JP2000511155A - ヒトＭＰ５２ Ａｒｇタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトMP52 Arg及びヒトMP52 Argを含む、特に軟骨及び骨形態形成を促進するための薬剤医学的組成物に関する。特にこの医学的組成物は、骨粗鬆症のような異常な骨の代謝により発生する骨疾患の治療、骨折の治療、及び整形外科的復興術、骨移植、美容整形、歯科治療の目的に有用である。さらに、軟骨疾患の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトMP52 Argタンパク質 本発明は、新規な化合物、ヒトMP52 Arg、及びヒトMP52 Argを含む、特に軟骨 及び骨形態形成を促進するための薬剤医学的組成物に関する。特にこの医学的組 成物は、骨粗鬆症のような異常な骨の代謝により発生する骨疾患の治療、骨折の 治療、及び整形外科的復興術、骨移植、美容整形、歯科治療の目的に有用である 。さらに、軟骨障害の治療にも有用である。 ビタミンD3、カルシトニン、エストロゲン及びビスホスホネート誘導体を含む 医薬組成物が骨疾患の治療の臨床実務に使用されてきた。しかしそれらの治療的 効果は完全に満足できるものではなく、より優れた医薬組成物が強く求められて いる。 BMP、TGF及びインヒビン関連タンパク質を含む成長因子のTGF-βファミリーが 外傷治療及び組織修復に有用であると報告されている。これらのタンパク質のい くつかのものの骨形態形成活性も知られている。PCT特許出願WO 93/16099及びWO 95/04819は、ヒトTGF-β-様タンパク質をコードするＤＮＡ配列、及び好ましい タンパク質としてヒトMP52を開示している。 E.E．Stormらは、Nature，1994，vol.368，p.639-643に、TGF-βスーパーファ ミリーの新しいメンバーであるマウス成長/分化因子5(GDF5)遺伝子の突然変異が マウス短脚症を起こすことを報告している。マウスGDF5は1つのアミノ酸を除い てヒトMP52と同じ予想成熟形態のアミノ酸配列を有する。しかし、この刊行物に はこれらのタンパク質を骨疾患の治療に使用するという示唆はない。 従って本発明の目的は、骨あるいは軟骨形成の剌激剤として有用な別の成長因 子を提供することである。従って本発明の一つの態様は、配列番号1のアミノ酸1 〜121を含むタンパク質ヒトMP52 Argである。 驚くべきことに本発明により、適当なＤＮＡ配列を発現したときにヒトMP52 A rgまたはヒトMP52及びヒトMP52 Argの混合物を形成する細胞系が存在することが 実際に見出された。本発明は、骨形態形成活性を有し、骨疾患の予防及び／また は治療に有用なヒトMP52 Argを提供することに初めて成功したものである。 ヒトMP52 Argは、未分化間葉細胞からの軟骨の形成を誘導し、骨芽細胞の分化 と成熟を促進することも確認された。従ってヒトMP52 Argは、骨粗鬆症のような 異常な骨代謝により起こる骨疾患の予防及び／または治療に有効である。また、 骨折の治癒過程も促進する。さらにその骨形態形成活性により、整形外科的復興 術、骨移植及び歯科治療にも有用である。また、MP52 Argは異常な軟骨代謝によ り起こる軟骨疾患の予防及び／または治療にも有効である。 本発明のまた別の目的は、ヒトMP52 Argの製造方法であり、該方法においては 配列番号1に示したＤＮＡ配列の少なくとも一部を該ＤＮＡ配列の発現とタンパ ク質の形成に好ましい条件下で適当な宿主細胞に導入し、その後該タンパク質を その宿主細胞により生成された他のタンパク質から分離する。 本発明の範囲内において、配列番号1に記載されたＤＮＡ配列をヒトMP52 Arg を製造するのに使用し得、またそのより短い部分もそれらがヒトMP52 Argをやは りコードし、該ＤＮＡ配列の適当なべクター/宿主系における発現が可能である かぎりヒトMP52 Argを製造するのに使用し得る。適当な発現系は当業者に知られ ており、配列番号1のＤＮＡ配列の長さについてどれだけが最低の要件であるか は通常の実験により容易に決定できる。 タンパク質形成の後、それ自体公知の方法により該タンパク質を宿主細胞から 回収し、最終的にそれからヒトMP52 Argを単離する。特に、互いに一つのアミノ 酸においてのみ異なるヒトMP52及びMP52 Argの単離は、当業者に知られた非常に 正確に区別する分離方法により行うことができる。一つの例は、Davisの方法(An n．NY Acad．Sci., 121，404-427，1964)を、0.1% Nonidet P-40及び6M尿素を添 加するような若干改変したものに従って行うMP52 Argの電気泳動分離である。電 気泳動の後に分離されたMP52 Argは同じバッファー中のゲル片から電気溶出され る。 さらに別の本発明の目的は、ヒトMP52 Argを含む医薬組成物である。必要に応 じて、この組成物は、通常の担体物質、助剤物質、希釈剤及び／または充填剤も 含むものとすることができる。本発明の医薬組成物は、骨形態形成の促進、骨、 軟骨、結合組織、皮膚、粘膜、上皮あるいは歯の損傷の治療または予防、歯科移 植物における用途、及び外傷治療及び組織再生過程での用途に有用である。 異常な骨代謝により起こる骨疾患の治療のためには、例えば静脈内注射、筋肉 注射、腹腔内注射のような注射、経口投与、座剤のような非経口投与、及びその 他の任意の慣用の方法により全身的にヒトMP52 Argを投与する。 骨折の治療のためには、注射、経口及び非経口投与により全身に、あるいは局 所的に投与する。ヒトMP52 Argを含むマトリックスを骨折した骨の近くの領域に 移植することも好ましい。適当なマトリックスとしては、コラーゲン、フィブリ ンクロットのような天然のポリマー、ポリ乳酸化グリコール酸のような生体で分 解可能な合成ポリマー等が挙げられる。 整形外科復興術、美容整形、骨移植及び歯科移植の場合は、ヒトMP52 Argを例 えばコラーゲンペースト、フィブリングルー及びその他の接着物質により移植す る骨や歯の表面に被覆することができる。また、骨や歯を移植する周囲の組織、 骨、歯槽骨に適用することもできる。骨移植の場合は、天然及び人工骨の両方に 使用できる。人工骨及び歯の材料としては、金属、セラミックス、ガラス、及び その他の天然または人工の無機材料等の慣用の材料が使用される。ヒドロキシア パタイトは好ましい人工物質である。人工骨は、密度の高い材料を内部に使用し 、その他の部分を多孔質材料で構成することができる。例えば多孔質の鋼で被覆 された密度の高い鋼を挙げることができる。多孔質ヒドロキシアパタイトは人工 骨を製造する材料の一つである。そのような多孔質材料を使用した場合、ヒトMP 52 Argはそれに浸透することができる。また、人工骨の表面を粗面化してヒトMP 52 Argをその表面に保持させるようにすることもできる。 腫瘍性骨組織を除去した部分に、骨の再生を促進するためにヒトMP52 Argを適 用することも有用である。 達成すべきヒトMP52 Argの投与量は適用の目的及び方法により決まる。一般に は全身的に投与する場合、投与量は1μｇ−100μｇ/kgである。移植に使用する 場合には、好ましい投与量は部位あたり30μｇ〜30mgである。 この精製されたヒトMP52 Argは、注射液、錠剤、カプセル、座剤等の任意の慣 用の形態に配合することができる。局所的投与用には、ヒトMP52 Argをコラーゲ ン、フィブリングルー、ポリ乳酸化グリコール酸等のマトリックス中に含有させ ることができる。インプラント及び移植の用途用には、骨及び歯の表面あるいは 多孔性の部分に適用する。 本発明を実施例により説明する。 実施例１ MP52 Argの発現ベクターの構築 pSK52sプラスミド(WO 95/04819)をHind IIIで消化し、完全なMP52をコードす る領域を有するｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を0.8％低融点アガロースゲルからの 抽出により単離し、Behringwerke AGのDr．Gerd Zettlmeiβlから提供されたpAB stopべクターのHind III部位に結合した。得られたMP52発現ベクター、pMSS99(5 .0 kb)の構造をＤＮＡ配列決定及び制限酵素マッピングにより確認した。pMSS99 の遺伝子エレメントを概略的に図1に示す。pMSS99中のMP52配列は、配列表の配 列番号1のヌクレオチド576-2279を含む。 実施例２ MP52 Argを生成するCHOクローンの樹立 Dhfr-欠損CHO細胞CHO-DUKX-B11(Urlaub，G.及びChasin，L.A．(1980)Proc.Nat l．Acad．Sci，USA，77，pp.4216-4220)に、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ移入法 によりMP52の発現プラスミド(pMSS99)及びpSVOAdhfr(Zettlmeiβl，G．ら、(198 7）Bio/Technology 5，720-725)を同時にトランスフェクトした。その後MP52 Ar gの高生産クローンをメトトレキセート(MTX)を使用する遺伝子増幅プロトコルで 樹立した。 簡単に記載すると以下の通りである。10μｇのpMSS99及び2μｇのpSVOAdhfrを １mlの25mM HEPES-140mM NaCl-0.75mM NaBHPO₄(pH7.05)に溶解し、50μｌの2.5M CaCl₂と混合した。得られた沈殿をCHO-DUKX-B11細胞に重層し、室温で30分間イ ンキュベートした。次いで10％胎児ウシ血清(FBS)を含むリボ及びデオキシリボ ヌクレオシドを有するMEM ALPHA培地(MEMα⁺)を細胞層に加え、CO₂インキュベー ター中で4-6時間インキュベートした。10％FBSを含むMEMα⁺中の10％グリセロー ルでの室温における3分間の処理の後、細胞を10％FBSを含むMEMα⁺中で2日間培 養した。その後細胞を10％透析FBSを含むリボ及びデオキシリボヌクレオシドを 有しないMEM ALPHA培地(MEMα^-)中に置き、形質転換体を選択した。形 質転換クローンを単離し、次項に記載するようにウェスタンブロット分析により MP52 Argの発現についてアッセイした。 その後メトトレキセート(MTX)を使用する遺伝子増幅プロトコルでMP52 Argの 高生産クローンを樹立した。MP52 Arg生産クローンを、メトトレキセート(MTX) の増加する濃度で段階的にさらに選択し、pSVOAdhfr遺伝子に従ってMP52遺伝子 rgを生産するいくつかのクローンが得られた。 実施例３ 培養上清におけるMP52 Argの検出 以下のようにしてウェスタンブロット分析によりMP52 Argの発現についてクロ ーンを調べた。培養上清(1−15μｌ)を還元条件下にSDS-PAGE(15-25%ポリアクリ ルアミド勾配ゲル，Daiichi Pure Chemicals)にかけ、その後タンパク質をPVDF メンブラン(Clear Blot Membrane-P，ATTO)に移した。メンブランをBlockAce(Da i-Nihon Seiyaku)で1時間ブロックし、トリスバッファー化食塩水(TBS)でリンス し、その後10倍に希釈したBlock Ace中のMP52 Argに対するニワトリ抗体の10μ ｇ/ｍｌで処理した。メンブランをTBS中の0.1% Tween 20(TTBS)で洗浄した後、 メンブランを10倍に希釈したBlock Ace中のウサギ抗-ニワトリIgG-ALP抱合体(Si gma A 9171)で1時間処理した。メンブランをTTBSで洗浄し、次いでAlkaline Pho sphatase Conjugate Subserate Kit(BIO-RAD)と反応させてMP52 Argに対応する バンドを可視化した。 実施例４ MP52 Arg生産CHO細胞系の細胞培養 MP52 Arg及びMP52の最高の生産性を示すCHO細胞系、MC-2(No．FERM BP-5142で 1995年6月21日にNational Institute of Bioscience and Human Technology，Ja panに寄託)を、10％FBS、400nM MTX、100U/mlペニシリン及び100μｇ/mlストレ プトマイシンを補充したMEMα^-を含むローラーボトルで増殖させた。MC-2細胞が 集密状態に増殖した後、細胞を無血清MEMα-nで洗浄し、その後10mM HEPES (pH7.3)、10KIE/mlアプロチニン、１mM酪酸ナトリウム、６μｇ/mlセレン酸ナト リウム、５μｇ/mlトランスフェリン、18μｇ/mlエタノールアミン、９μｇ/ml インシュリン、100U/mlペニシリン及び100μｌ/mlストレプトマイシンを補充し た無血清DME/F12培地で培養した。上記のコンディショニングした培地を1週間毎 日回収した。 実施例５ 精製 1ｌの培養上清を0.1容の0.２Mリン酸ナトリウムバッファー、pH6.0と混合し、 POR0S HSカラム(10ml，PerSeptive Biesystems)にアプライした。溶出は0.3-2M のNaClの直線勾配で行った。MP52 Argを含む溶出物を逆相カラム(RESOURCE RPC ，Pharmacia)にアプライした。溶出は0.05%TFAを含むアセトニトリルの直線勾配 により行い、約35%アセトニトリルにおいてMP52 Argが溶出された。パルス液体 気体相シークエンサー(Applied Biosystems model 476)を使用して、精製された MP52 ArgについてN-末端アミノ酸配列分析を行った。結果を表1に示す。MP52 Ar gはその前駆体からArg(380)-Arg(381)(配列番号1のアミノ酸位置-1及び+1)にお いてタンパク質分解によりプロセシングされることが示されている。しかし、そ の前駆体はArg(381)-Ala(382)(配列番号1のアミノ酸位置+1及び+2)においてもプ ロセシングされ得る。 表1 CHO-細胞で発現されたMP52のN-末端アミノ酸配列分析 実施例６ 生物学的活性 骨前駆細胞様ROB-C26細胞(Calcif．Tissue Int．vol．49，p.221-225，1991) を48-ウェルマルチウェルプレート(Coaster)上に1.5ｘ10⁴細胞/ウェルの密度で プレート化し、10%胎児ウシ血清(FBS)を含むMEMα^-中で3日間予備インキュベー トした。培養培地を除去した後、10%FBSを含む新鮮なMEMα^-及び10mM HCl中に連 続希釈したMP52 Arg(2μｌ/ml)を培養物に加え、培地と添加物を3日目に交換し て6日間インキュベートした。細胞層をリン酸バッファー化食塩水で洗浄し、１m M MgClβを含む0.2% Nonidetで抽出した。アルカリホスファターゼ(ALP)活性をT akuwaらの方法(Am．J．Physiol．vol．257，p．E797-E803，1989)に従って測定 した。表2に示すように、ROB-C26細胞をMP52 Argで処理するとウェルあたりの全 ALP活性は濃度に依存して増加した。 表2 ROB-C26細胞系のALP活性に対するCHO細胞誘導MP52 Argの影響 値は4個の培養の平均±標準偏差を示す。 *ビヒクル処理対照と比較してp<0.01（Dunnett検定）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 河合 信治 埼玉県入間郡大井町亀久保1056―２―301 (72)発明者 藤野 幸夫 埼玉県所沢市御幸町５―１―303

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 添付の配列表の配列番号１のアミノ酸１〜121を含むタンパク質。 2. 請求項１に記載の生物学的に活性なタンパク質の製造方法であって、配列番 号１に示されたＤＮＡ配列の少なくとも一部を該ＤＮＡ配列の発現及びタンパク 質の形成を可能とする条件下で適切な宿主細胞に導入し、その後該タンパク質を 宿主が生成したその他のタンパク質から単離する方法。 3. 所望により通常の担体物質、補助物質、希釈剤及び充填剤とともに、請求項 １に記載のタンパク質を活性物質として含む医薬組成物。 4. 骨形態形成の促進、骨、軟骨、結合組織、皮膚、粘膜、上皮あるいは歯の損 傷の治療または予防、歯科インプラントにおける用途、及び外傷治療及び組織再 生過程おける用途のための請求項３に記載の医薬組成物の使用。 5. 骨粗鬆症あるいは骨折の治療のための請求項３に記載の医薬組成物の使用。 6. 整形外科的復興術、骨移植、美容整形あるいは歯科移植の使用のための請求 項３に記載の医薬組成物。