JPH0551400A - 短鎖コラーゲン - Google Patents
短鎖コラーゲンInfo
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- JPH0551400A JPH0551400A JP3209606A JP20960691A JPH0551400A JP H0551400 A JPH0551400 A JP H0551400A JP 3209606 A JP3209606 A JP 3209606A JP 20960691 A JP20960691 A JP 20960691A JP H0551400 A JPH0551400 A JP H0551400A
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- collagen
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なＸ型コラーゲンを提供する。
【構成】 （Ｇｌｙ−ａ−ｂ）nの繰り返し配列及び構
成アミノ酸としてヒドロキシプロリンとヒドロキシリジ
ンを有し、更に以下の特徴； 分子量：６０，０００±５，０００ダルトン（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動による） Ｎ末端近傍のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ を有する、ウサギ由来のＸ型コラーゲン（ａ、ｂは、任
意のアミノ酸、ｚは不明アミノ酸、ｎは整数を表す）。
上記Ｘ型コラーゲンは、ウサギの肋軟骨および／または
長管骨の成長板より得た軟骨細胞を培養し、その培養物
から単離することにより、容易に多量に得ることができ
る。
成アミノ酸としてヒドロキシプロリンとヒドロキシリジ
ンを有し、更に以下の特徴； 分子量：６０，０００±５，０００ダルトン（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動による） Ｎ末端近傍のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ を有する、ウサギ由来のＸ型コラーゲン（ａ、ｂは、任
意のアミノ酸、ｚは不明アミノ酸、ｎは整数を表す）。
上記Ｘ型コラーゲンは、ウサギの肋軟骨および／または
長管骨の成長板より得た軟骨細胞を培養し、その培養物
から単離することにより、容易に多量に得ることができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウサギ由来の新規なＸ型
コラーゲン、その製造法及びその用途に関する。
コラーゲン、その製造法及びその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】コラーゲンは、高等生物の細胞外マトリ
ックスの主成分である。コラーゲンは皮膚、腱、骨、軟
骨、および組織の主構成成分であり、高等動物の全タン
白質の３０〜４０％を占めている。コラーゲンには、現
在までに少なくとも１３種類の分子が発見されている
が、これらはアミノ酸組成や分子量を異にするばかりで
なく、その分布において、細胞あるいは組織特異性を異
にしている。
ックスの主成分である。コラーゲンは皮膚、腱、骨、軟
骨、および組織の主構成成分であり、高等動物の全タン
白質の３０〜４０％を占めている。コラーゲンには、現
在までに少なくとも１３種類の分子が発見されている
が、これらはアミノ酸組成や分子量を異にするばかりで
なく、その分布において、細胞あるいは組織特異性を異
にしている。
【０００３】これらのコラーゲンの内、骨、皮膚、歯、
腱、血管などの細胞外マトリックスの主成分であるＩ型
コラーゲンは、各種コラーゲンの中でも最大の量を占め
るものであり、これまで医薬品や化粧品などの担体ある
いは構成成分として広範囲に用いられてきたと共に、生
体材料として、骨折、骨粗ショウ症、関節炎などの治療
に、また工業用材料としてコラーゲンを混ぜた塗料、プ
ラスチック、インク等、さらには細胞培養器材のコーテ
ィング剤など産業上で多様な製品として実用化されてい
る。しかし他のコラーゲン、特に軟骨細胞由来のＸ型コ
ラーゲンについては、産生組織の特異性から推測される
有用性が従来から考えられていたにもかかわらず、その
入手法の困難さから全く産業上の利用がなされていない
現状である。
腱、血管などの細胞外マトリックスの主成分であるＩ型
コラーゲンは、各種コラーゲンの中でも最大の量を占め
るものであり、これまで医薬品や化粧品などの担体ある
いは構成成分として広範囲に用いられてきたと共に、生
体材料として、骨折、骨粗ショウ症、関節炎などの治療
に、また工業用材料としてコラーゲンを混ぜた塗料、プ
ラスチック、インク等、さらには細胞培養器材のコーテ
ィング剤など産業上で多様な製品として実用化されてい
る。しかし他のコラーゲン、特に軟骨細胞由来のＸ型コ
ラーゲンについては、産生組織の特異性から推測される
有用性が従来から考えられていたにもかかわらず、その
入手法の困難さから全く産業上の利用がなされていない
現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】軟骨が骨化するとき、
および骨折後にできる仮骨では、Ｘ型の短鎖コラーゲン
が特異的に軟骨細胞によって産生され、コラーゲンが細
胞外マトリックスの石灰化、軟骨マトリックスの分解、
骨形成の誘導に不可欠な役割を果たしている可能性が考
えられている。従って、骨形成が関与する疾患への治療
にＸ型コラーゲンの応用が推測されるが、上記したよう
に、Ｘ型コラーゲンの産生が特別な部位に限られている
ことから、このコラーゲンを単離することが困難であ
り、また目的とするコラーゲンが得られたとしても極く
少量であるという問題点がある。このため、今までウシ
とニワトリのＸ型コラーゲンについてその極く小量が確
認されたに過ぎない。
および骨折後にできる仮骨では、Ｘ型の短鎖コラーゲン
が特異的に軟骨細胞によって産生され、コラーゲンが細
胞外マトリックスの石灰化、軟骨マトリックスの分解、
骨形成の誘導に不可欠な役割を果たしている可能性が考
えられている。従って、骨形成が関与する疾患への治療
にＸ型コラーゲンの応用が推測されるが、上記したよう
に、Ｘ型コラーゲンの産生が特別な部位に限られている
ことから、このコラーゲンを単離することが困難であ
り、また目的とするコラーゲンが得られたとしても極く
少量であるという問題点がある。このため、今までウシ
とニワトリのＸ型コラーゲンについてその極く小量が確
認されたに過ぎない。
【０００５】従って、Ｘ型コラーゲンを産業上に応用す
る為には、上記問題点を解決することが必要であり、容
易にまた多量に入手できる方法を開発することが切に望
まれている。
る為には、上記問題点を解決することが必要であり、容
易にまた多量に入手できる方法を開発することが切に望
まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために種々の検討を重ねた結果、ウサギの肋
軟骨や長管骨の成長板由来の軟骨細胞を培養液中で培養
することにより、目的とするＸ型コラーゲンを単離する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。以下、本
発明を詳細に説明する。
を解決するために種々の検討を重ねた結果、ウサギの肋
軟骨や長管骨の成長板由来の軟骨細胞を培養液中で培養
することにより、目的とするＸ型コラーゲンを単離する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。以下、本
発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明の新規Ｘ型コラーゲンは、例えば下
記の方法によって調製できる。すなわちウサギ成長板よ
り分離した軟骨細胞を、通常の動物細胞培養に使用され
る培地、例えば１０％牛胎児血清を含むアルファ−ＭＥ
Ｍ存在下でコンフルエントになるまで培養した後、アス
コルビン酸を強化したイスコフ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｖｅｃｃ
ｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）に変えてさらに１０〜１４日間
培養し細胞層を採取する。採取した細胞層は０．１Ｎ／
ＮａＯＨ中でホモゲナイザーにより粉砕し、酢酸での酸
性条件下、ペプシン消化することにより、夾雑蛋白が分
解し、ペプシン耐性のコラーゲン画分を得る。さらに通
常の生化学的手法、例えば高速液体クロマトグラフィ
ー、電気泳動、ゲル濾過などのクロマトグラフィーを行
い、ＳＤＳ−電気泳動で分子量約６０，０００を示すＸ
型コラーゲンを精製できる。
記の方法によって調製できる。すなわちウサギ成長板よ
り分離した軟骨細胞を、通常の動物細胞培養に使用され
る培地、例えば１０％牛胎児血清を含むアルファ−ＭＥ
Ｍ存在下でコンフルエントになるまで培養した後、アス
コルビン酸を強化したイスコフ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｖｅｃｃ
ｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）に変えてさらに１０〜１４日間
培養し細胞層を採取する。採取した細胞層は０．１Ｎ／
ＮａＯＨ中でホモゲナイザーにより粉砕し、酢酸での酸
性条件下、ペプシン消化することにより、夾雑蛋白が分
解し、ペプシン耐性のコラーゲン画分を得る。さらに通
常の生化学的手法、例えば高速液体クロマトグラフィ
ー、電気泳動、ゲル濾過などのクロマトグラフィーを行
い、ＳＤＳ−電気泳動で分子量約６０，０００を示すＸ
型コラーゲンを精製できる。
【０００８】本発明のＸ型コラーゲンのＮ末端近傍のア
ミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号：１）
である。この配列は、ペプシン消化により単離された精
製タンパク質のＮ末端部の配列であり、天然に細胞から
産生されるＸ型コラーゲンは、上記配列のＮ末端側にさ
らにアミノ酸配列を有するプレコラーゲンである。
ミノ酸配列は、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌ
ａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号：１）
である。この配列は、ペプシン消化により単離された精
製タンパク質のＮ末端部の配列であり、天然に細胞から
産生されるＸ型コラーゲンは、上記配列のＮ末端側にさ
らにアミノ酸配列を有するプレコラーゲンである。
【０００９】上記Ｎ末端近傍の配列は、ウシのＸ型コラ
ーゲン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３巻．１４１頁（１
９９１））及びニワトリのＸ型コラーゲン（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．ＣＨｅｍ．２６１巻 ５０４１頁（１９８６））の
ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列に類似しているが
部分的に異なっていた。また、コラーゲンに特徴的な
（Ｇｌｙ−ａ−ｂ）nの繰り返し配列を有している
（ａ、ｂは、任意のアミノ酸、ｚは、不明アミノ酸、ｎ
は、整数を表す）。
ーゲン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３巻．１４１頁（１
９９１））及びニワトリのＸ型コラーゲン（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．ＣＨｅｍ．２６１巻 ５０４１頁（１９８６））の
ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列に類似しているが
部分的に異なっていた。また、コラーゲンに特徴的な
（Ｇｌｙ−ａ−ｂ）nの繰り返し配列を有している
（ａ、ｂは、任意のアミノ酸、ｚは、不明アミノ酸、ｎ
は、整数を表す）。
【００１０】本精製蛋白のアミノ酸組成は、アスパラギ
ン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、
グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、
ヒスチジン、アルギニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロ
キシリジンを構成成分として含み、システイン、シスチ
ンおよびトリプトファンを構成成分として含んでいな
い。ヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンとを構成成
分として含んでいることは、コラーゲン蛋白の特徴を示
している。また、アミノ酸組成比は、ウシＸ型コラーゲ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３巻 １４１頁（１９９
０））、ニワトリＸ型コラーゲン（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６１巻 ５０４１頁（１９８６））とも異なっ
ていた。さらに、本精製タンパク質はコラーゲナーゼ処
理により完全に分解された。以上の結果より、本精製タ
ンパク質は新規なＸ型コラーゲンと同定された。
ン酸、トレオニン、セリン、グルタミン酸、プロリン、
グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシ
ン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リジン、
ヒスチジン、アルギニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロ
キシリジンを構成成分として含み、システイン、シスチ
ンおよびトリプトファンを構成成分として含んでいな
い。ヒドロキシプロリンとヒドロキシリジンとを構成成
分として含んでいることは、コラーゲン蛋白の特徴を示
している。また、アミノ酸組成比は、ウシＸ型コラーゲ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３巻 １４１頁（１９９
０））、ニワトリＸ型コラーゲン（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６１巻 ５０４１頁（１９８６））とも異なっ
ていた。さらに、本精製タンパク質はコラーゲナーゼ処
理により完全に分解された。以上の結果より、本精製タ
ンパク質は新規なＸ型コラーゲンと同定された。
【００１１】このようにして得られた本発明のウサギＸ
型コラーゲンは、軟骨基質の主要成分たるプロテオグリ
カンの合成を促進し、さらに軟骨細胞の増殖を促進する
ことが確認された。従って、生体特に人間の骨−軟骨形
成反応のメカニズムの解析や、骨折、骨粗ショウ症、関
節炎の治療剤として利用することができる。さらに、ウ
シＩ型、II型コラーゲンをリウマチ性関節炎のモデル動
物に投与した場合、その発症を抑えることがＺ．Ｚｈａ
ｎｇら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５巻．２４８９頁
（１９９０））により報告されているが、より関節炎に
関与することが考えられるＸ型コラーゲンは、より大き
な効果が期待できるのでリウマチ患者や他の関節の病
気、骨の病気の患者に対して、発症の予防及び治療効果
がつよく期待できる。
型コラーゲンは、軟骨基質の主要成分たるプロテオグリ
カンの合成を促進し、さらに軟骨細胞の増殖を促進する
ことが確認された。従って、生体特に人間の骨−軟骨形
成反応のメカニズムの解析や、骨折、骨粗ショウ症、関
節炎の治療剤として利用することができる。さらに、ウ
シＩ型、II型コラーゲンをリウマチ性関節炎のモデル動
物に投与した場合、その発症を抑えることがＺ．Ｚｈａ
ｎｇら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５巻．２４８９頁
（１９９０））により報告されているが、より関節炎に
関与することが考えられるＸ型コラーゲンは、より大き
な効果が期待できるのでリウマチ患者や他の関節の病
気、骨の病気の患者に対して、発症の予防及び治療効果
がつよく期待できる。
【００１２】本発明のＸ型コラーゲンを治療剤として用
いる場合、局所注射あるいは固型として局所に埋め込む
か、または経口で投与あるいは静脈内投与が望ましい。
いずれの場合も、有効量は１μｇ〜１００mg／日程度が
望ましいが、この有効量については当業者が適宜決める
ものとする。また本発明のＸ型コラーゲンは石灰化組成
の生体材料としても特に利用価値が高いので既知のＩ型
コラーゲンなどと組み合わせることによって、あるいは
ハイドロキシアパタイトと組み合わせることによって、
さらにまた単体でＸ型コラーゲン含有成形物を作製し骨
折部、人工関節、歯科インプラントなどの部位に各種の
補綴物として埋め込む生体材料として利用することがで
きる。
いる場合、局所注射あるいは固型として局所に埋め込む
か、または経口で投与あるいは静脈内投与が望ましい。
いずれの場合も、有効量は１μｇ〜１００mg／日程度が
望ましいが、この有効量については当業者が適宜決める
ものとする。また本発明のＸ型コラーゲンは石灰化組成
の生体材料としても特に利用価値が高いので既知のＩ型
コラーゲンなどと組み合わせることによって、あるいは
ハイドロキシアパタイトと組み合わせることによって、
さらにまた単体でＸ型コラーゲン含有成形物を作製し骨
折部、人工関節、歯科インプラントなどの部位に各種の
補綴物として埋め込む生体材料として利用することがで
きる。
【００１３】さらにまた、各種コラーゲンはインシュリ
ン、骨誘導タン白（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＭＰ）などのホルモンや成長
因子と結合することによって、これらの生理活性物質の
作用を安定化、長期化させる。従って、本発明のＸ型コ
ラーゲンも、ホルモン、成長因子、薬物の担体（ドラッ
グキャリアー）として、その活性物質の安定化、作用の
持続化あるいは局所にその作用を限定させるものに利用
可能である。
ン、骨誘導タン白（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔ
ｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＭＰ）などのホルモンや成長
因子と結合することによって、これらの生理活性物質の
作用を安定化、長期化させる。従って、本発明のＸ型コ
ラーゲンも、ホルモン、成長因子、薬物の担体（ドラッ
グキャリアー）として、その活性物質の安定化、作用の
持続化あるいは局所にその作用を限定させるものに利用
可能である。
【００１４】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的かつ詳細に説明するが、本発明がこれに限定されない
ことは言うまでもない。
的かつ詳細に説明するが、本発明がこれに限定されない
ことは言うまでもない。
【００１５】
［実施例１］ （軟骨細胞の分離）軟骨細胞の分離は、Ｙ．Ｋａｔｏら
の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻．２３６４
（１９８５））に従って行った。すなわち、６羽のウサ
ギの肋軟骨や長管骨から成長板を無菌的に切り出し周囲
の軟組織を取り除いた後、メスで細かく刻み、遠心管に
移して０．１％ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で２０分間
処理した。次いで約１０倍量のトリプシン溶液と交換し
て、３７℃で１時間処理した。さらに軟骨重量の約２０
倍量のコラーゲナーゼ溶液を加えて３７℃で２〜３時間
消化した。その後、強くピペッテングして均一な細胞懸
濁液として、ナイロンフィルターで濾過して培養液を入
れた遠心管に受けた。１，５００ｒｐｍで３分間遠心し
てその沈澱を再び培養液に懸濁し、ピペッテングしたの
ち、遠心した。この操作を３回繰り返してコラーゲナー
ゼを除き、最後に新しい培養液に分離した軟骨細胞を懸
濁して実験に用いた。
の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻．２３６４
（１９８５））に従って行った。すなわち、６羽のウサ
ギの肋軟骨や長管骨から成長板を無菌的に切り出し周囲
の軟組織を取り除いた後、メスで細かく刻み、遠心管に
移して０．１％ＥＤＴＡ溶液を加えて３７℃で２０分間
処理した。次いで約１０倍量のトリプシン溶液と交換し
て、３７℃で１時間処理した。さらに軟骨重量の約２０
倍量のコラーゲナーゼ溶液を加えて３７℃で２〜３時間
消化した。その後、強くピペッテングして均一な細胞懸
濁液として、ナイロンフィルターで濾過して培養液を入
れた遠心管に受けた。１，５００ｒｐｍで３分間遠心し
てその沈澱を再び培養液に懸濁し、ピペッテングしたの
ち、遠心した。この操作を３回繰り返してコラーゲナー
ゼを除き、最後に新しい培養液に分離した軟骨細胞を懸
濁して実験に用いた。
【００１６】［実施例２］ （軟骨細胞の培養方法）培養液としては、アルファ−Ｍ
ＥＭ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ある
いは１０％牛胎児血清、０．１mg／mlのＬ−システイン
・ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ、０．０９μｇ／mlのビオチン、０．
２μｇ／mlのリポ酸（ＤＬ−チオクト酸）と５０μｇ／
mlのアスコルビン酸を添加したイスコフ培地（Ｉｓｃｏ
ｖｅ’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｂｅ
ｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ．Ｓｉｇｍａ社）にペニシリン
（３２Ｕ／ml）、ファンギゾーン（０．２５μｇ／m
l）、ストレプトマイシン（４０μｇ／ml）などの抗生
物質を加えて、さらに重曹２ｇ／Ｌ（２mg／ml）を加え
て、pH７．１に調製した培養液（メジウムＡ）を用い
た。
ＥＭ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ある
いは１０％牛胎児血清、０．１mg／mlのＬ−システイン
・ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ、０．０９μｇ／mlのビオチン、０．
２μｇ／mlのリポ酸（ＤＬ−チオクト酸）と５０μｇ／
mlのアスコルビン酸を添加したイスコフ培地（Ｉｓｃｏ
ｖｅ’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｕｌｂｅ
ｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ．Ｓｉｇｍａ社）にペニシリン
（３２Ｕ／ml）、ファンギゾーン（０．２５μｇ／m
l）、ストレプトマイシン（４０μｇ／ml）などの抗生
物質を加えて、さらに重曹２ｇ／Ｌ（２mg／ml）を加え
て、pH７．１に調製した培養液（メジウムＡ）を用い
た。
【００１７】細胞は、コーニング社の細胞培養用フラス
コ（２２５cm2）に成長板から分離した直後の軟骨細胞
を１０6個接種して、５０mlの１０％牛胎児血清を含む
アルファ−ＭＥＭ存在下でコンフルエントになるまで培
養した。その後、培地を１００mlのメジウムＡに変えて
さらに１０〜１４日間培養する。なお培地は２日毎に交
換した。ただしアスコルビン酸は使用直前に溶かしたも
のを２日毎に添加した。
コ（２２５cm2）に成長板から分離した直後の軟骨細胞
を１０6個接種して、５０mlの１０％牛胎児血清を含む
アルファ−ＭＥＭ存在下でコンフルエントになるまで培
養した。その後、培地を１００mlのメジウムＡに変えて
さらに１０〜１４日間培養する。なお培地は２日毎に交
換した。ただしアスコルビン酸は使用直前に溶かしたも
のを２日毎に添加した。
【００１８】［実施例３］ （コラーゲンの抽出と精製）細胞層は５０mlのＰＢＳ
（生理的食塩水）にて６回洗浄した。さらにＨ2Ｏで２
回洗浄した。そして０．１ＮのＮａＯＨ（３０４ml）中
で細胞層をガラスホモゲナイザーにて徹底的に粉砕（１
０分間ぐらいかける）した。４５分間静置した後、５Ｍ
の酢酸を６０．８ml加えて酸性化した。その後に、６mg
／mlのペプシンを含む０．５Ｍ酢酸を９．３５ml添加し
て、４℃で１６時間攪拌した。以下の操作は全て４℃で
行った。この懸濁液を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心
して上澄液を除き、次いで５０mlの水を加えた後、超音
波を用いて徹底的に再懸濁した。懸濁液は再度遠心し
た。この操作を４回繰り返した。そして最後にできるだ
け少量の水で回収した後、凍結乾燥した。この段階での
ペプシン耐性画分をＳＤＳ−電気泳動にかけるとII型コ
ラーゲンと６０ｋＤコラーゲンのみが認められた。II型
コラーゲンと６０ｋＤコラーゲンを分離するには、ＳＤ
Ｓ−電気泳動後のゲルからのタンパク質の溶出と逆相や
分子ふるいなどの高速液体クロマトグラフィーを用いた
がいずれも有効であった。
（生理的食塩水）にて６回洗浄した。さらにＨ2Ｏで２
回洗浄した。そして０．１ＮのＮａＯＨ（３０４ml）中
で細胞層をガラスホモゲナイザーにて徹底的に粉砕（１
０分間ぐらいかける）した。４５分間静置した後、５Ｍ
の酢酸を６０．８ml加えて酸性化した。その後に、６mg
／mlのペプシンを含む０．５Ｍ酢酸を９．３５ml添加し
て、４℃で１６時間攪拌した。以下の操作は全て４℃で
行った。この懸濁液を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心
して上澄液を除き、次いで５０mlの水を加えた後、超音
波を用いて徹底的に再懸濁した。懸濁液は再度遠心し
た。この操作を４回繰り返した。そして最後にできるだ
け少量の水で回収した後、凍結乾燥した。この段階での
ペプシン耐性画分をＳＤＳ−電気泳動にかけるとII型コ
ラーゲンと６０ｋＤコラーゲンのみが認められた。II型
コラーゲンと６０ｋＤコラーゲンを分離するには、ＳＤ
Ｓ−電気泳動後のゲルからのタンパク質の溶出と逆相や
分子ふるいなどの高速液体クロマトグラフィーを用いた
がいずれも有効であった。
【００１９】［実施例４］ （分子量の測定）前記、実施例３で得られた約６０ｋダ
ルトン精製タンパク質画分を、還元剤存在下あるいは非
存在下、ＳＤＳ−ゲル電気泳動（泳動条件；８％ポリア
クリルアミドゲルを用いて１５０ｖで１時間泳動、分子
量標準；ウサギ骨格筋由来ミオシン（２００ｋ）、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来βガラクトシダーゼ（１１６ｋ）、牛血清
由来牛血清アルブミン（６６ｋ）、ウサギ骨格筋由来ア
ルドラーゼ（４２ｋ）、牛赤血球由来カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０ｋ））を行い分子量を測定した。その
結果、本条件下での精製タンパク質の分子量は６０，０
００±５，０００であった。
ルトン精製タンパク質画分を、還元剤存在下あるいは非
存在下、ＳＤＳ−ゲル電気泳動（泳動条件；８％ポリア
クリルアミドゲルを用いて１５０ｖで１時間泳動、分子
量標準；ウサギ骨格筋由来ミオシン（２００ｋ）、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来βガラクトシダーゼ（１１６ｋ）、牛血清
由来牛血清アルブミン（６６ｋ）、ウサギ骨格筋由来ア
ルドラーゼ（４２ｋ）、牛赤血球由来カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０ｋ））を行い分子量を測定した。その
結果、本条件下での精製タンパク質の分子量は６０，０
００±５，０００であった。
【００２０】［実施例５］ （Ｎ末端アミノ酸配列）実施例３で得られた精製タンパ
ク質（１００ｐｍｏｌ）のＮ末端アミノ酸配列を４７７
Ａ／１２０Ａプロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＮ末端から３４番目ま
で決定した。その結果、Ｎ末端部分のアミノ酸配列は次
の通りであった。
ク質（１００ｐｍｏｌ）のＮ末端アミノ酸配列を４７７
Ａ／１２０Ａプロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＮ末端から３４番目ま
で決定した。その結果、Ｎ末端部分のアミノ酸配列は次
の通りであった。
【００２１】Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ
−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号：１）
（ｚは不明であった）。
−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号：１）
（ｚは不明であった）。
【００２２】［実施例６］ （アミノ酸組成）前記、実施例３で得られた精製タンパ
ク質のアミノ酸組成分析を行った。すなわち、試料１０
０μｇを真空封管下、４％チオグリコール酸（還元剤）
を含む６Ｎ塩酸で１１０℃、２２時間加水分解した後、
塩酸を減圧乾固し、蒸留水で溶解した後、日立８３５型
アミノ酸分析計で組成の分析を行った。その結果を表１
に示した。
ク質のアミノ酸組成分析を行った。すなわち、試料１０
０μｇを真空封管下、４％チオグリコール酸（還元剤）
を含む６Ｎ塩酸で１１０℃、２２時間加水分解した後、
塩酸を減圧乾固し、蒸留水で溶解した後、日立８３５型
アミノ酸分析計で組成の分析を行った。その結果を表１
に示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】［実施例７］ （コラーゲナーゼによる分解）実施例３で得られた精製
タンパク質１００μｇをコラーゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ
社）で処理した後に、ＳＤＳ−ゲル電気泳動分析を行っ
た結果、分子量６０ｋダルトンの目的タンパク質は消化
していた。
タンパク質１００μｇをコラーゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ
社）で処理した後に、ＳＤＳ−ゲル電気泳動分析を行っ
た結果、分子量６０ｋダルトンの目的タンパク質は消化
していた。
【００２５】［実施例８］ （軟骨細胞の増殖促進作用）実施例３で得られ、実施例
５、６、７でＸ型コラーゲンと同定できた精製タンパク
質を０．０１Ｎ ＨＣｌに０．１μｇ／mlの濃度になる
よう溶解し、その３０μｌを直径１６mmの組織培養用シ
ャーレ（コーニング社）に入れて１６時間放置し、シャ
ーレにコーティングした。対照には、コラーゲンを含ま
ない０．０１Ｎ ＨＣｌを用いた。その後ＰＢＳで１回
シャーレを洗浄し、次いで１万個の軟骨細胞をまき、更
に１０％血清を含むアルファ−ＭＥＭ存在下で１週間培
養した。対照群のＤＮＡ含量は１．６９±０．０５μｇ
／シャーレであったのに対して、Ｘ型コラーゲンをコー
トした群では２．４４±０．５１μｇ／シャーレであ
り、Ｘ型コラーゲンは有意に軟骨細胞の増殖を亢進し
た。
５、６、７でＸ型コラーゲンと同定できた精製タンパク
質を０．０１Ｎ ＨＣｌに０．１μｇ／mlの濃度になる
よう溶解し、その３０μｌを直径１６mmの組織培養用シ
ャーレ（コーニング社）に入れて１６時間放置し、シャ
ーレにコーティングした。対照には、コラーゲンを含ま
ない０．０１Ｎ ＨＣｌを用いた。その後ＰＢＳで１回
シャーレを洗浄し、次いで１万個の軟骨細胞をまき、更
に１０％血清を含むアルファ−ＭＥＭ存在下で１週間培
養した。対照群のＤＮＡ含量は１．６９±０．０５μｇ
／シャーレであったのに対して、Ｘ型コラーゲンをコー
トした群では２．４４±０．５１μｇ／シャーレであ
り、Ｘ型コラーゲンは有意に軟骨細胞の増殖を亢進し
た。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、単離、精製された新規
Ｘ型コラーゲンが提供される。ウサギの肋軟骨および／
または長管骨の成長盤より得た軟骨細胞の細胞培養物を
用いることにより、上記Ｘ型コラーゲンが容易に多量に
入手可能となる。
Ｘ型コラーゲンが提供される。ウサギの肋軟骨および／
または長管骨の成長盤より得た軟骨細胞の細胞培養物を
用いることにより、上記Ｘ型コラーゲンが容易に多量に
入手可能となる。
【００２７】
【００２８】
【配列番号：１】配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トロポジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (5)
- 【請求項１】（Ｇｌｙ−ａ−ｂ）nの繰り返し配列及び
構成アミノ酸としてヒドロキシプロリンとヒドロキシリ
ジンを有し、更に以下の特徴； 分子量：６０，０００±５，０００ダルトン（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動による） Ｎ末端近傍のアミノ酸配列；Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ
−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ｚ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ を有する、ウサギ由来のＸ型コラーゲン（ａ、ｂは、任
意のアミノ酸、ｚは不明アミノ酸、ｎは整数を表す）。 - 【請求項２】ウサギの肋軟骨および／または長管骨の成
長板より得た軟骨細胞を培養し、該培養物から請求項１
に記載のＸ型コラーゲンを単離することを特徴とする、
請求項１に記載のＸ型コラーゲンの製造法。 - 【請求項３】請求項１に記載のＸ型コラーゲンを有効成
分として含有する骨あるいは関節疾患の治療又は予防
剤。 - 【請求項４】請求項１に記載のＸ型コラーゲンを有効成
分として含有する生体材料。 - 【請求項５】請求項１に記載のＸ型コラーゲンを有効成
分とするドラックキャリアー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3209606A JPH0551400A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 短鎖コラーゲン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3209606A JPH0551400A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 短鎖コラーゲン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0551400A true JPH0551400A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16575596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3209606A Pending JPH0551400A (ja) | 1991-08-21 | 1991-08-21 | 短鎖コラーゲン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0551400A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2770777A1 (fr) * | 1997-11-10 | 1999-05-14 | Fabre Pierre Dermo Cosmetique | Composition synergique associant de l'acs et/ou de l'adn a de l'hydroxyproline ainsi que leurs applications en nutritherapie et en cosmetologie |
| WO2000049132A3 (en) * | 1998-10-08 | 2001-08-16 | Univ Hong Kong | Uses of transgenic animals containing a type x collagen mutant |
| CN113024636A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-25 | 宁波绿之健药业有限公司 | 一种具有缓解高尿酸血症和调节肠道菌群的六肽及其应用 |
-
1991
- 1991-08-21 JP JP3209606A patent/JPH0551400A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2770777A1 (fr) * | 1997-11-10 | 1999-05-14 | Fabre Pierre Dermo Cosmetique | Composition synergique associant de l'acs et/ou de l'adn a de l'hydroxyproline ainsi que leurs applications en nutritherapie et en cosmetologie |
| WO1999024046A1 (fr) * | 1997-11-10 | 1999-05-20 | Pierre Fabre Dermo-Cosmetique | Composition orale synergique associant de l'acs et/ou de l'adn a de l'hydroxyproline |
| WO2000049132A3 (en) * | 1998-10-08 | 2001-08-16 | Univ Hong Kong | Uses of transgenic animals containing a type x collagen mutant |
| CN113024636A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-06-25 | 宁波绿之健药业有限公司 | 一种具有缓解高尿酸血症和调节肠道菌群的六肽及其应用 |
| CN113024636B (zh) * | 2021-02-09 | 2022-01-18 | 宁波绿之健药业有限公司 | 一种具有缓解高尿酸血症和调节肠道菌群的六肽及其应用 |
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|---|---|---|---|
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