JP3499825B2 - 哺乳類の歯のプレセメント質及び／又はセメント質由来細胞走化性因子（ｃｃｔｆ）、その精製法及びそれを有効成分とする新結合組織付着促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、哺乳類の歯のプレセメント質及び／又はセ
メント質由来の細胞走化性因子（ＣＣＴＦ）、その精製
法及びそれを有効成分とする歯と歯肉と（歯根と歯根膜
と）の新結合組織付着の形成を促進する薬剤に関する。

背景技術 歯周病とは、歯垢（細菌の塊）が歯の支持組織（歯
肉、歯根膜、歯槽骨）を破壊する炎症性疾患であり、歯
科領域において、虫歯と並んで２大疾患といわれてい
る。

歯周病のうち重度のものは、外科的手法による歯周組
織の再構築が必要となる。その目的は、歯周ポケットの
除去のみならず、歯周病により破壊された歯周組織の再
生による咬合機能の回復にある。現在行われている代表
的な手術法は歯肉剥離掻爬術であるが、術後の治癒様式
は、セメント質の新生を伴った、歯根と歯根膜との真の
付着（新結合組織付着）はごく根尖側に限局しており、
他は理想的な付着とは言えない（上皮性の付着）。

このような背景から、近年、新結合組織付着を積極的
に獲得するため種々の方法が試みられている。中でも、
歯周組織再生誘導法（Guided tessue regenerationtech
nique：ＧＴＲ法）が注目を集めている。このＧＴＲ法
は、治癒しつつある歯周組織の欠損部に歯肉上皮や歯肉
真皮の細胞が入り込まないようにすることによって、そ
こに新しい結合組織付着と歯槽骨を作れる細胞を増殖さ
せて歯周組織を再生させようとする方法のことである。

この方法を概説すると、次のようになる。すなわち、
歯周病によって形成されたポケットを外科的に切除、歯
肉弁を剥離し、ポケットに対応する汚染セメント質を完
全に掻爬する。その後、歯根面を膜で覆い、歯肉を膜の
上において縫合する。

上記方法において、健全な歯周組織を再生させるため
には、歯肉線維芽細胞（以下、新結合組織付着形成細胞
と記す）の移動、付着、増殖及び分化を誘導し、歯根の
周りに新生セメント質を形成させ、新結合組織付着を得
ること、更には、歯槽骨の形成させることが必要であ
る。

しかし、現在一般的に行われている歯周病の治療法で
は、新結合組織付着及び歯槽骨の形成が不完全である。

本発明の目的は、新結合組織付着形成細胞の移動、付
着、増殖及び分化を誘導し、歯と歯肉と（歯根と歯根膜
と）の新結合組織付着の形成を促進する物質を提供する
こと、また、これを単離精製する方法を提供すること、
更には、これを有効成分とする、歯周病に羅患した歯の
健全な歯周組織を回復させるために用いられる、新結合
組織付着の形成を促進する薬剤を提供することにある。

発明の開示 本発明の目的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が６
７０００±１０００である哺乳類の歯のプレセメント質
及び／又はセメント質由来細胞走化性因子（ＣＣＴＦ）
により達成される。

また、本発明の目的は、哺乳類の抜歯からプレセメン
ト質及び／又はセメント質を採取し、生理食塩水中又は
コラゲナーゼ含有生理食塩水中に撹拌浸析することによ
り得られる溶出成分から、分子量分画、イオン交換吸着
クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロ
マトグラフィーによりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量６
７０００±１０００のプレセメント質及び／又はセメン
ト質由来細胞走化性因子（ＣＣＴＦ）を精製する方法に
よって達成される。

また、本発明の目的は、上記のプレセメント質及び／
又はセメント質由来細胞走化性因子（ＣＣＴＦ）を有効
成分として含有する新結合組織付着促進剤によって達成
される。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、既知の細胞接
着因子、細胞成長因子等について検討したところ、良好
なものはなく、更に研究を進めた結果、哺乳類の歯のプ
レセメント質及び／又はセメント質中に、細胞走化性を
有し、また、新結合組織付着形成細胞を侵入、増殖及び
分化させて結合組織に誘引する物質が存在することを見
出した。

また、哺乳類の抜歯から採取したプレセメント質及び
／又はセメント質を生理食塩水中又はコラゲナーゼ含有
生理食塩水中に撹拌浸析し、得られた溶出成分から、分
子量分画、イオン交換吸着クロマトグラフィー、ハイド
ロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーを行うことに
より、新規な細胞走化性因子（以下、ＣＣＴＦと記す）
を精製することが可能であることを見出し、本発明に到
達した。

また、上記ＣＣＴＦを有効成分とする、歯周病に羅患
した歯の健全な歯周組織を回復させるために有用な、新
結合組織付着の形成を促進する薬剤を見出した。

図面の簡単な説明 第１図は、プレセメント質及びセメント質の１％コラ
ゲナーゼ含有ｐＨ７生理食塩水抽出物のＴＳＫ・Ｇ３０
００とＴＳＫ・Ｇ４０００分取用カラムを直列につなぎ
ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーを行った溶出パタ
ーンである。

第２図は、第１図で得られた分子量２７〜２９万、５
８万及び６３万以上の細胞走化活性分画を混合濃縮後、
ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを行った溶出パ
ターンである。

第３図は、第２図で得られた細胞走化活性分画（Ｆ
ｒ．Ｎｏ．１３）を脱塩濃縮後、ＨＰＬＣハイドロキシ
アパタイトクロマトグラフィーを行った溶出パターンで
ある。

第４図は、第３図で得られた細胞走化活性分画（Ｆ
ｒ．Ｎｏ．１４）ＣＣＴＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量
を測定したパターンである（検出は銀染色）。

第５図は、抗ＢＳＰ−II抗体を用いたＣＣＴＦのウエ
スタンブロッティングのパターンである。

第６図は、抗ＢＭＰ−２抗体を用いたＣＣＴＦのウエ
スタンブロッティングのパターンである。

発明を実施するための最良の形態 本発明のＣＣＴＦは、哺乳類の歯のプレセメント質及
び／又はセメント質から得られる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分子量が６７０００±１０００の糖蛋白質であり、
細胞走化性を有し、新結合組織付着細胞の形成を促進す
る作用を有する。

このＣＣＴＦが、細胞接着因子であるフィブロネクチ
ン（分子量４５０Ｋｄ)、ビトロネクチン(分子量７６Ｋ
ｄ)でないことは、ＣＣＴＦがそれぞれに対する抗体で
細胞走化活性が阻害されなかったことから証明された。

更に、歯肉細胞の接着に関与するセメント質より得ら
れたＢＳＰ−II（分子量３３．６Ｋｄ、糖鎖含有では約
６０Ｋｄ)、歯槽骨の再生に関与するＢＭＰ−２（分子
量３０Ｋｄ）とはウエスタンブロッティングにより異な
ることが証明された。

また、骨の再生には、ＢＳＰ−II、ＢＭＰ−２以外
に、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）等が
関与していることが知られているが、これらの抗体すな
わち抗ＴＧＦ−β抗体および抗ＰＤＧＦ抗体によって、
ＣＣＴＦの細胞走化活性が阻害されないことから、ＣＣ
ＴＦはＴＧＦ−βやＰＤＧＦではないことが判明し、現
在までに報告されている細胞接着因子、細胞成長因子に
該当する物資がないことが明らかになった。

本発明のＣＣＴＦを得るためには、哺乳類から抜去し
た歯を使用する。哺乳類の中でも特に、食用目的等で大
量に飼育されており個体数が多いこと、歯の入手が容易
であること及び１本の歯から得られるＣＣＴＦの量が多
いことから、ウシの歯が好適に使用できる。

その精製法は、例えば、以下のようにして行う。

即ち、抜去した歯からスケーラー等で歯根膜繊維を除
去した後、鋭利なスケーラー等でプレセメント質及び／
又はセメント質を掻爬、０〜５％コラゲナーゼ含有のｐ
Ｈ７．０±０．５生理食塩水中に分散（プレセメント質
のみの場合はコラゲナーゼ不含有）し、撹拌等により蛋
白質成分を溶出する。溶出液から不溶物を遠心分離除去
し、更に、メンブランフィルター濾過を行い、その濾過
液をゲル濾過、限界濾過等の分子量分画法により分子量
２７万以上の分画を得る。

次に、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーにて
（ｐＨ７．５〜±０．５にて樹脂に吸着後）、５０±５
ｍＭトリスエタノールアミン塩酸緩衝液にて洗浄し、
０．２〜０．３Ｍ塩化ナトリウム含有の５０±５ｍＭト
リスエタノールアミン塩酸緩衝液で溶出してくる分画を
集め、脱塩濃縮する。

濃縮液をｐＨ６．６±０．３の１０±１ｍＭリン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトに吸着させ、
ｐＨ６．６±０．３の１０±１ｍＭリン酸緩衝液で洗浄
後、８０〜１１０ｍＭのリン酸で溶出してくる分画を集
める。

こうして得られた物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一な
６７±１Ｋｄのバンドを呈する。また、アミノ酸組成は
Ａｓｐ：１０．６±０．５％，Ｔｈｒ：３．７±０．３
％，Ｓｅｒ：１３．３±０．７％，Ｇｌｕ：１３．８±
０．７％，Ｇｌｙ：２３．３±１．２％，Ａｌａ：１
０．１±０．５％，Ｃｙｓ／２：３．６±０．３％，Ｖ
ａｌ：６．７±０．３％，Ｉｌｅ：３．８±０．３％，
Ｌｅｕ：７．３±０．４％，Ｌｙｓ：３．８±０．３％
であり、糖鎖を含む糖蛋白質である。等電点は６．５±
０．５である。

上記のようにして得られる糖蛋白質は、細胞走化性を
有する物質であり、更に、新結合組織付着促進の作用を
有するものである。

次に、上記のようにして得られた本発明のＣＣＴＦ
を、新結合組織付着促進剤として使用するには、例え
ば、コラーゲン膜、ゼラチン膜又は他の生分解性膜に染
み込ませた形状、或いは、塗布剤、皮下注射等により行
い、これらを患部に投与する。

具体的な使用方法としては、例えば、歯周病の治療法
である歯肉剥離掻爬手術に適用する場合に、汚染物質を
掻爬滑沢化した歯根面と歯肉との間に、コラーゲン膜、
ゼラチン膜又は他の生分解性膜に、本発明の細胞走化性
因子を浸み込ませた形態のものを挿入することによっ
て、手術後、新結合組織付着を促進させる方法が挙げら
れる。このようにして使用することにより、健全な歯周
組織を回復することが可能である。

実施例 以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。

実施例１ 屠殺牛から抜去したウシ歯４０本をまずスケーラーで
歯根膜繊維を可及的に除去した。次に、鋭利なスケーラー
でプレセメント質を含むセメント質を掻爬、１％コラゲ
ナーゼ含有ｐＨ７生理食塩水２０ｍｌに分散した。ボル
テックス（Automatic Mixer S-100,タイテック製）で１
０分撹拌後、蛋白質成分を溶出させた。次に不溶物を３
０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で除去し、上清液を得
た後、更に、孔径０．２２μのメンブランフィルター
（Durapore,Nippon Milli pore社製）にて濾過を行い、
その濾過液を濃縮し４ｍｌ（ブラッドフォード法による
蛋白量として１１ｍｇとし、ＴＳＫ・Ｇ３０００（内径
２．１５ｃｍ×長さ６０ｃｍ、東ソー製）とＴＳＫ・Ｇ
４０００（内径２．１５ｃｍ×長さ３０ｃｍ、東ソー
製）分取用カラムを直列につなぎ、ＨＰＬＣゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより分子量分画を行った。

４．２ｍｌづつ分取し、ヒト歯肉線維芽細胞を用いた
ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓａｓｓａｙ（細胞走化性検出
法）［KW.Falkら、Immununol.Methods，Vol.33，239-24
7(1980)］に従って活性分画を調べた。

すなわち、具体的には、96well microchemotaxis chamb
er(Neuro Probe，Cabin John，MD,USA)を使用し、チャ
ンバーの下部wellに各分子量分画を１０％含んだＤ−Ｍ
ＥＭ(無血清)を２５μｌ／ｗｅｌｌ分注した。なお、posi
tive controlとしてＤ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地
を、negative controlとしてＤ−ＭＥＭ（無血清）培地
を用いた。下部チャンバーの上に孔経８μｍのフィルタ
ー、ラバー、上部チャンバーの順に置き固定した。上部
チャンバーのｗｅｌｌに５×１０⁵sells/mlのヒト歯肉
線維芽細胞を含むＤ−ＭＥＭ培地を５０μｌ／ｗｅｌｌ
分注した。３７℃、５％ＣＯ₂−９５％ａｉｒの条件下
で、３時間培養した。培養後、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｈ染
色液（International Reagents &Co.,Japan)に固定、染
色して、水洗後風乾した。メンブランフィルターの下面
にまで遊走した細胞数を計測した。計測法としては、接
眼レンズ（×１０）内に方眼ミクロメータを挿入した光
学顕微鏡(対物レンズ×２０)にて観察し、各ｗｅｌｌに
おけるhigh powerfield内の細胞数を計測した。

その結果、分子量約５８万以上のフラクション４０〜
４１（以下、Ａ分画と記す）及び分子量約２７〜２９万
のフラクション４７〜７９（以下、Ｂ分画と記す）で細
胞走化活性が認められた。その結果を第１図に示す。

また、このＡ分画及びＢ分画は、ＴＧＦ−β，ＢＳＰ
−II活性を示さず、また６０℃、３０分の処理で失活し
なかった。

既に、Ａ分画及び及びＢ分画はＤＥＡＥイオン交換ク
ロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィーで精製すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで同一の分子
量バンドを示すことが準備実験で判明していたので、一
緒にして限外濾過で濃縮して２ｍｌとし、ｐＨ７．５に
てＤＥＡＥイオン交換樹脂（ＴＳＫ・ＤＥＡＥ−３Ｓ
Ｗ、東ソー製）に吸着させた後、ＤＥＡＥイオン交換ク
ロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−３ＳＷ：内径７．５ｍｍ
×長さ７．５ｃｍ、東ソー製）にて、５０ｍＭトリスエ
タノールアミン塩酸緩衝液で洗浄し、０〜０．５Ｍ塩化
ナトリウムの５０ｍＭトリスエタノールアミン塩酸緩衝
液でグラジエント溶出し、１ｍｌづつ分取し、上記細胞
走化性検出法にて活性分画を調べたところ、０．２〜
０．３ Ｍ塩化ナトリウム含有の５０ｍＭトリスエタノ
ールアミン塩酸緩衝液で溶出してくる分画に活性を認め
た。その結果を第２図に示す。

次に、それぞれの活性分画を脱塩濃縮し、この濃縮分
画をｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したハ
イドロキシアパタイトクロマトグラフィー（内径１０ｍ
ｍ×長さ１０ｃｍ、高研製）にてｐＨ６．８の１０ｍＭ
リン酸緩衝液で洗浄し、０〜２００ｍＭのリン酸グラジ
エント溶出を行い、１．５ｍｌづつ分画した。細胞走化
性検出法にて活性分画を調べたところ、８０〜１１０ｍ
Ｍのリン酸で溶出してくる分画に細胞走化性活性が認め
られた。その結果を第３図に示す。

この分画を脱塩濃縮して、ＣＣＴＦを７００ｎｇ得
た。こうして得られたＣＣＴＦは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
単一な６７±１Ｋｄのバンドを呈した。その結果を第４
図に示す。

また、このバンドは抗ＢＳＰ−II抗体、抗ＢＭＰ−２
抗体を用いたウエスタンブロッテイングで染色されなか
ったのでＣＣＴＦはＢＳＰ−II、ＢＭＰ−２ とは異な
る物質であることが判明した。（第５図、第６図）。

また、得られたＣＣＴＦのアミノ酸組成はＡｓｐ：１
０．６％，Ｔｈｒ：３．７％，Ｓｅｒ：１３．３％，Ｇ
ｌｕ：１３．８％，Ｇｌｙ：２３．３％，Ａｌａ：１
０．１％， Ｃｙｓ／２：３．６％，Ｖａｌ：６．７
％， Ｉｌｅ：３．８％，Ｌｅｕ：７．３％， Ｌｙ
ｓ：３．８％であり、糖鎖を含む糖蛋白質であった。ま
た、等電点は６．５±０．５であった。

次に、５％コラーゲン溶液（タイプＩ−Ａ）４ｍｌを
作成、これに上記ＣＣＴＦ２００ｎｇを添加した。これ
を、２４穴プレート（１穴；底面積１．７７ｃｍ²，高
さ２cm）に１穴当たり０．４ｍｌ分注し、開放系で重合
させた。３０分後に、そのコラーゲンゲル上に５×１０
⁴個のヒト歯肉線維芽細胞を播種、３日間３７℃、５％
炭酸ガス存在下で培養し、電顕試料を作製、エポン包埋
し、トルイジンブルー染色を施した。播種したヒト歯肉
線維芽細胞の、ＣＣＴＦ含有コラーゲン内への侵入距
離、細胞数を光学顕微鏡にて鏡検測定した。

また、無添加、フィブロネックチン添加、ＴＧＦ−β
添加、ＰＤＧＦ添加及びＣＣＴＦと抗ビトロネクチン抗
体添加についても同様に実施した。その結果を表１に示
す。

表１に示すように、ＣＣＴＦを添加した場合、無添
加、フィブロネクチン添加、ＴＧＦ添加、ＰＤＧＦ添加
に比べて、コラーゲンゲル内への侵入細胞数、侵入距離
共に有意に高い値を示した。また、ＣＣＴＦのこれらの
作用は、抗ビトロネクチン抗体で活性が阻害されること
はなかった。

（実施例２） 屠殺牛から抜去したウシ歯４０本を、まず、スケーラ
ーで歯根膜繊維を可及的に除去した。次に鋭利なスケー
ラーでプレセメント質及びセメント質を掻爬し、１％コ
ラゲナーゼ含有ｐＨ７生理食塩水中２０ｍｌに分散し
た。ボルテックス（Automatic Mixer S-100,タイテック
製）で１０分間撹拌後、蛋白質成分を溶出させた。次
に、不溶物を３０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で除去
し、上清液を得た後、更に、孔径０．４５μのメンブラ
ンフィルター（Durapore,Nippon Millipore社製）にて
濾過を行い、その濾過液を、分画分子量２０万限外濾過
膜で濃縮し４mlとした。

次に、ｐＨ７．５にてＤＥＡＥイオン交換カラム樹脂
に吸着させた後、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ
ー（ＤＥＡＥ−３ＳＷ：内径７．５ｍｍ×長さ７．５ｃ
ｍ、東ソー製）にて、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの５
０ｍＭトリスエタノールアミン塩酸緩衝液でグラジエン
ト溶出し、０．２〜０．３Ｍ塩化ナトリウム含有の５０
ｍＭトリスエタノールアミン塩酸緩衝液で溶出してくる
分画を集め、脱塩濃縮した。

次に、この濃縮分画をｐＨ６．６の１０ｍＭリン酸緩
衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー（内径１０ｍｍ×長さ１０ｃｍ、高研製）にか
け、０．２００ｍＭのリン酸グラジエント溶出を行い、
８０〜１１０ｍＭのリン酸で溶出してくる分画を集め、
脱塩濃縮して、ＣＣＴＦを７３０ｎｇ得た。こうして得
られた物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一な６７±１Ｋｄ
のバンドを呈した。

また、このバンドは抗ＢＳＰ−II抗体、抗ＢＭＰ−２
抗体を用いたウエスタンブロッテイングで染色されなか
ったのでＢＳＰ−II、ＢＭＰ−２とは異なることが判っ
た。

次に、５％コラーゲン溶液（タイプＩ−Ａ）１０ｍｌ
を作成、これに上記ＣＣＴＦを６００ｎｇを添加混合
し、２ｍｍ厚に流し込み、凍結乾燥することにより、Ｃ
ＣＴＦ含有コラーゲン膜を作製した。これを使用直前に
２時間紫外線殺菌した。

サルの上顎の左右の切歯と測切歯の唇側の歯肉弁剥離
翻転し歯槽骨を根尖側方向へ約４ｍｍの削除し、歯根を
露出させ、表面のセメント質を掻爬し、なめらかにした
後、左側の露出歯根面をＣＣＴＦ含有コラーゲン膜で覆
い、右側は露出歯根面はそのままの状態で、歯肉弁を元
に戻し縫合した。手術後、治癒が認められるまでの３週
間は毎日プラークコントロールを施した。

３週間後に屠殺、潅流固定後、組織ブロックを採取
し、パラフィン切片を作製、Ｈ−Ｅ染色を施し、組織学
的観察を行った結果、左側のＣＣＴＦ含有コラーゲン膜
を施した方には新結合組織付着の形成が認められた。ま
た、歯槽骨の形成も認められた。一方、右側にはそのい
ずれも認められなかった。

産業上の利用可能性 請求の範囲第１項に係る発明は、歯周組織の欠損部に
適用することによって、新結合組織付着の形成が促進さ
れ、健全歯周組織を回復させるために、適用可能なＣＣ
ＴＦを提供するものである。

また、請求の範囲第４項に係る発明の精製法により、
本発明のＣＣＴＦを効率良く、抽出、精製することがで
きる。

また、請求の範囲第７項に係る発明により、歯と歯肉
と（歯根と歯根膜と）の新結合組織付着の形成を促進す
る薬剤を提供することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/52 A61K 35/32 A61K 38/02 A61P 1/02 A61K 6/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】(補正後）生理食塩水に溶解し、ＳＤＳ−
   ＰＡＧＥによる分子量が６７０００±１０００である哺
   乳類の歯のプレセメント質及び／又はセメント質由来繊
   維芽細胞走化性因子（ＣＣＴＦ)。
2. 【請求項２】(補正後）アミノ酸組成がＡｓｐ：１０．
   ６±０．５％，Ｔｈｒ：３．７±０．３％，Ｓｅｒ：１
   ３．３±０．７％，Ｇｌｕ：１３．８±０．７％，Ｇｌ
   ｙ：２３．３±１．２％，Ａｌａ：１０．１±０．５
   ％，Ｃｙｓ／２：３．６±０．３％，Ｖａｌ：６．７±
   ０．３％，Ｉｌｅ：３．８±０．３％，Ｌｅｕ：７．３
   ±０．４％，Ｌｙｓ：３．８±０．３％の糖鎖を含む糖
   タンパクで、等電点が６．５±０．５であることを特徴
   とする請求の範囲第１項に記載の繊維芽細胞走化性因子
   （ＣＣＴＦ)。
3. 【請求項３】(補正後）哺乳類がウシであることを特徴
   とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の繊維芽細胞
   走化性因子（ＣＣＴＦ)。
4. 【請求項４】(補正後）哺乳類の歯のプレセメント質及
   び／又はセメント質から蛋白質成分を溶出し、分子量分
   画、イオン交換吸着クロマトグラフィー、ハイドロキシ
   アパタイト吸着クロマトグラフィーにより、特許請求の
   範囲第1項から第3項のいずれか1項記載の哺乳類のプレ
   セメント質及び／又はセメント質由来繊維芽細胞走化性
   因子（ＣＣＴＦ）を精製する方法。
5. 【請求項５】(補正後)（ａ）哺乳類の抜歯からプレセメ
   ント質及び／又はセメント質を採取し、生理食塩水中又
   はコラゲナーゼ含有生理食塩水中に攪拌浸析することに
   より蛋白質成分を溶出し、 （ｂ）工程（ａ）の溶出液から不溶物を遠心分離及び濾
   過により除去し、その濾過液からゲル濾過、限外濾過等
   の方法により分子量２７万以上の分画を得、 （ｃ）工程（ｂ）で得た分画をＤＥＡＥイオン交換樹脂
   に吸着させ、０．２〜０．３ｍＭ塩化ナトリウム含有ト
   リスエタノールアミン塩酸緩衝液で溶出してくる分画を
   集め、脱塩濃縮し、 （ｄ）工程（ｃ）で得た濃縮液をリン酸緩衝液で平衡化
   したハイドロキシアパタイトに吸着させ、８０〜１１０
   ｍＭのリン酸で溶出してくる分画を集めることを特徴と
   する請求の範囲第４項に記載の繊維芽細胞走化性因子
   （ＣＣＴＦ）を精製する方法。
6. 【請求項６】(補正後）哺乳類がウシであることを特徴
   とする請求の範囲第４項又は第５項に記載の繊維芽細胞
   走化性因子（ＣＣＴＦ）を精製する方法。
7. 【請求項７】(補正後）請求の範囲第１項乃至第３項記
   載の哺乳類の歯のプレセメント質及び／又はセメント質
   由来繊維芽細胞走化性因子（ＣＣＴＦ）を有効成分とす
   る新結合組織付着促進剤。