DE69118535T2

DE69118535T2 - Osteo-induktive pharmazeutische formulierungen

Info

Publication number: DE69118535T2
Application number: DE69118535T
Authority: DE
Inventors: Tobin N. Brookline Ma 02146 Gerhart; Mary Jo Hudson Ma 01749 Kriz; Elizabeth A. Carlisle Ma 01741 Wang
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: US5364839A; JPH05507930A; CA2085750A1; JP3191937B2; ATE136221T1; DE69118535D1; CA2085750C; EP0535091B1; WO1991019510A1; GR3019901T3; EP0535091A1; ES2088006T3; DK0535091T3

Description

Osteoinduktive Arzneimittel

Die Erfindung betrifft Arzneimittel, die eine einen Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufen. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von 8- Aminocapronsäure (EACA) oder anderen Lysinanaloga, Serinprotease-Inhibitoren oder anderen antifibrinolytischen Mitteln in eine Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Arzneimitteln.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel umfassen EACA oder andere Lysinanaloga, Serinprotease-Inhibitoren oder antifibrinolytische Mittel zusannnen mit eine den Knorpel und/oder den Kochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteinen, wie beispielsweise BMP-2 (früher als BMP-2A oder BMP-2 Klasse 1 bezeichnet), BMP-3 oder BMP-4 (früher als BMP-28 und BMP-2 Klasse II bezeichnet), die in den veröffentlichten internationalen PCT-Anmeldungen WO 88/00205 und WO 89/10409 offenbart sind. Weitere eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Proteine zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen BMP-5, BMP-6 und BMP-7.
In weiteren Ausführungsformen können die Arzneimittel außerdem Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und den von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), umfassen.
Die Arzneimittel können ferner eine geeignete Matrix umfassen, beispielsweise zur Sequestration und/oder als Träger des Präparats und/oder zur Bereitstellung einer Oberfläche für die Knochen- und/oder Knorpelbildung. Die Matrix kann die Sequestration des Knorpels und/oder des osteoinduktiven Proteins/der osteoinduktiven Proteine und/oder die geeignete Umgebung zur Präsentation des Proteins/der Proteine gewährleisten.
EACA ist das gegenwärtig bevorzugte Lysinanalogon zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln. Das Arzneimittel kann andere Lysinanaloga einschließlich trans-p-Aminomethylcyclohexancarbonsäure (AMCA; Tranexamsäure) (Amstat) umfassen. Das Vorliegen von EACA in osteoinduktiven Arzneimitteln beschleunigt die Knochenbildung und/oder erniedrigt die Menge des benötigten, eines den Knorpel und/oder den Knochen betreffenden Reaktion hervorrufenden Proteins.
EACA besitzt bekanntlich eine fibrinstabilisierende Wirkung. Es inaktiviert Plasmin, das eine Serinprotease ist. [Nilsson etal., Lancet 1 (1960), 1233-1236]. Es wurde gezeigt, daß EACA die Synthese von neuem Collagen in Tieren durch die Blockade des fibrinolytischen Systems verstärkt [Brandstedt et al., Eur. Surg. Res. 12 (1980), 12-21]. Es wurde gefünden, daß EACA die Empfindlichkeit der osteoinduktiven Tests durch Erhöhung der Menge des gebildeten Knorpels und/oder des gebildeten Knochens und/oder durch Erniedrigen der Menge des benötigten, eine den Knorpel/Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteins erhöht.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Formulierung der erfindungsgemäßen Präparate, ebenso wie die Verwendung der Mittel zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung einer Reihe von Knochen- und/oder Knorpeldefekten und von periodontalen Erkrankungen. Die Arzneimittel können auch in Verfahren zur Behandlung verschiedener Typen von Wunden und bei der Gewebsreparatur verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Präparate werden einem Patienten, der eine solche Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebsreparatur benötigt, verabreicht. Das Verfahren betrifft daher die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Lysinanalogons, eines Serinprotease-Inhibitors oder eines anderen antifibrinolytischen Mittels und einer therapeutisch wirksamen Menge eines eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Diese Proteine umfassen beispielsweise mindestens eines der "BMP"-Proteine, die in den vorstehend beschriebenen Anmeldungen des gleichen Anmelders offenbart sind.
Ferner können diese Verfahren zusätzlich die Verabreichung anderer Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und PDGF umfassen.
Weitere Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den bevorzugten Ausführungsformen davon hervor.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäßen osteoinduktiven Arzneimittel umfassen EACA, ein Lysinanalogon, zusammen mit einem eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktor in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Andere synthetische Lysinanaloga, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden können, umfassen trans-p-Aminomethylcyclohexancarbonsäure (AMCA; Tranexamsäure).
Neben den vorstehend genannten Lysinanaloga können auch weitere Inhibitoren der Fibringerinnsellyse, beispielsweise Serinprotease-Inhibitoren, zusammen mit einem eine den Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktor von den erfindungsgemäßen Arzneimitteln umfaßt werden. Solche Serinprotease-Inhibitoren können beispielsweise Aprotinin, α&sub2;-Antiplasmin und α&sub2;-Makroglobulin umfassen. Ein weiteres fibrinolytische Mittel, das in den erfindungsgemäßen Arzneimittel nützlich sein kann, ist p- Aminomethylbenzoesäure.
Die eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktoren, die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln verwendet werden können, umfassen, allerdings ohne Beschränkung darauf, BMP-2, BMP-3 und BMP-4, die in den internationalen Veröffentlichungen WO 88/00205 und WO 89/10409 offenbart sind. Weitere eine den Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Proteine zur erfindungsgemäßen Verwendung umfassen BMP-5, BMP-6 und BMP-7, die in der veröffentlichten internationalen PCT-Anmeldung WO 90/11366 offenbart sind.
Die Verwendung von EACA in osteoinduktiven Arzneimitteln erhöht die Menge der Knochenbildung und/oder erniedrigt die Menge des benötigten, eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteins. Beispielsweise wird bei Vorhandensein von EACA signifikant mehr Knochenbildung sieben Tage nach der Implantation unter der Verwendung der gleichen Menge des eine den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktors, verglichen mit Arzneimitteln ohne EACA, beobachtet.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Arzneimittel weiter autologes Blut umfassen. Zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs wird die Matrix (nachstehend beschrieben) mit einer ausreichenden Menge an Patientenblut, EACA und Knorpel- /Knochenprotein vermischt. Die Eignung von autologem Blut basiert auf dessen Biokompatibilität und leichten Verfügbarkeit. Autologes Blut kann auch anstelle einer anderen Matrix verwendet werden. Weitere erfindungsgemäße Arzneimittel umfassen EACA (oder andere Fibrinolytika), autologes Blut und ein eine den Knorpel/Knochen betreffende Reaktion hervorrufendes Protein.
Zusätzlich zu dem Knorpel-/Knochenprotein können die Arzneimittel mindestens ein weiteres therapeutisch nützliches Mittel einschließlich Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (EGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor (PDGF), umfassen.
Die Arzneimittel können auch eine geeignete Matrix umfassen, beispielsweise zur Abgabe und/oder zum Tragen der Zusammensetzung und/oder zum Bereitstellen einer Oberfläche für die Knochen- und/oder Knorpelbildung. Die Matrix kann eine Sequestration des BMP-Proteins, eines anderen Knorpel-/Knochenproteins oder anderer Faktoren der Formulierung und/oder die geeignete Umgebung zur Präsentation der erfindungsgemäßen Formulierung liefern. Vorzugsweise umfaßt das Präparat für die Knorpel- und/oder Knochenbildung eine Matrix, die die den Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteine zu der Stelle des Knochen- und/oder Knorpelschadens befördern kann, eine Struktur zur Entwicklung von Knochen und Knorpel bereitstellen kann und optimal im Körper resorbiert werden kann. Solche Matrices können aus Materialien, die gegenwärtig für andere medizinische Implantierungsanwendungen verwendet werden, gebildet sein.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf der Biokompatibilität, der biologischen Abbaubarkeit, den mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinungsbild und den Grenzflächeneigenschaften. Die spezielle Anwendung der erfindungsgemäßen Arzneimittel definiert die geeignete Formulierung. Mögliche Matrices für die Präparate können biologisch abbaubares und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Poly(milchsäure), Poly(glykolsäure) und Polyanhydride ebenso wie "Coral" sein. Weitere mögliche Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen, Sehnen oder Hautcollagen. Weitere Matrices bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrixkomponenten. Weitere mögliche Matrices sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxylapatit, Bioglas ("bioglass"), Aluminate und andere Keramiken. Die Matrices können aus Kombinationen von jedem der vorstehend genannten Materialtypen, wie beispielsweise aus Poly(milchsäure) und Hydroxylapatit oder Collagen und Tricalciumphosphat hergestellt sein. Die Biokeramiken können in der Zusammensetzung verändert sein, wie beispielsweise bezüglich Calciumaluminatphosphat und so verarbeitet sein, daß die Porengröße, die Teilchengröße, die Teilchenform und die biologische Abbaubarkeit verändert sind.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in Verfahren zur Behandlung einer Reihe von Knochen- und/oder Knorpeldefekten und periodontalen Erkrankungen verwendet werden. Sie können auch in Verfahren zur Behandlung von verschiedenen Wundtypen und bei der Gewebsreparatur verwendet werden. Bei diesen Verfahren wird erfindungsgemäß ein erfindungsgemäßes Präparat einem Patienten, der eine solche Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebsreparatur benötigt, verabreicht. Bei dem Verfahren wird daher ein Lysinanalogon oder ein anderes antifibrinolytisches Mittel und eine therapeutisch wirksame Menge eines einen Knorpel und/oder einen Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht. Diese Verfahren können außerdem die Verabreichung von EACA und/oder einem einen Knorpel und/oder einen Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Protein zusammen mit anderen Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α TGF-β und PDGF umfassen.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, das die Knorpel- und/oder Knochenbildung unter Umständen, unter denen Knochen und/oder Knorpel normalerweise nicht gebildet werden, induziert, wird bei der Heilung von Knochenbrüchen und Knorpeldefekten bei Menschen und Tieren angewendet. Ein Präparat, bei dem Lysinanaloga, wie beispielsweise EACA, Serinprotease-Inhibitoren oder andere antifibrinolytische Mittel und ein den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufendes Protein verwendet werden, kann prophylaktisch bei der Behandlung sowohl eines geschlossenen als auch eines offenen Bruchs und auch bei der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken verwendet werden. Eine durch ein osteogenes Mittel induzierte de-novo-Knochenbildung trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder durch Tumorresektion induzierten kraniofazialen Defekten bei und ist auch in der kosmetischen plastischen Chirurgie nützlich. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können zur Behandlung von periodontalen Erkrankungen und bei anderen Zahnrepaturprozessen verwendet werden. Solche Arzneimittel liefern eine Umgebung, die die knochenbildenden Zellen anzieht, das Wachstum von knochenbildenden Zellen stimuliert oder die Differenzierung von Vorläuferzellen der knochenbildenden Zellen induziert.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können auch bei der Wundheilung und bei der verwandten Gewebsreparatur verwendet werden. Die Typen von Wunden umfassen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Verbrennungen, Schnittwunden und Geschwüre. Vergleiche z.B. PCT-Veröffentlichung WO 84/01106 bezüglich der Diskussion der Wundheilung und der verwandten Gewebsreparatur.
Die Herstellung von solchen physiologisch verträglichen Arzneimitteln liegt unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität, der Stabilität und dgl. im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns. Die Arzneimittel sind auch gegenwärtig für veterinärmedizinische Anwendungen infolge des offensichtlichen Fehlens von Artspezifität bei Knorpel- und Knochenwachstumsfaktorproteinen wertvoll. Haustiere und Vollblutpferde sind neben dem Menschen geeignete Patienten für eine solche Behandlung mit den erfindungsgemäßen Proteinen.
Bei dem therapeutischen Verfahren wird das Arzneimittel beispielsweise topisch, systemisch oder lokal als Implantat oder über eine Vorrichtung verabreicht. Bei Verabreichung liegt die therapeutische Formulierung zur erfindungsgemäßen Verwendung natürlich in einer pyrogenfreien, physiologisch verträglichen Form vor. Ferner kann die Formulierung zweckdienlicherweise verkapselt werden oder in einer viskosen Form zur Abgabe an die Stelle des Knorpel- und/oder Knochen- oder Gewebsschadens injiziert werden.
Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, die die Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels modifizieren, bestimmt. Faktoren, die die Wirkung des Arzneimittels modifizieren können, umfassen die Menge des Knochengewichts, das gebildet werden soll, den Ort des Knochenschadens, den Zustand des geschädigten Knochens, die Größe einer Wunde, den Typ eines beschädigten Gewebes, das Alter des Patienten, das Geschlecht und die Ernährung, die Schwere einer Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann mit dem Typ der Matrix, die zur Rekonstitution verwendet wird, und dem Typ oder den Typen von Knochen- und/oder Knorpelproteinen, die in dem Präparat vorhanden sind, variieren. Die Zugabe weiterer bekannter Wachstumsfaktoren, wie EGF, PDGF, TGFα, TGF-β, IGF-I und IGF-II zu dem abschließend erhaltenen Präparat, kann auch die Dosierung beeinflussen.
Die Konzentration des in den nachstehend beschriebenen Versuchen mit Schafen verwendeten EACA beträgt 10&supmin;³ M. EACA sollte eine große Sicherheitsspanne bei lokaler Verwendung besitzen, weil bis zu 30 g pro 24 h systemisch ohne Toxizität verabreicht werden können. [Hemostasis and Thrombosis Basic Principles and Clinical Practice (1988), 380-384; Stefanini et al., J. of Urology (1990), 143: 559-561].
Der Fortschritt kann durch die periodische Bewertung des Knorpel- und/oder Knochenwachstums und/oder der Reparatur, beispielsweise unter Verwendung von Röntgenstrahlen, histomorphometrischen Bestimmungen und Tetracyclinmarkierung, überwacht werden.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen davon hervor.

Beispiel 1

Sampath-Reddi-Test in einer Modifikation nach Rosen

Eine modifizierte Version des Rattenknochenbildungstests, der in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 80:6591-6595 beschrieben ist, wird verwendet, um die Aktivität hinsichtlich der Bildung von Knochen- und/oder Knorpel eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, umfassend EACA und/oder eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Proteine, zu bewerten. Dieser modifizierte Test wird hier als Rosen-Test bezeichnet. Der Ethanolfällungsschritt des Sampath-Reddi- Verfahrens wird durch Dialyse (wenn das Präparat eine Lösung ist) oder Diafiltration (wenn das Präparat eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. EACA (Amicar) wird in Wasser aufgelöst und zu 20 mg Rattenmatrix, die mit 0,1 % TFA und dem eine den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Protein benetzt ist, gegeben. Die Kontrollen umfassen Proben, die das eine den Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Protein ohne EACA enthalten. Dieses Material wird gefroren und lyophilisiert, und das so erhaltene Pulver wird in #5-Gelatinekapseln verschlossen. Die Kapseln werden subkutan in die abdominale Thoraxregion von 21 bis 49 Tage alten männlichen Long-Evans-Ratten implantiert. Die Implantate werden nach 7 bis 14 Tagen entfernt. Die Hälfte jedes Implantats wird für die Analyse der alkalischen Phosphatase verwendet [vgl. A.H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(1972), 69:1601].
Die andere Hälfte jedes Implantats wird fixiert und für die histologische Analyse weiterverarbeitet. Glykolmethacrylatschnitte (1 µm) werden mit von Kossa und saurem Fuschin oder Toluidinblau gefarbt, um die Menge der in jedem Implantat vorhandenen induzierten Knochen- und Knorpelbildung zu bewerten. Die Ausdrücke +1 bis +5 bezeichnen den Bereich jedes histologischen Abschnitts eines Implantats, der von neuen Knochen- und/oder Knorpelzellen und neu gebildeter Knochen- und/oder Knorpelmatrix eingenommen wird. Zwei Bewertungsmethoden sind hier beschrieben. Bei dem ersten Bewertungsverfahren zeigt eine Bewertung von +5 an, daß mehr als 50 % des Implantats neuer Knochen und/oder Knorpel ist, der als direktes Ergebnis des Proteins in dem Implantat erzeugt wurde. Eine Bewertung von +4, +3, +2 und +1 zeigt an, daß mehr als 40 %, 30 %, 20 % bzw. 10 % des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthalten. Das zweite Bewertungsverfahren (das nachstehend als das modifizierte Bewertungsverfahren bezeichnet werden kann) ist wie folgt: drei nicht-benachbarte Abschnitte werden von jedem Implantat bewertet und der Durchschnitt wird ausgerechnet. "+/-" zeigt eine vorsichtige Identifikation von Knorpel und/oder Knochen an; "+1" zeigt an, daß mehr als 10 % jedes Abschnitts neuer Knorpel oder Knochen ist; "+2",> 25 %; "+3",> 50 %; "+4", 75 %; "+5"> 80 %. Die Bewertungspunkte der einzelnen Implantate werden tabellarisch aufgeführt, um die Variabilität des Tests anzuzeigen.
Wie bei anderen eine den Knorpel und/oder den Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Proteinen, so wie beispielsweise bei den vorstehend genannten "BMP"- Proteinen, ist der gebildete Knochen und/oder Knorpel vermutlich physikalisch auf den von der Matrix eingenommenen Raum beschränkt. Die Implantate, die die Rattenmatrix enthalten, der spezifische Mengen von "BMP"-Protein oder EACA und "BMP"-Protein zugesetzt wurden, werden den Ratten nach etwa 7 Tagen entnommen und für die histologische Bewertung weiterverarbeitet. Repräsentative Abschnitte aus jedem Implantat werden bezüglich der Anwesenheit von neuem Knochenmineral mit von Kossa und saurem Fuchsin angefärbt, und auf die Anwesenheit von knorpelspezifischer Matrixbildung unter Verwendung von Toluidinblau untersucht. Die Zelltypen, die innerhalb des Abschnitts vorhanden sind, ebenso wie das Ausmaß, in dem diese Zellen einen Phänotyp zeigen, werden abgeschätzt und bewertet.

Beispiel II

Biologische Aktivität von EACA und BMP-2 im Rosen-Test

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Arzneimittel, die EACA und BMP-2 umfassen, wird in dem vorstehend beschriebenen Rosen-Test getestet. Die Versuche umfassen BMP-2, EACA und autologes Blut, ebenso wie BMP-2 und autologes Blut ohne EACA. Negative Kontrollen ohne Rattenmatrix umfassen BMP-2 allein, BMP-2 und autologes Blut und BMP-2 mit autologem Blut und EACA. EACA wird in Wasser aufgelöst und der mit 0,1 % TFA und BMP-2 benetzten Rattenmatrix zugesetzt [beschrieben in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 88/00205; PNAS, (USA) (März 1990), 87:2220-2224]. EACA-Mengen im Bereich von 13 µg bis 6,9 mg werden pro 20 mg an entmineralisiertem, mit Guanidiniumchlorid extrahiertem Rattenknochen oder von 1 mM bis 0,5 M, bezogen auf ein Volumen von 100 µg pro Implantat, zugesetzt. Die Proben werden eingefroren und gefriergetrocknet und den Ratten 7 Tage lang implantiert. Das modifizierte Bewertungsverfahren wird verwendet. In Versuchen mit autologem Blut wird BMP-2 mit EACA vermischt und in einem siliconbeschichteten Glasröhrchen lyophilisiert. 100 bis 200 µl autologes Blut werden der Ratte durch Orbitalpunktion entnommen und dann dem Röhrchen zugesetzt. Das Blut wird 1 bis 2 h lang gerinnen gelassen. Wenn es fest ist, wird das Gerinnsel entfernt und subkutan implantiert.
Die Menge an gebildetem Knochen und/oder Knorpel nimmt mit der Verwendung von EACA, verglichen mit Proben, denen EACA fehlt, zu, wenn die gleiche Menge an Knorpel-/Knochenprotein verwendet wird. Die Kontrollproben führten zu keiner Knochenund/oder Knorpelbildung. So erhöht EACA in der Gegenwart der Rattenmatrix die Menge des gebildeten Knochens, verglichen mit BMP-2 ohne EACA, bei einer mäßigen Dosis. EACA erhöht die Menge an Knorpel, der bei einer sehr niedrigen Dosis beobachtet wird. Höhere Mengen an BMP-2 führen zu einer Erhöhung der Menge des gebildeten Knorpels und Knochens (in der Summe) und zu einem rascheren Auftreten von Knochen.
Blut als Matrix erhöht drastisch die Empfindlichkeit von BMP-2, verglichen mit BMP-2 ohne Blut. Die Wiedergewinnung jedes Implantats ist in Abwesenheit von Blut generell recht gering. Das Weglassen von EACA in diesen Implantaten führt zu einer niedrigeren Wiedergewinnung der Aktivität und der Implantate.

Beispiel III

Biologische Aktivität von EACA und BMP-2 in einem Schafmodell

Ein osteoperiostealer Defekt wird durch Herausschneiden eines 2,5 cm großen Mittelstücksegments aus dem rechten Oberschenkeiknochen eines, bezogen auf das Skelett, erwachsenen Schafes erzeugt. Mark und das Periosteum werden aus den exponierten Enden entfernt, und die 2,5 cm große Lücke wird mit einer anterolateralen Metallfixierungsplatte stabilisiert. Unterschiedliche Materialien werden verwendet, um die Lücke in jeder der vier Gruppen von Tieren aufzufüllen: (1) autologes Knochentransplantat aus der Knochenrinde und dem Darmbeinkamm; (2) kein Implantat; (3) rekombinantes menschliches BMP-2, vorstehend beschrieben, gemischt mit inaktiver Knochenmatrix, umfassend gemahlenen entmineralisierten und mit Guanidiniumchlorid extrahierten und sterilisierten Schafknochen plus EACA; und (4) inaktive Knochenmatrix und EACA. Das hochgereinigte menschliche BMP-2, das in Säugerzellen exprimiert wird, wird mit inaktiver Knochenmatrix rekonstituiert, gefroren und lyophilisiert. Nach der Lyophilisation wird das Blut zugesetzt. EACA wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt.
Radiographien des Oberschenkelknochens werden wöchentlich durchgeführt. Die Tiere werden 12 Wochen nach der Operation getötet und an den Gliedmaßen wird eine biomechanische Testung (Vier-Punkt-Beugung bis zum Bruch) mit anschließender histologischer Analyse durchgeführt.
Der unbehandelte Defekt [Gruppe (2)] und der mit inaktiver Matrix behandelte Defekt [Gruppe (4)] zeigten anhand der Radiographie keine Heilung in der Woche 12. Alle mit BMP-2 behandelten Defekte [Gruppe (3)] zeigten in der Radiographie eine neue Knochenbildung, beginnend mit Woche 5 und fortschreitend bis zum Zusammenwachsen bis Woche 12. Die mit autologen Transplantaten behandelten Defekte [Gruppe (1)] zeigten auch ein Zusammenwachsen in der Woche 12. Die radiographischen Beflinde wurden durch die makroskopische Analyse bestätigt; Proben aus den Gruppen (2) und (4) wurden nach 12 Wochen untersucht und zeigten eine makroskopische Bewegung bei einem faserigen Gewebssaum um die segmentierte Defektstelle, während die mit dem autologen Transplantat und mit BMP-2 behandelten Stellen steif waren. Die biomechanische Testung unterstützte diese Ergebnisse. In Woche 12 betrug die relative Beugungsfestigkeit [ausgedrückt als Prozentsatz des kontralateralen intakten Oberschenkelknochens] 111 % für das autologe Transplantat, 16 % für die Gruppen (2) und (4) und 91 % für die mit BMP-2 behandelten Defekte. Die histologische Analyse eines mit BMP-2 behandelten Defekts zeigte den Nachweis einer neuen endochondralen Knochenbildung zwei Wochen nach der Operation.

Beispiel IV

Orthotopes Rattenmodell

Ein 5 mm großer osteoperiostealer Segmentdefekt (2 x Diaphysen-Durchmesser) wird im Mittelschaft des Oberschenkeiknochens von 325 bis 350 g schweren Sprague- Dawley-Ratten erzeugt. Die interne Fixierung wird mit einer Polyethylenplatte mit vier Löchern, die mit 0,062 mm aufgefädelten Kirschner-Drähten fixiert ist, erzielt. Das Knochenmark wird aus der intramedullären Höhle an jeder Seite der durchtrennten Knochen herausgespült. Zwei getrennte Versuche, bei denen das orthotope Rattenmodell verwendet wird, werden nachstehend beschrieben.
A. Drei Gruppen zu 15 Ratten werden wie folgt untersucht:
Gruppe I: Eine Rattenmatrix wird in den Defekt als Kontrolle implantiert.
Gruppe II: Eine Rattenmatrix, EACA und 1 µg BMP-2 werden als niedrige Testdosis implantiert.
Gruppe III: Eine Rattenmatrix, EACA und 8 µg BMP-2 werden als hohe Testdosis implantiert.
EACA wird zu 1 mM Endkonzentration (unter der Annahme eines Volumens von 50 µl) gleichzeitig mit BMP-2 den entmineralisierten, mit Guanidmiumchlorid extrahierten Rattenknochen zugesetzt. Die Probe wird gefroren und lyophilisiert. Alle Ratten werden am Tag 7 auf Effekte hinsichtlich der Gefaßbildung unter Verwendung eines dynamischen quantitativen Knochen-Scannings über eine intrakardiale Injektion bewertet. Das Verhaltnis der über 60 s aufgezeichneten Gesamt-Counts des operierten Oberschenkelknochens im Vergleich zum normalen Oberschenkelknochen wurde dann für jede Ratte bestimmt.
Die Knochenbildung wird mit aufeinanderfolgenden Radiographien, die nach 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 9 Wochen durchgeführt werden, in allen Ratten bewertet. Die Fläche des Defekts, die von Knochen eingenommen wird, wurde planimetrisch auf lateralen Radiographien bewertet und für jede Ratte aufgezeichnet (als Prozentsatz der gesamten Defektfläche).
Eine Ratte wird jede Woche für die histologische Analyse getötet. Gewebe aus dem transplantierten Bereich und sein umgebender Knochen wird herausgeschnitten, von Calcium befreit, sektioniert und mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Die histologischen Befünde wurden für parallel zu der longitudinalen Achse des Knochens entnommene Sektionen, die sich über die Gesamtlänge des Defekts erstreckten, aufgezeichnet.
Die Ratten, in denen ein Zusammenwachsen um den Defekt auftritt, werden einer mechanischen Torsionstestung bis zum Bruch zur Bestimmung des maximalen Drehmoments, der Winkelverschiebung, der Energieabsorption und der Steifheit des operierten Oberschenkelknochens unterworfen, wobei die Ergebnisse mit dem kontralateralen normalen Oberschenkeiknochen verglichen werden.
B. Vier Gruppen von Ratten werden wie folgt untersucht:
Gruppe I: BMP-2 und autologes Blut werden in den Defekt implantiert.
Gruppe II: BMP-2, autologes Blut und EACA werden in den Defekt implantiert.
Gruppe III: Eine PLGA-Matrix, BMP-2 und autologes Blut werden in den Defekt implantiert.
Gruppe IV: Eine PLGA-Matrix, BMP-2, autologes Blut und EACA werden in den Defekt implantiert.
Die Menge von BMP-2 beträgt 15 µg, 5 µg und 1,5 µg mit 0,5 M Arg in Imidazolpuffer, pH-Wert 6,5. Die Menge an EACA pro Implantat beträgt 10 mM. BMP-2 und EACA werden zu 56 µl autologem Blut gegeben. Nach Vermischen wird die Blutlösung zu den PLGA-Teilchen (80 µl, ca. 24 mg), wie nachstehend beschrieben, gegeben und gründlich vermischt. Nach 90 bis 120 min wird das Gerinnsel in die Oberschenkelknochenöffhung der Ratte implantiert.
Die porösen PLGA-Teilchen [ein 50:50 (molar) Zufalls-Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure (PLGA) mit einem Molekulargewicht-Zahlenmittel von 30 bis 40 K, einem Molekulargewicht-Zahlenmittel von etwa 20 K (ausgedrückt als GPC, bezogen auf Polystyrolstandards) und einer inhärenten Viskosität von 0,35 bis 0,45 dl/g] werden durch eine Lösungsmittelverdampfüngstechnik hergestellt. PLGA wird in CH&sub2;Cl&sub2; (15 % Gew./Vol.) aufgelöst, und Porosigen wird in dieser Lösung suspendiert. Die so erhaltene Lösung wird zu einem Überschuß einer wäßrigen Poly(vinylalkohol)-Lösung (0,1 % Gew./Vol.) gegeben. Nach ein paar Stunden Rühren werden die Teilchen in einem Überschuß kaltem Ethanol (95 %) gehärtet. Die so erhaltenen Teilchen werden mit WFI gewaschen und lyophilisiert, wodurch ein rieselfähiges Produkt erhalten wird.
Die Ratten werden nach 9 Wochen getötet. Die ex vivo-Analyse des neuen Knochens wird radiographisch, bezogen auf den kontralateralen Oberschenkelknochen, durchgeführt. Vorläufige Ergebnisse, die nach drei Wochen gewonnen wurden, zeigen, daß das Vorhandensein von EACA bei geringfügigen Dosen (5 µg) und niedrigen Dosen (1,5 µg) an BMP-2 das Ausmaß des Zusammenwachsens zu erhöhen scheint, das, verglichen mit den Kontrollen ohne EACA, beobachtet wird. Die vorläufigen Daten zeigen eine geringere Wirkung von EACA bei höheren Dosen (15 µg) BMP-2 im Vergleich zu niedrigeren Dosen an. EACA scheint insbesondere die Antwort in den BMP-2/autologes Blut-Implantaten zu erhöhen.

Claims

1. Arzneimittel, umfassend ein antifibrinolytisches Mittel und eine therapeutisch wirksame Menge eines eine Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktors in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei das antifibrinolytische Mittel ausgewählt ist aus Lysinanalogen oder Serin proteaseinhibitoren.

3. Arzneimittel, umfassend E-Aminocapronsäure und eine therapeutisch wirksame Menge eines eine Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktors in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

4. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der eine Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Faktor ausgewählt ist aus BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP- 5, BMP-6 oder BMP-7.

5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, außerdem autologes Blut umfassend.

6. Arzneimittel nach Anspruch 1, außerdem eine pharmazeutisch verträgliche Matrix umfassend.

7. Arzneimittel nach Anspruch 1, außerdem einen Wachstumsfaktor, ausgewählt aus IGF-I, IGF-II, PDGF, FGF, EGF, TGF-α oder TGF-β, umfassend.

8. Arzneimittel, umfassend BMP-2, E-Aminocapronsäure, autologes Blut und eine PLGA-Matrix.

9. Verfahren zur Formulierung eines eine Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Arzneimittels durch Kombinieren von E-Aminocapronsäure mit mindestens einem eine Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktor.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der eine Knochen betreffende Reaktion hervorrufende Faktor ausgewählt ist aus BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 oder BMP-7.

11. Verwendung eines Lysinanalogen und einer therapeutisch wirksamen Menge eines eine Knorpel und/oder Knochen betreffende Reaktion hervorrufenden Faktors in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Knorpel- und/oder Knochendefekten.

12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Lysinanaloge &epsi;-Aminocapronsäure ist.

13. Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei der Serinproteaseinhibitor ausgewählt ist aus Aprotinin, α&sub2;-Antiplasmin oder α&sub2;-Makroglobulin.