge von BMP-2 zu quantifizieren, wurde rekombinantes BMP-2 als ein Standard (1, 5, 3, 6 und 12 ng; NIBSC, WHP, Pottersbar, England) laufen gelassen. Um BMP-2 zu detektieren, wurde Anti-humaner-BMP-2 und ein ALP-konjugierter Antikörper als primärer bzw. sekundärer Antikörper verwendet.
Mit dieser Methode gelingt eine spezifische Schätzung der Menge von TGFβ1 und TGFβ2 in den Proben und eine grobe Schätzung der Mengen von BMP-2 in den Mischungen. BMP-2 kann nur grob abgeschätzt werden, da Rinderstandards und Rinderantikörper nicht verfügbar sind, und die humanen und Rinder-BMP-2-Sequenzen können sich unterscheiden. Für einen Fachmann versteht sich, dass Rinder- und humanes TGFβ1 identische Aminosäuresequenzen aufweisen, und dass Rinder- und humanes TGFβ1 identische Aminosäuresequenzen haben, und deshalb Rinder-TGFβ1 und rhTGFβ1 identische Aktivitäten haben sollten, wie dies Rinder-TGFβ2 und rhTGFβ1 haben sollten. Für einen Fachmann versteht sich, dass hochreines TGFβ1 aus Rinderknochen isoliert werden kann, indem Methoden verwendet werden, die von Seyedin offenbart wurden (Ogawa et al., Meth. Enzymol., 198:317-327(1991); Seyedin et al,; PNAS, 82:2267–71 (1985)).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. TABELLE 7
Beispiel 6
Das folgende Beispiel demonstriert die Knochen- und Knorpel-induktive Aktivität von Knochenprotein (BP) und Proteinmischungen, die aus der komplexen Mischung von Proteinen in BP stammen, im Vergleich zu einzelnen rekombinanten Proteinkomponenten, wie dies unter Verwendung eines Subkutan-Assays im Nager in vivo bestimmt wurde.

A. In dem folgenden Experiment wurde ein Subkutan-Assay im Nager und ein Einstufungssystem, das von Sulzer Biologics, Inc. (Denver, Colorado) entwickelt wurde, dazu verwendet, um die Knorpel- und Knochen-induktiven Fähigkeiten von rekombinantem BMP-2 (bereitgestellt für Sulzer Biologics, Inc. durch Genetics Institute) zu evaluieren. Die Ergebnisse wurden dann mit Daten für BP verglichen, die im gleichen Assay unter Verwendung des gleichen Einstufungssystems generiert wurden.

Um den subkutanen Assay in der Ratte von Sulzer Biologics, Inc. durchzuführen, wurde eine Matrix aus geeignetem Material präpariert. Wenn das Material Typ I-Kollagen war, wurde eine Dispersion von 4 % w/w Kollagen hergestellt, indem Typ I-Kollagen aus dem Rind und 1 % Eisessig verwendet wurde. Kollagenscheiben/schwämme wurden in Formen gebildet und anschließend eingefroren und lyophilisiert. Für den Assay wurden die Scheiben mit der Zusammensetzung beladen (z.B. Knochenprotein, eine Untergruppe des Knochenproteins, ein Wachstumsfaktor), und die Scheibe wurde mit der Zusammensetzung bei Raumtemperatur für etwa 30 Minuten inkubiert, gefolgt von dem Einfrieren und der Lyophilisierung der Scheiben. Die Scheiben wurden in Long-Evans-Ratten in subkutanen Positionen implantiert. In allen in diesem Beispiel beschriebenen Experimenten und anderen unten genannten Beispielen wurden 5–10 Ratten pro Behandlung verwendet, und die Kollagenscheibe bzw. der Kollagenschwamm, die bzw. der mit der Zusammensetzung behandelt wurde (oder anderes Material in Beispiel 14) wurde für drei Wochen implantiert. Am Ende der drei Wochen wurden die Ratten getötet und die Explantate wurden chirurgisch entfernt, histologisch verarbeitet und eingestuft. Die Einstufungsskala, die für die Knochen-induktive Aktivität in dem Subkutan-Assay im Nager verwendet wurde, und die von Sulzer Biologics, Inc. entwickelt wurde, ist in Tabelle 1 dargestellt (siehe Beispiel 1). Die Einstufungsskala, die für die Knorpel-induktive Aktivität in dem Subkutan-Assay im Nager verwendet wurde, und die ebenfalls von Sulzer Biologics, Inc. entwickelt wurde, ist in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8

SCHLÜSSEL: A = Wert; B = Vorhandensein von mineralisiertem Gewebe; C = etwas nicht-mineralisierter Knorpel; D = nicht-mineralisierter Knorpelbereich ist vergleichbar mit dem Knochenbereich; Knorpel ist im Ring > 50 % des Umfanges des Explantates; häufig starke Knorpelfärbung; E = nicht-mineralisierter Knorpelbereich ist größer als der Knorpelbereich; häufig sehr wenig oder keine Mineralisierung resultierend aus Knochen oder Knorpel.

BP, verabreicht bei einer Dosis von 10 μg auf einem Kollagenschwamm, liefert routinemäßig Werte zwischen 1,5 und 2,2 für Knorpel und zwischen 2,0 und 2,5 für Knochen. Im Speziellen induziert BP im Subkutan-Assay in der Ratte einen geordneten Ring von Knochenbildung um die Peripherie des Kollagenschwammes herum. BP und BP-Derivate, die in den unten stehenden Beispielen beschrieben sind (siehe Beispiele 7 und 8), produzieren einen geordneten Knochenring auf der Außenseite und direkt im Inneren einen geordneten Knorpelring. Einige Derivate sind effizienter im Produzieren dieses inneren Knorpelringes als andere. AX-Fraktionen, die bei pH 9,0, 9,5 und 10,0 eluiert werden und BP sind effizient im Induzieren dieses inneren Knorpelringes. Außerdem ist BP mit exogen zugegebenem TGFβ, wie bspw. TGFβ1-3 und vorzugsweise TGFβ1, wobei das Verhältnis von TGFβ1 zu BP 1:10 groß ist (z.B. 1 μg exogen zugegebenes TGFβ1 zu 10 μg BP), ebenfalls effizient im Produzieren dieses geordneten Ringes von Knochen an der Außenseite und eines geordreten Knorpelringes direkt im Inneren. Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nehmen die in Rede stehenden Erfinder an, dass diese Eigenschaft eine vorteilhafte Sehne zur Knochenfixierung liefert.
Im Gegensatz hierzu liefert rekombinantes humanes BMP-2 die Ergebnisse, die in Tabelle 9 gezeigt sind, welche ergeben, dass BMP-2 sowohl einen niedrigeren Knochen- als auch Knorpelwert im Vergleich zu BP hat. Es ist festzustellen, dass BMP-2 weder die geordnete Knochenringbildung um die Peripherie des Kollagenschwammes noch direkt im Inneren einen geordneten Knorpelring induziert. TABELLE 9 BMP-2 Subkutan-Assay in der Ratte

B. TGFβ-1 und -2 wurden ursprünglich durch deren Fähigkeit identifiziert, die Chondrogenese in vitro zu stimulieren. Es ist jedoch im Stand der Technik bekannt, dass TGFβ1-5 und Wachstumsfaktoren, wie bspw. FGF und PDGF, im Subkutan-Assay in der Ratte keinen Knochen oder Knorpel induzieren, wie auch in dem ektopischen Assay im Nager in vivo (z.B. sowohl TGFβ-1 und -2 sind nicht in der Lage, die Knorpel- oder Knochenbildung zu initiieren; nur fibröses Gewebe wird beobachtet). Dies wird bestätigt durch die Ergebnisse, die unten mit rekombinantem TGFβ1 gezeigt werden. Der Assay wurde unter Verwendung des Subkutan-Assays in der Ratte von Sulzer Biologics, Inc. und dem oben in Abschnitt (A) beschriebenen Graduierungssystem durchgeführt. Die Tabelle 10 zeigt, dass rekombinantes humanes TGFβ1 in diesem Assay keinen Knochen oder Knorpel induziert. Hier zum Gegensatz führt Knochenprotein (BP), das bei einer Dosis 10 μg verabreicht wird, routinemäßig zu Werten von 1,5 bis 2,2 für Knorpel und von 2,0 bis 2,4 für Knochen (siehe unten stehende Beispiele).

Beispiel 7
Das folgende Beispiel demonstriert, dass Mischungen von Proteinen, die aus einem modifizierten Reinigungsprozess für BP stammen, die BMP-2, BMP-3, BMP-7 und TGFβ-1 enthalten, sowohl Knochen als auch Knorpel produzieren.
BP wird üblicherweise unter Verwendung von Schritten des Anionenaustausches (AX), Kationenaustausches (CX) und Hochleistungsflüssigkeits-Chromatografie (HPLC) (PCT-Veröffentlichung mit der Nummer WO95/13767, diese ist durch Inbezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil der Anmeldung) gereinigt. Solch eine Methode ist im Detail oben und im US-Patent mit der Nummer 5,290,763 beschrieben; diese ist durch Inbezugnahme in ihrer Gesamtheit Bestandteil der Anmeldung.
Typischerweise werden Proteine von der AX-Säule bei pH = 8,5 eluiert. Für dieses Experiment wurden die Proteine von der AX-Säule bei pH 9,0, 9,5 und 10,0 eluiert. Die Proben wurden dann über die CX- und HPLC-Säulen gereinigt, wie zuvor beschrieben (PCT-Veröffentlichung mit der Nummer WO95/137679). Jede HPLC- Fraktion, die bei den obigen pH-Werten eluiert wurde, wurde durch Westernblot auf das Vorhandensein von BMP-2, BMP-3, BMP-7, TGFβ-1 und TGFβ-2 untersucht.
Die Elution der AX-Säule mit zunehmendem pH resultierte in einer zunehmenden Menge von BMP-2, BMP-3, BMP-7 und TGFβ-1 in BP. Bei einem pH von 9,0 zeigten die BMP-2- und BMP-7-Mengen den größten Anstieg, während TGFβ-1 und BMP-3 begrenzten oder keinen Anstieg im Vergleich zu pH 8,5 zeigten. Zunehmende Mengen dieser Faktoren haben keinen signifikanten Effekt auf den Knochenwert und erhöhen leicht den Knorpelwert (Tabelle 12). Bei pH 10 steigt die TGFβ-1-Menge deutlich stärker an als der Anstieg für BMP-2, -3 und -7, und die pH-10-Fraktion zeigt den höchsten Knorpelwert. Die HPLC-gereinigten Fraktionen (10 μg) wurden in dem subkutanen Rattenmodell getestet, wobei die Ergebnisse in Tabelle 11 gezeigt sind. TABELLE 11
Beispiel 8
Das folgende Beispiel demonstriert, dass eine Zusammensetzung, die aus BP gereinigt wurde und BMP-2, BMP-3, BMP-7 und TGFβ-1 beinhaltet, Komponenten enthält, die für die Knochen- und Knorpelbildung erforderlich sind.
Um spezifische Proteinuntergruppen von BP zu erhalten, wurden die Proteine innerhalb von BP auf einer Hydroxyapatitsäule aufgetrennt. Das Porenmaterial enthielt Proteine, die mit < 120 mM KPO₄-Puffer eluiert werden konnten. Während der Elution verlief der pH-Gradient von 6,0 bis 7,4. 10 μg einer jeden Fraktion wurden auf Kollagenschwämme gegeben und der Subkutan-Assay im Nager wurde durchgeführt, wie oben in Beispiel 6 beschrieben. Zusätzlich wurde eine äquivalente Menge einer jeden Fraktion auf ein Proteingel geladen, und ein Westernblot wurde mit Antikörpern gegen BMP-2, BMP-3, BMP-7 und TGFβ-1 durchgeführt (Tabelle 12). Ein (–) zeigt an, dass kein Signal detektiert wurde, und ein (+) zeigt an, dass ein Signal detektiert wurde. TABELLE 12
Die Daten in Tabelle 14 demonstrieren, dass eine BP-Fraktion, die BMP-2, BMP-3, BMP-7 und TGFβ-1 enthält, Proteine enthält, die erforderliche Komponenten von BP für die Knorpel- und Knochen-induktive Aktivität sind. TABELLE 14
Beispiel 9
Das folgende Beispiel demonstriert, dass unterschiedliche Knorpel-Reparaturmatrices, kombiniert mit BP, die Knochen- und Knorpelbildung in vivo gemäß der vorliegenden Erfindung induzieren.

A. Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung eines Materials aus Polymilchsäure und Glykolsäure, das BP zur Knochen- und Knorpelbildung enthält. Eine 60 %ige (v/v) Lösung von Polymilchsäure und Polyglykolsäure (PLGA) (50:50) in N-Methylpyrrilidon wurde hergestellt. Kollagen (6 mg) wurde in eine Delrin-Form gepresst. Das PLGA (140 mg) wurde hinzugegeben und gemischt. BP (100 μg) enthaltend in einer 10 mM HCl-Lösung (100 μl) wurde hinzugegeben und alle Komponenten wurden zusammengemischt, um eine feste Scheibe zu bilden. Diese Mischung wurde in eine Form gepresst und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert, und dann in Ratten in dem RattenSubkutan-Assay, wie beschrieben in Abschnitt 5, implantiert. Die Histologie erfolgte nach einem Monat der Implantation. Die Tabelle 15 zeigt, dass BP in Kombination mit der PLGA-Matrix die Knochen- und Knorpelbildung in diesem in-vivo-Modell induziert. TABELLE 15
B. In diesem Assay wurde ein Kompositschwamm aus 3 % Kollagen Typ I/1 % Kollagen Typ IV (Sigma) hergestellt, indem die normale Reparationsmethode verwendet wurde, wie diese in Beispiel 4 der Anmeldung beschrieben ist. Die Matrix, die 10 μg BP enthielt, wurde in Ratten in dem RattenSubkutan-Assay implantiert, wie beschrieben in Abschnitt 5, und die Histologie wurde nach drei Wochen durchgeführt. Tabelle 16 zeigt, dass BP in Kombination mit der Matrix, die sowohl Typ I- als auch Typ IV-Kollagen enthielt, in diesem in-vivo-Modell Knochen- und Knorpelbildung induziert. TABELLE 16
C. Dieses Experiment demonstriert, dass die Knorpelreparaturmatrices, die Triethanolamin und Kollagen in Form eines Gels (basischem pH) in Kombination mit BP enthalten, die Knorpelbildung in vivo induzieren. Zur Präparation von basischem Kollagen wurden 0,5 g von TEA zu 99,5 g dI-Wasser zu pH 9,9 hinzugegeben. Um ein 2 %iges Kollagengel herzustellen, wurden 2,0 g Kollagen zu pH 8,8 hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert und dann eingefroren und für 48 Stunden lyophilisiert. Die Mischung wurde in 10 mM HCL (enthaltend 35 mg von BP) als 3 % und 6 % Kollagenschwämme rekonstituiert. Das Gel wurde durch eine #18- oder #20-Nadel in einem 100 Mikrolitervolumen zugeführt. Nach dem Trocknen hatten die resultierenden Schwämme 80 Gew.-% Kollagen und 20 Gew.-% TEA. Die Tabelle 17 demonstriert, dass sowohl der 3- als auch der 6 %-Kollagen-TEA-Schwamm kombiniert mit BP in diesem in-vivo-System Knochen und Knorpel induziert. TABELLE 17
TABELLE 18
D. Dieses Experiment demonstriert, dass Knochenreparaturmatrices, die Kollagen bei acidischem pH in Form eines injizierbaren Geles in Kombination mit BP enthalten, die Knorpelbildung in vivo induzieren. Eine BP-Lösung (1 mg/ml) enthaltend in 10 mM HCl (5 ml) wurde zu Kollagen (30 mg/ml) hinzugegeben. Die Lösungen wurden gemischt, bis sich eine geleeartige Konsistenz bildete, und wurden bei 4°C über Nacht inkubiert. In Abwesenheit eines Einschnittes wurden 100 μl des Geles subkutan in die Ratte injiziert. Tabelle 18 demonstriert, dass BP in einer Matrix in der Form eines Geles in diesem in-vivo-Modell die Knochen- und Knorpelbildung induziert.
E. Dieses Experiment demonstriert, dass Knorpelreparaturmatrices, die Kollagen bei acidischem pH in Form eines injizierbaren Gels in Kombination mit BP enthalten, in vivo die Knorpelbildung induzieren. Dieses Experiment unterscheidet sich von dem oben in Teil D dargestellten darin, dass 1 M H₃PO₄ anstelle von HCl verwendet wurde. Um das acidische pH-Kollagengel herzustellen, wurden zu 995 ml dI-Wasser 5 ml 1 M H₃PO₄ hinzugegeben, gefolgt von 1,75 ml 1,00 N NaOH (Mischung pH = 2,49)·10,0 g Kollagen wurden zu BP hinzugegeben und für 2 Stunden gemischt (End-pH = 3,61). Dies führt zu einem einprozentigen Kollagengel, das eingefroren und lyophilisiert wurde. Ein Schwamm mit 60 mg Kollagen wurde mit 2 ml dI-Wasser beladen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Das resultierende 3 %ige Kollagengel hatte einen pH von 3,7. Das Material war unter Verwendung von Nadeln mit den Maßen #18 und #20 injizierbar, nicht aber mit Nadeln mit dem Maß #22 oder #25. Ein Volumen von 100 μl enthielt 35 μg BP.

Tabelle 19 demonstriert, dass 3 % acidische Kollagenmatrices in der Form eines Gels und kombiniert mit BP in diesem in-vivo-System Knochen und Knorpel induzieren. TABELLE 19
Obwohl verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben wurden, versteht es sich, dass der Fachmann Modifizierungen und Anpassungen dieser Ausführungsbeispiele kennt. Es wird jedoch ausdrücklich festgehalten, dass solche Modifizierungen und Anpassungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen, wie diese in den nachstehenden Ansprüchen festgelegt ist:

Claims

Verwendung einer Mischung von Proteinen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung einer Anhaftung des Knochens an Bindegewebe, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sehne, einem Ligament und einem Cementum, wobei die Mischung von Proteinen Folgendes aufweist, nämlich: transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1), knochenmorphogenetisches Protein BMP-2, BMP-3, und BMP-7; wobei die Menge von TGFβ1 in der Mischung bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt; wobei die Menge von BMP-2 in der Mischung bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt; wobei die Menge von BMP-3 in der Mischung bei 0,1 % bis 15 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt; und wobei die Menge von BMP-7 in der Mischung bei 0,01 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Menge von TGFβ1 in der Mischung bei 0,05 % bis 1 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Menge von BMP-2 in der Mischung bei 0,1 % bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Menge von BMP-3 in der Mischung bei 0,1 % bis 10 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Menge von BMP-7 in der Mischung bei 0,1 % bis 5 % des Gesamtproteins in der Mischung liegt.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mischung von Proteinen ferner ein Protein aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TGFβ2, TGFβ3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9 und knorpelabgeleitetem morphogenetischen Protein (CDMP).
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mischung von Proteinen ferner zumindest ein Knochenmatrixprotein aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Osteocalcin, Osteonectin, Knochensialoprotein (BSP), Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Osteopontin, Matrix-GLA-Protein (MGP), Biglycan, Decorin, Proteoglycan-Chondroitin-Sulfat III (PG-CS III), Knochen-Acidisches-Glycoprotein (BAG-75), Thrombospondin (TSP) und Fibronectin; wobei das Knochenmatrixprotein etwa 20 % bis etwa 98 % der Mischung von Proteinen umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei das Knochenmatrixprotein 40 % bis 98 % der Mischung von Proteinen umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mischung von Proteinen ferner zumindest ein Wachstumsfaktorprotein aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Fibroblasten-Wachstumsfaktor I (FGF-I), FGF-II, FGF-9, Leukozyten-Inhibierender-Faktor (LIF), Insulin, Insulin-Wachstumsfaktor I (IGF-I), IGF-II, Platelet-Derived-Growth-Factor AA (PDGF-AA), PDGF-BB, PDGF-AB, Stromal-Derived-Factor-2 (SDF-2), Hypophysen-Thyroid-Hormon (PTH), Wachstumshormon, Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF), epithelialer Wachstumsfaktor (EGF), transformierender Wachstumsfaktor α (TGFα) und den Hedgehog-Proteinen; wobei das Wachstumsfaktorprotein etwa 0,01 % bis etwa 50 % der Mischung von Proteinen umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das Wachstumsfaktorprotein 0,1 % bis 10 % der Mischung von Proteinen umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Wachstumsfaktorprotein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-I (FGF-I).
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung ferner ein oder mehrere Serumproteine aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Albumin, Transferrin, α2-Hs GlycoP, IgG, α1-Antitrypsin, β2-Mikroglobulin, Apo A1 Lipoprotein (LP) und Faktor XIIIb ist.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Mischung von Proteinen Folgendes aufweist, nämlich: TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, CDMP, FGF-I, Osteocalcin, Osteonectin, BSP, Lysyloxidase, Cathepsin L pre, Albumin, Transferrin, Apo A1 LP und Faktor XIIIb.
Verwendung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Arzneimittel zusätzlich eine Matrix aufweist, die dafür konfiguriert ist, eine Zwischenschicht zwischen dem Bindegewebe und dem Knochen zu bilden.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Matrix bioresorbierbar ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei die Matrix porös ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Matrix ein Material aufweist, das ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus einem synthetischen Polymermaterial und einer Grundsubstanz.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Matrix ein Material aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Schwamm, einer Membran, einem Film und einem Gel.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Matrix Kollagen aus der Rindersehne aufweist.