JP2002537022A - 軟骨病変を再生して修復する装置及び方法 - Google Patents

軟骨病変を再生して修復する装置及び方法

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Abstract

(57)【要約】 生体分解性材料中への細胞の内向き成長及び軟骨組織への細胞分化の両方を誘発する軟骨修復生産物が開示されている。そのような生産物は、血管及び無血管の両方の軟骨病変、特に関節軟骨病変、さらに詳細には断裂及び区域性欠損などの半月板組織病変の再生及び／又は修復に有用である。そのような生産物を用いる軟骨病変の再生及び修復方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、生体吸収可能材料内への細胞内方成長と軟骨組織内への細胞分化と
を誘起する軟骨の再生・修復用生産物、ならびに、軟骨病変を修復するための該
生産物の使用方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 関節で結合した骨の端部に見られる無血管組織である関節軟骨の自然な治癒能
力は限られている。通常の軟骨発生の間、間充織幹細胞が凝縮することにより、
高密度の領域を形成すると共に、最終的には成熟軟骨細胞になる一連の発達段階
を経由する。最終的なヒアリン軟骨組織は、II型コラーゲン、硫酸プロテオグリ
カン及び付加的タンパク質から成るマトリックスにより包囲された軟骨細胞のみ
を含む。そのようなマトリックスは構造的に不均一であると共に、形態的には別
個の３つの領域から成る：皮相、中間及び深部である。各領域は、コラーゲン及
びプロテオグリカンの分布、石灰化、コラーゲン原線維の配向、及び、軟骨細胞
の位置及び整列に関して異なっている（Ａｒｃｈｅｒ等、１９９６年、Ｊ．Ａｎ
ａｔ．第１８９（１）巻：第２３〜３５頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９９６年、
Ｊ．Ａｎａｔ．第１８９（１）巻：第９〜２２頁；Ｍｏｗ等、１９９２年、Ｂｉ
ｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第１３（２）巻：第６７〜９７頁。これらの特性は、ヒ
アリン軟骨組織に対して固有の機械的及び物理的パラメータを提供する。
【０００３】 Ｃ形の軟骨組織である半月板は、大腿骨から脛骨への負荷送達、屈曲の間にお
ける前後方向位置の安定化、及び、関節潤滑などの、膝の幾つかの機能を果たす
。半月板が損傷すると、膝の安定性及び膝の固定性が損なわれる。２０年以上も
前、即時性の痛覚軽減を許容する半月軟骨切除術が行われたが、これは引き続き
変形性関節症の早期発生を誘起することが分かった（Ｆａｉｒｂａｎｋ、Ｊ．
Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ３０Ｂ：第６６４〜６７０頁；Ａｌｌｅｎ
等、１９８４年、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ６６Ｂ：第６６６
〜６７１頁；Ｒｏｏｓ等、１９９８年、Ａｒｔｈ． Ｒｈｅｕｍ． ４１、６８
７〜６９３頁）。より最近では、部分的半月軟骨切除術と半月板断裂の修復が実
施されている（図９Ａ〜Ｄ；Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｄ．編、１９９５年、Ｒｅｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｋｎｅｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ、ニューヨーク、Ｒ
ａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ）。しかし、部分的切除によると、半月板組織の機能の喪
失と、変形性関節症の早期発生を生じる。（Ｌｙｎｃｈ等、１９８３年、Ｃｌｉ
ｎ． Ｏｒｔｈｏｐ．、第１７２巻：第１４８〜１５３頁；Ｃｏｘ等、１９７５
年、Ｃｌｉｎ． Ｏｒｔｈｏｐ．、第１０９巻：第１７８〜１８３頁；Ｋｉｎｇ
、１９９５年、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． ７７Ｂ：８３６〜８３
７頁）。これに加え、半月板断裂の修復は半月板の血管１／３までの断裂に制限
され、半血管から無血管における２／３までの断裂は修復不能である（前掲のＪ
ａｃｋｓｏｎ、図９Ａ〜Ｄ）。合衆国で１年間に生ずる約５６０，０００件の半
月板負傷の内、推定で断裂の８０％は無血管で修復不能な領域に位置している。
明らかに、“修復不能”な断裂を修復し又は切除した半月板の再生を誘発し得る
方法は、無痛筋骨格運動に対し、且つ、人々の大部分における変形性関節症の早
期発生の防止に対して有益であろう。
【０００４】 半月板の基部の凹状表面は大腿顆に接触し、且つ、末端の平坦表面は脛骨平坦
部に接触する。半月板の外側１／３は高度に血管化されると共に、密度の高い弱
い結合組織を含む。これと対照的に、残りの半月板は、多量の細胞外マトリック
スにより包囲された線維軟骨細胞から成る半血管又は無血管の無神経組織から成
る（ＭｃＤｅｖｉｔｔ等、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．第２５２
巻、第８〜１７頁）。線維軟骨細胞は未分化の線維芽細胞と比較して外見及び機
能の両者において区別される。線維芽細胞は多くの細胞過程を含む細長い細胞で
あり、主にI 型コラーゲンを生成する。線維芽細胞により生成されたマトリック
スは十分な機械的負荷を生成しない。これと対照的に、線維軟骨細胞はI 型及び
II型コラーゲン及びプロテオグリカンを生成する。これらのマトリックス成分は
、筋骨格運動の間において通常半月板に及ぼされる圧縮力を支持する。
【０００５】 １９６０年代に、無機質除去骨マトリックスが、異所性部位に植設されたとき
に新たな軟骨及び骨の形成を誘起することが観察された（Ｕｒｉｓｔ、１９６５
年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１５０巻：第８９３〜８９９頁）。骨誘起作用を引き起
こす成分は、骨形態形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）と称される。後に少なくとも７種の別個のＢＭＰタ
ンパク質（ＢＭＰ１〜７）が骨から確認されるとともに、アミノ酸分析によれば
、上記７種のＢＭＰの内の６種は互いに関連すると共にＴＧＦ−βのスーパーフ
ァミリーの他のメンバーに対して関連することが分かった。軟骨内性骨形成の間
、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、走化性、多能性細胞の軟骨系列への分化
、軟骨細胞の肥厚段階への成熟、軟骨の無機質化、骨細胞による軟骨の置換、及
び、石灰化マトリックスの形成などの一連の事象を誘導する（Ｒｅｄｄｉ、１９
９７年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ
、第８巻、第１１〜２０頁）。別個ではあるが、組換えＢＭＰはこれらの事象を
誘起し得るものであり、自然の骨形成の複雑さには、骨組織における複数のＴＧ
Ｆ−βファミリーメンバーの普及率が背景となる。
【０００６】 本明細書中ではＢＰとも称される骨タンパク質（ズルツァー オルソペディク
ス バイオロジクス社、コロンビア州ウェアトリッジ所在（Ｓｕｌｚｅｒ Ｏｒ
ｔｈｏｐｅｄｉｃｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｗｈｅａｔｒｉｄｇｅ， ＣＯ）
）は、試験管内及び生体内において骨形成作用を有する無機質除去牛骨から分離
された自然発生タンパク質混合物である。齧歯動物の異所性モデルにおいて、Ｂ
Ｐは、軟骨中間物を介した軟骨内性骨形成もしくは骨形成を誘起する（Ｄａｍｉ
ｅｎ， Ｃ．等、 １９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．
第２４巻：第６３９〜６５４頁）。炭酸カルシウムと組み合わされたＢＰは体内
で骨形成を促進する（Ｐｏｓｅｒ及びＢｅｎｅｄｉｃｔ、ＰＣＴ公報第ＷＯ９５
／１３７６７号）。インビトロにおいてＢＰは、マウス胚間充織幹細胞（Ａｔｋ
ｉｎｓｏｎ等、１９９６年、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ"、Ａｎｎａｌｓ Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．第７８５巻：第２０６〜２０８頁、メリ
ーランド州ベセスダ所在；Ａｔｋｉｎｓｏｎ等、１９９７年，Ｊ． Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． 第６５巻：３２５〜３３９頁）及び成人筋芽細胞及び皮膚
細胞（Ａｔｋｉｎｓｏｎ等、１９９８年、４４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉ
ｎｇ， Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ａｂ
ｓｔｒａｃｔ））の軟骨への分化を促進すると示されている。しかし、これらの
インビトロシステムにおける軟骨生成を確実にするためには、培養組織内の細胞
構成の制御、培地組成の最適化、及び、細胞分裂促進に関して軟骨生成を最大化
すべく入念に確立されるべき外因性因子の付加、などにより培養期間に亙り培養
条件が厳しく制御されねばならない。斯かる条件の最適化の故に、開示されたイ
ンビトロ法を生体内システムに適用するのは非現実的であり且つ予測不能なもの
となる。これに加え、成人筋芽細胞及び皮膚細胞のインビトロ（試験管内）培養
により最初は軟骨が生成するが、その効果は過渡的で経時的なものにすぎず、上
記培養組織はその元の表現型へと戻った。一定の種類の胚細胞及び前駆細胞はこ
れらの研究でインビトロで長期の軟骨生成を示したが、胚細胞の場合には、成人
患者でインビボ（生体内）部位へとそのような特定の種類の細胞が補充されるか
は予期不能であり又は不可能でさえあろう。
【０００７】 参照によりその全体が本明細書中に援用されるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ／０
５１００号においてＡｔｋｉｎｓｏｎ等は軟骨修復を誘起すべく、複数の天然因
子から成る骨誘起及び／又は軟骨誘発用混合物に対する送達システムを記述して
いる。
【０００８】 Ｈｕｎｚｉｋｅｒ（米国特許第５，３６８，８５８号及び第５，２０６，０２
３号）は、生物分解性マトリックスと、増殖／走化性試薬と、形質転換因子とを
含む軟骨修復組成物を記述している。各成分が経時的に特定機能を有する、２段
階の手法が使用されている。第１に、特定濃度の増殖／走化性試薬が欠陥を修復
細胞により充填する。第２に、好適には送達システムに関連して配備された高濃
度の形質転換因子が修復細胞を軟骨細胞へと形質転換する。送達システム（すな
わちリポソーム）において高濃度の形質転換因子の送達を行う第２段階は、治療
部位にてヒアリン軟骨組織を形成するために必要とされた。
【０００９】 Ｃｈｅｎ及びＪｅｆｆｒｉｅｓ（米国特許第５，７０７，９６２号）は、骨形
成を増進するコラーゲン及び吸着因子から成る骨形成組成物を記述している。 Ｖａｌｅｅ及びＫｉｎｇ（米国特許第４，９５２，４０４号）は、少なくとも
３週間に亙り血管新生因子すなわちアンギオゲニンを投与することによる、負傷
した無血管半月板組織の治療法を記述している。
【００１０】 以前にＡｍｏｃｚｋｙ等は、イヌの半月板における無血管円形病変を修復すべ
く自原性フィブリン塊を使用する方法を記述している（Ａｍｏｃｚｋｙ等、１９
８８年、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７０Ａ：第１２０９〜１２１
７頁）。この手法は、フィブリン塊を欠くコントロールと比較して半月板組織の
修復を増進した。しかし、修復組織は半月板様の組織では無く、結合性瘢痕組織
であった。
【００１１】 Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等は、イヌのモデルにおいて無血管で円形の半月板欠陥に
おいて、血管内皮細胞成長因子と共に或いは／血管内皮細胞成長因子無しで、フ
ィブリン封鎖剤を使用する方法を記述している（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等、１９９
２年、Ａｍ． Ｊ． Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．、第２０巻：第５３７〜５４１頁
）。血管内皮細胞成長因子はフィブリン封鎖剤のみによる治癒と比較して適度な
利点を与えたが、この付加的効果は治療後に３ヶ月が過ぎるまで観察されなかっ
たことから、成長因子の寄与が間接的であることを示している。これに加えて上
記欠陥は、正常な半月板組織に普通は存在しないヒアリン軟骨様の細胞により充
填された。
【００１２】 Ｓｈｉｒａｋｕｒａ等は、半月板断裂内に縫合される自原性滑膜移植片の使用
を記述している。上記滑膜は動物の１／３で治癒を増進したが、上記移植片は半
月板組織において通常的に観察される線維軟骨組織ではなく線維組織により治癒
した（Ｓｈｉｒａｋｕｒａ、１９９７年、Ａｃｔａ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｓｃａ
ｎｄ．、第６８巻：第５１〜５４頁）。更に、上記移植片の２／３は治癒しなか
った。
【００１３】 軟骨及び骨形成に対する分子メカニズムは部分的に解明されている。骨形態形
成タンパク質（ＢＭＰ）及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）の分
子は両者ともに細胞表面の受容体（すなわちＴＧＦβ／ＢＭＰ受容体）に結合し
て、増殖、軟骨への分化、及び／又は、骨への分化を促進するシグナルカスケー
ドを、核に対して発し始める（Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９６年、Ｃｅｌｌ、第８
５巻：第９４７〜９５０頁。１９８４年にＵｒｉｓｔは、骨修復のための、生物
分解性ポリ（乳酸）ポリマー投与システムと組み合わせた組換え型では無いが実
質的に純粋なＢＭＰを記述した（米国特許第４，５６３，４８９号）。このシス
テムは等量のＢＭＰ及びポリ（乳酸）（ＰＬＡ）粉末（各々１００μｇ）を混合
すると共に、骨修復を促進するに必要なＢＭＰの量を減少する。
【００１４】 Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ等（ＷＯ９６／３９１７０号）は、軟骨形成誘起タンパ
ク質及び軟骨保持誘起タンパク質を使用して軟骨組織形成を誘起するための、２
因子から成る組成物を開示している。軟骨を誘起する特定の組換えタンパク質は
ＢＭＰ−１３、ＭＰ−５２及びＢＭＰ−１２として特定されると共に、特定の軟
骨保持誘起タンパク質はＢＭＰ−９として特定される。一実施形態においてＢＭ
Ｐ−９は再吸収可能ポリマーシステム内に密閉収納されると共に、軟骨形成誘起
タンパク質の存在と一致して送達される。
【００１５】 Ｌａｕｒｅｎｃｉｎ等（米国特許第５，６２９，００９号）は、無機質除去骨
マトリックス、ＴＧＦβ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ）又は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来する水溶性タンパク質を送達す
るという、ポリ無水物及びポリオルトエステルから成る軟骨生成誘導装置を開示
している。
【００１６】 Ｂｅｎｔｚ等（ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０９６９７号）は、骨修復のためにＴ
ＧＦβタンパク質と共に骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を使用することを記述
している。混合物におけるＢＭＰとＴＧＦβとの比率は１０：１〜１：１０の範
囲である。ＢＭＰ−２もしくはＢＭＰ−３のいずれかと共にＴＧＦ−βを添加す
ると、いずれかの因子のみの場合と比較して骨誘起作用が増大し且つ骨組織に対
する軟骨の比率が増加する（Ｂｅｎｔｚ等、Ｍａｔｒｉｘ、第１１巻：第２６９
〜２７５頁（１９９１年）；Ｏｇａｗａ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、第
２６７巻（２０）：第１４２３３〜７頁（１９９２年）、ＷＯ９２／０９６９７
号）。但しこの組成物は、齧歯動物の皮下アッセイにおいて相当の骨組織を生成
した。
【００１７】 Ｂｕｌｐｉｔｔ及びＡｅｓｃｈｌｉｍａｎｎは、ＴＧＦβ−２及びＢＭＰ−２
によればラットの異所性骨形成アッセイにおいて骨形成が促進され且つ軟骨形成
は減少することを発見した（Ｂｕｌｐｉｔｔ等、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ、第１６２〜１６９頁（１９９９年）。
【００１８】 他の研究は、ＴＧＦβ−１もしくは−２をＢＭＰと組み合わせても全くもしく
は殆ど効果が無いことを例証している。インビトロにおいて、ＴＧＦβ−１及び
ブタＢＭＰを組み合せてもコラーゲン生成には何らの相乗効果も例証されなかっ
た（Ｋｉｍ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． ＢｉｏＬ Ｉｎｔ’ｌ、第３３巻
：第２５３〜２６１頁（１９９４年）。同様にＢａｌｌｏｃｋ等は、試験管内で
細胞に由来する骨膜におけるコラーゲン生成に対してＴＧＦβ−１及びＢＭＰ−
３の相乗作用を例証しなかった（Ｂａｌｌｏｃｋ等、Ｊ． Ｏｒｔｈｏ． Ｒｅ
ｓ．、第１５巻：第４６３〜７頁（１９９７年）。
【００１９】 Ｒｏｓｅｎにより改変されたＳａｍｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉの齧歯動物アッセイ
（Ｓａｍｐａｔｈ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ、
第８０（２１）巻：第６５９１〜５頁（１９８３年）において、ＢＭＰ−２含有
インプラントは、１０日後には軟骨及び骨形成を示し、且つ２１日後には大半が
骨組織（軟骨なし）を示した（米国特許第５，６５８，８８２号）。
【００２０】 以前に、Ｌｉ及びＳｔｏｎｅ（米国特許第５，６８１，３５３号）は生体適合
性かつ生体吸収可能な繊維から成る半月板強化装置を記述しているが、この装置
は、半月板線維軟骨細胞の内方成長に対する足場として作用し、通常の半月板負
荷を支持し、且つ、自然な半月板外形を近似する外態様を有している。半月板を
血管領域まで部分的に切除した後、該装置は結果的な断片的欠陥内に植設される
。その結果は、イヌ及びヒトの両者に対して記述されている（Ｓｔｏｎｅ等、１
９９２年、Ａｍ． Ｊ． Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．、第２０巻：第１０４〜１１
１頁；Ｓｔｏｎｅ等、１９９７年、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．、
第７９巻、第１７７０〜１７７７頁）。
【００２１】 上述した半月板強化装置、研究報告及び特許開示内容ならびに現在の修復手術
は軟骨修復の分野において有望な成果を提供するが、修復組織が半月板組織であ
るという“修復不能な”無血管断裂の修復を誘起する上では十分でなく、且つ、
患者のリハビリ時間を短くして血管領域に半月板組織を再生する上では十分でな
い。更には、生体内での“修復可能”な半月板断裂の治癒率の増大を例証する報
告は無い。
【００２２】 （発明の要約） 本発明は、軟骨病変を修復且つ／又は再生する生産物及び方法に関する。本発
明の生産物及び方法は、血管、半血管及び無血管の病変を含め、関節及び半月板
の病変などの、種々の軟骨病変を修復する為に有用である。更に、本発明の生産
物及び方法は、径方向断裂、バケツ柄状断裂及び断片的欠陥などの種々のサイズ
及び形状の軟骨病変を修復すべく使用され得る。
【００２３】 本発明の生産物の第１実施形態は、軟骨病変を修復する生産物に関する。斯か
る生産物は、（ａ）軟骨修復用マトリックスと、（ｂ）上記マトリックスと連携
してタンパク質の混合物を提供する軟骨誘発組成物と、を含む。本発明の生産物
の一実施形態において、軟骨誘発組成物は、トランスフォーミング成長因子β１
（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ
−７、を含むタンパク質の混合物を含む。混合物におけるＴＧＦβ１の量は、混
合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約９９．９９％であり、混合物
におけるＢＭＰ−２の量は混合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約
１０％であり、混合物におけるＢＭＰ−３の量は混合物における合計タンパク質
の約０．１％乃至約１５％であり、混合物におけるＢＭＰ−７は混合物における
合計タンパク質の約０．０１％乃至約１０％である。
【００２４】 本発明の生産物の第２実施形態において、軟骨誘発組成物は、（ａ）骨由来の
骨形成もしくは軟骨形成用製剤、及び（ｂ）外因性ＴＧＦβタンパク質を含むタ
ンパク質の混合物を含む。上記外因性ＴＧＦβタンパク質は、該外因性ＴＧＦβ
タンパク質が存在しない場合に上記骨由来の骨形成もしくは軟骨形成用タンパク
質製剤による軟骨誘発のレベルを超えて上記組成物により軟骨誘発を増加するに
十分な量で存在する。この実施形態の１態様において、上記外因性ＴＧＦβタン
パク質はＴＧＦβ１である。この態様において、タンパク質の混合物における他
のすべてのタンパク質に対するＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１：１０、少な
くとも約１：３、少なくとも約１：１、又は少なくとも約１０：１である。
【００２５】 本発明の生産物の第３実施形態において、軟骨誘発組成物は、（ａ）ＴＧＦβ
タンパク質と、（ｂ）少なくとも一種類の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含
むタンパク質の混合物とを含み、ＢＭＰタンパク質に対するＴＧＦβタンパク質
の比率は約１０：１より大きい。この実施形態において上記ＴＧＦβタンパク質
は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４、ＴＧＦβ５、又はその
混合物などの任意のＴＧＦβタンパク質とされ得る。好適実施例において、上記
ＴＧＦβタンパク質はＴＧＦβ１もしくはＴＧＦβ２であり、ＴＧＦβ１が最も
好適である。上記ＢＭＰタンパク質は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、
ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＣＤＭＰ、及
びその混合物などの任意のＢＭＰタンパク質とされ得るが、これらに限定される
わけではない。
【００２６】 本発明の上記各実施例のいずれかの１態様において、タンパク質の混合物はＴ
ＧＦβスーパーファミリー・タンパク質：ＴＧＦβ１、骨形態形成タンパク質（
ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７を含み、上記ＴＧＦβスーパーファミ
リー・タンパク質は上記タンパク質の混合物の約０．５％乃至約９９．９９％か
ら成る。ひとつの態様において上記ＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質は
上記タンパク質の混合物の約０．５％乃至約２５％から成り、他の態様において
上記ＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質は上記タンパク質の混合物の約１
％乃至約１０％から成る。
【００２７】 上記各実施例の各々の１態様において、上記混合物におけるＴＧＦβ１の量は
混合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約７５％であり、別の態様に
おいて上記混合物におけるＴＧＦβ１の量は混合物における合計タンパク質の約
０．０１％乃至約５０％であり、別の態様において上記混合物におけるＴＧＦβ
１の量は混合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約２５％であり、別
の態様において上記混合物におけるＴＧＦβ１の量は混合物における合計タンパ
ク質の約０．０１％乃至約１０％であり、別の態様において上記混合物における
ＴＧＦβ１の量は混合物における合計タンパク質の約０．１％乃至約１％であり
、別の態様において上記混合物におけるＴＧＦβ１の量は混合物における合計タ
ンパク質の約３３％乃至約９９．９９％であり、別の態様において上記混合物に
おけるＴＧＦβ１の量は混合物における合計タンパク質の約５０％乃至約９９．
９９％である。
【００２８】 上記各実施形態の各々の１態様において、上記混合物におけるＢＭＰ−２の量
は混合物における合計タンパク質の約０．１％乃至約５％である。上記各実施形
態の各々の１態様において、上記混合物におけるＢＭＰ−３の量は混合物におけ
る合計タンパク質の約０．１％乃至約５％である。上記各実施形態の各々の１態
様において、上記混合物におけるＢＭＰ−７の量は混合物における合計タンパク
質の約０．１％乃至約５％である。本発明の生産物の上記第１実施形態において
、上記混合物におけるＢＭＰ−３の量は約０．１％乃至約１０％である。
【００２９】 上記各実施形態の各々の１態様において、上記タンパク質の混合物は、ＴＧＦ
β２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ
−９及び軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）から成る群から選択されたタ
ンパク質を更に含む。１態様において、ＴＧＦβ２はタンパク質の混合物の約０
．５％乃至約１２％から成り、他の態様において、ＴＧＦβ３はタンパク質の混
合物の約０．０１％乃至約１５％から成り、他の態様においてＢＭＰ−４はタン
パク質の混合物の約０．０１％乃至約１％から成り、他の態様においてＢＭＰ−
５はタンパク質の混合物の約０．０１％乃至約１％から成り、他の態様において
ＢＭＰ−６はタンパク質の混合物の約０．０１％乃至約１％から成り、他の態様
においてＣＤＭＰはタンパク質の混合物の約０．０１％乃至約１％から成る。
【００３０】 上記の各実施形態の他の態様において、上記タンパク質の混合物は少なくとも
一種類の骨マトリックスタンパク質を更に含む。上記骨マトリックスタンパク質
は、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リ
シルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポンチン、マトリックスＧＬ
Ａタンパク質（ＭＧＰ）、ビグリカン、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）、プロテオ
グリカン−コンドロイチン硫酸塩III （ＰＧ−ＣＳIII ）、骨酸性糖タンパク質
（ＢＡＧ−７５）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）及びフィブロネクチンを含み
得るが、これらに限定されるわけではない。一般に上記骨マトリックスタンパク
質は上記タンパク質の混合物の約２０％乃至約９８％から成る。１態様において
上記骨マトリックスタンパク質は、オステオカルシン、オステオネクチン、骨シ
アロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ及びカテプシンＬ前駆体を含む
。別の態様において上記骨マトリックスタンパク質は、上記タンパク質の混合物
の約４０％乃至約９８％から成る。
【００３１】 上記の各実施形態の他の態様において、上記タンパク質の混合物は少なくとも
一種類の成長因子タンパク質を更に含む。上記成長因子タンパク質は、線維芽細
胞成長因子−I （ＦＧＦ−I ）、ＦＧＦ−II、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子（Ｌ
ＩＦ）、インスリン、インスリン成長因子I （ＩＧＦ−I ）、ＩＧＦ−II、血小
板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、間
質由来因子−２（ＳＤＦ−２）、脳下垂体甲状線ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホル
モン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミ
ング成長因子−α（ＴＧＦα）及びヘッジホッグタンパク質（ｈｅｄｇｅｈｏｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）を含み得るが、これらに限定されるわけではない。一般に上
記成長因子タンパク質は、上記タンパク質の混合物の約０．０１％乃至約５０％
から成る。１態様において上記成長因子タンパク質は上記タンパク質の混合物の
約０．０５％乃至約２５％から成り、別の態様において上記成長因子タンパク質
は上記タンパク質の混合物の約０．１％乃至約１０％から成る。好適には上記成
長因子タンパク質は線維芽細胞成長因子−I （ＦＧＦ−I ）である。この点にお
いて上記ＦＧＦ−I は上記タンパク質の混合物の約０．００１％乃至約１０％か
ら成る。
【００３２】 本発明の上記の各実施例の更に別の態様において、上記組成物は一種類以上の
血清タンパク質を更に含む。上記血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェ
リン、α２−Ｈｓ グリコＰ、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、β２−ミクロ
グロブリン、Ａｐｏ Ａ１リポタンパク質（ＬＰ）及び因子ＸIII ｂを含み得る
が、これらに限定されるわけではない。１態様において上記血清タンパク質は、
アルブミン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子ＸIII ｂから成る
群から選択される。
【００３３】 本発明の上述の各実施形態のいずれかの１態様において、上記タンパク質の混
合物はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ
−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−I 、オステオカルシン、オ
ステオネクチン、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、アルブミ
ン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子ＸIII ｂを含む。別の態様
において上記タンパク質の混合物は骨タンパク質（ＢＰ）を含む。更に別の態様
において上記軟骨誘発組成物は、細胞浸潤を誘起する能力、細胞増殖を誘起する
能力、血管新生を誘起する能力、及び、II型コラーゲン生成軟骨細胞への細胞分
化を誘起する能力から成る群から選択された識別特性を有する。
【００３４】 本発明の上述の各実施例のいずれかの１態様において、上記軟骨誘発組成物は
重量で生産物の約０．５％乃至約３３％の濃度である。別の態様において上記軟
骨誘発組成物は重量で生産物の約１％乃至約２０％の濃度である。
【００３５】 本発明の生産物の上記第１実施形態において上記タンパク質の混合物は、ラッ
トの皮下アッセイにおいて６．５〜７．３ｍｇの牛腱コラーゲン当たり少なくと
も約１０μｇの濃度で使用されたとき、表８に示された骨の等級分けスケールを
使用すると約１．０乃至約３．５の骨スコアを生じ、且つ、表９に示された軟骨
の等級分けスケールを使用すると少なくとも約１．２の軟骨スコアを生じる。
【００３６】 本発明の上記生産物の第２実施形態及び第３実施形態において上記組成物は、
ラットの皮下アッセイにおいて６．５〜７．３ｍｇの牛腱コラーゲン当たり少な
くとも約１０μｇの濃度で使用されたとき、表８に示された骨の等級分けスケー
ルを使用すると約２．０未満の骨スコアを生じ、且つ、表９に示された軟骨の等
級分けスケールを使用すると少なくとも約２．０の軟骨スコアを生じる。好適に
は上記第２実施形態及び第３実施形態において上記組成物は、ラットの皮下アッ
セイにおいて６．５〜７．３ｍｇの牛腱コラーゲン当たり少なくとも約１０μｇ
の濃度で使用されたとき、表８に示された骨の等級分けスケールを使用すると約
２．０未満の骨スコアを生じ、且つ、表９に示された軟骨の等級分けスケールを
使用すると少なくとも約２．５の軟骨スコアを生じる。更に好適には上記第２実
施形態及び第３実施形態において上記組成物は、ラットの皮下アッセイにおいて
６．５〜７．３ｍｇの牛腱コラーゲン当たり少なくとも約１０μｇの濃度で使用
されたとき、表８に示された骨の等級分けスケールを使用すると約２．０未満の
骨スコアを生じ、且つ、表９に示された軟骨の等級分けスケールを使用すると少
なくとも約３．０の軟骨スコアを生じる。
【００３７】 本発明の上記第１実施形態の１態様において、タンパク質の混合物における他
のすべてのタンパク質に対するＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１：１０であり
、別の態様においてタンパク質の混合物における他のすべてのタンパク質に対す
るＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１：３であり、別の態様においてタンパク質
の混合物における他のすべてのタンパク質に対するＴＧＦβ１の比率は少なくと
も約１：１であり、別の態様においてタンパク質の混合物における他のすべての
タンパク質に対するＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１０：１である。
【００３８】 本発明の上記生産物の第２実施形態又は第３実施形態において、ＴＧＦβタン
パク質は組換え型ＴＧＦβタンパク質とされ得るか、又は、骨由来タンパク質混
合物から精製され得る。１態様において、ＢＭＰタンパク質に対するＴＧＦβタ
ンパク質の比率は約１００：１より大きく、別の態様においてＢＭＰタンパク質
に対するＴＧＦβタンパク質の比率は約１０００：１より大きく、別の態様にお
いてＢＭＰタンパク質に対するＴＧＦβタンパク質の比率は約１０，０００：１
より大きい。
【００３９】 上述の第３実施形態において、好適な態様でＴＧＦβタンパク質はＴＧＦβ１
である。該実施例の別の好適な態様では、上記ＢＭＰタンパク質はＢＭＰ−２、
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、
ＢＭＰ−９及びＣＤＭＰから成る群から選択される。
【００４０】 本発明の上記生産物の上記各実施形態の他の種々の態様は、以下に詳述する。 本発明の上記生産物はまた、（ａ）軟骨修復用マトリックス、及び、（ｂ）上
記軟骨生成増進タンパク質の上記混合物により培養された細胞を含む、上記マト
リックスと連携する軟骨誘発組成物、を含むべく処方され得る。
【００４１】 上記軟骨修復用マトリックスは、軟骨欠陥が修復される如く、該軟骨欠陥に合
致する形状及びサイズである。故に上記マトリックスは軟骨断裂を修復するに最
も適切なシートとして造形され得るか、又は、上記マトリックスはテーパ形状を
含み得る断片的欠陥を修復すべく造形され得る。上記軟骨修復用マトリックスは
合成ポリマー材料及びマトリックスなどの任意の適切な材料から形成され得る。
一実施形態において上記マトリックスは生体吸収可能である。別実施例において
上記マトリックスは孔性である。上記マトリックスがシートとして造形されたと
き、上記マトリックスは架橋されないのが好適であり、且つ、上記マトリックス
が断片的欠陥を修復すべく造形されたときに該マトリックスは架橋されるのが好
適である。
【００４２】 上記軟骨誘発組成物は、上記マトリックスの表面に対する上記組成物の凍結乾
燥、及び、上記組成物を含む送達製剤の上記軟骨修復用マトリックス内での懸濁
などの任意の適切な方法により、上記マトリックスと組み合わされ得るが、それ
らに限定されるわけではない。さらに、上記組成物は上記マトリックスに対し生
体外（ex vivo ）もしくは生体内（in vivo ）で組み合わされ得る。
【００４３】 本発明の別実施形態は、軟骨誘発組成物の上記各実施例のいずれかを含む軟骨
修復用生産物などの上述の本発明の軟骨修復用生産物を軟骨病変へと植設して固
定する工程を含む、軟骨病変の修復方法に関する。本発明の方法は、血管軟骨断
裂及び断片的欠陥の修復の速度及び／又は質を増進すべく使用され得ると共に、
本発明以前においては一般に修復不能と見做された半血管及び無血管の断裂なら
びに断片的欠陥を修復する機能を提供し得る。病変が半血管もしくは無血管の軟
骨であるとき、上記生産物は時的制御された送達製剤を付加的に含み得る。
【００４４】 １態様において本発明の方法は、断片的欠陥を修復すべく２つの軟骨修復用生
産物を使用する。第１の生産物は、上述の如く軟骨生成誘起組成物と組み合わさ
れるべくシートとして造形された軟骨修復用マトリックスを含む。第２の生産物
は軟骨修復用マトリックスを含むが、該マトリックスは、断片的欠陥から除去さ
れた軟骨を置換すべく造形されたものであり、本発明の上記軟骨生成誘起組成物
と組み合わされても良くされなくても良い。
【００４５】 （発明の詳細な説明） 本出願は一般に、軟骨病変を修復且つ／又は再生する生産物、及び、斯かる生
産物を使用して軟骨病変を修復もしくは再生する方法に関する。本発明の生産物
及び方法は、関節軟骨（たとえばヒアリン軟骨）及び半月板軟骨（たとえば線維
軟骨）における欠陥（すなわち病変）を修復する上で特に有用である。半月板軟
骨を修復すべく使用される場合、本発明の生産物及び方法は血管及び無血管の半
月板軟骨病変の両者を修復する効果がある。特に、本発明の生産物及び方法は、
半月板修復の速度を高めると共に、現在実施されている習用の修復の間に通常的
に観察されるよりも一層正常な（すなわち内因性タイプの）半月板組織を誘起す
る。本発明の軟骨修復用生産物はまた、無血管の“修復不能”な断裂の半月板修
復も誘発し、且つ、更には半月板状組織により欠陥を充填し得る。更に、上記生
産物及び方法は、部分的なもしくは完全な半月軟骨切除術により除去された半月
板組織を修復かつ再生する上で有用である。本発明の生産物及び方法は、血管形
成を増進し、線維軟骨細胞を生成し、上記生産物内への細胞浸潤を誘起し、細胞
増殖を誘起し、且つ、細胞状の空間構成を生成して３次元半月板組織を形成し得
る。
【００４６】 生体内にて血管及び無血管の軟骨の両者を修復且つ／又は再生するという本発
明の生産物の機能は、現在公知の軟骨修復装置／組成物もしくは方法のいずれに
よっても達成されていない。更に、これまでの装置及び方法は主として、極めて
小寸の欠陥の修復に関しており、大寸で臨床関連の欠陥の修復に伴う問題を解決
する上では好首尾でなかった。理論に拘泥されることを意図しなければ本発明者
等は、これらの先行手法が軟骨を適切に修復し得なかった理由は、これらの手法
が自然軟骨個体発生を正確に十分に発生反覆し得なかったからであり、この自然
個体発生は種々の因子、因子組合せ、及び、一時的かつ局所的な勾配による因子
濃度、の極めて複雑なシステムに基づくからと確信する。単一の組換え因子もし
くは２種の組換え因子は、軟骨成長を十分な程度まで擬態する誘起的複雑さを欠
く可能性がある。更に、先の研究者等は、生体内で骨成長を制限して軟骨成長を
増進する骨形成因子／軟骨生成因子の種々の組合せを操作する方法を発見してい
ない。同様に、一種もしくは二種の組換え因子を提供すべく使用されたシステム
は、自然システムの勾配複雑さを十分な程度まで擬態し得ず、又は、前駆細胞が
軟骨細胞へと完全に永続的に分化するのを許容するに十分な時間に亙り因子濃度
を維持し得なかったのかも知れない。理論に拘泥されることを意図しなければ本
発明者等は、一定の欠陥、特に大寸の欠陥を修復するには、軟骨の適切な形成を
誘起するに十分な時間に亙り当該部位にて修復因子の特定の複合混合物を十分な
濃度に維持する必要があると確信する。
【００４７】 本発明者等により発見され且つ本明細書中に記述される場合、骨タンパク質（
ＢＰ）及びＢＰに由来する混合物は、無血管環境（たとえば関節軟骨かつ試験管
内）では骨形成作用が制限されて軟骨生成的である。但し、ＢＰは他の血管環境
（腰椎、皮下など）では軟骨生成的であるが、相当の骨形成作用も有する。半月
板などの一定の軟骨再生用途では、血管環境における軟骨修復が必要とされる。
半月板は血管形成されることから、ＢＰ及び他の骨誘起分子は修復の間において
軟骨形成を誘起するにも関わらず、臨床用途では望ましくない骨形成をも誘起す
る。本発明は骨形成なしで軟骨を誘起すべく、牛骨から誘導された各因子の新規
な混合物の検証を記述する。上記軟骨誘発作用は、容認され得る骨形成環境であ
る、齧歯動物の血管皮下モデルにて観察された。特にこの新規な混合物は意外に
も、骨誘起特性も有する混合物などの本明細書中で開示された軟骨誘発組成物に
対して高濃度のＴＧＦβタンパク質を結合することにより、骨形成作用を相当に
減少しもしくは排除し乍ら、この新規な軟骨生成作用を生成する。本発明者等が
知る限りでは本発明に先立ち、高濃度のＴＧＦβタンパク質を骨形成タンパク質
及び／又は軟骨生成タンパク質と組合せて、（骨形成を容認する）血管環境にお
いて骨形成なしで軟骨形成のみを促進することは記述されていない。
【００４８】 本発明の１態様は、軟骨病変の修復の為の生産物に関している。一実施形態に
おいて斯かる生産物は、（ａ）軟骨修復用マトリックス、及び、（ｂ）上記マト
リックスと連携して、（以下で詳述される）軟骨生成増進タンパク質として本明
細書中で言及され得るタンパク質混合物を提供する軟骨誘発組成物、を含む。本
発明に依れば“軟骨誘発組成物”という語句は、種々の軟骨生成増進タンパク質
の混合物を含むと共に生体内で軟骨成長を増進（すなわち、強化、増幅、改善、
増加もしくは増補）する製剤を指す。好適実施例において、本発明の上記生産物
に有用な軟骨誘発組成物は、生体内にて又は適切な試験管内条件の下で、細胞浸
潤を誘起する能力、細胞増殖を誘起する能力、血管新生を誘起する能力、及び／
又は、II型コラーゲン生成軟骨細胞への細胞分化を誘起する能力などの識別特性
を有する。
【００４９】 より詳細には本発明の軟骨誘発組成物は、特に本明細書中で詳述された如き混
合物に組合されたときに骨形成及び／又は軟骨生成増進作用を有するタンパク質
を含むタンパク質の混合物を提供する。本発明に依れば、特に軟骨生成の増進に
関して“増進”という語句は、上記生産物無しで又は上記生産物の組成物部分無
しで生じるであろう軟骨形成と比較して、軟骨形成の自然個体発生を更に厳密に
擬態する様式で軟骨が形成される如く、軟骨生成に関連する生物学的活性を強化
、増幅、改善、増加もしくは増補する任意の手段を指す。増進という語句はまた
、無機質化された軟骨及び骨組織への軟骨内性成熟が防止されもしくは遅延され
得ることも意味する。
【００５０】 本発明の一実施形態において、軟骨生成誘起組成物に含まれる軟骨生成増進タ
ンパク質の混合物は、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で７日間に亙りＡＴＤＣ５細胞
と共に培養されたときに、ＡＴＤＣ５細胞により実施されたアルシアンブルーア
ッセイにおいて統計的に有意なＡ595 の増加を誘起し得るものと特徴付けられ得
る。斯かるＡＴＤＣ５／アルシアンブルーアッセイに関連する特定条件は、以下
で詳述される。尚、軟骨生成増進タンパク質の混合物は上述の特性を有するが、
上記混合物内の他のタンパク質から分離されたときに個々の軟骨生成増進タンパ
ク質は必ずしも軟骨生成的ではないことを銘記されたい。たとえば以下に記述さ
れる如くオステオカルシンなどの骨マトリックスタンパク質は本発明に係る軟骨
生成増進タンパク質である、と言うのも、斯かるタンパク質が本明細書中で記述
された如きＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質の組合せなどの他の適切な
タンパク質と組合されたとき、上記タンパク質の混合物はＡＴＤＣ５アルシアン
ブルーアッセイにおける有意なＡ595 の増加を誘起し得るからである。しかしオ
ステオカルシンは、斯かるＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質が存在しな
ければ、軟骨生成的では無い。
【００５１】 以下においては、本発明の軟骨生成誘起組成物の種々の実施形態が詳述される
。但し以下の説明は、概略的参照の為に提供されるものである。本発明に依れば
、本発明の軟骨誘発組成物における軟骨生成増進タンパク質は一般に、ＴＧＦβ
スーパーファミリー・タンパク質の少なくとも２種の異なるメンバーを含む。他
の実施形態において、上記軟骨生成増進タンパク質はＴＧＦβスーパーファミリ
ー・タンパク質の少なくとも３種の異なるメンバーを含み、且つ、代替実施例に
おいては、ＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質の少なくとも４種、５種、
６種、７種、８種、９種、最も好適には１０種の異なるメンバーを含む。本明細
書中で使用された如き“ＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質（ＴＧＦβ
ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）”は、ＴＧＦβ１〜５に構造的に関
連する細胞外シグナル送達タンパク質の業界認知スーパーファミリーの任意のタ
ンパク質とされ得る。好適には、本発明で使用するに適切なＴＧＦβスーパーフ
ァミリー・タンパク質は、以下のタンパク質を含むが、これらに限定されるわけ
ではない：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４、ＴＧＦβ５、骨
形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、Ｂ
ＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、軟骨由来形態形成タンパク質
（ＣＤＭＰ）−１、ＣＤＭＰ−２及び／又はＣＤＭＰ−３。更に好適には、本発
明の組成物に有用な軟骨生成増進タンパク質は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧ
Ｆβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭ
Ｐ−７、及び／又は、ＣＤＭＰ（ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２及び／又はＣＤＭ
Ｐ−３）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５２】 本発明の幾つかの態様において本発明の軟骨誘発組成物は、少なくとも一種類
の骨マトリックスタンパク質及び／又は少なくとも一種類の成長因子タンパク質
を含み得る。好適な態様において、上記タンパク質の混合物は少なくとも一種類
の骨マトリックスタンパク質及び少なくとも一種類の成長因子タンパク質を含む
。更に好適な実施例において上記軟骨生成増進タンパク質は、優先性が増加する
順で、少なくとも２種、３種、４種且つ最も好適には５種の異なる骨マトリック
スタンパク質、及び／又は、少なくとも２種の成長因子タンパク質を含む。
【００５３】 本明細書中で使用する“骨マトリックスタンパク質”は、骨マトリックスを形
成する微小膠原原線維及びマトリックスの成分もしくは該マトリックスに関連す
る成分であるとして当業界で公知のタンパク質群の内の任意のタンパク質である
。本明細書中で使用す場合、骨マトリックスタンパク質は本明細書中に記述され
た如きＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーでは無く、本明細書中に記述され
た如き成長因子タンパク質でも無い。骨マトリックスタンパク質は、オステオカ
ルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダー
ゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポンチン、マトリックスＧＬＡタンパク質（
ＭＧＰ）、ビグリカン、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）、プロテオグリカン−コン
ドロイチン硫酸塩III （ＰＧ−ＣＳIII ）、骨酸性糖タンパク質（ＢＡＧ−７５
）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）及び／又はフィブロネクチンを含み得るが、
これらに限定されるわけではない。好適には、本発明の生産物と共に使用される
に適切な骨マトリックスタンパク質は、オステオカルシン、オステオネクチン、
ＭＧＰ、ＴＳＰ、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ及びカテプシンＬ前駆体の内の一
種以上を含む。一実施形態において上記少なくとも一種類の骨マトリックスタン
パク質は少なくとも、オステオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ、リシルオ
キシダーゼ及びカテプシンＬ前駆体を含む。特に好適な骨マトリックスタンパク
質はＭＧＰであり、更に好適にはオステオネクチンであり、最も好適にはＴＳＰ
である。
【００５４】 本明細書中で使用する“成長因子タンパク質”は、細胞を刺激して成長もしく
は増殖させる細胞外ポリペプチドシグナル分子として特徴付けられるタンパク質
の群の任意のタンパク質である。斯かる成長因子はまた、細胞成長もしくは増殖
の誘起の他にも作用を有し得る。本明細書中で使用される場合、成長因子は、本
明細書中で定義された如きＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーでは無く、本
明細書中で定義された骨マトリックスタンパク質でも無い。好適には、本発明の
生産物と共に使用するに適切な成長因子タンパク質は次の１種以上を含む：線維
芽細胞成長因子−I （ＦＧＦ−I ）、ＦＧＦ−II、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子
（ＬＩＦ）、インスリン、インスリン成長因子I （ＩＧＦ−I ）、ＩＧＦ−II、
血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ
、間質由来因子−２（ＳＤＦ−２）、脳下垂体甲状線ホルモン（ＰＴＨ）、成長
ホルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォ
ーミング成長因子−α（ＴＧＦα）及びヘッジホッグタンパク質。本発明の生産
物と共に使用される最も好適な成長因子タンパク質は、ＦＧＦ−I である。
【００５５】 本発明の１態様において、上記軟骨生成誘起組成物におけるタンパク質の混合
物は一種類以上の血清タンパク質も含み得る。本明細書中で使用される場合、血
清タンパク質は血清の成分であるタンパク質群の内の任意のタンパク質である。
本明細書中で記述される場合、血清タンパク質はＴＧＦβスーパーファミリーの
メンバー、骨マトリックスタンパク質、又は、成長因子では無い。一実施形態に
おいて軟骨生成誘起組成物は、優先性が増加する順で、少なくとも１種類、２種
類、３種類、最も好適には４種類の異なる血清タンパク質を含む。本発明の生産
物と共に使用されるに適切な血清タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン
、α２−Ｈｓ グリコＰ、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、β２−ミクログロ
ブリン、Ａｐｏ Ａ１リポタンパク質（ＬＰ）及び因子ＸIII ｂの内の一種類以
上を含み得る。好適には、本発明の生産物と共に使用されるに適切な血清タンパ
ク質は、アルブミン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子ＸIII ｂ
の内の一種類以上を含み得る。
【００５６】 本発明の１態様において、上記タンパク質の混合物内の各タンパク質の相対割
合は、１００ｎｇ／ｍｌ以下の濃度にて上記混合物が、以下に記述される如くＡ
ＴＤＣ５細胞により実施されたアルシアンブルーアッセイにおいて統計的に有意
なＡ595 の増加を誘起するに十分な任意の割合である。一実施形態において上記
混合物内のＴＧＦβスーパーファミリー要素の百分率は、混合物全体の約０．１
％乃至約９９．９９％、好適には混合物全体の約０．５％乃至約９９．９９％、
更に好適には混合物全体の約０．１％乃至約５０％、更に好適には混合物全体の
約０．５％乃至約５０％、更に好適には約０．５％乃至約２５％、更に好適には
混合物全体の約１％乃至約１０％の範囲である。上記混合物内における成長因子
の百分率は、混合物全体の約０．０１％乃至約５０％、好適には約０．００５％
乃至約２５％、更に好適には混合物全体の約０．１％乃至約１０％の範囲である
。血清及び骨マトリックスタンパク質成分の百分率は、別個にもしくは組合せて
、約２０％乃至約９８％、好適には約４０％乃至約９８％、更に好適には約８０
％乃至約９８％の範囲である。本発明の一実施形態において上記軟骨生成誘起タ
ンパク質の混合物は少なくともＢＭＰ−３、ＢＭＰ−２及びＴＧＦβ１を含み、
上記混合物におけるＢＭＰ−３の量はＢＭＰ−２の量の約２〜６倍多く、且つ、
上記混合物におけるＴＧＦβ１の量よりも約１０〜３０倍多い。特に指定がなけ
れば、タンパク質の混合物に対する又は特定タンパク質に対するタンパク質の百
分率もしくはタンパク質の比率は重量／重量（ｗ／ｗ）に基づいている。
【００５７】 本発明の軟骨生成誘起組成物内に存在し得るタンパク質の混合物の幾つかの態
様を概略的に論じて来たが、斯かる組成物の特に好適な実施形態を以下に記述す
る。
【００５８】 本発明の第１実施形態において、軟骨誘発組成物は、トランスフォーミング成
長因子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３
及びＢＭＰ−７、を含むタンパク質の混合物を含む。上記混合物におけるＴＧＦ
β１の量は上記混合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約９９．９９
％である。上記混合物におけるＢＭＰ−２の量は一般には上記混合物における合
計タンパク質の約０．０１％乃至約１０％、もしくは約０．０１％乃至約１％、
もしくは約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１乃至約１％、もしくは、合
計タンパク質の約０．１％乃至約１０％である。上記混合物におけるＢＭＰ−３
の量は一般には上記混合物における合計タンパク質の約０．１％乃至約１５％で
あり、もしくは、約０．１乃至約１％、又は約０．０１％乃至約１５％、もしく
は約０．０１％乃至約１％、もしくは約０．０１％乃至約０．１％である。上記
混合物におけるＢＭＰ−７の量は一般には上記混合物における合計タンパク質の
約０．０１％乃至約１０％であり、もしくは約０．０１％乃至約１％、もしくは
約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１乃至約１％、もしくは合計タンパク
質の約０．１％乃至約１０％である。上述の各タンパク質に対するアミノ酸及び
核酸の配列は、当業界で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを介し
て一般的に閲覧可能である。更に、これらのタンパク質は所望であれば、無機質
除去済骨組織などの適切な供給源から精製され得る。たとえばＳｅｙｅｄｉｎ（
Ｏｇａｗａ等、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１９８巻：第３１７〜３２７頁
（１９９１年）；Ｓｅｙｅｄｉｎ等、ＰＮＡＳ、第８２巻：第２２６７〜７１頁
（１９８５年）により開示された方法を使用して牛骨から高純度のＴＧＦβ−１
が分離され得る。
【００５９】 本発明の該実施形態の１態様において、上記タンパク質の混合物はＴＧＦβス
ーパーファミリー・タンパク質：ＴＧＦβ１、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）
−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７を含み、上記ＴＧＦβスーパーファミリー・タ
ンパク質は上記タンパク質の混合物の約０．５％乃至約９９．９９％から成る。
代替的に、上記ＴＧＦβスーパーファミリー・タンパク質は上記タンパク質の混
合物の約０．５％乃至約２５％、又は、上記タンパク質の混合物の約１％乃至約
１０％の百分率で存在し得る。
【００６０】 上記で論じた如く、生体内で有意な軟骨生成を誘起し得る本発明に係るタンパ
ク質の混合物は、タンパク質の混合物におけるタンパク質の合計量に対して比較
的に低い百分率（たとえば約０．０１％乃至約１％）のＴＧＦβタンパク質、特
にＴＧＦβ１を有し得る。但し本発明者等は、本発明のタンパク質の混合物の混
合物全体に対して意外に高濃度のＴＧＦβタンパク質、特にＴＧＦβ１を使用す
ると、骨形成が相当に減少され乍ら生体内で軟骨生成の誘起が増進されることを
発見した。この発見は、血管もしくは骨形成環境における生体内での軟骨生成誘
起に対して特に重要であり、且つ、斯かる生体内環境において本発明の組成物の
臨床的性能を相当に改善するであろう。故に本発明の該実施形態におけるタンパ
ク質の混合物は、上記混合物におけるタンパク質の合計量の約０．０１％乃至約
９９．９９％であるＴＧＦβ１の量を含み、タンパク質の合計量に対してＴＧＦ
β１を増加すると軟骨生成が増進される。他の実施例において、ＴＧＦβ１の量
は混合物における合計タンパク質の約０．０１％乃至約７５％、上記混合物にお
ける合計タンパク質の約０．０１％乃至約５０％、上記混合物における合計タン
パク質の約０．０１％乃至約２５％、上記混合物における合計タンパク質の約０
．０１％乃至約１０％、又は、上記混合物における合計タンパク質の約０．１％
乃至約１％である。好適実施例において、ＴＧＦβ１の量は上記混合物の合計タ
ンパク質の少なくとも約３３％（最大で約９９．９９％）である。別の好適実施
例において、ＴＧＦβ１の量は上記混合物の合計タンパク質の少なくとも約５０
％（最大で約９９．９９％）である。
【００６１】 代替的に、上記タンパク質の混合物に添加されるべきＴＧＦβ１の量は比率と
して決定され得る。一実施形態において、タンパク質の混合物における他のすべ
てのタンパク質に対するＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１：１０である。好適
には、タンパク質の混合物における他のすべてのタンパク質に対するＴＧＦβ１
の比率は少なくとも約１：３であり、更に好適には少なくとも約１：１であり、
更に好適には少なくとも約１０：１である。生体内において上記混合物における
タンパク質の合計量に対してＴＧＦβ１を１：１０、１：３及び１：１の比率で
使用する例は、実施例１５において例証される。実施例１５は、合計タンパク質
に対する意外な高濃度のＴＧＦβタンパク質は、軟骨生成を相当に増進し且つ骨
形成を相当に減少することを例証している。タンパク質の所定混合物に添加され
るべきＴＧＦβ１の最適量、軟骨修復用マトリックス、並びに、生体内環境（す
なわち血管もしくは無血管）は、例えば、実施例の部分（例えば実施例１４を参
照）で詳細に記述された単純なラットの皮下アッセイを用いて決定され得る。
【００６２】 別の実施形態において、タンパク質の混合物に含めるべきＴＧＦβ１などのＴ
ＧＦβタンパク質の量はその混合物内のＢＭＰタンパク質の１つ又は合計の量を
上回るＴＧＦβタンパク質の量として決めることができる。好ましい実施の形態
において、ＴＧＦβタンパク質の量はＢＭＰ（１つのＢＭＰ又はその混合物にお
けるＢＭＰの組み合わせ）の量より１０倍よりも多くなければならないが、その
混合物のＢＭＰの量の１００倍よりも小さくなければならない。
【００６３】 上記混合物におけるＢＭＰ−２の量は通常その混合物内の合計タンパク質の約
０．０１％乃至約１０％、又は約０．０１％乃至約１％、又は約０．０１％乃至
約０．１％、又は約０．１％乃至約１％、又は０．１％乃至約１０％の範囲であ
り、１実施形態において、その混合物内の合計タンパク質の約０．１％乃至約５
％の範囲の量で存在している。上記混合物内のＢＭＰ−３の量は通常その混合物
内の合計タンパク質の約０．０１％乃至約１５％、又は約０．０１％乃至約１％
、又は約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１％乃至約１％、又は約０．１
％乃至約１５％の範囲であり、そして１実施形態ではその混合物内の合計タンパ
ク質の約０．１％乃至約１０％の量で存在しており、別の実施の形態では、その
混合物内の合計タンパク質の約０．１％乃至約５％の量で存在している。その混
合物内のＢＭＰ−７の量は通常その混合物内の合計タンパク質の約０．０１％乃
至約１０％、又は約０．０１％乃至約１％、又は約０．０１％乃至約０．１％、
又は約０．１％乃至約１％、又は約０．１％乃至約１０％で、１つの実施の形態
においてはその混合物の合計タンパク質の約０．１％乃至約５％の量で存在して
いる場合もある。
【００６４】 本発明のこの実施形態の１つの態様で、上記タンパク質混合物はさらに以下の
ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質：ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−４
、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９の１つ以上と、ＣＤＭＰ−
１、ＣＤＭＰ−２、又はＣＤＭＰ−３の１つ以上を含んでいる場合もある軟骨由
来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）を含んでいる。こうした混合物におけるＴＧ
Ｆβ２の量は通常タンパク質の混合物全量の約０．５％乃至約１２％であるが、
望ましい場合はそのタンパク質混合物の軟骨形成活性を増大させるために、最大
そのタンパク質の混合物全量の９９．９９％程度まで追加的なＴＧＦβ２を加え
ることができる。こうした混合物におけるＴＧＦβ３の量は通常タンパク質混合
物全量の約０．０１％乃至約１５％であるが、望ましい場合、そのタンパク質混
合物の軟骨形成活性を増大させるために、追加的ＴＧＦβ３をタンパク質の混合
物全量の最大約９９．９９％まで加えることができる。そうしたタンパク質混合
物におけるＢＭＰ−４の量は通常そのタンパク質混合物全量の約０．０１％乃至
約１％の範囲であるが、望ましい場合、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を
増大させるために、追加的ＢＭＰ−４をタンパク質の混合物全量の最大約１０％
まで加えることができる。上記タンパク質混合物内のＢＭＰ−５の量は通常その
タンパク質混合物全量の約０．０１％乃至約１％の範囲であるが、望ましい場合
、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を増大させるために、追加的ＢＭＰ−５
をタンパク質の混合物全量の最大約１０％まで加えることができる。上記タンパ
ク質混合物内のＢＭＰ−６の量は通常そのタンパク質混合物全量の約０．０１％
乃至約１％の範囲であるが、望ましい場合、そのタンパク質混合物の軟骨形成活
性を増大させるために、追加的ＢＭＰ−６をタンパク質の混合物全量の最大約１
０％まで加えることができる。上記タンパク質混合物内のＣＤＭＰの量は通常そ
のタンパク質混合物全量の約０．０１％乃至約１％の範囲であるが、望ましい場
合、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を増大させるために、追加的ＣＤＭＰ
をタンパク質の混合物全量の最大約１０％まで加えることができる。
【００６５】 この実施形態の１つの態様において、上記タンパク質混合物はさらに少なくと
も１つの骨マトリックスタンパク質を含むことができる。骨マトリックスタンパ
ク質は上に概略を述べてある。このタンパク質混合物で使用するための好ましい
骨マトリックスタンパク質はオステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタ
ンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポン
チン、マトリックスＧＬＡタンパク質（ＭＧＰ）、ビグリカン、デコリン、プロ
テオグリカン−コンドロイチン硫酸ＩＩＩ（ＰＧ−ＣＳ ＩＩＩ）、骨酸性糖タ
ンパク質（ＢＡＧ−７５）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、及びフィブロネク
チンなどである。より好ましくは、この混合物での使用に適した骨マトリックス
タンパク質はオステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳ
Ｐ）、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体などである。上記骨マトリック
スタンパク質は通常そのタンパク質内に合計タンパク質混合物の約２０％乃至約
９８％の量である。１つの実施の形態で、上記骨マトリックスタンパク質は合計
タンパク質混合物の約４０％乃至約９８％の量で存在している。
【００６６】 本実施の形態の別の態様で、上記タンパク質混合物はさらに少なくとも１つの
成長因子タンパク質を含むことができる。成長因子タンパク質は一般的には上に
述べてある。この混合物で使用するのに好ましい成長因子タンパク質は繊維芽細
胞成長因子−Ｉ（ＦＧＦ−Ｉ）、ＦＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子（
ＬＩＦ）、インスリン、インスリン成長因子、（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−ＩＩ、
血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ
、間質由来因子−２（ＳＤＦ−２）、脳下垂体甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長
ホルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォ
ーミング成長因子−α（ＴＧＦα）、及びヘッジホッグタンパク質である。本発
明によるこの混合物での使用に特に好ましい成長因子はＦＧＦ−Ｉである。通常
、成長因子タンパク質は上記タンパク質混合物内にタンパク質混合物全量の約０
．０１％乃至約５０％の量で存在している。他の実施の形態で、その混合物内で
の成長因子タンパク質の量はそのタンパク質混合物全量の約０．５％乃至約２５
％、又はそのタンパク質混合物全量の約０．１％−約１０％である。成長因子が
ＦＧＦ−Ｉの場合、そのタンパク質混合物内でのＦＧＦ−Ｉの量はタンパク質混
合物全量の約０．００１％乃至約１０％の範囲である。
【００６７】 この実施形態のさらに別の態様で、上記タンパク質混合物は１つ又は複数の血
清タンパク質を含むことができる。血清タンパク質は一般的には上に説明してあ
る。好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質はアルブミン、トランスフ
ェリン、α２−ＨｓグリコＰ、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、β２−ミクロ
グロブリン、Ａｐｏ Ａ１リポタンパク質（ＬＰ）及び／又は因子XIIIｂなどで
ある。より好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質は、アルブミン、ト
ランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び／又は因子XIIIｂなどである。
【００６８】 本発明のこの実施形態の別の態様で、本発明による軟骨修復生産物の形態形成
誘発組成物部分で使用するのに適したタンパク質の混合物は以下のタンパク質を
含んでいる：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、
ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−Ｉ、オ
ステオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ、リシルアオキシダーゼ、カテプシ
ンＬ前駆体、アルブミン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子XIII
ｂなど。さらに別の実施の形態で、形態形成強化タンパク質の適切な混合物は本
明細書中で骨タンパク質（ＢＰ）と表されるタンパク質の混合物を含んでおり、
これは本明細書内ではＰｏｓｔｅｒ及びＢｅｎｅｄｉｃｔ、ＷＯ第９５／１３７
６７号に述べられているような仔ウシ長骨から得た部分的に精製されたタンパク
質混合物として定義されており、この文献全体は参照によって本明細書に組み込
まれる。本発明のこの実施形態の別の態様で、軟骨誘発組成物は細胞侵入を誘発
する能力、細胞増殖を誘発する能力、血管壊死を誘発する能力、そしてII型コラ
ーゲン生産軟骨細胞への細胞分化を誘発する能力から成るグループから選択され
る識別特性を有している。本発明のこの実施形態のさらに別の形態で、上記タン
パク質混合物はラット皮下アッセイで仔ウシ腱コラーゲン６．５−７．３ｍｇあ
たり少なくとも１０μｇの濃度で用いられた場合、表８に示す骨等級分けスケー
ル（例１０）を用いて約１．０から約３．５の骨スコアを誘発し、そして、表９
に示す軟骨等級分けスケール（例１０）を用いて少なくとも約１．２の軟骨スコ
アを誘発する。この態様による骨及び軟骨スコアを決定するのに適したラット皮
下アッセイと表８及び９の等級分けスケールについては実施例の箇所で詳細に説
明する。
【００６９】 本発明の第２の実施形態において、軟骨誘発組成物は（ａ）骨誘発骨形成又は
軟骨形成製剤、及び（ｂ）外因性ＴＧＦβタンパク質を含むタンパク質混合物を
含んでいる。この外因性ＴＧＦβタンパク質はその外因性ＴＧＦβタンパク質が
存在しない場合の骨誘発骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤による軟骨誘発レベ
ル以上に軟骨誘発を増大させるのに十分な量で存在している。本発明によれば、
「骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤」とは骨の開始物質から（例えば、少なくとも
１つの、そして通常は複数の精製ステップによって）単離又は誘導された、そし
て、ｉｎ ｖｉｖｏで骨形成又は軟骨形成を行うタンパク質の複合混合物を意味
している。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤は少なくとも１つの骨形態形成タンパ
ク質（ＢＭＰ）を含んでおり、その混合物内での外因性ＴＧＦβのＢＭＰ（又は
複数のＢＭＰ）に対する比率は約１０：１よりも大きい。このＢＭＰタンパク質
はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７
、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＣＤＭＰ及びそれらの混合物などを含
むいずれかのＢＭＰタンパク質を含むことができる。好ましくは、上記骨誘導製
剤はＲｏｓｅｎ改変Ｓａｍｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉ齧歯類アッセイ（Ｓａｍｐａｔ
ｈ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０（２１）：６５９１
−５ （１９８３））の実施例の箇所に述べられているようなｉｎ ｖｉｖｏで
のラット皮下アッセイで骨及び／又は軟骨形成を誘発することができる。より好
ましくは、この骨誘導製剤は表８（例１０）に示されている骨等級分けスケール
を用いた実施例１０に述べてあるようなラット皮下アッセイで仔ウシ腱コラーゲ
ン６．５−７．３ｍｇあたり少なくとも１０μｇの濃度で用いた場合に少なくと
も約１．０の骨スコアを誘発することができ、そして／又は表９（実施例１０）
に述べる軟骨等級分けスケールを用いた場合、同じ条件で少なくとも約１．０の
軟骨スコアを誘発する。理論に拘束されることなく、本発明者らはＴＧＦβタン
パク質のレベルをかなり高くした場合の骨形成又は軟骨形成タンパク質混合物に
対する増強された軟骨形成効果に関するここで述べられているような発見を前提
として、過剰な（外因性）ＴＧＦβタンパク質が存在していない状態で強力な骨
形成活性を示すと同時に軟骨形成活性をほとんど、又は全く示さないタンパク質
のタンパク質混合物でも高い量のＴＧＦβタンパク質、そして特にＴＧＦβ１を
加えることで軟骨形成用混合物に転化される場合があるのではないかと考えた。
本発明のこの実施形態での使用に特に好ましい骨形成又は軟骨形成製剤は骨タン
パク質（ＢＰ）とその構成部分そしてそれらからの誘導物などを含んでいる。上
記実施例部分はＢＰ（例９）、その構成部分（例１２）及びその関連誘導物（例
１１）の実例について述べている。
【００７０】 骨の開始物質は仔ウシの骨及びヒトの骨などを含むいずれの供給源からの骨サ
ンプルであってもよい。この骨は骨形成活性だけ、又は一定のレベルの軟骨形成
活性も合わせて持っている組成物を製造するためのこの技術分野で公知の多数の
方法のいずれを用いてでも処理することができる（例えばＵｒｉｓｔの米国特許
第４，５６３，４８９号、Ｌａｕｒｅｎｃｉｎらの米国特許第５，６２９，００
９号、ＢｅｎｔｚらのＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０９６９７号、そしてＰｏｓｅｒ
及びＢｅｎｅｄｉｃｔ、ＰＣＴ公報第ＷＯ９５／１３７６７号参照）。本発明に
おいては、開始物質として骨を用いて遺伝子組換えタンパク質は製造することが
できないので、「骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤」とは１つ以上の遺伝子組換え
体タンパク質の混合物を指して使われることはない。
【００７１】 例えば、本発明による、そして例えば、引用することで本明細書に組み入れら
れる“Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ”と題される米国特許第５
，２９０，７６３号に述べられているような方法は、通常、無機質除去骨抽出物
溶液上での陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換手順、そして逆相ＨＰ
ＬＣ手順を含むステップを含んでいる。
【００７２】 本発明によれば、「外因性ＴＧＦβタンパク質」とはほぼ純粋な形態で、タン
パク質の骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤の一部ではないＴＧＦβタンパク質を指
している（例えば、外因性ＴＧＦβタンパク質は骨誘発骨形成又は軟骨形成タン
パク質製剤から単離されなかった）。外因性ＴＧＦβタンパク質はその代わりに
異なった供給源からの追加的タンパク質としてその製剤に付加される。なお、上
記骨誘発骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤はＴＧＦβタンパク質（つまり、「
外因性」タンパク質）を含むことはできるが、それは少なくともＴＧＦβ１及び
ＴＧＦβ２を通常含んでいるからである。しかしながら、外因性ＴＧＦβタンパ
ク質組成物の上記第２の成分は骨及びそれから誘導される混合物に通常広く見出
される組成物よりその組成物中のＴＧＦβタンパク質の全量を多く増大させる手
段として意図されている。具体的には、ＴＧＦβタンパク質は外因性ＴＧＦβタ
ンパク質が存在していない状態で骨誘発骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤によ
る軟骨誘発のレベル（つまり、同じ条件でｉｎ ｖｉｖｏ）以上にその組成物に
よる軟骨誘発を（ｉｎ ｖｉｖｏで）増大させるのに十分な量で用いられる。こ
の外因性ＴＧＦβタンパク質は遺伝子組換え体ＴＧＦβタンパク質でも、又は骨
など適切な供給源からのほとんど精製されたＴＧＦβタンパク質であっても差し
支えない。遺伝子組換え体ＴＧＦβタンパク質は一般的に利用することができ、
ＴＧＦβタンパク質は例えばこれまでに公開されている方法Ｓｅｙｅｄｉｎ（Ｏ
ｇａｗａ等、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１９８巻：第３１７〜３２７頁（
１９９１年）；Ｓｅｙｅｄｉｎ等、ＰＮＡＳ、第８２巻：第２２６７〜７１頁（
１９８５年）を用いて骨から高純度に精製することができる。この外因性タンパ
ク質はＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４、ＴＧＦβ５、又はそ
れらの混合物を含むいずれのＴＧＦβタンパク質であってもよい。好ましい実施
の形態において、ＴＧＦβタンパク質はＴＧＦβ１又はＴＧＦβ２で、ＴＧＦβ
１が最も好ましい。
【００７３】 好ましくは、上記混合物内でのＴＧＦβタンパク質の少なくとも１つのＢＭＰ
タンパク質に対する比率（ｗ／ｗ）は約１０：１よりも大きく、１つの態様では
約１００：１よりも大きく、そして別の態様では約１０００：１よりも大きく、
そしてさらに別の態様では、約１０，０００：１よりも大きい。１つの実施の形
態で、上記タンパク質混合物内でのＴＧＦβタンパク質対総ＢＭＰタンパク質の
比率は１０：１よりも大きく、別の態様では約１００：１よりも大きく、さらに
別の態様では約１０００：１よりも大きく、そしてさらに別の態様では約１０，
０００：１よりも大きい。なお、タンパク質混合物における種々の成分の割合は
付加された過剰なＴＧＦβの量に応じて調節され、非常に高い濃度のＴＧＦβタ
ンパク質が付加された場合を含むいくつかの実施の形態では、組成物の全量とし
てのＢＭＰの割合は、例えば、上記混合物におけるＢＭＰの通常の量よりかなり
低い場合もある。
【００７４】 本発明のこの実施形態の１つの形態で、骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤と
外因性ＴＧＦβタンパク質の両方を含むタンパク質の混合物はＴＧＦβスーパー
ファミリータンパク質：ＴＧＦβ１、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、Ｂ
ＭＰ−３、及びＢＭＰ−７を含んでおり、ここでＴＧＦβスーパーファミリータ
ンパク質はそのタンパク質混合物の約０．５％乃至約９９．９９％を含んでいる
。又はまた、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質はそのタンパク質混合物の
約０．５％乃至約２５％、又は約１％乃至約１０％の範囲で存在することもでき
る。本発明のこの実施形態においては、ＴＧＦβタンパク質は骨誘発骨形成ある
いは軟骨形成製剤及び／又はＴＧＦβの外因性供給源によって提供することがで
きる。他のすべてのタンパク質は通常骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤によって提
供されるが、望ましい場合、その組成物の軟骨形成特性をさらに増大させるため
に他の外因性タンパク質をその混合物に付加することができる。
【００７５】 本発明のこの実施形態におけるタンパク質混合物は従ってその混合物内のタン
パク質の全量の約０．０１％乃至約９９．９９％の量のＴＧＦβ１を含むことが
でき、タンパク質全量に対するＴＧＦβ１の量を増大すると軟骨形成の増強につ
ながる。他の実施の形態で、ＴＧＦβ１の量はその混合物内のタンパク質全量の
約０．０１％乃至約７５％、その混合物内のタンパク質全量の約０．０１％乃至
約５０％、その混合物内のタンパク質全量の約０．０１％乃至約２５％、その混
合物内のタンパク質全量の約０．０１％乃至約１０％、又はその混合物内のタン
パク質全量の約０．１％乃至約１％の範囲である。通常、骨誘発骨形成又は軟骨
形成製剤はその混合物に対して約０．０１％乃至約１％のＴＧＦβ１タンパク質
を構成し、外因性ＴＧＦβ１の方がその割合は高い。好ましい実施の形態におい
て、ＴＧＦβ１の量は少なくともその混合物内のタンパク質全量の約３３％（最
大約９９．９９％）である。別の好ましい実施の形態では、ＴＧＦβ１の量はそ
の混合物内のタンパク質全量の少なくとも約５０％（最大９９．９９％）である
。
【００７６】 また、その混合物に付加されるＴＧＦβ１の量は比率で決めることもできる。
１つの実施の形態で、上記タンパク質混合物における他のすべてのタンパク質に
対するＴＧＦβ１の比率は少なくとも約１：１０（少なくとも１つのＢＭＰに対
するＴＧＦβタンパク質の比率は約１０：１よりも大きい）である。好ましくは
、上記タンパク質混合物内における他のすべてのタンパク質に対するＴＧＦβ１
の比率は少なくとも約１：３であり、より好ましくは少なくとも約１：１、さら
に好ましくは少なくとも約１０：１である。
【００７７】 さらに別の実施の形態において、そのタンパク質混合物に含まれるべきＴＧＦ
β１などのＴＧＦβタンパク質の量はその混合物内の１つの、又は複数のＢＭＰ
タンパク質の全量の上回るＴＧＦβタンパク質の量として決めることができる。
１つの好ましい実施の形態において、ＴＧＦβタンパク質の量はＢＭＰ（１つの
ＢＭＰ又はその混合物におけるＢＭＰの組み合わせ）の量より１０倍より多くな
ければならないが、その混合物のＢＭＰの量の１００倍より小さくなければなら
ない。
【００７８】 上記混合物におけるＢＭＰ−２の量は通常その混合物内のタンパク質全量の約０
．０１％乃至約５％、又は約０．０１％乃至約１％、又は約０．０１％乃至約０
．１％、又は約０．１％乃至約１％であるが、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が
加えられた場合は（例えば、ＴＧＦβタンパク質のＢＭＰに対する比率が１０，
０００：１より大きい場合は）、ＢＭＰ−２の割合はタンパク質全量の０．０１
％より低くてもよい。上記混合物におけるＢＭＰ−３の量は通常その混合物内の
タンパク質全量の約０．０１％乃至約５％、又は約０．０１％乃至約１％、又は
約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１
％乃至約１％であるが、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合は、Ｂ
ＭＰ−３の割合はタンパク質全量の０．０１％より低くてもよい。上記混合物に
おけるＢＭＰ−７の量は通常その混合物内のタンパク質全量の約０．１％乃至約
５％、又は約０．０１％乃至約１％、又は約０．０１％乃至約０．１％、又は約
０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１％乃至約１％であるが、高い濃度のＴ
ＧＦβタンパク質が加えられた場合は、ＢＭＰ−７の割合はタンパク質全量の０
．０１％より低くてもよい。
【００７９】 本発明のこの実施形態の１つの態様で、上記タンパク質混合物はさらに以下の
スーパーファミリータンパク質：ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ
−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９の１つ以上とＣＤＭＰ−１、ＣＤＭ
Ｐ−２、又はＣＤＭＰ−３の１つ以上を含んでいる場合もある軟骨由来形態形成
タンパク質（ＣＤＭＰ）を含んでいる。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤内でのＴ
ＧＦβ２の量は通常その製剤全量の約０．５％乃至約１２−１５％であるが、望
ましい場合は、上記タンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらに多
くのＴＧＦβ２を外因性ＴＧＦβタンパク質として、タンパク質混合物全量の最
大約９９．９９％まで加えることができる。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤内で
のＴＧＦβ３の量は通常その製剤全量の約０．０１％乃至約１５％であるが、望
ましい場合は、上記タンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらに多
くのＴＧＦβ３を外因性ＴＧＦβタンパク質として、タンパク質混合物全量の最
大約９９．９９％まで加えることができる。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤内で
のＴＧＦβ４の量は通常その製剤全量の約０．０１％乃至約１％であるが、望ま
しい場合は、上記タンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらに多く
のＴＧＦβ４を外因性ＴＧＦβタンパク質として、タンパク質混合物全量の最大
約９９．９９％まで加えることができる。いくつかの実施の形態で、高濃度のＴ
ＧＦβタンパク質が加えられた場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が
１０，０００：１よりも大きい場合）、ＢＭＰ−４の割合はタンパク質全量の０
．０１％より少なくてもよい。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤内でのＢＭＰ−５
の量は通常製剤全量の約０．０１％乃至約１％であるが、上記タンパク質混合物
の軟骨形成活性を増強するためにはさらに多くのＢＭＰ−５を付加することがで
きる。
【００８０】 いくつかの実施の形態では、高濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合（
例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が１０，０００：１よりも大きいの場合
）、ＢＭＰ−５の割合はタンパク質全量の０．０１％よりも少なくてもよい。骨
誘発骨形成又は軟骨形成製剤内でのＢＭＰ−６の量は通常製剤全量の約０．０１
％乃至約１％であるが、上記タンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するために
はさらに多くのＢＭＰ−６を付加することができる。いくつかの実施の形態では
、高濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧ
Ｆβの比率が１０，０００：１よりも大きいの場合）、ＢＭＰ−６の割合はタン
パク質全量の０．０１％よりも少なくてもよい。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤
内でのＣＤＭＰの量は通常製剤全量の約０．０１％乃至約１％であるが、上記タ
ンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するためにはさらに多くのＣＤＭＰを付加
することができる。いくつかの実施の形態では、高濃度のＴＧＦβタンパク質が
加えられた場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が１０，０００：１よ
りも大きい場合）、ＣＤＭＰの割合はタンパク質全量の０．０１％よりも少なく
てもよい。
【００８１】 この実施形態の１つの態様で、上記タンパク質混合物はさらに、通常、骨誘発
骨形成又は軟骨形成製剤から提供される少なくとも１つの骨マトリックスタンパ
ク質を含むことができる。骨マトリックスタンパク質は上に概述してある。この
タンパク質混合物で使用するための好ましい骨マトリックスタンパク質はオステ
オカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシ
ダーゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポンチン、マトリックスＧＬＡタンパク
質（ＭＧＰ）、ビグリカン、デコリン、プロテオグリカン−コンドロイチン硫酸
ＩＩＩ（ＰＧ−ＣＳ ＩＩＩ）、 骨酸性糖タンパク質（ＢＡＧ−７５）、トロ
ンボスポンジン（ＴＳＰ）、及びフィブロネクチンなどである。より好ましくは
、この混合物での使用に適した骨マトリックスタンパク質はオステオカルシン、
オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ、カテ
プシンＬ前駆体などである。上記骨マトリックスタンパク質は通常そのタンパク
質内に合計タンパク質混合物の約２０％乃至約９８％の量で存在している。１つ
の実施の形態で、上記骨マトリックスタンパク質は合計タンパク質混合物の約４
０％乃至約９８％の量で存在している。
【００８２】 本実施の形態の別の態様で、上記タンパク質混合物はさらに少なくとも１つ
の成長因子タンパク質を含むことができる。成長因子タンパク質は一般的には上
に述べてある。この混合物で使用するのに好ましい成長因子タンパク質は繊維芽
細胞成長因子−Ｉ（ＦＧＦ−Ｉ）、ＦＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子
（ＬＩＦ）、インスリン、インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−ＩＩ
、血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−Ａ
Ｂ、間質由来因子−２（ＳＤＦ−２）、下垂体甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長
ホルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォ
ーミング成長因子−α（ＴＧＦα）、及びヘッジホッグタンパク質である。本発
明によるこの混合物での使用に特に好ましい成長因子はＦＧＦ−Ｉである。通常
、成長因子タンパク質は上記タンパク質混合物内にタンパク質混合物全量の約０
．０１％乃至約５０％の量で存在している。他の実施の形態で、その混合物内で
の成長因子タンパク質の量はそのタンパク質混合物全量の約０．５％乃至約２５
％、又はそのタンパク質混合物全量の約０．１％−約１０％である。成長因子が
ＦＧＦ−Ｉの場合、そのタンパク質混合物内でのＦＧＦ−Ｉの量はタンパク質混
合物全量の約０．００１％乃至約１０％の範囲である。
【００８３】 この実施形態のさらに別の態様で、上記タンパク質混合物は１つ又は複数の血
清タンパク質を含むことができる。血清タンパク質は一般的には上に説明してあ
る。好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質はアルブミン、トランスフ
ェリン、α２−ＨｓグリコＰ、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、β２−ミクロ
グロブリン、Ａｐｏ Ａ１リポタンパク質（ＬＰ）及び／又は因子XIIIｂなどで
ある。より好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質は、アルブミン、ト
ランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び／又は因子XIIIｂなどである。
【００８４】 本発明のこの実施形態の別の態様で、本発明による軟骨修復生産物の形態形成
誘発組成物部分で使用するのに適したタンパク質混合物は以下のタンパク質を含
んでいる：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、Ｂ
ＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−Ｉ、オス
テオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ、リシルアオキシダーゼ、カテプシン
Ｌ前駆体、アルブミン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子XIIIｂ
。さらに別の実施の形態で、形態形成強化タンパク質の適切な混合物は本明細書
中で骨タンパク質（ＢＰ）と表されるタンパク質の混合物を含んでおり、これは
本明細書内ではＰｏｓｔｅｒ及びＢｅｎｅｄｉｃｔ、ＷＯ９５／１３７６７に述
べられているような仔ウシ長骨から得た部分的に精製されたタンパク質混合物と
して定義されており、この資料は参照によってその全体が本明細書に組み込まれ
る。 この実施形態の別の態様で、軟骨誘発組成物は細胞侵入を誘発する能力、
細胞増殖を誘発する能力、血管壊死を誘発する能力、そしてII型コラーゲン生産
軟骨細胞への細胞分化を誘発する能力から成るグループから選択される識別特性
を有している。
【００８５】 好ましくは、この実施形態で、上記組成物はラット皮下アッセイで仔ウシ腱コ
ラーゲン６．５−７．３ｍｇあたり少なくとも約１０μｇの濃度で用いられた場
合、表８に示す骨等級分けスケールを用いて約２．０よりも小さい骨スコアを誘
発し、そして、表９に示す軟骨等級分けスケールを用いて少なくとも約２．０の
軟骨スコアを誘発する。より好ましくは、上記組成物はラット皮下アッセイで仔
ウシ腱コラーゲン６．５−７．３ｍｇあたり少なくとも約１０μｇの濃度で用い
られた場合、表８に示す骨等級分けスケールを用いて約２．０よりも小さい骨ス
コアを誘発し、そして、表９に示す軟骨等級分けスケールを用いて少なくとも約
２．５の軟骨スコアを誘発する。さらに好ましくは、上記組成物はラット皮下ア
ッセイで仔ウシ腱コラーゲン６．５−７．３ｍｇあたり少なくとも約１０μｇの
濃度で用いられた場合、表８に示す骨等級分けスケールを用いて約２．０よりも
小さい骨スコアを誘発し、そして、表９に示す軟骨等級分けスケールを用いて少
なくとも約３．０の軟骨スコアを誘発する。
【００８６】 本発明による生産物の第３実施形態において、軟骨誘発組成物は（ａ）ＴＧＦ
βタンパク質、及び（ｂ）少なくとも１つの骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）か
ら成るタンパク質混合物を含んでおり、ＴＧＦβタンパク質とＢＭＰタンパク質
との比率は約１０：１より大きい。この実施形態で、ＴＧＦβタンパク質は、Ｔ
ＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβ４、ＴＧＦβ５、又はそれらの混
合物を含むいずれのＴＧＦβタンパク質であってもよい。好ましい実施の形態に
おいて、ＴＧＦβタンパク質はＴＧＦβ１又はＴＧＦβ２であり、ＴＧＦβ１が
最も好ましい。ＢＭＰタンパク質はＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭ
Ｐ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＣＤＭＰ、及びそ
れらの混合物を含むいずれのＢＭＰタンパク質でもよい。
【００８７】 好ましくは、その混合物内でのＴＧＦβタンパク質の少なくとも１つのＢＭＰ
タンパク質に対する比率（ｗ／ｗ）は約１０：１よりも大きく、そして１つの態
様では約１００：１より大きく、別の態様では約１０００：１よりも大きく、そ
してさらに別の態様では約１０，０００：１よりも大きい。１つの実施の形態で
、そのタンパク質混合物内でのＴＧＦβタンパク質のＢＭＰタンパク質全量に対
する比率は１０：１よりも大きく、そして別の態様では約１００：１よりも大き
く、別の態様では約１０００：１よりも大きく、そしてさらに別の態様では約１
０，０００：１よりも大きい。なお、タンパク質混合物内での種々の成分の割合
は加えられた過剰のＴＧＦβの量に応じて調節され、そして非常に高い濃度のＴ
ＧＦβが加えられた場合を含むいくつかの実施の形態では、組成物の全量として
のＢＭＰの割合は、例えば、その混合物内での通常のＢＭＰの量をかなり下回っ
ていてもよい。
【００８８】 別の実施の形態で、上記タンパク質混合物内に含まれるべきＴＧＦβ１などの
ＴＧＦβタンパク質の量はその混合物内の１つのＢＭＰタンパク質、又はＢＭＰ
タンパク質の全量を上回るＴＧＦβタンパク質の量として決めることができる。
１つの好ましい実施の形態において、ＴＧＦβタンパク質の量はＢＭＰ（その混
合物内での１つのＢＭＰ又はＢＭＰの組み合わせ）の量の１０倍より大きく、そ
してその混合物内のＢＭＰの量の１００倍より小さくなければならない。
【００８９】 本発明のこの実施形態によれば、ＴＧＦβタンパク質及び少なくとも１つのＢ
ＭＰタンパク質は、上の実施の形態で述べた骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤の成
分など遺伝子組換え体タンパク質、又はほぼ純粋なタンパク質として提供するこ
とができる。
【００９０】 この実施形態で、上記タンパク質混合物は１つのＴＧＦβタンパク質と１つの
ＢＭＰタンパク質だけを含んでいてもよいが、本発明のこの実施形態の１つの態
様では、上記タンパク質混合物はＴＧＦβスーパーファミリータンパク質：ＴＧ
Ｆβ１、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３、及びＢＭＰ−７を
含んでおり、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質はそのタンパク質混合物の
約０．５％乃至約９９．９９％を構成している。また、ＴＧＦβスーパーファミ
リータンパク質は上記タンパク質混合物の約０．５％乃至約２５％、又は約１％
乃至約１０％の割合で存在していてもよい。
【００９１】 本発明のこの実施形態におけるタンパク質混合物はその混合物内での１つのＢ
ＭＰタンパク質に対するＴＧＦβの比率が１０：１以上であれば、その混合物内
のタンパク質の全量の約０．０１％乃至約９９．９９％の割合の量のＴＧＦβ１
を含むことができる。他の実施の形態で、ＴＧＦβ１の量はその混合物内のタン
パク質全量の約０．０１％乃至約７５％、その混合物内のタンパク質全量の約０
．０１％乃至約５０％、その混合物内のタンパク質全量の約０．０１％乃至約２
５％、その混合物内のタンパク質全量の約０．０１％乃至約１０％、又はその混
合物内のタンパク質全量の約０．１％乃至約１％の範囲である。１つの好ましい
実施の形態で、ＴＧＦβ１の量はその混合物内のタンパク質全量の少なくとも約
３３％（最大９９．９９％）である。別の好ましい実施の形態で、ＴＧＦβ１の
量はその混合物内のタンパク質全量の少なくとも約５０％（最大約９９．９９％
）である。
【００９２】 上記混合物内でのＢＭＰ−２の量は通常、その混合物内のタンパク質全量の約
０．１％乃至約５％、又は約０．１％乃至約１％、又は約０．０１％乃至約０．
１％、又は約０．１％乃至約１％の範囲であるが、高い濃度のＴＧＦβタンパク
質が加えられた場合は（例えば、ＴＧＦβタンパク質のＢＭＰに対する比率が１
０，０００：１よりも大きい場合は）、ＢＭＰ−２の割合はタンパク質全量の０
．０１％より低くてもよい。上記混合物内でのＢＭＰ−３の量は通常、その混合
物内のタンパク質全量の約０．１％乃至約５％、又は約０．１％乃至約１％、又
は約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１％乃至約１％の範囲であるが、高
い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合は、ＢＭＰ−３の割合はタンパク
質全量の０．０１％より低くてもよい。上記混合物内でのＢＭＰ−７の量は通常
、その混合物内のタンパク質全量の約０．１％乃至約５％、又は約０．０１％乃
至約１％、又は約０．０１％乃至約０．１％、又は約０．１％乃至約１％の範囲
であるが、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合は、ＢＭＰ−７の割
合はタンパク質全量の０．０１％より低くてもよい。
【００９３】 本発明のこの実施形態の１つの態様で、上記タンパク質混合物は以下のＴＧＦ
βスーパーファミリータンパク質：ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−４、ＢＭ
Ｐ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９の１つ以上と、ＣＤＭＰ−１、Ｃ
ＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３の１つ以上を含んでいる場合もある軟骨由来形態形成
タンパク質（ＣＤＭＰ）を含んでいる。そうした混合物内のＴＧＦβ２の量は通
常上記タンパク質混合物全量の約０．５％乃至約１２％の範囲であるが、望まし
い場合は、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するために最大上記タン
パク質混合物全量の９９．９９％までＴＧＦβ２を加えることができる。そうし
た混合物内のＴＧＦβ３の量は通常上記タンパク質混合物全量の約０．０１％乃
至約１５％の範囲であるが、望ましい場合は、そのタンパク質混合物の軟骨形成
活性を増強するために最大上記タンパク質混合物全量の９９．９９％までＴＧＦ
β３を加えることができる。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤におけるＢＭＰ−４
の量は通常上記製剤全量の０．０１％乃至約１％の範囲であるが、そのタンパク
質混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらにＢＭＰ−４を加えることができ
る。いくつかの実施の形態においては、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えら
れた場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が１０，０００：１よりも大
きい場合）、ＢＭＰ−４の割合はタンパク質全量の０．０１％より低くてもよい
。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤におけるＢＭＰ−５の量は通常上記製剤全量の
０．０１％乃至約１％の範囲であるが、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を
増強するためにさらにＢＭＰ−５を加えることができる。いくつかの実施の形態
においては、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた場合（例えば、ＢＭＰ
に対するＴＧＦβの比率が１０，０００：１よりも大きい場合）、ＢＭＰ−５の
割合はタンパク質全量の０．０１％より低くてもよい。骨誘発骨形成又は軟骨形
成製剤におけるＢＭＰ−６の量は通常上記製剤全量の０．０１％乃至約１％の範
囲であるが、そのタンパク質混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらにＢＭ
Ｐ−６を加えることができる。いくつかの実施の形態においては、高い濃度のＴ
ＧＦβタンパク質が加えられた場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が
１０，０００：１よりも大きい場合）、ＢＭＰ−６の割合はタンパク質全量の０
．０１％より低くてもよい。骨誘発骨形成又は軟骨形成製剤におけるＣＤＭＰの
量は通常上記製剤全量の０．０１％乃至約１％の範囲であるが、そのタンパク質
混合物の軟骨形成活性を増強するためにさらにＣＤＭＰを加えることができる。
いくつかの実施の形態においては、高い濃度のＴＧＦβタンパク質が加えられた
場合（例えば、ＢＭＰに対するＴＧＦβの比率が１０，０００：１よりも大きい
場合）、ＣＤＭＰの割合はタンパク質全量の０．０１％より低くてもよい。
【００９４】 この実施形態の１つの態様で、上記タンパク質混合物はさらに少なくとも１つ
の骨マトリックスタンパク質を含んでいてもよい。骨マトリックスタンパク質は
上に概略を述べてある。このタンパク質混合物で使用するための好ましい骨マト
リックスタンパク質はオステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク
質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、オステオポンチン、
マトリックスＧＬＡタンパク質（ＭＧＰ）、ビグリカン、デコリン、プロテオグ
リカン−コンドロイチン硫酸ＩＩＩ（ＰＧ−ＣＳ ＩＩＩ）、骨酸性糖タンパク
質（ＢＡＧ−７５）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、及びフィブロネクチンな
どである。より好ましくは、この混合物での使用に適した骨マトリックスタンパ
ク質はオステオカルシン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、
リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体などである。上記骨マトリックスタン
パク質は通常そのタンパク質内に合計タンパク質混合物の約２０％乃至約９８％
の量である。１つの実施の形態で、上記骨マトリックスタンパク質は合計タンパ
ク質混合物の約４０％乃至約９８％の量で存在している。
【００９５】 本実施の形態の別の態様で、上記タンパク質混合物はさらに少なくとも１つの
成長因子タンパク質を含むことができる。成長因子タンパク質は一般的には上に
述べてある。この混合物で使用するのに好ましい成長因子タンパク質は繊維芽細
胞成長因子−Ｉ（ＦＧＦ−Ｉ）、ＦＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子（
ＬＩＦ）、インスリン、インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−ＩＩ、
血小板由来成長因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ
、間質由来因子−２（ＳＤＦ−２）、下垂体甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホ
ルモン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォー
ミング成長因子−α（ＴＧＦα）、及びヘッジホッグタンパク質である。本発明
によるこの混合物での使用に特に好ましい成長因子はＦＧＦ−Ｉである。通常、
成長因子タンパク質は上記タンパク質混合物内にタンパク質混合物全量の約０．
０１％乃至約５０％の量で存在している。他の実施の形態で、その混合物内での
成長因子タンパク質の量はそのタンパク質混合物全量の約０．５％乃至約２５％
、又はそのタンパク質混合物全量の約０．１％−約１０％である。成長因子がＦ
ＧＦ−Ｉの場合、そのタンパク質混合物内でのＦＧＦ−Ｉの量はタンパク質混合
物全量の約０．００１％乃至約１０％の範囲である。
【００９６】 この実施形態のさらに別の態様で、上記タンパク質混合物は１つ又は複数の血
清タンパク質を含むことができる。血清タンパク質は一般的には上に説明してあ
る。好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質はアルブミン、トランスフ
ェリン、α２−ＨｓグリコＰ、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、β２−ミクロ
グロブリン、Ａｐｏ Ａ１リポタンパク質（ＬＰ）及び／又は因子XIIIｂなどで
ある。より好ましくは、この混合物で有益な血清タンパク質は、アルブミン、ト
ランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び／又は因子XIIIｂなどである。
【００９７】 本発明の１つの実施の形態で、本発明による軟骨修復生産物の軟骨形成誘発組
成物部分での使用に適した軟骨形成増強タンパク質の混合物は以下のタンパク質
：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４
、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−Ｉ、オステロカル
シン、オステオネクチン、ＭＧＰ、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ、及びカテプシ
ンＬ前駆体などで、少なくとも１つの、そして好ましくはすべてのＢＭＰタンパ
ク質（ＣＤＭＰを含む）に対するＴＧＦβ１の比率は１０：１より大きい。本発
明の別の実施の形態で、本発明による軟骨修復生産物の軟骨形成誘発組成物部分
での使用に適した軟骨形成増強タンパク質の混合物は以下のタンパク質：ＴＧＦ
β１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ
−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−Ｉ、オステロカルシン、オ
ステオネクチン、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ、及びカテプシンＬ前駆体、アル
ブミン、トランスフェリン、Ａｐｏ Ａ１ ＬＰ及び因子XIIIｂなどで、少なく
とも１つの、そして好ましくはすべてのＢＭＰタンパク質（ＣＤＭＰを含む）に
対するＴＧＦβ１の比率は１０：１以上である。さらに別の実施の形態で、軟骨
形成増強タンパク質の適切な混合物は本明細書では骨タンパク質（上記でＢＰと
記載）と呼ばれるタンパク質の混合物を含んでおり、その混合物における少なく
とも１つのＢＭＰタンパク質、好ましくはＢＰを含むすべてのＢＭＰタンパク質
に対するＴＧＦβ１の比率は１０：１以上である。ＴＧＦβ１及び（ＢＰとして
存在している）少なくとも１つのＢＭＰタンパク質を約１０：１から１０，００
０：１より大きい比率で含んでいるタンパク質混合物の一例を例１４に示す。
【００９８】 本発明による軟骨修復生産物の１つの実施の形態で、軟骨誘発組成物内の各軟
骨形成増強タンパク質は（１）マトリックスに結合したタンパク質として直接に
、又は（２）そのタンパク質をコードしそのタンパク質が適切な条件下で発現さ
れるように転写制御配列に操作可能に結合されている遺伝子組換え核酸分子など
、そのマトリックスと結合した遺伝子組換え核酸分子として、のいずれかでその
組成物によって提供される。従って、本発明による軟骨誘発組成物はタンパク質
、遺伝子組換え核酸分子、又は上に述べた軟骨形成増強タンパク質を提供する組
成物などタンパク質と遺伝子組換え核酸分子との組み合わせを含むことができる
。
【００９９】 本発明によれば、軟骨形成増強タンパク質はその天然の供給源から入手したり
、遺伝子組換え体ＤＮＡ技術を用いて製造したり、又は化学的に合成したりする
ことができる。ここで用いられる場合、軟骨形成増強タンパク質は全長タンパク
質（つまり、その全長で、天然由来型のタンパク質）、そうしたタンパク質のい
ずれかの同族体、又はそうしたタンパク質のいずれかのミメトープであってもよ
い。ここで述べられているＴＧＦβスーパーファミリータンパク質及びそれをコ
ードする核酸配列を含む軟骨形成増強タンパク質のためのアミノ酸配列はこの技
術分野で知られており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースなどか
ら公的に入手することができる。従ってそうした配列を本発明によるタンパク質
及び／又は遺伝子組換え核酸分子を製造するために入手、使用することができる
。
【０１００】 同族体とはその内部でアミノ酸が（ペプチドやフラグメントなどのタンパク質
の先端切断版など）欠失していたり、挿入、逆転、置換及び／又は（グリコシル
化、ホスホリル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミチン化、アミド化及び
／又はグリコシルホスファチジル・イノシトルの付加など）の誘導体化されたタ
ンパク質と定義されている。軟骨形成増強タンパク質の１つの同族体は天然由来
の軟骨形成増強タンパク質アミノ酸配列と十分に類似していてその同族体が上記
対応する天然由来のタンパク質と比較して同じ、又は増強された生物学的活性を
基本的に有しているアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【０１０１】 本明細書で使用する場合、本発明による軟骨形成増強タンパク質のミメトープ
（合成擬態とも呼ばれる）とは、往々にしてミメトープが軟骨形成増強タンパク
質を模倣する構造を有していることから、軟骨形成増強タンパク質の活性を模倣
することができるすべての組成物を意味している。ミメトープは劣化に対する感
作性を減らすように改変されたペプチド類、抗イディオタイプ及び／又は触媒性
抗体又はそのフラグメント、単離されたタンパク質の非タンパク質性免疫原性部
分（例えば、炭化水素構造）、そして核酸を含む合成又は天然の有機分子などで
ある。こうしたミメトープは自然発生軟骨形成増強タンパク質のコンピュータで
作成した構造を用いて設計することができる。ミメトープはまたオリゴヌクレオ
チド、ペプチド、又はその他の有機又は無機分子などの分子のランダム・サンプ
ルを発生させたり、又は対応する結合相手を用いた親和性クロマトグラフィによ
ってそうしたサンプルをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１０２】 本発明によれば、融合タンパク質とは１つ以上の融合セグメントに取り付けら
れた軟骨形成増強タンパク質含有領域を含むタンパク質である。本発明における
使用に適した融合セグメントはタンパク質の安定性を増強し、軟骨形成増強タン
パク質の生物学的活性を増強し、そして／又は軟骨形成増強タンパク質の精製を
（例えば親和性クロマトグラフィによって）支援することができるセグメントを
意味している。適切な融合セグメントは（例えば、安定性を増大させたり、タン
パク質に対する生物学的活性を増強したり、及び／又はタンパク質の精製をより
容易にしたりするなどの）望ましい機能を有するにいずれのサイズの領域であっ
てもよい。融合セグメントはそのタンパク質の軟骨形成増強タンパク質含有領域
のアミノ酸及び／又はカルボキシル末端に結合させることができ、軟骨形成増強
タンパク質の単刀直入な回収を可能にする切断の影響を受ける場合もある。融合
タンパク質は好ましくは軟骨形成増強タンパク質含有領域のカルボキシル及び／
又はアミノ酸末端のいずれかに取り付けられた融合セグメントを含むタンパク質
をコードする融合核酸分子で形質転換された遺伝子組換え体タンパク質を培養す
ることによって製造される。好ましい融合セグメントは金属結合領域（例えば、
ポリ−ヒスチジン・セグメント）、免疫グロブリン結合領域（例えば、タンパク
質ａ、タンパク質Ｇ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｅ受容体又は相補タンパク質抗体結合
領域）、糖結合領域（例えば、マルトース結合領域）、及び／又は「タグ」領域
（例えば、少なくともβ−ガラクトシダーゼの一部、ストレップタグペプチド、
モノクローナル抗体などのその領域に結合する化合物を用いて精製することがで
きる他の領域）である。
【０１０３】 １つの実施の形態で、本発明による軟骨形成増強タンパク質の混合物は、ＡＴ
ＤＣ５細胞と共に約１００ｎｇ／ｍｌ以下の濃度で７日間培養すると、ＡＴＤＣ
５細胞で行われたアルシアンブルーアッセイで統計的に有意なＡ595の増大をも
たらすことができる。１つの好ましい実施の形態で、軟骨形成増強タンパク質の
混合物は上記の条件下で約５０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは約２５ｎｇ／ｍ
ｌ、そしてさらにより好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ以下の濃度で培養された場合
に、ＡＴＤＣ５細胞を用いて行われるアルシアンブルーアッセイで統計的に有意
なＡ595の増大をもたらすことができる。ここで用いられている場合、統計的に
有意な増大とは変化による相した増大の確率がｐ＜０．０５、より好ましくはｐ
＜０．０１、そしてより好ましくはｐ＜０．００５であるような比較対象と比較
してのＡ595の増大と定義される。
【０１０４】 本発明によれば、ＡＴＤＣ５アルシアンブルーアッセイはこの技術分野で公知
であり、例えば、ｖｏｎ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、１９９４年、Ｔｅｒａｔｏｌ
ｏｇｙ、第５０巻、５４〜６２頁に述べられている。軟骨形成増強タンパク質が
任意の濃度（例えば１００ｎｇ／ｍｌ）でそうした細胞と共に培養された場合に
ＡＴＤＣ５細胞を用いて行われるアルシアンブルーアッセイでＡ595の有意の増
大を誘発することができるという必要条件を満たしているかどうかを決定するた
めに、以下の手順を用いることができる。
【０１０５】 マウスＡＴＤＣ細胞がＴ．Ａｔｓｕｍｉによって寄託されており（寄託番号第
ＲＣＢ０５６５番）、日本つくば研究都市高野台３−１−１、理研細胞バンクか
ら入手することができる。ＡＴＤＣ５細胞は１００ｘ２０ｍｍ標準組織培養プレ
ートで５％仔ウシ胎児血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイ
シン（５０Ｕ／ｍｌ）を含むダルベッコ改変イーグルズ培養液（ＤＭＥＭ）内で
保存される。評価の対象となるタンパク質混合物の活性を評価するためにパッセ
ージ３−８を用いることができる。アルシアンブルーアッセイを実施するために
は、先ず最初に、Ａｔｋｉｎｎｓｏｎら、１９９７年、前掲に述べられているよ
うなマイクロ質量培養技術に多少の変更を加えて実施する。簡単に言うと、トリ
プシン処理した細胞を上に述べたＡＴＤＣ５培養液に約１００，０００細胞／２
５μｌの濃度で再懸濁させる。細胞の２５μｌスポットを２４ウェル・ポリスチ
レン・マイクロタイター組織培養皿の中央に置く。１．５時間後、１ｍｌの上に
述べた培養液をその皿に加える。３７℃で５％ＣＯ2内で一昼夜培養した後、種
々の濃度の軟骨形成誘発タンパク質（例えば１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ
、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌなど）、５％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコ
ルビン酸、及び１０ｍＭ β−グリセロリン酸を加えて（０日目）、培養を継続
する。後者の培養液はその後３−４日毎に交換する（全部でＢＰを二回以上加え
る）。テストされるべきタンパク質混合物によって培養した後、７日目に、培養
液を取り出して、培養体を１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄する。培養体をその後１０
％中性緩衝ホルマリンで１５時間固定して、０．５Ｎ ＨＣｌで二度洗浄する。
培養体を室温で０．５％アルシアンブルー溶液（ｐＨ１．４）で１時間染色する
。その後その染色液を取り出して、培養体をＰＢＳで洗浄して未結合の染色液を
取り除く。この青色染色液をグアジニウム塩酸（４Ｍ、ｐＨ１．７）を用いて７
０℃の温度下、１８時間をかけて抽出し、その後、５９５ｎｍでの吸収を測定す
る。
【０１０６】 なお、当業者であれば上記の手順に多少の改変を加えて同様の結果を得ること
は可能であろう。そうした改変にはＡＴＤＣ５細胞と共にウェルの底に播腫する
こと（例えば、マイクロ質量培養ではなく、約２５，０００−５０，０００）、
培養液内での血清の使用、血清濃度の変更、及び／又は培養液からアスコルビン
酸及びβ−グリセロホスフェートの省略などが含まれる。アルシアンブルーアッ
セイ自体に対する多少の変更にはアルシアンブルー溶液のｐＨのｐＨ１からｐＨ
１．４の範囲での変更、アルシアンブルー溶液の濃度の約０．０５％乃至約０．
５％の範囲での変更などが含まれる。
【０１０７】 上に述べたように、軟骨誘発組成物内の１つ又は複数の軟骨形成増強タンパク
質は軟骨修復マトリックスと結合した遺伝子組換え核酸分子などの組成物によっ
て提供することができ、そうした遺伝子組換え核酸分子は軟骨形成増強タンパク
質をコードし、そのタンパク質が適切な条件の下で発現されるように転写制御配
列と操作可能に結合されている。本発明で有益な遺伝子組換え核酸分子は軟骨形
成増強タンパク質をコードする単離された天然遺伝子又はそうした遺伝子の同族
体で、後者について以下にさらに詳しく説明する。本発明で有益な核酸分子は１
つ以上の調節領域、全長又は部分的コード領域、又はそれらの組み合わせなどで
ある。
【０１０８】 本発明によれば、単離された核酸分子はその天然の環境から取り出された（つ
まり、人為的な操作を受けた）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡか
ＲＮＡの誘導体を含むことができる。その場合、「単離した」とはその核酸の精
製された程度を意味するものではない。軟骨形成増強タンパク質をコードする単
離された核酸分子はその天然の供給源から単離するか、又は遺伝子組換え体ＤＮ
Ａ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）、又
は化学合成によって生成することができる。単離された核酸分子は、例えば、天
然の対立遺伝子変種及びそうした改変が本発明による軟骨形成増強タンパク質を
コードしたり、又は天然の遺伝子単離物を用いて厳しい条件下で安定した交雑雑
種を形成するその核酸分子の能力に基本的に干渉しないような方法で、分子挿入
、欠失、置換、及び／又は逆転などによって改変された核酸分子同族体を含み得
る。単離された核酸分子は縮重を含んでいてもよい。本明細書で使用する場合、
ヌクレオチドの縮重とは、１つのアミノ酸が異なる複数のヌクレオチドコドンに
よってコードされる現象のことを指す。従って、本発明の軟骨形成増強タンパク
質をコードする核酸分子の核酸配列は、縮重によって変わり得る。
【０１０９】 核酸分子同族体はこの技術分野で当業者に知られている多数の方法（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲参照）を用いて製造することができる。例えば、核酸
分子は古典的な突然変異誘発及び遺伝子組換え体ＤＮＡ技術（例えば、部位突然
変異誘発、化学処理、制限酵素切断、核酸フラグメントの結合及び／又はＰＣＲ
増幅など）、又はオリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物をつく
るための混合体グループの結合、及びそれらの組み合わせなど種々の技術を用い
て改変することができる。核酸分子同族体は天然由来の遺伝子とのハイブリッド
形成、又は天然由来の核酸分子によってコードされるタンパク質の機能のスクリ
ーニングなどによって選択することができる。「核酸分子」という用語は主に物
理的な核酸分子を意味しており、「核酸配列」とは主に核酸分子上のヌクレオチ
ドの配列を意味しているが、これらの２つの用語は核酸分子、又は軟骨形成増強
タンパク質をコードすることができる核酸分子に対しては共用することができる
。
【０１１０】 本発明による天然由来の軟骨形成増強タンパク質をコードする核酸分子が分か
れば、当業者なら、例えば、（ａ）これらの核酸分子のコピーをつくったり、（
ｂ）そうした核酸分子の少なくとも一部（例えば、全長遺伝子、全長コード領域
、調節制御配列、先端切断コード領域など）の少なくとも一部を含む核酸分子を
得たりすることは可能であろう。そうした核酸分子は抗体を用いて適切な発現ラ
イブラリをスクリーニングしたり、適切なライブラリ又はＤＮＡをスクリーンす
るためにオリゴヌクレオチド・プローブを用いる従来のクローニング技術、そし
てオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた適切なライブラリ又はＤＮＡのＰＣ
Ｄ増幅などを含むいろいろな方法で得ることができる。遺伝子のクローン及び増
幅のための技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲に開示されている。
【０１１１】 本発明によれば、軟骨形成増強タンパク質をコードする核酸分子は１つ又は複
数の転写制御配列と操作可能に結合されて遺伝子組換え分子を形成する。「操作
可能に結合される」という用語は、その分子が宿主細胞内に入れられた場合に（
つまり、形質転換されたり、形質導入、又は形質移入された場合に）発現される
ような方法で核酸分子を転写制御配列に結合させることを意味する。
【０１１２】 転写制御配列は転写の開始、延長、そして停止を制御する配列のことである。
特に重要な転写制御配列はプロモータ、エンハンサ、オペレータ、そしてリプレ
ッサ配列などの転写の開始を制御するものである。適切な転写制御配列は本発明
の生産物及び方法において有益な遺伝子組換え体細胞の少なくとも１つにおいて
機能することができる転写制御配列である。種々のそうした転写制御配列が当業
者に知られている。好ましい転写制御配列は哺乳動物、微生物、昆虫細胞、そし
て好ましくは哺乳動物細胞内で機能するものである。
【０１１３】 軟骨形成増強タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子組換え核酸分子を用い
てそのタンパク質を生成することができる。１つの実施の形態で、そのタンパク
質はそのタンパク質を生成するのに効果的な条件下で遺伝子組換え核酸分子を発
現することにより生成される。コードされたタンパク質を生成するための好まし
い方法は１つ以上の遺伝子組換え分子を用いて宿主細胞を形質転換させて遺伝子
組換え体細胞を形成する方法である。形質転換に適した宿主細胞は形質転換可能
なすべての哺乳動物細胞などである。宿主細胞は細胞移入されていない細胞か、
又はすでに少なくとも１つの核酸分子によって形質転換された細胞のいずれでも
よい。本発明で有益な宿主細胞は軟骨形成増強タンパク質を生成することができ
るいずれの細胞でもよい。１つの好ましい実施の形態において、宿主細胞自体が
軟骨形成の増強に有益である。特に好ましい宿主細胞は繊維軟骨細胞、軟骨細胞
、そして間葉前駆体細胞である。
【０１１４】 本発明によれば、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで軟骨形成
増強タンパク質をコードする遺伝子組換え核酸分子によって形質転換することが
できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子組換え核酸分子の細胞への形質転換は核酸
分子がその細胞に挿入されるいずれの方法によってでも達成することができる。
形質転換技術は形質移入、電気泳動、微量注入、リポフェクション、プロトプラ
スト融合などである。その結果得られる遺伝子組換え体細胞はその後いずれかの
適切な方法によって本発明の軟骨修復マトリックスと結合させて、軟骨形成増強
タンパク質を提供することができる。
【０１１５】 遺伝子組換え核酸分子はｉｎ ｖｉｖｏで、（ａ）裸の（つまり、ウィルス被
膜や細胞膜に包まれていない）核酸分子（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０年、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７、１４６５−１４６８）に教示されているような裸のＤ
ＮＡ又はＲＮＡ分子などのような）を投与する方法、（ｂ）遺伝子組換え体ウィ
ルス又は遺伝子組換え体細胞として包まれており（つまり、ウィルスや細胞媒介
体によって核酸分子が送達されている）、それによってそのウィルスや細胞が軟
骨修復マトリックスと結合している核酸分子を投与する方法、又は（ｃ）リポソ
ームや本明細書中に述べられているナノスフィア送達システムを介して軟骨修復
マトリックスと結合された遺伝子組換え核酸分子を投与する方法など、種々の方
法によって送達し、軟骨修復マトリックスと結合させることができる。
【０１１６】 上に述べたように、軟骨形成増強タンパク質タンパク質をコードする遺伝子組
換え核酸分子は遺伝子組換え体ウィルス粒子として軟骨修復マトリックスと結合
させることがでいる。遺伝子組換え体ウィルスはウィルス被膜に包むことができ
、投与後に動物の体内で発現され得る遺伝子組換え分子などである。好ましくは
、上記遺伝子組換え分子はパッケージング欠損している。アルファウィルス、ポ
ックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、及びレトロウィルスに基
づくものなど多数のウィルス粒子を用いることができる。動物に投与された場合
に、遺伝子組換え体イゥルスは軟骨修復マトリックスを投与した部位に感染して
、軟骨形成増強タンパク質の生成を指令する。
【０１１７】 ｉｎ ｖｉｖｏで用いることができる遺伝子組換え体核酸のための送達賦形剤
としての使用に適したリポソームはいずれのリポソームでもよい。本発明の好ま
しいリポソームは例えば当業者に公知の遺伝子送達システムで一般的に用いられ
るリポソームである。リポソーム生成及び核酸とリポソームの複合化の方法はこ
の技術分野で公知である。
【０１１８】 以下に詳細に説明するように、軟骨誘発組成物は軟骨修復マトリックスと結合
しており、従って、軟骨修復マトリックスはその１つの能力として軟骨病変の部
位に送達されるべき組成物のための送達賦形剤をして機能する。軟骨形成増強タ
ンパク質及び／又はそうしたタンパク質をコードする遺伝子組換え核酸分子を含
む軟骨誘発組成物を軟骨修復マトリックスと結合させるのに適した方法は、軟骨
修復マトリックスと共に軟骨修復の部位に送達されるべきそれらのタンパク質及
び／又は遺伝子組換え核酸分子が送達されてその軟骨修復生産物がその部位で軟
骨を修復又は再生させるのに効果的であるようないずれの方法でもよい。そうし
た結合方法にはその組成物の軟骨修復マトリックス内での懸濁、その組成物のマ
トリックス表面への凍結乾燥、及びその組成物を含むマトリックス／送達製剤の
マトリックス内への懸濁などがある。さらに、この軟骨誘発組成物はその生産物
を軟骨病変部位に入れる前にそのマトリックスと結合させてもよいし（つまり、
その組成物とマトリックスとがｅｘ ｖｉｖｏで起きる）、又は、軟骨修復マト
リックスを最初に病変部分に移植してから、その後、軟骨誘発組成物を例えばそ
のマトリックス内又はその上に移入させることでそのマトリックスと結合させる
（つまり、組成物とマトリックスの結合がｉｎ ｖｉｖｏで起きる）こともでき
る。軟骨誘発組成物はマトリックスとの結合を増強し、その組成物の適切な細胞
及び病変部位の組織への送達を促進し、そして病変部位でその組成物内の因子の
放出の制御に寄与する追加的な送達用製剤あるいキャリアを含んでいてもよい。
適切な送達用製剤は、本発明で使用する場合、措置される動物内の軟骨誘発組成
物の半減期を延長させる組成物を含むキャリアのことである。適切なキャリアは
ポリマー徐放性賦形剤、生分解性インプラント、リポソーム、微生物、ウィルス
、オイル、細胞、エステル類、及びグリコール類などである。
【０１１９】 本発明の１つの実施の形態は本発明による組成物を動物の体内にゆっくり放出
できる徐放性製剤である。本発明で用いられる場合、徐放性製剤は徐放性媒体内
に本発明による軟骨誘発組成物を含んでいる。適切な徐放性媒体は、生体適合性
ポリマー、その他のポリマー性マトリックス、ミクロカプセル、微小粒子、丸薬
製剤、浸透圧ポンプ、分散装置、リポソーム、リポスフィア、そして経皮膚送達
システムなどである。本発明によるその他の徐放性製剤としてはマトリックスと
結合したり、動物に投与された場合にｉｎ ｓｉｔｕで固体又はゲルを形成する
液体などである。そうした徐放性媒体は好ましくは上に述べた方法の１つで軟骨
修復マトリックスに結合される。好ましい徐放性製剤は生分解性（生体腐食性）
である。
【０１２０】 本発明による好ましい徐放性製剤は、処置される動物の軟骨病変部位でその組
成物によって提供される軟骨形成増強タンパク質の治療的に有効なレベルの量を
達成するのに十分な一定量で放出して、病変部位での軟骨形成の増強をもたらす
ことができる。本発明による特に好ましい徐放性媒体はナノスフィア送達賦形剤
である。
【０１２１】 本発明によるナノスフィア送達賦形剤は同時係属ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ９
８／０５１００号に述べられているナノスフィア送達賦形剤などであり、この文
献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。１つの好ましい実施の形態
で、こうした送達賦形剤は１０００ｎｍよりも小さいサイズを有し軟骨誘発組成
物の重量ベースで０．００１％乃至１７％の範囲で添加されているポリマー粒子
を含んでいる。これらのナノスフィアはｉｎ ｖｉｔｒｏで分析的に決められた
放出量特性を有しており、最初の一斉放出は最初の２４時間で組成物全量の約１
０％乃至約２０％であり、長期的な放出量はその後の少なくとも７日間に最低１
日当たり０．１％である。
【０１２２】 本発明による軟骨修復生産物で有益な軟骨誘発組成物は１種類又はそれ以上の
医薬として許容可能な賦形剤を含んでいる。ここで用いられる場合、医薬として
許容可能な賦形剤とは軟骨誘発組成物を軟骨修復マトリックスと結合させて、そ
の組成物の成分（例えば、タンパク質及び／又は遺伝子組換え核酸分子）を適切
なｉｎ ｖｉｖｏ部位（つまり、軟骨病変部位）の適切な細胞に送達するのに適
した物質を意味している。好ましい医薬として許容可能な賦形剤は、送達部位で
核酸分子に到達すると、その核酸分子が遺伝子組換え体細胞によって発現される
か、又は病変部位で宿主細胞に入り込んでその細胞によって発現されるかのいず
れかによって軟骨形成増強タンパク質を発現させることができるような形態で核
酸分子を保持することができる。適切な医薬として許容可能な賦形剤は送達部位
のタンパク質が到達すると、そのタンパク質は生物学的に活性を示し、その部位
で軟骨形成が増強されるような形態でタンパク質を保持することができる。医薬
として許容可能な賦形剤の例としては、水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デ
キストロース溶液、血清含有溶液、ハンク液、その他の水性生理学的均衡溶液、
オイル、エステル類、そしてグリコールなどである。水性キャリアは例えば化学
的安定性と等張性を増強して賦形剤の生理学的条件をほぼ等しくするのに必要な
適切な補助物質を含んでいる。特に好ましい賦形剤は非イオン性希釈剤で、好ま
しい非イオン性緩衝液は５％デキストロース緩衝液（ＤＷ５）である。適切な補
助物質は、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム、及びリン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、そして重炭酸緩
衝液をつくるのに用いられるその他の物質などを含んでいてもよい。補助物質は
さらにチメロサール、又はｏ−クレゾール製剤及びベンゾール・アルコールなど
の保存剤を含んでいてもよい。本発明による軟骨誘発組成物は通常の方法で殺菌
したり、凍結乾燥することができる。
【０１２３】 軟骨誘発組成物は本発明による軟骨修復生産物においては、軟骨病変部位で、
細胞侵入、細胞増殖、アングリオジェネシス、そしてII型コラーゲン生産軟骨細
胞への細胞分化の１つ、又は複数を誘発させるのに効果的な濃度で存在している
。好ましくは、軟骨誘発組成物は本発明による軟骨修復生産物内で、軟骨病変部
位で軟骨修復及び／又は再生を誘発させるのに効果的な濃度で存在している。軟
骨形成増強タンパク質が軟骨誘発タンパク質によって直接タンパク質として提供
される場合は、軟骨誘発組成物は通常重量で軟骨修復生産物の約０．５％乃至約
３３％の濃度で提供される。より好ましくは、軟骨誘発組成物は重量で軟骨修復
生産物の約１％乃至約２０％の濃度で存在している。その組成物によって１つ又
は複数の軟骨形成増強タンパク質が遺伝子組換え核酸分子として提供される場合
は、１つの軟骨形成増強タンパク質を発現する核酸分子の適切な濃度は送達され
た核酸の１μｇあたり送達部位での総組織タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１
ｐｇのタンパク質が発現されるような結果をもたらす量であり、より好ましくは
、送達された核酸の１μｇあたり送達部位での総組織タンパク質１ｍｇあたり少
なくとも約１０ｐｇのタンパク質が発現されるような結果をもたらす量、そして
さらに好ましくは送達された核酸の１μｇあたり送達部位での総組織タンパク質
１ｍｇあたり少なくとも５０ｐｇのタンパク質が発現されるような結果をもたら
す量であり、そして最も好ましくは送達された核酸の１μｇあたり送達部位での
総組織タンパク質１ｍｇあたり少なくとも１００ｐｇのタンパク質が発現される
ような結果をもたらす量である。当業者であればその組成物によって提供される
タンパク質の種類と数、さらに用いられる送達賦形剤によって組成物内のタンパ
ク質及び／又は核酸分子の濃度を調節できるであろう。
【０１２４】 本発明による軟骨修復生産物の別の実施の形態において、軟骨誘発組成物は製
剤中の軟骨形成増強タンパク質又は遺伝子組換え核酸分子のいずれかの１つ以上
に非共有結合で取り付ける因子も含むことができ、従ってその因子の放出速度を
調節することもできる。こうした因子はいずれかのマトリックス又はその他のポ
リマー物質である。ここで用いられる場合、マトリックス物質とは結合組織の生
きていないマトリックスとして定義され、天然のポリマー及びプロテオグリカン
がそれに相当する。天然のポリマーはコラーゲン、エラスチン、レチクリン、及
びそれらの類似物などである。プロテオグリカンはいずれかのグリコースアミノ
グリカン含有分子などであり、硫酸コンドロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ヘパ
ラン、硫酸ケラタン、及びヒアルロナンなどである。好ましいマトリックスとし
てはＩ型コラーゲン、II型コラーゲン、III 型コラーゲン、IV型コラーゲン、そ
してヒアルロン酸などである。好ましいその他のポリマー性物質はポリ（ラク酸
）及びポリ（グリコール酸）である。
【０１２５】 別の実施の形態で、上記軟骨誘発組成物は軟骨病変の部位で軟骨形成をさらに
増強するために提供される１つ、又は複数のタイプの細胞を含んでいてもよい。
こうした細胞は繊維軟骨細胞、軟骨細胞、間葉前駆体細胞、及び軟骨細胞前駆体
として機能することができる他のいずれの細胞であってもよい。こうした細胞は
上に述べた方法で上記組成物やマトリックスに結合させることができる。１つの
実施の形態で、少なくともいくつかの細胞は軟骨形成増強タンパク質をコードす
る遺伝子組換え体株によって形質転換されて遺伝子組換え体細胞を形成する。
【０１２６】 本発明の軟骨修復生産物は軟骨修復マトリックスを含むこともできる。この軟
骨修復マトリックスは軟骨誘発組成物を軟骨病変の部位に送達するための媒体と
その上に軟骨修復及び再生を起こすことができる適切な足場を提供する軟骨修復
装置の成分である。好ましい実施の形態において、この軟骨修復マトリックスは
生体吸収性である。
【０１２７】 本発明によれば、軟骨修復マトリックスはｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適してお
り、本発明による軟骨誘発組成物と共に使用するための軟骨修復マトリックスと
しての上に述べたような特性を提供するいずれかの素材で形成することができる
。このマトリックスは合成ポリマー及び／又はマトリックス物質などを含む素材
で形成することができる。好ましいマトリックス物質は天然ポリマー及びプロテ
オグリカンなどである。天然ポリマーはコラーゲン、エラスチン、レチクリン、
及びそれらの類似物などである。プロテオグリカンはいずれかのグリコースアミ
ノグリカン含有分子などである。特に好ましいプロテオグリカン類は硫酸コンド
ロイチン、硫酸デルマタン、硫酸ヘパラン、硫酸ケラタン、及びヒアルロナンな
どである。その他の好ましいマトリックスとしてはＩ型コラーゲン、II型コラー
ゲン、III 型コラーゲン、IV型コラーゲン、そしてヒアルロン酸などである。好
ましいポリマー性物質はポリ（ラク酸）及びポリ（グリコール酸）である。
【０１２８】 本発明の１つの実施の形態で、軟骨修復マトリックスはコラーゲンを含んでい
る。好ましくは、上記マトリックスは乾重量でマトリックスの約２０％乃至約１
００％の範囲のコラーゲンを含んでおり、より好ましくは乾重量でマトリックス
の約５０％乃至約１００％の範囲のコラーゲン、そしてさらに好ましくは乾重量
でマトリックスの約７５％乃至約１００％の範囲のコラーゲンを含んでいる。１
つの実施の形態で、適切な軟骨修復マトリックスは仔ウシの腱から採ったコラー
ゲンなどである。
【０１２９】 本発明での使用に適した軟骨修復マトリックスは、スポンジ、薄膜、フィルム
、又はゲルなどを含む軟骨病変の修復においての使用に適したいずれかの形態で
上記の物質を含むことができる。１つの実施の形態で、適切な軟骨修復マトリッ
クスは自家移植片組織、異系移植片組織及び／又は異種移植片組織を含んでいる
。
【０１３０】 本発明による軟骨修復生産物は血管性及び無血管性軟骨組織両方における断裂
及び部分的欠損の両方を含む種々の軟骨欠損を修復するために有益である。この
生産物は（関節などの）硝子体及び／又は繊維性軟骨（例えば半月板など）にお
ける欠損修復に特に有効である。本発明による軟骨修復生産物を用いることがで
きるいろいろなタイプの軟骨断裂及び半月板欠損の事例を図１−４に示す。要約
的に説明すると、図１は半月板の径方向断裂（図１（Ａ））、半月板の三重バケ
ツ柄状断裂（図１Ｃ）、そして半月板の無血管領域の長手方向断裂（図４（Ａ）
）をそれぞれ示している。半月板の部分的病変を図２（Ａ）及び２（Ｂ）に示す
。図３（Ａ）はさらに、本発明以前には血管領域での断裂だけが修復可能であっ
た血管、半血管、及び無血管領域を含む半月板の断面を示している。
【０１３１】 従って、軟骨欠損（つまり病変）は種々の形状、サイズ及び位置で起こり得る
から、本発明による軟骨修復生産物においての使用に適した軟骨修復マトリック
スは措置すべき患者の軟骨の具体的な欠損に十分に合致するような形状とサイズ
である。好ましくは、上記軟骨修復マトリックスは、軟骨欠損の修復で使用する
場合は、その患者に対して治療上の利益を提供するのに適した形状をその欠損部
位で実現することができる。こうした治療上の利点は患者の健康の改善と軟骨欠
損の是正に関連した快適な状況などを含んでおり、好ましくはその治療上の利点
はその軟骨の自然な構成が少なくとも部分的に再生されるような欠損の修復を含
んでいる。
【０１３２】 軟骨断裂の場合、軟骨修復マトリックスは通常シート状に構成される。このシ
ートは好ましくはその断裂部位に挿入するのに適した形状及びサイズを有してい
る。シート状マトリックスの１つの実施の形態を図３（Ｂ）に図式的に示してあ
る。無血管領域の長手方向断裂を修復するためのそうしたマトリックスの使用を
図４（Ｂ）に示す。好ましくは、このマトリックスはその断裂の緊急の物理的修
復、上記軟骨誘発組成物が天然の軟骨組織と相互作用するための表面、そして、
軟骨形成が行われる足場を提供する。さらに、このマトリックスは好ましくはそ
の生産物にその生産物が病変部位に固定できるようにするのに十分な物理的安定
性を提供する。本発明以前は、図１（Ａ）及び１（Ｃ）に示されるような半月板
血管領域の断裂は図１（Ｂ）及び１（Ｄ）にそれぞれ示すような縫合及び切除に
よって修復されていた。さらに、本発明以前は、無血管軟骨組織（又は図３（Ａ
）に示すような半血管組織）に断裂が起きた場合は、その断裂は「修復不可能」
とみなされていた。本発明による軟骨修復生産物は好適に無血管軟骨領域と血管
を含む軟骨領域の両方の断裂を可能にし、血管性軟骨で用いられた場合、この生
産物は図１（Ｂ）及び図１（Ｄ）に示されているような従来用いられていた生産
物や方法と比較して修復の速度と質を向上させる。
【０１３３】 上記軟骨修復マトリックスがシート状に構成される１つの実施の形態において
、上記マトリックスは好ましくは約０．１ｍｍから約３ｍｍの厚みを有しており
、より好ましくは約０．５ｍｍから約２ｍｍの厚みを有している。この厚みはも
ちろん修復されるべき断裂の形状に応じて変えることができる。この実施形態で
、マトリックスは、マトリックス素材の水性分散液を型に入れて、例えばその型
がそのシートに適切な厚みを付与するような方法でつくることができる。そうし
た方法を実施例４で述べる。好ましい実施の形態で、このマトリックスは重量で
約０．２％乃至約４％のコラーゲンの水性分散液からつくられ、より好ましくは
、このマトリックスは重量で約０．５％乃至約３％のコラーゲンの水性分散液か
らつくられる。
【０１３４】 軟骨の部分的欠損（つまり、断裂より大きく、それとは異なった形状の欠損）
の場合、軟骨修復マトリックスは通常はその欠損を修復するのに適した献上を実
現するように構成され、取り除かれた損傷した軟骨に代わるように構成されたマ
トリックスを含んでいる。本発明以前には、部分的欠損、実際に名半月板組織の
無血管領域で発生した何らかの欠損の修復は通常半月板の部分的又は全体的切除
（つまり、半月板切除）などの方法で損傷した組織を取り除くステップを含んで
いた。そして切除に続いて、義半月板が取り付けられることが多かったが、本発
明が行われるまでは、そうした方法は半月板の無血管領域の内因性タイプの軟骨
を再生させることは出来なかった。部分的半月板欠損（つまり、「非断裂」欠損
）にとって有益な軟骨修復マトリックスは好ましくはその緊急の物理的修復、上
記軟骨誘発組成物が天然の軟骨組織と相互作用するための表面、そして軟骨形成
が行われる足場を提供するのに適した形状とサイズを有している。さらに、上記
マトリックスは好ましくはその生産物が病変部位に固定されるようにするのに十
分な物理的安定性を付与する。本発明の軟骨修復生産物で部分的欠損を修復する
ための使用に適した軟骨修復マトリックスはＬｉらに対する米国特許第５，６８
１，３５３号に詳細に述べられており、この文献全体が参照により本明細書に組
み込まれる。その他の好ましい軟骨修復マトリックスは実施例の箇所で述べる。
１つの実施の形態で、半月板の軟骨における部分的欠損を修復するために用いら
れる軟骨修復マトリックスはコラーゲンを含み、半月板病変を修復するのに適し
た形状及び物理的特性を有する多孔性マトリックス物質合成物を含んでいる。
【０１３５】 １つの実施の形態で、部分的欠損の修復で使用するのに適した軟骨修復マトリ
ックスはテーパー加工した形状を有している。こうしたマトリックスは通常最も
薄い部分で約０．５ｍｍから約３ｍｍ、そして最も厚い部分で約４ｍｍから約１
０ｍｍの範囲の厚みを有している。こうしたマトリックスは通常１ｃｍ3あたり
約０．０７から約０．５グラムマトリックス、より好ましくは１ｃｍ3あたり約
０．１から約０．２５グラムマトリックスの密度を有しており、ここでｇ／ｃｍ 3 はマトリックス１立方センチメートルあたりのグラム数を示している。図２Ａ
と２Ｂは半月板の部分的欠損を修復するために構成された軟骨修復マトリックス
を示している。
【０１３６】 １つの好ましい実施の形態で、本発明による軟骨修復マトリックスは多孔性で
、この特性はそのマトリックスが軟骨誘発組成物のための送達賦形剤として、そ
して特に細胞のそのマトリックス内部への成長を可能にすることによる軟骨形成
の足場として機能する能力を増強してくれる。好ましくは、この孔サイズはその
マトリックスの望ましい物理的強度を維持しつつ、病変部位での軟骨の再生のた
めの細胞の十分な内側への成長を可能にするのに十分である。マトリックスの多
孔性はそのマトリックスの構成によって変わるが、通常はそのマトリックスは約
１０μｍから約５００μｍの範囲の孔サイズを有している。そのマトリックスが
断裂欠損を修復するように構成される場合は、孔サイズは通常約１０μｍから約
１００μｍの範囲である。そのマトリックスが部分的欠損を修復するために構成
される場合は、その孔サイズは通常約５０μｍから約５００μｍの範囲である。
【０１３７】 上記軟骨修復マトリックスがシート状に構成される場合は、架橋されない方が
好ましい。しかしながら、上記軟骨修復マトリックスが部分的損傷を修復するた
めに構成される場合、例えば人為的架橋法などによって架橋させることもできる
が、そうした架橋が必要な訳ではない。軟骨修復マトリックスはホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、ジメチル・スベルイミド、カルボジイミド、多機能性
エポキシ類、スクシンイミジル、ゲニピン、ポリ（グリシジル・エーテル）、ジ
イソシアネート、アシルアミド、紫外線照射、脱水熱処理、イリス（ヒドロキシ
メチル）ホスフィン、アスコルビン酸銅、グルコース・リシン、及び光酸化剤な
どを含むいずれかの適切な薬剤によって架橋することができる。１つの実施の形
態で、軟骨修復マトリックスはアルデヒドで架橋される。
【０１３８】 本発明の他の実施形態は、軟骨損傷修復のための生産物に関し、該生産物は、
（ａ）上記詳細に記載した軟骨修復マトリックスと、（ｂ）本明細書中で前述し
たような軟骨形成強化タンパク質の混合物とともに培養された細胞を含む、前記
マトリックスに関連する軟骨誘導組成物とを含む。軟骨誘導組成物は、本発明の
生産物において有用な上述のいずれの軟骨誘導組成物であってもよい。好ましく
は、タンパク質の混合物とともに培養する細胞は、軟骨形成に関与する細胞であ
り、線維軟骨細胞、軟骨細胞、間葉前駆体、及び軟骨細胞前駆体として機能しう
る他のあらゆる細胞を含むが、これらに限定されることはない。そのような細胞
は、好ましくは、軟骨修復マトリックスと会合させる前に、細胞がタンパク質と
相互作用して該細胞によって軟骨形成を開始させるのに有効な条件下でｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおいて培養する。有効培養条件には、タンパク質と細胞の間の相互作
用ならびに該細胞による軟骨形成プロセスの開始を可能にする、有効な培地、バ
イオリアクター、温度、ｐＨ及び酸素条件が含まれる。有効培地とは、その培地
中で細胞を培養をした場合に上記のような結果をもたらす培地のことをいう。そ
のような培地は、一般には、同化可能な炭素、窒素及びリン酸塩源、及び適当な
塩、ミネラル、金属、ならびにビタミンなどの他の栄養素を含む水性培地から成
る。細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタ
イタープレート及びシャーレ内で培養することができる。培養は、その細胞に適
した温度、ｐＨ及び酸素含量で実施することができる。そのような培養条件は、
当業者の経験の範囲である。本発明の本実施形態の他の態様において、ｉｎ ｖ
ｉｖｏにおける軟骨損傷への移植の前に、軟骨修復マトリックスを細胞及びタン
パク質の混合物とともにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。さらなる実施形態におい
て、タンパク質の混合物とともに培養された細胞は、上述のようなさらに別の軟
骨形成強化タンパク質及び／又はそのようなタンパク質をコードする組換え核酸
分子と結合した軟骨修復マトリックスに会合させることができる。
【０１３９】 本発明の他の実施形態は、血管及び無血管の半月板断裂を修復するための生産
物に関する。そのような生産物は、（ａ）コラーゲンを含みシートとして構成さ
れる軟骨修復マトリックスと、（ｂ）前記マトリックスに関連する軟骨誘導組成
物とを含む。軟骨誘導組成物は、本発明の生産物において有用な上述のいずれの
軟骨誘導組成物であってもよい。それぞれの軟骨形成強化タンパク質は、タンパ
ク質として、又は転写調節配列に機能上連結された当該タンパク質をコードする
組換え核酸分子として提供される。１つの実施形態において、軟骨修復マトリッ
クスはコラーゲンスポンジによって形成される。修復すべき損傷が無血管部位に
ある場合には、生産物は詳細に上述したように徐放性製剤をさらに含んでいても
よい。
【０１４０】 本発明のさらに他の実施形態は、軟骨損傷を修復するための方法に関する。本
方法は、軟骨損傷中に生産物を移植して固定する工程を含み、該生産物は、（ａ
）軟骨修復マトリックスと、（ｂ）前記マトリックスに関連する軟骨誘導組成物
とを含む。軟骨誘導組成物は、本発明の生産物とともに使用するのに適した軟骨
誘導組成物の上述のいずれの実施形態であってもよい。１つの実施形態において
、本発明の方法において有用な軟骨誘導組成物には、トランスフォーミング成長
因子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及
びＢＭＰ−７を含むタンパク質の混合物が含まれ、混合物中のＴＧＦβ１の量は
、混合物中の全タンパク質に対して約０．０１％〜約９９．９９％であり、混合
物中のＢＭＰ−２の量は、混合物中の全タンパク質に対して約０．０１％〜約１
０％であり、混合物中のＢＭＰ−３の量は、混合物中の全タンパク質に対して約
０．１％〜約１５％であり、混合物中のＢＭＰ−７の量は、混合物中の全タンパ
ク質に対して約０．０１％〜約１０％である。軟骨誘導組成物の本実施形態の様
々な代替及び追加の態様は、上記詳細に記載した通りである。特に、本実施形態
の１つの態様において、タンパク質混合物中の他の全タンパク質に対するＴＧＦ
β１の割合は、重量比（ｗ／ｗ）にして、少なくとも約１：１０であり、より好
ましくは少なくとも約１：３であり、さらに好ましくは少なくとも約１：１であ
り、さらに好ましくは少なくとも約１０：１である。
【０１４１】 他の実施形態において、本発明の方法における使用に適した軟骨誘導組成物に
は、（ａ）骨由来の骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤と、（ｂ）外因性ＴＧＦ
βタンパク質と、を含むタンパク質の混合物が含まれ、該混合物中、前記ＴＧＦ
βタンパク質は、前記組成物による軟骨誘導を、外因性ＴＧＦβタンパク質の非
存在下における、前記骨由来の骨形成又は軟骨形成タンパク質製剤による軟骨誘
導よりも高いレベルまで高めるのに十分な量存在する。軟骨誘導組成物の本実施
形態の様々な代替及び追加の態様は、上記詳細に記載した通りである。特に、本
実施形態の１つの態様において、ＴＧＦβタンパク質はＴＧＦβ１であり、タン
パク質混合物中の他の全タンパク質に対するＴＧＦβ１の割合は、重量比（ｗ／
ｗ）にして、少なくとも約１：１０であり、より好ましくは少なくとも約１：３
であり、さらに好ましくは少なくとも約１：１であり、さらに好ましくは少なく
とも約１０：１である。
【０１４２】 他の実施形態において、本発明の方法において使用するのに適した軟骨誘導組
成物には、（ａ）ＴＧＦβタンパク質と、（ｂ）少なくとも１つの骨形態発生タ
ンパク質（ＢＭＰ）と、を含むタンパク質の混合物が含まれ、該混合物において
、ＢＭＰタンパク質に対するＴＧＦβタンパク質の割合は、約１０：１より大き
い。軟骨誘導組成物の本実施形態の様々な代替及び追加の態様は、上記詳細に記
載した通りである。特に、本実施形態の１つの態様において、ＴＧＦβタンパク
質はＴＧＦβ１であり、ＢＭＰタンパク質に対するＴＧＦβ１の割合は、重量比
（ｗ／ｗ）にして、約１００：１よりも大きく、より好ましくは約１０００：１
よりも大きく、さらに好ましくは約１０，０００：１よりも大きい。
【０１４３】 本発明の方法は、関節及び半月板の軟骨損傷、ならびに無血管及び血管の欠損
も含む上述のいずれの軟骨損傷を修復するのに有用である。移植の工程は、当該
術分野において公知の外科的技術を用いて実施され、一般には、マトリックスが
シートとして構成されている場合には、修復生産物を断裂内に直接挿入すること
を含み、また、マトリックスが扇形欠損を修復するように構成されている場合に
は、損傷組織を除去して修復生産物を移植するというさらに複雑なプロセスを含
む。固定の工程は、本明細書中に記載のマトリックスをｉｎ ｖｉｖｏにおいて
軟骨又は軟骨を取り巻く組織に付加するのに適した任意の手段によって、生産物
を病変にある軟骨に付加することを含んでいてもよい。そのような付加のための
手段には、生物溶解性縫合糸の適用、非溶解性縫合糸の適用、圧着、矢の適用、
爪の適用、又はＴ−固定縫合固定装置の適用が含まれうるが、これらに限定され
ることはない。実施例５及び７〜９は、軟骨修復マトリックスがシートとして構
成されており、半月板及び関節の軟骨を修復するために用いられる場合の、本発
明の方法について記載している。実施例６は、修復マトリックスが扇形欠損を修
復するように構成されている場合の、半月板及び関節の軟骨を修復するために用
いられる本発明の方法について記載している。図２（Ａ）及び２（Ｂ）は、半月
板軟骨内の扇形欠損への軟骨修復生産物の移植及び固定を示している。図４（Ａ
）及び４（Ｂ）は、シートとして構成された軟骨修復生産物を用いた、無血管半
月板組織内の長軸断裂の修復を模式的に示している。
【０１４４】 本発明の方法の１つの実施形態において、扇形欠損である軟骨損傷は、本発明
の２つの軟骨修復生産物を用いて修復される。本実施形態において、扇形欠損、
好ましくは半月板扇形欠損は、損傷を受けた軟骨組織を刈り取って、修復器具の
移植に適した界面を形成することによって修復され。シートとして構成されたマ
トリックスを有する第１の軟骨修復生産物を欠損に沿って（たとえば、欠損が血
管軟骨内にあり、この軟骨が除去されている場合には、半月板の縁に沿って）移
植し固定する。扇形欠損と置換するように構成された第２の軟骨修復マトリック
ス、又は扇形欠損と置換するように構成されたマトリックスを有する軟骨修復生
産物を、シートとして構成された第１の生産物に移植し固定する。シートは、細
胞が迅速に浸潤して軟骨修復組成物と反応できるような界面を提供する。本実施
形態において、シートとして構成された軟骨修復生産物は、本明細書中に記載の
軟骨修復組成物を含み、扇形欠損を修復するように構成された軟骨修復生産物は
、外科医による必要性の判断に応じて、軟骨修復組成物と会合させてもよいし、
させなくてもよい。図８は、シートとして構成された軟骨修復生産物と、扇形欠
損を修復するように構成された軟骨修復生産物とを同時に使用した様子を模式的
に示している。
【０１４５】 本発明の方法の他の実施形態は、無血管半月板損傷の修復のための方法に関す
る。この方法は、半月板の無血管領域の軟骨損傷中に、本明細書中に記載の軟骨
修復生産物を移植し固定する工程を含み、該方法において、軟骨修復マトリック
スはシートとして構成され、軟骨修復生産物は、軟骨誘導組成物と結合させたマ
トリックスに関連する徐放性製剤をさらに含んでいる。
【０１４６】 本発明の方法の他の実施形態は、血管半月板損傷の修復向上のための方法であ
る。本方法は、半月板の血管領域にある軟骨損傷中に、本明細書中に記載の軟骨
修復生産物を移植し固定する工程を含み、該方法において、軟骨修復マトリック
スはコラーゲンを含み、シートとして構成されている。本願発明者らは、軟骨損
傷を修復するために本発明の軟骨修復生産物を使用することにより、血管損傷の
修復速度が、生産物の非存在下で修復された半月板損傷の修復速度に比べて測定
可能に高められることを発見した。本発明に従えば、修復速度の測定可能な増大
は、修復０日目（すなわち、生産物が患者に移植された日）から病変に適切な軟
骨組織の成長が起こっていると判断される日のまでの期間における、本発明の生
産物の非存在下で修復された軟骨損傷と比較した場合のあらゆる測定可能な増大
のことをいう。適切な軟骨組織の成長は、血管形成の向上、線維軟骨細胞の産生
、生産物中への細胞浸潤の誘導、細胞増殖の誘導、及び病変からの内在性軟骨組
織をよりよく表す三次元組織を形成するための細胞性及び立体的有機体の産生が
初期に現れることとして定義される。好ましい実施形態において、本発明の生産
物は、血管軟骨損傷の修復速度を本発明の生産物の非存在下で修復された血管損
傷と比較して、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに
好ましくは少なくとも約１００％、測定可能に高める。
【０１４７】 さらに、本発明の軟骨修復生産物を血管軟骨損傷の修復に使用した場合、該生
産物の非存在下で修復された損傷の修復特性と比較して、血管損傷の修復の特性
が測定可能に高められる。血管損傷の修復特性における測定可能な向上は、病変
における軟骨形成の特性のあらゆる向上として定義され、この向上は、血管形成
の向上、線維軟骨細胞の産生、生産物への細胞浸潤の誘導、細胞増殖の誘導、及
び病変からの内在性軟骨組織をよりよく表す三次元組織を形成するための細胞性
及び立体的有機体の産生によって示される、より正常な軟骨組織の発生として定
義される。
【０１４８】 さらに詳細には、本発明に従う軟骨組織の修復特性は以下のようにして評価す
ることができる。 半月板軟骨修復特性（すなわち、線維軟骨軟骨）は、修復部位の組織学的分析
により、以下のパラメータＩ〜ＩＩＩに基づいて０〜４のスコアで評価すること
ができる。Ｉ：欠損における組織学的軟骨染色。ＩＩ：コラーゲン移植片内への
細胞浸潤。ＩＩＩ：内在性半月板への統合。本発明に従うこれらのスコアは以下
のように定義される。
【０１４９】
【表１】
【表２】
【表３】 好ましくは、半月板損傷の修復特性における測定可能な向上は、それぞれ「４
」を最高スコアとする上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとして定義したパラメータの少な
くとも１つにおいて、本発明の生産物の非存在下で修復された損傷に比べて高い
スコアを示すものとして定義される。より好ましくは、半月板損傷の修復特性に
おける測定可能な向上は、上記Ｉ、ＩＩ及び／又はＩＩＩとして定義したパラメ
ータの少なくとも１つにおいて、本発明の生産物の非存在下で修復された損傷に
比べて、少なくとも１、より好ましくは少なくとも２、さらに好ましくは少なく
とも３、最も好ましくは少なくとも４高いスコアを示すものとして定義される。
【０１５０】 軟骨骨（関節軟骨欠損）修復の特性は、修復部位の組織学的分析により、以下
のパラメータＩ〜ＩＩＩに基づいて０〜４のスコアで評価することができる。Ｉ
：骨による欠損の充填。ＩＩ：修復軟骨の厚さ。ＩＩＩ：内在性軟骨への修復軟
骨の統合。本発明に従うこれらのスコアは以下のように定義される。
【０１５１】
【表４】
【表５】
【表６】 好ましくは、軟骨骨損傷の修復特性における測定可能な向上は、それぞれ「４
」を最高スコアとする上記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとして定義したパラメータの少な
くとも１つにおいて、本発明の生産物の非存在下で修復された損傷に比べて高い
スコアを示すものとして定義される。より好ましくは、軟骨骨損傷の修復特性に
おける測定可能な向上は、上記Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩとして定義したパラメータの
少なくとも１つにおいて、本発明の生産物の非存在下で修復された損傷に比べて
、少なくとも１、より好ましくは少なくとも２、さらに好ましくは少なくとも３
、最も好ましくは少なくとも４高いスコアを示すものとして定義される。
【０１５２】 囓歯目皮下アッセイにおいて骨誘導活性に対して用いられた上記スコアは、ズ
ルツァー・バイオロジクス社によって開発されたものであり、実施例１０、表８
に示されている。囓歯目皮下アッセイにおいて軟骨誘導活性に対して用いられた
上記スコアもまた、サルツァー・バイオロジクス社によって開発されたものであ
り、実施例１０、表９に示されている。上記のようなスコアは、本発明において
使用する組成物の最適化するために、また当該組成物の予想されるｉｎ ｖｉｖ
ｏ効率を評価するために用いることもできる。
【０１５３】 （ある）存在物（"ａ" ｏｒ "ａｎ" ｅｎｔｉｔｙ）とは、１つ又はそれ以
上の当該存在物のことをいい、たとえば、タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）と
は、１つ又はそれ以上のタンパク質、又は少なくとも１つのタンパク質のことを
いう。「ある（"ａ" （ｏｒ "ａｎ"））」、「１つ以上の」及び「少なくとも
１つの」という用語は本明細書中では互換的に用いることができるものとする。
また、「〜からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉ
ｎｇ）」」及び「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語もまた、互換的に用
いることができるものとする。
【０１５４】 以下の実施例は、説明の目的で与えられるものであり、本発明の範囲を制限す
ることを意図したものではない。
【実施例】実施例１ 以下の実施例は、脱塩したウシ骨（ＢＰ）から単離されたタンパク質の自然抽
出混合物が、間葉前駆体細胞系、１０Ｔ１／２及びＣ2Ｃ12において、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでのスフェロイド形成及び軟骨形成を誘導することを実証するものであ
る。
【０１５５】 マウスＣ３Ｈ／１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２６）胚間葉幹細胞及
びＣ2Ｃ12成体筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７７２、脚部筋肉由来）は、
米国基準菌株保存機構（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）より入手した。１０Ｔ１／２及びＣ2Ｃ12は、それぞれ１０％及
び１５％のＦＢＳの存在下で増殖させた。マイクロ質量培養は、以下のようにし
て実施した。簡単に説明すると、トリプシン処理した細胞をＦＢＳを含有する培
地中に１０7細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁し、１０μｌの細胞を２４ウ
ェルマイクロタイター組織培養プレートの中央に入れた。３７℃にて２〜３時間
おいた後、１％のＮｕｔｒｉｄｏｍａ及び様々な濃度のＢＰ（前掲のポーザート
（Ｐｏｓｅｒ）とベネディクト（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ）、ＷＯ９５／１３７６７に
記載されるようにして調製）を含む１ｍｌのＤＭＥＭ（１０Ｔ１／２に対して）
又は１：１ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（Ｃ2Ｃ12）を加えた。ＢＰは最初の４８時間の
間存在していたが、その後は添加しなかった。
【０１５６】 表１に示した結果は、ＢＰ濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上の場合、９０％を越える
１０Ｔ１／２マイクロ質量培養物においてスフェロイド形成が誘導されたことを
示している。９０％を越えるＣ2Ｃ12マイクロ質量培養物において、１００ｎｇ
／ｍｌ以上のＢＰ濃度においてスフェロイド形成が誘導された。
【０１５７】
【表７】 Ｃ2Ｃ12に対し、得られたスフェロイドをブアン（Ｂｏｕｉｎ）固定液中で２
４時間処理し、組織学試験及び免疫細胞化学試験を実施した。ミオシンＦ１．６
５２抗体は、アイオワハイブリドーマバンク（Ｉｏｗａ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
Ｂａｎｋ）より購入した。
【０１５８】 より詳細には、組織学試験に際し、スフェロイドを脱水し、４℃の無水アルコ
ール中で２０分間固定した。固定後の切片をメタクリル酸グリコール包埋技術を
用いて湿潤させ重合させた。重合後の栓子をＪＢ−４Ｓｏｒｖａｌｌミクロトー
ムを用いて５ｍｍの厚さに薄切した。切片をシランコートスライドに載せ、ｐＨ
１の０．２％アズールＩＩによって染色した。
【０１５９】 免疫細胞化学試験に際し、スフェロイドを１００％イソペンタン／ドライアイ
ス溶液中でスナップ凍結し、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇクリオスタットを用い
て５μｍの厚さに薄切し、シランコートスライドに載せた。凍結切片を１％のパ
ラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７
．４）中でリンスし、室温にて１％ＢＳＡで２０分間ブロックし、ヤギ又はマウ
スのいずれかの一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。リンスした
後、切片を室温にて１０％正常ウサギ血清で２０分間ブロックした。次に切片を
１：２，０００ビオチニル化ウサギ抗ヤギＩｇＧで処理し、続いて１：１００ス
トレプトアビジン結合アルカリホスファターゼとともにインキュベートした。そ
れぞれのインキュベーションは室温にて３０分間行った。マウス抗体で処理した
スライドは、非標識ウサギ抗マウス（ラット吸収）抗体とともにインキュベート
した後、アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ抗体とともにインキ
ュベートした。それぞれのインキュベーションは室温にて３０分間行った。反応
は、アルカリホスファターゼマトリックスであるニューフクシン（Ｎｅｗ Ｆｕ
ｃｈｓｉｎ）で可視化した。スライドをギルの＃１ヘマトキシリンで１０秒間対
比染色し、工程的にアルコールで脱水し、アメリクリアキシレン代用物（Ａｍｅ
ｒｉｃｌｅａｒ ｘｙｌｅｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）中で透明化した。ＩＩ
型コラーゲンに対するポリクローナルヤギ一次抗体を使用前に、０．５Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＢＳＡ及び１％アジ化ナトリウム中に１：２
００の割合で希釈した。
【０１６０】 軟骨形成は、硫酸化プロテオグリカンのｐＨ１のアズールによるポジティブ染
色、小腔周囲マトリックスによって包囲された円熟細胞型の形態、及びＩＩ型コ
ラーゲンの存在によって示される。コラーゲンの量は、それぞれ２試料に対して
、染色が全く認められなかったことを表す”−”から、染色量及び強度の増加に
ともなって”＋”を増やしていくような方法で、独自に評価した。一次抗体を含
まない試料は”−”のスコアを得た。
【０１６１】 表２はＢＰ（５００ｎｇ／ｍｌ）が１０Ｔ１／２細胞中で２８日間にわたって
軟骨形成マーカーを誘導したことを示している。
【０１６２】
【表８】 表３は、Ｃ2Ｃ12細胞中において、培養物中３日後に、ＢＰ（１０００ｎｇ／
ｍｌ）がミオシン産生（筋肉の指標）を阻害し、ＩＩ型コラーゲン産生（軟骨の
指標）を誘導していることを示している。
【０１６３】
【表９】 実施例２ 以下の実施例は、脱塩したウシ骨（ＢＰ）から単離されたタンパク質の自然抽
出混合物が、Ｃ2Ｃ12細胞内において、筋形成を用量依存的に阻害することを実
証するものである。
【０１６４】 筋形成阻害実験のために、２５，０００のＣ2Ｃ12細胞を、１５％ＦＢＳを含
むＤＭＥＭ培地を入れた３組の２４ウェルプレートに植菌した。翌日（０日目）
、この培地を１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ＋／−様々な濃度のＢＰを含む培地と交換
した。培地は２、３日毎に交換した。
【０１６５】 ＢＰ濃度（０、１０、２０、６０、１００、４００、１０００又は３０００ｎ
ｇ／ｍｌ）について、Ｃ2Ｃ12筋管形成に対する影響について調べた。表４に示
されるように、ＢＰ濃度１０ｎｇ／ｍｌでは、ＢＰを含まない培養物と比較して
いかなる形態学的差異も与えなかった。しかしながら、２０及び６０ｎｇ／ｍｌ
の場合には、ＢＰは実質的に筋管の数を減少させた。完全な筋管阻害が１００ｎ
ｇ／ｍｌ以上のＢＰ濃度で観察された。
【０１６６】
【表１０】 実施例３ 以下の実施例は、脱塩したウシ骨（ＢＰ）から単離されたタンパク質の自然抽
出混合物が、ＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成を用量依存的に定量的に誘導することを
実証するものである。
【０１６７】 本実験において、１００，０００ＡＴＤＣ５細胞／２５μｌ培地（ＤＭＥＭ：
ハムの（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ―１２（１：１）、５％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリ
ン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を３組の２４ウェルプレート（マイク
ロ質量培養）に植菌した。ＡＴＤＣ５細胞はＴ．アツミ（Ａｔｓｕｍｉ）によっ
て寄託されたものであり、理研細胞バンク（日本、３０５、つくば市高野台３−
１−１）から寄託番号第ＲＣＢ０５６５番として公に利用可能なものであった。
１時間半後、１ｍｌの培地を加えた。翌日、様々な濃度のＢＰ、５０μｇ／ｍｌ
アスコルビン酸、５％ＦＢＳ、及び１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩を含む同一
の培地を加えた（０日目）。この後者の培地は３、４日毎に交換した。当業者は
同様の結果を得るために本プロトコールに若干の変更を加えることができる。た
とえば、より少数の細胞（たとえば２５，０００〜５０，０００）をウェルの底
部に植菌することもできるであろう（たとえばマイクロ質量培養中ではなく）。
血清の代わりに、１％栄養腫（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）（べーリンガーマンハイム
）などの血清代用物を含む培地を使用することもできるであろう。また、培養物
は異なる濃度の血清を含んでいてもよいし、又はアスコルビン酸及び／又はβ−
グリセロリン酸塩を含んでいても含んでいなくてもよい。
【０１６８】 軟骨マトリックスの産生を測定するために、以前に記述されたもの（前掲の文
献、フォン・シュロウダーら、１９９３年）に小さな変更を加えてアルシアンブ
ルー染色法を用いた。簡単に述べると、上述のようにＢＰとともにインキュベー
トした後、培養培地を除去し培養物を１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に培養
物を１０％の中性に緩衝されたホルマリンで１５時間固定し、０．５Ｎ ＨＣｌ
で２回洗浄した。培養物を０．５％アルシアンブルー溶液（ｐＨ１．４）で室温
にて１時間染色した。染料を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄して結合していない
染料を除去した。次に青色染料を塩酸グアニジン（４Ｍ、ｐＨ１．７）により、
７０℃で１８時間抽出し、続いて５９５ｎｍにおける吸収を測定した。培養は３
組について行った。本方法を用いて、グリコサミノグリカンの定量化が、35ＳＯ 4 統合に比例していることが実証された（ロウ（Ｌａｕ）ら、１９９３年、Ｔｅ
ｒａｔｏｌｏｇｙ、第４７巻、５５５〜５６３頁）。
【０１６９】 軟骨形成に対するＢＰの影響を調べるために、０、１０、２０、６０、１００
、４００及び１０００ｎｇ／ｍｌのＢＰを軟骨形成ＡＴＤＣ５マイクロ質量培養
物に加え、７日後に培養物をアルシアンブルーで染色した。定量的顕微鏡観察に
より、ＢＰを含まない培養物ではポジティブ染色は一切見られなかったが、ＢＰ
を低濃度で含む（１０、２０及び６０ｎｇ／ｍｌ）培養物では拡散した染色が見
られた。さらに多くのＢＰ（１００、４００及び１０００ｎｇ／ｍｌのＢＰ）を
加えた場合には、染色強度とポジティブに染色された局所細胞面積のいずれも用
量依存的に増大した。４００及び１０００ｎｇ／ｍｌのＢＰで処理した培養物は
、小腔周辺マトリックスによって包囲された円熟細胞から成るポジティブに染色
された局所クラスタを含んでいた（データ示さず）。ネガティブに染色された領
域も存在していた。アルシアンブルー染色の定量化（図５）は、わずか１０ｎｇ
／ｍｌのＢＰ濃度でも、ＢＰを含まない対照培養物と比較してアルシアンブルー
含量を有意に増加させることを示した（ｐ＜０．０００５）。最大のアルシアン
ブルー染色は、ＢＰ濃度４００ｎｇ／ｍｌにおいて観察された。
【０１７０】 ＢＰは血清代用物であるＮｕｔｒｉｄｏｍａを含む培養物中でも軟骨形成を刺
激し、この刺激は１４日間に亘って起こった。ＢＰの非存在下においては、７日
目と１４日目にわずかなアルシアンブルー染色が観察されただけであった（図６
）。しかしながら、１０００ｎｇ／ｍｌのＢＰを含む培養物は、７日目と１４日
目に、ＢＰを含まない培養物と比較してそれぞれ８．５倍及び１１．２倍まで軟
骨形成を有意に（ｐ＜０．００１）刺激した（図６）。
【０１７１】 骨から単離された他の画分がＢＰと同様の活性を有するかどうかを調べるため
に、以下の実験を実施した。ＢＰは以前に記載された（ポーザー（Ｐｏｓｅｒ）
とベネディクト（Ｂｅｎｄｉｃｔ）、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／１３７６７）ように
精製した。しかしながら、ＢＰ含有画分をＨＰＬＣから回収した後、ＢＰよりも
疎水性の高いＩＢＰ及びＰＩＢＰも回収した。ＢＰ、ＩＢＰ及びＰＩＢＰの軟骨
形成活性は、ＡＴＣＤ５細胞上で試験した。図７はＩＢＰとＰＩＢＰのいずれも
、ＢＰに比べて軟骨形成の誘導が有意に低い（ｐ＜０．００５）ことを示してい
る。
【０１７２】 異なるＢＰのロットによって軟骨形成が有意に変化するかどうかを調べるため
、２つのロットについて２つの濃度で実験を行った。表５は軟骨形成活性が２つ
の異なるＢＰロット間で有意に違わないことを示している。
【０１７３】
【表１１】 実施例４ 以下の実施例は、シートとして構成される本発明の軟骨修復生産物の調製のた
めの手法について説明したものである。
【０１７４】 レゲンバイオロジクス社（ＲｅＧｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｉｎｃ．）よ
り入手したウシ腱Ｉ型コラーゲンを１本のシリンジに入れた。適当な体積の１０
ｍＭ酢酸を別のシリンジに入れた。ＢＰを含むスポンジのために、１０ｍＭ酢酸
を含む方のシリンジに適当な用量のＢＰを入れた。シリンジを連結し、各シリン
ジの内容物を混合して２％（ｗ／ｗ）スラリーを作製した。一晩インキュベート
した後、調製物を適当な厚さの型に入れ、−２０℃で４時間以上凍結し、乾燥す
るまで凍結乾燥した。シートに対する適当な移植寸法は、長さ１５．５ｍｍ、幅
４．８ｍｍ、厚さ１．２ｍｍである。
【０１７５】実施例５ 以下の例により、シートとして構成された本発明の軟骨修復生産物を外科移植
するための手順を説明する。 この研究では、５０〜７０ポンドの重量の成体の去勢雄ヤギを複数用いた。予
備麻酔を行った後、吸入麻酔薬（イソフルレン）によりヤギに麻酔を施した。各
ヤギの後肢を，外科手術に備えて抑え付け、スクラブし、ドレープした。膝（後
膝）関節の中間相にわたって切開部を設けた。縫工筋膜を切開して内側側副靭帯
（ＭＣＬ）を露出させた。ＭＣＬの中央に楔形の大腿骨ブロックを揺動鋸子及び
骨刀により形成した。次いでこの骨ブロックを、後に３．５ｍｍの皮質両ねじを
用いて再び取り付けられるように穿孔しかつ先細の形状にした。次いで骨ブロッ
クを持ち上げて、内側半月板の表面を、冠状靭帯を損傷させない状態のまま露出
させた。半月板の中央の無血管部にメスで長手方向の断裂を設けた。この欠損部
に４つの処置を試験した。グループＩ：欠損部に何も与えずに、欠損部を１〜０
の非吸収性縫合糸及び水平マットレス技法（すなわち慣用の修復方法）を用いて
修復した。グループＩＩ：グループＩの方法を用いてコラーゲンシートを欠損部
に縫合した。グループＩＩＩ：グループＩの方法を用いて、３５μｇＢＰを含む
コラーゲンシートを欠損部に縫合した。
【０１７６】 ねじ及びワッシャを用いて骨ブロックの整復及び固着を行った後、被膜の外側
で縫い目を閉じ合わせた。次いで、吸収性縫合糸及び皮下３〜０プロレン皮膚縫
合を用いて皮下組織を閉じ合わせた。ヤギが麻酔から覚醒した後、ヤギを檻の中
に入れ、そして、拘束せずに屋外設備中においた。
【０１７７】 ８週間後、ペントバルビタールナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｋｇＩＶ）溶液
を用いて動物を安楽死させた。半月板を１０％の中性の緩衝ホルマリン溶液中で
固定した。次いで半月板のための組織部をＨ＋Ｅにより染色した。
【０１７８】 ３５μｇＢＰを含むグループＩＩＩの欠損部に、半月板の上側から下側までの
組織を充填し、そして、この修復組織を内因性半月板組織に一体化させた。さら
に、欠損部に隣接した内因性半月板組織を、修復反応を示す正常な内因性半月板
よりも多細胞にした。一方、グループＩ及びＩＩの欠損部は空のままにされ、治
癒の証拠は何ら観察されなかった。
【０１７９】実施例６ 以下の実施例により、半月板軟骨損傷の一部を交換するように構成された本発
明の軟骨修復生産物を外科移植するための手順を説明する。 断裂がひどく又は組織の質が低いことにより半月板の修復を行えない（例えば
本発明のシート状の生産物を用いて）場合には、軟骨組織の断裂部を除去するこ
とにより半月板リムの用意をする。本発明の軟骨修復生産物は、半月板軟骨損傷
の一部を交換し、それにより半月板軟骨を再生及び修復させるように構成される
ことができる。本発明の修復生産物を有さない外科手術が、ストーン・アンド・
ローゼンバーグ（Ｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）により既に先に記
載されている（引用文献）。以下の手順は、本発明の軟骨修復生産物を組み込ん
だストーン・アンド・ローゼンバーグの手順の変型を述べる。
【０１８０】 簡単に述べると、生得的に有されていた半月板軟骨の断裂した部分を除去し、
半月板角のための取り付け部位を解剖学的に配置するか、又は、天然の周辺リム
及び角をそのまま用いる。ストーン及びローゼンバーグが記載した外科技術を用
いて、コラーゲン半月板移植片（ＣＭＩ、半月板の形状及び機械的特性を有する
）として構成された、本発明による軟骨修復組成物と関連する軟骨修復のマトリ
ックスを移植しかつ半月板リムに固定する。外科手術において、半月板移植片周
囲部を、軸方向荷重及び回転荷重を可能にするように十分に確実に取り付けなけ
ればならず、膝関節を取り囲む被膜及び靭帯を固定術により過度に侵襲及び拘束
してはならない。
【０１８１】 シートとして構成された本発明の軟骨修復生産物を、上記のＣＭＩ生産物に関
して記載した手法と同じ外科処置を用いて半月板リムに固定することが、幾つか
の場合において可能である。本発明の軟骨修復生産物をこのように組合せて用い
ることが図８に概略的に示されている。このようなシートを用いることにより、
薄い多孔質の、軟骨修復組成物を含有するコラーゲンを与えることによって半月
板リムとＣＭＩとの一体化が最適化される。シートは境界面をもたらし、この境
界面にて、細胞は急速に浸透しかつ軟骨修復組成物と反応することができる。こ
の実施形態において、シートとして構成された軟骨修復生産物は本発明の軟骨修
復組成物を含有し、ＣＭＩとして構成された軟骨修復生産物は、軟骨修復組成物
と関連するか、又は関連しない。
【０１８２】実施例７ 以下の実験は、本発明の軟骨修復生産物が生体内にて血管組織及び無血管組織
の両方において半月板再生の程度を高めかつ誘発することを示す。 １〜２歳の雌の羊の後肢の１本に施術を行った。簡単に述べると、大腿骨の遠
位第４部位から脛骨の近位第４部位へ末端方向に皮膚及び皮下組織に切開部を設
けて外科的侵入を行った。次いで、内側側副靭帯の起点を含む骨ブロックを大腿
顆から切り離した。脛骨を外転させた。３ｍｍの皮膚バイオプシーパンチ（ミル
テックス社）（Ｍｉｌｔｅｘ）を用いて、内側半月板の血管／無血管ゾーンに２
つの欠損部を形成した。コラーゲン半月板移植片（ＣＭＩ）は、リジェン・バイ
オロジクス社（ＲｅＧｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）から入手した。４ｍｍの皮膚
バイオプシーパンチ（ミルテックス）を用いて、ＣＭＩスポンジを適当な寸法に
カットした。４ｍｍの移植片を半月板損傷部に押し込んだ。ＣＭＩはＢＰ（６９
μｇ／ｍｇコラーゲン）を含有してもしなくてもよい。ＢＰを含有するＣＭＩを
生成するために、以下の実験計画に従った。ＢＰを含む飽和量の１０ミリモル酸
溶液を４ｍｍのＣＭＩスポンジに加えた。スポンジを室温の給湿環境に３０分間
置き、−２０℃で４時間より長い時間冷凍し、次いで乾燥するまで凍結乾燥した
。
【０１８３】 ４週間後、動物を犠牲にして半月板を１０％の中性の緩衝ホルマリン溶液中で
固定した。組織部分にｐＨ値１及び４．５のアズールＢで着色した。組織学によ
る研究結果によれば、ＢＰを含まない未分化線維芽細胞のみが移植片に存在する
ことが示されている（データは示さず）が、細胞は、ＢＰが含まれても含まれな
くてもＣＭＩマトリックスに浸透した。これに対し、ＢＰが含浸された移植片は
分化繊維軟骨細胞を含んだ（データは示さず）。繊維軟骨細胞を、細胞形状が丸
く、かつ明確に染色された空隙に取り囲まれていることにより識別した。さらに
、ＢＰを含まないＣＭＩスポンジは、ＩＩ型コラーゲンの抗体によって変色しな
い細胞を含んでいた。これに対し、ＢＰを含むＣＭＩスポンジは、ＩＩ型コラー
ゲンの抗体によって明確に変色する細胞を含んでいた。
【０１８４】実施例８ 以下の実施例は、本発明の軟骨修復生産物が生体内にて関節軟骨修復の程度を
高めかつ誘発することを示す。 この実験において、生後８ヶ月（骨格は成熟）の５匹のニュージーランドホワ
イトラビットを使った。左右両足の各膝の滑車溝に、長さ８ｍｍ、幅３ｍｍ、深
さ３ｍｍの欠損部を形成した。各ラビットに、長さ８ｍｍ、幅３ｍｍ、深さ３ｍ
ｍの２％コラーゲンスポンジを各膝の欠損部に入れた。一方の膝はＢＰを含まな
いスポンジを受け入れ、他方の膝は４０〜４５μｇのＢＰを含むスポンジを受け
入れた。ラビットの血液５０ｍｌから、ジェラガード（Ｋｊａｅｒｇａｒｄ）ら
の１９９２年、Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔ．１７５（１）：７２−７
３によるアルコール沈殿法を用いて自己フィブリンを準備した。約２０μｌのフ
ィブリノーゲンをコラーゲンの上に置き、１０μｌのウシトロンビン（Ｇｅｎｔ
ｒａｋ）と共に重合した。２ヶ月後、動物を犠牲にした。
【０１８５】 欠損領域の５００μｍのスラブを冷メタノール中で固定しかつｐＨ値１及び４
．５のアズールＢで着色した後、グリコールメタクリレートに埋め込んだ。約５
００μｍのスラブを固定し、次いで、４％のパラホルムアルデヒド中のエチレン
ジアミン四酢酸を用いて石灰質を取り除き、パラフィン中に埋め込んだ。連続切
片をコンドロイチナーゼＡＢＣにより蒸解し、ヘモトキシリン及びエオシンを用
いて着色した。
【０１８６】 組織学的には、コラーゲンスポンジを含む欠損部は、コラーゲン＋ＢＰを含む
欠損部よりも未成熟の組織をより多く生成するにすぎなかった。ＢＰを追加しな
ければ、骨領域は繊維軟骨組織及び線維芽細胞組織で満たされた。これと対照的
に、ＢＰを含む欠損部は骨芽細胞により満たされ、形態学的に認められる骨を有
した。ＢＰを含まない軟骨領域は、正常な深さ０．５〜０．７ｍｍではなく、３
ｍｍの深さの部分を随所に有した。ＢＰを追加すると、軟骨面の厚さは、体内で
形成される軟骨の厚さとほぼ等しくなった。さらに、偏光顕微鏡検査により、Ｂ
Ｐ処置された欠損部には、ＢＰを含まない欠損部よりも多くの成熟コラーゲン繊
維の構成が見られることが明らかになった。
【０１８７】実施例９ 以下の実施例は、骨タンパク質（ＢＰ）がタンパク質の複合混合物であり、少
なくとも、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、Ｂ
ＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−１、オス
テオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ
前駆体、アルブミン、トランスフェリン、アポＡ１リポタンパク質及び第ＸＩＩ
Ｉｂ因子を含むことを示す。
【０１８８】 本発明は、骨タンパク質内のこれらのタンパク質を特定するために当分野にお
いて標準的である技術及び入手可能な試薬を用いた（例えば、ジョン・ウィリー
・アンド・サンズ社の「タンパク質科学における現在の規約」（ＪＥコリガン（
Ｃｏｌｉｇａｎ）他編、１９９５〜１９９８年）、及び、「タンパク質の精製：
原理及び実践」（スコープス・アンド・ヴァーラス、１９８２年）を参照のこと
）。これらの分析の少なくとも１つによりＢＰ内に存在するタンパク質として特
定されてきたタンパク質を表６に示す。
【０１８９】
【表１２】 さらに、骨タンパク質中に認められた細胞内タンパク質は、以下の細胞内タン
パク質、すなわち、ダイニン付随タンパク質、プロタミンＩＩ、ヒストン状タン
パク質、Ｌ６（リボソームタンパク質）、及びＬ３２（リボソームタンパク質）
を含む。ＢＰ中に認められた他の血清タンパク質は、α２ミクログロブリンを含
む。認識されている他の細胞外マトリックス（骨マトリックス）タンパク質は、
フリーズルド関連タンパク質を含む。必要であれば、これらのタンパク質をすべ
て本発明の組成物中に含むことができる。
【０１９０】 表６中のタンパク質の全量を概算するために、タンパク質混合物もしくは骨タ
ンパク質の幾つかの調製物又はそれらの誘導体を検査した。詳細には、ｐＨ９．
０，９．５及び１０．０にて抽出された幾つかの異なるＢＰ及びＡＸ片（例１１
を参照のこと）を標準的なウエスタンブロット分析法によりＴＧＦβ１、ＴＧＦ
β２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７の抗体を用いて検査した。得られた放射線透過
写真をシャープ（Ｓｈａｒｐ）社のＪＸ−３３０スキャナを用いて走査し、イメ
ージマスタＩＤソフトウェアを用いてレーン量を計算した。ＢＰ及びその誘導体
中のＴＧＦβ１の量を測定するために、組換えウシのＴＧＦβ１を標準値（２，
４，８及び１６ｎｇ、プロメガ）とし、抗ウシＴＧＦβ１を用いた。与えられた
任意の試料中のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＢＭＰ−３又はＢＭＰ−７の量を計算
するために、以下の式、（レーン量試料／レーン量試料標準ＴＧＦβ１）×（投
入された標準ＴＧＦβ１の量）を用いた。抗ウシＴＧＦβ抗体を用いた。この方
法は、試料中のＴＧＦβ１の量を概算する特定の方法であり、混合物中のＴＧＦ
β２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７の量の概算をする方法である。ＴＧＦβ２、Ｂ
ＭＰ−３及びＢＭＰ−７に関して概算のみを行うことことができる。なぜなら、
これらの３つのタンパク質の各々のためのウシ標準値及びウシ抗体は入手可能で
ないからである（これらのタンパク質のためにヒト抗体を用い、ＴＧＦβ１標準
値に基づいて量を概算した）。検査した全組成物の４つのタンパク質の各々の高
量概算値及び低量概算値を表７に示す。これらの組成物に関して、ＴＧＦβ１の
、混合物中の他の全タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は約１：１０００〜１：１
００である。
【０１９１】 当業者は、ウシ及び人のＴＧＦβ１が同一のアミノ酸配列を有し、それゆえ、
ウシＴＧＦβ１及びｒｈＴＧＦβ１が同一の作用を持つはずであることを理解す
るであろう。当業者は、また、セイエディン（Ｓｅｙｅｄｉｎ）らにより開示さ
れた方法を用いて高純度ＴＧＦβ−１をウシの骨から分離することができること
を理解するであろう。（オガワ（Ｏｇａｗａ）らによるＭｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、１９８：３１７−３２７（１９９１）、セイエディンらによるＰＮＡＳ，８
２：２２６７−７１（１９８５））。
【０１９２】
【表１３】 例１０ 以下の実施例は、ＢＰ中のタンパク質の複合混合物から生じた骨タンパク質（
ＢＰ）及びタンパク質混合物の軟骨誘発作用が、組換えタンパク質の個々の成分
の軟骨誘発作用よりも優れていることを示す。これは、齧歯動物生体内皮下アッ
セイ標準値を用いて決定される。
【０１９３】Ａ． 以下の実験において、齧歯動物皮下アッセイ法、及び、ズルツァー・バイオ
ロジクス社（コロラド州、デンバー）が開発した格付けシステムを用いて、組換
えＢＭＰ−２（遺伝学協会によりズルツァー・バイオロジクス社に提供された）
の軟骨誘発及び骨誘発能力を評価した。次いで、得られた結果を、同一の測定に
おいて得られたＢＰに関するデータと、同一の格付けシステムを用いて比較した
。
【０１９４】 ズルツァー・バイオロジクス社のラット皮下アッセイを行うために、適切な材
料からマトリックスを準備した。材料がＩ型コラーゲンの場合には、４％ｗ／ｗ
のコラーゲン分散液をウシＩ型コラーゲン及び１％氷酢酸を用いて準備した。コ
ラーゲンディスク／スポンジをモールド内で形成し、冷凍及び凍結乾燥した。測
定のために、コラーゲンディスクに組成物（例えば、骨タンパク質、骨タンパク
質の亜集団、成長因子）を装填した。これは、組成物を有するディスクを室温に
て約３０分間保温静置し、次いで冷凍及び凍結乾燥することにより行われた。デ
ィスクをロングエヴァンズラットの皮下位置に移植した。この例及び後述する他
の例において記載される実験のすべてにおいて、１つの処置について５から１０
匹のラットを用い、組成物を装填したコラーゲンディスク／スポンジ（又は例１
４においては他の材料）を３週間移植した。３週間の最後に、ラットを安楽死さ
せ、外植片を手術により取り出して組織学的に処理し、そして格付けした。
【０１９５】 齧歯動物皮下アッセイ法において骨誘発作用に関して用いた、ズルツァー・バイ
オロジクス社により作成された格付け表を表８に示す。また、齧歯動物皮下アッ
セイ法において軟骨誘発作用に関して用いた格付け表を表９に示す。この表もズ
ルツァー・バイオロジクス社により作成されたものである。
【０１９６】
【表１４】
【表１５】 略語一覧：Ａはスコア、Ｂは鉱化組織の存在、Ｃは非鉱化軟骨が幾らか存在す
る、Ｄは非鉱化軟骨領域が骨領域と同等であり、軟骨がリング状でかつ外植片の
周囲部の５０％より多く、しばしば軟骨変色の程度が高い。Ｅは非鉱化軟骨領域
が骨領域より多く、しばしば骨又は軟骨による鉱化が非常に少なく又は全く無い
。
【０１９７】 １０μｇの量のＢＰがコラーゲンスポンジに与えられると、通常、軟骨は、１
．５〜２．２、骨は２．０〜２．５のスコアを得る。これと対照的に、組換えヒ
トＢＭＰ−２は、表１０に示されているように、ＢＭＰ−２による骨スコア及び
軟骨スコアが共に、ＢＰを与えたときよりも低かった。
【０１９８】
【表１６】 Ｂ．ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２は、当初は、生体内での軟骨形成を促進させ
る能力を有するものとして認められていた。しかし、当分野において、ＴＧＦβ
１〜５、及び、ＦＧＦ及びＰＤＧＦなどの成長因子が骨及び軟骨の形成を誘発し
ないことが、齧歯動物生体内偏位測定などのラット皮下アッセイにおいて分かっ
ている（例えば、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２は共に、軟骨又は骨の形成を開
始することができず、繊維組織のみが観察される）。これは、組換えＴＧＦ−β
１に関して以下に示す結果により確認される。測定は、上記（Ａ）章に記載した
ようにズルツァー・バイオロジクス社のラット皮下アッセイ及び格付けシステム
を用いて行った。表１１は、この測定において組換えヒトＴＧＦβ１が骨及び軟
骨の形成を誘発しないことを示す。これと対照的に、１０μｇの量の骨タンパク
質（ＢＰ）を与えると、通常、軟骨は１．５〜２．２、骨は２．０〜２．５のス
コアを得る。
【０１９９】
【表１７】 例１１ 以下の例は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−β１を含むＢ
Ｐのための改良精製プロセスにより得られたタンパク質の別の混合物を用いると
、ＢＰを用いるのと比べて骨の生成は同等であるが、軟骨の生成量がより多くな
ることを示す。
【０２００】 ＢＰは、通常、陰イオン交換（ＡＸ）ステップ、陽イオン交換（ＣＸ）ステッ
プ及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ステップを用いて精製される
（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７６７号による、これをすべて援用して本文の
記載の一部とする）。この方法は本文中において先に詳細に記載されており、ま
た、米国特許第５，２９０，７６３号に記載されている。この特許をすべて援用
して本文の記載の一部とする。
【０２０１】 一般に、タンパク質は陰イオン交換カラム（分離管）からｐＨ値８．５にて溶
離する。この実験においては、タンパク質を陰イオンカラムからｐＨ９．０、９
．５及び１０．０にて溶離させた。次いで試料を、先に記載したように（ＰＣＴ
公開番号ＷＯ９５／１３７６７号）ＣＸ及びＨＰＬＣカラムを横切らせて精製し
た。上記ｐＨ値にて抽出された各ＨＰＬＣの留分を、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、
ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の有無に関してウエスタンブロット
法により分析した。
【０２０２】 ＡＸカラムの抽出を、ｐＨ値を高くして行った結果、ＢＰ中のＢＭＰ−２、Ｂ
ＭＰ−３、ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−β１の量が増大した。ｐＨ９．０にて、ＢＭ
Ｐ−２及びＢＭＰ−７の量は最も増大したが、ＴＧＦ−β１及びＢＭＰ−３は、
ｐＨ８．５のときと比較して増加が抑えられ、又はなかった。これらの因子の量
の増大は、骨スコアに大きな影響を与えず、軟骨スコアを僅かに増大させる（表
１２）。ｐＨ値が１０．０になると、ＴＧＦ−β１の量は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ
−３、ＢＭＰ−７が増大するよりもかなり多く増大する。ｐＨ１０．０の留分は
、最大の軟骨スコアを示し、これは、タンパク質の混合物内でＴＧＦβ１が軟骨
形成の誘発において特定の役割を有することを示す。ＨＰＬＣ精製留分（１０μ
ｇ）をラット皮下モデルにてテストした。その結果を表１２に示す。
【０２０３】
【表１８】 例１２ 以下の例は、ＢＰから精製されかつＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７及びＴ
ＧＦ−β１を含む組成物が、軟骨形成に必要な成分を含むことを示す。
【０２０４】 ＢＰの特定のタンパク質亜集団を得るために、ＢＰ内のタンパク質をヒドロキ
シアパタイトカラム上で分離した。ボイド物質が、１２０ミリモル未満のＫＰＯ 4 緩衝液により溶離したタンパク質を含んでいた。溶離中、ｐＨ勾配は６．７〜
７．４の範囲にあった。各留分の１０μｇを、コラーゲンスポンジに加え、先に
例１０にて記載したように齧歯動物皮下アッセイを行った。さらに、同量の各留
分をタンパク質ゲルに加え、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−７及びＴＧＦ−
β１の抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った（表１３）。記号（−）は
、何らシグナルが無かったことを示し、（＋）はシグナルが検知されたことを示
す。
【０２０５】
【表１９】 表１４のデータは、ＢＭＰ−２，３，７及びＴＧＦβ−１を含むＢＰ留分が、
ＢＰの軟骨及び骨の形成誘発作用のために必要な成分であるタンパク質を含むこ
とを示す。
【０２０６】
【表２０】 例１３ 以下の例は、ＴＧＦβ１の純粋な供給源の量を、骨形成／軟骨形成タンパク質
の複合混合物に外因的に加えるときに高レベルで増加すると、生体内の骨及び鉱
化軟骨の形成の減損が進行し、非鉱化軟骨の形成が進行することを示す。
【０２０７】 先に示した多くの例に記載したように、骨タンパク質（ＢＰ）は天然にＴＧＦ
β１を、他の種々のタンパク質と共に含む。しかし、例１１〜１２は、ＴＧＦβ
１が骨形成／軟骨形成混合物の能力のために特に重要であり得ることを示した。
したがって、本発明の発明者は、ほぼ純粋なＴＧＦβ１（すなわち組換え又は精
製された）の外因源が、ＢＰなどの混合物において他の骨形成／軟骨形成タンパ
ク質と比較して高濃度に与えられたときに軟骨形成誘発能力に影響するかどうか
を決定することを試みた。
【０２０８】 この例においては、組換えヒトＴＧＦβ１（ｒｈＴＧＦβ１）を、１０μｇの
骨タンパク質（ＢＰ）に、徐々に量を増やして（０．１μｇ、３．５μｇ、１０
μｇ）加えた。次いで、混合物をコラーゲンスポンジ上に置き、例１０に記載し
たように齧歯動物皮下アッセイ法を行った。軟骨及び骨の誘発のための、ＴＧＦ
β１とＢＰの種々の比を以下の表１５に示す。ＢＰ中の個々のＢＭＰタンパク質
の量が約０．０１％〜約９％（最小量と最大量）の範囲にあるため、混合物中の
少なくとも１つのＢＭＰに対するＴＧＦβ１の有効比は、１０：１より大きい値
〜１０００：１より大きい値の範囲にあることが分かる。
【０２０９】
【表２１】 表１５は、外因性ＴＧＦβ１を徐々に量を増やして加えることにより、ＢＰに
関して本文中に前述した骨形成及び軟骨形成作用を、骨の生成を減らして軟骨の
生成を増進させるように進歩的に変化させ得ることを示す。注目すべきことには
、組成物のＴＧＦβ１の濃度が高ければ、主に軟骨形成に作用し、骨形成への作
用はごく僅かであることが観察される。
【０２１０】例１４ 以下の例は、種々の軟骨修復材料がＢＰと組み合わされて、本発明に従う生体
内での軟骨形成を誘発することを示す。Ａ ．この例は、骨及び軟骨形成のために、ＢＰを含むポリ乳酸、ポリグリコール
酸材料を用いることを示す。
【０２１１】 ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）（５０：５０）を６０％（ｖ／ｖ）
含むＮ−メチルピロリドン溶液をつくった。コラーゲン（６ｍｇ）をデルリンモ
ールドに押し込んだ。ＰＬＧＡ（１４０ｍｇ）を加えて混合した。１０ミリモル
の塩酸溶液（１００マイクロリットル）中に含まれたＢＰ（１００μｇ）を加え
、固体のディスクを形成するためにすべての成分を混合した。この混合物をモー
ルドに押し込み、室温で１時間保温静置し、次いで、５章に記載したラット皮下
アッセイ法に基づいてラットに移植した。移植の１ヶ月後に組織学的検査を行っ
た。表１６は、ＰＬＧＡマトリックスと組み合せたＢＰがこのｉｎ ｖｉｖｏモ
デルにおいて軟骨形成を誘発することを示す。
【０２１２】
【表２２】 Ｂ．この方法において、３％のＩ型コラーゲン／１％のＩＶ型コラーゲン（シグ
マ）を含む複合スポンジを、本願の例４に記載したような通常の準備方法により
作成した。１０μｇのＢＰを含むこのマトリックスを、５章に記載したラット皮
下アッセイ法に基づいてラットに移植し、３週間後に組織学的検査を行った。表
１７は、Ｉ型コラーゲン及びＩＶ型コラーゲンを共に含むマトリックスと組合せ
たＢＰが、このｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて軟骨形成を誘発することを示す。
【０２１３】
【表２３】 Ｃ．この実験は、ＢＰを含む注入可能なコラーゲンゲルを用いることにより骨及
び軟骨の形成が誘発されることを示す。１０ミリモルの塩酸（５ｍｌ）中に含ま
れたＢＰ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）をコラーゲン（３０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。この
溶液を、ゼリー状の粘稠度を有するまで混合し、４℃で一晩保温静置した。切開
部を設けずに、１００ミクロリットルのゲルをラットに皮下注入した。表１８は
、ゲル状のマトリックスに含まれたＢＰがこのｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて軟
骨形成を誘発することを示す。
【０２１４】
【表２４】 Ｄ．この実験は、ＢＰと組み合わせた、トリエタノールアミン及びゲル状のコラ
ーゲン（塩基性ｐＨ）を含む軟骨修復マトリックスが、ｉｎ ｖｉｖｏでの軟骨
形成を誘発することを示す。
【０２１５】 塩基性コラーゲンの準備において、０．５ｇのＴＥＡを９９．５ｇ脱イオン水
に加えると、ｐＨ値が９．９になった。２％のコラーゲンゲルを作るために２．
０ｇのコラーゲンを加えるとｐＨ値が８．８になった。混合物を室温で１時間保
温静置し、次いで４８時間凍結乾燥した。混合物を１０ミリモルの塩酸（３５マ
イクログラムのＢＰを含有）にて、３％のコラーゲンスポンジ及び６％のコラー
ゲンスポンジとして復元した。容積１００マイクロリットルのゲルを１８番又は
２０番針を通じて供給した。ゲルの乾燥後、得られたスポンジは重量にて８０％
のコラーゲン及び２０％のＴＥＡを有した。表１９は、ＢＰと組み合せた３％の
コラーゲンＴＥＡスポンジ及び６％のコラーゲンＴＥＡスポンジが共にこのｉｎ
ｖｉｖｏ系にて軟骨形成を誘発することを示す。
【０２１６】
【表２５】 Ｅ．この実験は、ＢＰと組み合わせた、酸性ｐＨのゲル状のコラーゲンを含む軟
骨修復マトリックスがｉｎ ｖｉｖｏでの軟骨形成を誘発することを示す。酸性
ｐＨコラーゲンゲルを準備するために、９９５ｍｌの脱イオン水、５．０ｍｌの
１モルのＨ3 ＰＯ4 を加え、次いで、１．７５ｍｌの１．００規定の水酸化ナト
リウムを加えた（混合物のｐＨ＝２．４９）。１０．０ｇのコラーゲンをＢＰに
加えて２時間混合した（最終ｐＨ＝３．６１）。これにより１％のコラーゲンゲ
ルが生成され、これを冷凍及び凍結乾燥した。６０ｍｇのコラーゲンディスクに
２ｍｌの脱イオン水を加えて室温で２時間保温静置した。得られた３％コラーゲ
ンゲルのｐＨ値は３．７であった。この材料は、１８番又は２０番ゲージの針を
用いて注入可能であったが、２２番又は２５番ゲージの針では注入できなかった
。容積１００マイクロリットルのゲルが３５μｇのＢＰを含んでいた。表２０は
、ＢＰと組み合わされたゲル状の３％の酸性コラーゲンマトリックスがこのｉｎ
ｖｉｖｏ系での軟骨形成を誘発することを示す。
【０２１７】
【表２６】 本発明の様々な実施形態を詳細に記載してきたが、当業者には、これらの実施形
態を改良し、また様々に適合させることが可能であることが明らかであろう。し
かし、かかる改良及び適合が、特許請求の範囲に詳述された本発明の範囲にある
ことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１（Ａ）は、半月板径方向断裂を示す図である。図１（Ｂ）は、
図１（Ａ）に示された半月板径方向断裂に対する従来の縫合による修復及び切除
を示す図である。図１（Ｃ）は、半月板三重バケツ柄状断裂を示す図である。図
１（Ｄ）は、図１（Ｃ）に示された半月板三重バケツ柄状断裂に対する従来の縫
合による修復及び切除を示す図である。
【図２】図２（Ａ）は、半月板断片的病変に対する本発明の軟骨修復用生産
物の植設を示す図である。図２（Ｂ）は、半月板断片的病変に対する本発明の軟
骨修復用生産物の固定を示す図である。
【図３】図３（Ａ）は、血管、半血管及び無血管の各領域を有する半月板断
面を示す図である。図３（Ｂ）は、本発明の軟骨修復用生産物のひとつの概略形
状を示す図である。
【図４】図４（Ａ）は、大腿骨から脛骨へと見た場合の無血管領域における
長手断裂を有する半月板を示す図である。図４（Ｂ）は、本発明の軟骨修復用生
産物を含む図４（Ａ）の半月板の断面を示す図である。
【図５】ＡＴＤＣ５マイクロ質量培養株のアルシアンブルー染色の定量を示
す線グラフである。
【図６】７及び１４日目の栄養腫（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）含有培地における
ＡＴＤＣ５マイクロ質量培養株のアルシアンブルー染色の定量を示す棒グラフで
ある。
【図７】無機質除去された牛骨から分離されたタンパク質のＨＰＬＣ画分を
含むＡＴＤＣ５マイクロ質量培養株のアルシアンブルー染色の定量を示す棒グラ
フである。
【図８】半月板欠陥を修復すべく使用されるコラーゲン製半月板インプラン
ト（ＣＭＩ）と本発明の軟骨修復用薄寸状生産物との組合せの断面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベネディクト、ジェームス ジェイ． アメリカ合衆国 80007 コロラド州 ア ーヴァダ ウェスト セブンティセブンス ドライブ 15239 Ｆターム(参考） 4C081 AB04 BA12 BA16 BB06 CD112 CD122 CD26 CD27 CD28 CD29 CD34 DA02 DA12 DA16 DB03 4C097 AA01 BB01 DD14 DD15 EE18 EE19

Claims (87)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 軟骨病変修復生産物であって、 ａ．軟骨における欠損に一致させるのに適した軟骨修復マトリックスと、 ｂ．トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タンパク
    質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７を含むタンパク質混合物を含有す
    る、前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成物とを含み、 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約９９．９９％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−２の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−３の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．１％〜約１５％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−７の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％である生産物。
  2. 【請求項２】 軟骨病変修復生産物であって、 ａ．軟骨修復マトリックスと、 ｂ．（ｉ）１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む骨由来の骨形成用
    又は軟骨形成用製剤、及び （ｉｉ）外因性ＴＧＦβタンパク質 を含むタンパク質混合物を含有する、前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成
    物とを含み、 前記外因性ＴＧＦβタンパク質の前記１以上のＢＭＰに対する比が約１０：１
    より大きく、 前記外因性ＴＧＦβタンパク質非存在下における前記骨由来の骨形成性又は軟
    骨形成用タンパク質製剤による軟骨誘発のレベルと比較して、前記組成物による
    軟骨誘発を増加させるだけの量で前記外因性ＴＧＦβタンパク質が存在する生産
    物。
  3. 【請求項３】 軟骨病変修復生産物であって、 ａ．軟骨修復マトリックスと、 ｂ．（ｉ）ＴＧＦβタンパク質、及び （ｉｉ）１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ） を含むタンパク質混合物を含有する、前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成
    物とを含み、 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する比が約１０：１より
    大きい生産物。
  4. 【請求項４】 前記タンパク質混合物がＴＧＦβスーパーファミリータンパ
    ク質類であるＴＧＦβ１、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及
    びＢＭＰ−７を含有し、前記ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質類が前記タ
    ンパク質混合物の約０．５％〜約９９．９９％を占める請求項１、２又は３に記
    載の生産物。
  5. 【請求項５】 前記ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質類が、前記タン
    パク質混合物の約０．５％〜約２５％を占める請求項４に記載の生産物。
  6. 【請求項６】 前記ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質類が、前記タン
    パク質混合物の約１％〜約１０％を占める請求項４に記載の生産物。
  7. 【請求項７】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計
    タンパク質の約０．０１％〜約７５％である請求項４に記載の生産物。
  8. 【請求項８】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計
    タンパク質の約０．０１％〜約５０％である請求項４に記載の生産物。
  9. 【請求項９】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計
    タンパク質の約０．０１％〜約２５％である請求項４に記載の生産物。
  10. 【請求項１０】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約０．０１％〜約１０％である請求項４に記載の生産物。
  11. 【請求項１１】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約０．１％〜約１％である請求項４に記載の生産物。
  12. 【請求項１２】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約３３％〜約９９．９９％である請求項４に記載の生産物。
  13. 【請求項１３】 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約５０％〜約９９．９９％である請求項４に記載の生産物。
  14. 【請求項１４】 前記混合物中の前記ＢＭＰ−２の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約０．１％〜約５％である請求項４に記載の生産物。
  15. 【請求項１５】 前記混合物中の前記ＢＭＰ−３の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約０．１％〜約５％である請求項４に記載の生産物。
  16. 【請求項１６】 前記混合物中の前記ＢＭＰ−７の量が、前記混合物中の合
    計タンパク質の約０．１％〜約５％である請求項４に記載の生産物。
  17. 【請求項１７】 前記タンパク質混合物が、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＢＭ
    Ｐ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９及び軟骨由来形態形
    成タンパク質（ＣＤＭＰ）からなる群から選択されるタンパク質をさらに含む請
    求項４に記載の生産物。
  18. 【請求項１８】 前記ＴＧＦβ２が、前記タンパク質混合物の約０．５％〜
    約１２％を占める請求項１７に記載の生産物。
  19. 【請求項１９】 前記ＴＧＦβ３が、前記タンパク質混合物の約０．０１％
    〜約１５％を占める請求項１７に記載の生産物。
  20. 【請求項２０】 前記ＢＭＰ−４が、前記タンパク質混合物の約０．０１％
    〜約１％を占める請求項１７に記載の生産物。
  21. 【請求項２１】 前記ＢＭＰ−５が、前記タンパク質混合物の約０．０１％
    〜約１％を占める請求項１７に記載の生産物。
  22. 【請求項２２】 前記ＢＭＰ−６が、前記タンパク質混合物の約０．０１％
    〜約１％を占める請求項１７に記載の生産物。
  23. 【請求項２３】 前記ＣＤＭＰが、前記タンパク質混合物の約０．０１％〜
    約１％を占める請求項１７に記載の生産物。
  24. 【請求項２４】 前記タンパク質混合物がさらに、オステオカルシン、オス
    テオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ、カテプシ
    ンＬ前駆体、オステオポンチン、マトリックスＧＬＡタンパク質（ＭＧＰ）、ビ
    グリカン、デコリン、プロテオグリカン−コンドロイチン硫酸ＩＩＩ（ＰＧ−Ｃ
    ＳＩＩＩ）、骨酸性糖タンパク質（ＢＡＧ−７５）、トロンボスポンジン（ＴＳ
    Ｐ）及びフィブロネクチンからなる群から選択される１以上の骨マトリックスタ
    ンパク質を含み、前記骨マトリックスタンパク質が前記タンパク質混合物の約２
    ０％〜約９８％を占める請求項４に記載の生産物。
  25. 【請求項２５】 前記骨マトリックスタンパク質が、オステオカルシン、オ
    ステオネクチン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、リシルオキシダーゼ及びカテ
    プシンＬ前駆体を含む請求項２４に記載の生産物。
  26. 【請求項２６】 前記骨マトリックスタンパク質が、前記タンパク質混合物
    の約４０％〜約９８％を占める請求項２４に記載の生産物。
  27. 【請求項２７】 前記タンパク質混合物がさらに、線維芽細胞成長因子−Ｉ
    （ＦＧＦ−Ｉ）、ＦＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ−９、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、イン
    スリン、インスリン成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＩＧＦ−ＩＩ、血小板由来成長
    因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、間質由来因子
    −２（ＳＤＦ−２）、下垂体甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン、肝細胞
    成長因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子
    −α（ＴＧＦα）及びヘッジホッグタンパク質からなる群から選択される１以上
    の成長因子タンパク質を含み、前記成長因子タンパク質が前記タンパク質混合物
    の約０．０１％〜約５０％を占める請求項４に記載の生産物。
  28. 【請求項２８】 前記成長因子タンパク質が、前記タンパク質混合物の約０
    ．０５％〜約２５％を占める請求項２７に記載の生産物。
  29. 【請求項２９】 前記成長因子タンパク質が、前記タンパク質混合物の約０
    ．１％〜約１０％を占める請求項２７に記載の生産物。
  30. 【請求項３０】 前記成長因子タンパク質が線維芽細胞成長因子−Ｉ（ＦＧ
    Ｆ−Ｉ）である請求項２７に記載の生産物。
  31. 【請求項３１】 前記ＦＧＦ−Ｉが前記タンパク質混合物の約０．００１％
    〜約１０％を占める請求項３０に記載の生産物。
  32. 【請求項３２】 前記組成物がさらに、１以上の血清タンパク質を含む請求
    項４に記載の生産物。
  33. 【請求項３３】 前記血清タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、
    α２−Ｈｓ糖タンパク質、ＩｇＧ、α１−抗トリプシン、β２−ミクログロブリ
    ン、アポＡ１リポタンパク質（ＬＰ）及び因子ＸＩＩＩｂからなる群から選択さ
    れる請求項３２に記載の生産物。
  34. 【請求項３４】 前記血清タンパク質が、アルブミン、トランスフェリン、
    アポＡ１ＬＰ及び因子ＸＩＩＩｂからなる群から選択される請求項３２に記載の
    生産物。
  35. 【請求項３５】 前記タンパク質混合物が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧ
    Ｆβ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭ
    Ｐ−７、ＣＤＭＰ、ＦＧＦ−１、オステオカルシン、オステオネクチン、ＢＳＰ
    、リシルオキシダーゼ、カテプシンＬ前駆体、アルブミン、トランスフェリン、
    アポＡ１ＬＰ及び因子ＸＩＩＩｂを含む請求項１、２又は３に記載の生産物。
  36. 【請求項３６】 前記タンパク質混合物が骨タンパク質（ＢＰ）を含む請求
    項１、２又は３に記載の生産物。
  37. 【請求項３７】 前記軟骨誘発組成物が、細胞浸潤を誘発する能力、細胞増
    殖を誘発する能力、血管形成を誘発する能力ならびにＩＩ型コラーゲン産生性軟
    骨細胞への細胞分化を誘発する能力からなる群から選択される識別特性を有する
    請求項１、２又は３に記載の生産物。
  38. 【請求項３８】 前記軟骨誘発組成物の濃度が、前記生産物の約０．５重量
    ％〜約３３重量％である請求項１、２又は３に記載の生産物。
  39. 【請求項３９】 前記軟骨誘発組成物の濃度が、前記生産物の約１重量％〜
    約２０重量％である請求項１、２又は３に記載の生産物。
  40. 【請求項４０】 前記混合物中のＢＭＰ−３の量が前記混合物中の合計タン
    パク質の約０．１％〜約１０％である請求項１に記載の生産物。
  41. 【請求項４１】 ラット皮下アッセイでウシ腱コラーゲン６．５〜７．３ｍ
    ｇ当たり約１０μｇ以上の濃度で使用した場合に前記タンパク質混合物が、表８
    に示した骨等級分けスケールを用いて約１．０〜約３．５の骨スコアを誘発し、
    表９に示した軟骨等級分けスケールを用いて約１．２以上の軟骨スコアを誘発す
    る請求項１に記載の生産物。
  42. 【請求項４２】 ラット皮下アッセイでウシ腱コラーゲン６．５〜７．３ｍ
    ｇ当たり約１０μｇ以上の濃度で使用した場合に前記組成物が、表８に示した骨
    等級分けスケールを用いて約２．０未満の骨スコアを誘発し、表９に示した軟骨
    等級分けスケールを用いて約２．０以上の軟骨スコアを誘発する請求項２又は３
    に記載の生産物。
  43. 【請求項４３】 ラット皮下アッセイでウシ腱コラーゲン６．５〜７．３ｍ
    ｇ当たり約１０μｇ以上の濃度で使用した場合に前記組成物が、表８に示した骨
    等級分けスケールを用いて約２．０未満の骨スコアを誘発し、表９に示した軟骨
    等級分けスケールを用いて約２．５以上の軟骨スコアを誘発する請求項２又は３
    に記載の生産物。
  44. 【請求項４４】 ラット皮下アッセイでウシ腱コラーゲン６．５〜７．３ｍ
    ｇ当たり約１０μｇ以上の濃度で使用した場合に前記組成物が、表８に示した骨
    等級分けスケールを用いて約２．０未満の骨スコアを誘発し、表９に示した軟骨
    等級分けスケールを用いて約３．０以上の軟骨スコアを誘発する請求項２又は３
    に記載の生産物。
  45. 【請求項４５】 前記外因性ＴＧＦβタンパク質がＴＧＦβ１である請求項
    ２に記載の生産物。
  46. 【請求項４６】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：１０以上である請求項１又は４５に記載の生産物。
  47. 【請求項４７】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：３以上である請求項１又は４５に記載の生産物。
  48. 【請求項４８】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：１以上である請求項１又は４５に記載の生産物。
  49. 【請求項４９】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１０：１以上である請求項１又は４５に記載の生産物。
  50. 【請求項５０】 前記ＴＧＦβタンパク質が組換えＴＧＦβタンパク質であ
    る請求項２又は３に記載の生産物。
  51. 【請求項５１】 前記ＴＧＦβタンパク質が骨由来タンパク質混合物から精
    製される請求項２又は３に記載の生産物。
  52. 【請求項５２】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１００：１より大きい請求項２又は３に記載の生産物。
  53. 【請求項５３】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１０００：１より大きい請求項２又は３に記載の生産物。
  54. 【請求項５４】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１００００：１より大きい請求項２又は３に記載の生産物。
  55. 【請求項５５】 前記ＴＧＦβタンパク質がＴＧＦβ１である請求項３に記
    載の生産物。
  56. 【請求項５６】 前記ＢＭＰタンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭ
    Ｐ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９及びＣ
    ＤＭＰからなる群から選択される請求項３に記載の生産物。
  57. 【請求項５７】 前記軟骨修復マトリックスが生体吸収性である請求項１、
    ２又は３に記載の生産物。
  58. 【請求項５８】 前記軟骨修復マトリックスが多孔質である請求項１、２又
    は３に記載の生産物。
  59. 【請求項５９】 前記軟骨修復マトリックスがスポンジ、膜、薄膜及びゲル
    である請求項１、２又は３に記載の生産物。
  60. 【請求項６０】 前記軟骨修復マトリックスがウシ腱からのコラーゲンを含
    む請求項１、２又は３に記載の生産物。
  61. 【請求項６１】 前記軟骨修復マトリックスがシート形状を有する請求項１
    、２又は３に記載の生産物。
  62. 【請求項６２】 前記軟骨修復マトリックスが軟骨における部分欠損に一致
    する請求項１、２又は３に記載の生産物。
  63. 【請求項６３】 前記軟骨修復マトリックスがテーパ形状を有する請求項６
    ２に記載の生産物。
  64. 【請求項６４】 前記組成物がさらに、徐放性製剤を含む請求項６２に記載
    の生産物。
  65. 【請求項６５】 軟骨病変の修復方法であって、 ａ．軟骨における欠損に一致させるのに適した軟骨修復マトリックスと、 ｂ．トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タンパク
    質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７を含むタンパク質混合物を有して
    なる前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成物とを含有し、 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約９９．９９％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−２の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−３の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．１％〜約１５％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−７の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％である生産物を軟骨病変に埋め込み固定する工程を有する方
    法。
  66. 【請求項６６】 軟骨病変の修復方法であって、 ａ．軟骨修復マトリックスと、 ｂ．（ｉ）１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含む骨由来の骨形成用
    又は軟骨形成用製剤、及び （ｉｉ）外因性ＴＧＦβタンパク質 を含むタンパク質混合物を含有する、前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成
    物 をとを含み、 前記外因性ＴＧＦβタンパク質の前記１以上のＢＭＰに対する比が約１０：１
    より大きく、 前記外因性ＴＧＦβタンパク質非存在下における前記骨由来の骨形成用又は軟
    骨形成用タンパク質製剤による軟骨誘発のレベルと比較して、前記組成物による
    軟骨誘発を増加させるだけの量で前記外因性ＴＧＦβタンパク質が存在する生産
    物を、軟骨病変に埋め込み固定する工程を有する方法。
  67. 【請求項６７】 軟骨病変の修復方法であって、 ａ．軟骨修復マトリックスと、 ｂ．（ｉ）ＴＧＦβタンパク質、及び （ｉｉ）１以上の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ） を含むタンパク質混合物を含有する、前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成
    物 とを含み、 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する比が約１０：１より
    大きい生産物を、軟骨病変に埋め込み固定する工程を有する方法。
  68. 【請求項６８】 前記ＴＧＦβタンパク質がＴＧＦβ１である請求項６６に
    記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：１０以上である請求項６５又は６８に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：３以上である請求項６５又は６８に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１：１以上である請求項６５又は６８に記載の方法。
  72. 【請求項７２】 前記タンパク質混合物中でＴＧＦβ１の他のすべてのタン
    パク質に対する比が約１０：１以上である請求項６５又は６８に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記ＴＧＦβタンパク質がＴＧＦβ１である請求項６７に
    記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１００：１より大きい請求項６６又は６７に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１０００：１より大きい請求項６６又は６７に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 前記ＴＧＦβタンパク質の前記ＢＭＰタンパク質に対する
    比が約１００００：１より大きい請求項６６又は６７に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記軟骨病変が関節軟骨病変である請求項６５、６６又は
    ６７に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 前記軟骨病変が半月板軟骨病変である請求項６５、６６又
    は６７に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 前記病変が血管半月板病変である請求項７８に記載の方法
    。
  80. 【請求項８０】 前記病変が無血管半月板病変である請求項７８に記載の方
    法。
  81. 【請求項８１】 前記病変が半月板径方向断裂である請求項７８に記載の方
    法。
  82. 【請求項８２】 前記病変が半月板バケツ柄状断裂である請求項７８に記載
    の方法。
  83. 【請求項８３】 前記病変が半月板部分欠損である請求項７８に記載の方法
    。
  84. 【請求項８４】 前記病変が断裂であり、前記マトリックスがシート形状で
    あり、前記埋め込みの工程が前記生産物を直接前記断裂に挿入する工程を有する
    請求項６５、６６又は６７に記載の方法。
  85. 【請求項８５】 前記生産物を、生体吸収性縫合糸、非吸収性縫合糸、圧入
    、アロー、平爪及びＴ−固定縫合糸固定機器からなる群から選択される取付手段
    によって前記病変に固定する請求項６５、６６又は６７に記載の方法。
  86. 【請求項８６】 部分軟骨病変の修復方法であって、 ａ． （ｉ）シート形状の軟骨修復マトリックスと、 （ｉｉ）トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タ
    ンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及びＢＭＰ−７を含むタンパク質混合物を
    含む前記マトリックスに関連する軟骨誘発組成物と を含み、 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約９９．９９％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−２の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−３の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．１％〜約１５％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−７の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％である第１の生産物、ならびに ｂ．前記区域性欠損から除去された軟骨と置換する形状の軟骨修復マトリック
    スを含む第２の生産物 を、部分軟骨病変に埋め込む工程を有し、 前記第１の生産物を前記病変の縁部と前記第２の生産物との間に埋め込むこと
    で、前記病変と前記第２の生産物との間に界面を提供する方法。
  87. 【請求項８７】 前記マトリックスがさらに、トランスフォーミング成長因
    子β１（ＴＧＦβ１）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３及び
    ＢＭＰ−７を含むタンパク質混合物を含む前記マトリックスに関連する軟骨誘発
    組成物を含み、 前記混合物中の前記ＴＧＦβ１の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約９９．９９％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−２の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−３の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．１％〜約１５％であり、 前記混合物中の前記ＢＭＰ−７の量が、前記混合物中の合計タンパク質の約０
    ．０１％〜約１０％である方法。
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