JP6144049B2 - 腱障害を処置するための血小板由来成長因子組成物及び方法 - Google Patents

Description

＜関連出願の相互参照＞
本願は、その全体を参照により本明細書に援用する、２０１０年２月２２日付で提出された米国仮特許出願第６１／３０６，９３８号、２０１０年３月５日付で提出された米国仮特許出願第６１／３１１，２８４号、２０１０年１２月３０日付で提出された米国仮特許出願第６１／４２８，８０９号、及び２０１１年１月３日付で提出された米国仮特許出願第６１／４２９，４２８号の利益を主張する。

技術分野
本発明は、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎又は「テニス肘」、内側上顆炎又は「ゴルフ肘」、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害を含む腱鞘炎、腱症、又は腱炎等の腱障害を処置するための組成物及び方法に関し、特に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含む組成物を投与することにより腱障害を処置する方法に関する。

腱は、通常筋肉を骨に連結する繊維性結合組織の強靭な帯である。腱の弾性特性により、歩行運動中の力が調節され、能動的な作業なしに安定性が向上する。また、腱はエネルギーを高い効率で貯蔵して取り出す。通常の健康な腱は、密に詰まったＩ型コラーゲン繊維の平行な配列から主に構成されるが、少量のエラスチン及び少量のプロテオグリカンも含む。高度に特化した超微細構造、低レベルの血管新生、ゆっくりなコラーゲンの代謝回転のため、腱は、損傷すると治癒が非常に遅く、その本来の強度を取り戻すことはほとんどない。部分的な裂傷は、組織の乱れた（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）ＩＩＩ型コラーゲンの急速な産生により治るが、これは通常の腱よりも弱い。腱の損傷領域では損傷の再発がよく起こる。

腱障害は、慢性的な腱の疾患又は損傷であり、酷使又は加齢による腱への徐々な消耗及び裂傷による異化反応と同化反応の不均衡によるものと考えられる。この不均衡の結果が、腱の変性、弱さ、裂傷、及び疼痛である。一方、例えば腱断裂又は骨からの剥離等の急性の腱損傷は、非常に突発的であり、通常、断裂を修復するか骨に腱を再接合するための手術が必要である。腱障害は誰でも起こり得るが、仕事、スポーツ、又は通常の日常的作業で同じ動きを何度も繰り返しがちな人で起こり易い。腱障害は通常、患部における疼痛、硬直（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、及び強度低下を引き起こす。

腱障害という用語は、腱症及び腱炎の２種類の腱損傷を指す。この用語はまた、屈筋腱、アキレス腱等の特定の腱で起こる腱の外側の内層の腱障害である腱鞘炎も含む。

腱症とは、酷使により生じる、通常は腱の内部及び周囲の組織における微小断裂（ｍｉｃｒｏｔｅａｒ）の形態である腱の腱内変性を特徴とする腱の非炎症性損傷であり、これにより損傷部分周辺の腱修復細胞の数が増える。腱の変性は、腱のコラーゲン繊維、細胞、及び血管構成要素へのダメージ又はこれらの組織崩壊（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）により生じ、これは、処置されないと、腱の引張強度を低下させることがあり、腱断裂を招くことがある。コラーゲン組織化の変化は、繊維の分離／弛緩／縮み（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）、平行な配向性の消失、繊維直径の縮小、及びコラーゲンの全体的密度の低下により特徴付けられる。更に、赤血球、フィブリン、及びフィブロネクチンの沈着物に囲まれたコラーゲンの微小断裂も起こり得る。一方、ＩＩＩ型（修復性）コラーゲンは増加する。これらのマトリックス組成変化は、偏光顕微鏡下での複屈折の低下につながり得る。コラーゲンの含有量及び組織化に加え、腱症は更に、患部におけるムコイド間質物質（プ
ロテオグリカン）の増加及び細胞密度の変化を特徴とする。一部の領域は、異常に多くの腱細胞を含み、これらは、核が丸くなっており、プロテオグリカン及びタンパク質の生産増大の超微細構造的証拠を示す。一方、腱の患部以外の領域は、濃縮された小さな核を有する、通常よりも少ない腱細胞を含み得る。腱症の別の特徴は、毛細血管及び細動脈の増殖である。腱症における腱変性の複数のサブカテゴリーが電子顕微鏡法により同定されている。すなわち、（１）低酸素性変性、（２）ヒアリン変性、（３）ムコイド変性又は粘液様変性、（４）フィブリノイド変性、（５）リポイド変性、（６）石灰化、及び（７）線維軟骨及び骨の化生である。これらの病変は、解剖学的な部位及びそれを引き起こした損傷の性質（例えば、低酸素対機械的負荷；急性損傷対慢性損傷）に応じて、様々な罹病率で同時に存在し得る。例えば、ムコイド変性領域は、光学顕微鏡で、大きなムコイドパッチ及び繊維間の空胞を特徴とする。しかし、リポイド変性は、コラーゲン繊維構造の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を引き起こす腱内への脂質の異常な蓄積を特徴とする。場合によっては、腱症は、腱の巣状壊死又は石灰化を伴う。これは、関節周辺の慢性的な疼痛の非常によくみられる原因である。腱症はまた、初期炎症反応がないことを特徴とする。炎症細胞は、修復プロセスの初期段階のメディエーターであると考えられ、これがないと腱症が慢性的な状態となる。

腱症に伴うコラーゲンマトリックスの組織崩壊（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び水分の特徴的な増加は、超音波検査又は磁気共鳴画像法によって診断することができる。症状は、腱の局所領域における単純な疼痛及び硬直から、損傷を受けた腱周辺の関節全体を囲む灼熱感まで様々であり得る。多くの患者で、疼痛は活動中及び活動後に悪化することが多く、翌日、腫れが腱の動きに影響し、腱及び関節領域がより硬くなることがある。

腱炎は、腱症で観察されるような変性を特徴とするが、血管破壊及び炎症修復反応を伴う腱の炎症を伴う、腱への炎症性の損傷である。腱炎は、しばしば、線維芽細胞及び筋線維芽細胞の増殖並びに出血及び組織化している肉芽組織を伴う。一般的に、腱炎は、アキレス腱炎（アキレス腱に発症する）又は膝蓋腱炎（膝蓋腱に発症する「ジャンパー膝」としても知られる）のように、関与する身体部分を用いて言及されるが、外側上顆炎（短橈側手根伸筋腱に発症する「テニス肘」としても知られる）等の例外もある。症状は、痛み又は疼痛及び局所的硬直から、炎症した腱周辺の関節全体を囲む灼熱感まで様々であり得る。場合によっては、腱炎は、腫れ（熱及び発赤を伴うこともある）を特徴とし、関節周囲における目に見える節（ｋｎｏｔ）があることもある。多くの患者で、疼痛は通常、活動中及び活動後に悪化し、翌日、腱の動きにより筋肉が固くなるため、腱及び関節領域がより硬くなる。

現在の処置は主に対症的な性質であり、腱症は炎症反応を伴わない傾向があるにも関わらず、従来から、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド注射、及び理学療法を用いた処置を含む抗炎症処置が処置の焦点となっている。より最近になって、衝撃波療法、低出力レーザー治療、硬化療法、及び他の実験的処置が試験された。多くの場合、いくつかの処置（例えばＮＳＡＩＤ及びコルチゾン注射）は短期間の軽減をもたらすようであるが、現行の処置による長期間の効果は不明瞭なままである。したがって、既存の処置様式と比べて長期間の効果を提供する腱障害を処置するための改善された方法が必要とされている。

ＰＤＧＦは、血小板のα顆粒中に貯蔵され、マクロファージ、線維芽細胞、及び内皮細胞を含む局所的に活性化された細胞によって組織修復中に分泌される。ＰＤＧＦ−ＢＢは、急性腱損傷の出血及び炎症の主な生成物の１つである。血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）は、創傷治癒タンパク質であり、骨（骨芽細胞）及び腱（腱細胞）の細胞を含む間葉起源の細胞に走化性（細胞遊走）及び分裂促進性（細胞増殖）であることが知
られている。更に、ＰＤＧＦ−ＢＢは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をアップレギュレートして血管形成（血管再生）を増加させることが示されており、これは再生プロセスの成功に必須である。

アキレス腱は、人体で最も太くて強い腱であり、大きな荷重を支えることを可能にする。アキレス腱が機能する機械的荷重環境は、アキレス腱を断裂し易くする。アキレス腱断裂は種々の要因によって起こり得るが、多くの場合、断裂は変性的変化に関連する（非特許文献１）。修復プロセス後、断裂したアキレス腱では、Ｉ型コラーゲンが減少し、ＩＩＩ型コラーゲンの量が相対的に増加している。この組成変化により、交差結合が減り、引張強さが低下する。治癒した後でも、細胞過形成、組織崩壊、及びコラーゲン交差結合の減少のため、断裂したアキレス腱は弱いままである（非特許文献２）。アキレス腱断裂の最適な処置については論争があり、保存的（非手術的）及び外科的治療の両方に賛否両論がある。非手術的処置では、再断裂率が高くなり、強度が低下するが、手術に関連する費用及びリスクが避けられる（非特許文献３〜５）。手術的修復には手術及び麻酔のリスクがあるが、強度が増大し、再断裂率がより低く、より早期に運動競技活動に復帰できる（非特許文献４及び６）。急性アキレス腱断裂の処置に対する医師の好みに関わらず、活動的な患者集団におけるこれらの損傷の様々な処置の中で手術的修復はその役割を有し続けるであろう。生物学的修復プロセスの増強により腱の治癒を向上させることにより、現行の処置様式と比べて、活動へのより速い復帰及び臨床的転帰の向上が実現され得る。

腱の治癒の生物学的増強に関する複数のインビボ及びインビトロでの研究がなされている。例えば非特許文献７〜１３を参照されたい。

十分な量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを適切なタイムコースで修復部位に送達することが所望の臨床的効果を達成するために重要である。複数の研究が、生体物質でコーティングされた縫合糸を記載している。例えば、非特許文献１４〜１７を参照されたい。

Mafulli N, Wong J, Almekinders L. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinics in Sports Medicine. 2003;22:675-692 Maffulli N, Moller HD, Evans CH. Tendon Healing: Can it be Optimized? British Journal of Sports Medicine, 2002;36:315-316 Inglis AE, Scott WN, Sculco TP, et al. Ruptures of the tendo achillis: an objective assessment of surgical and non-surgical treatment. J Bone Joint Surg Am. 1976;58:990-993 Nistor L. Surgical and Nonsurgical treatment of Achilles tendon rupture: a prospective randomized trial. J Bone Joint Surg Am 1981 63(3):394-9 Chalmers J. Review Article: Treatment of Achilles tendon ruptures. Journal of Orthopaedic Surgery 200 8(l):97-99 Rettig A, Liotta FJ, Klootwyk TE, Porter DA, Mieling P. Potential Risk of Rerupture in Primary Achilles Tendon Repair in Athletes Younger than 30 years of Age. Am J of Sports Med 2005:33(1): 119-123 Seeherman HJ, Archambault JM, Rodeo SA, et al. rhBMP-12 accelerates healing of rotator cuff repairs in a sheep model. J Bone Joint Surg Am. 2008;90(10):2206-2219 Chan BP, Fu SC, Qin L, et al. Supplementation-time dependence of growth factors in promoting tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 2006;448:240-247 Uggen JC, Dines J, Uggen CW, et al. Tendon gene therapy modulates the local repair enviroment in the shoulder. J Am Osteopath Assoc. 2005;105(1):20-21 Gelberman R, Thomopoulos S, Sakiyama-Elbert S, et al. The early effects of sustained platelet-derived growth factor administration on the functional and structural properties of repaired intrasynovial flexor tendons: an in vivo biomechanic study at 3 weeks in canines. J Hand Surg Am. 2007;32(3):373-379 Thomopoulos S, Das R, Silva MJ, et al. Enhanced flexor tendon healing through controlled delivery of PDGF-BB. J Orthop Res. 2009;27(9): 1209-1215 Thomopoulos S, Zaegel M, Das R, et al. PDGF-BB released in tendon repair using a novel delivery system promotes cell proliferation and collagen remodeling. J Orthop Res. 2007;25(10): 1358-1368 Dines J, Grande D, Dines D. Tissue Engineering and Rotator Cuff Tendon Healing. J Shoulder Elbow Surg, Sept/Oct 2007: 204S-206S Rickert M, Jung M, Adiyaman M, Richter W, Wimank HG. Growth and differentiation factor 5 coated suture stimulates tendon healing in an Achilles tendon model in rats. Growth Factors 2001;19: 115-126 Weiler A, Forster C, Hunt P, Falk R, Jung T, Unterhauser FN, Bergmann V, Schmidmaier G, Haas NP. The Influence of Locally Applied Platelet-Derived Growth Factor-BB on Free Tendon Graft Remodeling After Anterior Cruciate Ligament Reconstruction. American Journal of Sports Medicine 2004; 32(4):881-891 Dines J, Weber L, Razzano P, et al. The Effect of GrowthDifferentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a Rat Model. J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S Uggen C, Dines J, McGarry M, et al. The effect of Recombinant Human Platelet Derived growth Factor BB coated sutures on Rotator cuff Healing in a Sheep Model. Arthroscopy: 2010:26(11): 1456-1462

例えば断裂したアキレス腱等の断裂した腱の修復のための、ＰＤＧＦを腱に送達するための改善された縫合糸が必要とされている。

一態様では、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む有効量の組成物を患部に投与することを含む腱障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、腱障害は腱症である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱鞘炎である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約７５〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５００〜約１，０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５，０００〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約４５０〜約３０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約４００〜約１０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いく
つかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５００〜約９００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約６００〜約８００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約６５０〜約７５０μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約７００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．０〜約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約１０〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約４．０〜約７．０である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約６である。いくつかの実施形態では、投与は患部への直接注射による。いくつかの実施形態では、患部は骨−腱接合部である。いくつかの実施形態では、患部は腱である。いくつかの実施形態では、腱障害は、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱障害は外側上顆炎である。いくつかの実施形態では、組成物は単回投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は単回注射により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は２回以上の投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、週１回の単回注射により４週間投与される。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６０％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６５％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８０％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８５％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約９０％に達する。

別の態様では、ＰＤＧＦ及びバッファーからなる有効量の組成物を患部に投与することを含む腱障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、腱障害は腱症である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱鞘炎である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約７５〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５００〜約１，０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５，０００〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約４５０〜約３０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約４００〜約１０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５００〜約９００μｇのＰ
ＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約６００〜約８００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約６５０〜約７５０μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約７００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．０〜約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約１０〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約４．０〜約７．０である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約６である。いくつかの実施形態では、投与は患部への直接注射による。いくつかの実施形態では、患部は骨−腱接合部である。いくつかの実施形態では、患部は腱である。いくつかの実施形態では、腱障害は、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱障害は外側上顆炎である。いくつかの実施形態では、組成物は単回投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は単回注射により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は２回以上の投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、週１回の単回注射により４週間投与される。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６０％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６５％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、本方法により、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８０％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８５％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約９０％に達する。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＤＧＦ及びバッファーからなる有効量の組成物を患部に投与することからなる。

別の態様では、有効量のＰＤＧＦ及びバッファーを含む、腱障害の処置に使用するための組成物を提供する。いくつかの実施形態では、腱障害は腱症である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱鞘炎である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。 いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒト
（ｒｈ）ＰＤＧＦ−ＢＢである。 いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約
７５〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約５００〜約１，０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約５，０００〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約４５０〜約３０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約４００〜約１０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約５００〜約９００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用
量当たり約６００〜約８００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約６５０〜約７５０μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量は、１用量当たり約７００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．０〜約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態では、組成物の体積は１用量当たり約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約１０〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約４．０〜約７．０である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約６である。いくつかの実施形態では、処置は、直接注射により組成物を患部に投与することを含む。いくつかの実施形態では、患部は骨−腱接合部である。いくつかの実施形態では、患部は腱である。いくつかの実施形態では、腱障害は、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱障害は外側上顆炎である。いくつかの実施形態では、組成物は単回投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は単回注射により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は２回以上の投与により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、週１回の単回注射により４週間投与される。いくつかの実施形態では、処置により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６０％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約６５％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、投与から約７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８０％に達する。いくつかの実施形態では、処置により、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約８５％に達する。いくつかの実施形態では、処置により、腱は、投与から約７日以内に、投与の約２１日後に測定される最終強度の少なくとも約９０％に達する。いくつかの実施形態では、組成物は、有効量のＰＤＧＦ及びバッファーからなる。

別の態様では、特に断りのない限り又は特定の文脈から明らかであるように、本明細書に記載されている方法に関連する本明細書に記載されているＰＤＧＦ組成物の使用を提供する。本明細書に記載されているＰＤＧＦ組成物は、本明細書に記載されている方法で使用するための医薬の製造に使用することもできる。

腱細胞の細胞遊走に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置の影響を示す図である。 ＢｒｄＵの取込みにより測定した、腱細胞の細胞増殖に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置の影響を示す図である。 右脚（ｒｉｇｈｔ ｌｅｇ）の腱−踵骨接合部の注射部位を示す図である。注射は２８．５Ｇの針を付けたインスリン注射器で行った。 生化学検査用に試験動物を処理した後のラット中足−アキレス−腓腹筋複合体の代表的画像を示す図である。 踵骨（Ｃ）−アキレス腱（Ｔ）結合部位の外側縁から得た矢状切片の代表的画像を示す図である。 処置７日後のコラゲナーゼ誘発ラットアキレス腱損傷モデルにおいて組換えヒト血小板由来成長因子アイソフォームＢＢ（「ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ」）を腱内に適用した場合の腱成長の肉眼的観察における用量反応研究の結果を示す図である。中用量（１０．２μｇ）又は高用量（１０２μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの単回注射では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置７日後に腱の大きさが有意に増加していた。 同じ実験のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置２１日後の結果を示す図である。腱のサイズに対する高用量（１０２μｇ）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ単回注射の影響は、酢酸ナトリウムバッファーだけを注射した場合の処置２１日後の影響と同程度であった。 図６Ａ及び６Ｂと同じデータを別の表し方で示したものであり、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目の肉眼による腱の大きさを示している（０＝成長なしから、３＝著しい成長まで）。 ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目における踵骨付着点における腱の幅（μｍ±ＳＥＭ）を示す図である。 ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目の腱本体の幅（μｍ±ＳＥＭ）を示す図である。 ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目における細胞増殖（細胞数±ＳＥＭ）に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響を示す図である。 ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目におけるアキレス腱の力学的特性、すなわち断裂までの最大荷重（Ｎ±ＳＥＭ）を示す図である。 静脈内（ＩＶ）投薬後の平均血清ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度−時間を示す図である。 腱内（ＩＴ）投薬後の平均血清ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度−時間を示す図である。 図１４Ａは、各時点で４−０バイクリル縫合糸から放出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量のインビトロ放出プロファイルを示す図である。 図１４Ｂは、４−０バイクリル縫合糸からの４８時間にわたるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのインビトロ累積放出量（平均±ＳＥＭ）を示す図である。 図１４Ｃは、縫合糸コーティング溶液中の初期ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度に対する、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの推定インビボ累積用量を示す図である。 図１４Ｄは、植え込まれた４−０バイクリル縫合糸の長さを示す図である。

限定されるものではないが特許、特許出願、及び科学文献を含む本明細書中に引用される全文献の全体を参照により本明細書に援用する。

本発明の組成物及び方法により、驚くべきことに、腱障害の処置が改善される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法により、腱の強度が上昇し、腱強度の回復速度が上昇する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法により腱の強度が上昇する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法により、腱強度回復速度が上昇する。例えば、損傷後に腱が治る際に、腱の治癒プロセスとして腱の生体力学的強度が上昇する。本発明の組成物の投与により、腱の強度がより急速に上昇し得る。理論により限定されるものではないが、このより急速な強度上昇は、荷重負荷により腱損傷が更に増えなければ、腱の治癒促進に有用であり得、腱への荷重負荷は、一般的に組織のリモデリング及び再組織化（ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を向上させるので、腱の治癒反応を向上させる。（例えば本発明の組成物の投与により）腱強度が初期により速く上昇することで、腱への荷重負荷をより迅速に始めることができ得、そのため腱の治癒反応が更に改善され得る。理論により限定されるものではないが、腱の強度の向上は、細胞増殖及び／若しくは細胞外マトリックス産生の増加により、並びに／又は組織構築の改善（例えば、細胞外マトリックスの組織化の改善）により起こり得る。

更に、理論により限定されるものではないが、本発明者らは、驚くべきことに、本発明
の組成物を腱に（例えば注射により）直接投与した時に、ＰＤＧＦが投与部位（例えば注射部位）に局在し続けることを見出した。例えば、後述する実施例５に更に詳細に説明されるように、バッファー中に含まれるＰＤＧＦからなる組成物の投与によりＰＤＧＦが注射部位に局在したままになることは予想されていなかった。

定義
本明細書において、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、処置される障害（例えば、腱症、腱炎、又は腱鞘炎等の腱障害）の臨床的病状の自然な課程を変化させるようにデザインされた臨床的介入を指す。処置の望ましい効果としては、例えば、患部関節若しくは手足の疼痛若しくは硬直の軽減、患部関節若しくは手足の可動性及び強度の上昇、腱障害進行速度の低下、炎症の軽減、腱の強度の上昇、腱の強度回復速度の向上、疾患状態の軽減若しくは緩和、及び寛解又は予後の改善の１若しくは複数が含まれる。例えば、腱障害に関連する１又は複数の症状が軽減されるか消失した場合、個体の「処置」は成功である。

本明細書において、「有効量」という用語は、投薬量で、必要な期間にわたり、少なくとも所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。有効量は１又は複数回の投与によって提供されてよい。

本明細書の値又はパラメーターで「約」という場合、その値又はパラメーター自体に関する実施形態も含まれる（及び説明されている）ものとする。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈から明確に単数でない限り、単数形（a、an、及びthe）は複数形を含む。例えば、「ＰＤＧＦホモダイマー」への言及は、１又は複数のＰＤＧＦホモダイマーへの言及であり、当業者に知られているその均等物等も含む。

本明細書に記載されている本発明の全ての態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むと理解される。記載の要素「から本質的になる」方法又は組成物は、記載されたステップ又は材料及びそれらの方法及び組成物（例えば、ＰＤＧＦ及びバッファーから本質的になる有効量の組成物を患部に投与すること又は有効量のＰＤＧＦを含む緩衝溶液から本質的になる組成物）の基本的及び新規な特徴に著しい影響を与えないものだけを含むと理解されるべきである。

血小板由来成長因子及びその組成物
本明細書において、「血小板由来成長因子」又は「ＰＤＧＦ」という用語は、２つの異なる受容体を介して細胞応答を活性化する４つの異なるアイソフォームのＰＤＧＦのいずれかを指す。これらのアイソフォームには、Ａ（ＰＤＧＦ−ＡＡと呼ばれるホモダイマーとして及びＰＤＧＦ−ＡＢと呼ばれるＢアイソフォームとのヘテロダイマーの一部として観察される）、Ｂ（ＰＤＧＦ−ＢＢと呼ばれるホモダイマーとして及びＰＤＧＦ−ＡＢと呼ばれるＡアイソフォームとのヘテロダイマーの一部として観察される）、Ｃ（ＰＤＧＦ−ＣＣと呼ばれるホモダイマーとして観察される）、及びＤ（ＰＤＧＦ−ＤＤと呼ばれるホモダイマーとして観察される）が含まれる。通常、本明細書中で、「ＰＤＧＦ」という用語は、公知のＰＤＧＦのホモダイマー及びヘテロダイマー（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤ）を全般的に指す。

本発明は、個体の腱障害を処置する方法及びそれらの方法で使用する組成物を提供する。一般的に、処置方法は、腱障害を有する個体の患部にＰＤＧＦを含む組成物を投与することを含む。具体的には、処置方法は、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物を腱障害部
位に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ及びバッファーを含む（例えば、ＰＤＧＦの緩衝溶液）。

いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ及びバッファーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、並びにその混合物及び誘導体からなる群から選択されるＰＤＧＦダイマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦダイマーはホモダイマーである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦホモダイマーは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦホモダイマーはＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦダイマーはヘテロダイマーである。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦヘテロダイマーはＰＤＧＦ−ＡＢである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを天然源（ｎａｔｕｒａｌ ｓｏｕｒｃｅ）から得てよい。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを組換えＤＮＡ技術によって生産してよい。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ又はその断片は、固相ペプチド合成等の当業者に公知のペプチド合成技術を用いて作製され得る。

天然源から得られた場合、ＰＤＧＦは生体液に由来し得る。いくつかの実施形態では、生体液には、血液等の、生きた生物に関連する任意の処置された又は処置されていない流体が含まれ得る。生体液は更に、血小板濃縮物、アフェレーシスされた（ａｐｈｅｒｅｓｅｄ）血小板、多血小板血漿、血漿、血清、新鮮凍結血漿等の血液成分を含み得る。生体液は、血漿から分離されて生理学的流体又はバッファーに再懸濁された血小板を含み得る。

組換えＤＮＡ技術により生産する場合、単一モノマー（例えばＰＤＧＦのＢ鎖又はＡ鎖）をコードするＤＮＡ配列を、培養している発現用の原核細胞又は真核細胞中に導入して、その後ホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦ−ＡＡ）を生産させてよい。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦホモダイマー（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、又はＰＤＧＦ−ＤＤ）を含む。いくつかの実施形態では、培養されている原核細胞又は真核細胞中にヘテロダイマーの両方のモノマー単位をコードするＤＮＡ配列を導入し、翻訳されたモノマー単位を細胞に処理させてヘテロダイマー（例えばＰＤＧＦ−ＡＢ）を生産させることによりＰＤＧＦヘテロダイマーが作製され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦヘテロダイマー（例えばＰＤＧＦ−ＡＢ）を含む。市販の組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢは、限定されるものではないが、レインコ・テクノロジーズ社（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．；ミズーリ州セントルイス）及びＲ＆Ｄシステムズ社（（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．；ミネソタ州ミネアポリス）を含む種々の供給元から購入することができる。

本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは組換えヒトＰＤＧＦ（「ｒｈＰＤＧＦ」）を含む。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦ（「ｒｈＰＤＧＦ」）は、ｒｈＰＤＧＦ−ＡＡ、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、ｒｈＰＤＧＦ−ＡＢ、ｒｈＰＤＧＦ−ＣＣ、ｒｈＰＤＧＦ−ＤＤ、並びにその混合物及び誘導体からなる群から選択されるＰＤＧＦダイマーである。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦはｒｈＰＤＧＦホモダイマーである。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦホモダイマーは、ｒｈＰＤＧＦ−ＡＡ、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、ｒｈＰＤＧＦ−ＣＣ、及びｒｈＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦホモダイマーはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦはｒｈＰＤＧＦヘテロダイマーである。いくつかの実施形態では、組換えヒトＰＤＧＦヘテロダイマーはｒｈＰＤＧＦ−ＡＢである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂは、以下の断片の１又は複数を含む：全長ヒトＢ鎖のアミノ酸１〜３１、１〜３２、３３〜１０８、３３〜１０９、及び／又は１〜１０８。ヒトＰＤＧＦのＢ鎖の完全アミノ酸配列（アミノ酸１〜１０９）は米国特許第５，５１６，８９６号の図１５に示されている。本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ組成物はインタクトなヒトＰＤＧＦ−Ｂ（アミノ酸１〜１０９）及びその断片の組合せを含み得ると理解されるべきである。米国特許第５，５１６，８９６号に開示されているようなＰＤＧＦのその他の断片も使用され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢは全長ヒトＰＤＧＦ−Ｂ（アミノ酸１〜１０９）の少なくとも６５％を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢは全長ヒトＰＤＧＦ−Ｂ（アミノ酸１〜１０９）の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択されるＰＤＧＦダイマー（例えばｒｈＰＤＧＦダイマー）を含み、組成物は、ＰＤＧＦダイマーを約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．９〜約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦダイマーを約３．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦダイマーを約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦダイマーを約０．３４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦダイマーを以下の濃度のいずれかで含む：約０．０５ｍｇ／ｍｌ；約０．１ｍｇ／ｍｌ；約０．１５ｍｇ／ｍｌ；約０．２ｍｇ／ｍｌ；約０．２５ｍｇ／ｍｌ；約０．３ｍｇ／ｍｌ；約０．３５ｍｇ／ｍｌ；約０．４ｍｇ／ｍｌ；約０．４５ｍｇ／ｍｌ；約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ；約０．７５ｍｇ／ｍｌ；約０．８ｍｇ／ｍｌ；約０．８５ｍｇ／ｍｌ；約０．９ｍｇ／ｍｌ；約０．９５ｍｇ／ｍｌ；約１．０ｍｇ／ｍｌ；約１．５ｍｇ／ｍｌ；約２．０ｍｇ／ｍｌ；約２．５ｍｇ／ｍｌ；約３．０ｍｇ／ｍｌ；約３．５ｍｇ／ｍｌ；約４．０ｍｇ／ｍｌ；約４．５ｍｇ／ｍｌ；又は約５．０ｍｇ／ｍｌ。これらの濃度は単に特定の実施形態の例であり、ＰＤＧＦダイマーの濃度は任意の上記濃度の範囲内であってよいと理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦダイマー（例えばｒｈＰＤＧＦダイマー）はＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＧＦ−ＢＢを約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｍｌ、約０．０５〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約５．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．９〜約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ−ＢＢを約３．４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ−ＢＢを約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ−ＢＢを約０．３４ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ−ＢＢを以下の濃度のいずれかで含む：約０．０５ｍｇ／ｍｌ；約０．１ｍｇ／ｍｌ；約０．１５ｍｇ／ｍｌ；約０．２ｍｇ／ｍｌ；約０．２５ｍｇ／ｍｌ；約０．３ｍｇ／ｍｌ；約０．３５ｍｇ／ｍｌ；約０．４ｍｇ／ｍｌ；約０．４５ｍｇ／ｍｌ；約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ；約０．７５ｍｇ／ｍｌ；約０．８ｍｇ／ｍｌ；約０．８５ｍｇ／ｍｌ；約０．９ｍｇ／ｍｌ；約０．９５ｍｇ／ｍｌ；約１．０ｍｇ／ｍｌ；約１．５ｍｇ／ｍｌ；約２．０ｍｇ／ｍｌ；約２．５ｍｇ／ｍｌ；約３．０ｍｇ／ｍｌ；約３．５ｍｇ／ｍｌ；約４．０ｍｇ／ｍｌ；約４．５ｍｇ／ｍｌ；又は約５．０ｍｇ／ｍｌ。これらの濃度は単に特
定の実施形態の例であり、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの濃度は任意の上記濃度の範囲内であってよいと理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。種々の量のＰＤＧＦが本発明の組成物中に用いられ得る。使用され得るＰＤＧＦの量としては、限定されるものではないが、以下の範囲の量が含まれる：約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、約２５０μｇ〜約５ｍｇ、及び約４５０μｇ〜約３ｍｇ。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。種々の量のＰＤＧＦ−ＢＢが本発明の組成物中で用いられ得る。用いられ得るＰＤＧＦ−ＢＢの量としては、限定されるものではないが、以下の範囲の量が含まれる：約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１０μｇ〜約２５ｍｇ、約１００μｇ〜約１０ｍｇ、約２５０μｇ〜約５ｍｇ、及び約４５０μｇ〜約３ｍｇ。

本発明のいくつかの実施形態において、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤを含むＰＤＧＦ（例えばｒｈＰＤＧＦ）の濃度は、例えば、米国特許第６，２２１，６２５号；同第５，７４７，２７３号；及び同第５，２９０，７０８号に記載されている酵素結合免疫測定法又はＰＤＧＦ濃度を決定するための当該技術分野で公知の任意の他のアッセイを用いて決定することができる。本明細書で記載される場合、ｒｈＰＤＧＦのモル濃度は、ＰＤＧＦホモダイマーの分子量（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＭＷ〜２５ｋＤａ）に基づいて決定されている。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ（例えばｒｈＰＤＧＦ）は高度に精製された形態であり得る。本明細書において、精製ＰＤＧＦは、本発明の溶液中に含める前に、約９５重量％を超えるＰＤＧＦを含む組成物を含む。溶液は任意の薬学的に許容されるバッファー又は希釈剤を用いて調製され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは実質的に精製されていてよい。本明細書において、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に含める前に、約５〜約９５重量％のＰＤＧＦを含む組成物を含む。一実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に含める前に、約６５〜約９５重量％のＰＤＧＦを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、実質的に精製されたＰＤＧＦは、本発明の溶液中に含める前に、約７０〜約９５重量％、約７５〜約９５重量％、約８０〜約９５重量％、約８５〜約９５重量％、又は約９０〜約９５重量％のＰＤＧＦを含む組成物を含む。精製されたＰＤＧＦ及び実質的に精製されたＰＤＧＦは組成物中に含められ得る。

別の実施形態では、ＰＤＧＦは一部精製されていてよい。本明細書において、一部精製されたＰＤＧＦは、ＰＤＧＦを生成するために回収及び分離が必要な多血小板血漿、新鮮凍結血漿、又は任意の他の血液製剤の文脈において、ＰＤＧＦを含む組成物を含む。本発明の実施形態では、ホモダイマー及びヘテロダイマーを含む本明細書中に記載されているＰＤＧＦアイソフォームのいずれも精製又は一部精製されてよいと考えられる。ＰＤＧＦ混合物を含む本発明の組成物は、ＰＤＧＦアイソフォーム又はＰＤＧＦ断片を一部精製された部分として含み得る。いくつかの実施形態では、一部精製されたＰＤＧＦ及び精製されたＰＤＧＦを、米国特許出願第１１／１５９，５３３号（米国特許出願公開第２００６／００８４６０２（Ａ１）号）に記載されているように調製することができる。

本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、高度に精製された又は一部精製されたＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。本明細書に記載されている実施形態のいずれかでは、高度に精製された又は一部精製されたＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。

バッファー
いくつかの実施形態では、組成物はＰＤＧＦ及びバッファー、好ましくは薬学的に許容されるバッファーを含む。本発明のＰＤＧＦ溶液における使用に適したバッファーには、限定されるものではないが、炭酸塩、リン酸塩（例えばリン酸緩衝食塩水）、食塩水、ヒスチジン、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウム）、酸性バッファー、例えば酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、及びＨＣｌ、並びに有機バッファー、例えばリジン、トリスバッファー（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）が含まれ得る。

バッファーは、ＰＤＧＦとの生体適合性及びバッファーが望ましくないタンパク質修飾を妨げる能力に基づいて選択することができる。バッファーは更に、宿主組織との適合性及び薬学的許容性（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｃｃｅｐｔａｂｉｌｉｔｙ）に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、酢酸ナトリウムバッファー中に含まれるＰＤＧＦを含む。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムバッファー中のＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムバッファー中のＰＤＧＦはｒｈＰＤＧＦ−ＢＢである。

バッファーは、種々のモル濃度、例えば約０．１〜約１００ｍＭ、約１〜約１００ｍＭ、約１０〜約１００ｍＭ、約１〜約５０ｍＭ、約５〜約４０ｍＭ、約１０〜約３０ｍＭ、若しくは約１５〜約２５ｍＭ、又はこれらの範囲内の任意のモル濃度で使用され得る。いくつかの実施形態では、酢酸バッファーを約２０ｍＭのモル濃度で用いる。バッファーは、種々の濃度、例えば約０．０１〜約１０ｍｇ／ｍｌ、０．０５〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５〜約５ｍｇ／ｍｌ、０．１〜約１ｍｇ／ｍｌ、及び約０．５〜約１ｍｇ／ｍｌ、又はこれらの範囲内の任意の濃度で使用され得る。

別の実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液は、可溶化前に適切なバッファーからＰＤＧＦを凍結乾燥させた凍結乾燥ＰＤＧＦを水中に可溶化することにより形成され得る。

本発明のいくつかの実施形態に係るＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物のｐＨは約３．０〜約８．０又は約４．０〜約７．０であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物のｐＨは約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約５．５〜約６．５、又はこれらの範囲内の任意の値である。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物のｐＨは約４．０〜約７．０である。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物のｐＨは約５．０〜約７．０である。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物のｐＨは約４．０、約５．０、約６．０、又は約７．０である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物のｐＨは、ＰＤＧＦ又は任意のその他の所望の生物学的活性剤の長期間にわたる安定性及び有効性に適合するｐＨであり得る。ＰＤＧＦは一般的に酸性環境中でより安定である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦ組成物の酸性保存製剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物のｐＨは好ましくは約３．０〜約７．０、より好ましくは約４．０〜約６．５である。しかし、ＰＤＧＦの生物学的活性は中性ｐＨ範囲の溶液中で最適化され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物の中性ｐＨの製剤を提供する。この実施形態では、組成物のｐＨは好ましくは約５．０〜約８．０、より好ましくは約５．５〜約７．０、最も好ましくは約
５．５〜約６．５である。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを含む溶液のｐＨは、本明細書中に記載されているバッファーによって調整され得る。種々のタンパク質でそれらが安定なｐＨ範囲は異なる。タンパク質の安定性は主にタンパク質の等電点及び電荷に反映される。ｐＨ範囲は、タンパク質の構造及び／又は生物学的活性を変化させ得るタンパク質分解、加水分解、酸化、等のプロセスへのタンパク質の感受性並びにタンパク質の立体構造に影響を与え得る。

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供されるＰＤＧＦ組成物は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、及びＰＤＧＦ−ＡＢからなる群から選択されるＰＤＧＦ並びにＰＢＳ、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、及びＡＣＥＳからなる群から選択されるバッファーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に提供されるＰＤＧＦ組成物は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと、ＰＢＳ、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、及びＡＣＥＳからなる群から選択されるバッファーとを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及び酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及び酢酸アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及び酢酸を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びクエン酸を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンを含む。いくつかの実施形態では、ｒｈＰＤＧＦ組成物はＰＤＧＦ−ＢＢ及びＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＭＯＰＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＡＤＡを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＰＩＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及びＡＣＥＳを含む。

本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は１〜１０００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は１０〜１０００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は１００〜１０００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は５〜５００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は５０〜５００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は１０〜１００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は２０〜２００ｍＭである。本明細書に記載されているいくつかの実施形態では、バッファーの濃度は１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、又は１００ｍＭである。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、ｒｈＰＤＧＦ−ＡＡ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムをｐＨ約６．０で含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、ｒｈＰＤＧＦ−ＡＢ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムをｐＨ約６．０で含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムをｐＨ約６．０で含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧＦ−ＣＣ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムをｐＨ約６．０で含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物はｒｈＰＤＧ
Ｆ−ＤＤ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムをｐＨ６．０で含む。

用量及び投与計画
ラット腱モデルで特定されたＰＤＧＦの有効量から、腱の処置領域の相対的大きさに基づき、ヒト等の他の個体の有効量を推定することができる。例えば、ヒトアキレス腱の処置領域はラットアキレス腱の処置領域の約６９倍大きいので、ヒト患者に対するＰＤＧＦの有効量は、ラット腱モデルで決定されたＰＤＧＦの有効量の約６９倍となり得る。

本明細書に記載されているＰＤＧＦ組成物の投与により送達される例示的な有効量又は用量としては、限定されるものではないが、１用量当たり約４５０〜約３，０００μｇ、１用量当たり約１〜約１０，０００μｇが含まれ、例えば１用量当たり約１〜約７，５００μｇ、１用量当たり約１〜約５，０００μｇ、１用量当たり約１〜約２，５００μｇ、１用量当たり約１〜約１，０００μｇ、１用量当たり約１〜約５００μｇ、１用量当たり約１〜約２５０μｇ、１用量当たり約１〜約１００μｇ、１用量当たり約１０〜約１０，０００μｇ、１用量当たり約１０〜約７，５００μｇ、１用量当たり約１０〜約５，０００μｇ、１用量当たり約１０〜約２，５００μｇ、１用量当たり約１０〜約１，０００μｇ、１用量当たり約１０〜約５００μｇ、１用量当たり約１０〜約２５０μｇ、１用量当たり約１０〜約１００μｇ、１用量当たり約２５〜約１０，０００μｇ、１用量当たり約２５〜約７，５００μｇ、１用量当たり約２５〜約５，０００μｇ、１用量当たり約２５〜約２，５００μｇ、１用量当たり約２５〜約１，０００μｇ、１用量当たり約２５〜約５００μｇ、１用量当たり約２５〜約２５０μｇ、１用量当たり約２５〜約１００μｇ、１用量当たり約５０〜約１０，０００μｇ、１用量当たり約５０〜約７，５００μｇ、１用量当たり約５０〜約５，０００μｇ、１用量当たり約５０〜約２，５００μｇ、１用量当たり約５０〜約１ ，０００μｇ、１用量当たり約５０〜約５００μｇ、１用量当たり
約５０〜約２５０μｇ、１用量当たり約５０〜約１００μｇ、１用量当たり約５０〜約１００μｇ、１用量当たり約７５〜約１０，０００μｇ、１用量当たり約７５〜約７，５００μｇ、１用量当たり約７５〜約５，０００μｇ、１用量当たり約７５〜約２，５００μｇ、１用量当たり約７５〜約１，０００μｇ、１用量当たり約７５〜約５００μｇ、１用量当たり約７５〜約２５０μｇ、１用量当たり約７５〜約１２５μｇ、１用量当たり約１００〜約２００μｇ、１用量当たり約２００〜約３００μｇ、１用量当たり約３００〜約５００μｇ、１用量当たり約５００〜約１ ，０００μｇ、１用量当たり約１，０００〜
約２，５００μｇ、１用量当たり約１ ，０００〜約５，０００μｇ、１用量当たり約１
，０００〜約７，５００μｇ、１用量当たり約１ ，０００〜約１０，０００μｇ、１用
量当たり約２，５００〜約５，０００μｇ、１用量当たり約２，５００〜約７，５００μｇ、１用量当たり約５，０００〜約７，５００μｇ、１用量当たり約１０，０００〜約５０，０００μｇ、１用量当たり約５０，０００〜約１００，０００μｇ、１用量当たり約１００，０００〜約２００，０００μｇ、１用量当たり約２００，０００〜約３００，０００μｇ、１用量当たり約３００，０００〜約４００，０００μｇ、又は１用量当たり約４００，０００〜約５００，０００μｇのいずれかが含まれる。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦを、１用量当たり約４００〜約１０００μｇ、１用量当たり約５００〜約９００μｇ、約６００〜約８００μｇ、１用量当たり約６５０〜約７５０μｇ、１用量当たり約７００μｇで投与する。

いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される用量は、５０μＬ、１００μＬ、１５０μＬ、２００μＬ、２５０μＬ、３００μＬ、３５０μＬ、４００μＬ、４５０μＬ、５００μＬ、５５０μＬ、６００μＬ、６５０μＬ、７００μＬ、７５０μＬ、８００μＬ、８５０μＬ、９００μＬ、９５０μＬ、１０００μＬ、又はそれ以上の体積で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される用量は、１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９
００μＬ、１０００μＬ、１１００μＬ、１２００μＬ、１３００μＬ、１４００μＬ、１５００μＬ、１６００μＬ、１７００μＬ、１８００μＬ、１９００μＬ、２０００μＬ、又はそれ以上の体積で投与される。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される用量は、約１０００〜約２０００μＬ、約１２５０〜約１７５０μＬ、約１３００〜約１６００μＬ、又は約１５００μＬの体積で投与される。

本明細書中に記載されているＰＤＧＦ組成物は、１日１回量（ｓｉｎｇｌｅ ｄａｉｌｙ ｄｏｓｅ）で投与されてもよく、例えば１日２回、３回、又は４回の分割した投与量で１日総量を投与してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＤＧＦ組成物の１日１回量が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、又はそれ以上にわたり１日１回投与され得る。ＰＤＧＦ組成物は、１日１回より少ない頻度で投与されてもよく、例えば、週６回、週５回、週４回、週３回、週２回、週１回、２週間に１回、３週間に１回、月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回で投与されてよい。

いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は一定期間にわたり、間を置いて投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって週１回投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって月２回投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ組成物は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって月１回投与される。

腱障害の処置方法
本明細書において、「腱障害（ｔｅｎｄｉｎｏｐａｔｈｙ）」という用語は、腱症、腱炎、腱鞘炎等の慢性的な腱損傷を指す。例示的な腱障害としては、限定されるものではないが、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎又は「テニス肘」、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害が含まれる。

本明細書において、「腱症（ｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）」という用語は、損傷領域周辺の腱修復細胞の数を増加させる、酷使により生じる腱の内部及び周辺の組織の微小断裂の形態であることが一般的な腱の腱内変性（ｉｎｔｒａｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を特徴とする腱への非炎症性の損傷を指す。腱の変性は、腱のコラーゲン繊維、細胞、及び血管構成要素へのダメージ又はその組織崩壊により生じ、処置されないと、腱の引張強さが低下することがあり、腱断裂につながり得る。場合によっては、腱症は腱の巣状壊死又は石灰化を伴う。

本明細書において、「腱炎」という用語は、腱症で観察されるような変性を特徴とするが、腱の炎症、血管の破壊、及び炎症修復反応を更に伴う、腱への炎症性の損傷を指す。腱炎は多くの場合、線維芽細胞及び筋線維芽細胞の増殖並びに出血及び組織化している肉芽組織を伴う。一般的に、腱炎は、例えばアキレス腱炎（アキレス腱に発症する）又は膝蓋腱炎（「ジャンパー膝」としても知られ、膝蓋腱に発症する）のように関わる身体の部分で呼ばれるが、外側上顆炎（「テニス肘」としても知られ、短橈側手根伸筋腱に発症する）等の例外もある。

本発明の方法で処置され得る腱障害としては、ヒト又は哺乳動物の体の任意の腱の腱障害が含まれる。いくつかの実施形態では、腱障害は腱症である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は腱鞘炎である。

本発明の方法で処置され得る腱としては、ヒト又は哺乳動物の体の任意の腱が含まれ得
る。腱の非限定的な例としては、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝腱（ｈａｍｓｔｒｉｎｇ ｔｅｎｄｏｎ）、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、内転筋腱、棘上筋腱、棘下筋腱、肩甲下筋腱、小円筋腱、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、及び大腿四頭筋腱が含まれる。

いくつかの実施形態では、腱は足（ｆｏｏｔ）又は足首の腱である。いくつかの実施形態では、足又は足首の腱は、長母趾伸筋、長母趾屈筋、長指伸筋、短指伸筋、長腓骨筋、短腓骨筋、短母趾屈筋、長指屈筋、後脛骨筋、アキレス腱、及び足底筋膜からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱は脚（ｌｅｇ）の腱である。いくつかの実施形態では、脚の腱は、膝蓋腱、前脛骨筋腱、アキレス腱、膝屈筋腱、半腱様筋腱、薄筋腱、外転筋腱、及び内転筋腱からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱は、屈筋腱、大腿直筋腱、後脛骨筋腱、及び大腿四頭筋腱からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱は肩の腱である。いくつかの実施形態では、肩の腱は、棘上筋腱、棘下筋腱、甲下筋腱、及び小円筋腱（回旋腱板複合体）からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱は肘の腱である。いくつかの実施形態では、肘の腱は、二頭筋腱、三頭筋腱、短橈側手根伸筋、一般的な伸筋腱、指伸筋、小指伸筋、尺側手根伸筋、回外筋、一般的な屈筋腱、円回内筋、橈側手根屈筋、長掌筋、尺側手根屈筋、及び浅指筋（ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｉｓ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱は手首の腱である。いくつかの実施形態では、手首の腱は、二頭筋腱、三頭筋腱、短橈側手根伸筋、一般的な伸筋腱、指伸筋、小指伸筋、尺側手根伸筋、回外筋、一般的な屈筋腱、円回内筋、橈側手根屈筋、長掌筋、尺側手根屈筋、浅指筋、短母指屈筋、長母指屈筋、短母指外転筋、長母指外転筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母指伸筋、及び長母指伸筋からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱は手の腱である。いくつかの実施形態では、手の腱は、短母指屈筋、長母指屈筋、短母指外転筋、長母指外転筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母指伸筋、及び長母指伸筋からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱障害は回旋腱板腱障害である。いくつかの実施形態では、回旋腱板腱障害は、棘上筋腱障害、棘下筋腱障害、肩甲下筋腱障害、及び小円筋腱障害からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱障害は、主に短橈側手根伸筋（ＥＣＲＢ）腱における、上腕骨外側顆付着点の伸筋群起始点の外側上顆炎又は「テニス肘」である。いくつかの実施形態では、外側上顆炎を有する対象は、視覚的アナログスコア（ＶＡＳ）で５０の疼痛で示される、関連する疼痛を有する（例えば少なくとも約６ヶ月間）。いくつかの実施形態では、外側上顆炎を有する対象は、例えば少なくとも約６ヶ月間、外側上顆への圧力及び／又は抵抗を加えた手首の伸展（ｒｅｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｗｒｉｓｔ）によって大きくなる、関連する疼痛を有する。いくつかの実施形態では、腱障害は、内側上腕骨顆の円回内筋と橈側手根屈筋起始点との間の接点における内側上顆炎又は「ゴルフ肘」である。

いくつかの実施形態では、腱障害は膝蓋腱障害である。いくつかの実施形態では、腱障害はアキレス腱障害である。いくつかの実施形態では、腱障害は足底筋膜炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は内側足底筋膜炎である。いくつかの実施形態では、腱障害は外側足底筋膜炎である。

別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む有効量の組成物を患部に投与することを含む、腱障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ−ＢＢである。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約７５〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５００〜約１，０００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約４５０〜約３，０００μｇのＰＤＧＦを含む。いくつかの実施形態では、有効量の組成物は、１用量当たり約５，０００〜約７，５００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む。

いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約１０〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムのｐＨは約４．０〜約７．０である。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムのｐＨは約６である。

いくつかの実施形態では、投与は、患部への直接注射によりなされる。いくつかの実施形態では、直接注射は、超音波ガイダンスを用いて又は用いずに、「ペッパリング法（ｐｅｐｐｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」を用いてなされる。「ペッパリング法」とは、圧痛領域に針を挿入した後、針を皮膚から出さずに引っ込めて方向を変え、再度挿入することにより複数回の少量注射がなされる注射法である。

いくつかの実施形態では、患部は骨−腱接合部である。いくつかの実施形態では、患部は腱である。いくつかの実施形態では、腱障害は、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は単回注射により投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、単回注射により、週１回、４週間投与される。

いくつかの実施形態では、腱障害は腱症である。いくつかの実施形態では、腱症は長母趾伸筋腱症、長母趾屈筋腱症、長指伸筋腱症、短指伸筋腱症、長腓骨筋腱症、短腓骨筋腱症、短母趾屈筋腱症、長指屈筋腱症、後脛骨筋腱症、アキレス腱症、及び足底筋膜腱症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱症は、膝蓋腱症、前脛骨腱症、膝腱症、半腱様筋腱症、薄筋腱症、外転筋腱症、及び内転筋腱症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱症は、屈筋腱症、大腿直筋腱症、後脛骨筋腱症、及び大腿四頭筋腱症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱症は、棘上筋腱症、棘下筋腱症、肩甲下筋腱症、及び小円筋腱症からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱症は、二頭筋腱症、三頭筋腱症、短橈側手根伸筋腱症、一般的な伸筋腱症、指伸筋腱症、小指伸筋腱症、尺側手根伸筋腱症、回外筋腱症、一般的な屈筋腱症、円回内筋腱症、橈側手根屈筋腱症、長掌筋腱症、尺側手根屈筋腱症、及び浅指筋腱症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱症は、二頭筋腱症、三頭
筋腱症、短橈側手根伸筋腱症、一般的な伸筋腱症、指伸筋腱症、小指伸筋腱症、尺側手根伸筋腱症、回外筋腱症、一般的な屈筋腱症、円回内筋腱症、橈側手根屈筋腱症、長掌筋腱症、尺側手根屈筋腱症、浅指筋腱症、短母指屈筋腱症、長母指屈筋腱症、短母指外転筋腱症、長母指外転筋腱症、深指屈筋腱症、浅指屈筋腱症、短母指伸筋腱症、及び長母指伸筋腱症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱症は、短母指屈筋腱症、長母指屈筋腱症、短母指外転筋腱症、長母指外転筋腱症、深指屈筋腱症、浅指屈筋腱症、短母指伸筋腱症、及び長母指伸筋腱症からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱障害は腱炎である。いくつかの実施形態では、腱炎は、長母趾伸筋腱炎、長母趾屈筋腱炎、長指伸筋腱炎、短指伸筋腱炎、長腓骨筋腱炎、短腓骨筋腱炎、短母趾屈筋腱炎、長指屈筋腱炎、後脛骨筋腱炎、アキレス腱炎、及び足底筋膜腱炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱炎は、膝蓋腱炎、前脛骨腱炎、膝腱炎、半腱様筋腱炎、薄筋腱炎、外転筋腱炎、及び内転筋腱炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱炎は、屈筋腱炎、大腿直筋腱炎、後脛骨筋腱炎、及び大腿四頭筋腱炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱炎は、棘上筋腱炎、棘下筋腱炎、肩甲下筋腱炎、及び小円筋腱炎からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、腱炎は、二頭筋腱炎、三頭筋腱炎、短橈側手根伸筋腱炎、一般的な伸筋腱炎、指伸筋腱炎、小指伸筋腱炎、尺側手根伸筋腱炎、回外筋腱炎、一般的な屈筋腱炎、円回内筋腱炎、橈側手根屈筋腱炎、長掌筋腱炎、尺側手根屈筋腱炎及び浅指筋腱炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱炎は、二頭筋腱炎、三頭筋腱炎、短橈側手根伸筋腱炎、一般的な伸筋腱炎、指伸筋腱炎、小指伸筋腱炎、尺側手根伸筋腱炎、回外筋腱炎、一般的な屈筋腱炎、円回内筋腱炎、橈側手根屈筋腱炎、長掌筋腱炎、尺側手根屈筋腱炎、浅指筋腱炎、短母指屈筋腱炎、長母指屈筋腱炎、短母指外転筋腱炎、長母指外転筋腱炎、深指屈筋腱炎、浅指屈筋腱炎、短母指伸筋腱炎、及び長母指伸筋腱炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、腱炎は、短母指屈筋腱炎、長母指屈筋腱炎、短母指外転筋腱炎、長母指外転筋腱炎、深指屈筋腱炎、浅指屈筋腱炎、短母指伸筋腱炎、及び長母指伸筋腱炎からなる群から選択される。

本発明の方法は、以下の１又は複数を改善し得る：患部関節又は手足の疼痛軽減、患部関節又は手足の硬直軽減、患部関節又は手足の可動性の上昇、患部関節又は手足の強度の上昇、腱障害の進行速度の低下、炎症の軽減、腱の強度の上昇、又は腱強度回復速度の改善。処置の有効性を測定する種々の方法としては、限定されるものではないが、上肢障害評価表（Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍ， ｓｈｏｕｌｄｅｒ ａｎｄ Ｈａｎｄ Ｓｃｏｒｅ：ＤＡＳＨ）、視覚的アナログスコア（ＶＡＳ）、及び握力検査が含まれる。いくつかの実施形態では、処置により、処置前のＤＡＳＨスコアが少なくとも２５％低下する。いくつかの実施形態では、処置により、処置前のＶＡＳスコアが少なくとも２５％低下する。いくつかの実施形態では、処置により、圧力及び／又は関節屈曲による疼痛が低下する。いくつかの実施形態では、処置により、圧力及び／又は関節屈曲による疼痛が低下し、関節の可動性が上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、如何なる異常な骨形成も生じない。いくつかの実施形態では、処置により、如何なる異常な腱成長も生じない。いくつかの実施形態では、処置は安全であり、対象に耐えられる。いくつかの実施形態では、組成物の安全性及び忍容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）は、身体検査、バイタルサイン測定、臨床検査、Ｘ線、及び／又はＭＲＩイメージングの１又は複数により特定される有害事象又は異常の欠如によって評価される。

いくつかの実施形態では、処置により腱の強度が上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、より急速に腱強度が回復する。いくつかの実施形態では、処置により、本発明の組成物の投与から約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日以内に、ベースラインと比べて、腱強度が
少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、本発明の組成物の投与から約７日以内に、ベースラインと比べて、腱強度がなくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、本発明の組成物の投与から約７日以内に、ベースラインと比べて、腱強度が少なくとも約６０％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、本発明の組成物の投与から約７日以内に、ベースラインと比べて、腱強度が少なくとも約６５％上昇する。いくつかの実施形態では、処置により、本発明の組成物の投与から約７日以内に、ベースラインと比べて、腱強度が少なくとも約７０％上昇する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与から約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日以内に、腱は、処置の約２１日後に測定されるその最終強度の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、本発明の組成物の投与から約７日以内に、処置の約２１日後に測定されるその最終強度の少なくとも約８０％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、本発明の組成物の投与から約７日以内に、処置の約２１日後に測定されるその最終強度の少なくとも約８５％に達する。いくつかの実施形態では、腱は、本発明の組成物の投与から約７日以内に、処置の約２１日後に測定されるその最終強度の少なくとも約９０％に達する。腱強度は、例えばモデル動物、例えばラットコラゲナーゼモデルにおいて測定することができ、腱強度は、断裂までに測定される荷重である。腱強度の測定例は実施例３に更に詳細に記載されている。

キット
別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物を含む容器を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥ＰＤＧＦを含む第１の容器と凍結乾燥ＰＤＧＦを可溶化するためのバッファーを含む第２の容器とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥ＰＤＧＦ及びバッファーを含む第１の容器と凍結乾燥ＰＤＧＦ及びバッファーを可溶化するための水を含む第２の容器とを含む。いくつかの実施形態では、バッファーは、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、バッファーは酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約１０〜約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムの濃度は約２０ｍＭである。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムのｐＨは約４．０〜約７．０である。いくつかの実施形態では、酢酸ナトリウムのｐＨは約６である。

いくつかの実施形態では、キットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、注射器、使用のための説明が記載された添付文書等の、販売、治療、及び使用者の立場から望ましい他の材料及び資料を更に含む。本明細書において、「添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）」という用語は、医薬品の市販のパッケージに通常含まれ、適応についての情報を含み、医薬品の市販パッケージに通常含まれ、適応、使用方法、用量、投与、禁忌、パッケージ製品と組み合わせられる他の医薬品、及び／又はそのような医薬品の使用に関する注意についての情報を含む説明書を指す。

縫合糸
ＰＤＧＦでコーティングされた縫合糸及びそのような縫合糸の作製方法もまた、提供す
る。この縫合糸は、例えば、個体の腱の処置（例えば腱裂傷の処置）に使用され得る。好適な縫合糸としては、例えば、ラクチド及びグリコリドのコポリマーから作製されたもの（例えばバイクリル縫合糸（例えば４−０バイクリル縫合糸））が含まれる。好適なコーティング方法としては、例えば、ディップコーティング法、例えばDines J, Weber L, Razzano P, et al. The Effect of Growth Differentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a Rat Model. J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S）に記載さ
れている、ゼラチンが除去されるように変更されてもよいディップコーティング法が含まれる。本出願人らは、驚くべきことに、高用量のＰＤＧＦをゼラチンなしで特定の種類の縫合糸にコーティングできることを見出した。いくつかの実施形態では、縫合糸はゼラチンを含まない。いくつかの実施形態では、縫合糸コーティングはゼラチンを含まない。いくつかの実施形態では、縫合糸コーティングは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又は乳酸−グリコール酸コポリマーを含まない。いくつかの実施形態では、縫合糸のコーティング方法でゼラチンを使用しない。いくつかの実施形態では、縫合糸コーティングは、ＰＤＧＦから本質的になる。いくつかの実施形態では、縫合糸コーティングはＰＤＧＦ及びバッファーからなる。いくつかの実施形態では、縫合糸コーティングはＰＤＧＦからなる。縫合糸は、個体、例えば哺乳動物を処置するために使用され得る。本発明の縫合糸を用いて処置され得る哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、ペット（例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等）、実験動物（例えばマウス、ラット）、家畜（例えばウマ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ等）が含まれる。

いくつかの実施形態では、縫合糸に添加（ｌｏａｄ）されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１０ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約５０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約６０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約１０〜約２０，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約１００〜約１０，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約５００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約１０００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約４０００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、縫合糸に添加されるＰＤＧＦの量は、縫合糸１ｃｍ当たり約６０００〜約７，０００ｎｇＰＤＧＦである。

いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１０ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約１０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約５０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり少なくとも約６０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約１０〜約２０，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦ
の累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約１００〜約１０，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約５００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約１０００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約４０００〜約８，０００ｎｇＰＤＧＦである。いくつかの実施形態では、４８時間で縫合糸から放出されるＰＤＧＦの累積量はインビトロでの測定で縫合糸１ｃｍ当たり約６０００〜約７，０００ｎｇＰＤＧＦである。インビトロでの累積ＰＤＧＦ放出量を測定する好適な方法としては、例えば実施例７に記載されている方法が含まれる。本発明のコーティングされた縫合糸は、好ましくは生体内での安定した投薬を可能にし得る。

以下の実施例は例としてのみ提供するものであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。

＜実施例１＞
正常及び病気の初代ヒト腱細胞はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに応答して増殖する
本研究は、腱障害を有する患者に由来する初代腱細胞の増殖及び／又は走化性をｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが直接活性化するかどうかを調べた。そのような発見は、腱障害におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの治療可能性を裏付け得る。

患者及び方法
患者
アキレス腱障害患者５名及び後脛骨筋腱（ＰＴＴ）の腱障害患者５名を含む腱障害患者１０名を本研究に用いた。膝の完全な関節置換術を受けた患者５名を更に含めた。

腱細胞の初代培養
臨床的兆候に対して行われた再腱外科手術中に正常な腱及び損傷した腱から、廃棄されるはずであった腱組織を得た。これらの組織には、アキレス腱又はＰＴＴ腱の腱障害部分並びに長指屈筋（ＦＤＬ）腱組織、アキレス腱組織、及び膝蓋腱組織の健康（腱障害部分でない）部分が含まれていた。これらの組織から初代腱細胞外植片培養を得、３〜５継代目に調べた。腱細胞の特定は、腱細胞特異的な遺伝子スクレラキシスの発現並びにコラーゲンａ１（Ｉ）、ａ２（Ｉ）、及びａ１（ＩＩＩ）の遺伝子の発現について特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイで評価することで確認した。

細胞増殖
腱細胞単層をトリプシン処理し、０．５％の透析されたウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁し、一晩付着させた後、漸増濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢと一緒に２４時間インキュベートした。市販のアッセイ（ロシュ・アプライド・サイエンス社、インディアナ州インディアナポリス）を用いてＤＮＡ合成中における細胞中へのＢｒｄＵ取込みに基づいて、細胞増殖速度の変化を評価した。各用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢについて各培養を３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で調べた。

細胞遊走
腱細胞単層をトリプシン処理し、０．５％の透析されたウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁し、９６ウェルＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）ディスポーザブル細胞遊走システム（ニューロ・プローブ社（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ）、メリーランド州ゲイサーズバーグ）の上側チャンバーに入れた。下側チャンバーには漸増濃度のｒｈＰＤＧＦ−
ＢＢを入れた。チャンバーを隔てる膜を介して腱細胞を４８時間遊走させた。次いで、９６ウェルプレートをスピンし、３回凍結融解することで遊走した細胞を溶解させた。プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）から市販されているキットを用いて、細胞質の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に基づいて、遊走した生細胞の量を測定した。

統計解析
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた刺激が用量依存的に腱細胞の増殖に影響するかどうかについて、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて決定した。

結果
腱細胞培養だけがスクレラキシスｍＲＮＡを発現し、対照の肺線維芽細胞培養又は対照の一次Ｔ細胞培養はこれを発現しなかった。一方、腱細胞及び線維芽細胞はコラーゲン遺伝子ｍＲＮＡを発現したが、リンパ球はこれを発現しなかった。

全ての場合で、疾患プロセスに関わる又は関わらない腱組織由来の腱細胞は、ＢｒｄＵ取込みを加速させることでｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答した（ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ）。この応答は、用量依存的であり、１０、５０、及び１５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで観察された。全ての細胞培養がｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答したが、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激後のＢｒｄＵ取込みの大きさには患者間で大きなばらつきがあった。ＢｒｄＵ取込みは、対照の非刺激培養と比べて、最低２．１±０．２倍から最大１０．７±０．５倍まで増加した。５名の患者の腱細胞は逆説的に応答し、高濃度（５０及び１５０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢよりも低濃度（１０ｎｇ／ｍＬ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢでＢｒｄＵ取込みがより大きく増加した。このような逆説的な応答は、これらの患者の腱障害組織及び正常組織のどちらに由来する腱細胞でも観察された。４名の患者の健康な腱に由来する腱細胞が、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ刺激に応答して、疾患組織に由来する腱細胞の２倍のＢｒｄＵを取り込んだ。患者の１名では、疾患組織に由来する腱細胞が、ｒｈＰＤＧＦ刺激に応答して、疾患プロセスに関わらない組織に由来する腱細胞の４倍のＢｒｄＵを取り込んだ。図２は、健康腱細胞及び疾患腱細胞について、１日目、４日目、及び８日目に培養培地に０、１０、５０、及び１５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを添加した場合のＢｒｄＵ取込み（ｙ軸、吸収）を示す図である。吸収の増加は、増殖の増加と一致し、健康腱細胞及び疾患腱細胞はどちらも１日目にＰＤＧＦに応答した。

全ての場合で、腱細胞は、５０ｎｇ／ｍＬ及び１５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに走化性の応答をした。走化性実験では、パイロット実験で応答が少なかったので、腱細胞を１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢにはさらさなかった。ここでも、応答は用量依存的であり、５０ｎｇ／ｍＬよりも１５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで走化性が強かった。しかし、５名の患者の腱細胞は、１５０ｎｇ／ｍＬよりも５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢにより強い走化性で応答し、遊走した細胞の数が有意に減少した（ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに対する最大走化性応答は、患者間でばらつきがあり、非刺激対照と比べて１．４±０．１〜４．０±０．５倍であった。対応する腱障害の腱組織又は健康な腱組織に由来する腱細胞培養内では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢへの腱細胞の走化性には統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。図１は、濃度０、５０、又は１５０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで培養した細胞の走化性を示す図である（ｙ軸は上昇した光学濃度を示す）。遊走は、１２５０、２５００、５０００、及び１００００個の初期細胞で評価した。

結論
これらの実験の結果は、健康組織及び腱障害組織に由来する腱細胞が、増殖速度及び走化性速度を増大することによりｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに応答することを示唆している。重要なことに、一部の患者に由来する腱細胞はＰＤＧＦに対して逆説的な応答を示し、低用量
より高用量の方が影響が小さかった。同様に重要なことに、疾患腱に由来する腱細胞は、いくつかの場合で、ＰＤＧＦに対して健康な腱に由来する腱細胞と示差的な応答をした。このことは、臨床状況において適切な投薬が最も重要となり得ることを示している。

＜実施例２＞
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた安全性の研究
局所注射試験
本研究の目的は、ラットにアキレス腱内送達した後のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの局所的毒性を決定することである。アキレス腱内投与は、診療所において外側上顆炎を処置するためのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの投与経路を真似た。アキレス腱−踵骨接合部の注射部位は、短橈側手根伸筋腱及び外側上顆骨の付着部位を真似た。

本研究ではスプラーグドーリーラットを用いた。動物は、研究期間中同じ研究施設に収容した。全ての収容（ｈｏｕｓｉｎｇ）及び管理（ｈｕｓｂａｎｄｒｙ）は動物保護法及び「実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）」に従った。標準的なプロトコールに従ってラットに餌及び水を与えた。麻酔等の適当な研究関連事象の際には食物及び水を控えた。研究前に動物を最低５日間施設に順化させた。この順化期間により、動物を研究用の部屋の環境に慣れさせる。

異なる濃度の無菌組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢの３つのバッチ、（１）１０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）；（２）５．２ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）；及び（３）１．７ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）を研究に用いた。ビヒクル対照サンプルは、無菌２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）とし、標準的なプロトコールに従って調製した。

試験物質及び対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順（ｓａｆｅｔｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いた。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（ｇｏｗｎ）（又は白衣（ｌａｂ ｃｏａｔ））、及びアイプロテクション（ｅｙｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を着用した。

１群当たりｎ＝６０で各群が雄３０頭及び雌３０頭を含む４つの群に動物をランダム化した。各群の四頭筋の骨腱接合部に以下の化合物を単回腱内注射した：（１）２０ｍＭ酢酸ナトリウム；（２）５１μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム；（３）１５６μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム；又は（４）５１５μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム。注射は２８．５Ｇの針を付けたインスリン注射器を用いた行った。全ての動物は１日目に試験物質の単回アキレス腱内注射を受けた。第１群の動物は、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を受け、第２〜４群は、それぞれ用量３６．６９、１１２．２３、及び３７０．５０μｇ／ｍｍ²のｒｈＰＤＧＦ
−ＢＢを受けた。

各群の三分の一を、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射後１日目、２週目、及び６週目に屠殺した。生存中処置群の完了後、ＵＳＤＡの動物保護法、実験動物の管理と使用に関する指針（ILAR publication, 1996, National Academy Press）、及びＨＳＳ獣医手技（ＨＳＳ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従い、動物を安楽死させ、組織を回収した。ＣＯ₂の過剰投与により動物を安楽死させた。反射（まばたき、引っ込み等）の欠如に
より死亡を確認した。

評価基準には、臨床観察、身体評価、体重、及び食物消費量の測定、臨床病理、剖検、臓器重量、並びに腱毒性及び骨毒性の検査を含む注射された又は注射されていない後脚首の組織病理評価を含めた。

血液学的評価、凝固試験、及び種々の臨床化学試験を動物に行った。血液学的評価には以下の測定が含まれる：白血球数（ＷＢＣ）；赤血球数（ＲＢＣ）；ヘモグロビン（Ｈｂ）の測定、平均赤血球血色素（ＭＣＨ）レベル、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、及び平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）；血小板数；平均赤血球容積（ＭＣＶ）の測定、及び白血球分類の評価、例えば好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、％好中球、％リンパ球、％単球、及び％好酸球）。凝固試験では活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定した。臨床化学試験には以下の分析が含まれる：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、グロブリン（Ｇｌｏｂ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、カリウム（Ｋ）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、塩化物（ＣＩ）、クレアチニン（ＣＲＥＡＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ナトリウム（Ｎａ）、無機リン（ＰＨＯＳ）、カルシウム（Ｃａ）、Ａ／Ｇ比、及び総タンパク質（ＴＰＲＯＴ）。

結果
用量３６．６９μｇ／ｍｍ²、１１２．２３μｇ／ｍｍ²、３７０．５０μｇ／ｍｍ²の
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢをラットに単回アキレス腱内注射しても死亡率又は瀕死状態に対する影響はなかった。更に、臨床観察、体重への影響、又は食物消費量に、試験物質に関連する生物学的に有意な差はなかった。

２日目では、対照（第１群）と比べた時、全ての処置ラット群で分析した血液学又は尿検査パラメーターのいずれにおいても、統計的又は生物学的に有意な差はなかった。白血球及び凝固パラメーターには変化が見られたが、これらの変化は異種タンパクの注射に対する微小な急性炎症反応と一致した。更に、複数の血清化学パラメーターにおいても微小変化が観察された。しかし、これらの変化は個々の動物の差異によるものと考えられ、生物学的に有意とは見なされず、如何なる臓器特異的毒性にも関連しなかった。

１６日目及び４３日目では、対照（第１群）と比べた時、全ての処置ラット群で、分析した血液学、白血球、凝固、又は尿検査パラメーターのいずれにおいても生物学的に有意な差はなかった。

試験物質に関連する巨視的観察結果（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）はなく、全ての巨視的観察結果は偶発的なものであると見なされた。

２日目に対照及び処置ラット群で急性出血及び亜急性炎症が観察されたが、頻度及び重症度は処置ラット群で大きいようであった。１６日目では、急性出血は鎮まり、亜急性炎症はほとんど起こらなくなった。処置ラット群は、浅屈筋腱及び踵骨腱の腱細胞の肥大及び過形成に加えて、上記腱の腱傍組織の線維増殖及び血管新生を示した。４３日目までに、線維増殖及び血管新生の重症度は改善されたが、処置ラットの大部分で、依然として腱細胞は肥大及び過形成を示していた。

第２の種の局所注射試験
本研究の目的は、イヌのアキレス腱内に送達した後の組換えヒト血小板由来成長因子（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）の局所的毒性を決定することである。

本研究ではビーグル犬を用いる。動物は、研究期間中同じ研究施設に収容する。全ての収容及び管理は動物保護法及び「実験動物の管理と使用に関する指針」に従う。標準的なプロトコールに従ってイヌに餌及び水を与える。麻酔等の適当な研究関連事象の際には食物及び水を控える。研究前に動物を最低５日間施設に順化させる。この順化期間により、動物を研究用の部屋の環境に慣れさせる。

異なる濃度の無菌組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢの３つのバッチ、（１）１０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）；（２）３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）；及び（３）１ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）を研究に用いた。ビヒクル対照サンプルは、無菌２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）とし、標準的なプロトコールに従って調製する。

試験物質及び対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順を用いる。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（又は白衣）、及びアイプロテクションを着用する。

１群当たりｎ＝２４で各群が雄１２頭及び雌１２頭を含む４群に動物をランダム化する。各群の四頭筋の骨腱接合部に以下の組成物を単回腱内注射する：（１）２０ｍＭ酢酸ナトリウム；（２）１．５ｍｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム；（３）４．５ｍｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム；又は（４）１５ｍｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム。注射は２８．５Ｇの針を備えたインスリン注射器を用いて一定の用量体積１．５ｍＬで行う。

各群の三分の一を、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射後１日目、２週目、及び６週目に屠殺する。生存中処置群の完了後、ＵＳＤＡの動物保護法、実験動物の管理と使用に関する指針（ILAR publication, 1996, National Academy Press）、及びＨＳＳ獣医手技に従い、動物を安楽死させ、組織を回収する。ペントバルビタールナトリウム（Ｆａｔａｌ−Ｐｌｕｓ（登録商標）又は適切な代替物）による深い麻酔下で全採血により動物を安楽死させる。

血液学的評価、凝固試験、及び種々の臨床化学試験を動物に行う。

血液学的評価には以下の測定値が含まれる：白血球数（ＷＢＣ）；赤血球数（ＲＢＣ）；ヘモグロビン（Ｈｂ）の測定、平均赤血球血色素（ＭＣＨ）レベル、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、及び平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ）；血小板数；平均赤血球容積（ＭＣＶ）の測定、及び白血球分類の評価、例えば好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、％好中球、％リンパ球、％単球、及び％好酸球）。凝固試験では活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）及びプロトロンビン時間（ＰＴ）を測定する。臨床化学試験には以下の分析が含まれる：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（ＧＬＵ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、グロブリン（Ｇｌｏｂ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、カリウム（Ｋ）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、トリグリセリド（ＴＲＩＧ）、塩化物（Ｃｌ）、クレアチニン（ＣＲＥＡＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ナトリウム（Ｎａ）、無機リン（ＰＨＯＳ）、カルシウム（Ｃａ）、Ａ／Ｇ比、及び総タンパク質（ＴＰＲＯＴ）。

腱毒性及び骨毒性の検査を含む局所組織の組織病理も評価する。

ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢはイヌに毒性ではない。

急性全身毒性
本研究の目的は、静脈内注射によって投与されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの全身毒性を決定することである。

本研究ではスプラーグドーリーラットを用いる。動物は、研究期間中同じ研究施設に収容する。全ての収容及び管理は動物保護法及び「実験動物の管理と使用に関する指針」に従う。標準的なプロトコールに従って動物に餌及び水を与える。麻酔等の適当な研究関連事象には食物及び水を控える。研究前に動物を最低５日間施設に順化させる。この順化期間により、動物を研究用の部屋の環境に慣れさせる。

無菌組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢを３．０ｍｇ／ｍｌ及び０．３ｍｇ／ｍｌで含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）を本研究に用いる。投薬の日、０．３ｍｇ／ｍＬの溶液の一部を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで１：１０希釈して０．０３ｍｇ／ｍｌの溶液を作製し、これも本研究で使用する。対照サンプルは無菌２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）であり、標準的な手順に従って調製する。

試験物質及び対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順を用いる。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（又は白衣）、及びアイプロテクションを着用する。

１群当たりｎ＝４０（１群当たり雄２０頭及び雌２０頭）の４群に動物をランダム化した。用量群１には、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．５）を１ｋｇ当たり１．４ｍｌの体積で単回静脈内注射した。用量群２には、３．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．５）を１ｋｇ当たり１．４ｍｌの体積で単回静脈内注射した。用量群３には、０．３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．５）を１ｋｇ当たり１．４ｍｌの体積で単回静脈内注射した。用量群４には、０．０３ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．５）を１ｋｇ当たり１．４ｍｌの体積で単回静脈内注射した。

死亡及び他の重度な毒性の兆候について動物を評価する。研究期間中、生存率、臨床検査、体重、食物消費量、眼の検査、及び臨床病理について動物を観察する。２日目及び１４日目の剖検後（雄１０頭及び雌１０頭／群／時点）、血液学、凝固、血清化学、及び尿検査を含む動物の臨床病理を評価し、完全な剖検を行う。

＜実施例３＞
コラゲナーゼ誘発ラットアキレス腱損傷モデルにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの腱内（ＩＴ）適用の用量反応
本研究の目的は、ラット腱コラゲナーゼモデルにおいてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの腱内適用の用量反応を決定してアキレス腱の損傷及びリモデリングに対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの修復効果を検証することである。本発明者らは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの腱内送達により、細胞増殖がアップレギュレートされ且つ腱の生体力学的強度が回復することによって、腱が修復されるという仮説を立てた。

組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）は、骨芽細胞、腱細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞等の間葉起源細胞に分裂促進性及び走化性である。したがって、筋骨格系の損傷部位に導入されると、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは結合組織細胞及び前駆細胞を処置部位に引きつけ、その増殖を刺激することにより細胞の数を増やし、これがその後マト
リックスを沈着させて損傷組織を再生する。更に、上記実施例１に示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢにさらされた腱細胞はＤＮＡ合成及び走化性の増大を示した。

コラゲナーゼ誘発ラットアキレス腱損傷モデル
腱障害を評価するための良く確立された１つのモデルはない。しかし、コラゲナーゼ誘発ラットアキレス腱損傷モデルはアキレス腱損傷に広く使用されてきた。このモデルは、腱炎に相当すると考えられる変性的な腱応答を開始し、上り坂トレッドミル過剰使用モデル（４ヶ月）と比べて急速に腱炎損傷を発症する（３日以内）。したがって、これは、腱損傷に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの効果を短時間でスクリーニングするモデルとなる。したがって、このモデルは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの治療効果の審査に、誘発期間が比較的短く、非常に好適であり、臨床的腱炎に相当する。

合計１６５頭の雄のスプラーグドーリーラットを本研究に用いた。これらの動物の右アキレス腱にコラゲナーゼを注射し、その後、コラゲナーゼ注射の７日後に損傷部位にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ又は対照（バッファーのみ）を単回注射処置した。コラゲナーゼ及びｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ又は対照（バッファーのみ）を、２８．５Ｇの針を付けたインスリン注射器を用いてラットの骨−腱接合部近くの右アキレス腱に注射した。

表１に概要を示すように、各群についてｎ＝１５で、動物を１１群に分けた。このモデルを用いた文献で報告されている実験では、従来から、生体力学的試験は処置群当たり８〜９頭の動物、組織学的分析には３〜６頭の動物が使用されてきた。

試験物質及び対照物質
研究対照群に、損傷した腱の自然な治癒応答を見積もるための対照として、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いないコラゲナーゼ処置ラットアキレス腱のラット腱の自然な修復応答を用いた。研究試験物質に、腱の再生を助ける注射用薬物としてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた。組換えヒト血小板由来成長因子ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）は、骨芽細胞、腱細胞、軟骨細胞、間葉系幹細胞等の間葉起源細胞に分裂促進性及び走化性である。したがって、筋骨格系の損傷部位に導入されると、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは結合組織細胞及び前駆細胞を処置部位に引きつけ、その増殖を刺激することにより細胞の数を増やし、これがその後マトリックスを沈着させて損傷組織を再生する。更に、上記実施例１に示されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢにさらされた腱細胞はＤＮＡ合成及び走化性の増大を示した。

異なる濃度の無菌組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢの２つのバッチ、（１）３．４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）及び（２）０．３４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）を本研究に用いた。ビヒクル対照サンプルは、無菌２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）とし、標準的なプロトコールに従って調製した。用量には、１．０２μｇ、１０．２μｇ、及び１０２μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが含まれる。３．４ｍｇ／ｍｌ及び０．３４ｍｇ／ｍｌの２つの濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むＮａＯＡｃバッファーを調製した。３０μｌで腱内に送達された時に、１０２μｇ及び１０．２μｇの用量レベルとなる。用量１．０２μｇ用には、０．３４ｍｇ／ｍｌの溶液を２０ｍＭのＮａＯＡｃバッファーで１：１０希釈した。コラゲナーゼは粉末の形態でシグマ−アルドリッチ社から購入し（カタログ番号Ｃ−６８８５；ミズーリ州セントルイス）、５０ｍＭのＮａＨ₂Ｐ０₄及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４±０．５）中に所望の濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）で再構成した。

研究開始時、３．４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、０．３４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ、及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー試験物質の少なくとも２つの未開封、未使用バイアルを、投薬、安定性、及び濃度の分析に用いるバイアルと同じ保存条件（
４℃）下に保持した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光測定及び逆相ＨＰＬＣ分析を用いて安定性及び用量の検証分析を行った。

試験物質及びビヒクル対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順を用いた。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（又は白衣）、及びアイプロテクションを着用した。

試験系（動物及び動物管理）
１６５頭の雄のスプラーグドーリーラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズＩｎｔ’ｌ社、マサチューセッツ州ウィルミントン）を本研究に用いた。研究に選択する前に、健康及び正常な歩行を確認する視覚検査により全動物をスクリーニングした。全ての動物を、体重に基づいて研究に選択した（コラゲナーゼ注射時におよそ３１５グラム）。各ラットは尾に書かれた固有の番号により識別した。体重に従ってラットをランダムに各群に割り当てた。

ラットは研究期間中同じ研究施設に収容した。全ての収容及び管理は動物保護法及び「実験動物の管理と使用に関する指針」に従った。麻酔等の適当な研究関連事象の際には食物及び水を控えたが、それ以外では自由に摂取させた。研究前に動物を最低５日間施設に順化させた。この順化期間により、動物を研究用の部屋の環境に慣れさせた。

実験デザイン
ケージ当たり４頭で収容した動物（１群当たり１５頭）にイソフルランで麻酔し、踵関節領域を刈りとって注射のために消毒した。２８．５Ｇの針を付けたインスリン注射器を用いて、全ラットの骨−腱接合部近くの右アキレス腱にコラゲナーゼ（５０ｍＭのＮａＨ₂Ｐ０₄及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４のＰＢＳに溶解した１０ｍｇ／ｍｌのもの５０μｌ）を注射した（図３）。コラゲナーゼ注射の７日後、２８．５Ｇの針を付けたインスリン注射器を用いて、ビヒクル又は１．０２μｇ、１０．２μｇ、若しくは１０２μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを総体積３０μｌで投与した。腱のダメージの組織病理学的評価及び生体力学のために７日目（ベースライン）、１４日目、２８日目に動物を殺した。１５頭の各群について、６頭を組織病理学に用い、９頭の後脚（処置及び非処置後肢の両方）を取り、解剖し、その後の生体力学的評価のために凍結した。生体力学的評価は以下に説明する。

生存中の観察及び測定
屠殺するまで動物を少なくとも１日１回観察した。動物の処置はＵＳＤＡの動物保護法（連邦規則集第９巻の第１部、第２部、及び第３部）に略述されている規則並びに実験動物の管理と使用に関する指針（ILAR publication, 1996, National Academy Press）及びＨＳＳ獣医手技に規定されている条件に従った。

コラゲナーゼ注射前及び屠殺前に体重を記録した。食物消費量は定性的であった。

全動物を適切な研究エンドポイントで屠殺した。予定外の動物の死亡は観察されなかった。生存中処置群の完了後、ＵＳＤＡの動物保護法、実験動物の管理と使用に関する指針（ILAR publication, 1996, National Academy Press）、及びＨＳＳ獣医手技に従い、動物を安楽死させ、組織を回収した。ＣＯ₂の過剰投与により動物を安楽死させた。反射（
まばたき、引っ込み等）の欠如により死亡を確認した。

肉眼的な腱の大きさ
剖検の直前に、以下のシステムに従って足首の太さをスコア化した：０＝成長なし；１＝軽度の成長；２＝中程度の成長；３＝重度の成長。

組織学
剖検では、皮膚を注意深く踵関節領域から外し、足全体を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に浸し、屈曲状態で固定した。１０％ＮＢＦ中で最低１２時間及び脱灰のための１０％ギ酸中で４〜５日の後、腱−骨接合部を特に強調して足首の内側及び外側で切り整え、約１／４インチ厚の組織ブロックを得（腱が付着している足首の中央部）、ラベルした組織用カセットに入れた。切り整えた足首組織ブロックを矢状方向でパラフィン包埋に処理した。回転式ミクロトームを用いて、骨−腱接合部が好適に視覚化されるまで、２００ミクロン毎に代表的な４〜６ミクロン厚の切片を取り、その後、これらの切片をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、マッソン三色染色し、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の免疫組織化学的検出に用いた。

血清を得るために、イソフルラン麻酔下で大動脈用のバキュテイナを差し込むことにより、全動物を末端で出血させた（１０ｍｌの血液を採取した）。血液を１，８００ｇ、室温で１０分間遠心して血清を得た。１ｍｌまでの血清を２ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）チューブに入れた。分析前に血清を−７０℃で保存した。

組織病理学的評価を以下に記載するように行った。種々のパラメータの測定は、光学顕微鏡を用いて各組織学的検体（スライド）から３つの等距離視野カラムを評価することによりなされた。

組織病理のために測定されたパラメーターには以下が含まれる。

（１）炎症
Ｈ＆Ｅ染色により、炎症細胞の種類（好中球、リンパ球、及びマクロファージ）を決定した。炎症を以下のようにスコア化した：（ａ）０＝炎症なし；（ｂ）１＝微小炎症（１００％単核；好中球なし）；（ｃ）２＝中程度の炎症（好中球＝１９％；細胞の残りは単核）；及び（ｄ）３＝顕著な炎症（好中球＝２０％；細胞の残りは単核）。

（２）コラーゲン組織化
コラーゲン原線維の組織化をＨ＆Ｅ及びトリクロームによる染色により評価した。コラーゲンの組織化を以下のようにスコア化した：（ａ）０＝コラーゲン原線維が完全に組織崩壊している；（ｂ）１＝コラーゲン原線維の一部は整列しているが、束の大部分が高度に組織崩壊している；（ｃ）２＝コラーゲン原線維が高度に整列しているが、束はまだ幾分組織崩壊している；及び（ｄ）３＝組織中に存在するコラーゲン原線維が完全に整列しており、コラーゲン束の組織崩壊がない。

（３）コラーゲン繊維密度
修復組織中のコラーゲン繊維密度をＨ＆Ｅ及びトリクロームによる染色により評価した。コラーゲン繊維密度を以下のようにスコア化した：（ａ）０＝低密度コラーゲン束；（
ｂ）１＝中密度コラーゲン束；及び（ｃ）２＝高密度コラーゲン束。

（４）修復部位における腱の血管新生
修復組織における血管新生をＨ＆Ｅ及びトリクロームによる染色で評価した。血管新生を以下のようにスコア化した：（ａ）０＝なし（血管新生なし）；（ｂ）１＝中程度；及び（ｃ）２＝豊富。

（５）細胞増殖
ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて細胞増殖を評価した。接眼マイクロメーターを用いて３９．４×１９７μｍ（７７６２μｍ²）の領域又はマイ
クロメーター上の１０×５０ユニットを描いた。各検体について、この寸法の３つの視野を計数した。これらの３つの等距離の視野から、増殖している細胞を計数した。

（６）腱幅の測定
顕微鏡下で接眼マイクロメーターを用いて腱の２つの異なる部位を測定した。踵骨付着点（付着部位の厚さを最もよく表すと考えられる非接線領域（ｎｏｎ−ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ａｒｅａ））及び腱自体（増殖応答のある付着部位から遠い腱本体の最も厚い非接線領域）の測定値を取った。

マンホイットニーのＵ検定又はクラスカル・ワリス検定（ノンパラメトリック）を用いて半定量的組織病理データを分析した。１元配置分散分析（１元配置ＡＮＯＶＡ）を適切な多重比較事後検定と共に用いて全群の適当なデータを分析した。

生体力学的試験
本研究のこの部分には９９頭の動物を用いた。損傷を誘発した腱を、反対側のコラゲナーゼ処置しなかった腱と共に評価した。合計１２３個の生体力学的検体を評価した。処置の割当ての概略を上記表１に示す。

脚（ｌｅｇ）を大腿部で切り離し、足中央部（ｍｉｄ−ｆｏｏｔ）まで切開（ｄｅ−ｓｌｅｅｖｅ）した。メスを用いて、アキレス−腓腹筋複合体を脛骨から切り離した。簡潔に述べると、踵骨付着点から開始して、メスを脛骨に沿って走らせて複合体を分離し、筋肉の大部分を腱に付けたままにして生体力学的試験で握持できるようにする。腱を分離した後、中足との接合部で脛骨を除き、生体力学的試験で遠位端を握持するために足は付けたままにする（図４）。生体力学的分析を行う前に、保存するために、中足−アキレス−腓腹筋全体の検体を、食塩水に浸したガーゼにくるみ、−２０℃で凍結する。

力学的試験（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ）の前４時間以内に、プロテイナーゼ阻害剤を含む４℃のＰＢＳ中でサンプルを解凍した。腱サンプルをパットドライし、余分な筋肉を除去してグリップにサンプルを取り付け易くした。骨をクリッパー（ｃｌｉｐｐｅｒ）で切り整えて取り付け易くした。

すべての力学的試験はインストロン社製の試験フレーム（モデル５５６６）上で行い、ＰＢＳを含む浴に浸しながらサンプルを試験した。各検体に正確な変位制御を加え、荷重精度±０．５％の１００Ｎロードセルを用いて、荷重を測定した。全てのデータ取得及びデバイス制御はパソコンを用いて行われ、データは１０Ｈｚで取得される。

引張試験中に検体が滑らないように、油圧グリップ中で２つの粗くした定盤と紙やすりの間に検体を取り付けた。０．１Ｎを予め検体に負荷し、検体の長さを記録し、その後、０．１Ｎ及び１Ｎの荷重間で１０サイクル分、予めサイクルした。０．１％／秒の歪み速度で構造体に一軸引張変位を与え、その時の荷重を記録した。破壊が起こって測定される
荷重が０．０５Ｎ未満となるまで、サンプルを引っ張って破損するまで試験する。試験前に、検体の横断面積を測定した。特定可能な群の分類を一切示さず、盲検的に全ての検体を試験した。

試験後、収集したデータを分析して、それぞれ荷重−変位曲線又は応力−歪み曲線の線形部分から、（１）線形剛性及び（２）弾性係数を決定した。荷重データから最大荷重及び極限引張強さも決定した。ピーク荷重までの力変位曲線下面積として定義される弾性靭性（ｅｌａｓｔｉｃ ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）をリーマン和法を用いて数値的に計算する。

生体力学的データの分析には、交互作用項を用いる二元配置ＡＮＯＶＡ及びフィッシャーのＬＳＤ事後検定（ｐ＜０．０５）を用いた。１元配置分散分析（１元配置ＡＮＯＶＡ）を適切な多重比較事後検定と共に用いて、利用可能なデータを全群について分析した。

応力とは、サンプルの横断面積に対して正規化された、検体への荷重である。歪みとは、元のサンプルの長さに対して正規化された、検体の長さの変化を表す。したがって、応力対歪み曲線は、荷重対変位曲線が正規化されたものである（検体の寸法のばらつきによる影響が除かれている）。例えば、より長い腱はより大きな総変位を有することになり、一方、より幅の広い腱は、より幅の狭い腱より大きな荷重に耐えることができる。検体間の寸法におけるこれらのわずかなばらつきは、それらが耐えられる荷重及び変位の大きさに有意な影響を与える。これらの変数を、応力及び歪みに対してそれらの寸法で正規化すると、分析は検体の大きさに依存しなくなる。荷重対変位曲線から直接抽出された全ての特性を構造的特性と呼ぶ。正規化された応力対歪み曲線から抽出された全ての特性を材料特性と呼ぶ。

線形剛性（Ｌｉｎｅａｒ Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）とは、荷重対変位曲線の線形部分の最小二乗法から決定される構造的特性である。これは検体の引張剛性を表す。

弾性係数は、応力対歪み曲線の線形部分の最小二乗法から決定される材料特性である。これは腱材料の引張剛性を表す。

最大荷重とは、引っ張り中に検体が耐えられる最大の荷重である。

極限引張応力とは、検体の横断面積によって正規化された最大荷重である。

靭性（ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）とは、折れる又は壊れるまでの材料の抵抗である。これは通常、エネルギーの単位で測定され、破損（ｆａｉｌｕｒｅ）までの荷重−変位曲線下面積として計算される。

結果
肉眼的な足首の太さ（Ｇｒｏｓｓ Ａｎｋｌｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの単回腱内注射の７日後に肉眼的な足首の太さの用量依存的増加が観察され（図６Ａ及び図７、Ｔｘ後７日目）、中用量（１０．２μｇ）及び高用量（１０２μｇ）で注射７日後に腱の大きさが有意に増加していた。Ｔｘ後２１日目では、ビヒクル対照群（酢酸ナトリウムバッファー）以外の全群で肉眼的な足首の太さが減少していた。このことは、処置後２１日目における組織のリモデリングを示唆している（図６Ｂ及び図７、Ｔｘ後２１日目）。図６Ａ、６Ｂ、及び７のデータは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目及び２１日目におけるアナログスケールに基づいている（０＝成長なしから、３＝重度の成長）。記載データは、１群当たりｎ＝６頭の足首の太さの平均（±ＳＥＭ）である。

ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの体重への影響
処置時の動物の平均体重は３１４．４８グラムであった。処置後７日目及び２１日目の平均体重はそれぞれ３９６．４及び４６７．０グラムであった。いずれの時点でも処置に関連する体重の変化はなかった。

ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの骨への影響
異常な骨の成長及び再吸収のどちらも確認されなかった。

踵骨付着点（付着部）における腱の幅へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
図８は、処置後７日目及び２１日目の踵骨付着点において測定した腱幅（μｍ±ＳＥＭ）を示す図である。記載データは、１群当たりｎ＝６頭の踵骨付着点における腱幅の平均（±ＳＥＭ）である（^*ビヒクル対照群に対してｐ＝０．０１）。腱幅は接眼マイクロメ
ーターを用いた顕微鏡観察により測定した。

処置７日後（Ｔｘ後７日目）、ビヒクルと比べて、３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ
−ＢＢ用量群で踵骨付着点における腱幅の有意な増加（〜１３７％の増加）が観察された（図８、Ｔｘ後７日目）。３．２４及び３２４μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処置した動物は、腱幅の有意な増加を示さなかったが、ビヒクル対照より大きい傾向があった。処置後２１日目では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処置した動物及び処置しなかった動物の腱幅に有意な差は測定されなかった（図８、Ｔｘ後２１日目）。処置後２１日目（図８、Ｔｘ後２１日目）までに、３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群は、処置後７日目
と比べて４０％の腱幅の減少を示した。このことは、腱がリモデリングされたことを示唆している（図８）。

腱中央部分（Ｔｅｎｄｏｎ Ｍｉｄ−Ｂｏｄｙ）の腱幅へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
図９は、処置後７日目及び２１日目において測定された腱中央部分の腱幅（μｍ±ＳＥＭ）を示す図である。記載データは、１群当たりｎ＝６頭の腱本体の腱幅の平均（±ＳＥＭ）である（^*ビヒクル群に対してｐ＜０．０５）。腱幅は、接眼マイクロメーターを用
いた顕微鏡観察により測定した。

処置後７日目に３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群で、ビヒクル対照群に
対して〜９７％の腱幅増加が観察された（図９、Ｔｘ後７日目）。３．２４及び３２４μｇ／ｋｇ用量群では、ビヒクル群及び非処置（Ｔｘ）群と比べて有意でない用量依存的増加が観察された。２１日目には、全群で腱幅の有意な差は観察されなかった（図９、Ｔｘ後２１日目）。しかし、２１日目に、３２．４μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群は処置後７日目と比べて１１６％の腱幅減少を示した。これは腱がリモデリングされたことを示唆している。

細胞増殖へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
細胞増殖の定量化は、免疫染色されたＰＣＮＡ陽性細胞の細胞計数によりなされた（図１０）。記載データは、１群当たりｎ＝６頭の細胞数の平均（±ＳＥＭ）である（^*ビヒ
クルに対してｐ＜０．０５）。各検体について、寸法の等しい３つの視野を数えた。

ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群において細胞密度の用量依存的な増加が観察された。細胞増殖のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量依存的増加が処置後７日目に観察された（図１０、Ｔｘ後７日目）。ビヒクル対照に対して３２．４及び３２４μｇ／ｋｇ用量群では細胞増殖の有意な増加が観察され（図１０、Ｔｘ後７日目）、それぞれ〜６０％及び〜７２％の増加であった。しかし、２１日目には、細胞増殖に有意な差は観察されなかった（図１０、Ｔｘ後２１日目）。３２．４及び３２４μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ用量群はビヒクル対照の増
殖レベルまで戻っていた。このことは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの増殖反応が可逆的であることを示唆している（図１０、Ｔｘ後２１日目）。

炎症へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
全群、全時点で、マクロファージ及び単核細胞からなる軽度から中程度の炎症が観察された（表２）。

血管新生へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
全群、全時点で、血管新生の有意な変化は観察されなかった（表３）。

コラーゲン密度へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
全群、全時点で、コラーゲン密度の有意な変化は観察されなかった（表４）。

コラーゲン組織化へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
全群、全時点で、コラーゲン組織化の有意な変化は観察されなかった（表５）。

生体力学：断裂までの最大荷重へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの影響
このモデルにおいて、断裂までの最大荷重値によれば、非処置群は時間と共に自然修復した（図１１）。処置後７日目における断裂までの平均最大荷重値は、ビヒクル対照群及び非処置群と比べて３２．４μｇ／ｋｇ用量群で有意に上昇していた（それぞれ〜４３％及び２７％）（図１１、Ｔｘ後７日目）。処置後２１日目でも、断裂までの最大荷重はビヒクル対照と比べて依然として有意に上昇していた（図１１、Ｔｘ後２１日目）。処置後２１日目では、３２．４μｇ／ｋｇ用量群及び非処置群の平均最大荷重はほぼ同じであり、このことは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置により、非処置の場合より修復速度が上がったことを示している。しかし、ビヒクル群及び３２４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群では
、投薬後２１日目に３２．４μｇ／ｋｇ用量群及び非処置群よりも断裂までの最大荷重値が有意に下がっていた。記載データは１群当たりｎ＝９頭の断裂までの最大荷重の平均（±ＳＥＭ）である（＋「ビヒクル」群に対してｐ＜０．０５；^**「非処置」群に対してｐ
＜０．０５）。

表６に、反対側の無傷の腱並びにｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処置された腱及び処置されていない腱の力学的強度を示す。

コラゲナーゼ注射後１４日目における３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の断
裂までの平均最大荷重値（２６．８Ｎ）は、コラゲナーゼ注射後１４日目における無傷の腱（１９．０３Ｎ）より４１％増加していた。これは、３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧ
Ｆ−ＢＢ群の生体力学的特性が、通常の発達をしている腱より速く成熟したことを示唆している。更に、コラゲナーゼ注射後１４日目における３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ
−ＢＢ群の断裂までの平均最大荷重（２６．８Ｎ）は、コラゲナーゼ注射後２８日目における無傷の腱のもの（２７．９８Ｎ）に近づいていた。７、１４、及び２８日目の無傷群
及び非処置（コラゲナーゼ注射）群における断裂までの最大荷重値はほぼ同じであった。１４日目（Ｔｘ後７日目）、３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群は、ビヒクル群
、無傷群、及び非処置群より断裂までの最大荷重値が高く、それぞれ４３％、４１％、及び２７％増加していた。しかし、２８日目（Ｔｘ後２１日目）では、無傷群、非処置群、及び３２．４μｇ／ｋｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群の断裂までの最大荷重はほぼ同じであっ
た（表６）。

結論
生存中パラメーター
足首の太さの結果から、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置後７日目には腱の大きさが用量依存的に増加するが、２１日目までには成長が止まり、組織がリモデリングされて腱の大きさが小さくなることが示された。

全群、全時点で、体重に有意な差はなかった。

顕微鏡評価
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは細胞増殖、特に線維芽細胞増殖を増加させた。細胞増殖及び顕微鏡的腱幅の増加は可逆的であり、これは組織のリモデリングの潜在的適応期を示している。

本研究の条件下で、単回腱内送達後３週間にわたり、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢによる局所的有害作用は観察されなかった。異常な骨又は腱の成長及び骨吸収は特定されなかった。炎症は単核性であった。細胞のモルホロジーは線維芽細胞的であった。

生体力学
断裂までの生体力学的荷重データから、非ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置コホートと比べた時、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが腱の力学的強度のより速い修復反応を開始させることが示された。処置後２１日目までに細胞増殖及び腱幅はベースラインに戻ったが、これによって生体力学的な腱の強度は消失しなかった。

概要
本研究の生物学的及び生体力学的結果により、腱内に注射されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの局所的安全性が確認された。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ１回注射後、２１日間で弱まる腱成長の初期段階があった。本研究では、接眼マイクロメーターを用いて顕微鏡下で腱幅を測定し、ＰＣＮＡ免疫染色を用いて細胞増殖を測定した。それらの測定の結果、３２．４μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで処置された動物で、処置後７日目に顕微鏡的腱幅及び細胞増殖が増加することが示された。しかし、処置後２１日目までに、腱幅及び増殖は対照レベルに戻った。腱へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射後２１日間にわたり、異所性の又は異常な骨、及び異常な腱の成長は観察されなかった。

顕微鏡的な腱幅及び細胞増殖の初期の増加は、腱の力学的強度の上昇に対応していた。細胞増殖及び腱幅は処置後２１日目までにベースラインに戻ったが、こによって腱の生体力学的な強度は消失せず、腱の生体力学的向上は維持された。

本研究の結果は、外側上顆炎患者を処置する診療所で特に注目されるであろう。外側上顆炎では、疼痛並びに関与する腕及び手の荷重に耐える機能の低下を呈する短橈側手根伸筋（ＥＣＲＢ）腱の変性変化がある。本研究に記載されているラットアキレス腱障害モデルで示されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ治療による腱の生体力学的強度の上昇及び構造的変化は、臨床的に、外側上顆炎に罹患している患者にとっての疼痛の抑止及び機能の回復を意味すると予想される。

＜実施例４＞
組換えヒト血小板由来成長因子−ＢＢ（ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）静脈内投与後のスプラーグドーリーラットにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態
本研究の目的は、雄のスプラーグドーリーラットに単回静脈内投与されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態を評価することである。本研究は、静脈内投与後の体液（血清）に由来するナイーブｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのクリアランスを評価するようにデザインした。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態学的性質及び薬力学的性質をより深く理解するために、静脈内曝露後の全身クリアランスを決定した。本発明者らは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの静脈内投与後のクリアランス速度は速いという仮説を立てた。

研究デザイン
ラットモデル
ラットは、種々のクラスの化学物質の薬物動態及び毒性を評価するために一般的に使用されている齧歯類モデルであり、ラットには大きな過去のデータベースが存在する。合計４８頭の雄のスプラーグドーリーラットを本研究に用いた。６頭／群／時点で動物を２群に分けた（表７）。本研究は、本研究の目的、本発明者らの科学的ニーズ、及び現代の科学的標準を満たす、可能な限り少ない数の動物を用いるようにデザインされた。このデザインはデータの有意義な分析を可能にするのに十分な大きさの群を提供する。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、インスリン注射器（２８．５Ｇ）を用いて側尾静脈に静脈内送達により投与した。

試験物質及び対照物質
試験物質は０．４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）である。対照物質は２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）である。

研究開始時、０．４ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ及び２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ア
セタート）バッファーの試験物質の少なくとも２つの未開封、未使用バイアルを、投薬、安定性、及び濃度分析に用いるバイアルと同じ保存条件（４℃）下に保持した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光測定及び逆相ＨＰＬＣ分析からなる安定性及び用量の検証分析を行った（付属書類ＩＩ）。

試験物質及び対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順を用いた。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（又は白衣）、及びアイプロテクションを着用した。

試験系
本研究には４８頭の雄のスプラーグドーリーラットを用いた。本研究で使用したラットはその重量に基づいて選択した。処置時点における平均重量は約２２７グラムであった。各ラットは永久マーカー（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍａｒｋｅｒ）で書かれた固有の尾番号により識別した。麻酔等の適当な研究関連事象の際には食物及び水を控えたが、それ以外では自由に摂取させた。研究選択前に、視覚的検査によりすべての動物をスクリーニングした。

試験物質の投与
血清中でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの１００％のバイオアベイラビリティ及び薬物動態特性が達成されるように静脈内送達を選択した。用量は、ラット腱コラゲナーゼモデルにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ腱内適用の用量反応の有効性に関する先の研究（実施例３参照）に基づいて選択した。本研究で使用される最大用量濃度は、ラットの重量が０．２２７ｋｇで
あったことに基づき、１００μｇ、すなわち０．４４ｍｇ／ｋｇである。

ラット４８頭の重量を測定し、２４ラット／群で２群にランダムに分けた。ラットは体重に基づいて各群にランダムに割り当てた。

投薬前に体重を記録した。第１群の動物には、標的用量体積１．１ｍＬ／ｋｇ、０．４４ｍｇ／ｋｇ（４４０μｇ／ｋｇ）でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを単回静脈内投与した。第２群の動物は、標的用量体積１．１ｍＬ／ｋｇでビヒクル対照（ＮａＯＡｃバッファー）を受けた。静脈内注射は、インスリン注射器（２８．５Ｇ）を用いて側尾静脈アプローチによりなされた。約３００μｌの血清を回収した。

臨床観察
屠殺するまで動物を少なくとも１日１回観察した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射前及び屠殺前に体重を記録した。食物消費量は定性的であった。

適切な研究エンドポイントで全動物を屠殺した。生存中処置群の完了後、ＣＯ₂過剰投
与により動物を安楽死させた。反射（まばたき、引っ込み等）の欠如により死亡を確認した。本研究中、肉眼的又は組織病理学的観察は行わなかった。予定外の動物の死亡は記録されなかった。

血清の採取
約６００μｌの血液を血清チューブに取り、１，８００ｇ、室温で１０分間遠心して血清を得た。約３００μｌの血清を２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れた。分析前に血清を−７０℃で保存した。

血清分析
各時点でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度を測定した。Ｒ＆Ｄシステムズ社のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを用いてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを定量化した

薬物動態分析
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎの非コンパートメントモデルを用いて以下のパラメーターを計算した：最終半減期（ｔ１／２）、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｌａｓｔ、及びＣＬ。分析は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットアッセイを用いて血清中で決定される種々の時点で存在するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を用いて行われた。

統計
統計分析は、必要に応じて、平均、標準偏差、変動係数等の記述的パラメーターに限定した。

結果
処置時の全動物の平均体重は２２７グラムであった。動物は平均用量４４０．５３μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを受けた。

平均血清ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度−時間値を図１２に示す。投薬後１分でＣｍａｘ（６１６１．２ｎｇ／ｍＬ）に達した。その後、５分〜１時間の間にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度は低下した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度は１〜１６８時間まで、定量レベルより低かった（＜０．１５６ｎｇ／ｍＬ）。

表８に、雄のスプラーグドーリーラットにおいてＩＶ投与されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態学的体内動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を示す。送達された平均用量は４４０ｇ／ｋｇであった。０．０１６７時間（１分）でＴｍａｘが観察され、Ｃｍａｘは６１６１．２ｎｇ／ｍＬであった。ＡＵＣ０−ｌａｓｔは３７５．６４ｈｒ＊ｎｇ／ｍＬであり、クリアランス（ＣＬ）は１７．５ｍＬ／ｍｉｎ／ｋｇであった。

結論
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの静脈内（ＩＶ）投与では、初期に全身曝露量が高くなった。これは、投薬後の最初の１０分間に血液から迅速に排除される中間的クリアランス分子である。

＜実施例５＞
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの腱内投与後のスプラーグドーリーラットにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態
本研究の目的は、雄のスプラーグドーリーラットに単回腱内投与されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの薬物動態を評価することである。本研究は、腱内送達後のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの全身曝露量及びクリアランスを評価するようにデザインされた。

研究デザイン
ラットモデル
ラットは、種々のクラスの化学物質の薬物動態及び毒性を評価するために一般的に使用されている齧歯類モデルであり、ラットには大きな過去のデータベースが存在する。合計
３２頭の雄のスプラーグドーリーラットを本研究に用いた。８頭／群で動物をランダムに４群に分けた（表９）。本研究は、本研究の目的、本発明者らの科学的ニーズ、及び現代の科学的標準を満たす、可能な限り少ない数の動物を用いるようにデザインされた。このデザインはデータの有意義な分析を可能にするのに十分な群サイズを提供する。

試験物質及び対照物質
試験物質は、（１）３．４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）及び（２）０．３４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝６．０±０．５）である。対照物質は２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０±０．５）である。

研究開始時、３．４ｍｇ／ｍｌ及び０．３４ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ試験物質並びに２０ｍＭ酢酸ナトリウム（酢酸塩）バッファー対照物質の少なくとも２つの未開封、未使用バイアルを、投薬、安定性、及び濃度分析に用いるバイアルと同じ保存条件（４℃）下に保持した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光測定及び逆相ＨＰＬＣ分析からなる安定性及び用量の検証分析を行った（付属書類ＩＩ）。

本研究で用いる用量には１．０２、１０．２、及び１０２μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが含まれる。用量１０２μｇ及び１０．２μｇは、それぞれ３．４ｍｇ／ｍｌ及び０．３４ｍｇ／ｍｌの３０μｌ注射によってなされた。用量１．０２μｇには、０．３４ｍｇ／ｍｌをＮａＯＡｃバッファーで１：１０希釈した。

試験物質及び対照物質の取扱いには標準的な研究室の安全手順を用いた。具体的には、用量の調製及び投与中、手袋、フェイスマスク、手術着（又は白衣）、及びアイプロテクションを着用した。

試験系
３２頭の雄のスプラーグドーリーラットを本研究に用い、重量に基づいて選択した（注射時に約２９４グラム）。ラットを体重に基づいてランダムに各群に割り当てた。

各ラットは尾に書かれた固有の番号により識別した。麻酔等の適当な研究関連事象の際には食物及び水を控えたが、それ以外では自由に摂取させた。研究選択前に全動物を視覚的検査によりスクリーニングした。

動物の処置は、ＵＳＤＡの動物保護法（連邦規則集第９巻の第１部、第２部、及び第３部）に記載されている規則及び実験動物の管理と使用に関する指針（ILAR publication, 1996, National Academy Press）に規定されている条件に準拠したＦＩＭＲのＣＣＰ標準手順に従った。

試験物質の投与
アキレス腱内投与は、診療所におけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの投与を真似たものである。腱−踵骨接合部の注射部位は、腱及び骨の付着点部位を真似たものである。

用量は、ラット腱コラゲナーゼモデルにおけるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ腱内適用の用量反応の有効性に関する先の研究（実施例３参照）に基づいて選択した。本研究で使用される最大用量濃度は、ラットの重量が０．２９４ｋｇであったことに基づき、１０２μｇ、すなわち０．３４７ｍｇ／ｋｇである。

平均重量が２９４グラムの３２頭の雄スプラーグドーリーラットを８頭／群の４群にランダムに分けた。第１群、第２群、及び第３群はそれぞれ、骨腱接合部近くの右アキレス
腱に１頭当たり３０μｌ（０．１０２ｍＬ／ｋｇ）の標的送達体積で、平均用量３４７μｇ／ｋｇ、３４．７μｇ／ｋｇ、及び３．４７μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを単回腱内ボーラス投与された。第４群は、１頭当たりの標的送達体積３０μｌで、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーの単回腱内注射を受けた。処置は、インスリン注射器（２８．５Ｇ）を用いて骨腱接合部近くの右アキレス腱中に注射された。血清用の空の１ｃｃ注射器（２６Ｇ）を用いて、以下の出血時間で動物の尾静脈から出血させた（全血〜４００μｌ、血清〜２００μｌ）。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡを用いて血清中のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを測定した。

血液約４００μｌを血清チューブに回収し、１，８００ｇ、室温で１０分間遠心して血清を得た。血清約２００μｌを２ｍＬのエッペンドルフチューブに入れた。保存した血清サンプルでｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を測定するための分析の前に血清を−７０℃で保存した。

臨床観察
屠殺するまで動物を少なくとも１日１回観察した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射前に体重を記録した。食物消費量は定性的であった。予定外の動物の死亡は記録されなかった。

適切な研究エンドポイントで全動物を屠殺した。生存中処置群の完了後、ＣＯ₂過剰投
与により動物を安楽死させた。反射（まばたき、引っ込み等）の欠如により死亡を確認した。本研究では肉眼的及び組織病理学的観察は行わなかった。

血清分析
各時点でｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度を測定した。Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネソタ州ミ
ネアポリス）のQuantikine(登録商標) Human PDGF-BB Immunoassay for the Quantitative Determination of Human Platelet Derived Growth Factor-BB Concentrations ELISA
キットを用いて以下のようにｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを定量化した。

最初に、キット中の全ての試薬を使用前に室温にした。次に、試験サンプルに用いるのと同じロットのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの標準曲線を作製した。キットに付属の希釈バッファーを用いてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。次いで、その溶液を濃度０．１５６２５ｎｇ／ｍｌまで１：２で段階希釈した。試験されるサンプルを同じ希釈バッファーで希釈して、濃度の値が０．１５６２５〜１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ標準曲線に十分収まるようにした。

全サンプルを２重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）でアッセイするのに必要なウェルの数を決定し、マイクロタイタープレート上の各８ウェルストリップに適宜番号を振った。１ウェル当たり１００μｌのＡｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１Ｘを各ウェルに添加した後、１００μｌの標準及びサンプルを添加した。次いで、プレートを接着性のカバーで覆い、オービタルシェーカー（５０〜７０回転／分に設定）上で室温にて約２時間インキュベートした。各ウェルを吸引し、３００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。４回繰り返す。次いで、２００μｌの抗ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｒ＆Ｄ社製キットに付属。希釈不要）を各ウェルに添加した。新しい接着性カバーでプレートを多い、５０〜７０回転／分に設定したオービタルシェーカー上で約１．５時間室温でインキュベートした。吸引及び洗浄ステップを繰り返した後、２００μｌのＳｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（Ｒ＆Ｄ社製キットに付属。希釈不要）を各ウェルに添加した。次いで、サンプルを室温、暗黒下、オービタルシェーカー上で約３０分間インキュベートした。５０μｌのＳｔｏｐ溶液（Ｒ＆Ｄ社製キットに付属。希釈不要）を各ウェルに添加し、色の展開が不均一であった場合には、８チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて上下に２〜４回ピペッティングすることにより溶液を混合した。４５０ｎｍ（５４０ｎｍの波長補正を使用）に設定したマイクロプレートリーダー中で、Ｓｔｏｐ溶液の添加から３０分以内に各ウェルの光学濃度を決定した。光学濃度の読取値をマイクロソフトエクセルにエクスポートして分析した。

サンプルそれぞれの平均値を計算した。各プレートの標準曲線を用いて、各試験サンプルについてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度を計算した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ濃度及び各サンプルの総体積を用いて、各サンプル中に存在するタンパク質の総量を計算した。

薬物動態分析
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎの非コンパートメントモデルを用いて以下のパラメーターを計算した：最終半減期（ｔ_1/2）、最高濃度到達時間（Ｔ_max）、Ｔ_maxで起こる最高濃度（Ｃ_max）、ｔ＝０時間からｔ＝最終観察時点までの薬物濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ_0-last）、及びバイオアベイラビリティ（％Ｆ）。分析は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットアッセイを用いて血清中で決定された種々の時点で存在するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を用いて行った。

最終観察濃度（ＡＵＣ_inf）、静脈内投与の全身クリアランス（ＣＬ）、腱内投与の全
身クリアランス（ＣＬ／Ｆ）に基づいて、時間＝０から無限大まで外挿した薬物濃度−時間曲線下面積等の他のパラメーターを計算することができる。

統計
統計分析は、必要に応じて平均値、標準偏差、変動係数等の記述的パラメーターに限定した。

結果
処置時点の全動物の平均体重は２９４グラムであった。平均用量３４７μｇ／ｋｇ（１０２μｇ）、３４．７μｇ／ｋｇ（１０．２μｇ）又は３．４７μｇ／ｋｇ（１．０２μｇ）のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを動物に投与した。

３４７μｇ／ｋｇ用量群の平均ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度−時間値を図１３に示す。５分〜８時間にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度の低下が観察された。８〜１６８時間では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの血清濃度はＥＬＩＳＡの定量レベルより低かった（＜０．１５６ｎｇ／ｍＬ）。３４．７μｇ／ｋｇ及び３．４７μｇ／ｋｇ用量群のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度は、全時点で定量レベルより低かった（＜０．１５６ｎｇ／ｍＬ）。

表１０に、雄のスプラーグドーリーラットにおける３４７μｇ／ｋｇ用量群のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ腱内（ＩＴ）投与及び実施例４に記載した４４０μｇ／ｋｇ用量群の静脈内（ＩＶ）投与のパラメーターの薬物動態分析を示す。Ｔｍａｘは０．０８３時間（４．９８分）に見られ、Ｃｍａｘ濃度は１６．３ｎｇ／ｍＬであった。ＡＵＣ０−ｌａｓｔは１２．５８ｎｇ^*ｈｒ／ｍＬであり、バイオアベイラビリティは３．３４％であった。３４．
７μｇ／ｋｇ及び３．４７μｇ／ｋｇ用量群のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ血清濃度は全ての時点で定量レベルより低かった（＜０．１５６ｎｇ／ｍＬ）ので、薬物動態パラメーターは計算されなかった。

結論
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの腱内（ＩＴ）投与では、初期に速くて低い全身曝露量が見られた。３４７μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢより低い用量では、検出可能な血清濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは観察されなかった。

３４７μｇ／ｋｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのＩＴ投薬では、投与された用量の約３．３４％が全身循環に達したが、Ｃｍａｘの値は、ＩＶ投薬後に見られた値のたった０．２６％であった。したがって、腱内投与後のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは、血清への吸収後に迅速にクリアランスされる。腱内投与後のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのバイオアベイラビリティが低い（〜３．３４％）ことから、驚くべきことに、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが作用部位に保持されることが予測される。

＜実施例６＞
外側上顆炎へのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射の影響に関する第ＩＩ相ランダム化単回投与用量漸増二重盲検プラセボ対照多施設研究
本研究の目的は、「テニス肘」としても知られる外側上顆炎の処置としてのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ注射の有効性を評価することである。

研究場所／研究群
研究は最大６ヶ所の臨床現場で行う。研究集団は、１群当たり対象２５名で４群にラン
ダム化された対象１００名である。各コホートにはプラセボ患者５名及び実薬処置患者２０名が含まれる。

研究集団：３ヶ月の保存療法に失敗した外側上顆炎の臨床診断を有する対象

研究デザイン
本研究は、第ＩＩ相ランダム化単回投与漸増用量二重盲検プラセボ対照多施設研究である。研究登録の選択基準を満たす適格な対象者を、研究参加のためのインフォームド・コンセントを得た後に登録する。対象は処置後２４週間フォローされる。研究登録後のランダム化により、１：１：１：１：１の計画で以下の処置群の１つに対象を割り当てる：（１）用量Ａ：バッファーのみ−対照群；（２）用量Ｂ：バッファー＋０．４５ｍｇ ｒｈ
ＰＤＧＦ−ＢＢ；（３）用量Ｃ：バッファー＋０．７５ｍｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ；（４
）用量Ｄ：バッファー＋１．５ｍｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ；及び（５）用量Ｅ：バッファ
ー＋３．０ｍｇ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ。全ての用量で、総体積は、１用量当たりｒｈＰＤ
ＧＦ−ＢＢ溶液１．５ｍＬである（それぞれ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、及び２．０ｍｇ／ｍｌのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群に相当し、それぞれ７０ｋｇのヒトで６．４、１０．７、２１．４、及び４２．９μｇのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢに相当する）。バッファーは２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）である。

段階的漸増アプローチを用いてランダム化を行う。最初のランダム化は、以下のパターンを用いて対象を処置群に割り当てる統計的に検出される漸増法に従う：予め定められた統計的に検出される数の対象が用量Ａ（バッファーのみ−対照群）又は用量Ｂ（バッファー＋０．３ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）のいずれかにランダム化される。この最初
の用量耐性（用量Ｂ）のための予め定められた数に達した後、２段目のランダム化で、予め定められた統計的に検出される数の対象を加え、用量Ａ、用量Ｂ、又は更なる用量Ｃ（バッファー＋０．５ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）のいずれかにランダム化する。こ
の同じパターン、すなわち統計的に検出される数の対象を各段のランダム化スキーム内で加えることが、用量Ｄ（バッファー＋１．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）及び用量
Ｅ（バッファー＋２．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ）がランダム化スキームに組み
込まれて研究登録目標に達するまで繰り返される。

割り当てた用量の単回注射を、「ペッパリング法（ｐｅｐｐｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」を用いて腱に投与する。「ペッパリング法」とは、圧痛領域に針を挿入した後、針を皮膚から出さずに引っ込めて方向を変え、再度挿入することにより複数回の少量注射がなされる注射法である。

注射部位に対する局所的反応（赤み、腫れ、かゆみ、疼痛）、慢性的損傷領域への疼痛の増加、及びアレルギー反応の兆候について対象を評価する。対象が上記の症状の発生を報告した場合、対象の評価及び研究者による決定後に重症度及び試験薬との関連を決定し、指定のｅＣＲＦに記録する。症状の重症度及び関連がｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置に関係すると決定された場合、情報はすぐにスポンサー及び適切な規制機関に報告される。次いで、その時点で、登録を続けるか対象の登録を停止するかを決定する。

手順前の前後（ＡＰ）及び側面のＸ線写真を、手順前４週間以内にベースラインのイメージングのために得る。研究プロトコールに従って手順後２４週間の時点で更なるＡＰ及び側面Ｘ線写真を得る。全対象の２４週間にわたる追跡調査のための来診が完了した時に安全性の最終評価を行う。

選択基準
本研究に含まれる対象は、抵抗を加えた回外運動又は手首の背屈により症状が再現可能
であり、外側上顆炎の臨床診断を受けている、２１歳以上の対象である。

除外基準
本研究から除外される対象は、過去３ヶ月以内にコルチコステロイド注射療法を受けたことがある又は外側上顆炎を処置するための外科的処置を受けた対象；酵母由来産物に対するアレルギーを有する対象；手根管症候群の病歴がある対象；頸部神経根症の病歴がある対象；及び処置の６ヶ月以内に患部の肘に外傷を有した対象である。

研究期間
登録は約９ヶ月である。追跡調査のための来診には、手順後２４週間までの握力検査及び四肢の身体検査が含まれる。安全性のエンドポイントは２４週間目の最後の来診まで監視された。

主要評価項目
（１）安全性。有害事象の発生を評価することによりｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの安全性及び忍容性を評価した。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢは安全であり、患者に耐えられた。

副次的評価項目
研究手順前の２回目の来診及び研究手順後の４、８、１２、及び２４週目の来診で以下の評価を完了する：（１）上肢障害評価表のスコア（ＤＡＳＨ）、（２）視覚的アナログスコア（ＶＡＳ）、（３）握力検査により測定される努力の誠実さ。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを用いた処置は、処置前のスコアからの向上（ＤＡＳＨ及びＶＡＳ）、圧力及び／若しくは手首の屈曲よる疼痛の軽減、患部四肢の可動性の向上、並びに／又は握力の上昇等の腱の臨床的転帰の１又は複数の有益な変化をもたらす。

＜実施例７＞
ラットモデルにおける腱治癒に対するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢコーティング縫合糸の影響：組織学的及び生体力学的研究
要約
序論
アキレス腱の裂傷は、外科的修復が必要となることが多い一般的な損傷である。本研究の目的は２つあり、（１）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢでコーティングされた縫合糸を用いて修復部位に適切な量の因子を送達することができるかどうかを決定すること及び（２）生体力学及び組織学に基づいてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢでコーティングされた縫合糸がラットアキレス腱モデルにおける治癒を改善するかどうかを決定することである。

方法
以前に記載されているディップコーティングプロセスを用いて種々の濃度のｒｈＰＤＧＦ（０、０．３、１．０、及び１０．０ｍｇ／ｍｌ）で４−０バイクリル縫合糸をコーティングした。０ ｒｈＰＤＧＦ群を対照とした。ＥＬＩＳＡを用いて、種々のディップコ
ーティング溶液中でコーティングされた後の縫合糸上のｒｈＰＤＧＦの濃度を決定した。

ラットアキレス腱を横切し、４種類の縫合糸のいずれかを用いてすぐに修復した。手術後４週目に腱を回収した。各検体からの組織切片をコラーゲン組織化及び血管形成についてスコア化した。荷重及び伸張データが得られた各検体の一軸引張生体力学的分析を行った。各検体のヤング率、極限引張強さ、及び弾性靭性（Ｅｌａｓｔｉｃ ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）について生データを分析した。

結果
ｒｈＰＤＧＦで縫合糸をコーティングすることに成功した。ディップコート濃度が高い
ほど、縫合糸上のｒｈＰＤＧＦの量が多くなった。組織学的分析により、対照群とＰＤＧＦ群の間でコラーゲンスコア又は血管形成に有意な差がないことが示された。生体力学的結果から、対照（１．０±０．２ＭＰａ）と高用量ＰＤＧＦ群（１．９±０．５ＭＰａ及び２．１±０．５ＭＰａ）との間に極限引張応力の有意な差が示された。引張ヤング率は、ＰＤＧＦ １０ｍｇ／ｍｌ群（７．２２、ＳＤ ３．７９）で他の全ての群より有意に高かった。これにより、ＰＤＧＦコーティング縫合糸の正の用量反応及び強度改善が示された。

結論
本研究は、修復された腱の材料特性がｒｈＰＤＧＦコーティング縫合糸によって正の用量依存的に改善され得るという本発明者らの仮説を証明した。

序論
本研究で、本発明者らは、再現可能な量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで４−０バイクリル縫合糸をコーティングでき、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢコーティング縫合糸を用いたラットアキレス腱修復の増強により、生体力学的及び組織学的な評価で修復が用量依存的に改善されると仮説を立てた。

材料及び方法
本研究は２つのパートに分けて行った。１）インビトロでの縫合糸のコーティング及び分析並びに２）ラットモデルにおけるインビボでのアキレス腱修復。手順はＩＵＣＡＣによる承認を受けた。

パート１：
縫合糸コーティング：
４群の４−０バイクリル縫合糸（エチコン社（Ｅｔｈｉｃｏｎ）、ニュージャージー州サマービル）を、以前に記載されているようにディップコーティングプロセスを用いて（Dines J, Weber L, Razzano P, et al. The Effect of Growth Differentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a Rat Model. J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S）、（１）２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（キャリア対照）、（２）０．
３ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むバッファー、（３）１．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含むバッファー、及び（４）１０．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含
むバッファーでコーティングした。簡潔に述べると、７０％エタノールで処置した後、（針の付いた）縫合糸を、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（０、０．３、１．０、及び１０．０ｍｇ／ｍｌ）を含む又は含まない酢酸ナトリウムバッファー中に３０分間浸漬し、その後、風乾した。Dines et al．に記載されているプロセスと異なり、コーティング溶液中にゼラチ
ンは使用しなかった。生体内での研究に使用するために縫合糸を長さ１５ｃｍに切り揃えた。切り揃えた縫合糸の残った長さの部分をインビトロ分析に用いた。

インビトロでのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出
酢酸バッファー（第１群）又はｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（第２〜４群）の溶液でコーティングされた縫合糸（ｎ＝５／群）を溶出バッファー（２％のウシ胎児血清、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のＬ−グルタミン、及び１％のＨＥＰＥＳバッファーを含む最小必須培地）中に入れ、振盪機（ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ）の上で３７℃でインキュベートした。溶出バッファーは１、６、２４、及び４８時間の時点で完全に交換した。ＰＤＧＦ−ＢＢ ＥＬＩＳＡ（ｈｕｍａｎ ＰＤＧＦ−ＢＢ ＤｕｏＳｅｔ、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、各時点で放出された全ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを決定した。

パート２
研究デザイン
４８頭のスプラーグドーリーラット（３５０〜４００グラム）を、盲検的に４つの処置群のいずれかにランダム化した（各群につきｎ＝１２）。群は４つの異なる濃度のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢを含む上記ディップコーティング溶液、すなわち対照群（０ｍｇ／ｍｌ ｒ
ｈＰＤＧＦ−ＢＢ）及び３つの実験群（０．３、１．０、及び１０．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈ
ＰＤＧＦ−ＢＢ初期コーティング濃度）からなる。

外科的手技
全ての手術は無菌状態で行われた。アキレス腱の上の皮膚を１．５ｃｍ切開した。ブラントジセクションを用いてアキレス腱を露出させた。この時点で、メスを用いて踵骨の付着点近くで腱を横切した。すぐに、４つの群のいずれかの縫合糸を用いた１種類のmodified Mason-Allen縫合及び１種類の単純結節縫合を用いて腱を修復した。いずれの縫合の実施においてもラットアキレス腱が小さいことによる困難はなかった。コーティングされていない結節バイクリル縫合糸を用いて皮膚を閉じた。外科的修復後、動物は普通に歩き回れるようにした。４週間後、ラットを屠殺し、踵骨の骨片及び近位の腓腹筋−ヒラメ筋複合体を含む腱を回収した。検体を生体力学的分析（ｎ＝８／群、新鮮凍結）又は組織学的分析（ｎ＝４／群、ホルマリン固定）にランダムに割り当てた。

生体力学
荷重精度±０．５％の１００Ｎのロードセルを取り付けたインストロン社製のシステム（モデル番号５５６６）を用いて各検体に生体力学的一軸引張分析を行った。サンプルを、プロテアーゼ阻害剤を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で４℃で最大４時間解凍した後、解剖して余分な筋肉を除去し、踵骨及び腓腹筋−ヒラメ筋末端を２２０グリットのサンドペーパーで包んだ。検体を空気圧グリップの間に固定し、ＰＢＳ浴に浸漬した。サンプルを引っ張って予荷重（１Ｎ）を負荷し、サンプルの寸法を測定した。次いで、腱を歪み速度０．２５％／秒で引張伸張にさらした。検体が破損するまで引っ張り、パソコンで荷重及び伸張データを収集した。データは１０Ｈｚで取得した。試験後、収集したデータを分析して、それぞれ荷重−変位又は応力−歪み曲線の線形部分から（１）線形剛性及び（２）弾性係数を決定した。荷重曲線から最大荷重及び極限引張強さも計算された。

組織学
腱検体をアキレス腱付着部位で踵骨から分離し、修復されたアキレス腱を処理してパラフィン中に包埋した。各検体の矢状切片をマロリー３色染色又はシリウスレッド染色により染色した。スライドは画像化され、以前に記載されているように（Dines J, Weber L, Razzano P, et al. The Effect of Growth Differentiation Factor-5-Coated Sutures on Tendon Repair in a Rat Model. J Shoulder Elbow Surg 2007;16:215S-221S）コラー
ゲン組織化及び血管形成の程度についてのスコア化シートを用いて３人の盲検観察者によりスコア化された。処置群について知らされていない３人の独立した観察者が各スライドを評価した。各処置群の合計スコアを計算し、統計的有意性があるかどうか比較した。

統計解析
時間を反復測定として反復測定ＡＮＯＶＡを用いて、インビトロで放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量を分析した。初期コーティング濃度に対する放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量及び送達された総用量は非線形（ｌｏｇ−ｌｏｇスケール）最小二乗法に一致していた。一元配置ＡＮＯＶＡをボンフェローニの多重比較検定と共に用いて、群間における生体力学的パラメーターの差を決定した。クラスカル・ワリス検定をダンの多重比較事後検定と共に用いて組織学的分類スコアの統計解析を行った。生体力学データを平均値±ＳＥＭで表し、組織学スコアを中央値（範囲）で表す。有意性はｐ＜０．０５で決定した。

結果
インビトロｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ放出
インビトロ放出データは、放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量として表されており、縫合糸の長さで正規化されている（ｎｇ／ｃｍ）（図１４Ａ及び１４Ｂ）。インビトロ放出は、他の群にとってのベースライン測定値と見なされる第１群（０ｍｇ／ｍｌ）（累積放出量：１．３±０．１ｎｇ／ｃｍ）を含む全ての群で測定された。インキュベーションの最初の１時間後に、縫合糸からのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢのボーラス放出が観察された（第２群：６．２９±３．０ｎｇ／ｃｍ；第３群：６８．８１±９．３ｎｇ／ｃｍ；及び第４群：５８０９．４２±５４１．６ｎｇ／ｃｍ）（図１４Ａ）。最初のボーラス放出に続いて、４８時間の時点まで、更にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが連続的にゆっくりと放出された。４８時間のインキュベーション中に放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量は用量依存的であり、ディップコーティング溶液の濃度が高いほど多くのｒｈＰＤＧＦ−ＢＢが放出され、第４群（１０ｍｇ／ｍｌ；６４９５．９±５５２．６ｎｇ／ｃｍ）で、第２群（０．３ｍｇ／ｍｌ；１４．０±５．７ｎｇ／ｃｍ）及び第３群（１．０ｍｇ／ｍｌ；１２６．８±１８．８ｎｇ／ｃｍ）と比べて有意に増加していた（ｐ＜０．００１）（図１４Ｂ）。第２群と第３群で放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量（Ｙ、ｎｇ／ｃｍ）は以下の式により初期コーティング濃度（Ｘ、ｍｇ／ｍｌ）に対数比例していた（Ｒ²＝０．９５７５）。
Ｙ＝１０^{(1.711*log(X)+2.102)}

外科的観察及び肉眼的観察
全ての動物は手術に好ましい反応を示したが、例外として（組織学的検査に割り当てられた）第３群の１頭は麻酔による合併症により手術後一晩で死亡した。修復に使用された縫合糸の長さは群の間で一致していた（第１群：４．８±０．１ｃｍ；第２群：４．７±０．２ｃｍ；第３群：４．８±０．１ｃｍ；及び第４群：４．８±０．１ｃｍ；ｐ＝０．９４）（図１４Ｄ）。インビトロで放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ平均量及び縫合糸の長さに基づいて、各群のインビボでの用量（平均±ＳＥＭ）は以下のように計算された：第１群：０ｎｇ；第２群：６６．０±６１．２ｎｇ；第３群：６０２．５±１９０．９ｎｇ；及び第４群：３１，３４２．６±６７７４．５ｎｇ。放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの累積量同様、インビボで送達される用量（Ｙ、ｎｇ）は、以下の式で初期コーティング濃度（Ｘ、ｍｇ／ｍｌ）に対数比例した（Ｒ²＝０．９８５９）（図１４Ｃ）。
Ｙ＝１０^{(1.732*log(X)+2.757)}

生体力学
５つの検体は、その試験日にインストロン社製試験機でエラーが生じたため、生体力学的分析に使用することができなかった。生体力学的分析に得られた検体の数はｎ＝７（第１群、第２群、及び第３群）及びｎ＝６（第４群）であった。

修復された腱の構造的特性（極限荷重及び剛性）に有意な差は観察されなかった（ｐ＞０．１６）が、極限荷重の平均値（第１群：２２．１±１．８Ｎ；第２群：３１．６±３．５Ｎ；第３群：２８．０±３．７Ｎ；第４群：２７．６±１．８Ｎ）、及び剛性の平均値（第１群：６．７±０．４Ｎ／ｍｍ；第２群：８．９±０．８Ｎ／ｍｍ；第３群：８．０±１．０Ｎ／ｍｍ；第４群：７．９±０．７Ｎ／ｍｍ）は、対照群（第１群）よりもｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群で常に大きかった。

横断面積（ＣＳＡ）の有意な減少（ｐ＜０．０５）が、第１群（０．２１±０．０３ｃｍ²）及び第２群（０．２３±０．０４ｃｍ²）と比べて第４群（０．１４±０．０５ｃｍ²）で観察された。ＣＳＡは、第３群（０．１７±０．０２ｃｍ²）でも第２群と比べて有意に減少していた（ｐ＜０．０５）。ＣＳＡの減少により、修復された腱の材料特性（極限引張強さ及び弾性係数）に有意な差が生じた。極限引張強さの有意な増加（ｐ＜０．０
５）が、０ｍｇ／ｍｌ（１．０±０．１ＭＰａ）及び０．３ｍｇ／ｍｌ（１．４±０．１ＭＰａ）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群と比べた１０．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群（２
．１±０．２ＭＰａ）並びに０ｍｇ／ｍｌ群と比べた１．０ｍｇ／ｍｌ（１．９±０．２ＭＰａ）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群で見られた。弾性係数は、１０．０ｍｇ／ｍｌ（７．２２±１．５ＭＰａ）ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群で他のすべての群（０ｍｇ／ｍｌ：３．５±０．４ＭＰａ；０．３ｍｇ／ｍｌ：４．４±０．４ＭＰａ；１．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ
−ＢＢ：４．９±０．７ＭＰａ）と比べて有意に増加していることが観察された（ｐ＜０．０５）。０、０．３、及び１．０ｍｇ／ｍｌ ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群には互いに統計的
な差はなかった。

組織学
各群の動物４頭の組織学的検査を行った（第３群はｎ＝３）。各切片を３人の採点者がスコア化し、平均スコアを求めた。平均スコアは中央値（範囲）で表される。組織学的分析は、群間でコラーゲン組織化又は血管形成のスコアの有意な差を示さなかった。しかし、対照群と比べてｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ群で、特にコラーゲン組織化のスコアで、より正常な外観が観察される傾向があった。

考察
本研究で、本発明者らは、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢをバイクリル縫合糸にコーティングでき、インビトロで縫合糸から放出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量が初期コーティング濃度に依存することを実証した。構造的機械的特性（極限荷重及び剛性）又は組織学的試験で有意な差は観察されなかったが、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ処置群でこれらの特性の改善傾向が見られた。材料の力学的特性（極限引張応力及び弾性係数）の増加に示されるように、材料の生体力学的特性について、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢコーティング縫合糸に対する用量依存的反応が観察された。

生体力学的に、極限強度及び弾性係数について最大用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢで有意な差が観察された。極限強度（極限引張強さ又は極限引張応力ともいう）及び弾性係数（ヤング率ともいう）は、腱の寸法特性（変位及びＣＳＡ）で正規化された構造的特性（極限荷重及び剛性）を表し、組織の質の尺度となる。本研究では、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量を増やすとＣＳＡが減少したことから、材料特性の増加が説明される。ＣＳＡの減少は、より組織化された腱を示唆するものである。ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢによりコラーゲン組織化が改善される傾向が組織学的に観察されたものの、おそらく組織学に割り当てたサンプルサイズが小さかったため、このスコアはＣＳＡで見られたような統計的有意性には達しなかった。しかし、コラーゲン組織化の改善傾向は、ＣＳＡの減少と合わせて、最大用量のｒｈＰＤＧＦ−ＢＢにより対照縫合糸と比べてより質の高い腱組織（極限強度及び弾性係数の増大）が促進されたことを示唆している。

縫合糸コーティングプロセスの効率及び腱治癒への用量依存的影響を評価するために、適用されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの用量の定量化が必須である。インビトロ分析により、最大コーティング濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）で、放出されるｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの量の有意な増加が示されたが、より低い２つのコーティング濃度（０．３及び１．０ｍｇ／ｍｌ）では、放出されたｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの平均累積量が９倍違っても（それぞれ１４．０±５．７ｎｇ／ｃｍ対１２６．８±１８．８ｎｇ／ｃｍ）、有意な差が見られなかった。これは、この２つの低用量群の間で極限強度及び弾性係数に有意な差がなかったという観察結果と一致していた。

本研究は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢの送達によりラットアキレス腱の生物学的修復を増強できることを示した。本研究の制限事項は、本研究に用いられているサンプルサイズによりこれらの結果の解釈がどのように影響を受けるかということである。本研究は、生体力学
に８頭／群及び組織学に４頭／群でデザインされた。力学的試験日の１日でインストロン社の試験デバイスにエラーが生じたため、５つの検体が分析に含められず、統計的検出力が低下した。その結果、極限荷重、剛性等の特性が対照群と比べて平均的に増加しているように見えたにも関わらず、これらの特性のより小さな差は実験群で有意と見なされなかった。

結果が用量依存的であることが多い成長因子の応用では、動物のサイズが大きくなると、より大きな用量の送達が必要となり得る。予備調査（データ示さず）から、送達される用量が初期コーティング濃度及び縫合糸の表面積の両方に依存することが示された。このことは、より大きな動物用に用量を変更することが可能であることを示唆している。

示された結果は、臨床用途において、患者の腱の治癒改善及び機能向上にｒｈＰＤＧＦ−ＢＢコーティング縫合糸を使用できる可能性を示唆している。

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Claims (21)

1. 腱障害の処置に使用するための、１〜２ｍＬの１用量当たり７５μｇ〜７，５００μｇのＰＤＧＦ及びバッファーを含む組成物であって、前記組成物が腱又は骨−腱接合部への直接注射により投与される、組成物。
2. 前記腱障害が腱症、腱炎、又は腱鞘炎である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＰＤＧＦが、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、及びＰＤＧＦ−ＤＤからなる群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
4. 前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ＰＤＧＦが組換えヒト（ｒｈ）ＰＤＧＦ−ＢＢである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記組成物が、１〜２ｍＬの１用量当たり５００〜１，０００μｇ、５，０００〜７，５００μｇ、４５０〜３０００μｇ、４００〜１０００μｇ、５００〜９００μｇ、６００〜８００μｇ、６５０〜７５０μｇ、又は７００μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む、請求項４〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記組成物の体積が１用量当たり１．５ｍＬである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記バッファーが、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、酢酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（「トリス」）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）、及びＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ
   」）からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記バッファーが酢酸ナトリウムである、請求項８に記載の組成物。
10. 前記酢酸ナトリウムの濃度が１０〜１００ｍＭ、又は２０ｍＭである、請求項９に記載の組成物。
11. 前記組成物のｐＨが４．０〜７．０、又は６である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記腱障害が、アキレス腱障害、膝蓋腱障害、外側上顆炎、内側上顆炎、足底筋膜炎、及び回旋腱板腱障害からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記腱障害が外側上顆炎である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 前記組成物が単回投与として投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記組成物が単回注射によって投与される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記組成物が２回以上の投与で投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
17. 前記組成物が、週１回の単回注射によって４週間投与される、請求項１〜１３又は１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記組成物により、投与から７日以内にベースラインと比べて腱強度が少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％上昇する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記組成物により、腱が、投与から７日以内に、投与の２１日後に測定される最終強度の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％に達する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. （i）１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって週１回、
    （ii）１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって月２回、又は
    （iii）１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又はそれ以上にわたって月１回投与される、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
21. 患部に針を挿入した後、針を皮膚から出さずに引っ込めて方向を変え、再度挿入することによる複数回の少量注射によって投与される、請求項１〜１３の何れか一項に記載の使用のための組成物。