ES2199815T3 - Mineralizacion y desarrollo celular supeerficial sobre biomateriales. - Google Patents
Mineralizacion y desarrollo celular supeerficial sobre biomateriales.Info
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Abstract
Un procedimiento para generar una superficie mineralizada extendida sobre un material biocompatible, que comprende funcionalizar al menos una primera superficie de un material biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto dicha superficie funcionalizada in vitro con una cierta cantidad de una disolución que contiene un mineral eficaz para generar una mineralización extendida sobre al menos dicha primera superficie de dicho material biocompatible.
Description
Mineralización y desarrollo celular superficial
sobre biomateriales.
La presente invención se refiere generalmente a
los diversos campos de la litografía, la química, los
biomateriales y la ingeniería tisular. Más particularmente,
concierne a la estructuración y/o la mineralización de los
biopolímeros. Estos procedimientos proporcionados son
particularmente adecuados para la generación de biomateriales
tridimensionales modificados en superficie para su uso en cultivos
celulares, transplantes e ingeniería tisular.
Muchos procedimientos biomédicos requieren la
provisión de tejido sano para contrarrestar los procesos morbosos o
el traumatismo que se está tratando. Este trabajo se entorpece a
menudo por la tremenda escasez de tejidos disponibles para
transplantes y/o injertos. La ingeniería tisular puede proporcionar
últimamente alternativas al transplante de todo un órgano o
tejido.
Con el fin de generar tejidos modificados, varias
combinaciones de biomateriales y células vivas se están
investigando actualmente. Aunque la atención se centra a menudo en
los aspectos celulares de los procesos de ingeniería, las
características de diseño de los biomateriales también constituyen
un reto principal en este campo.
En los últimos años, la habilidad para regenerar
tejidos y para controlar las propiedades del tejido regenerado se
han investigado mediante el intento de ajustar las propiedades
mecánicas o químicas del armazón biomaterial (Kim y col.,
1997; Kohn y col., 1997). La mayoría de este trabajo ha
implicado la incorporación de factores químicos dentro del
material durante el procesamiento, o el ajuste de las propiedades
mecánicas alterando los constituyentes del material.
Los procedimientos precedentes se han usado en un
intento de utilizar las señales químicas o mecánicas para afectar
los cambios en la proliferación y/o la diferenciación de las
células durante la regeneración del tejido. A pesar de tales
esfuerzos, permanece en la técnica una necesidad de biomateriales
mejorados, particularmente aquellos con una capacidad mejor para
dar soporte al completo crecimiento de tejido in vitro (en
cultivo celular) e in vivo (tras la implantación).
El documento
EP-A-0 891 783 revela un
procedimiento para precalcificar un material poliéster
biocompatible mediante incubación en una solución
CaCl_{2}/Na_{2}HPO_{4}.
La presente invención supera varios
inconvenientes en la técnica proporcionando una serie de
procedimientos mejorados, composiciones y dispositivos para su uso
en cultivo celular, transplante celular e ingeniería tisular. Los
procedimientos, composiciones y aparatos de la invención incluyen
superficies biomateriales estructuradas y/o mineralizadas. Las
técnicas y productos proporcionados son particularmente útiles para
la generación de materiales de bioimplante tridimensionales o
contorneados con propiedades de superficie modificadas y para la
generación de biomateriales que incorporan factores bioactivos y/o
células. Los diversos procedimientos para usar los biomateriales
estructurados y/o mineralizados en ingeniería tisular, incluyen la
ingeniería y vascularización del tejido óseo, proporcionando así
control sobre los procesos biológicos.
La invención se define en las
reivindicaciones.
La invención implica el tratamiento de superficie
o funcionalización de un material biocompatible, preferiblemente
un polímetro poroso y degradable, tal como una película o esponja,
para estimular la nucleación y el crecimiento de una capa mineral
extendida en la superficie. Tal tratamiento puede ser controlado
para proporcionar una capa superficial mineral homogénea o una
capa mineral estructurada, tal como islas de minerales. Cada una
de tales capas minerales extendidas permite el crecimiento de capas
minerales similares a hueso, incluso sobre las superficies
internas de los poros de los armazones poliméricos.
Tales polímeros extensamente mineralizados,
estructuradamente mineralizados y/o hipermineralizados, de la
invención, tienen usos ventajosos en la ingeniería del tejido óseo
y la regeneración y la vascularización tisular. La formación de
islas minerales extendidas y/o de las sustancialmente homogéneas
capas minerales "continuas", particularmente aquellas sobre
las superficies internas de los poros de matrices tridimensionales,
es ventajosa en la medida en que puede conseguirse de forma simple
(una incubación de un paso), rápidamente (en aproximadamente 5
días), a temperatura ambiente, sin conducirnos a un descenso
apreciable en la porosidad total del armazón o en el tamaño de los
poros, y es flexible para una incorporación posterior de sustancias
bioactivas.
La posterior incorporación de sustancias
bioactivas se ejemplifica mediante la formación y el uso de
polímeros, preferiblemente polímeros biodegradables, que son tanto
mineralizados como proporcionados por la liberación sostenida de
factores bioactivos, tales como los factores de crecimiento
proteicos. En estos aspectos de la invención, la capa mineral
puede controlarse mediante la alteración del peso molecular del
polímero; la composición del polímero, la técnica de procesamiento
(verificación del solvente, presión de calor, gas espumoso) usada
para preparar el polímero; el tipo y/o densidad de los defectos
sobre la superficie del polímero, y/o mediante la variación del
tiempo de incubación.
El pretratamiento funcionalizado anterior a la
mineralización puede involucrar un tratamiento estructurado de
superficies biomateriales poliméricas usando un único proceso de
"difracción litográfica". Los procedimientos litográficos
anteriores de la estructuración de superficie se han limitado a
superficies planas, bidimensionales, lo cual es una limitación
significativa superada por los procedimientos proporcionados en este
documento. La presente invención es así aplicable a la
estructuración de superficie de biomateriales complejos
tridimensionales con contornos de superficie.
Esto es particularmente sorpresivo en la medida
en que esto proporciona patrones de suficiente resolución para ser
útiles en realizaciones biológicas. Otras ventajas de la invención
sobre los procedimientos de la técnica previa incluyen la
incorporación preparada de componentes biológicamente activos
dentro de los biomateriales estructurados y el riesgo reducido de
contaminación. Otras características significativas de la invención
son la efectividad de coste y la naturaleza ahorradora de trabajo
de las técnicas.
Los varios biomateriales mejorados de la
invención tienen usos ventajosos en el cultivo celular y tisular y
en los procedimientos de ingeniería, tanto in vitro como
in vivo. Siguiendo sólo el ejemplo, la presente invención
proporciona procedimientos biomateriales y composiciones con
superficies minerales estructuradas para su uso en la
estructuración de la adhesión de las células óseas.
Por consiguiente, los procedimientos generales de
la invención son aquellos adecuados para la modificación de
superficie de al menos un primer material o dispositivo
biocompatible, comprendiendo
- la generación de una superficie mineralizada extendida sobre un material o dispositivo biocompatible mediante un procedimiento que incluye la funcionalización de al menos una primera superficie de un material o dispositivo biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares de oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto la superficie funcionalizada con un incremento de una solución que contiene minerales, generándose así una mineralización extendida de al menos una primera superficie del material o dispositivo biocompatible.
El pretratamiento puede involucrar la generación
de una superficie estructurada o de un material o dispositivo
biocompatible mediante un procedimiento que incluye la irradiación
de al menos una primera superficie fotosensible de un material o
dispositivo biocompatible con una radiación electromagnética
preestructurada, generándose así una estructura de al menos una
primera superficie del material o dispositivo biocompatible.
Los procedimientos de irradiación, litográficos o
la litografía de difracción generalmente incluyen la generación de
una superficie estructurada sobre un material biocompatible
mediante un procedimiento que incluye la funcionalización de al
menos una primera superficie fotosensible de un material
biocompatible mediante la irradiación de la superficie
fotosensible con una cantidad de radiación electromagnética
preestructurada efectiva para generar un material estructurado
biocompatible que incluye una estructura sobre al menos una
primera superficie del material biocompatible. En estos
procedimientos, la superficie funcionalizada es funcionalizada para
crear una pluralidad de grupos polares de oxígeno en la
superficie, generalmente para que la superficie funcionalizada
pueda ser modificada posteriormente, e.g., con minerales,
células o similares.
Se notará así que los procedimientos para generar
una superficie estructurada sobre un biomaterial o dispositivo,
incluyen "directamente" la aplicación de radiación
preestructurada sobre una superficie fotosensible de un material o
dispositivo. La aplicación "directa" de la radiación
preestructurada es una ventaja significativa sobre si esto ocurre
sin la intervención de una "máscara", lo cual es una
desventaja significativa en litografía de contacto. La presente
invención proporciona así una litografía con "menos máscara" o
"desnuda" para la estructuración biomaterial en la cual la
radiación preestructurada está incidiendo directamente sobre una
superficie fotosensible de un biomaterial en ausencia de una
máscara intermedia.
La "radiación electromagnética", como se usa
aquí, incluye todos los tipos de radiación que en origen son
electromagnéticos, i.e., estando compuesta de campos
eléctricos y magnéticos perpendiculares. La radiación
preestructurada para usar en la invención es preferiblemente
radiación electromagnética interferida constructiva o
destructivamente.
La presente invención incluye el uso de toda la
radiación interferida constructiva o destructivamente, tanto la
interferencia constructiva o destructiva basada en la amplitud,
como los hologramas de fase que dependen sólo de la interferencia
constructiva o destructiva basada sólo en la fase. Una ventaja de
los hologramas sólo de fase es que pasa mucha luz, y se puede
formar un patrón más complejo. Sin embargo, el empleo de rejillas
de difracción para proporcionar interferencia constructiva o
destructiva basada en la amplitud es ventajosa en construcción y
coste.
La radiación preestructurada puede ser
interferida constructiva y destructivamente por una parte efectiva
del espectro visible. La radiación constructiva y destructivamente
interferida en los rayos ultravioleta, infrarrojos y del espectro
visible son los ejemplos preferidos, con los espectros
ultravioleta y visible como más preferidos.
La radiación preestructurada, interferida
constructiva y destructivamente puede ser generada mediante la
incidencia de radiación monocromática en un elemento óptico de
difracción que convierte la radiación monocromática en radiación
interferida constructiva y destructivamente.
La radiación monocromática puede ser generada
desde cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, uno o más lásers o una
o más lámparas de mercurio. La radiación monocromática puede ser
generada primero desde una fuente de radiación electromagnética y
entonces pasar a través de un filtro adecuado.
Un amplio rango de elementos ópticos de
difracción pueden ser usados en la invención. "Elemento óptico de
difracción" es un término que incluye rejillas de difracción,
hologramas, y otros generadores de estructura. No hay virtualmente
ninguna limitación a estos aspectos de la invención como algún
componente del espectro pueda ser estructurado mediante algún tipo
de elemento óptico mediante variación del diseño del elemento
óptico. Por ejemplo, hay una relación bien definida entre la
característica espaciamiento en un patrón de difracción, y el
espaciamiento de las ranuras en el patrón de difracción más la
longitud de onda de la radiación. Así, las anchuras de ranura pueden
variarse para crear un patrón de espaciamiento con cualquier
longitud de onda de radiación.
Por lo tanto, podemos usar en la invención una o
más lentes de difracción, generadores con electrodos de desviación
ordenados, lentes hemisféricas, kinoformas, rejillas de
difracción, microlentes de Fresnel y/o un holograma sólo de fase.
Aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria entenderán que un
"enrejado de difracción" actualmente produce un "patrón de
interferencia", no un "patrón de difracción", lo cual es
una razón de semántica resultante de la nomenclatura original de
las "rejillas de difracción".
El/los elemento(s) óptico(s)
difractivo(s) pueden fabricarse también a partir de
cualquier material adecuado, tal como un polímero transparente o
vidrio. Ejemplos de polímeros transparentes son aquellos
seleccionados del grupo consistente en un poli(metil
metacrilato), poli(estireno), y un poli(etileno) de
alta densidad. Ejemplos de rejillas de difracción son aquellas
fabricadas de metal sobre vidrio, metal sobre polímero o metal con
aberturas de transmisión (ranuras u orificios). Otros elementos
difractivos adecuados son aquellos fabricados a partir de sílice
fundida o zafiro. La elección del elemento y la adecuación del
elemento a las condiciones de procesamiento será rutina para
aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria.
Aquellos que son hábiles con la técnica ordinaria
entenderán que la luz ultravioleta es menos adecuada para usarse
con células. Cuando se usa luz visible, no se espera ningún
compromiso de las funciones celulares. Solamente como una
precaución, un límite superior puede ser aproximadamente de 6
W/cm^{2} (watios por centímetro cuadrado). Para la luz
infrarroja, un límite superior de precaución puede ser de
aproximadamente 2,2 MW/cm^{2} (megawatios por centímetro
cuadrado).
Para usar con proteínas, un límite superior de
precaución de rayos ultravioleta puede ser de aproximadamente 8
mW/cm^{2} (miliwatios por centímetro cuadrado). No es creíble
que un límite superior de intensidad de luz visible limite la
aplicación de la presente invención para su uso con proteínas.
Para usar con proteínas y células, el calentamiento local durante
la polimerización puede minimizarse fácilmente, e.g.,
mediante el empleo de resinas de alto peso molecular, y mediante
el decrecimiento del tiempo total de polimerización.
La generación de una estructura con radiación
electromagnética preestructurada incluye la generación directa de
una superficie estructurada que sucede naturalmente como un
resultado de la radiación electromagnética contactando con la
superficie del biocompatible material. Por lo tanto, la
"superficie fotosensible" del material biocompatible puede
simplemente ser la superficie "sin modificar" del material
biocompatible. La "generación de este modo" del procedimiento
puede, por tanto, ser una característica inherente del
procedimiento.
La "generación de este modo" puede por tanto
incluir procedimientos donde la superficie fotosensible irradiada
es "desarrollada" para proporcionar la superficie
estructurada. Donde la superficie fotosensible no se ha cubierto por
ningún material fotosensible en particular, la generación de la
superficie estructurada después de la radiación incluye
preferiblemente "el desarrollo" del biomaterial irradiado
fotosensible para generar la superficie estructurada. "El
desarrollo" en este sentido preferiblemente involucra el lavado
o enjuagado en un líquido o solvente adecuado, tal como agua u otro
solvente orgánico.
La invención incluye además más procedimientos
indirectos de generar la superficie estructurada, i.e.,
donde la superficie fotosensible a irradiarse no es la superficie
biomaterial sin modificar. En tales procedimientos, la superficie
fotosensible se prepara mediante la aplicación de una composición
fotosensible, mezcla, combinación, cobertura o capa al menos a una
primera superficie del material biocompatible.
La composición fotosensible puede ser aplicada al
menos a una primera superficie del material biocompatible mediante
la puesta en contacto del material biocompatible con una
formulación de la composición fotosensible en un solvente volátil y
la evaporación del solvente para cubrir la composición
fotosensible sobre al menos una primera superficie. La composición
fotosensible puede también aplicarse a al menos una primera
superficie del material biocompatible poniendo en contacto el
material biocompatible con una formulación de la composición
fotosensible en una solución acuosa o coloidal para adsorber la
composición fotosensible sobre al menos una primera superficie.
Un pretratamiento funcionalizado puede, por lo
tanto, incluir alternativamente los pasos de:
Alternativa
I
- (a)
- aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;
- (b)
- creación de una radiación preestructurada;
- (c)
- irradiación de la capa fotosensible con la solución preestructurada para formar una capa irradiada; y
- (d)
- desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.
Alternativa
II
- (a)
- aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;
- (b)
- obtención de una fuente de radiación monocromática;
- (c)
- incidencia de la radiación monocromática sobre un elemento que convierte la radiación monocromática en radiación estructurada;
- (d)
- irradiación de la capa fotosensible con la solución preestructurada para formar una capa irradiada; y
- (e)
- desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.
Alternativa
III
- (a)
- aplicación de una capa fotosensible en al menos una primera superficie de un material;
- (b)
- obtención de una fuente de radiación monocromática;
- (c)
- transmisión de la fuente de radiación monocromática a través de un elemento que transforma la radiación monocromática en radiación estructurada;
- (d)
- incidencia de la radiación monocromática sobre la capa fotosensible del biomaterial para formar una capa irradiada; y
- (e)
- desarrollo de la capa irradiada para generar una estructura sobre al menos una primera superficie del biomaterial.
Puede usarse cualquiera de la amplia variedad de
composiciones fotosensibles. Tales composiciones generalmente
incluyen una cantidad efectiva combinada de al menos un primer
fotoiniciador y al menos un primer componente polimerizable.
Las composiciones fotosensitivas adecuadas pueden
incluir una cantidad iniciadora de polimerización de al menos un
primer fotoiniciador excitable por radiación ultravioleta, tal
como un fotoiniciador excitable por radiación ultravioleta
seleccionado del grupo consistente en un derivado de benzoína,
bencilcetal, hidroxialquilfenona, alfaaminocetona, óxido de
acilfosfina, derivado de benzofenona y derivado de tioxantona.
Otras composiciones fotosensitivas pueden incluir
una cantidad iniciadora de polimerización de al menos un primer
fotoiniciador excitable por luz visible, tal como un fotoiniciador
excitable por luz visible seleccionado del grupo consistente en
eosina, azul de metileno, rosa de Bengala, butiltrifenilborato de
dialquilfenacilsulfonio, un diariltitanoceno fluorinado, una
cianina, un borato de cianina, una cetocomarina y un tinte de
fluorona. Estas composiciones fotosensibles pueden incluir también
una cantidad coiniciadora de al menos un primer coiniciador o
acelerador, tal como un coiniciador o acelerador seleccionado del
grupo consistente en una amina terciaria, peróxido, compuesto
organoestannico, sal de borato y un imidazol.
La elección de componentes para usar en las
composiciones fotosensibles será sencilla para aquellos que son
hábiles con la técnica. Esencialmente, cualquier sistema
fotoiniciador o iniciador y cualquier "resina" (tipos de
componentes o monómeros para polimerizarse) pueden combinarse. La
elección de resina es, por tanto, amplia. Por ejemplo, un
"acrilato multifuncional" adecuado es cualquier monómero que
pueda acrilarse.
Los componentes de tipo resina se usan en
cantidades fotopolimerizables, tales como cantidades
fotopolimerizables de al menos un primer componente polimerizable
monomérico, oligomérico o polimérico. Los monómeros polimerizables
adecuados incluyen aquellos seleccionados del grupo consistente en
un poliéster insaturado de ácido fumárico, poliéster de ácido
maleico, estireno, un monómero multifuncional de acrilato, un
epóxido y un éter de vinilo.
Una composición fotosensitiva actualmente
preferida incluye una cantidad efectiva combinada de un
fotoiniciador de eosina, un componente polimerizable de diacrilato
de poli(etilenglicol) y un acelerador de trietanolamina.
Los pretratamientos de la invención producen
estructuras con una resolución de entre aproximadamente 1 \mum y
aproximadamente 500 \mum; de entre aproximadamente 1 \mum y
aproximadamente 100 \mum; o de entre aproximadamente 10 \mum y
aproximadamente 100 \mum; o de entre aproximadamente 1 \mum y
aproximadamente 10 \mum; o de entre aproximadamente 10 \mum y
aproximadamente 20 \mum. Estos son altamente adecuados para
realizaciones biomédicas, aunque sustancialmente inadecuados para
realizaciones microelectrónicas, al estar una sola célula en el
rango de 10 \mum a 20 \mum. Los patrones con una resolución de
aproximadamente 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15,
20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o
aproximadamente 600 \mum o similar pueden producirse y usarse
con ventaja.
Una ventaja de la invención es que los procesos
completos pueden llevarse a cabo a temperaturas biocompatibles. Por
ejemplo, un material biocompatible puede mantenerse sobre un
soporte de temperatura controlada durante la irradiación.
A los materiales biocompatibles, ya sea antes,
durante, o después de la estructuración, se les pone en contacto
con una cantidad de una solución que contiene minerales efectiva
para generar alguna, moderada o, preferiblemente, extendida
mineralización sobre al menos una primera superficie del material
biocompatible. Tales procedimientos enlazan con los procedimientos
de mineralización e incluyen el contacto anterior con una solución
que contenga minerales.
Preferiblemente, al material biocompatible se le
pone en contacto con la solución que contiene minerales durante o
inmediatamente después de la generación de la superficie
estructurada, formándose de este modo un material biocompatible
mineralizado que incluye una estructura de minerales al menos en
una primera superficie. Además, al menos una primera célula
biológica mineral-adherente puede unirse
subsiguientemente al material biocompatible mineralizado, para
formar un patrón de células biológicas sobre al menos una primera
superficie del material biocompatible.
Tanto la adherencia a minerales como la
adherencia a células puede llevarse a cabo mediante la exposición
del material biocompatible y/o del material biocompatible
mineralizado a una población de minerales y/o células o bien in
vitro o in vivo. Se puede usar una exposición secuencial
o simultánea.
En los procedimientos de mineralización de la
invención, uno de ellos genera una superficie mineralizada
extendida sobre un material biocompatible mediante un procedimiento
que incluye la funcionalización de al menos una primera superficie
de un material biocompatible para crear una multiplicidad de grupos
polares de oxígeno en una superficie funcionalizada y la puesta en
contacto de una superficie funcionalizada con una cantidad,
efectiva para generar mineralización extendida sobre al menos una
primera superficie del material biocompatible, de una solución que
contiene minerales.
Los métodos pueden incluir la generación de la
superficie funcionalizada mediante la exposición de al menos una
primera superficie de un material biocompatible a un
pretratamiento de funcionalización anterior al contacto con la
solución que contiene minerales. Los pretratamientos de
funcionalización efectivos incluyen la exposición a una cantidad
efectiva de radiación electromagnética, tal como radiación
ultravioleta; exposición a una cantidad efectiva irradiación con
rayo de electrones (rayos e); y exposición a productos químicos de
funcionalización biocompatibles, tales como cantidades efectivas
de una solución de NaOH.
Los procedimientos también incluyen
procedimientos de un solo paso, en los cuales la superficie
funcionarizada se genera durante el contacto con la solución que
contiene minerales. Tales procedimientos de un solo paso para
formar un biomaterial mineralizado que incluye una cobertura
mineral extendida en una superficie del biomaterial, incluyen la
incubación de un biomaterial mineralizable con una cantidad de una
solución que contiene minerales, tal como una disolución acuosa de
minerales, efectiva para generar una superficie biomaterial
funcionalizada sobre la cual se forma una cobertura mineral
extendida durante la incubación. Estos métodos se prefieren para
usar con biomateriales poliméricos o copoliméricos, tales como
biomateriales de polímero de ácido poliláctico (PLA), polímero de
ácido poliglicólico (PGA) o copolímero de ácido poliláctico
co-glicólico (PLG).
Cualquier procedimiento de mineralización, ya sea
o no preestructurado, puede usar una solución que contiene
minerales que incluya calcio, en la que la mineralización
resultante, o mineralización extendida, incluye una cobertura
extendida de calcio. Las soluciones que contiene minerales pueden
también al menos un primer y un segundo minerales, en los cuales la
mineralización resultante, o mineralización extendida, incluye una
mezcla de los minerales primero y segundo. Más aún, las soluciones
que contienen minerales pueden también incluir una pluralidad de
minerales diferentes, en la cual la mineralización resultante, o
mineralización extendida, incluye una cobertura heterogénea
polimineralizada.
Los procedimientos son controlables para dar
lugar a mineralización, mineralización extendida, mineralización
estructurada, mineralización estructurada extendida, coberturas
minerales sustancialmente homogéneas, porciones o regiones
hipermineralizadas, superficies internas de poro de materiales
porosos en los cuales una superficie mineral o una superficie
mineral extendida se genera sobre la superficie interior del poro,
y/o pluralidades de islas minerales discretas.
Los procedimientos para controlar la
mineralización de superficie de polímeros biomateriales incluye la
alteración del peso molecular, la composición del polímero, la
razón de componentes dentro del polímero, la técnica de fabricación
o las propiedades de superficie del polímero biomaterial con
anterioridad a llevar a cabo al menos un primer procedimiento de
mineralización de superficie. Los procedimientos permiten el
control del tipo de mineralización de superficie y el grado de la
mineralización de superficie, ejemplificada por el número o tamaño
de islas minerales en la superficie del polímero biomaterial.
En un ejemplo, el polímero biomaterial es un
copolímero biomaterial de ácido poliláctico
co-glicólico, y la razón de los componentes de
lactina y glicolina dentro de la composición del copolímero es
alterada. En otro ejemplo, se altera al menos una primera
propiedad de superficie de la composición del polímero. Más aún, el
control de los defectos de superficie puede proporcionarse a la
composición del polímero para proporcionar una nucleación
controlada de las islas minerales discretas en la superficie del
polímero biomaterial. La densidad de tales defectos de superficie
puede ser alterada.
El periodo de tiempo de la mineralización de
superficie puede alterarse también. Por ejemplo, el tiempo de los
procesos de la mineralización de superficie puede extenderse hasta
las islas minerales discretas en la superficie del polímero
biomaterial expandiéndose para formar una cobertura mineral
sustancialmente homogénea en la superficie del polímero
biomaterial.
En todos esos métodos, la solución que contiene
minerales puede ser un cuerpo fluido o un medio sintético que imita
a un cuerpo fluido. El material biocompatible puede estar en
contacto con la solución que contiene minerales mediante exposición
a una solución que contiene minerales natural o sintética in
vitro o mediante un fluido corporal conteniendo minerales
in vivo.
Cualquiera de los procedimientos precedentes, ya
sea para estructuración o para mineralización o para ambas, es
adecuada para el uso directo con, o para adaptación para el uso
con, virtualmente, cualquier material o dispositivo biocompatible.
Por ejemplo, los materiales biocompatibles pueden incluir, al
menos, una primera porción que es biodegradable, no biodegradable,
tridimensional, similar a un armazón, sustancialmente
bidimensional, bidimensional o similar a una película. Los
materiales biocompatibles pueden incluir al menos una primera
porción que tiene una estructura de poros interconectada o
abierta.
Los materiales biocompatibles pueden además
incluir al menos una primera porción que esté fabricada de metal,
bioglass, aluminato, biomineral, biocerámica, titanio, titanio
recubierto de biomineral, hidroxiapatita, hidroxiapatita
carbonatada, carbonato cálcico, o de una porción de polímero
presente en la naturaleza o sintética. Los polímeros pueden
seleccionarse de colágeno, arginato, fibrina, matrigel, alginato
modificado, elastina, quitosano, gelatina,
poli(vinilalcohol), poli(etilenglicol), plurónico,
poli(vinilpirrolidona), hidroxietilcelulosa,
carboximetilcelulosa, poli(etilentereftalato), polianhidro,
poli(propilenfumarato), un polímero enriquecido en grupos
ácidos carboxílicos, polímero de ácido poliláctico (PLA), polímero
de ácido poliglicólico (PGA), copolímero de ácido poliláctico
co-glicólico (PLG), y copolímeros PLG que tienen una
razón de aproximadamente un 85 por ciento de lactina frente a
aproximadamente un 15 por ciento de glicolina.
Los materiales biocompatibles pueden además
incluir al menos una primera porción que se prepara mediante un
proceso que incluye espumación por gas y lixiviación de
partículas, en los cuales, opcionalmente, al menos una primera
sustancia bioactiva está operativamente asociada con el material
biocompatible durante el proceso de espumación por gas y
lixiviación de partículas.
El proceso de espumación por gas y lixiviación de
partículas puede incluir los pasos de:
- a)
- preparación de una mezcla que incluye al menos un material particulado lixiviable y partículas capaces de formar un biomaterial polimérico poroso, degradable;
- b)
- someter la muestra a un proceso de espumación por gas para crear un biomaterial polimérico poroso, degradable, que incluye el material particulado lixiviable; y
- c)
- someter al biomaterial polimérico poroso, degradable, a un proceso de lixiviación que se lleva las el material particulado lixiviable del biomaterial polimérico poroso, degradable, del cual crea una porosidad adicional.
El proceso de lixiviación puede incluir la puesta
en contacto del biomaterial polimérico poroso, degradable, con un
mineral que contiene material lixiviado.
Los materiales biocompatibles pueden además
incluir al menos una primera porción que es una superficie
sustancialmente nivelada o una superficie contorneada. Como tal, el
material biocompatible puede ser fabricado como al menos una
porción de un dispositivo implantable.
Los procedimientos anteriores y los materiales
biocompatibles y dispositivos resultantes pueden además incluir una
cantidad biológicamente efectiva de al menos una primera sustancia
bioactiva, fármaco bioactivo o célula biológica, dos de tales
sustancias bioactivas, drogas o células biológicas o una pluralidad
de sustancias bioactivas, drogas o células biológicas.
Los materiales bioactivos estructurados pueden
así ser expuestos a al menos un primer mineral capaz de formar
uniones, sustancia bioactiva o célula biológica, de lo cual se
forma un material biocompatible que incluye un mineral, sustancia
bioactiva o célula biológica unido en una estructura a al menos una
primera superficie de ella. Cualquiera de los materiales
biocompatibles mineralizados estructurados resultantes puede
exponerse a al menos una primera célula
mineral-adherente, la cual forma un material
mineralizado biocompatible que incluye al menos una primera célula
unida en una estructura a al menos una primera superficie de dicho
material biocompatible.
Los factores de crecimiento y/o los ligandos de
adhesión pueden ser usados para formar materiales biocompatibles
recubiertos de un factor de crecimiento o ligando de adhesión
comprendiendo al menos un primer factor de crecimiento o ligando de
adhesión unido en una estructura a al menos una primera superficie
de dicho material biocompatible. Tal material biocompatible
recubierto de un factor de crecimiento o ligando de adhesión puede
exponerse a al menos una primera célula adherente a factor de
crecimiento o ligando de adhesión, de la cual se forma un material
biocompatible mineralizado que incluye al menos una primera célula
unida en una estructura a al menos una primera superficie de dicho
material biocompatible.
La(s) sustancia(s)
bioactiva(s) incluyen moléculas de DNA, moléculas de RNA,
ácidos nucléicos antisentido, ribozimas, plásmidos, vectores de
expresión, vectores virales, virus recombinantes, proteínas
marcadoras, factores de transcripción o elongación, proteínas de
control del ciclo celular, quinasas, fosfatasas, proteínas de
reparación del DNA, oncogenes, supersores de tumores, proteínas
angiogénicas, proteínas antiangiogénicas, receptores de la
superficie celular, moléculas accesorias de señalización, proteínas
transportadoras, enzimas, agentes antibacterianos, agentes
antivirales, antígenos, inmunógenos, agentes inductores de
apoptosis, agentes antiapoptóticos y citotoxinas.
La(s) sustancia(s)
bioactiva(s) incluyen además hormonas, neurotransmisores,
factores de crecimiento, hormonas, receptores de neurotransmisores
o de factores del crecimiento, interferonas, interleucinas,
quimioquinas, citoquinas, factores estimuladores de colonia,
factores quimiotácticos, componentes de la matriz extracelular, y
moléculas de adhesión, ligandos y péptidos; tales como hormona del
crecimiento, hormona paratiroidea (PTH), proteína ósea
morfogenética (BMP), factor transformador del crecimiento \alpha
(TGF-\alpha), TGF-\beta1,
TGF-\beta2, factor de crecimiento de los
fibroblastos (FGF), factor estimulador de colonia de
granulocitos/macrófagos (GMCSF), factor de crecimiento epidermal
(EGF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF),
factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de
dispersión/factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), fibrina,
colágeno, fibronectina, vitronectina, ácido hialurónico, un RGD que
contiene péptido o polipéptido, una angiopoyetina y factor de
crecimiento de las células endoteliales vasculares (VEGF).
Las células biológicas incluyen células óseas
progenitoras, fibroblastos, células endoteliales, precursores de
las células endoteliales, células madre, macrófagos, fibroblastos,
células vasculares, osteoblastos, condroblastos, osteoclastos y
células recombinantes que expresan segmento(s)
exógeno(s) de ácidos nucléicos, lo que produce productos
transcripcionales o traducidos en la célula.
Los materiales biocompatibles pueden además
incluir una cantidad biológicamente efectiva de al menos una
primera sustancia bioactiva y al menos una primera célula
biológica. Por ejemplo, una cantidad combinada biológicamente
efectiva de al menos un primer factor de crecimiento osteotrópico o
ácido nucléico de factor de crecimiento osteotrópico y una población
celular que incluye células óseas progenitoras; o una cantidad
biológicamente efectiva de VEGF o un ácido nucléico de VEGF y una
población de células que los incluye.
La al menos primera sustancia bioactiva, fármaco
o célula biológica puede incorporarse dentro del material
bicocompatible anteriormente a, durante, o seguidamente a, el
proceso de modificación de superficie. La incorporación dentro de
la(s) superficie(s) estructurada(s) es una
ventaja puesto que la sustancia bioactiva, el fármaco o la célula
biológica se une en una estructura a una superficie estructurada.
El material biocompatible puede incluir al menos una primera
superficie mineralizada, en la cual una sustancia bioactiva
mineral-adherente, fármaco o célula biológica puede
unirse a la superficie mineralizada.
La presente invención, además, cubre todos los
materiales biocompatibles modificados en la superficie, equipos,
estructuras, dispositivos y dispositivos médicos implantables con
al menos una primera porción realizada mediante cualquiera de los
procedimientos, métodos o medios precedentes y combinaciones de los
mismos. Tales materiales biocompatibles modificados en la
superficie pueden usarse en cultivos celulares, transplante celular,
ingeniería tisular y/o regeneración tisular guiada y en la
preparación de uno o más medicamentos o equipos terapéuticos para
usar para el tratamiento de una situación médica que necesite
transplante celular, ingeniería tisular y/o regeneración celular
guiada.
Los procedimientos de la invención incluyen
aquellos para el cultivo de células, incluyendo el crecimiento de
una población celular en contacto con un material biocompatible
modificado en la superficie en concordancia con la presente
invención, La población celular puede mantenerse en contacto con el
material biocompatible modificado en la superficie bajo condiciones
efectivas y durante un periodo de tiempo efectivo para generar una
estructura similar a un tejido bi o tridimensional, tal como un
tejido similar al óseo o un tejido neovascularizado o
vascularizado.
Tales métodos pueden ejecutarse in vitro o
in vivo. Las células cultivadas pueden separarse de un
material biocompatible modificado en la superficie y suministradas
a un animal mientras permanezca en contacto con el material
biocompatible modificado en la superficie.
Los usos médicos incluyen aquellos para el
transplante de células dentro de un animal, incluyendo la
aplicación a un lugar de un tejido de un animal una cantidad
biológicamente efectiva de una composición de un material
biocompatible con células que incluye una población celular en
asociación operativa con un material biocompatible modificado en la
superficie en concordancia con la presente invención.
Otros usos son aquellos para la ingeniería de
tejidos en un animal, incluyendo la aplicación a un lugar de un
tejido progenitor de un animal de una cantidad biológicamente
efectiva de una composición de un material biocompatible que
proporcione un armazón para el crecimiento tisular y que incluya un
material biocompatible modificado en la superficie en concordancia
con la presente invención.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente especificación y están incluidos para demostrar aún más
ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede
entenderse mejor mediante referencia a uno o más de esos dibujos en
combinación con la descripción detallada de específicas
realizaciones presentadas en ellos.
Fig. 1. Los espectros de FTIR muestran el
desarrollo de los picos de fosfato (*) y carbonato (^) con el
tiempo de incubación creciente en SBF. Los picos que representan
copolímero de ácido poliláctico co-glicólico están
también marcados (\medcirc). Los tiempos de incubación se dan a
la derecha de cada espectro.
Fig. 2. El porcentaje de incremento de masa
frente al tiempo de incubación de los armazones incubados en SBF
(\medcirc), y (\sqbullet) muestras control incubadas en un
tampón Tris (pH=7,4). La gráfica muestra una tendencia de incremento
de masa de armazones incubados en SBF, culminando en un 11 +/- 2%
de incremento de masa tras el día 16 de incubación.
Fig. 3. La masa de fosfato presente en los
armazones frente al tiempo de incubación.
Fig. 4. Módulos compresivos frente a tiempo de
incubación para armazones incubados en SBF (\medcirc), y
armazones control incubados en un tampón Tris (pH=7,4)
(\boxtimes).
Fig. 5. Incremento de masa en porcentaje frente a
tiempo de incubación para armazones PLG incubados en un fluido
corporal simulado (SBF). Los valores representan la desviación
media y estándar (n=3).
Fig. 6. La masa de fosfato presente en los
armazones frente al tiempo de incubación en SBF. Los valores
representan la desviación media y estándar (n=3).
Fig. 7. La liberación acumulativa del factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) a partir de armazones
mineralizados (X) y no mineralizados (v). Los valores
representan la desviación media y estándar (n=5).
Fig. 8A. El efecto estimulatorio de la liberación
de VEGF de los armazones mineralizados (v) y no
mineralizados (\pi) en células endoteliales microvasculares
dérmicas humanas. Las cuentas celulares por cada intervalo temporal
de liberación se dan como porcentajes del valor control (columna
rayada) para ese intervalo. Los valores que son significativamente
mayores que sus controles correspondientes se indican mediante
^{*1}s. Los valores representan la desviación media y standard
(n=5).
Fig. 8B. La curva de muestra
dosis-respuesta demuestra el efecto mitogénico de
VEGF en células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. Los
valores representan la desviación media y standard (n=5).
Fig. 9. La incorporación de VEGF dentro de
armazones de PLG durante la incubación en SBF (\vardiamondsuit) y
tampón Tris-HCl (\lambda).
Las estrategias de ingeniería tisular ortopédica
se han centrado a menudo en el uso de materiales degradables o
armazones naturales o sintéticos para transplantes celulares
(estrategias basadas en células) (Langer y Vacanti, 1993; Crane
y col., 1995; Putnam and Money, 1996) o como un medio para
guiar la regeneración mediante células osteogénicas nativas
(estrategias conductivas) (Minabe, 1991). Las estrategias de
transplante conductivas o basadas en células han sido algo
efectivas en ingeniería tisular ósea (Ripamonti, 1992; Ishaug-
Riley, 1997; Shea y col., "Formación de huesos a partir
de pre-osteoblastos en armazones
tridimensionales", presentado). El grado de éxito de estos
procedimientos de ingeniería tisular depende de las propiedades del
armazón.
Los requerimientos básicos del diseño del armazón
incluyen degradabilidad, biocompatibilidad, una razón alta área
superficial/volumen, osteoconductividad, e integridad mecánica. Un
material biocompatible de armazón que es degradable en una escala
controlada de tiempo en productos de degradación no tóxicos debe
desaparecer de manera concertada con la formación de nuevo tejido,
dejando un reemplazamiento de tejido natural. Una razón alta área
superficial/volumen permite en transporte de masa entre las células
dentro del armazón y el tejido circundante del hospedador, y
proporciona espacio para el crecimiento interior del tejido
fibrovascular.
La osteoconductividad es importante para la unión
y la migración de células osteogénicas nativas y/o transplantadas.
Se requiere integridad mecánica para aguantar las fuerzas de
contracción celular durante el desarrollo tisular para asegurar el
mantenimiento de la forma inicial del armazón (Kim y Mooney,
1998).
La degradabilidad, la biocompatibilidad, y la
razón alta área superficial/volumen de los armazones puede lograrse
mediante la elección apropiada de un material sintético o natural y
el abordaje del procedimiento. El ácido poli(láctico), el
ácido poli(glicólico), y sus copolímeros se han usado en
aplicaciones de ingeniería tisular porque experimentan una
degradación hidrolítica controlable en metabolitos naturales
(Gilding, 1981; Li y col., 1990), y pueden procesarse en
armazones altamente porosos mediante una variedad de procedimientos
(Harris y col., 1988; Lo y col., 1995; Mikos y
Thorsen, 1994).
Una limitación en la ingeniería de muchos tipos
de tejidos, incluyendo el tejido óseo, es la falta de capacidad
para inducir un rápido crecimiento vascular interno durante el
desarrollo del tejido (Mooney y col., 1997). La viabilidad
de las células transplantadas y/o de las células del hospedador que
migran dentro del armazón desde el tejido nativo depende del
transporte de nutrientes y productos de desecho entre las células y
el tejido hospedador.
El transporte se debe inicialmente sólo a la
difusión, y más de varios miles de micras de células procedentes de
los vasos sanguíneos en el tejido circundante o fallan al
implantarse o mueren rápidamente debido a la falta de oxígeno
(Colton, 1995). Los estudios indican que los vasos sanguíneos se
infiltrarán en un armazón de grandes poros para proporcionar un
transporte mejorado hacia los tejidos manipulados, pero el proceso
ocurre en un grado de menos de un milímetro por día, y típicamente
se toma de una a dos semanas para la penetración completa del
tejido vascular dentro de armazones relativamente finos
(e.g., 3 mm de grosor) (Mikos y col., 1993, Money y
col., 1994).
La presente invención proporciona biomateriales
mejorados para su uso en ingeniería tisular. Varios de los
inconvenientes anteriores se superan por las novedades de la
invención. Ciertos materiales proporcionados son polímeros porosos
biodegradables, con capas superficiales homogéneas de minerales y
poros internos mineralizados. También se proporcionan los materiales
polimericos porosos que tienen capas minerales continuas en
combinación con factores bioactivos. Otros materiales provistos son
materiales estructurados, a los cuales se puede unir cualquier
componente mineral o biológico de una forma controlada
espacialmente.
Los polímeros estructurados o mineralizados con
factores bioactivos se proporcionan para dar mayor control sobre, o
para aumentar, los procesos de formación y regeneración tisulares.
Por ejemplo, los factores de crecimiento se pueden usar para
inducir a las células a comportarse de una manera específica
(Giannobile, 1996). Varios factores se han identificado que inducen
quimiotaxis, proliferación, diferenciación, y síntesis de una
matriz de tipos celulares específicos, cualquiera o más de los
cuales pueden usarse en la presente invención.
Aunque ciertos sistemas se han propuesto como
factores de desarrollo (Langer, 1990; Whang y col., 1998;
Wheeler y col., 1998; Shea y col., 1999; Sheridan
y col., J. Cont. Rel., In Press), las matrices de
grandes poros de ingeniería tisular permanecen necesitadas de
mejoras. Los inventores razonan que la inclusión de factores
bioactivos dentro de un armazón permitirían un nivel más alto de
control sobre la función celular tanto dentro como adyacente a una
construcción tipo armazón, dirigiendo así las limitaciones
específicas en procedimientos de ingeniería conductivos y basados
en células.
Ciertos aspectos de la presente invención, por lo
tanto, proporcionan armazones que combinan la degradabilidad, la
biocompatibilidad y la osteoconductividad de armazones
mineralizados con las propiedades titulares inductivas de
polipéptidos bioactivos. La organización proporciona un grado de
control adicional. La invención logra el crecimiento de mineral
similar al del hueso en las superficies internas de poro de un
armazón que contenga un factor de crecimiento sin comprometer la
bioactividad del factor o la porosidad del armazón. El factor de
crecimiento se ejemplifica mediante el factor de crecimiento
celular endotelial vascular (VEGF), un potente mitógeno para las
células endoteliales micro y macrovasculares humanas, el cual no
muestra efectos mitogénicos sobre otros tipos celulares (Leung y
col., 1989).
Se consideran las matrices que contienen
minerales y VEGF de la presente invención para su uso en la
inducción de neovascularización concurrente con la ingeniería de
tejido óseo. Una formación de tejido vascular aumentada durante el
desarrollo tisular conducirá a una viabilidad mejorada de células
osteogénicas nativas y/o transplantadas dentro de un armazón,
permitiendo la síntesis de un volumen mayor de tejido óseo.
Otros factores bioactivos para uso en esta
invención incluyen la hormona del crecimiento (GH); hormona
paratiroidea (PTH, incluyendo PTH1-34); proteínas
morfogenéticas del hueso (BMPs), como por ejemplo
BMP-2A, BMP-2B,
BMP-3, BMP-4,
BMP-5, BMP-6, BMP-7
y BMP-8; factor-\alpha de
crecimiento transformante (TGF-\alpha);
TGF-\beta1 y TGF-\beta2; factor
de crecimiento de fibroblastos (FGF); factor estimulante de
colonias de granulocitos/macrófagos (GMCSF); factor de crecimiento
epidérmico (EGF); factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF); un factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) y el factor
inhibidor de leucemia (LIF).
De hecho, virtualmente se puede emplear cualquier
hormona, neurotransmisor, factor de crecimiento, receptor de factor
de crecimiento, interferón, interleuquina, quimiocina, citoquina,
factor estimulante de colonias y/o proteína o polipéptido con
función de factor quimiotáctico. Ejemplos adicionales incluyen
factores de transcripción o elongación, proteínas de control del
ciclo celular, kinasas, fosfatasas, proteínas de reparación del
ADN, oncogenes, supresores tumorales, proteínas angiogénicas,
proteínas anti-angiogénicas, proteínas estimulantes
de la respuesta inmune, receptores de la superficie celular,
moléculas accesorias de señalización, proteínas de transporte,
enzimas, proteínas o polipéptidos anti-bacterianos
y/o anti-virales y similares, dependiendo del uso
considerado de la composición final.
Los biomateriales de la invención con superficies
estructuradas en tres dimensiones permiten una mineralización de
localización controlada y la deposición celular. Los biomateriales
de superficie estructurada tridimensionales de la presente
invención son "biomateriales inteligentes", los cuales se unen
preferentemente a moléculas biológicas y células en sitios
específicos. Las propiedades de la superficie específicas de región
permiten el control sobre la localización y la actividad de las
células que se unen al biomaterial, cuando se usan en cultivos
celulares y en implantación in vivo.
Estos aspectos de la invención representan un
importante avance, ya que el control sobre las
"localizaciones" de la deposición y actividad celular se prevé
que es al menos tan importante como controlar las
"características" de la actividad celular. De hecho se puede
probar que controlar la localización de las células activas en la
superficie de un biomaterial es el determinante más importante en
la regeneración tisular. Las técnicas de la presente invención son
particularmente ventajosas ya que proporcionan la capacidad de
controlar las localizaciones de presencia y actividad celular en la
superficie de un material en una escala de micras.
Ciertos aspectos de la presente invención son
procedimientos para alterar un biomaterial haciendo crecer una capa
mineral extendida u homogénea en la superficie. Se prefieren
biomateriales poliméricos porosos y degradables para tales
procedimientos, por ejemplo, ácido poliláctico (PLA), ácido
poliglicólico (PGA) y ácido
poliláctico-co-poliglicólico
(PLGA).
El fundamento de los inventores acerca de
revestir estos materiales con minerales es que los revestimientos
de tipo mineral son importantes para el crecimiento óseo en un
material poroso y/o para la adhesión a un sustrato. La base para
este procedimiento está en la observación de que en la naturaleza,
los organismos usan varias macromoléculas para controlar la
nucleación y crecimiento de fases minerales (Campbell y
col., 1996; Lowenstein and Weiner, 1989). Estas macromoléculas
contienen generalmente grupos funcionales que están cargados
negativamente al pH de cristalización (Weiner, 1986). Existen
hipótesis de que estos grupos quelan especies iónicas presentes en
el medio que les rodea, estimulando la nucleación del cristal
(Campbell y col., 1996).
Las observaciones en los procedimientos de
mineralización natural no se han adaptado previamente para su uso
en conexión con procedimientos de ingeniería de biomateriales o
tejidos. Sin embargo, los presentes inventores se dieron cuenta de
que se podía funcionalizar en el laboratorio un sustrato de
biomaterial para permitir la inducción de la deposición del
mineral.
Los inventores se dieron cuenta además de que la
presencia de una capa mineral extendida u homogénea en la
superficie de un biomaterial ayudará en la capacidad de regenerar
eficazmente el tejido óseo. En esta memoria descriptiva se
describen varios procedimientos para alcanzar tal mineralización de
una superficie extendida u homogénea. Sin embargo, la
mineralización de superficies estructuradas (u homogéneas) se
contempla también para su uso en ciertas realizaciones y se puede
alcanzar ventajosamente por las técnicas de estructuración
descritas en esta memoria descriptiva.
Avances recientes en el control de los
procedimientos celulares han mostrado la utilidad de controlar las
características de la actividad celular. Sin embargo, tal trabajo
no ha tratado el control específico de localizaciones de adhesión
celular a un biomaterial. Los presentes inventores prevén que el
control sobre las "localizaciones" de la actividad celular es
tan importante como el control de las características de la
actividad celular.
Específicamente, en el área de regeneración de
tejido óseo, es un pre-requisito para la unión de
biomateriales al hueso vivo, la formación de una capa mineral
similar al hueso en el biomaterial en el cuerpo. Esta observación
sugirió a los inventores que la presencia o ausencia del mineral
puede determinar si las células óseas se adherirán o no y
posteriormente actuarán en el biomaterial. De esta forma, razonaron
que un control específico sobre la localización del mineral sobre
la superficie del biomaterial permitirá tener un control sobre las
localizaciones de actividad de células óseas. La estructuración de
minerales en la superficie de un biomaterial debería tener por lo
tanto un profundo efecto en las propiedades del tejido óseo
regenerado.
Para controlar las localizaciones de adhesión
celular a una superficie polimérica tridimensional, la presente
invención proporciona además varios nuevos procedimientos para
tratar biopolímeros antes de la siembra celular. En un
procedimiento sorprendentemente simple, tratando solamente ciertas
regiones o subsecciones de materiales biopoliméricos, matrices o
armazones con soluciones acuosas que contienen minerales, da lugar
a una mineralización localizada solamente en aquellas áreas en
contacto con la solución de mineralización. El tratamiento de lo
biomateriales poliméricos en una escala de del orden de micras se
lleva a cabo preferiblemente usando uno o dos procedimientos
diferentes: fotólisis de superficie y/o electrólisis de
superficie.
Los procedimientos de fotólisis y electrólisis
estructurados de la presente invención son adecuados para uso con
armazones poliméricos porosos y biodegradables. Los procedimientos
de manipulación de la superficie de la presente invención resultan
sorprendentes en el aspecto de que la adaptación de los inventores
de las técnicas a partir del campo de litografía de rayo de
electrones ha permitido, por primera vez, aplicaciones de
estructuración en biomatrices tridimensionales, mejor que
limitándose a dos dimensiones. Las matrices tridimensionales son
generalmente más efectivas para crear un armazón de biomaterial
para su uso en regeneración tisular.
Las diferentes técnicas de estructuración de la
invención proporcionan por lo tanto la capacidad para controlar
localizaciones para células óseas específicamente (estructuración
mineral), y para todos los tipos de células en general (tratamiento
de superficie polimérica sin formación de mineral). Las diferencias
en el procesamiento para el control de las células óseas frente al
control de otros tipos celulares se describen en esta memoria
descriptiva.
Tal y como se describe también en los Ejemplos
Detallados, todos los procedimientos de la presente invención son
procedimientos a temperatura ambiente. Por lo tanto, sustancias
bioactivas específicas, fármacos y proteínas, como por ejemplo
moléculas de adhesión, citoquinas, factores de crecimiento y
similares se pueden incorporar en el procedimiento de estructuración
y en el biomaterial resultante. Las proteínas se pueden incorporar
también en el medio de cultivo celular, estructurando de esta forma
la superficie del material y provocando la unión de células
específicas.
Ciertos procedimientos de la invención para
funcionalizar la superficie de un biomaterial permitiendo la
mineralización y/ o control de la localización celular se basan en
procedimientos de radiación (con o sin estructuración). Para
alcanzar una capa mineral homogénea en una superficie de
biomaterial, se usan los procedimientos de radiación sin
estructuración. Para alcanzar un control de localización celular o
mineralización, se usan los procedimientos de radiación
estructurada.
El tratamiento de biomateriales poliméricos con
radiación electromagnética (EM) provoca degradación de la
superficie a través de una reacción de fotólisis. La radiación
adecuada incluye todas las longitudes de onda de radiación EM,
incluyendo ultravioleta, visible, infrarrojo, etc. Esta forma
de degradación de la superficie, como aquella que se alcanza con
NaOH, provoca un aumento en la cantidad de grupos funcionales
polares con oxígeno en la superficie del material.
Al interpretar los resultados a partir de
estudios diferentes en polímeros de unión a huesos (Li y
col. 1997), los inventores razonaron que los grupos polares
con oxígeno formados estimularían la nucleación del mineral en la
superficie el biomaterial cuando se dispone en un fluido corporal.
De esta forma, los inventores se dieron cuenta de que la capacidad
para estructurar grupos funcionales de la superficie tridimensional
daría lugar a la capacidad para estructurar la formación del
mineral y adhesión celular en la superficie de un biomaterial.
Desafortunadamente, las técnicas de radiación EM
anteriormente disponibles, se limitaban todas a aplicaciones con
objetos bidimensionales. Las técnicas de litografía óptica "por
contacto" convencionales están así limitadas (a dos
dimensiones) debido al requerimiento de un contacto íntimo entre una
máscara o rejilla de contacto y el objeto que se va a estructurar.
De esta forma, previo a la presente invención, no había ningún
mecanismo para producir estructuras superficiales del tipo
tridimensional, materiales de superficie contorneada que son de uso
mayoritario en ingeniería de tejidos.
Las técnicas litográficas se basan en el paso de
radiación EM monocromática a través de una rejilla óptica para
producir estructuras de radiación en una pantalla que está en el
lado opuesto de la rejilla a partir de la fuente de radiación EM.
La estructura formada puede ser tan simple como franjas igualmente
espaciadas formadas por una rejilla que contiene aberturas
igualmente espaciadas, o tan complicado como un holograma
complejo.
La presente invención facilita significativamente
la técnica de ingeniería tisular proporcionando procedimientos para
usar radiación EM para estructurar biopolímeros tridimensionales.
En los procedimientos de la inventiva, la "pantalla" es el
biomaterial polimérico. Este sistema equivale a una aproximación de
"litografía de difracción", pero el procedimiento difiere del
de la litografía óptica "de contacto" convencional en que la
rejilla no actúa como una máscara para el polímero, de modo que no
es necesario un contacto íntimo entre la rejilla y el polímero.
En los procedimientos presentes, la rejilla
produce una estructura de interferencia constructiva y destructiva
en la superficie del polímero. Como la rejilla no se requiere que
esté en un contacto íntimo con el material durante el tratamiento,
este procedimiento de litografía de difracción se puede usar para
tratar materiales con contornos de superficie tridimensionales
complejos. Esto es también una aplicación sorprendente de
tecnología previa en que la técnica ahora empleada sacrificaría
anchura de línea cuando se ha usado en realizaciones previas, así
que, la ausencia de intuición particular de los inventores al
considerar la estructuración matricial tridimensional, no habría
motivación para desarrollar esta metodología. Además, no se
necesita retirar la "máscara de contacto", mejorando la
naturaleza estéril de la biotécnica.
Ciertos tipos de biomatrices tridimensionales
previstos para estructuración usando esta invención son matrices
microesféricas y cilíndricas. Aunque una motivación para
desarrollar la presente invención fue el objetivo de los inventores
de desarrollar un procedimiento para una estructuración
tridimensionales y con contorno, ahora que se ha desarrollado el
procedimiento, es igualmente adecuado para uso con polímeros
bidimensionales.
El tratamiento de biomateriales poliméricos con
irradiación por rayo de electrones (rayo-e) se
puede usar también para provocar degradación de la superficie a
través de una reacción de electrólisis. La degradación de la
superficie provoca un aumento en la cantidad de grupos funcionales
polares con oxígeno en la superficie del material, lo cual tiene
las mismas cualidades ventajosas descritas en esta memoria
descriptiva para las reacciones de hidrólisis y fotólisis.
La electrólisis de la superficie se puede
estructurar en una superficie polimérica usando un microscopio
electrónico de barrido con capacidades básicas de litografía de
rayo-e. Tal y como se ha mostrado en los Ejemplos
Detallados, este procedimiento se puede usar también para tratar
materiales con superficies lisas o con contornos superficiales
tridimensionales complejos.
Otros procedimientos para funcionalizar la
superficie de un biomaterial para permitir la deposición del
mineral utilizan un pretratamiento químico para alcanzar la
hidrólisis de la superficie, por ejemplo, usando una solución de
NaOH. La degradación superficial por esta técnica provoca un
incremento en la cantidad de grupos funcionales polares con oxígeno
en la superficie del material. La superficie funcionalizada se
incuba entonces en una solución que contiene minerales. Los
inventores han usado tales técnicas de funcionalización para
permitir la generación de un revestimiento mineral o
"hipermineralización".
Gao y col. (1998) informó recientemente
sobre la hidrólisis de la superficie de mallas de ácido
poliglicólico para aumentar la densidad de sembrado y mejorar la
unión de las células de músculo liso vascular. Aunque su
procedimiento se basaba también en la hidrólisis de PGA en NaOH, el
armazón polimérico se desarrolló entonces directamente hacia los
experimentos de siembra celular (Gao y col., 1998). La
presente invención expone en su lugar el biopolímero de superficie
hidrolizada a una solución rica en calcio para inducir
mineralización de la superficie.
En un desarrollo inesperado de los procedimientos
de funcionalización de la superficie, los inventores descubrieron
sorprendentemente que se podía alcanzar una deposición del mineral
eficaz en superficies de biomaterial sin pretratamiento químico. En
estos procedimientos, se produce un grado suficiente de hidrólisis
de la superficie simplemente empapando el biomaterial en un medio
acuoso de mineralización. Aunque el pretratamiento, como por ejemplo
por exposición a una solución de NaOH, todavía se puede utilizar o
incluso preferir en ciertas realizaciones, los procedimientos de
mineralización en una etapa tienen la ventaja de la simplicidad y
se prefieren en ciertas realizaciones.
Los procedimientos de mineralización en una etapa
utilizan el mismo tipo de soluciones acuosas que contienen el
mineral que el descrito anteriormente, como por ejemplo fluidos
corporales y medios sintéticos que imitan a los fluidos corporales.
A la funcionalización le sigue la mineralización in situ sin
manipulación externa. Aunque estos procedimientos son adecuados
para su uso con un amplio intervalo de biopolímeros, las
preferencias actuales son para uso junto con copolímeros de PLG con
relaciones de 85:15 de copolímeros de PLG, y con armazones de
biomaterial preparados por procedimientos de espumación por
gas/lixiviación de partículas. Se prefiere particularmente el uso de
armazones de copolímeros de PLG 85:15 preparados por espumación
por gas/lixiviación de partículas.
El uso de copolímeros de PLG 85:15 es ventajoso
ya que se cree que una disminución en la relación de
láctido/glicólido del copolímero aumenta la relación de hidrólisis
de la superficie. Sin embargo, previo a la presente invención, se
desaprobó el uso de copolímeros de PLG 85:15 ya que la integridad
mecánica del polímero disminuye con el incremento del contenido de
glicólido. Esta invención muestra que los copolímeros de PLG 85:15
se pueden usar eficazmente ya que la hidrólisis rápida de la
superficie permite una formación de mineral suficiente para
compensar el potencial para la disminución de la integridad, dando
lugar a una fuerza total suficiente o incluso aumentada del
material compuesto.
Los éxitos de los presentes procedimientos de
mineralización en una etapa (Ejemplo V), incluso sin la
espumación/lixiviación de partículas, están en marcado contraste
frente a intentos previos para crecer minerales en superficies de
poliéster. Los primeros procedimientos no dan lugar a un crecimiento
capas minerales continuas similares a hueso, incluso después de una
incubación de 6 días en fluidos con concentraciones iónicas un 50%
más altas que las que se usan actualmente (Tanahashi y col.,
1995). Igualmente, una incubación de 15 días esencialmente en el
mismo medio fluido que el usado actualmente, no produjo continuidad
de micropartículas minerales (Zhang and Ma, 1999).
Los inventores creen que la preparación de
matrices a través de técnicas de espumación por gas/lixiviación de
partículas dan lugar a más grupos de tipo ácido carboxílico en la
superficie que la preparación matricial por otros procedimientos
(por ejemplo, prueba del disolvente/lixiviación de partículas).
Esta funcionalización mayor de la superficie se propone para
contribuir a la nucleación y crecimiento más rápidos de mineral
apatítico observado durante los procedimientos de mineralización en
una etapa. También, las etapas de lixiviación de los
procedimientos de espumación por gas/lixiviación de partículas
emplean típicamente soluciones de minerales, como por ejemplo
CaCl_{2} 0,1 M, las cuales puede favorecer además la quelación
de Ca^{2+} y una nucleación de mineral similar a hueso más
rápida.
Las técnicas de formación de la matriz por
espumación por gas/lixiviación de partículas, con o sin agentes
bioactivos adicionales, se describen en las siguientes solicitudes
coposeídas, solicitud de la patente de EE.UU. de nº de serie
09/402.119, presentada el 20 de septiembre de 1999, la cual
reivindica prioridad a la solicitud del PCT nº PCT/US98/06188 (WO
98/44027), presentada el 31 de marzo de 1998, la cual designa a los
EE.UU. y reivindica prioridad a la solicitud provisional de los
EE.UU. de nº de serie 60/042.198, presentada el 31 de marzo de
1997; y la solicitud de EE.UU. de nº de serie 09/310.802,
presentada el 12 de mayo de 1999, la cual reclama prioridad a una
segunda solicitud provisional de nº de serie 60/109.054, presentada
el 19 de noviembre de 1998 y a una primera solicitud provisional de
nº de serie 60/085.305, presentada el 13 de mayo de 1998.
Los estudios en el Ejemplo IX muestran que el
mineral similar al hueso se puede formar ventajosamente en las
superficies internas del poro de matrices preparadas por espumación
por gas/lixiviación de partículas. Los armazones de PLG preparados
por un procedimiento de espumación por gas/lixiviación de
partículas se mineralizaron con éxito usando una incubación en una
etapa en fluido corporal simulado (SBF) sin ningún descenso
apreciable en la porosidad total del armazón.
Usando armazones de PLG espumados por
gas/lixiviados de partículas, una incubación de 5 días en SBF es
suficiente para un crecimiento continuo de mineral similar al hueso
en las superficies internas del poro del armazón (Ejemplo IX). La
cuantificación de la ganancia de masa en porcentaje y el contenido
de fosfato sugiere que la mayor parte del crecimiento del mineral
en estos aspectos de la invención se da entre el día 2 y el día 4
de la incubación. Estos resultados están incluso más avanzados
durante los intentos previos para producir minerales similares al
hueso en superficies de poliéster (Tanahashi y col., 1995;
Zhang and Ma, 1999).
Como estos procedimientos de mineralización en
una etapa son efectivos a temperaturas ambiente, su uso para
preparar armazones poliméricos mineralizados o hipermineralizados
se extiende a la preparación de materiales mineralizados que
incluyen otras sustancias bioactivas. En esta memoria descriptiva
se demuestra que tales procedimientos no son perjudiciales para la
actividad de moléculas biológicas, como por ejemplo factores de
crecimiento. La naturaleza de ahorro de tiempo y trabajo de estos
procedimientos los hace por lo tanto ideales para preparar matrices
para uso en muchos procedimientos biológicos, especialmente para
estimular el crecimiento del hueso, donde los minerales y factores
de crecimiento actúan en concierto. La fase, morfología y
constitución del mineral depositado se pueden controlar variando el
pH, concentraciones iónicas y/o temperaturas usadas en el
procedimiento.
Estas técnicas de mineralización son
particularmente adecuadas para su uso con materiales
biodegradables. La capacidad para obtener una capa mineral continua
similar al hueso, dentro de los poros de un armazón tridimensional,
poroso y degradable representa un avance en el procesamiento del
biomaterial. El crecimiento de tal capa mineral continua similar al
hueso no es sólo importante para la siembra celular, sino que
probablemente también aumentará la integridad mecánica de estas
construcciones sintéticas a través de un mecanismo de refuerzo.
Las construcciones poliméricas usadas para
aplicaciones de ingeniería tisular son generalmente altamente
porosas y no poseen propiedades mecánicas del mismo orden que el
hueso. El crear un revestimiento mineral interconectado sobre las
superficies internas del poro de una construcción polimérica, según
estos aspectos de la presente invención, es una ventaja clara. Estos
procedimientos permiten la producción de un exoesqueleto duro y
rígido, aumentando el módulo de un biomaterial y aumentando su
resistencia frente a fuerzas contráctiles en la célula durante el
desarrollo del tejido.
Los materiales del armazón mineralizado de la
presente invención, por ejemplo, tal y como se producen en el
Ejemplo V, tienen de hecho un módulo de compresión después del
tratamiento mayor que aquellos de otros materiales de poli(ácido
\alpha-hidroxi) usados para ingeniería de tejido
del hueso y mayor que matrices de ácido poliglicólico (PGA) unido
a PLLA que son adecuadas por resistencia de fuerzas celulares
durante el desarrollo del tejido del músculo liso. Los materiales
de esta invención muestran por lo tanto memoria de forma, un
importante factor en la regeneración tisular. La presente invención
proporciona también procedimientos para alcanzar incrementos en
módulos compresivos sin disminuir notablemente la porosidad del
armazón o el tamaño del poro, otra ventaja largamente buscada
después del diseño que permite la migración celular y la
infiltración vascular.
Además de mostrar una mineralización exitosa
usando una etapa, incubación de 5 días, los estudios del Ejemplo IX
demuestran también el libramiento sostenido de un factor bioactivo
(VEGF) a partir de los armazones de PLG mineralizados. Se
fabricaron armazones porosos tridimensionales del copolímero de
poli(láctido-co-glicólido)
80:15 incluyendo el factor de crecimiento en un procedimiento de
espumación por gas/lixiviación de partículas. El armazón se
mineralizó entonces a través de incubación en un fluido corporal
simulado.
En resumen, el crecimiento de una película
mineral similar al hueso en las superficies internas de los poros
del armazón poroso se confirma por medidas de incremento de masa y
cuantificación del contenido de fosfato entro de los armazones. Se
siguió la liberación de VEGF marcado radiactivamente con ^{125}I
durante un período de 15 días para determinar la cinética de
liberación de los armazones mineralizados. Se alcanzó la liberación
sostenida de los armazones mineralizados y el crecimiento de la
película mineral alteró la cinética de liberación de los armazones
atenuando el efecto inicial de estallido, y haciendo la curva de
liberación más lineal. El VEGF liberado a partir de armazones
mineralizados y no mineralizados fue superior a un 70% activo
durante hasta 12 días después del tratamiento de mineralización, y
el crecimiento del mineral tuvo un efecto pequeño en la porosidad
total del armazón.
En más detalle, se muestra la presencia del
mineral para disminuir la liberación del factor de crecimiento a
partir del armazón, dando lugar a la liberación de una mayor
cantidad de factor durante un período de crecimiento más largo (por
ejemplo, de los días 3 al 10). Después de un estallido de liberación
inicial de un 44 \pm 2% del factor incorporado en las primeras 36
horas, se mantuvo el perfil de liberación de las esponjas
mineralizadas durante hasta 10 días en SBF (Fig. 7). En contraste,
la liberación de los armazones no mineralizados muestra un
estallido inicial relativamente largo de un 64 \pm 2% durante las
primeras 60 horas, seguido de una liberación sostenida durante
\sim 5 días.
La liberación del factor bioactivo a partir del
armazón mineralizado es un resultado importante para la ingeniería
tisular, particularmente ingeniería del tejido óseo, porque
combina las cualidades osteoconductivas de un mineral similar al
hueso con las cualidades inductivas de tejido de un factor
bioactivo, como por ejemplo un factor de crecimiento de tipo
proteína. La liberación de VEGF es especialmente útil en la
inducción del crecimiento de tejido vascular para ingeniería
tisular. Este sistema se podría usar también con varios factores de
crecimiento inductivos de tipo proteína diferentes, fácilmente
unidos a la célula y tipos de tejidos a los que se intenta
estimular.
El Ejemplo IX sugiere que el crecimiento del
mineral en la superficie de PLG poroso modula la liberación del
factor. Existe una clara correlación entre el comienzo del
crecimiento del mineral y la divergencia en los perfiles de
liberación para las muestras incubadas en SBF y PBS (control). La
primera ocurre entre el día 2 y el día 4 de incubación (Fig. 6)
mientras que la última ocurre en el punto temporal del día 3 (Fig.
7). El efecto neto de la presencia del mineral es la atenuación de
un estallido de liberación inicial del armazón, y una liberación
sostenida de una cantidad de factor mayor durante un período de
tiempo más largo.
El efecto de modulación de la liberación queda
claro también en los datos de bioactividad (Fig. 8A). La liberación
a partir de los armazones mineralizados tiene un efecto
significativamente mayor en la proliferación celular que la
liberación a partir de los armazones no mineralizados durante el
intervalo de liberación del factor de 8 a 10 días. El examen de los
perfiles de liberación (Fig. 7) indica que los armazones
mineralizados liberan una cantidad de VEGF mayor que los armazones
no mineralizados durante este período de tiempo.
Formulaciones de liberación controlada previas
usando materiales de poli
(ácido-\alpha-hidroxi)
frecuentemente demuestran un estallido inicial medible en los
primeros 1 a 5 días de liberación seguido por una liberación mínima
en puntos temporales más tardíos (Cohen y col., 1991; Kwong
y col., 1986). El alcanzar una liberación relativamente
constante durante un período de tiempo más largo es un objetivo
importante en el libramiento de fármacos poliméricos. Intentos
previos para tratar el "efecto de estallido" han usado
microesferas poliméricas de doble pared (Pekarek y col.,
1994) y microesferas encapsuladas en membranas microporosas (Kreitz
y col., 1997). El mineral similar al hueso en es te estudio
alcanza un efecto funcional similar al de la capa externa en los
sistemas de libramiento de fármacos poliméricos de doble
membrana.
La formación de una capa de mineral dentro de los
poros de armazones de PLG no perjudica notablemente la capacidad
del factor de crecimiento liberado para estimular la proliferación
de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas. La
posibilidad de desnaturalización de la proteína y agregación durante
la exposición a humedad es un punto en la liberación controlada de
proteínas a partir de ciertos sistemas poliméricos
(Ishaug-Riley y col., 1998). En este caso,
la proteína es claramente bioactiva durante once días después del
tratamiento de mineralización (16 días después de la preparación de
la muestra).
Se eligió la escala de tiempo de 11 días para el
análisis en este estudio porque un porcentaje grande de células
transplantadas no se injertan y mueren dentro de este período de
tiempo sin el desarrollo de un soporte vascular para aumentar el
transporte de masa (Mooney y col., 1997;
Ishaug-Riley y col., 1998). Una liberación
sostenida durante este período de tiempo induce el aumento de
proliferación de células endoteliales, apoyando de esta forma la
angiogénesis durante las etapas iniciales del desarrollo de tejido
óseo in vivo.
La presente invención proporciona por lo tanto un
sistema para la liberación sostenida de factores bioactivos, como
por ejemplo polipéptidos, factores y hormonas de crecimiento, a
partir de armazones de PLG mineralizados. Los complejos
mineral-biofactor-armazón tiene usos
particulares en ingeniería de tejidos ortopédicos. La presencia de
un mineral similar al hueso es un requisito para la conducción de
células osteogénicas en varias construcciones sintéticas porosas.
(Hench, 1991; Kokubo, 1991), y de esta forma el mineral se asocia
con una biorreactividad incrementada (LeGeros and Daculzi, 1990).
El mineral crecido por los métodos de la presente invención
proporciona de esta forma una osteoconductividad aumentada además
del efecto inductivo (por ejemplo, angiogénico) de la liberación de
la proteína. El crecimiento del mineral se lleva a cabo a través
de una sorprendentemente simple etapa única, procedimiento a
temperatura ambiente el cual, de manera importante, no compromete la
biorreactividad del factor de crecimiento, o la porosidad total del
armazón.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar ciertas realizaciones preferidas de la invención.
Se trata un biomaterial polimérico poroso y
degradable para una mineralización fundamentalmente homogénea
pretratando para inducir hidrólisis de la superficie y exponiéndolo
luego a una solución mineralizante (Ejemplos II a IV) o llevando a
cabo una hidrólisis de superficie en una etapa y un procedimiento
de mineralización (Ejemplo V).
El pretratamiento para producir una hidrólisis de
superficie homogénea se puede alcanzar por empapamiento en una
solución de NaOH (Ejemplo II) o por tratamiento con radiación
electromagnética (EM) (Ejemplo III). El biomaterial tratado se
incuba en un fluido, como por ejemplo un fluido corporal o medios
sintéticos que imitan a un fluido corporal, rico en mineral,
preferiblemente rico en calcio, para inducir la nucleación y
crecimiento de una película mineral homogénea en la superficie
(Ejemplo IV).
La funcionalización y mineralización concomitante
se pueden alcanzar también simplemente empapando en soluciones
acuosas que contienen mineral, preferiblemente en fluidos
corporales o medios sintéticos que imitan a fluidos corporales. La
preparación de los biomateriales poliméricos usando un
procedimiento de espumación por gas/lixiviación de partículas se
prefiere generalmente para tal mineralización en una etapa (Ejemplo
V).
Una vez mineralizado, se siembran los precursores
de células osteogénicas en el material in vitro en un medio
de cultivo celular. In vivo, las células del hueso de unen
al biomaterial cuando se implantan.
Se prepararon películas de PLGA (\sim25 \mum
de grosor) por una técnica de prueba de presión. Se cargaron en un
molde sedimentos de polímero bruto y se colocaron en un horno de
convección a 200ºC. Los moldes se calentaron bajo presión (\sim22
N) durante 30 segundos y luego se enfriaron a temperatura
ambiente.
Para la creación de grupos funcionales en la
superficie por tratamiento con NaOH, las películas se limpiaron y
se sumergieron en una solución de NaOH 1,0 N para tiempos
variables, hasta 10 minutos para crear grupos funcionales en la
superficie. Después de la inmersión, se enjuagaron tres veces las
muestras en agua destilada.
Se prepararon películas de PLGA (\sim25 \mum
de grosor) por una técnica de prueba de presión. Se cargaron en un
molde sedimentos de polímero bruto y se colocaron en un horno de
convección a 200ºC. Los moldes se calentaron bajo presión (\sim22
N) durante 30 segundos y luego se enfriaron a temperatura
ambiente.
Para la creación de grupos funcionales en la
superficie por tratamiento UV (UltraVioleta), se expusieron las
membranas hasta 8 horas de irradiación de la superficie.
Las membranas tratadas por tratamiento con NaOH o
tratamiento UV se incubaron posteriormente a 37 grados centígrados
en 50 ml de un fluido fisiológico simulado (FFS, Na: 142 mM, K: 5
mM, Ca. 2,5 mM, Mg: 1,5 mM, Cl: 148 mM, HCO_{3}^{-}: 4,2 mM,
HPO_{4}^{2-}: 1 mM, SO_{4}^{2-}: 0,5 mM) tamponado a pH
7,4. Las soluciones se reemplazaban cada 48 horas para asegurar que
había suficientes iones en la solución para inducir nucleación y
crecimiento del mineral. Las muestras se secaron después de la
inmersión durante períodos de 120 a 240 horas.
El análisis por IR de la transformada de Fourier
(FTIR) indica la presencia de un apatito amorfo de superficie. Los
espectros de FTIR de los armazones tratados durante 0, 2, 6, 10 y
16 días indican el crecimiento de un mineral de apatito carbonatado
dentro del armazón (Fig. 1). Se produjeron también espectros
equivalentes con las películas tratadas con UV. La banda ancha a
3570 cm^{-1} es indicativa de la vibración de alargamiento de
iones hidroxilo en agua absorbida. El pico a 1454 cm^{-1} es
indicativo de CO_{3}^{2-} \nu_{3}, mientras que el de 867
cm^{-1} representa CO_{3}^{2-} \nu_{2}. Los picos a 1097
cm^{-1} y a 555 cm^{-1} son indicativos de alargamiento
anti-simétrico (\nu_{3}) e inclinación
anti-simétrica (\nu_{4}) de PO_{4}^{3-},
respectivamente. El pico a 1382 cm^{-1} representa una banda de
NO_{3}.
La presencia de OH-, CO_{3}^{2-} y
PO_{4}^{3-} indica que se ha formado una capa apatítica. Otras
bandas representativas de apatitos se enmascaran como consecuencia
de la fuerte absorción del PLGA.
Los picos principales a 1755 cm^{-1} y a 1423
cm^{-1} representan PLGA, y el pico a 1134 cm^{-1} es
indicativo de alargamiento C-O en el éster. Los
picos a 756 cm^{-1} y a 956 cm^{-1} son indicativos de los
dominios amorfos del polímero.
Los armazones demostraron un aumento de la masa
sobre el tiempo, culminando en una ganancia de masa de un 11 \pm
2% al final de la incubación de 16 días (FIG 2). El ANOVA de los
cambios en el porcentaje de masa de los armazones experimentales
revelan una diferencia significativa en la masa del armazón sobre
el tiempo (p < 0,05), mientras que el ANOVA de los cambios en el
porcentaje de masa de los armazones control no muestran una
diferencia significativa sobre el tiempo (p < 0,05). Los cambios
en el porcentaje de masa de las muestras experimentales y de las
muestras control eran significativamente diferentes para cada punto
temporal más allá de 8 días (p < 0,05).
Para confirmar que el incremento en la masa fue
provocado por la deposición de un mineral apatítico, la masa de
fosfato en los armazones se analizó después. El contenido en
fosfato en los armazones tratados aumentó también
significativamente con el tiempo de tratatamiento (Fig. 3). La
comparación de las masas de fosfato a través de un ANOVA muestran un
incremento estadísticamente significativo sobre el tiempo (p <
0,05), y las diferencias en la masa de fosfato entre el día 8 y el
día 12 (p < 0,05) y entre el día 12 y el 14 (p = 0,05)
resultaron también estadísticamente significativas. Después de una
incubación de 14 días la estimación de la masa de mineral en el
armazón usando los datos de masa de fosfato da 0,76 mg de
hidroxiapatito, mientras que el incremento de masa medida del
armazón es 1,02 \pm 0,40 mg. El hecho de que el valor medido sea
mayor que el valor estimado sugiere una significativa sustitución
de carbonatos en el cristal del mineral.
El crecimiento de la capa de BLM aumentó
significativamente el módulo de compresión de armazones de PLG
80:15 (Fig. 4) sin un descenso significativo en la porosidad del
armazón. El módulo de compresión aumentó de 60 \pm 20 KPa antes
del tratamiento a 320 \pm 60 KPa después de un tratamiento de 16
días, un incremento de 5 veces en módulo. El ANOVA de los cambios
en el módulo de los armazones experimentales revela una diferencia
significativa en el módulo del armazón sobre el tiempo (p <
0,05), mientras que el ANOVA de los datos del módulo control no
muestran una diferencia significativa sobre el tiempo (p >
0,05). Las diferencias entre los módulos de armazones experimentales
y módulos de armazones control resultaron estadísticamente
significativas durante los tiempos de tratamiento de 10 días o más
(p < 0,05). La porosidad de los armazones no disminuyó
apreciablemente después de la incubación en SBF. Los armazones no
tratados resultaron porosos en un 95,6 \pm 0,2%, mientras que los
armazones incubados en SBF durante 16 días resultaron porosos en un
94,0 \pm 0,30% (n = 3). Esto está de acuerdo con las
micrografías electrónicas, las cuales muestran solamente un
revestimiento de mineral delgado (1-10 \mum), y de
esta forma no se dan cambios significativos en el tamaño del poro
debido al crecimiento del mineral.
Este ejemplo muestra el uso exitoso de este
procedimiento a temperatura ambiente para dar una capa con
superficie de apatito en una superficie polimérica tratada. La
importancia del procesamiento a temperatura ambiente es que la
unión de los factores biológicos se puede alcanzar fácilmente, sin
preocupación por la desnaturalización.
Se pueden usar también procedimientos de
incubación a temperatura ambiente en una etapa para provocar la
nucleación y crecimiento de capas minerales en superficies
poliméricas. Esto se alcanza incubando armazones poliméricos en
soluciones acuosas que contienen el mineral, como por ejemplo
fluidos corporales y medios sintéticos que imitan a los fluidos
corporales. Estos procedimientos son capaces de hacer que crezcan
minerales similares al hueso dentro de los armazones poliméricos en
procedimientos sorprendentemente simples y baratos. La efectividad
de estos procedimientos en condiciones de temperatura ambiente les
proporciona conducente a la inclusión de proteínas bioactivas y
otros materiales en el procesamiento de mineralización.
Un primer ejemplo de mineralización en una etapa
se refiere a la deposición mineral en esponjas porosas de
poli(láctido-co-glicólido) a
través de incubación en un fluido corporal simulado. La técnica de
incubación simple se usó para obtener nucleación y crecimiento de
un mineral de apatito carbonatado continuo en las superficies
interiores del poro de un armazón polimérico poroso y
degradable.
Se fabricó un armazón poroso tridimensional de
PLG 85:15 por un procedimiento de prueba de disolvente/lixiviación
de partículas y se incubó en un fluido corporal simulado (SBF;
NaCl-141 mM, KCl-4,0 mM,
MgSO_{4}-0,5mM, MgCl_{2}-1,0
mM, NaHCO_{3}-4,2 mM,
CaCl_{2}-2,5 mM y
KH_{2}PO_{4}-1,0 mM en H_{2}O desionizada,
tamponado a PH 7,4 con Trisma-HCl). Los análisis de
espectroscopía de IR por transformada de Fourier y de SEM después de
diferentes tiempos de incubación demostraron el crecimiento de una
capa de apatito continua similar al hueso dentro de los poros del
armazón polimérico.
La mayor parte del crecimiento del mineral
ocurrió entre los días 8 y 12. El crecimiento del mineral en una
capa continua probablemente ocurre a partir del día 12 y se
completa hacia el día 16 o antes. El mineral crecido, siendo
continuo, es de esta forma similar a aquel en huesos y en
dientes.
Los armazones demostraron un incremento de la
masa sobre el tiempo, con una ganancia de un 11 \pm 2% después de
16 días. El incremento en la masa es debido a la deposición de un
material apatítico. La cuantificación de fosfato en el armazón
reveló el crecimiento y desarrollo de la película mineral sobre el
tiempo con una incorporación de 0,43 mg de fosfato (equivalente a
0,76 mg de hidroxiapatito) por armazón después de 14 días en SBF.
El incremento de masa total medido del armazón fue 1,02 \pm 0,4
mg a los 14 días. Esto sugiere sustitución de carbonato en el
cristal del mineral.
Los módulos de compresión de armazones
poliméricos aumentó también cinco veces con formación de una
película mineral después de un tiempo de incubación de 16 días, tal
y como se opusieron a los armazones control. Esto se alcanzó sin
una disminución significativa en la porosidad del armazón. El
revestimiento fino de mineral es de esta forma funcionalmente
importante, aunque la mineralización no cambia el tamaño de
poro.
Tal y como se muestra en los estudios de
mineralización y de factor de crecimiento del Ejemplo IX, los
armazones de PLG 85:15 preparados por espumación por
gas/lixiviación de partículas muestran una nucleación y un
crecimiento del mineral apatítico incluso más rápidos. Los armazones
de PLG 85:15 preparados por prueba del disolvente/lixiviación de
partículas mostraron un incremento de un 3 \pm 1% en masa después
de una incubación de 6 días en SBF. En comparación, los armazones
de PLG 85:15 preparados por espumación por gas/lixiviación de
partículas mostraron un incremento de un 6 \pm 1% en masa después
de una incubación de 4 días en SBF.
Se cree que la nucleación y crecimiento del
mineral de apatito incluso más rápidos en armazones de PLG 85:15
preparados por espumación por gas/lixiviación de partículas es
debido al incremento en grupos de tipo ácido carboxílico provocados
por el proceso de espumación por gas/lixiviación de partículas, es
decir, a la mayor funcionalización de la superficie. La lixiviación
con CaCl_{2} 0,1 M favorece probablemente también la quelación de
iones Ca^{2+}, produciendo una nucleación del mineral similar al
hueso más rápida.
El biomaterial polimérico se trata para formar
una biosuperficie estructurada, preferiblemente demandando
radiación EM estructurada o irradiación por rayo de electrones. El
biomaterial tratado se lava con agua destilada para eliminar
monómeros residuales de la fotólisis o electrólisis de la
superficie.
El biomaterial tratado se incuba en un fluido,
como por ejemplo un fluido corporal o un medio sintético que imita
a un fluido corporal, rico en mineral, preferiblemente rico en
calcio, para iniciar la nucleación y crecimiento del mineral en
las regiones tratadas del polímero. Esto da lugar a una estructura
mineral en la superficie del polímero. Esta etapa se puede hacer
in vitro, usando un fluido corporal o un fluido corporal
simulado; o in vivo, donde el fluido corporal natural lleva
a cabo su función.
Los precursores de células osteogénicas se
siembran en el biomaterial in vitro en un medio de cultivo
celular. In vivo, las células de hueso se unen al
biomaterial cuando se implantan. En cada caso, las células se
adhieren preferencialmente a las partes mineralizadas del
sustrato.
Estudios previos en el control de localizaciones
de adhesión celular a una superficie de biomaterial han utilizado
litografía de UV convencional para estructurar una superficie
polimérica bidimensional (Pierschbacher & Ruoslahti, (1984);
Ruoslahti & Pierschbacher (1987); Matsuda y col., (1990);
Britland y col., (1992); Dulcey y col., (1991); Lom
y col., (1993); Lopez y col., (1993); Healey y
col., (1996)).
En las técnicas anteriores, la superficie de
bidimensional se reviste con una capa fina de material
fotoendurecible (FE), el FE se expone a través de una máscara de
metal y el FE expuesto se retira en el disolvente, dejando una
máscara de FE en la superficie de la muestra de biomaterial. La
superficie del biomaterial polimérico se trata entonces
químicamente o físicamente a través de la máscara de FE, y la
máscara se retira por un disolvente después del tratamiento.
Los primeros procedimientos requieren un
biomaterial bidimensional plano, lo que basta para estudiar los
efectos del tratamiento de la superficie en actividad celular,
pero no es suficiente para el tratamiento de biomateriales típicos,
los cuales tienen contornos de superficie tridimensionales.
En los presentes procedimientos, adecuados para
uso con polímeros tridimensionales, la rejilla produce una
estructura de interferencia constructiva y destructiva en la
superficie del polímero. Como la rejilla no se requiere que esté
en contacto íntimo con el biomaterial durante el tratamiento, este
procedimiento de litografía de difracción se puede usar para tratar
materiales con contornos de superficie tridimensionales complejos.
Sin embargo, el procedimiento es igualmente útil en conexión con
biomateriales de dos dimensiones.
El biomaterial polimérico se trata para formar
una biosuperficie estructurada, preferiblemente usando radiación EM
estructurada o irradiación de rayo de electrones. El biomaterial
tratado se lava con agua destilada para eliminar monómeros
residuales de la fotólisis o electrólisis de la superficie.
El biomaterial tratado se incuba en una solución
que contiene moléculas bioactivas o proteínas, como por ejemplo
factores de crecimiento, moléculas de adhesión, citokinas y
similares, los cuales promocionan la adhesión de un tipo celular
específico. Las células se siembran en el biomaterial in
vitro en un medio de cultivo celular. In vivo, las
células se unen al biomaterial cuando se implantan. En cada caso,
las células se adhieren con preferencia a las partes tratadas del
sustrato.
El uso de agentes específicos o proteínas, como
por ejemplo factores de crecimiento, que promocionan la unión de
ciertos tipos celulares, da el potencial para estructurar
cualquier tipo celular en la superficie tridimensional del
polímero, in vitro e in vivo.
Se obtuvieron sedimentos de
poli(láctido-co-glicólido)
con una relación láctido:glicólido de 85:15 de Medisorb, Inc (I. V.
= 0,78 dl/g) y se molieron a un tamaño de partícula entre 106 y
250 \mum. Las partículas de PLG molidas se combinaron entonces
con 250 \mul de una solución de un 1% de alginato (MVM, ProNova;
Oslo, Noruega) en ddH_{2}O y 3 \mug de factor de crecimiento de
células del endotelio vascular (VEGF, Intergen; Purchase, NY), y se
agitaron en vórtex. Se liofilizaron estas soluciones, se mezclaron
con 100 mg de partículas de NaCl (250 \mum < d < 425
\mum) y se moldearon por compresión a 1,05 x 10^{7} Pa durante
1 minuto en un molde de 4,2 mm de diámetro. Esto dio discos gruesos
de 2,8 mm con un diámetro de 4,2 mm.
Los discos se expusieron luego a gas CO_{2} a
1,42 x 10^{6} Pa en un recipiente de presión aislado y se dejó
equilibrar durante 20 horas. Se disminuyó la presión a presión
ambiente en 2 minutos, provocando inestabilidad termodinámica, y
formación posterior de poros de gas en las partículas de polímero.
Las partículas de polímero se expanden y conglomeran para formar
un armazón continuo con alginato, VEGF y partículas de NaCl
atrapados. Después de la espumación por gas, los discos se
incubaron en CaCl_{2} 0,1 M durante 24 horas para lixiviar las
partículas salinas e inducir la gelificación del alginato dentro de
la matriz del polímero. El alginato se incluyó en los armazones
porque ha mostrado minimizar la liberación de VEGF a partir de
armazones de PLG (Wheeler y col., 1998).
Se mineralizaron ciertos armazones a través de
una incubación de 5 días en un fluido corporal simulado (SBF). El
fluido corporal simulado (SBF) se preparó disolviendo los
siguientes reactivos en agua desionizada: NaCl-141
mM, KCl-4,0 mM, MgSO_{4}-0,5mM,
MgCl_{2}-1,0 mM, NaHCO_{3}-4,2
mM, CaCl_{2}-2,5 mM y
KH_{2}PO_{4}-1,0 mM. El SBF resultante se
tamponó a PH 7,4 con Trisma-HCl y se mantuvo a 37ºC
durante los períodos de incubación. Las soluciones de SBF se
cambiaban diariamente para asegurar concentraciones iónicas
adecuadas para el crecimiento del mineral.
La porosidad de los armazones se calculó antes y
después del tratamiento de mineralización usando la densidad
conocida del polímero sólido, la densidad conocida del apatito
carbonatado, la masa medida de mineral y polímero en los armazones
y el volumen del armazón.
Para analizar el crecimiento del mineral en
armazones de PLG espumados por gas, se incubaron grupos de tres
armazones en SBF durante períodos que variaban de 0 a 10 días. Las
muestras se retiraron de la solución y se analizaron después de
períodos de incubación de 0, 2, 4, 8 y 10 días. Se midió la masa
seca de cada armazón antes y después de la incubación en SBF, y los
incrementos de porcentajes en masa se calcularon y compararon
usando un ANOVA y un ensayo de t de Student para revelar
diferencias significativas en masa para diferentes tiempos de
incubación en SBF.
La cantidad de fosfato presente en los armazones
después de los tiempos de incubación anteriormente mencionados se
determinó usando un ensayo colorimétrico previamente descrito
(Murphy y col., J. Biomed. Mat. Res., In Press). Los
datos de masa de fosfato se compararon también usando un ANOVA y un
ensayo de t de Student para revelar diferencias significativas en
masa para diferentes tiempos de incubación en SBF.
Para estimar la cantidad de apatito en el armazón
después de una incubación de 6 días, la masa de fosfato medida se
multiplicó por la relación conocida de masa de hidroxiapatito
[Ca_{10}(PO_{4})_{6}(OH)_{2},
f. w. = 1004,36 g] a la masa de fosfato en hidroxiapatito (569,58
g). Esta es una estimación conservativa, ya que asume que se
incorpora todo el fosfato en el hidroxiapatito estequiométrico. Esta
estimación de masa del mineral aumenta si uno asume una sustitución
creciente de carbonato en el cristal del mineral.
Para determinar la eficacia de incorporación de
VEGF en los armazones de PLG y rastrear la cinética de liberación
de VEGF desde los armazones, se utilizó como trazador VEGF humano
de tipo receptor marcado con ^{125}I (90 \muCi/\mug;
Biomedical Technologies Inc.; Stoughton, MA). En lugar de los 3
\mug de VEGF de la preparación normal de la muestra, se
añadieron 0,5 \muCi de VEGF radiomarcado a cada matriz. Para
determinar la eficacia de incorporación de VEGF, se comparó la
actividad total incorporada con la actividad de la muestra inicial
de VEGF marcada con ^{125}I antes de incorporarla a los
armazones.
Para determinar los efectos del desarrollo
mineral sobre la liberación del factor, se midió la cinética de
liberación tanto en SBF durante la formación del mineral como en
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los armazones
preparados con VEGF radiomarcado se introdujeron en 4 ml de SBF o
PBS y se mantuvieron a 37ºC. En diversos momentos los armazones se
retiraron de la disolución y se determinó su radioactividad usando
un contador gamma. Después de cada análisis, las disoluciones se
renovaron y los armazones se introdujeron de nuevo en
disolución.
La cantidad de VEGF radiomarcado liberado de los
armazones se determinó en cada tiempo comparando el VEGF marcado
con ^{125}I restante con el que se cargó originalmente en cada
armazón. Se comparó la liberación porcentual de VEGF de los
armazones incubados en SBF con la de los armazones incubados en PBS
en cada tiempo mediante un ensayo con t de Student que puso
de manifiesto diferencias significativas en la liberación
acumulativa.
Se determinó la actividad biológica del VEGF
incorporado a, y que se libera de, matrices poliméricas ensayando
su capacidad para estimular el desarrollo de células endoteliales
microvasculares dérmicas humanas cultivadas, aisladas de dermis
neonatal (HMVEC(nd), Cascade Biologics; Portland, OR).
El HMVEC(nd) se cultivó hasta el estado 7
en el medio MCDB 131 (Cascade Biologics) suplementado con el
suplemento de crecimiento microvascular de Cascade Biologics (5% de
suero bovino fetal, hidrocortisona, factor de crecimiento de
fibroblasto humano, heparina, factor de crecimiento epidérmico
humano y dibutirilAMP cíclico) antes de su utilización. Las células
se colocaron en placas a una densidad de 5 x 10^{3}
células/cm^{2} sobre platillos de cultivo tisular de 12
pocillos (Corning; Cambridge, MA) que se recubrieron previamente
con 1 \mug/cm^{2} de fibronectina de plasma humano (Life
Technologies, Grand Island, NY). Se dejó que las células se unieran
durante 24 horas y después se sustituyó el medio de cada pocillo
con 3 ml de un medio exento de suero (Cell Systems; Kirkland, WA)
suplementado con 50 \mug/ml de gentamicina (Life
Technologies).
Se colocó un pocillo de transferencia de 12 mm
(diámetro de poro de 3 \mum, Coming) que contenía la matriz de
liberación de VEGF mineralizado o no mineralizado, en cada pocillo
experimental (n = 5 para cada grupo), mientras que las matrices
mineralizadas que no contenían VEGF se colocaron en los pocillos de
control (n = 5). Para determinar la dosis respuesta a
concentraciones conocidas de VEGF, se suplementaron pocillos
adicionales (n = 4 por concentración) con 40, 20, 10 y 5 ng/ml de
VEGF soluble que no se había incorporado a las matrices.
Tras 72 horas se eliminaron todas las células en
los pocillos experimentales y de control con una disolución de
tripsina al 0,05%/EDTA 0,53 mM (Life Technologies) y se contaron
usando un contador ZM Coulter (Coulter; Miami, FL). Los pocillos de
transferencia que contenían las matrices se transfirieron
inmediatamente a nuevos pocillos revestidos de fibronectina (1
\mug/cm^{2}) que se habían sembrado con células (5 x 10^{3}
células/cm^{2}) 24 horas antes, y se dejó que incubaran durante
otras 72 horas más antes de que las células se eliminaran y
contaran. Se preparó conjuntamente un nuevo conjunto de pocillos de
dosis respuesta de VEGF con lo transferido de los pocillos de
transferencia. Los ciclos de 72 horas se continuaron durante 12
días.
Los conteos celulares en pocillos experimentales
se compararon con los conteos celulares en los pocillos de control
para cada intervalo de 72 horas usando un ensayo con t de
Student que puso de manifiesto diferencias significativas en la
proliferación de
HMVEC.
HMVEC.
La incubación de armazones de
poli(lactida-co-glicólido)
85:15 espumados por gas que contienen VEGF dio como resultado un
mineral similar al hueso sobre las superficies internas del poro.
El análisis de varianza mostró que las diferencias en el
porcentaje de ganancia de masa con el tiempo de incubación en SBF
eran significativas (p<0,05). Los armazones mostraron un
aumento de masa con el tiempo de incubación, con una ganancia de
masa de 6 \pm 1% después de 4 días de incubación en SBF (Fig. 5).
La masa del armazón posteriormente permaneció relativamente
constante. El aumento de masa entre los tiempos de incubación de
los días dos y cuatro fue significativo (p<0,05), mientras
que no había una diferencia significativa en la ganancia porcentual
de masa entre los tiempos de incubación entre el cuarto día y
posteriores (p>0,05).
Para verificar que el aumento de masa estaba
provocado por la deposición de un mineral apatítico, se analizó la
masa de fosfato en los armazones. El contenido de fosfato en los
armazones aumentó con el tiempo de incubación en SBF (Fig. 6). El
análisis de varianza mostró que las diferencias en el contenido de
fosfato con el tiempo de incubación en SBF eran significativas
(p<0,05). La diferencia en el contenido de fosfato entre
los tiempos de incubación entre los días segundo y sexto fue
significativa (p<0,05), mientras que no se encontró una
diferencia significativa entre la masa de fosfato del tiempo de
incubación del sexto día y los tiempos de incubación mayores
(p>0,05).
Los inventores habían demostrado previamente que
el aumento de masa y del contenido de fosfato en estos armazones
indica el crecimiento de una película mineral continua similar al
hueso sobre las superficies internas de los poros (Murphy y
col., J. Biomed. Mat. Res., Invención Press).
La porosidad total de los armazones después de
una incubación de 10 días en SBF fue de 92 \pm 1%, que es similar
a la porosidad inicial del armazón
(93 \pm 1%).
(93 \pm 1%).
Después de una incubación de 6 días, la
estimación de la masa de mineral sobre el armazón usando los datos
de masa de fosfato da 0,10 mg de hidroxiapatita, mientras que el
aumento de medida de la masa del armazón es de 0,39 \pm 0,03 mg.
El hecho de que el valor medido sea mayor que el valor estimado
sugiere una sustitución significativa de carbonato en el cristal
mineral.
El factor de crecimiento celular endotelial
vascular (VEGF) se incorporó a armazones PLG con una eficiencia del
44 \pm 9% y se liberó durante un periodo de 15 días en
disoluciones de SBF y PBS. Se observó una liberación repentina
inicial del factor de crecimiento incorporado durante las primeras
12-36 horas seguido de una liberación sostenida
durante el resto del estudio (Fig. 7).
La liberación acumulativa de los armazones
incubados en SBF se hizo significativamente menor que la liberación
desde los armazones incubados en PBS después de 3 días y esta
diferencia permaneció significativa durante 10 días de liberación
(p<0,05). En los tiempos posteriores a 10 días no hay una
diferencia significativa en la liberación acumulativa desde los
armazones incubados en SBF y los incubados en PBS
(p>0,05).
El VEGF liberado de armazones mineralizados y no
mineralizados tuvo un efecto mitogénico sobre las células
endoteliales microvasculares dérmicas humans (HMVEC).
Las células se desarrollaron en pocillos que
contenían tres tipos de armazones diferentes: 1) armazones
mineralizados que contenían VEGF (armazones MV); 2) armazones no
mineralizados que contenían VEGF (armazones NV); y 3) armazones
mineralizados de control sin VEGF (armazones MC). Las células que
se cultivaron en pocillos que contenían armazones MV y NV
demostraron un aumento de proliferación significativo cuando se
compararon con las células cultivadas en pocillos que contenía
armazones MC (Fig. 8A). Los conteos de células fueron
significativamente mayores en los pocillos que contenían armazones
MV y NV durante todos los intervalos de tiempo (p<0,05),
excepto los pocillos que contenían armazones NV durante el intervalo
de liberación del factor entre los días 14 y 16.
Durante el intervalo de liberación del factor
entre los días 8 y 10, los armazones MV mostraron un efecto
mitogénico significativamente mayor sobre las HMVEC que los
armazones NV (p<0,05). No hubo una diferencia
significativa en el efecto estimulador de los armazones MV frente a
los armazones NV durante cualquier otro intervalo de tiempo
(p>0,05).
Se usó una curva dosis-respuesta
(Fig. 8B) generada por las HMVEC para calcular una concentración
eficaz para el factor de crecimiento liberado. La comparación de
esta concentración eficaz con la cantidad de VEGF que se sabe que
se libera durante cada periodo de tiempo (Fig. 7) indica que el VEGF
liberado es mayor del 70% activo para todos los intervalos de
tiempo.
Se obtuvieron gránulos de
poli(láctica-co-glicolida)
con una proporción de lactida a glicolida de 85:15 de Medisorb,
Inc. (V.I.=0,78 dl/g) y se molieron hasta un tamaño de partícula
entre 106 y 250 \mum. Las partículas de PLG molidas se combinaron
después con 250 \muL de una disolución de alginato al 1% (MVM,
ProNova; Oslo, Norway) en ddH_{2}C, y se formó un remolino. Estas
disoluciones se liofilizaron, se mezclaron con 100 mg de
partículas de NaCl (250\mum<d<425\mum) y se moldearon
por compresión a 102,04 atm (1500 psi) durante 1 minuto en una
extrusora de 4,2 mm de diámetro. Esto dio como resultado discos de
2,8 mm de espesor con un diámetro de 5,0 mm.
Los discos se expusieron a 57,82 atm (850 psi) de
CO_{2} gas en un tanque de presión aislado y se permitió que se
equilibraran durante 20 horas. La presión se disminuyó hasta
presión ambiente en 2 minutos, lo que provocó una inestabilidad
termodinámica y la formación posterior de poros gaseosos en las
partículas poliméricas. Las partículas poliméricas se expandieron y
conglomeraron para formar un armazón continuo con partículas de
alginato y NaCl atrapadas. Después de la espumación por gas, los
discos se incubaron en CaCl_{2} 0,1M durante 24 horas para
lixiviar las partículas de sal e inducir la gelificación del
alginato en la matriz polimérica. Se incluyó alginato en los
armazones porque se había usado en los estudios de liberación de
VEGF para ayudar a remitir la liberación de VEGF de los armazones
de PLG^{11}, y era necesario imitar con precisión las condiciones
del armazón durante los estudios de liberación del factor.
La porosidad total de los armazones se calculó
usando la densidad conocida del polímero sólido, la masa medida del
polímero en el armazón y el volumen medido del armazón. Las
micrografías de sección transversal con electrones se obtuvieron
biseccionando los armazones mediante fractura en frío y reflejando
las imágenes usando un microscopio de barrido electrónico Hitachi
S3200N.
Para determinar el efecto del VEGF en disolución
sobre el procedimiento de crecimiento mineral, los armazones se
incubaron en SBF que contenía 0,2 \muCi de VEGF marcado con
^{125}I (VEGF humano de tipo receptor, 90 \muCi/\mug,
Biomedical Technlogies Inc.; Stoughton, MA) (n=5). Las muestras se
incubaron durante cinco días, pues este es el periodo de tiempo
requerido para el crecimiento de una cantidad significativa del
material similar al hueso en las superficies internas de los poros
de armazones de PLG^{14} obtenidos por espumación por
gas/lisiviación de partículas 85:15. Después de la incubación, los
armazones se lavaron tres veces en ddH_{2}O y se determinó su
radiactividad usando un contador gamma. Se calculó el porcentaje de
incorporación de VEGF en los armazones de polímero (Conteo del
armazón/conteo de la disolución * 100) y se dibujó frente al tiempo
de incubación.
La incubación se realizó en tubos que se
siliconaron usando sigmacota, después se preagitaron en una
disolución de albúmina de suero bovino al 1% (BSA) durante 30
minutos para revestir la superficie del tubo con BSA y, de esta
manera, reducir la unión del VEGF a la superficie interna de los
tubos. Las disoluciones se sustituyeron diariamente para asegurar
unas concentraciones iónicas suficientes para el crecimiento
mineral y una concentración constante del factor de crecimiento
yodado en la disolución.
Se preparó el fluido corporal simulado (SBF)
diariamente, disolviendo los siguientes reactivos en H_{2}O
desionizada: NaCl-141 mM, KCl-4,0
mM, MgSO_{4}-0,5 mM,
MgCl_{2}-1,0 mM, NaHCO_{3}-4,2
mM, CaCl_{2}-2,5 mM y
KH_{2}PO_{4}-1,0 mM. El SBF resultante se
tamponó a pH=7,4 con Trisma-HCl y se mantuvo a 37ºC
durante los periodos de incubación.
Los armazones de
poli(lactida-co-glicolida)
85:15 preparados mediante un procedimiento de espumación por
gas/lixiviación de partículas eran porosos en un 93 \pm 1% y
mostraron una estructura porosa abierta con un diámetro de poros de
\sim200 \mum.
La incorporación de VEGF radiactivo en los
armazones fue mayor para los armazones de control que para los
armazones experimentales para todos los puntos temporales
posteriores a 2 días (p<0,05). Los datos de control
muestran también una tendencia a un aumento en la incorporación de
VEGF al aumentar el tiempo de incubación (Fig. 9). Estos datos
indican que el VEGF se está incorporando en los armazones de
control más eficazmente de lo que se está incorporando en las
muestras experimentales, y la cantidad de VEGF en los armazones
experimentales no aumenta durante el tratamiento de
mineralización.
Los datos muestran que el VEGF no se incorpora
significativamente en los armazones de PLG durante la incubación en
SBF. No hay tampoco una incorporación significativa del factor de
crecimiento en el mineral durante las etapas iniciales del
crecimiento mineral. Por lo tanto, la atenuación de la liberación
de VEGF mostrada anteriormente desde los armazones de PLG durante el
crecimiento mineral no se puede explicar por la incorporación de
proteínas en la película mineral, unión de la proteína a la
superficie del armazón o difusión de la proteína de vuelta hacia
el armazón durante la liberación de proteína.
Las etapas postuladas en el procedimiento de
crecimiento mineral sobre armazones de PLG son: 1) funcionalización
superficial mediante reacción de hidrólisis; 2) quelación de iones
Ca^{2+} mediante aniones carboxilato superficiales; 3)
Nucleación y crecimiento de cristales minerales sobre la superficie
del polímero. La falta de incorporación de VEGF en los armazones de
PLG incubados en SBF indica que la proteína no compite con los
iones calcio por los centros de unión sobre las superficies
internas de los poros de los armazones o se difunde eficazmente de
vuelta a los armazones después de la liberación.
En este caso, la cantidad de proteína incorporada
en los armazones fue significativamente mayor para las muestras de
control incubadas en tampón de Tris-HCl, y la
incorporación aumentó con el tiempo. El aumento de la eficacia de
incorporación de VEGF en las muestras de control puede deberse a una
difusión más eficaz del factor en los armazones de control o a una
unión potenciada del factor a las superficies internas de los
armazones de control. Este resultado muestra que los efectos del
crecimiento mineral sobre la liberación de VEGF desde los armazones
de PLG no se puede explicar por la incorporación de VEGF de nuevo a
los armazones de PLG después de la liberación, o por la unión de
VEGF a las superficies internas de los poros de los armazones.
No hay una incorporación significativa de
proteína en la película mineral durante las etapas iniciales del
crecimiento mineral. Durante la incubación de armazones de PLG en
SBF que contenía VEGF marcado con ^{125}I, la cantidad de VEGF
medida en los armazones no cambió significativamente después de 2
días. El presente estudió limitó el marco temporal de incubación en
SBF a 5 días, pues este era el periodo en el que se iniciaba el
crecimiento mineral, y ocurrió un crecimiento mineral significativo
en un estudio previo sobre armazones de PLG obtenidos por
espumación por gas/lixiviación de partículas 85:15.
Los estudios previos sobre armazones de PLG
mineralizados muestran que el crecimiento mineral continua durante
al menos dos semanas in vitro y se considera que los
factores bioactivos se pueden incorporar en la película mineral
durante tiempos de incubación mayores. En particular, la atenuación
de la liberación de VEGF de los armazones de PLG provocada por la
formación mineral no se puede explicar por la incorporación de la
proteína en la película mineral, pues esta atenuación ocurre
mayoritariamente en los primeros 5 días de la incubación en SBF y
no hay una incorporación significativa durante este periodo de
tiempo.
Como la atenuación de la liberación del factor de
crecimiento no se puede explicar por la incorporación de las
proteínas de nuevo en los armazones después de la liberación o la
incorporación de proteínas en los cristales minerales en
crecimiento, es probable que la atenuación se deba simplemente a un
efecto de barrera. Los cristales minerales en crecimiento sobre las
superficies internas de los poros del armazón de PLG puede
bloquear físicamente la liberación de proteínas de la matriz
polimérica. Este efecto de barrera se ha estudiado ampliamente en
aplicaciones de administración controlada de fármacos usando
membranas de microesferas poliméricas laminadas y microesferas
encapsuladas, y el crecimiento de un mineral similar al hueso
representa un nuevo procedimiento para bloquear la difusión de
proteínas hacia fuera de los materiales poliméricos.
Por lo tanto el factor de crecimiento endotelial
vascular no se incorpora en la película mineral, o se incorpora
significativamente en el armazón polimérico durante la incubación
de PLG en SBF. El efecto observado anteriormente de crecimiento
mineral sobre la liberación de VEGF de los armazones de PLG está
causado, probablemente, porque el mineral actúa como barrera física
a la difusión de proteínas fuera del armazón. Se contempla que
este mecanismo es útil en aplicaciones de administración controlada
de fármacos, pues el perfil de liberación desde estos materiales
se puede controlar, de manera predecible, por el espesor y la
densidad de la película mineral.
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Claims (55)
1. Un procedimiento para generar una superficie
mineralizada extendida sobre un material biocompatible, que
comprende funcionalizar al menos una primera superficie de un
material biocompatible para crear una pluralidad de grupos polares
oxígeno en una superficie funcionalizada y poner en contacto dicha
superficie funcionalizada in vitro con una cierta cantidad de
una disolución que contiene un mineral eficaz para generar una
mineralización extendida sobre al menos dicha primera superficie de
dicho material biocompatible.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicha superficie funcionalizada se genera exponiendo al menos
una primera superficie de dicho material biocompatible a un
pretratamiento de funcionalización antes de ponerlo en contacto con
dicha disolución que contiene el mineral.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el
que dicho pretratamiento de funcionalización comprende la
exposición a una cantidad eficaz de radiación electromagnética,
radiación UV o radiación por haz de electrones
(haz-e).
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el
que dicho pretratamiento de funcionalización genera una superficie
estructurada, funcionalizada.
5. El procedimiento de la reivindicación 2, en el
que dicho pretratamiento de funcionalización comprende la
exposición a una cantidad eficaz de una disolución de NaOH.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que dicha superficie funcionalizada se genera durante dicho
contacto con dicha disolución que contiene el mineral.
7. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que
contiene mineral comprende calcio y en el que dicha mineralización
extendida comprende un revestimiento de calcio extendido.
8. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que
contiene el mineral comprende al menos un primer y un segundo
mineral y en el que dicha mineralización extendida comprende una
mezcla de dicho primer y segundo minerales.
9. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la disolución que contiene
el mineral comprende una pluralidad de minerales diferentes y en
que dicha mineralización extendida comprende un revestimiento
polimineralizado heterogéneo.
10. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en que dicha mineralización extendida
comprende al menos una primera parte hipermineralizada.
11. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en que al menos dicha primera
superficie de dicho material biocompatible es una superficie
interna del poro de un material biocompatible poroso y en el que se
genera un revestimiento mineral extendido sobre dicha superficie
interna del poro.
12. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha mineralización
extendida comprende un revestimiento mineral sustancialmente
homogéneo.
13. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha mineralización extendida
comprende una pluralidad de islas minerales discretas.
14. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha disolución que
contiene el mineral es un fluido corporal in vitro o un
medio sintético que imita un fluido corporal.
15. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte biodegradable,
no biodegradable o armazón tridimensional o al menos una primera
parte que tenga una estructura porosa abierta o interconectada.
16. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte en forma de
película de un biomaterial sustancialmente bidimensional.
17. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos un una primera parte de metal,
biocristal, aluminato, biomineral, biocerámico, titanio o titanio
revestido de biomineral.
18. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un
biomineral seleccionado del grupo constituido por hidroxiapatita,
hidroxiapatita carbonatada y carbonato cálcico o en el que dicho
material biocompatible comprende al menos una primera parte de
superficie que está enriquecida en grupos ácido carboxílico.
19. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte de polímero de
origen natural o sintético.
20. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un
polímero de origen natural seleccionado del grupo constituido por
colágeno, alginato, fibrina, matrigel, alginato modificado,
elastina, chitosano y gelatina; o un polímero sintético
seleccionado del grupo constituido por un
poli(vinilalcohol), poli(etilenglicol), plurónico,
poli(vinilpirrolidona), hidroxietilcelulosa,
hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa,
poli(etilentereftalato), poli(anhídrido) y
poli(propilenfumarato).
21. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte que comprende un
polímero de ácido poliáctico (PLA), un polímero de ácido
poliglicólico (PGA) o un copolímero de ácido
poliáctico-co-glicólico (PLG).
22. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera parte preparada
mediante un procedimiento que comprende espumación por gas y
lixiviación de partículas.
23. El procedimiento de la reivindicación 22, en
el que al menos una primera sustancia bioactiva se asocia de manera
operativa con dicho material biocompatible durante el procedimiento
de espumación por gas y lixiviación de partículas.
24. El procedimiento de la reivindicación 22, en
el que dicho material biocompatible se prepara mediante un
procedimiento de espumación por gas y lixiviación de partículas que
comprende las etapas de:
- a)
- preparación de una mezcla que comprende, al menos, un material lixiviable en forma de partículas y partículas capaces de formar un biomaterial polimérico degradable poroso;
- b)
- someter dicha mezcla a un procedimiento de espumación por gas para crear un biomaterial polimérico degradable, poroso que comprende dicho material lixiviable en forma de partículas; y
- c)
- someter dicho biomaterial polimérico degradable poroso a un procedimiento de lixiviación que elimina dicho material lixiviable en forma de partículas de dicho biomaterial polimérico degradable poroso, creando, de esa manera, porosidad adicional.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, en
el que dicho procedimiento de lixiviación comprende poner en
contacto dicho biomaterial polimérico degradable poroso con un
material de lixiviación que contiene mineral.
26. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que al menos dicha primera
superficie de dicho material biocompatible es sustancialmente una
superficie de nivel.
27. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, en el que al menos dicha superficie de
dicho material biocompatible es una superficie de contorno.
28. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible se fabrica como al menos una parte de un dispositivo
implantable.
29. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una sustancia bioactiva, un fármaco bioactivo o una
célula biológica.
30. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos dos sustancias bioactivas, fármacos o células
biológicas.
31. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una sustancia bioactiva adherente a mineral, un fármaco
bioactivo o una célula biológica.
32. El procedimiento de cualquiera de la
reivindicación 31, en el que la generación de la superficie
mineralizada extendida controla la liberación de dicha sustancia
bioactiva, fármaco o célula biológica de dicho material
biocompatible.
33. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una primera molécula de ADN, una molécula de ARN, un
ácido nucleico antisentido, una ribozima, un plásmido, un vector de
expresión, un vector viral o un virus recombinante.
34. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una primera proteína marcadora, factor de transcripción
o elongación, proteína de control del ciclo celular, quinasa,
fosfatasa, proteína de reparación del ADN, oncogen, supresor de
tumores, proteína angiogénica, proteína antiangiogénica, receptor
de superficie celular, molécula accesoria de señalización, proteína
de transporte, enzima, agente antibacteriano, agente antivírico,
antígeno, inmunógeno, agente inductor de apoptosis, agente
antiapoptosis o citotoxina.
35. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una primera hormona, neurotransmisor o receptor del
factor de crecimiento, interferón, interleucina, quimioquina,
citoquina, factor estimulante de colonias, factor quimiotáctico,
componente extracelular de la matriz o una molécula de adhesión,
ligando o péptido.
36. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de hormona del crecimiento, hormona paratiroidea (PTH), proteína
ósea morfogenética (BMP), factor de crecimiento transformador
\alpha (TGF- \alpha), TGF-\beta1,
TGF-\beta2, factor de crecimiento de fibroblasto
(FGF), factor estimulante de las colonias de
granulocitos/macrófagos (GMCSF), factor de crecimiento epidérmico
(EGF), factor de crecimiento proveniente de plaquetas (PDGF), factor
de crecimiento de tipo insulina (IGF), factor de dispersión/factor
de crecimiento de hepatocitos (HGF), fibrina, colágeno,
fibronectina, vitronectina, ácido hialurónico, un péptido o
polipéptido que contiene RGD, una angiopoyetina o factor de
crecimiento celular endotelial vascular (VEGF).
37. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una célula ósea progenitora, fibroblasto, célula
endotelial, célula madre, macrófago, célula vascular, osteoblasto,
condroblasto u osteoclasto.
38. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad biológicamente eficaz
de al menos una primera célula recombinante que expresa al menos un
primer segmento de ácido nucleico que produce un producto
transcripcional o traducido en dicha célula.
39. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad combinada
biológicamente eficaz de al menos una primera sustancia bioactiva y
al menos una primera célula biológica.
40. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad combinada
biológicamente eficaz de al menos un primer factor de crecimiento
osteotrópico o un ácido nucleico del factor de crecimiento
osteotrópico y una población celular que comprende células óseas
progenitoras.
41. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende además una cantidad combinada
biológicamente eficaz de VEGF o un ácido nucleico de VEGF y una
población celular que comprende células endoteliales.
42. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que al menos se incorpora una
primera sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica en dicho
material biocompatible antes del procedimiento de modificación
celular.
43. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que al menos una primera
sustancia bioactiva, fármaco o célula biológica se incorpora en
dicho material biocompatible durante o posteriormente al
procedimiento de modificación superficial.
44. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho material
biocompatible comprende al menos una primera superficie
estructurada y en el que al menos se une una primera sustancia
bioactiva, fármaco o célula biológica en una cierta estructura a
dicha superficie estructurada.
45. Un material biocompatible modificado en
superficie que comprende al menos una primera superficie modificada
preparada mediante un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones anteriores.
46. Un material biocompatible modificado en
superficie según la reivindicación 45 para usar en cultivo
celular.
47. Un material biocompatible modificado en
superficie según la reivindicación 45 para usar en transplante
celular.
48. Un material biocompatible modificado en
superficie según la reivindicación 45 para usar en ingeniería
tisular o en la regeneración guiada del tejido.
49. Uso de un material biocompatible modificado
en superficie según la reivindicación 45 en la preparación de un
medicamento para tratar una afección médica que necesite
transplante de células.
50. Uso de un material biocompatible modificado
en superficie según la reivindicación 45 en la preparación de un
medicamento para tratar una afección médica que necesite ingeniería
tisular o regeneración guiada del tejido.
51. Un dispositivo de cultivo celular que
comprende un material biocompatible modificado en superficie según
la reivindicación 45.
52. Un dispositivo biomédico implantable que
comprende un material biocompatible modificado en superficie según
la reivindicación 45.
53. Un procedimiento para cultivas células, que
comprende cultivar una población de células en contacto con un
material biocompatible modificado en superficie según la
reivindicación 45 in vitro.
54. El procedimiento de la reivindicación 53, en
el que dicha población de células se mantiene en contacto con dicho
material biocompatible modificado en superficie en unas condiciones
y durante un periodo de tiempo eficaz para generar un tejido con
estructura de tipo bi- o tridimensional.
55. El procedimiento de la reivindicación 53, en
el que dicha población de células se mantiene en contacto con dicho
material biocompatible modificado en superficie en unas condiciones
y durante un periodo de tiempo eficaz para generar un tejido
similar al hueso, tejido neovascularizado o vascularizado.
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