JP2003526677A

JP2003526677A - 骨形成に影響を与える組成物および方法

Info

Publication number: JP2003526677A
Application number: JP2001566698A
Authority: JP
Inventors: ティー．マイケルアンダーヒル，; アーサーブイ．サムペイオ，; アンドレアディー．ウエストン，
Original assignee: ザ・ユニバーシテイ・オブ・ウエスタン・オンタリオ
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2003-09-09
Also published as: AU4214101A; WO2001068135A3; WO2001068135A2; EP1265637A2; AU784377B2; CA2402413A1; US20030125252A1; WO2001068135A9

Abstract

(57)【要約】本発明は、骨形成を促進および阻害するための組成物、ならびに傷害、毒性または疾患から生じる骨の異常を処置するための方法、およびエキソビボでの骨組織操作のための方法に関する。より詳細には、本発明は、骨形成を刺激するための薬学的組成物であって、治療的に有効な量のＲＡＲアンタゴニスト；および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物、および骨格の外科手術の部位における骨に関連した整形外科的欠陥および傷害、または哺乳動物における異常を修復するための移植可能なプロテーゼデバイスもまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、インビトロおよびインビボで骨形成に影響を与える組成物に関する
。詳細には、本発明は、骨形成を刺激しそして阻害するための組成物、ならびに
傷害、毒性、または疾患によって生じた骨の異常を処置するため、およびエキソ
ビボでの骨組織の操作のためのその使用のための方法に関する。

【０００２】（発明の背景）本出願を通じて、種々の参考文献は、本発明が属する分野の技術水準をより完
全に記載するために括弧内に引用される。それぞれの引用についての完全な文献
目録の情報は、特許請求の範囲のすぐ前の明細書の最後に見られる。これらの参
考文献の開示は、本発明の開示において本明細書中で参考として援用されている
。

【０００３】ビタミンＤの活性な形態である、１α，２５−ジヒドロキシビタミン−Ｄ_３（
１，２５ＶＤ_３）は、カルシウムの恒常性の維持において機能し、そして腸の
内腔からの取り込みを増大させることによって血液のカルシウムレベルを上昇さ
せることにおいて重要であり、それによって腎臓からの排出を制限し、そして骨
での吸収を通じてＣａ^２＋を放出する（１）。骨に対する１，２５ＶＤ_３の影
響の多くは血漿のＣａ^２＋に対するその作用に対して二次的であると考えられて
いるが、いくつかの研究は、骨芽細胞の機能における１，２５ＶＤ_３の関与を
実証した（１，２）。培養された骨芽細胞の１，２５ＶＤ_３に対する曝露は、
細胞が処理される段階に依存する、表現型における変化を導く（３）。１，２５ＶＤ_３に対する前骨芽細胞の曝露は、細胞外マトリックスの蓄積および続くそ
の鉱化作用を阻害する。逆説的に言えば、より遅い段階では、１，２５ＶＤ_３の曝露は、骨芽細胞の成熟を刺激し、そしてマトリックスの合成およびカルシウ
ムの沈着を増強する。

【０００４】ビタミンＤ_３は、一部、核レセプターのスーパーファミリーのメンバーである
、ビタミンＤ_３レセプター（ＶＤＲ）の作用を通じて機能する（４，５）。ＶＤ
Ｒは、腎臓、骨、小腸、および皮膚において豊富に発現され、そして多数の他の
組織においてはより少ないレベルで発現される（６〜９）。より最近では、ＶＤ
Ｒのアイソフォームが同定されている。これは、１，２５ＶＤ_３の組織特異的
作用のいくつかを媒介することにおいて重要であり得る（１０）。ＶＤＲは、ホ
モ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとしてＤＮＡと相互作用することによっ
て、代表的には、レチノイド−Ｘ−レセプター（ＲＸＲ）を用いて、遺伝子の発
現を調節する（１，２，５）。ＶＤＲはまた、インビトロでレセプター（レチノ
イン酸レセプター（ＲＡＲ）を含む）のステロイドホルモンルーパーファミリー
の他のメンバーと相互作用することが示されている。これらの相互作用はまた、
ＶＤＲの機能に寄与し得る（１１，１２）。ＶＤＲヌル変異体は、誕生時には表
現型的には正常であるが、離乳後に、１，２５ＶＤ_３依存性のＩＩ型くる病に
類似した疾患を発症する。この疾患は、骨の再構成の間の骨の形成におけるＶＤ
Ｒの役割の指標である（１３，１４）。

【０００５】レチノイドもまた、骨格の発達および恒常性に影響を与える。研究は、骨芽細
胞の発達に対するレチノイドの相反する影響を報告する。胚発生の間に、外因性
のレチノイドは、軟骨形成の阻害を通じて骨格の発達を阻害し得、続いて骨の形
成を支持するための不適切な軟骨質のテンプレートを導く（１５）。ビタミン過
剰症−Ａは、インビボで骨の形成を阻害することが報告されている（１６，１７
）。ビタミン−Ａに対する誕生後の曝露は、骨形成に影響を与え、それによって
骨の病変および薄くなった骨の襟（ｃｏｌｌａｒ）を生じ、そして骨粗鬆症に関
係し得る。前骨芽細胞、または分化しつつある骨芽細胞のビタミンＡに対する曝
露は、マトリックスの合成および鉱化作用を阻害する。ビタミンＡのこれらの作
用は、ビタミンＡの代謝産物であるレチノイン酸（ＲＡ）、ならびに全トランス
ＲＡおよび９−シスＲＡのいずれかについてのレセプター、レチノイン酸レセプ
ター（ＲＡＲ）、または９−シスＲＡレチノイド−Ｘ−レセプター（ＲＸＲ）と
のその会合を通じて主に媒介される（１８）。ＲＡＲは、ＲＸＲパートナーとの
会合におけるヘテロ二量体として機能するが、これはまた、遺伝子の発現を調節
するために、特定の細胞型中のＶＤＲまたは甲状腺ホルモンレセプターとも相互
作用し得る（１９）。ＶＤＲ、ＲＡＲα、およびＲＸＲαは、骨芽細胞中で同時
に発現され、そしておそらく、骨芽細胞の表現型に対するそれらのそれぞれのリ
ガンドの影響を媒介することにおいて重要である。

【０００６】研究により、骨芽細胞の培養物に対するレチノイドの添加が骨の形成を刺激す
るか、または増強された骨芽細胞の機能の指標である遺伝子の発現を増強するこ
ともまた、報告された（４０、４２、４３、４４、４６、４７、６１、４９、５
０、５２、５６、６０）。しかし、ＲＡの添加がインビトロで骨の形成を阻害し
得るという他の報告が示された（４１，５１，５８）。骨の形成に対するＲＡの
影響のいくつかは、骨芽細胞の分化の段階および種に依存し得る。

【０００７】いくつかの報告により、ＲＡが、インビボで骨粗鬆症を刺激し得ることが示さ
れた。１つのこのような研究は、ラットにおいて行われた（５９）が、このモデ
ルにおいては、彼らは、減少した骨の鉱物密度の主な機構が、破骨細胞の活性化
を通じる骨の吸収における増大であることを見出した。これらの結果と一致して
、ＲＡは、破骨細胞の活性を刺激することが報告されている（４５、５３、５４
、５５、５８）。これは、骨粗鬆症を証明する骨の増大した吸収を生じる。断続
的なＲＡでの処置が、ラットにおいて骨の形成を刺激し得るというさらなる報告
が示された（５７）が、一方で、挫創について１３−シスＲＡを用いて処置され
たヒトについて行われたレントゲン写真による研究は、骨の鉱物密度に対するＲ
Ａの影響の証拠は示さなかった（４８）。

【０００８】研究により、骨芽細胞に対するビタミンＤおよびレチノイン酸レセプターの一
般的な関与を示したが、関係の性質は、骨細胞の発達に関して以前には解明され
ていない。レチノイン酸レセプターの活性およびビタミンＤの機能に対する直接
的な影響、ならびに結果としての、骨形成に対して得られる影響は以前には示さ
れていない。さらに、いずれの様式でもレチノイドシグナル伝達の阻害が骨の形
成を刺激することを、一貫してまたは決定的に実証する文献は存在しない。

【０００９】（発明の要旨）骨芽細胞に対するビタミンＤの作用におけるＲＡＲ媒介性シグナル伝達につい
ての、新規の機能的な要件が本明細書中で示される。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１前骨芽細
胞株のビタミンＤ_３での処理によって、鉱化作用を阻害し、そしてプログラムさ
れた細胞死を刺激した。ＲＡＲ選択的アゴニストは、これらの効果を強くし、一
方、ＲＡＲ選択的アンタゴニストは、細胞死に対する、および、より少ない程度
で骨の小結節形成の両方に対する、ビタミンＤの影響を逆転させた。アンタゴニ
ストはまた、鉱化作用およびオステオカルシンの発現を刺激した。ビタミンＤに
よって誘導される細胞死は、ドミナントネガティブなＲＡＲの発現によって阻害
された。ＲＡＲアンタゴニストもまた、骨の形成を刺激することが実証されてい
る。これらの結果は、ビタミンＤによる骨形成の阻害が前骨芽細胞中でのアポト
ーシスの刺激に関係していること、ならびに、ビタミンＤおよびＲＡＲ媒介性シ
グナル伝達経路が働きあって、骨芽細胞表現型の発現を調節することを実証する
。

【００１０】結果は、ＲＡＲ活性がビタミンＤによって誘導される細胞死を逆転させること
において直接役割を有することを示す。このことは、治療用組成物の開発のため
の基礎、および不適切な骨の形成に関係している障害を処置するためのこのよう
な組成物の使用を提供する。

【００１１】１つの局面においては、治療用組成物およびそれらを使用する方法は、ＲＡＲ
活性の阻害に基づく。このような組成物は、任意のＲＡＲアンタゴニストまたは
、ＲＡＲアンタゴニスト活性を有する薬剤を含有し得る。このように、組成物は
、ＲＡＲ活性をダウンレギュレートするかまたは阻害するアンチセンスＲＡＲオ
リゴヌクレオチドを含み得る。

【００１２】本発明は、治療用組成物、ならびに、疾患、外傷、ビタミンＤ毒性、およびビ
タミン過剰症Ａによって生じる異常な骨の形成および関連する異常な骨格の発達
に関係している障害の処置のための方法を提供する。

【００１３】第１の実施形態に従うと、本発明は、有効量のＲＡＲアンタゴニスト、および
必要に応じて、骨形成の促進のための薬学的に受容可能なキャリアを含有する、
薬学的組成物を提供する。

【００１４】本発明の別の実施形態に従うと、本発明は、有効量のＲＡＲアンタゴニスト、
および必要に応じて、ビタミンＤ毒性の処置のための薬学的に受容可能なキャリ
アを含有する、薬学的組成物である。

【００１５】本発明の別の実施形態に従うと、本発明は、有効量のＲＡＲアンタゴニスト、
および必要に応じて、筋無力症の骨の疾患の処置のための薬学的に受容可能なキ
ャリアを含有する、薬学的組成物である。

【００１６】本発明の別の実施形態に従うと、本発明は、有効量のＲＡＲアンタゴニスト、
ならびに必要に応じて、インビボおよびインビトロでのＶＤＲ転写活性の調節の
ための薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物である。

【００１７】本発明はさらに、生物学的システム（哺乳動物を含む）中で全てまたはいくつ
かのＲＡＲレセプター部位をブロックし、上記のレセプター部位に対するＲＡＲ
アゴニストの作用を妨げるかまたは減少させるためのＲＡＲアンタゴニストの使
用に関する。より詳細には、本発明は、レチノイド（ビタミンＡまたはビタミン
Ａ前駆体を含む）の慢性的または急性の毒性、およびレチノイド治療の副作用の
（ａ）予防および（ｂ）処置のための、ＲＡＲアンタゴニストの使用に関する。
本発明のこの局面においては、哺乳動物中での病理学的状態を処置する方法が提
供される。処置される状態は、レチノイン酸レセプター活性に関係している。こ
の方法は、以下のレチノイン酸レセプターのサブタイプの１つに対して結合し得
るレチノイドアンタゴニストまたはそのアナログを哺乳動物に対して投与する工
程を包含する：ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲＡＲλ。アンタゴニストは、哺乳
動物中の病理学的な状態に対して治療的な利点を提供するための薬学的に有効で
ある量で投与される。

【００１８】本発明での使用のためのＲＡＲアンタゴニストは、骨の形成に対する刺激効果
を有することによって、そして脊椎動物中で骨の発達の結果として特徴付けられ
る。ＲＡＲアンタゴニストは、１μＭ未満のＫｄでＲＡＲのサブタイプの１つ以
上に対して結合する任意の化合物として規定され得る。従来のように、ＲＡＲア
ンタゴニストは、ＲＡＲアゴニストの活性を阻害する化学的な薬剤である。従っ
て、レセプターアンタゴニストの活性は、従来のように、アゴニストの活性を阻
害するその能力によって測定される。

【００１９】本発明の別の実施形態に従うと、本発明は、ビタミンＤに対して曝露された骨
芽細胞におけるアポトーシスを阻害するためのＲＡＲアンタゴニストの使用であ
る。

【００２０】本発明の別の実施形態に従うと、本発明は、鉱化作用、ならびに骨芽細胞中の
オステオカルシンおよび骨のシアロタンパク質のような特定の遺伝子の発現の刺
激を導く骨芽細胞の分化を促進するための、ＲＡＲアンタゴニストの使用である
。

【００２１】さらなる実施形態に従うと、本発明は、脊椎動物中で骨形成を刺激するための
方法を提供する。この方法は、脊椎動物に対して、ＲＡＲアンタゴニストの骨形
成を刺激するための有効量を投与する工程を包含する。

【００２２】さらなる実施形態においては、本発明は、被験体中の損傷した骨を処置するた
めの方法を提供する。この方法は、被験体に対して有効量のＲＡＲアンタゴニス
トを投与する工程を包含する。ここでは、ＲＡＲアンタゴニストは、骨の修復お
よび形成を刺激する。

【００２３】さらなる実施形態に従うと、本発明は、被験体中の形成外科用または歯科用の
インプラントの骨への組込みを増強するための方法を提供する。この方法は、被
験体に対して有効量のＲＡＲアンタゴニストを投与する工程を包含する。

【００２４】この方法は、選択されたＲＡＲアンタゴニストの全身的または局所的投与を提
供することを包含し得る。

【００２５】さらなる実施形態に従うと、本発明は、被験体中の骨に関係している障害を処
置するための方法を提供する。この方法は、有効量のＲＡＲアンタゴニストで処
置される、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨、骨髄または血液から誘導された骨格前駆
体細胞、およびそれらの混合物からなる群より選択される細胞を、被験体に対し
て投与する工程を包含する。

【００２６】本発明の１つの実施形態に従うと、脊椎動物中の骨形成および関連する骨格の
発達を誘導するための組成物が提供される。この組成物は、以下を含有する： −ＲＡＲアンタゴニスト；および −薬学的に受容可能なキャリア。

【００２７】本発明の別の実施形態に従うと、脊椎動物中の骨の部位での移植のための、形
態形成用のデバイスが提供される。このデバイスは、以下を含む： −移植可能な生体適合性のキャリア；および −上記のキャリア中またはその上に分散されたＲＡＲアンタゴニスト。

【００２８】本発明のなお別の実施形態に従うと、インビトロで骨形成を誘導するための、
ＲＡＲアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物の使
用が提供される。

【００２９】本発明の１つの局面においては、組成物は、ＲＡＲ活性をダウンレギュレート
するかまたは阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有し得る。

【００３０】本発明のなお別の実施形態に従うと、骨芽細胞をインビトロでＲＡＲアンタゴ
ニストと接触させる工程を包含する、骨芽細胞の鉱化作用を刺激するための方法
が提供される。

【００３１】本発明の別の実施形態に従うと、脊椎動物中での骨に関係している整形外科的
な欠損、傷害、または異常を修復するための、移植可能なプロテーゼデバイスが
提供され、このデバイスは、以下を含む： −骨組織に隣接しているかまたは骨組織中の移植可能な表面領域を有する、プ
ロテーゼインプラント； −増強された骨の鉱化作用および表面上での骨の形成を促進するための十分な
量で、表面領域上に分散させられたＲＡＲアンタゴニスト組成物。

【００３２】本発明の別の実施形態に従うと、脊椎動物の標的の骨組織中への移植可能なプ
ロテーゼデバイスのインビボでの組込みを促進するための方法が、提供される。
この方法は、以下の工程を包含する： −プロテーゼデバイスの表面上に、ＲＡＲアンタゴニストおよび薬学的に受容
可能なキャリアを含有する組成物を提供する工程；ならびに −脊椎動物の部位にデバイスを移植する工程。ここでは、標的の骨組織および
プロテーゼデバイスの表面が、標的の骨組織とデバイスとの間で組織が増殖する
ことを可能にするために十分な時間の間、少なくとも部分的に接触して維持され
る。

【００３３】本発明のなお別の実施形態に従うと、脊椎動物中の骨格の外科手術の部位で天
然の骨の形成を促進するための方法が提供される。この方法は、骨格の外科手術
の部位にＲＡＲアンタゴニスト組成物を送達し、それによって、このような送達
が、新しい骨組織の形成を間接的に促進する工程を包含する。

【００３４】本発明の別の実施形態に従うと、大きな分節の骨格の間隙、および脊椎動物に
おける外傷または外科手術によって生じた結合していない（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ
）骨折を修復するための方法が提供される。この方法は、分節の骨格の間隙また
は結合していない骨折の部位にＲＡＲアンタゴニスト組成物を送達し、それによ
ってそのような送達が新しい骨組織の形成を促進する工程を包含する。

【００３５】本発明のなお別の実施形態に従うと、骨の部位に対して移植可能なプロテーゼ
の付着を補助するため、および脊椎動物においてプロテーゼの長期間の安定性を
維持するための方法が、提供される。この方法は、移植可能なプロテーゼの選択
された領域をＲＡＲアンタゴニスト組成物でコーティングする工程、および骨の
部位の中にコーティングしたプロテーゼを移植し、それによってそのような移植
が新しい骨の形成を促進する工程を包含する。

【００３６】本発明のさらなる実施形態に従うと、インビボで骨の欠損の部位で骨を産生す
る方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する： −ＲＡＲアンタゴニストの存在下で、インビトロで培養された骨芽細胞または
骨芽細胞の先祖細胞の集団を欠損の部位に移植する工程。

【００３７】本発明の別の実施形態に従うと、骨の再生によって特徴付けられる変形性関節
症を処置するための方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する： −疾患部位に対して治療有効量のＲＡＲアンタゴニストを送達する工程。

【００３８】本発明は、別の局面においては、異所性の骨の形成、ならびに例えば、大理石
骨病および進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）における場合のような、所望
されない骨形成（すなわち、増大した所望されない骨の形成）を含む障害の処置
のための、治療用組成物および方法を提供する。このような薬学的組成物は、治
療有効量のＲＡＲアゴニスト（ａｎｇｏｎｉｓｔ）およびそれについての薬学的
に受容可能なキャリアを含む。

【００３９】本発明のさらなる局面においては、本発明は、所望されない骨形成の処置のた
めの、罹患した骨組織の処置のための、または天然の骨の形成を阻害するための
薬学的組成物を含む。ここでは、上記の組成物は、治療有効量のＲＡＲアゴニス
ト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。このような組成物は、このよう
な処置を必要とする哺乳動物中の骨組織を減少させるための方法において使用さ
れ得る。この方法は、哺乳動物に対して治療有効量のＲＡＲアゴニストを投与す
る工程を包含する。ここでは、上記のＲＡＲアゴニストは、骨の鉱化作用を阻害
し、そして骨の組織および骨の組織の形成に関係している細胞のアポトーシスを
刺激する。ＲＡＲアゴニストは、特定の骨の部位に対して標的化されるように処
方され得る。

【００４０】本発明のなお別の局面においては、本発明は、エキソビボで骨格組織を操作す
るための方法を提供する。この方法は、細胞の集団をＲＡＲアンタゴニスト組成
物の存在下で培養する工程；および上記の細胞を、移植可能なマトリックスに対
して適用する工程、およびさらに、骨形成を受けるために十分な時間の間、細胞
をインキュベートする工程を包含する。ここでは、移植可能なマトリックスは、
その上およびその中に取り込まれた骨組織の形成を有する。

【００４１】（好ましい実施形態の詳細な説明）本発明は、ＲＡＲの刺激またはＲＡＲの阻害のいずれかによる、骨形成に影響
を与えるための組成物、およびその使用方法を提供する。このように、本発明は
、代謝性の骨の疾患または非代謝性の骨の疾患、ならびに適切な骨の形成の増大
に関係している疾患を処置するための広範囲の臨床的な用途を有する。

【００４２】本発明の組成物は、インビトロおよびインビボの両方での用途、ならびに、エ
キソビボでの骨組織を操作する適用を有する。この組成物はまた、他の生理学的
な薬剤とともに、そして吸収が可能であるはまたは吸収が不可能であるかのいず
れかの性質の、プロテーゼデバイスである外科手術用の移植物と組合せて、特定
の用途を有する。

【００４３】本発明は、ＶＤＲおよびＲＡＲ媒介性シグナル伝達経路が働きあって、前骨芽
細胞の発生運命（ｆａｔｅ）および分化を調節することを実証する。ＶＤＲは、
ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体を通じて主に機能すると考えられているが、直接ま
たは間接的な機構を通じるＲＡＲ媒介性シグナル伝達は、ＶＤＲの転写活性、プ
ロモーター特異性、および／または補因子の動員を調節することにおいて重要で
あり得る。ＶＤＲおよびＲＡＲは、骨芽細胞中で豊富に発現され、そしてそれら
のリガンドは、同様の表現型上の影響を有し、このことはさらに、骨芽細胞の機
能の制御における重複している役割を示唆している。

【００４４】１，２５ＶＤ_３は、カルシウムの恒常性を維持することにおいて十分に確立
された機能を有する。この様式においては、１，２５ＶＤ_３の濃度は、Ｃａ^２ ^＋の吸収および増大の刺激を通じて間接的に、骨芽細胞の生理学に影響を与える
（１）。この理由のために、骨芽細胞の機能に対する１，２５ＶＤ_３の直接的
な影響と間接的な影響との間を区別することは困難となっている。特徴付けられ
た骨芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を使用して、適切な条件下でこれらの細胞
が鉱化作用するように処理され得ることが、本明細書中で実証される。分化のこ
のプロセスの間に、これらの細胞は、インビボで観察されたものと並行する、十
分に規定された多数の段階を通過する（２０、２４）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培
養物（あるいは、マウスまたはラット起源の胎児の頭蓋冠細胞）に対する培養後
すぐの１，２５ＶＤ_３の添加は、骨形成性の小結節形成の減少、およびオステ
オカルシンの減少した発現を導く（２６−２８）。

【００４５】これらの初期の研究と一致して、１，２５ＶＤ_３の早い段階の培養物への添
加が、鉱化作用の濃度依存性の減少を導くことが、本明細書中で実証される。し
かし、これらの条件下では、１，２５ＶＤ_３が、アポトーシス性の細胞体の出
現の増大に付随して、細胞の生存性を減少させることもまた、最初に本明細書中
で実証される。このことは、前骨芽細胞に対する１，２５ＶＤ_３の阻害作用の
一部が、これらの細胞集団中でアポトーシスを刺激する１，２５ＶＤ_３の能力
とともに存在することを示唆する。同様に、これらの同じ培養物の全トランスＲ
Ａ、９−シスＲＡ、ＴＴＮＰＢ、およびＲＡＲα選択的アゴニストでの処理（図
２、およびデータは示されない）は、鉱化作用を阻害し、そして死亡しつつある
細胞の数の増大と対になった細胞の生存性における濃度依存性の減少を導いた。
従って、１，２５ＶＤ_３およびレチノイドは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物中で同
様の表現型上の応答を誘発した。

【００４６】２つのシグナル伝達経路の間での可能性のある協同を評価するために、組合せ
て骨形成を阻害し、そして細胞死を刺激するリガンドの能力が、研究された。リ
ガンドの組合せは、いずれかの単独よりも有効であることが見出され、そしてい
くつかの場合においては（特に、細胞死の誘導においては）、２つのリガンドが
、相乗作用の様式で作用するようである。特定の目的は、ＲＡＲ選択的リガンド
が、全トランスまたは９−シスと同様に作動する場合である。これらは、それぞ
れ、高濃度および低濃度でＲＸＲを活性化し得る。いくつかの例においては、こ
の複合体中のＲＸＲ部分の活性化は、１，２５ＶＤ_３媒介性トランス活性化を
阻害し得る（２９）。しかし、ＲＡＲ選択的リガンドが、ＲＡＲまたはＲＸＲの
いずれかを活性化し得るリガンドに対して同様の応答を誘発するという観察は、
ＲＡＲ媒介性シグナル伝達の活性化の重要な要件を示唆する。さらに、このプロ
セスにおけるＲＡＲシグナル伝達の重要性についての証拠は、前骨芽細胞の死に
対する１，２５ＶＤ_３の影響、およびより少ない程度には、鉱化作用が、ＲＡ
Ｒα選択的アンタゴニストの添加を通じて阻害され得ることである。ＲＡＲα選
択的であるアンタゴニストの濃度は、処理されていない培養物と比較して、鉱化
作用を３倍増強した。まとめると、これらのデータは、ＲＡＲ媒介性シグナル伝
達に対する依存性を、そしてより詳細には、これらのプロセスにおけるＲＡＲの
重要な役割を示唆する。

【００４７】観察された表現型の変化についてのレセプター依存性の機構を排除するために
、ＲＡＲαのドミナントネガティブのバージョンが構築され、そしてその１，２
５ＶＤ_３の作用を阻害する能力について試験された；公知のＶＤＲ相互作用タ
ンパク質であるＲＸＲのドミナントネガティブバージョンもまた、比較の目的の
ために作製された。セレクチンの非存在下では、ＥＧＦＰのみでトランスフェク
トされた細胞と比較して、いずれかのドミナントネガティブを発現する処理され
た細胞中のＥＧＦＰを発現する細胞数の増大が、観察された。処理されたグルー
プの中のＥＧＦＰを発現する細胞数の増大は、ドミナントネガティブのレセプタ
ーの存在が、１，２５ＶＤ_３、ＲＡＲアゴニスト、またはそれらの両方の存在
下で選択的な利点を伴ってそれを発現する細胞を提供することを示唆する。ｄｎ
ＲＡＲおよびｄｎＲＸＲの両方ともが、１，２５ＶＤ_３誘導性アポトーシスを
阻害し得た。ｄｎＲＡＲは、この点においてはわずかにより強力であった。この
ことは、ＲＡＲＥレポーター遺伝子を阻害することにおけるそれらのそれぞれの
有効性と一致する。この状況においては、ｄｎＲＡＲはＲＸＲを分離するように
機能することが可能であり（３０）、そしてそれによって、重要なヘテロ二量体
のＶＤＲ結合パートナーである、ＲＸＲの接近の調節を通じて間接的にＶＤＲの
シグナル伝達を制限する。しかし、ＶＤＲ／ＲＸＲのシグナル伝達には影響をあ
たえないはずであるＲＡＲ選択的アンタゴニストもまた、１，２５ＶＤ_３誘導
性の前骨芽細胞アポトーシスを阻害するという観察は、さらに、ＲＡＲの直接的
な関与を示す。

【００４８】リガンドによって活性化されるＲＡＲは、活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）
の活性を妨害することが示されており、そしていくつかの細胞システムにおいて
は、これは、増殖の停止およびアポトーシスを導く（３１）。組合わせると、１
，２５ＶＤ_３およびレチノイドは、アポトーシスを刺激することが示されてい
る（３２）。しかし、ほとんどの例においては、リガンドは、ＲＡＲ選択的では
なく、そして他の場合においては、リガンドは、レセプター依存性の作用を有す
ると考えられる（３２）。いくつかのＲＡＲ選択的アンタゴニストは、抗ＡＰ−
１を示し、レチノイドについて観察されるものと同様の様式で、細胞性の増殖の
阻害を生じる（３３）。ＡＧＮ１９３８３６および１，２５ＶＤ_３はともに、
ＡＰ−１のトランス抑制を通じて増殖を停止させそしてアポトーシスを刺激し得
るという可能性が存在する。ＡＧＮ１９４３０１の添加（これは、ＡＰ−１を阻
害するように作動しない場合）は、内因性のＲＡに対して競合し得、そしてそれ
によって、リガンドによって活性化されたＲＡＲの形成を減少させ、そしてＡＰ
−１に対するレチノイドによって活性化されたレセプターの影響を逆転させる。
１，２５ＶＤ_３およびレチノイドのシグナル伝達経路の両方が、ＡＰ−１活性
を協同して阻害することが示されており、その結果、１つの経路の不活化は、生
存性を維持する適切なＡＰ−１活性を回復するために十分であり得る（３４）。
しかし、ＡＰ−１の阻害がこれらの２つのシグナル伝達経路の作用を十分に説明
するためには十分ではないことを示唆する証拠は、ｄｎＲＡＲの発現によって生
じる。以前の研究で、Ｓｃｈｕｌｅら（３５）は、ｄｎＲＡＲがＡＰ−１活性の
ＲＡ媒介性不活化を抑制することにおいて無効であることを実証した。しかし、
本明細書中で示されるように、ｄｎＲＡＲは、骨芽細胞中でのアポトーシスの誘
導において、１，２５ＶＤ_３、レチノイド、またはそれらの両方の作用を阻害
することいおいて有効であった。これらの結果は、２つの経路の作用が、完全に
は、ＡＰ−１のリガンドによって活性化されたレセプターのトランス抑制によっ
て説明できないことを示唆する。

【００４９】ＶＤＲおよびＲＡＲが、インビボで会合してヘテロ二量体または大きなヘテロ
マーの複合体を形成して遺伝子発現に対して影響を与えることが、可能である。
ＶＤＲおよびＲＡＲは、インビトロで特定のホルモン応答エレメントに協同して
結合することが示されている（１１）。しかし、哺乳動物のツーハイブッドシス
テムを使用した場合には、これらの２つのタンパク質間での有意な相互作用はそ
のようには検出されなかった（ＳａｍｐａｉｏおよびＵｎｄｅｒｈｉｌｌ、公開
されていないデータ）。同様に、最近の研究は、ＶＤＲおよびＴＲもまた、イン
ビボでは相互作用しないことを示したが、インビトロで行われた以前の研究は、
それらのあり得る相互作用を示唆した（３６）。従って、ＶＤＲおよびＲＡＲが
相互作用して、遺伝子発現に影響を与え得る機構は、なお不明なままである。

【００５０】本発明の結果は、ＶＤＲおよびＲＡＲ媒介性シグナルが、前骨芽細胞中でのプ
ログラムされた細胞死を調節するように相似することを示唆する。次いで、これ
は、骨芽細胞の表現型の発現が、ＶＤＲおよびＲＡＲ媒介性シグナルの組合せに
よって調整されることを示唆する。インビボでは、１，２５ＶＤ_３への透析患
者の慢性的な曝露が、筋無力症の骨の疾患の発症に関係する。筋無力症の骨の疾
患は、有意に減少した骨の形成、および骨芽細胞培養物の慢性的な１，２５Ｖ
Ｄ_３での処理を用いて本明細書中で観察されるものと同様の結果によって特徴付
けられる（３８）。骨を形成する細胞中の両方の経路の同時活性化はまた、鉱化
作用のより大きな減少をみちびき、そして特定の条件下では、骨粗鬆症のような
骨格の疾患の発症に関係している因子であり得る（１６、１７、３９）。前骨芽
細胞に対する１，２５ＶＤ_３のこれらの影響の多くは、ＲＡＲ媒介性シグナル
伝達を妨害することによって弱められ、従って、骨形成の障害の処置のために骨
の形成を増大させるための、可能性のある治療標的を提供し得る。

【００５１】（１，２５ＶＤ_３およびレチノイドは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物の鉱化作用
を阻害する）１，２５ＶＤ_３およびレチノイドは、インビトロおよびインビボの両方にお
いて骨格形成に影響を与えることが示されている。１，２５ＶＤ_３の影響のほ
とんどは、ホモ二量体として、またはＲＸＲのヘテロ二量体パートナーとともに
のいずれかで作用する、ＶＤＲの作用によって媒介されると考えられている。レ
チノイドは、この後者の複合体の活性を調節し得るか、またはＲＡＲ／ＲＸＲヘ
テロ二量体を通じて作用して、遺伝子の発現に影響を与え得る。骨形成に対する
ＲＡＲおよびＶＤＲの関与に特に着手するために、ＲＡＲ選択的アゴニストが、
ＲＡＲ媒介性シグナル伝達を活性化するために使用された。

【００５２】ＲＡＲ選択的アゴニストの骨形成に対する影響は、十分に特徴付けられた前骨
芽細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１において研究された。これは、インビボでの骨
形成プログラムの直ぐ後に続くことが見出されている（２０、２４）。細胞を、
コンフルエントに到達させ、その時点で、アスコルビン酸およびＧＰをリガンド
とともに添加した。２８日後、培養物を固定し、そして鉱化作用の程度を、アリ
ザリンレッドＳでの染色によって決定した。コントロール培養物中の約１８％の
領域が、アリザリンレッドＳで染色された（図１Ａ、Ｅ）。対照的に、ＲＡＲ選
択的アゴニスト（ＡＧＮ１９３８３６）（２５）、１，２５ＶＤ_３、またはそ
れらの両方のいずれかへの培養物の曝露によって、用量依存性の様式でのアリザ
リンレッドの染色における減少が導かれた（図１Ｂ−Ｅ）。１０ｎＭのＡＧＮ１
９３８３６での培養物の処理は、骨の形成を劇的に阻害し、一方、より高い濃度
では、骨の形成は完全に妨げられた（図１Ｂ、Ｅ）。種々の濃度の全トランスＲ
Ａ、９−シスＲＡ、またはＴＴＮＰＢでの処理は、骨の形成において同様の減少
を導いた（データは示されない）。同様に、１，２５ＶＤ_３（０．１ｎＭ）は
、アリザリンレッド染色の量の減少を導き、漸増濃度では骨の形成をさらに抑制
した（図１Ｃ、Ｅ）。いずれかでの単独での処理を用いるよりも、組合せた場合
には、骨の小結節形成においてさらなる減少が存在した（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。興
味深いことに、高い薬物濃度では、細胞の形態学においてもまた変化が存在し、
そしてこれは特に、両方の化合物を用いて処理された培養物において明らかであ
った（図１Ｄ）。これらの培養物中では、細胞は、外形が放射状であり、そして
細胞密度は低く、個々の細胞は、容易に識別された（図１Ａを１Ｄと比較する）
。処理された培養物中では、細胞は単層として残り、一方、処理されていない培
養物中では、細胞は、複数の層を形成する。長期間の培養物中での細胞の密度に
おける明らかな変化と一致して、６０時間後のＭＴＴアッセイを使用した細胞の
生存性の分析は、ＡＧＮ１９３８３６または１，２５ＶＤ_３を用いたＭＣ３Ｔ３
−Ｅ１細胞の処理が、個々に、または組合せて、細胞の生存性を減少させること
を示した（図１Ｆ）。まとめると、１，２５ＶＤ_３またはＲＡＲ選択的アゴニ
ストでの前骨芽細胞の処理は、鉱化作用および細胞の生存性の同様の阻害を導き
、そして組み合わされた場合にさらに顕著な効果を導く。

【００５３】（１，２５ＶＤ_３およびレチノイドは、前骨芽細胞のアポトーシスを刺激す
る）１，２５ＶＤ_３およびレチノイドの両方での分化しつつある骨芽細胞の処理
は、細胞の密度における顕著な減少を導いた。これは、培地中での多数の剥離し
た細胞の出現を伴って、初期の培養時間（薬物の添加後２〜３日）で達成された
。これらの浮いている細胞の生存性を評価するために、膜不透性核染色であるヨ
ウ化プロピジウムが、培地に添加された。浮遊している細胞体は、ＰＩの存在下
で蛍光となり、このことは、それらの膜が損傷され、そしてそれらが死細胞また
は死亡しつつある細胞を示すしたことを示唆する（図２Ｂ−Ｅ）。鉱化作用しつ
つある培養物中で観察されるように、漸増濃度の１，２５ＶＤ_３またはＡＧＮ
１９３８３６のいずれかは、増大した数のＰＩポジティブである細胞を導いた（
図２Ｂ−Ｅ）。蛍光細胞数における２〜３倍の穏やかな増大が、漸増濃度のＡＧ
Ｎ１９３８３６で観察された。全トランスＲＡ、９−シスＲＡ、およびＴＴＮＰ
Ｂもまた、細胞死を刺激することが見出された（データは示されない）。同様に
、漸増濃度の１，２５ＶＤ_３は、より多数のＰＩ−によって染色された細胞体
を導き（図２Ｃ、Ｅ）、１，２５ＶＤ_３は、試験された濃度の範囲にわたって
ＲＡＲアゴニストよりもより大きな能力を示す。しかし、組合せると、ＰＩで染
色された細胞数における劇的な増大が存在した。これは、２つのリガンドでの処
理の個々の影響の和よりも大きく、このことは相乗作用を示す（図２Ｄ、Ｅ）。
従って、１，２５ＶＤ_３およびレチノイドが、分化しつつある骨芽細胞中で細
胞死を刺激することが明らかとなった。これらの細胞体の形態および強いＰＩ染
色は、アポトーシス性の細胞体中の濃縮されたクロマチンと一致した。

【００５４】リガンドがプログラムされた細胞死を通じて細胞死を生じるかどうかについて
さらに着手するために、ＴＵＮＥＬ標識がアポトーシス性の細胞を標識するため
に使用された。細胞が固定され、そしてＴＵＮＥＬアッセイを使用して標識され
、続いてヨウ化プロピジウムで染色された。これらの条件下では、全ての細胞が
、染色前の固定に起因してＰＩポジティブであるが、２つの顕著な細胞の集団が
存在するようである。１つは、弱い散剤性のＰＩ染色を有し、そして他方は、は
るかにより強いＰＩ染色を有する。これらはクロマチンの濃縮を反映する。ＰＩ
について最も強く染色されている細胞は、以前の実験において観察された細胞と
形態学において同様であり、そしてこれらは、コントロールの培養物（図２Ｆ）
と比較して、両方のリガンドで処理された培養物（図２Ｉ、Ｌ）中で非常に豊富
であることが見出された。ＴＵＮＥＬでポジティブに染色された細胞のグループ
もまた、同様であった（図２Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｍ、Ｎ）。ＰＩ染色を用いて観察
されるように、両方のリガンドでの組合せられた処理は、ＴＵＮＥＬポジティブ
細胞の数を大きく増大させた（図２Ｇを２Ｊ、Ｍに対して比較する）。ＴＵＮＥ
Ｌポジティブの細胞はまた、両方のリガンドでの処理と比較してより少ないが、
個々のリガンドでの処理の後で観察された（データは示されない）。さらに、低
い密度（＜６０％のコンフルエンス）での培養物に対するリガンドの添加は、ア
ポトーシス性の細胞が２４時間後に観察される（データは示されない）高い密度
の培養物（＞９５％のコンフルエンス）の処理と比較して、アポトーシス性の細
胞の出現を遅らせた。アポトーシスの誘導は、細胞の密度の程度に依存している
ようであった。これらの結果は、レチノイドおよび１，２５ＶＤ_３が、分化し
つつある骨芽細胞培養物中でアポトーシスを刺激することを示唆し、そしてこの
傾向はおそらく、骨の小結節形成の阻害に関係している。これらの結果の分析は
、ＶＤＲおよびＲＡＲ媒介性シグナルが、骨芽細胞の培養物中で鉱化作用を阻害
しそしてアポトーシスを刺激するように協同して作用することを示唆する。

【００５５】（ＲＡＲ選択的アンタゴニストは鉱化作用およびＯＣの発現を刺激する）ＶＤＲおよびＲＡＲシグナル伝達経路の間での協同の性質にさらに着手するた
めに、ＲＡＲ選択的アンタゴニストが、１，２５ＶＤ_３の作用を阻害するその
能力を評価するために使用された。鉱化作用しつつあるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物
のＲＡＲα選択的アンタゴニストであるＡＧＮ１９４３０１での処理（２７）は
、アリザリンレッドＳ染色における濃度依存性の増大を導いた（図３Ａ、Ｂ、Ｅ
）。１０ｎＭ程度の低い濃度のＡＧＮ１９４３０１は、処理されていないコント
ロールよりも約３倍大きい量でアリザリンレッドＳ染色を増大させた（図３Ｅ）
。１μＭでは、培養物の表面の領域の約９５％が、約１８％の染色を有したコン
トロールの培養物と比較して、アリザリンレッドＳで染色された（図３Ａ、Ｂ、
Ｅ）。これらの観察に従って、１０００ｎＭのＡＧＮ１９４３０１のＭＣ３Ｔ３
−Ｅ１培養物に対する添加は、ＯＣの発現を刺激した（図３Ｆ）。アンタゴニス
トは、コントロールの培養物と比較して、２５日目の培養物中でのＯＣｍＲＮ
Ａの定常状態のレベルを増大させ、そしてまたこれらの培養物中のオステオカル
シンｍＲＮＡの出現を加速した。野生型の培養物中では、ＯＣｍＲＮＡは、１
８日の培養後に初めて出現したが、一方、アンタゴニストで処理された培養物中
では、強力なＯＣｍＲＮＡの発現は、１２日後に明らかになった（図３Ｆ）。ア
ンタゴニストで処理された培養物中でのこのＯＣｍＲＮＡの量のこの増大は、骨
の鉱化作用に対するその影響と一致する。

【００５６】ＲＡＲαアンタゴニストを用いた結果は、ＲＡＲ選択的アゴニストを用いて観
察された結果とは非常に対照的であるという特徴がある（図１Ｂ）。さらに、１
，２５ＶＤ_３で処理された培養物に対するアンタゴニストの添加は、骨の小結
節形成の量を増大させた。１０ｎＭの１．２５ＶＤ_３での、１００ｎＭのＡＧ
Ｎ１９４３０１の添加は、コントロールの培養物中での形成の約７０％にまで骨
の形成を回復させた（図３Ａ、Ｃ−Ｅ）が、これは、アンタゴニストのみで処理
された培養物中で観察された形成よりもはるかに少なかった。従って、ＲＡＲ選
択的アンタゴニストの添加は、１，２５ＶＤ_３の鉱化作用に対する影響を部分的
に逆転させ得た。これらの結果と一致して、ＡＧＮ１９４３０１の１，２５Ｖ
Ｄ_３で処理された培養物に対する添加もまた、１，２５ＶＤ_３によって誘導さ
れる細胞死を阻害した（図４Ａ−Ｅ）。ＡＧＮ１９４３０１は単独では、ＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１培養物中でのＰＩポジティブ細胞の出現に対して容易に評価できる影
響を有さなかった（図４Ａ、Ｂ）。しかし、アンタゴニストの添加は、１，２５ＶＤ_３で処理された培養物のＰＩポジティブ細胞の数の２０％未満の量にまで
、１，２５ＶＤ_３で処理された培養物中のＰＩポジティブ細胞の数を劇的に減
少させた（図４Ｃ−Ｅ）。従って、ＲＡＲ選択的アンタゴニストは、アポトーシ
スに対して、そして鉱化作用に対しては一部、１，２５ＶＤ_３の影響を逆転さ
せることができる。

【００５７】（ドミナントネガティブなＲＡＲまたはＲＸＲの発現は１，２５ＶＤ_３によ
って媒介されるアポトーシスを阻害する）１，２５ＶＤ_３がＲＡＲ媒介性経路を通じて作動するかどうかを決定するた
めに、ＲＡＲαのドミナントネガティブなバージョン、および十分に規定された
ＶＤＲのパートナーであるＲＸＲが構築された。ドミナントネガティブなレセプ
ターを発現する細胞をモニターするために、構築物は、増強された緑色蛍光タン
パク質（ＥＧＦＰ）にＣ末端融合物を組み込んだ。この点で、リガンドの存在下
または非存在下での個々の細胞の発生運命が追跡され得た。より重要なことは、
これによって、安定なクローンを確立する必要性が排除され、そしてクローンの
異種性に伴う固有の問題点が最少にされた。ｄｎＲＡＲ−ＥＧＦＰおよびｄｎＲ
ＸＲ−ＥＧＦＰは最初に、ＣＯＳＰ７細胞中で試験され、そしてＲＡＲＥ含有
レポーター遺伝子のＲＡ刺激を阻害すること、および核に位置することが見出さ
れた（図５Ａ−Ｅ）。

【００５８】ｄｎレセプター構築物がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中にトランスフェクトされ、続
いて細胞が、１０００ｎＭのＲＡＲアゴニストおよび／または１０ｎＭの１，２
５ＶＤ_３で処理された。ＥＧＦＰのみを発現するコントロール細胞においては
、個々の処理において存在する蛍光細胞の数は減少し、最大の減少は、同時処理
された培養物中で観察された（図６Ａ−Ｄ、Ｋ）。ＥＧＦＰを発現する細胞にお
ける減少は、上記のリガンドで処理された培養物中での、細胞の生存性における
減少および細胞死の増大と一致する（図１Ｆおよび図２Ｅ）。対照的に、ｄｎＲ
ＡＲ−ＥＧＦＰを発現する細胞の数は、リガンドのみで、または組合せて処理さ
れた培養物中で増大し、処理されていないコントロールと比較して、１，２５
ＶＤ_３のみで処理された培養物中での単位面積あたりの蛍光細胞数が３倍増大し
た（図６Ｅ−Ｈ、Ｋ）。ｄｎＲＸＲ−ＥＧＦＰの発現もまた、ｄｎＲＡＲ−ＥＧ
ＦＰについて観察されたものよりも有効ではないが、１，２５ＶＤ_３誘導性細
胞死からＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を防御した。ＣＯＳでトランスフェクトされた細
胞中で見られるように、ｄｎＲＡＲ−ＥＧＦＰおよびｄｎＲＸＲ−ＥＧＦＰは、
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中の核に位置した。従って、ＲＡＲ媒介性シグナル伝達の
、ＲＡＲ選択的アンタゴニストの添加またはｄｎＲＡＲのトランスフェクション
のいずれかによる阻害が、骨芽細胞に対する１，２５ＶＤ_３の作用を阻害する
ために十分である。

【００５９】ＲＡおよびＲＡＲアンタゴニストの影響はまた、正常なヒトの骨芽細胞培養物
（ＮＨＯ）中でも実証された。細胞は、細胞核の可視化を可能にするために、そ
して細胞数の評価を可能にするために、ＤＮＡ染色によって染色された（図７Ａ
−Ｃ）。図７Ｄ−Ｆにおいては、細胞は、死細胞または死亡しつつある細胞の可
視化を可能にするために、膜不透性核酸染色を用いて染色された。全トランスＲ
Ａでの処理は、ＰＩで染色された細胞の数を増大させるようであり、このことは
、全トランスＲＡがこれらの培養物中で細胞死を刺激することを示唆する。図７
Ｇ、７Ｉにおいては、細胞は、アリザリンレッドＳで染色された。アンタゴニス
トで処理された培養物は、より強いアリザリンレッドＳ染色を示し、このことは
、アンタゴニストが正常なヒト骨芽細胞の培養物中で骨の形成を促進することを
示唆する。図７Ｊ−７Ｌにおいては、培養物は、リン酸の蓄積を試験するために
染色された。アンタゴニストで処理された培養物は、増強されたリン酸染色を示
し、このことは、アンタゴニストが正常なヒト骨芽細胞の培養物の骨の小結節形
成を促進することを示す。まとめると、このヒトでのインビトロのデータは、Ｒ
ＡＲアンタゴニストの骨の形成を刺激する有効性、およびＲＡのこれらの細胞中
でアポトーシスを刺激する有効性を実証する。

【００６０】ＲＡＲアンタゴニストであるＡＧＮ１９４３０１は、骨芽細胞中で１，２５ＶＤ_３によって誘導されるアポトーシスを減少させることが実証されており、
そしてまた、骨芽細胞の分化および鉱化作用を刺激および促進することもまた実
証されている。ＡＧＮ１９４３０１（２−フルオロ−４−［（１−（８−ブロ
モ−２，２−ジメチル−４−（４−メチルフェニル）−２−Ｈ−クロメン−６−
イル）−メタノイル）−アミノ］−安息香酸）は、そのレセプターについて高い
親和性を有する、ＲＡＲαの強力なアンタゴニストである。これは、ＲＡＲβお
よびＲＡＲγについては低い親和性を有するが、これらのレセプターのアンタゴ
ニストとしてもまた作用する。

【００６１】本発明の１つの実施形態に従うと、骨形成を刺激するＲＡＲアンタゴニストは
、ＲＡＲαに対して高度に有効であるアンタゴニスト化合物を含み、そしてまた
、ＲＡＲβおよびＲＡＲγともまた拮抗する。従って、本発明は、ＲＡＲアンタ
ゴニスト、一般的には、そのアナログ、およびＲＡＲアンタゴニスト活性を示す
任意の薬剤を含む。当業者は、例えば、Ｔｅｎｇら（１９９７）、Ｊ．Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ．，４０，２４４５−２４５１に記載されているように、科学文献にお
いて利用可能である方法によって、そのようなＲＡＲアンタゴニストのプロフィ
ールを有する化合物を同定するために候補化合物をスクリーニングすることが可
能である。従って、当業者は、本発明が、本明細書中で使用されそして詳細に記
載されているそれらのＲＡＲアンタゴニストに限定されず、ＲＡＲアンタゴニス
ト活性を有することが実証されている任意の薬剤が、本発明に良好に含まれるこ
とを理解する。さらに、当業者は、ＲＡＲアンタゴニストの混合物もまた、本発
明の組成物中に含まれることを理解する。

【００６２】本発明の１つの実施形態に従うと、骨形成を刺激するＲＡＲアンタゴニストは
、ＡＧＮ１９４３０１のような、モノ−またはジ−フルオロ置換されたメチルク
ロメンを含む。本発明のＲＡＲアンタゴニスト化合物は、従来の化学的な合成方
法によって合成され得る。例えば、ＡＧＮ１９４３０１は、Ｔｅｎｇら（前出）
に記載されているように、または米国特許第５，５５９，２４８号（これは、そ
の全体において本明細書中で参考として援用されている）に記載されているよう
に合成され得る。他の有用なＲＡＲアンタゴニストは、例えば、Ｅｙｒｏｌｌｅ
ｓら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２：３６１−３６７（１９９２）およびＡｐ
ｆｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７１２９−
７１３３（１９９２）（これらは、それらの全体において本明細書中で参考とし
て援用されている）に記載されている。

【００６３】再び、当業者は、本明細書中に詳細に記載されているアンタゴニスト以外のい
くつかの異なるタイプのＲＡＲアンタゴニストが、本発明での使用に適切である
ことを容易に理解する。他の適切なＲＡＲアンタゴニストは、例えば、第ＷＯ９
９３３８２１号、第ＷＯ９９２４４１５号、米国特許第第５，８７７，２０７号
、米国特許第５，７７６，６９９号、および日本国特許第１０１１４７５７号（
これらのそれぞれの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用
されている）において教示されている。このようなアンタゴニスト薬剤として、
以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＡＧＮ１９３１０９、ＡＧＮ１９０
１２１、ＡＧＮ１９４５７４、ＡＧＮ１９３１７４、ＡＧＮ１９３６３９、ＡＧ
Ｎ１９３６７６、ＡＧＮ１９３６４４、ＳＲＩ１１３３５、Ｒｏ４１−５２５３
、Ｒｏ４０−６０５５、ＣＤ２３６６、ＢＭＳ１８５４１１、ＢＭＳ１８９４５
３、ＣＤ−２６６５、ＣＤ２０１９、ＣＤ２７８１、ＣＤ２６６５、ＣＤ２７１
。本発明での使用に適切な他のＲＡＲアンタゴニストとして、Ｋａｎｅｋｏら、
１９９１；Ｅｙｒｏｌｌｅｓら、１９９４；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、１９９５；
ＥｃｋｈａｒａｔおよびＳｃｈｍｉｔｔ、１９９４；ならびにＴｅｎｇら、１９
９７に開示されているものが挙げられる。所望される場合には、ＲＡＲアンタゴ
ニストの混合物を使用することもまた、本発明の範囲内である。

【００６４】ＲＡＲアンタゴニストは、インビボおよびインビトロで骨の形成に直接影響を
与え得、そして特に、骨形成を促進する活性を保有するという実証を用いて、薬
学的組成物が今や開発され得、そして骨の発達の異常（非代謝性の骨の疾患およ
び代謝性の骨の疾患の両方）または骨の外傷、ならびにビタミン過剰症Ａおよび
ビタミンＤ毒性の宿主を処置するために使用され得る。本発明のＲＡＲアンゴニ
ストの、骨の発達の異常または骨の外傷についての代表的な用途として、例えば
、以下が挙げられる：骨の欠損および欠失の修復（例えば、閉鎖骨折、開放骨折
、および結合していない骨折）、骨／脊髄の奇形、骨肉腫、骨髄腫、骨の形成異
常症、および脊柱側彎症において生じるもの）；閉鎖骨折および開放骨折の軽減
における予防的な使用；形成外科手術における骨の治癒の促進；接着していない
補綴関節および歯科用インプラントへの骨の内方増殖（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）の刺
激；閉経前の女性での骨のピーク質量の増大；成長欠損の処置；歯周病および歯
周の欠損の処置、ならびに他の歯の修復プロセス；伸延（ｄｉｓｔｒａｃｔｉｏ
ｎ）骨形成の間の骨の形成の増大；ならびに他の骨格の障害（例えば、加齢関連
骨粗鬆症、閉経後の骨粗鬆症、グルココルチコイドによって誘導される骨粗鬆症
、または非活動性骨粗鬆症、および関節炎、骨軟化症、繊維性骨化症、腎性骨形
成異常（ｒｅｎａｌｂｏｎｅｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）および骨のページェット
病の処置、あるいは、骨の形成の刺激によって有利である任意の状態。

【００６５】当業者は、上記の骨の疾患を処置および緩和するために、本明細書中に記載さ
れているＲＡＲアンタゴニスト組成物を使用することが可能であり、そして胚性
幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、および骨、骨髄、または血液に
由来する骨格の前駆体細胞を含むがこれらに限定されない種々の細胞型に対する
ポジティブな生理学的な影響に関して、成功の合理的な期待を有する。ＲＡＲア
ンタゴニスト組成物の脱分化した細胞に対する使用もまた、本発明に含まれる。
脱分化した細胞は、細胞周期に再度入り、そして他の細胞型に関係し得る、有糸
分裂後の細胞である。当業者は、筋肉から採取されたような脱分化した細胞が、
例えば、骨芽細胞の能力を持続するように再分化ために、ＲＡＲアンタゴニスト
組成物で処理され得ることを理解する。任意の多能性の細胞型が、骨形成を持続
させるために本発明の組成物とともに使用され得、そしてそれで処理され得る。
さらに、任意の数の薬剤（例えば、骨の形態形成因子、抗吸収薬剤、骨形成因子
、軟骨に由来する形態形成タンパク質、成長ホルモン、および分化因子）が、骨
形成の促進を補助するために、本発明のＲＡＲアンタゴニスト組成物とともに使
用され得る。

【００６６】本発明の組成物は、先天性の、外傷によって誘導される、または外科手術によ
る骨の切除（例えば、ガンの処置のため）の修復において、そして美容外科手術
において有用であり得る。骨の欠損または異常は、脊椎動物被験体中では、特定
の構造および機能的な特性を示す本発明のＲＡＲアンタゴニスト化合物を投与す
ることによって、処置され得る。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に投
与され得る。全身的な使用のためには、本明細書中の化合物は、従来の方法に従
って、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、または経
皮的に）、または経腸での（例えば、経口または直腸から）送達のために処方さ
れる。例えば、組成物は、坐剤（例えば、直腸用の調製物、および局所的な投与
（例えば、筋肉内、皮下、関節内注射、包埋調製物、軟らかい軟膏など）のため
の、非経口用の調製物）に成形され得る。

【００６７】経口投与のためには、組成物は、液体の調製物の形態であり得るか、または軟
らかいカプセル中に充填され得るか、またはそれが液体で得られる場合には、経
口用の調製物を生じるなどであり得る。本発明の組成物が固体の分散物である場
合には、これは、カプセル中にパックされ得るか、あるいは、経口用の調製物を
生じるための、ペレット、微細な顆粒、顆粒、または錠剤に成形され得る。固体
の分散物の場合には、組成物は、球状、棒状、針状、ペレット状、およびフィル
ムのような固体の形態に、当業者によって理解されるように、必要とされるさら
なる添加物の存在下で成形され得る。

【００６８】静脈内投与は、一連の注射によって、または長期間にわたる持続的な注入によ
って行われ得る。注射による投与または別々の間隔を空けられた投与の他の経路
による投与は、１週間に１回から１日に１〜３回までの範囲の間隔で行われ得る
。あるいは、本明細書中で開示されている化合物は、周期的な様式で投与され得
る（開示された化合物の投与；続いて、投与されない；続いて開示された化合物
の投与；など）。処置は、所望される結果が達成されるまで継続する。

【００６９】ＲＡＲアンタゴニスト組成物は、本発明に従って治療有効用量で投与される。
治療濃度は、特定の状態（例えば、ビタミンＡ毒性）の軽減を達成するかまたは
その発現を遅らせるその濃度である。レチノイドによって誘導される毒性をブロ
ックするためにアンタゴニスト化合物が同時投与される場合には、アンタゴニス
ト組成物は、特定の状態の発症を防ぐために予防的な様式で使用されることが理
解される。

【００７０】有用な治療または予防濃度は、状態間で変化し、そして特定の例においては、
処置される状態の重篤度および処置に対する患者の感受性によって変化し得る。
従って、単一の濃度が一様に有用であり得るのではないが、処置される慢性的な
または急性の骨の状態の特徴に依存して、改変が必要である。このような濃度は
、当業者に公知であるように、慣用的な実験を通じて到達され得る。しかし、１
ｍｌの処方物あたり０．０１から１．０ミリグラムの間のアンタゴニストを含有
する組成物が、例えば、局所投与のための治療有効濃度を構成し得ることが理解
される。全身的に投与される場合には、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１か
ら５ｍｇの間の量が、治療結果を提供し得る。一般的には、組成物は、約０．０
０１ｍｇ／ｋｇ体重から約３００ｍｇ／ｋｇ体重の上限までの投薬範囲で投与さ
れ得る。

【００７１】一般的には、薬学的処方物は、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食
塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％のデキストロース、エタノール、微量金属
を含有するホウ酸緩衝化生理食塩水など、およびそれらの混合物）と組合せて本
発明のＲＡＲアンタゴニストを含む。処方物はさらに、１つ以上の賦形剤、防腐
剤、可溶化剤、緩衝化剤、バイアルの表面上でのタンパク質の損失を防ぐための
アルブミン、滑沢剤、充填剤、安定化剤などを含み得る。処方のための方法は当
該分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇＣｏ．，ＥａｓｔｏｎＰａ．，１９９０（これは、本明細書中で
参考として援用されている）に開示されている。

【００７２】本発明の組成物は、骨の疾患を処置するための他の薬剤と付随して使用され得
る。付随して使用される薬物の例として、例えば、以下が挙げられ得る：カルシ
ウム調製物（例えば、炭酸カルシウム）、カルシトニン調製物、性ホルモン（例
えば、エストロゲン、エストラジオール）、プロスタグランジンＡ１、ビスホス
ホン酸、イプリフラボン、フッ素化合物（例えば、フッ化ナトリウム）、ビタミ
ンＫ、骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、
インシュリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ−１，２）、副甲状腺ホルモン（Ｐ
ＴＨ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＰ）、オステオゲニン
、ならびに骨の吸収抑制因子（例えば、エストロゲン、カルシトニン、およびビ
ホスホネート）。このような薬剤の混合物もまた、本発明の組成物中で使用され
得、そしてその中に処方され得るか、あるいは、本発明の組成物と組合せて使用
され得ることが意図される。

【００７３】本発明での使用のための薬学的組成物は、滅菌の、非発熱性の液体の溶液、懸
濁液、コーティングされたカプセル、クリーム剤、ローション剤、坐剤、凍結乾
燥散剤、経皮用のパッチの形態、または当該分野で公知の他の形態であり得る。
局所的な投与は、傷害または欠損の部位での注射により得るか、あるいは、その
部位での固体のキャリアの挿入または接着により得るか、あるいは粘性の液体の
直接的な局所的な適用などにより得る。経口投与のためには、送達ビヒクルは、
好ましくは、骨または軟骨の成長のためのマトリックスを提供し得、そしてこれ
は、有害な影響を伴うことなく被験体によって吸収され得るビヒクルであり得る
。

【００７４】創傷の部位への本明細書中のアンタゴニスト化合物の送達は、徐放性組成物（
例えば、ＷＩＰＯ公開番号第ＷＯ９３／２０８５９号（これは、その全体におい
て本明細書中で参考として援用されている）に記載されているような）の使用に
よって増強され得る。このタイプのフィルムは、吸収が可能であるものおよび吸
収が不可能であるものの両方の、プロテーゼデバイスおよび外科用インプラント
についてのコーティングとして特に有用である。フィルムは、例えば、外科用の
ネジ、ロッド、ピン、プレートなどの外表面の周辺を包み得る。このタイプの移
植可能なデバイスは、整形外科手術において慣用的に使用される。このフィルム
はまた、ヒドロキシアパタイトブロック、脱鉱化作用した骨のマトリックスプラ
グ、コラーゲンマトリックスなどのような、骨を充填する材料をコーティングす
るためにも使用され得る。一般的には、本明細書中に記載されているフィルムま
たはデバイスは、骨折の部位で骨に対して適用される。適用は、一般的には、標
準的な外科手術手順を使用して、骨の内部への移植または骨の表面への接着によ
る。

【００７５】上記のコポリマーおよびキャリアに加えて、アンタゴニスト組成物を取り込ん
でいる生体分解性のフィルムおよびマトリックスは、上記に議論されているよう
な、他の活性なまたは不活性な成分、およびそれらの混合物を含み得る。特に目
的のものは、組織の増殖または浸潤を促進するそのような薬剤（例えば、増殖因
子）である。この目的についての例示的な増殖因子としては、表皮増殖因子（Ｅ
ＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ト
ランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻
害因子（ＬＩＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。骨の
成長を促進する薬剤（例えば、骨の形態形成タンパク質（米国特許第４，７６１
，４７１号）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７１０９−１３）、およびＮａＦ（Ｔ
ｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．（１９８９）２３：５７１
−８９）もまた好ましい。生体分解性のフィルムまたはマトリックスとしては、
硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ
無水物、骨または皮膚のコラーゲン、純粋なタンパク質、細胞外マトリックス成
分など、およびそれらの組合せが挙げられる。このような生体分解性の材料は、
非生体分解性の材料（例えば、ポリマーインプラント、チタンインプラント）と
組合せて、所望される機構的、美容上の、または組織もしくはマトリックスの界
面の特性を提供するために使用され得る。

【００７６】本発明の化合物の別の送達方法として、以下が挙げられる：ＡＬＺＥＴ浸透圧
ミニポンプ（ＡｌｚａＣｏｒｐ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）の使
用；Ｗａｎｇらにおいて開示されているような徐放マトリックス材料（ＰＣＴ公
開番号第ＷＯ９０／１１３６６号）の使用；Ｂａｏらにおいて開示されているよ
うな電気的に荷電したデキストランビーズ（ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９２／０３１
２５号）の使用；例えば、Ｋｓａｎｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）
２１１（３）：２８８−９４に開示されているようなコラーゲンに基づく送達シ
ステムの使用；Ｂｅｃｋら、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎ．Ｒｅｓ．（１９９１）６（
１１）：１２５７−６５に開示されているようなメチルセルロースゲルシステム
の使用；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９１）１２：６１
９−２６に開示されているようなアルギン酸に基づくシステムの使用など。骨の
中での維持された局所的な送達のための当該分野で周知の他の方法として、浸透
され得る有孔性のコーティングされた金属性のプロテーゼ、およびその中に治療
用組成物が取り込まれた固体のプラスチックのロッドが挙げられる。

【００７７】１つの実施形態においては、ＲＡＲアンタゴニスト組成物は、リポソームと呼
ばれるリン脂質のベシクル中に含まれた溶液または乳濁物として提供され得る、
少なくとも１つのＲＡＲアンタゴニストを含み得る。リポソームは、単層または
多層であり得、そしてホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコ
リン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリ
ン、デミリストイルホスファチジルコリン、およびそれらの組合せから選択され
る構成成分から形成され得る。多層のリポソームは、単層のベシクルと同様の組
成物の多層のベシクルを含むが、溶液または乳濁物中の銀成分がその中に捕捉さ
れる複数の区画を生じるように調製される。さらに、他のアジュバントおよび改
変剤が、リポソーム処方物（例えば、ポリエチレングリコール）または他の材料
中に含まれ得る。

【００７８】任意の数のリポソームの二重層の組成物が、本発明の組成物において使用され
得ることが当業者によって理解される。リポソームは、例えば、米国特許第４，
２３５，８７１号、およびＲＲＣ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａ
ｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９０、３３−
１０１頁に開示されているような種々の公知の方法によって調製され得る。

【００７９】ＲＡＲアンタゴニストを含有するリポソームは、ハプテン、酵素、抗体または
抗体フラグメント、サイトカインおよびホルモンおよび他の小さいタンパク質、
ポリペプチドまたは非タンパク質分子（これらは、リポソームに対して所望され
る酵素的特徴または表面認識特徴を付与する）のような、リポソームの外部に対
して結合した非ポリマー分子を有するような改変を有し得る。特定の器官または
細胞型に対してリポソームを優先的に標的化する表面分子として、例えば、特定
の抗原を保有する細胞に対してリポソームを標的化する抗体が挙げられる。この
ような分子をカップリングするための技術は、当業者に周知である（例えば、米
国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと（その開示は本明細書中で参考とし
て援用されている））。あるいは、または組合せて、当業者は、正または負の正
味の電荷を保有する任意の数の脂質が、リポソーム膜の表面電荷または表面電荷
密度を変化させるために使用され得ることを理解する。

【００８０】リポソームはまた、脂質ベシクルの膜の制御された分解を提供するために、脂
質二重層の成分として熱感受性またはｐＨ感受性の脂質を取り込み得る。

【００８１】静脈内送達による全身的な適用のためには、血液中で長期の循環時間を示す立
体的に安定化されたリポソーム中にＲＡＲアンタゴニストをカプセル化すること
が有利であり得る。立体的に安定化されたリポソームは、それらの表面の必須の
成分としてポリエチレングリコールを含有して産生され、そしてそのようなリポ
ソームを作製する方法は当業者に公知である。

【００８２】リポソームの大きさは、意図される標的および投与経路に基づいて選択され得
る。約１０ｎｍから３００ｎｍの間のリポソームが適切であり得る。さらに、本
発明の組成物は、種々の大きさのリポソームを含み得る。

【００８３】本発明の組成物は、リポソームによる投与のためにカプセル化され得るが、他
のタイプのカプセルの材料もまた、ＲＡＲアンタゴニストをカプセル化するため
に使用され得ることが当業者によって理解される。イオン交換樹脂、結晶性セラ
ミックス、生体適合性のガラス、ラテックスおよび分散させられた粒子から構成
されるものを含むがこれらに限定されないミクロスフェアが、本発明での使用に
適切である。同様に、ナノスフェアおよび他の脂質、ポリマー、またはタンパク
質材料もまた、使用され得る。

【００８４】本発明はまた、ＲＡＲの遺伝子機能を阻害するかまたは減少させ、従ってＲＡ
Ｒ活性を阻害するかまたは減少させるために、アンチセンスに基づくストラテジ
ーを使用する組成物を提供する。原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制がｍＲＮ
Ａと相補的なアンチセンス種との間での細胞内ハイブリダイゼーションによって
達成され得るという仮説に基づく。ＲＮＡまたはＤＮＡのセンス鎖と高い程度の
特異性で結合するアンチセンス鎖のヌクレオチドを合成することが可能である。
ハイブリッドのＲＮＡ２本鎖の形成は、次いで、標的のｍＲＮＡのプロセシング
／輸送／翻訳および／または安定性を妨害し得る。

【００８５】ハイブリダイゼーションは、アンチセンス作用が生じることを必要とする。ア
ンチセンス作用は、ＡＳオリゴヌクレオチド、ＡＳＲＮＡ、ＤＮＡの注入、お
よびＡＳＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを含む種々のアプローチ
を使用して記載されている。治療用のアンチセンスヌクレオチドは、オリゴヌク
レオチドまたは発現されるヌクレオチドとして作製され得る。オリゴヌクレオチ
ドは、通常は１５から２０の核酸塩基の長さであるＤＮＡの短い一本鎖である。
発現されるヌクレオチドは、アデノウイルス、レトロウイルス、またはプラスミ
ドベクターのような発現ベクターによって作製される。ベクターは、培養物中の
細胞に対して、または次いでその細胞がアンチセンスヌクレオチドを作製する患
者に対して投与される。発現ベクターは、数ダースの塩基から数千の塩基までの
長さで変化し得るアンチセンスＲＮＡを生じるように設計され得る。

【００８６】本発明においては、ＲＡＲを発現する哺乳動物細胞はさらに、ＲＡＲ遺伝子の
転写を阻害するために、アンチセンスＲＡＲＤＮＡ配列でトランスフェクトさ
れ得る。あるいは、アンチセンスＲＡＲ配列は、組成物として投与され得る。適
切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されたＲＡＲ配
列の一部に対して指向される。

【００８７】まとめると、ＲＡＲアンタゴニストは、骨の発達の欠損および骨の毒性の処置
のための、重要な臨床的な治療的用途を有する。ＲＮＲアンタゴニストは、イン
ビトロ、インビボおよびエキソビボの両方でそのような処置を提供して、外傷、
骨の発達および維持にネガティブな影響を与える遺伝的な疾患または変形性疾患
の結果としての種々の状態を処置するために、使用され得る。

【００８８】インビトロおよびエキソビボでの組織の操作の用途については、当業者は、所
望される細胞培養物に対して選択されたＲＡＲアンタゴニストまたはその混合物
を適用し得る。代表的な細胞培養物は、実施例を参照して本明細書中に記載され
ているが、一般的には、胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、お
よび骨、骨髄または血液に由来する骨格の前駆体細胞が挙げられ得る。このよう
な細胞はまた、脱分化した細胞を含み得る、細胞培養物は、細胞が所望される組
織部位で患者に対して種々の従来の方法によって投与された後で、所望される生
理学的な結果が達成されるまで維持され得る。あるいは、このような培養された
処理された細胞は、インプラント中に、またはインプラントもしくはプロテーゼ
デバイス中に適用され得るか、またはその中で増殖させられ得、そして、患者の
移植の前に行われる骨の鉱化作用および沈着を可能にするために、インビトロで
さらに培養され得る。

【００８９】本発明は、第２の実施形態においては、異所性の骨の形成が見られるような、
過剰な骨の形成が存在する障害を処置するために骨形成を阻害するために、そし
て、大理石骨病または進行性骨化性線維形成異常症（ＦＯＰ）においてもまた、
ＲＡＲアゴニストの薬学的組成物を提供する。ＲＡＲアゴニストは、ＲＡＲと会
合した場合に細胞性の応答を開始するアゴニスト化合物を含む。

【００９０】本発明のＲＡＲアゴニスト組成物の投与の態様にはかかわらず、ＲＡＲアゴニ
ストは、好ましくは、ＲＡＲについてのアゴニストとして選択的な活性を有する
、天然に存在しているかまたは合成のレチノイドのいずれかであり得る。ＲＡＲ
アゴニストとしての活性を有する天然に存在するレチノイドの例は、全トランス
レチノイン酸（全トランスＲＡ）および９−シスレチノイン酸（９−シスＲＡ）
（これらは、立体異性体である）であり、全トランスＲＡは、代謝の間に天然に
おいては９−シスＲＡに転換される（Ｊ．Ｇ．Ａｌｌｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃ．
Ｔｈｅｒ．，４０：１−２７、１９８９）。

【００９１】合成によって調製されたレチノイドは、当該分野で周知である。例えば、米国
特許第５，２３４，９２６号（これは、その全体において本明細書中で参考とし
て援用されている）は、ＲＡＲアゴニストとしての選択的な活性を有する、ヘテ
ロ芳香族基およびヘテロ二環式基を保有する、２置換されたアセチレンを合成す
る方法を開示する。米国特許第４，３２６，０５５号（これは、その全体におい
て本明細書中で参考として援用されている）は、レチノイド様の活性を有する、
５，６，７，８−テトラヒドロナフチルおよびインダニルスチルベン誘導体を合
成するための方法を開示する。レチノイド化合物は、それらがＲＡＲ活性を有す
るかどうかを、例えば、Ｍ．Ｐｆａｈｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，１：２５６−２７０，１９９０によって開示されているような周知
のインビトロでのトランス活性化アッセイ技術を利用して決定することによって
、容易に選択され得る。

【００９２】本発明の実施における使用に適切な合成のＲＡＲアゴニストの例は、エチル６
−［２−（４，４−ジメチルチオクロマン−６−イル）エチニル］ニコチン酸塩
および６−［２−（４，４−ジメチルクロマン−６−イル）エチニル］ニコチン
酸（これらの合成は、米国特許第５，２３４，９２６号に開示されている）、な
らびにｐ−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−
テトラメチル−２−ナフチル）プロペニル］−安息香酸（その合成は、米国特許
第４，３２６，０５５号に開示されている）である。対照的に、ＲＸＲ選択的ア
ゴニストの例は、２−［（Ｅ）−２−（５，６，７，８−テトラヒドロー３，５
，５，８，８−ペンタメチルナフタレン−２−イル）プロペン−１−イル］チオ
フェン−４−カルボン酸（化合物７０１）（その合成は、米国特許第５，３２４
，８４０号に開示されている）である。

【００９３】当業者は、当該分野で公知の方法によってＲＡＲアゴニストプロフィールを有
する化合物を同定するために候補化合物をスクリーニングし得る。本発明の組成
物中での使用のためのさらなるアゴニストとして、任意のレチノイド化合物（一
般的には、ＴＴＭＰＢ、ＡＧＮ１９３８３６、およびＬＧ１０６９）が挙げら
れ得るが、これらに限定されない。これらの構造および調製は、本明細書中でそ
れらの全体において参考として援用されている、Ｂｏｅｈｍら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃ
ｈｅｍ．３７：２９３０−２９４１（１９９４）に記載されている。他の有用な
ＲＡＲアゴニストは、例えば、Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１
９４４−１９４６（１９９２）（これは、その全体において本明細書中で参考と
して援用されている）に記載されている。

【００９４】本発明での使用に適切な他のＲＡＲアゴニストは、上記に記載されている方法
および当業者にとって慣用的である他の方法によって調製され得、そして種々の
細胞型（例えば、胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、および骨
、骨髄、または血液に由来する骨格の前駆体細胞）中での骨形成の阻害について
生理学的な成功の合理的な期待を有すると当業者によって予想される。このよう
な細胞はまた、例えば、筋肉のような、種々の組織から得られた脱分化した細胞
を含み得る。

【００９５】本発明のＲＡＲアンタゴニスト組成物を用いると、ＲＡＲアゴニスト組成物は
、インビトロ、インビボ、およびエキソビボで組織を操作することにおいて使用
され得、そしてＲＡＲアンタゴニスト組成物について上記の本文中に先に記載さ
れているように、種々の生理学的および臨床的な適用において処方され得そして
使用され得る。

【００９６】本発明のＲＡＲアンタゴニストおよびＲＡＲアゴニスト組成物は、処置の間の
種々の時点で、骨形成の刺激および骨形成の阻害を必要としている種々の骨学上
の状態を処置するために組み合わせて使用され得ることもまた、含まれる。

【００９７】本発明の骨形成を促進するおよび骨形成を阻害する薬学的組成物、ならびにそ
れに基づく調製物、ならびにそれらを使用する方法は、良好な生体利用可能性お
よび安定性、ならびに低い毒性を有し、そして従って、哺乳動物（例えば、いく
つか挙げると、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、および
ウサギなど）において安全にそして効果的に使用され得る。

【００９８】（実施例）実施例は、説明の目的のために記載され、そして本発明の範囲を限定するよう
には意図されない。

【００９９】本発明の開示および実施例に言及されているが、明白には記載されていない、
化学、タンパク質およびペプチドの生化学、細胞生物学、組織学、細胞生物学、
分子生物学、ならびに免疫学の方法は、科学文献に報告されており、そして当業
者に周知である。

【０１００】（実施例１）（細胞株および化合物）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充した最少必須イーグル
改変培地（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で維持し、そして以前に
記載されているように継代培養した（２０）。鉱化作用のために、ＭＣ３Ｔ３−
Ｅ１細胞の培養物に、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）およびβ−グリセロー
ルホスフェート（β−ＧＰ、１０ｍＭ）を補充し、そして培地を３日毎に交換し
た。リガンドに加えて、これらの化合物を、一旦培養物がコンフルエントに達し
たら培地に添加した。ＭＣ３Ｔ３−６３７ＯＣの安定なトランスフェクタントを
同じ様式で培養し、そして活性なＧ４１８（７００μｇ／ｍｌ）を補充した。Ｃ
ＯＳＰ７細胞を、１０％のＦＢＳおよび抗生物質を含有するダルベッコ改変イー
グル培地中で培養した。全トランスＲＡを、Ｓｉｇｍａから入手した。４−［Ｅ
−２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−
ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）、１，２５ＶＤ_３、および９−シスＲＡを、ＢｉｏＭｏｌから購入した。

【０１０１】（実施例２）（鉱化作用の組織学的分析）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１２ウェルプレート中に２×１０^４個の細胞／ウェ
ルで播種し、そして培地を、４週間の期間の間３日間の間隔で交換した。培養物
中でのマトリックスの鉱化作用を、アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ）での組織
学的染色によって測定した。細胞を、４０％のホルムアルデヒドおよびメタノー
ルの等しい部分で１０分間固定し、５０％のエタノール中で簡単にリンスし、続
いて水中でリンスした。次いで、サンプルを、アリザリンレッドＳ（２％ｗ／ｖ
、ｐＨ４．２）で２分間染色し、続いて、３０秒間アセトン中で洗浄し、そして
風乾させた。ＳｏｎｙＤＸＣ−９５０ビデオカメラに接続したＺｅｉｓｓＳ
Ｖ１１解剖顕微鏡を、デジタル画像を捕捉するために使用した。それぞれの培養
物についての鉱化作用の程度を、ＮｏｒｔｈｅｒｎＥｃｌｉｐｓｅ画像分析ソ
フトウェア（ＥｍｐｉｘＩｍａｇｉｎｇＩｎｃ．）を使用してアリザリンレ
ッドＳによって染色された物質によって占有された表面積の割合を計算すること
によって決定した。全ての画像を、低い倍率でウェルの中心から捕捉し、その面
積は、ウェルの全表面積の約６５％を示す。

【０１０２】（実施例３）（細胞死および生存性の分析）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の培養を、２４ウェルプレート中でコンフルエンス未満（１
〜２×１０^４個の細胞／ウェル）で開始し、そしてリガンド、β−ＧＰ、および
アスコルビン酸の添加の前にコンフルエントに到達させた。リガンドを添加しｔ
て３日後、ＰＢＳ中に溶解させたヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、２μｇ／ｍｌ
の最終濃度になるように培養培地に添加した。細胞を、５分間、色素の存在下で
インキュベートし、そして画像を、ＸＦ３５フィルターセット（ＯｍｅｇａＯ
ｐｔｉｃａｌ）を用いて低い倍率（５０×）でエピ蛍光を使用して得た。顕微鏡
の視野（３ｍｍ^２）あたりの蛍光ポジティブな細胞の数を、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｅｃｌｉｐｓｅ画像分析ソフトウェアを使用して計数した。

【０１０３】ＴＵＮＥＬアッセイを、わずかに改変して、製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）に従ってｄＵＴＰフルオレセイン結合を使用して、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物
について行った。細胞を、１０分間、ＰＢＳ中で４％のパラホルムアルデヒド中
に固定し、そしてＴｄＴインキュベーションを、シグナルを増進するために１．
５時間に延長した。マウントする前に、細胞調製物を１５分間、１μｇ／ｍｌで
ＰＩで染色した。ＴＵＮＥＬポジティブである細胞を、ＸＦ２２フィルターセッ
ト（ＯｍｅｇａＯｐｔｉｃａｌ）を使用してエピ蛍光を用いて可視化した。

【０１０４】細胞の生存性を、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中で、３−［４，５−ジメチルチアゾ
ール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）ア
ッセイを使用して、９６ウェルプレート中でＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｐｒｏｄｕｃｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに記載さ
れているように測定した。簡潔には、細胞をコンフルエンスにまで培養し、その
時点でリガンドの種々の濃度および組合せを、培養物に対して添加し、続いて２
４時間から６０時間の間インキュベーションした。０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度
になるようにＭＴＴ基質をそれぞれのウェルに添加し、そしてインキュベーショ
ンをさらに４時間の間延長した。この時点で、細胞を、０．０１ＭのＨＣｌ中の
１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で一晩可溶化させ、そして吸光度
を、６５０ｎｍの参照波長を使用して５９５ｎｍで測定した。

【０１０５】（実施例４）（ドミナントネガティブなＲＡＲ−およびＲＸＲ−ＥＧＦＰ融合遺伝子の構築
）ＲＡＲαおよびＲＸＲαのドミナントネガティブな誘導体を、それぞれ、ＲＡ
ＲαおよびＲＸＲα中のアミノ酸４０３位および４４９位でＣ末端レセプターの
短縮を作製するために設計されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅を使用して構築
した（２１，２２）。ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を、クローニング
を容易にし、そしてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヘのインフレームで
の融合を可能にするために、プライマー中に組み込んだ。レセプターの短縮のた
めに使用した内部プライマーは、ＲＡＲαについては、５’−ＡＧＡＴＣＴ
ＧＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧ−３’、そしてＲＸＲα
については、５’−ＣＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧ−３’であった。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１およびＣＯＳ細胞株中での発現
のために、レセプター−ＥＧＦＰ融合構築物を、哺乳動物発現プラスミドｐＳＧ
５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化した。ＥＧＦＰ−Ｎ１を最初にｐＳ
Ｇ５ベクター中にサブクローン化し、続いて対応している短縮化レセプターにサ
ブクローニングして、ｐＳＧ５−ｄｎＲＡＲα ＥＧＦＰおよびｐＳＧ５−ｄｎ
ＲＸＲα ＥＧＦＰを生じさせた。

【０１０６】（実施例５）（一時的なトランスフェクタントおよびルシフェラーゼアッセイ）ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１およびＣＯＳ細胞株のトランスフェクションを、製造業者の
説明書に従ってＦｕＧｅｎｅ６（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）を使用して行った。細胞を、６ウェルまたは１２ウェルプレー
ト中のいずれかに播種し、そしてトランスフェクションの前に一晩インキュベー
トした。ＤＮＡ−脂質複合体を、２工程の様式で作製した。最初に、３μｌのＦ
ｕＧｅｎｅ６を、９７μｌの血清を含まない培地に対して添加し、そして室温で
５分間インキュベートした。インキュベーション後、この混合物を２μｇのＤＮ
Ａに対して添加し、そして１５分間室温でインキュベートした。この最終的な混
合物を、それぞれ、１２または１６ウェルプレートのうちの４ウェルまたは２ウ
ェルをトランスフェクトするために使用した。

【０１０７】一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中での、（ＲＡＲＥ）_３チミジン
キナーゼプロモーター−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用したルシフェラ
ーゼ活性の分析を、以前に記載されているように行い（２３）、そして活性を、
内部α−ガラクトシダーゼを発現するコントロールプラスミドのものに対して較
正した。

【０１０８】（実施例６）（ノーザンブロッティング）全ＲＮＡを、ＴｒｉＰｕｒｅＩｓｏｌａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃ
ｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて、ＭＣ３Ｔ３
−Ｅ１培養物から、培養の開始後の種々の時点で鉱化作用条件下で単離した。Ｒ
ＮＡサンプルを、１％のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上の１５μｇのアリ
コートの電気泳動によって分離した。次いで、ＲＮＡを、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎナイ
ロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に
転写し、そしてＵＶ照射によって架橋させた。ブロットを、Ｕｌｔｒａｈｙｂ（
Ａｍｂｉｏｎ）中で４５℃で少なくとも１時間の間予備ハイブリダイズさせた。
ＯＣ（Ｊ．Ｅ．Ａｕｂｉｎ、トロント大学によって提供された）に対する放射標
識したラットのｃＤＮＡプローブを、ランダムプライミングによって合成した。
ハイブリダイゼーションを、４２℃でＵｌｔｒａｈｙｂ中で一晩行った。ハイブ
リダイゼーション後、ブロットを２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含有する緩衝
液で５分間を２回（それぞれ４２℃で）洗浄し、続いて、０．１×ＳＳＣ、０．
１％のＳＤＳで１５分間を２回（それぞれ４２℃で）洗浄し、そしてＢｉｏＭａ
ｘＸ線フィルムに対して−８０℃で２４時間曝露した。

【０１０９】（実施例７）（正常なヒト骨芽細胞培養物−ＲＡおよびＲＡＲの影響）正常なヒトの骨芽細胞（ＮＨＯ）は、１日齢のヒトのドナーの長骨から誘導さ
れた。細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＣｏｍｐａｎ
ｙ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓから得た培地および血清を用いてそ
れらのプロトコールに従って培養した。リガンドを、細胞が一旦コンフルエント
に達したら、細胞培養物に対して添加した。細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４
２、ＤＮＡ染色を用いて、細胞の核の可視化を可能にし、そして細胞数の評価を
可能にするために染色した（細胞の核は白色で現れる）（図７Ａ−Ｃ）。図７Ｄ
−Ｆにおいては、細胞を、死細胞または死亡しつつある細胞の可視化を可能にす
るために、ヨウ化プロピジウム（膜不透性核酸染色）を用いて染色した。全トラ
ンスＲＡでの処理は、ＰＩ染色された細胞の数を増大させるようであり、このこ
とは、全トランスＲＡがこれらの培養物中で細胞死を刺激することを示唆してい
る（死亡細胞または死亡しつつある細胞は白色で現れる）。図７Ｇ、７Ｉにおい
ては、細胞を、アリザリンレッドＳで染色した。アンタゴニストで処理した培養
物は、より多いアリザリンレッドＳでの染色を示し、このことは、アンタゴニス
トが正常なヒトの骨芽細胞の培養物中で骨の形成を促進することを示唆する（ア
リザリンレッドＳ物質は、これらの図中では暗く染色された物質として現れる）
。図７Ｊ−７Ｌにおいては、培養物を、ＶｏｎＫｏｓｓａで染色した（リン酸
の沈着を試験するために使用される標準的な組織学的染色であり、そしてこれら
の図中では黒で表れる）。アンタゴニストで処理した培養物は、増強されたＶｏ
ｎＫｏｓｓａ染色を示し、このことは、アンタゴニストが正常なヒトの骨芽細
胞の培養物の骨の小結節形成を促進することを示す。

【０１１０】種々の実施形態が本明細書中で詳細に記載されているが、本発明の範囲に影響
を与えることなく、これらの実施形態に対してバリエーションが行われ得ること
が理解される。

【０１１１】

【表】

【図面の簡単な説明】

本発明は、以下の図面を参照して上記の説明によってさらに理解される。

【図１】図１ＡからＦは、１，２５ＶＤ_３またはＲＡＲ選択的アゴニストでの、ＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１培養物中での鉱化作用の阻害を説明する。図１Ａ−Ｄは、培養物を
種々の濃度の１，２５ＶＤ_３またはＡＧＮ１９３８３６で２８日間処理し、固
定し、そしてアリザリンレッドＳで染色した顕微鏡写真である：図１Ａは、処理
していない培養物；図１Ｂは、１０００ｎＭのＡＧＮ１９３８３６；図１Ｃは、
１０ｎＭの１，２５ＶＤ_３；図１Ｄは、１０００ｎＭのＡＧＮ１９３８３６お
よび１０ｎＭの１，２５ＶＤ_３である。図１Ｅは、２８日後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１培養物中の、アリザリンレッドＳ（ＡｌｉｚａｒｒｉｎＲｅｄＳ）で染色
されたマトリックスの量の定量を説明するグラフを示す。ＡｌｉｚａｒｉｎＲ
ｅｄＳによって占有された面積は、ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄＳ染色された
全ての面積のパーセントとして示される。漸増濃度のいずれかのアゴニストは、
石灰化したマトリックスの面積における濃度依存性の減少を導く。アスタリスク
は、ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄＳによって染色された物質によって占有される
その面積が、全ての面積の＜０．１％であることを示す。図１Ｆは、１，２５
ＶＤ_３およびＲＡＲ選択的アゴニストが細胞の生存性を減少させることを説明す
るグラフを示す。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物の、種々の濃度のいずれかの薬剤の単
独で、またはそれらの組合せでの６０時間の処理は、ＭＴＴアッセイを用いた場
合に、５９５ｎｍでの吸光度の減少によって測定されるように、細胞の生存性に
おける減少を導く。目盛の棒は、０．５ｍｍを示す。

【図２】図２ＡからＮは、１，２５ＶＤ_３またはＲＡＲ選択的アゴニストで処理した
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物におけるアポトーシスの刺激を説明する。図２Ａ−Ｄは
、顕微鏡写真である。ここでは、ＭＴ３Ｔ３−Ｅ１培養物を、１０００ｎＭのＡ
ＧＮ１９３８３６で（図２Ｂ）、１０ｎＭの１，２５ＶＤ_３で（図２Ｃ）また
は図２Ｄは両方で、７２時間処理し、そしてＰＩで染色した。図２Ｅは、ＰＩで
染色された細胞の数（３ｍｍ^２の単位面積あたり）が、１，２５ＶＤ_３または
ＡＧＮ１９３８３６の場合に増大されること、そして両方の化合物の存在下でさ
らに増大されることを示すグラフである。図２Ｆ−Ｎは、ＴＵＮＥＬで処理され
た培養物中でのアポトーシスの分析を示す顕微鏡写真である。図２Ｆ、２Ｇ、２
Ｈは、処理していない培養物であり；図２Ｉ−Ｎは、１０００ｎＭのＡＧＮ１９
３８３６および１０ｎＭの１，２５ＶＤ_３を補充した培養物である。培養物を
、ＰＩ（Ｆ、Ｉ、Ｌ）またはＴＵＮＥＬ（Ｇ、Ｊ、Ｍ）で染色し、複合画像を作
製した（Ｈ、Ｋ、Ｎ）。目盛の棒は、Ａ−Ｄについては０．３ｍｍ、Ｆ−Ｋにつ
いては０．０８ｍｍ、そしてＬ−Ｎについては０．６５ｍｍを示す。

【図３】図３ＡからＦは、ＲＡＲα選択的アンタゴニストの添加が鉱化作用を刺激し、
そして１，２５ＶＤ_３の効果を逆転させることを説明する。図３Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄの培養物は、それぞれ、リガンドなし、１０００ｎＭのＡＧＮ１９４３０１、
１０ｎＭの１，２５ＶＤ_３、または両方を用いて処理された。図３Ｅは、２８
日目のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物の鉱化作用の定量を示すグラフである。鉱化作用
の程度は、アリザリンレッドＳで染色された物質によって占有された全体の面積
のパーセントとして表される。目盛の棒は、０．５ｍｍを示す。図３Ｆは、ノー
ザンブロットを示す。ここでは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１培養物が鉱化作用の条件下で
維持され、そしてＯＣｍＲＮＡの量は、処理され、そして１０００ｎＭのＡＧ
Ｎ１９４３０１で処理された培養物のノーザンブロッティング（上段のパネル）
を使用して培養開始後の種々の時点で測定された。下段のパネルは、２８Ｓｒ
ＲＮＡの量を示すエチジウムブロマイド染色したゲルである。

【図４】図４ＡからＥは、ＲＡＲ選択的アンタゴニストが、１，２５ＶＤ_３で処理さ
れた培養物中で細胞死を減少させることを示す。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、リガ
ンドなしで（図４Ａ）、１０００ｎＭのＡＧＮ１９４３０１を用いて（図４Ｂ）
、１０ｎＭの１．２５ＶＤ_３を用いて（図４Ｃ）、または両方を用いて（図４
Ｄ）３６時間処理された。図４Ｅは、示されたリガンドで処理された培養物中の
単位面積あたり計算された、ＰＩで染色された細胞の数を示すグラフである。目
盛の棒は、０．３６ｍｍを示す。

【図５】図５Ａから５は、ドミナントネガティブなＲＡＲ−ＥＧＦＰおよびＲＸＲ−Ｅ
ＧＦＰ融合タンパク質が核に位置し、そしてＲＡ媒介性シグナル伝達を阻害する
ことを示す。図５Ａは、示されたドミナントネガティブ構築物でトランスフェク
トされたＣＯＳ細胞のルシフェラーゼ活性を測定するグラフであり、そしてＲＡ
のシグナル伝達に対するそれらの影響は、ＲＡの存在下または非存在化でのＲＡ
ＲＥを含有するレポーターでの同時トランスフェクションによって測定された。
図５Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、融合タンパク質の細胞内位置を決定するために、ＣＯＳ
細胞が、ｄｎＲＡＲ−ＥＧＦＰ（図５Ｂ、Ｃ）またはｄｎＲＸＲ−ＥＧＦＰ（図
５Ｄ、Ｅ）のいずれかでトランスフェクトされた画像である。図５Ｂ、Ｄは、ト
ランスフェクトされた細胞の位相差画像であり、５Ｃ、Ｅは、ＥＧＦＰの核局在
化を示すエピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像に対応する。目盛の
棒は、０．１ｍｍを示す。

【図６】図６ＡからＫは、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞中でのｄｎＲＡＲまたはｄｎＲＸＲの
発現が１，２５ＶＤ_３媒介性細胞死を阻害することを示す。細胞は、ｐＳＧ５
−ＥＧＦＰ（図６Ａ−Ｄ）で、ｐＳＧ−ｄｎＲＡＲα−ＥＧＦＰ（図６Ｅ−Ｈ）
で、またはｄｎＲＸＲα−ＥＧＦＰ（図６Ｉ、Ｊ）でトランスフェクトされ、そ
してリガンドなしで（図６Ａ、Ｃ、Ｅ，Ｇ、Ｉ）または１０ｎＭの１．２５Ｖ
Ｄ_３および１０００ｎＭのＡＧＮ１９３８３６で（図６Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）、
３日間（図６Ａ−Ｄ、Ｇ−Ｊ）または４日間（図６Ｅ、Ｆ）処理された。図６Ｋ
は、それぞれの処理において計数された、ＥＧＦＰ発現細胞の数を示す。図６Ａ
−Ｆ、ＩおよびＪにおいては、培養物はＰＩで染色された。目盛の棒は、図６Ａ
−Ｂについては０．４ｍｍを示し、そして図６Ｃ−Ｊについては０．１ｍｍを示
す。

【図７】図７ＡからＬは、正常なヒトの骨芽細胞中での細胞死および骨の鉱化作用に対
する、全トランスＲＡおよびＡＧＮ１９４３０１の影響を示す。図７Ａ、７Ｄ、
および７Ｇは、処理されていないコントロールの培養物を示す。図７Ｂ、７Ｅ、
および７Ｈは、１０００ｎＭのＡＧＮ１９４３０１で処理された培養物である。
図７Ｃ、７Ｆ、および７Ｉは、１０００ｎＭの全トランスＲＡに対して曝露され
た培養物である。細胞は、１０日間培養され、そしてＨｏｅｃｈｓｔ３３３４
２（Ａ−Ｃ）またはＰＩ（Ｄ−Ｆ）のいずれかで染色された。１５日目の培養物
が、アリザリンレッド（Ｇ−Ｉ）で染色された。全トランスＲＡでの処理は、コ
ントロールの培養物と比較して、増大した細胞死、減少した細胞数、および減少
したアリザリンレッド染色を導く。図７Ｊおよび７Ｌの正常なヒトの骨芽細胞は
、ＶｏｎＫｏｓｓａの方法を使用して、リン酸カルシウムについてのリガンド
処理の１９日後に染色された（黒色の染色された領域）。図７Ｊは、処理されて
いない培養物である。図７Ｋ、７Ｌは、１０００ｎＭのＡＧＮ１９４３０１で処
理された。正常なヒトの骨芽細胞培養物のＡＧＮ１９４３０１での処理は、コン
トロールの培養物と比較して、鉱物の沈着を刺激する。倍率について、棒は、７
Ａ−Ｆにおいては０．４ｍｍに等しく、Ｇ−Ｋにおいては０．８ｍｍに等しく、
そして７Ｌにおいては０．２ｍｍに等しい。図面において、本発明の好ましい実施形態が例示によって説明されている。説
明および図面が例示の目的のためであり、そして理解することの補助としてであ
り、そして本発明を限定することを規定するとしては意図されないことが、明白
に理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 9/127 Ａ６１Ｋ 9/127 ４Ｃ２０６ 9/20 9/20 9/48 9/48 9/70 ４０１ 9/70 ４０１ 31/07 31/07 31/122 31/122 31/203 31/203 31/352 31/352 31/5575 31/5575 31/565 31/565 31/663 31/663 31/7088 31/7088 33/10 33/10 33/16 33/16 35/12 35/12 38/00 48/00 38/22 Ａ６１Ｌ 27/00 Ｆ 38/23 Ｇ 38/27 31/00 Ｚ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/02 Ａ６１Ｌ 27/00 19/02 19/08 31/00 19/10 Ａ６１Ｐ 1/02 35/00 19/02 43/00 １０５ 19/08 １１１ 19/10 Ａ６１Ｋ 37/24 35/00 37/36 43/00 １０５ 37/30 １１１ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者サムペイオ，アーサーブイ．カナダ国エヌ６エイチ５アール５オンタリオ，ロンドン，ブラックスミスストリート 886 (72)発明者ウエストン，アンドレアディー．カナダ国エヌ６ジー５イー５オンタリオ，ロンドン，プラッツレーン 706 Ｆターム(参考） 4C076 AA01 AA06 AA11 AA17 AA19 AA22 AA36 AA72 BB01 BB13 BB15 BB16 BB21 BB22 BB25 BB29 BB31 BB32 CC09 FF04 FF09 FF15 FF36 FF39 4C081 AB03 AB04 AB06 AC05 AC16 BA13 BA16 BB06 CD26 CD27 CD28 CD29 CD34 CE02 CG01 DA01 DB07 DC14 EA06 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 AA19 BA35 BA44 CA53 CA56 DB31 DB32 DB53 DB54 DB58 DB60 MA02 MA16 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA63 MA65 MA66 MA67 NA14 ZA962 ZA972 ZB212 ZB262 ZC412 ZC422 4C086 AA01 AA02 BA08 DA01 DA09 EA16 HA02 HA04 HA16 HA24 MA01 MA02 MA04 MA08 MA16 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA96 ZA97 ZB21 ZC41 ZC42 4C087 AA01 AA02 BB64 CA04 DA32 MA02 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA31 MA32 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA97 ZB21 ZB26 ZC41 ZC42 4C206 AA01 AA02 CA10 CB28 DA12 KA01 MA01 MA04 MA13 MA20 MA21 MA28 MA36 MA42 MA43 MA44 MA48 MA52 MA55 MA56 MA57 MA61 MA63 MA72 MA77 MA79 MA80 MA86 NA14 ZA96 ZA97 ZB21 ZB26 ZC41 ZC42

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】骨形成を刺激するための薬学的組成物であって、該薬学的組
成物は、以下：治療的に有効な量のＲＡＲアンタゴニスト；および薬学的に受容可能なキャリア、を含有する、薬学的組成物。
【請求項２】請求項１に記載の組成物であって、前記ＲＡＲアンタゴニス
トが、１μＭ未満のＫｄで１以上のＲＡＲサブタイプに結合する任意の化学物質
から選択される、組成物。
【請求項３】請求項２に記載の組成物であって、前記ＲＡＲアンタゴニス
トが、モノフルオロ置換メチルクロメンおよびジフルオロ置換メチルクロメンか
らなる群より選択される、組成物。
【請求項４】請求項３に記載の組成物であって、前記ＲＡＲアンタゴニス
トが、ＡＧＮ１９４３０１である、組成物。
【請求項５】請求項２に記載の組成物であって、前記ＲＡＲアンタゴニス
トが、ＡＧＮ１９４３０１、ＡＧＮ１９３０９、ＡＧＮ１９０１２１、ＡＧＮ１
９４５７４、ＡＧＮ１９３１７４、ＡＧＮ１９３６３９、ＡＧＮ１９３６７６、
ＡＧＮ１９３６４４、ＳＲＩ１１３３５、ＲＯ４１−５２５３、ＲＯ４０−６０
５５、ＣＤ２３６６、ＢＭＳ１８５４１１、ＢＭＳ１８９４５３、ＣＤ−２６６
５、ＣＤ２０１９、ＣＤ２７８１、ＣＤ２６６５およびＣＤ２７１、ならびにこ
れらの混合物からなる群より選択される、組成物。
【請求項６】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、上皮増殖因
子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因子、
副甲状腺ホルモン、白血病阻害因子、インスリン様増殖因子、骨形態形成タンパ
ク質、オステオゲニン、フッ化ナトリウム、エストロゲン、カルシトニン、二ホ
スホン酸塩、炭酸カルシウム、プロスタグランジン、ビタミンＫおよびこれらの
混合物からなる群より選択される薬剤をさらに含有する、組成物。
【請求項７】請求項１に記載の組成物であって、該組成物は、胚性幹細胞
、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、および骨、骨髄細胞または血液由来の
骨格前駆細胞からなる群より選択される細胞の骨形成を刺激する、組成物。
【請求項８】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、骨芽細胞の
分化を促進して、骨芽細胞における鉱化作用の増加を導く、組成物。
【請求項９】請求項８に記載の組成物であって、該組成物が、骨芽細胞に
おけるオステオカルシンおよび骨のシアロタンパク質の遺伝子の発現を増大させ
る、組成物。
【請求項１０】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、脱分化し
た細胞における骨形成を刺激する、組成物。
【請求項１１】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、局所投与
される、組成物。
【請求項１２】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が全身投与さ
れる、組成物。
【請求項１３】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、賦形剤、
防腐剤、可溶化剤、緩衝化剤、アルブミン、滑沢剤、充填剤、安定化剤およびこ
れらの混合物をさらに含有する、組成物。
【請求項１４】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、液体溶液
、液体エマルジョン、液体懸濁物、コーティングされたカプセル剤、丸剤、錠剤
、坐剤、凍結乾燥粉剤、経皮パッチ、ローションおよびクリームからなる群より
選択される形態で処方される、組成物。
【請求項１５】請求項１４に記載の組成物であって、前記処方物が、リポ
ソーム、マイクロスフェアおよびナノスフェアからなる群より選択される小胞内
にカプセル化された液体溶液、エマルジョンまたは懸濁液として提供される、組
成物。
【請求項１６】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、生体分解
性フィルム、生体分解性コーティングおよび生体分解性マトリックスからなる群
より選択される徐放性形態で処方される、組成物。
【請求項１７】請求項１６に記載の組成物であって、前記フィルム、コー
ティングまたはマトリックスが、プロテーゼデバイスおよび外科用インプラント
に適用される、組成物。
【請求項１８】請求項１７に記載の組成物であって、該組成物が、外科用
螺子、外科用ロッド、外科用ピンおよび外科用プレートの外面に適用される、組
成物。
【請求項１９】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、プロテー
ゼデバイスおよび外科用インプラントを含む非生体分解性マトリックスに処方さ
れるか、該マトリックス上に適用されるか、または該マトリックス内に埋め込ま
れる、組成物。
【請求項２０】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、代謝性の
骨の疾患および非代謝性の骨の疾患の処置のために投与される、組成物。
【請求項２１】請求項２０に記載の組成物であって、該組成物が、ビタミ
ンＤ毒性の処置のために投与される、組成物。
【請求項２２】請求項２０に記載の組成物であって、該組成物が、ビタミ
ンＡ毒性の処置のために投与される、組成物。
【請求項２３】請求項２０に記載の組成物であって、該組成物が、骨折、
骨の変形、脊髄変形、骨肉腫、骨髄腫、骨の形成異常、脊柱側弯症、歯周病およ
び歯周欠陥、歯の修復、骨粗鬆症、関節炎、繊維性骨炎、腎性骨形成異常、およ
びパジェット病の処置のために投与される、組成物。
【請求項２４】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、骨の外科
手術の間に投与されて、骨の治癒が促進される、組成物。
【請求項２５】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、体重につ
いて約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇの投薬範囲で投与される、組成
物。
【請求項２６】請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、骨芽細胞
におけるビタミンＤ_３誘導性アポトーシスの予防のために投与される、組成物。
【請求項２７】骨形成を刺激するための医薬品の製造におけるＲＡＲアン
タゴニストの使用。
【請求項２８】請求項２７に記載の使用であって、前記医薬品が、上皮増
殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因
子、副甲状腺ホルモン、白血病阻害因子、インスリン様増殖因子、骨形態形成タ
ンパク質、オステオゲニン、フッ化ナトリウム、エストロゲン、カルシトニン、
二ホスホン酸塩、炭酸カルシウム、プロスタグランジン、ビタミンＫおよびこれ
らの混合物からなる群より選択される薬剤をさらに含有する、使用。
【請求項２９】骨芽細胞におけるビタミンＤ_３誘導性アポトーシスを予防
するための医薬品の製造におけるＲＡＲアンタゴニストの使用。
【請求項３０】請求項２７に記載の使用であって、前記ＲＡＲアンタゴニ
ストが、１μＭ未満のＫｄで１以上のＲＡＲサブタイプに結合する任意の化学物
質から選択される、使用。
【請求項３１】請求項３０に記載の使用であって、前記ＲＡＲアンタゴニ
ストが、前記ＲＡＲアンタゴニストが、モノフルオロ置換メチルクロメンおよび
ジフルオロ置換メチルクロメンからなる群より選択される、使用。
【請求項３２】請求項３１に記載の使用であって、前記ＲＡＲアンタゴニ
ストが、ＡＧＮ１９４３０１である、使用。
【請求項３３】請求項３０に記載の使用であって、前記ＲＡＲアンタゴニ
ストが、ＡＧＮ１９４３０１、ＡＧＮ１９３０９、ＡＧＮ１９０１２１、ＡＧＮ
１９４５７４、ＡＧＮ１９３１７４、ＡＧＮ１９３６３９、ＡＧＮ１９３６７６
、ＡＧＮ１９３６４４、ＳＲＩ１１３３５、ＲＯ４１−５２５３、ＲＯ４０−６
０５５、ＣＤ２３６６、ＢＭＳ１８５４１１、ＢＭＳ１８９４５３、ＣＤ−２６
６５、ＣＤ２０１９、ＣＤ２７８１、ＣＤ２６６５およびＣＤ２７１、ならびに
これらの混合物からなる群より選択される、使用。
【請求項３４】請求項３０に記載の使用であって、前記医薬品が、賦形剤
、防腐剤、可溶化剤、緩衝化剤、アルブミン、滑沢剤、充填剤、安定化剤および
これらの混合物をさらに含有する、使用。
【請求項３５】代謝性の骨の疾患または非代謝性の骨の疾患を有する脊椎
動物における骨形成を刺激するためのキットであって、以下：有効に骨形成を刺激する量のＲＡＲアンタゴニストを含む第１の組成物；およ
び骨の成長を促進するか、または骨の吸収を阻害する１以上の薬剤を含む第２の
組成物、を含む、キット。
【請求項３６】請求項３５に記載のキットであって、前記薬剤が、骨の形
態形成因子、抗吸収薬剤、骨形成因子、軟骨由来骨形成タンパク質、成長ホルモ
ン、および分化因子からなる群より選択される、キット。
【請求項３７】請求項３６に記載のキットであって、前記薬剤が、上皮増
殖因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスホーミング増殖因
子、副甲状腺ホルモン、白血病阻害因子、インスリン様増殖因子、骨形態形成タ
ンパク質、オステオゲニン、フッ化ナトリウム、エストロゲン、カルシトニン、
二ホスホン酸塩、炭酸カルシウム、プロスタグランジン、ビタミンＫおよびこれ
らの混合物からなる群より選択される、キット。
【請求項３８】被験体における骨に関連する障害を処置するための薬学的
組成物であって、該組成物は、胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細
胞、および骨、骨髄細胞または血液由来の骨格前駆細胞、ならびにこれらの混合
物からなる群より選択される細胞を含有し、ここで該細胞は、有効量のＲＡＲア
ンタゴニストを用いてインビトロで処置される、組成物。
【請求項３９】請求項３８に記載の組成物であって、前記処置された細胞
が、プロテーゼデバイスまたは外科用インプラントを含む移植可能なマトリック
ス内に埋め込まれる、組成物。
【請求項４０】骨の鉱化作用のエキソビボ刺激のための方法であって、該
方法は、胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、および骨、骨髄細
胞または血液由来の骨格前駆細胞からなる群より選択される細胞を、有効量のＲ
ＡＲアンタゴニストともに培養する工程；および該細胞を小節形成の促進を可能
にするに十分な時間にわたりインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項４１】ヒトにおける骨粗鬆症を処置または予防するための薬学的
組成物であって、該組成物は、治療的に有効な量のＲＡＲアンタゴニスト；およ
び薬学的に受容可能なキャリア、を含む、組成物。
【請求項４２】インビボで、骨欠損部位において骨を生成するための薬学
的組成物であって、該組成物は、該骨欠損部位に移植するための、ＲＡＲアンタ
ゴニストの存在下でインビトロで培養された骨芽細胞または骨芽前駆細胞の集団
を含む、組成物。
【請求項４３】請求項４２に記載の組成物であって、前記細胞が、胚性幹
細胞および成体の幹細胞からなる群より選択される細胞を含む、組成物。
【請求項４４】骨の変性により特徴付けられる変形性関節症を処置するた
めの薬学的組成物であって、該組成物は、疾患部位に送達するための、治療的に有効な量のＲＡＲアンタゴニスト、を含有する、薬学的組成物。
【請求項４５】骨形成を刺激するための薬学的組成物であって、該組成物
は、以下：治療的に有効な量のＲＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチド；および薬学的に受容可能なキャリア、を含有する、組成物。
【請求項４６】請求項２０に記載の薬学的組成物であって、該組成物が、
ＲＡＲアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する、組成物。
【請求項４７】請求項４６に記載の組成物であって、前記ヌクレオチドが
、発現ベクター中に存在し、そして患者への投与がＲＡＲアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの発現を生じて、ＲＡＲ遺伝子の転写をダウンレギュレートまたは阻
害し、ＲＡＲ活性の減少を導く、組成物。
【請求項４８】骨形成を阻害するための薬学的組成物であって、該組成物
は、治療的に有効な量のＲＡＲアゴニストおよびそのための薬学的に受容可能な
キャリアを含有する、組成物。
【請求項４９】請求項４８に記載の組成物であって、該組成物が、骨形成
の増加に関連する障害を処置するために投与される、組成物。
【請求項５０】請求項４９に記載の組成物であって、該組成物が、異所性
の骨の形成を処置するために投与される、組成物。
【請求項５１】請求項４９に記載の組成物であって、前記障害が、大理石
骨病および進行性骨化性線維形成異常症からなる群より選択される、組成物。
【請求項５２】哺乳動物における罹患した骨組織を低減するための薬学的
組成物であって、該組成物は、治療的に有効な量の、骨鉱化作用を阻害し、そし
て罹患した骨組織のアポトーシスを刺激するＲＡＲアゴニスト、および薬学的に
受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項５３】骨芽細胞におけるアポトーシスを刺激するための薬学的組
成物であって、該組成物は、該骨芽細胞に対する有効量のＲＡＲアゴニストおよ
び薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項５４】骨形成を阻害するための医薬品の製造におけるＲＡＲアゴ
ニストの使用。
【請求項５５】請求項５４に記載の使用であって、前記ＲＡＲアゴニスト
が、天然に存在するレチノイド化合物または合成レチノイド化合物のいずれかか
ら選択される、使用。
【請求項５６】請求項１に記載の組成物であって、該組成物は、ＶＤＲ転
写活性のインビトロ調節およびインビボ調節のために投与される、組成物。
【請求項５７】請求項２１に記載の組成物であって、該組成物は、ビタミ
ンＤに曝された骨芽細胞におけるアポトーシスを改善する、組成物。
【請求項５８】脊椎動物における骨格部位での天然の骨形成を阻害するた
めの薬学的組成物であって、該組成物は、請求項４８に記載のＲＡＲアゴニスト
組成物を含有する、組成物。
【請求項５９】骨格の外科手術の部位における骨に関連した整形外科的欠
陥および傷害、または哺乳動物における異常を修復するための移植可能なプロテ
ーゼデバイスであって、該デバイスは、以下：骨組織に隣接して、または該組織内に移植可能な表面領域を有するプロテーゼ
インプラント；および骨の鉱化作用および骨形成の増強を促進するに十分な量で該表面領域に配置さ
れたＲＡＲアンタゴニスト組成物、を含む、デバイス。
【請求項６０】請求項５９に記載の移植可能なプロテーゼデバイスであっ
て、前記ＲＡＲアンタゴニスト組成物が、該プロテーゼインプラント内に配置さ
れる、デバイス。
【請求項６１】胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、およ
び骨、骨髄または血液由来の骨格前駆細胞からなる群より選択される細胞におい
てインビトロおよびインビボで骨形成を刺激するための組成物であって、ここで
該組成物は、以下：治療的に有効な量のＲＡＲアンタゴニスト；および薬学的に受容可能なキャリア、を含有する、組成物。
【請求項６２】胚性幹細胞、成体の幹細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、およ
び骨、骨髄または血液由来の骨格前駆細胞からなる群より選択される細胞におい
てインビトロおよびインビボで骨形成を阻害するための組成物であって、ここで
該組成物は、以下：治療的に有効な量のＲＡＲアゴニスト；および薬学的に受容可能なキャリア、を含有する、組成物。
【請求項６３】エキソビボでの骨格組織操作のための方法であって、該方
法は、以下：ＲＡＲアンタゴニスト組成物の存在下で細胞の集団を培養する工程；および該細胞を移植可能なマトリックスに付与し、そしてさらに該細胞が骨形成を受
けるに十分な時間にわたってインキュベートする工程、を包含し；該移植可能な
マトリックスが、その上でおよびその中で組み込まれた骨組織形成を有する、方
法。
【請求項６４】請求項６３に記載の方法であって、前記移植可能なマトリ
ックスの上および中に骨形成を有する移植可能なマトリックスが、ＲＡＲアゴニ
スト組成物で処置されて、骨組織の再構成が促進される、方法。