KR100450146B1 - 발치된 치아로부터 치아 단백질의 추출방법과 그의이용방법 - Google Patents

Abstract

발치된 치아를 법랑질을 제거하지 않고 치아 전체를 증류수로 세척하는 단계, 치아를 분쇄하여 수세하고 유기용매를 사용하여 탈지한 후, 탈회하는 단계, 탈회된 시편을 다시 탈지하고 수세한 후에 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 단백질의 추출방법이 개시된다.

Description

발치된 치아로부터 치아 단백질의 추출방법과 그의 이용방법{Method for extracting tooth protein from extracted tooth}

본 발명은 치아 법랑질을 제거하지 않고 치아 단백질의 추출효율을 높이는 추출방법과 PVDF막을 이용한 치아 단백질의 분리 흡착방법 및 치아단백질의 기능, 그의 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 법랑질을 제거하지 않고 치아단백질을 추출하여 치아 단백질의 추출효율을 증대시키고, 생체반응 시편의 제작을 간소화할 수 있도록 PVDF막을 이용한 치아 단백질의 분리 흡착방법을 통해 그 기능을 쉽게 파악하고 이를 의학적 용도에 응용하는 것에 관한 것이다.

일반적으로 치아단백질은 여러 가지 유전자에서 발현되는 다양한 종류의 치아단백질을 함유하고 있다. 그러나, 이러한 치아단백질의 정확한 구성요소에 대한 연구는 아직 미약한 상태이고 많은 학자들이 생화학적 정제를 시도하였지만 현재로서는 몇 가지 해결해야할 문제점이 남아있는 상태이다.

첫째로 치아 내에 존재하는 단백질의 양이 소량이라는 점과, 둘째로 단백질을 정제한 후 검정하는 과정이 힘들고 시간이 많이 소요된다는 점이다. 이러한 장애요소를 극복하기 위해 단백질 추출 효율을 증대시키고, 동시에 추가적인 술식없이 아미노산 서열을 확인할 수 있는 방법과 소량의 단백질을 이용한 생체반응 시편제작을 간소화하는 방법을 찾고자 시도하였고, 또한 단백질의 기능을 확인하고자 하였다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 치아의 단백질 추출 효율을 증대시키고, 동시에 추가 공정 없이 아미노산 서열을 확인할 수 있는 PVDF막을 이용한 치아 단백질의 추출방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 소량의 단백질을 이용한 생체반응 시편을 제작할 수 있는 PVDF막을 이용한 치아 단백질의 분리 흡착방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 치아 단백질의 기능 규명에 있고 이 기능을 이용할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 치아 단백질 시편의 단백질 추출량을 도시한 그래프이다.

도 2a 내지 도 2d는 범랑질을 제거한 치아 단백질을 수컷 흰쥐의 근육에 매식하고 6주 후에 방사선 촬영한 사진이다.

도 3a 내지 도 3d는 본 발명에 따라 범랑질을 제거하지 않은 치아 단백질을 수컷 흰쥐의 근육에 매식하고 6주 후에 방사선 촬영한 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 치아 단백질 띠를 분석한 사진이다.

도 5는 도 4의 단백질 띠 중에서 66kD의 아미노산 순서를 분석한 사진이다.

도 6a 내지 6b는 66kD 단백질이 PVDF상에 블롯되고, 수컷 흰쥐의 근육에 매식하여 2주 후에 관찰한 사진이다.

본 발명에 따르면, 발치된 치아를 법랑질을 제거하지 않고 치아 전체를 증류수로 세척하는 단계, 치아를 분쇄하여 수세하고 유기용매를 사용하여 탈지한 후, 탈회하는 단계, 탈회된 시편을 다시 탈지하고 수세한 후에 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 단백질의 추출방법이 개시된다.

바람직하게, 주요분획을 전기영동하는 단계와, 전기영동으로 분리된 치아 단백질을 PVDF막에 흡착시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

PVDF막을 이용함으로써 생체내 매식시 이물반응 없이 분리한 단백질을 그대로 함유한 채로 약물 전달체로서 사용할 수 있다.

또한, 추출한 치아 단백질은 전달물질로 키토산에 흡착시키며, 바람직하게, 파이버(fiber), 파이브렐(fibril), 섬유, 거즈모양, 스폰지, 종이 형태, 겔(gel)형태, 액체형태, 연고형태, 가루형태, 고체 형태 또는 이들의 혼합 형태를 구비한 수용성 및 불용성 키토산에 치아단백질을 코팅하거나 함유시킬 수 있다.

추출한 치아 단백질을 석회화 및 골화에 이용할 수 있으며, 제조된 물질을골 형성물질로 이용하며, 전달물질 혹은 골 대체물질에 코팅하거나 함유시켜 골을 형성시키는데 이용한다.

또한, 제조된 물질을 치아의 치수노출시 펄프 캡핑(pulp caping), 펄프 챔버(pulp chamber)를 치유하는데 이용 가능하며, 전달물질 혹은 펄프 캡핑, 펄프 챔버 필링(pulp chamber filling) 물질에 코팅하거나 함유시켜 이용한다.

또한, 제조된 물질을 치아의 근관치료시 이용가능하고, 전달물질 혹은 근관충전제에 코팅하거나 함유시켜 이용한다.

또한, 제조된 물질을 치아주위 조직의 치조골 결손시 치조골이 형성되도록 전달물질에 코팅하거나 함유시켜 치아주위에 이용한다.

제조된 물질을 발치후 발치한 곳의 치유 및 골 형성을 촉진하도록 전달물질에 코팅하거나 함유시켜 발치창에 이용한다.

제조된 물질을 조직공학적 혹은 생체 분자공학적 치아 제작시(bioengineering of the tooth) 치아형성제작에 이용하거나 거푸집(scaffold)에 코팅하거나 함유시켜 이용한다.

본 발명에 따르면, 전달물질은 파이버(fiber)형태, 파이브렐(fibril)형태, 섬유모양, 거즈모양, 스폰지형태, 종이 형태, 겔 형태, 액체형태, 연고형태, 고체 형태 및 이들의 혼합형태의 생체 이용가능한 천연고분자 혹은 고분자, 세라믹, 금속, 섬유, 종이, 콜라겐, 실라스틱, 생체조직 및 이의 혼합물질을 포함한다.

이하, 본 발명의 보다 상세한 이해를 위하여 본 발명의 실시예를 단계별로 상세히 상술한다.

1. 치아 단백질의 해리성 추출

발거한 사람의 치아에서 기계적으로 법랑질(enamel)을 제거한 후, 남아있는 상아질을 과산화수소와 증류수에 세척하여 시편 1로 분류하였다. 그리고, 동일한 치아에서 법랑질을 제거하지 않고 치아전체를 과산화수소와 증류수로 세척하여 시편 2로 분류하였다.

그 후, 각각의 시편을 액화질소 하에서 약 1㎣ 크기까지 분쇄한 후, 증류수로 수세하고 메탄올과 클로로포름의 혼합용액을 사용하여 12시간 동안 탈지한 후에 0.5N 염산으로 섭씨4도에서 72 시간 동안 탈회하였다.

탈회된 각 시편을 다시 6시간 동안 메탄올과 클로로포름의 혼합용액을 사용하여 탈지 및 수세한 후에 총량의 10배의 4M 구아니딘-염산(guanidine HCl, pH 5.2, 4℃)을 이용하여 96시간 동안 추출하였다.

추출된 용액을 4℃에서 10,000rpm으로 1시간동안 원심 분리한 후 상층액을 흡광분석기(Spectrophotometer)를 이용하여 단백질의 농도를 확인하고 농축기(Diafol membrane YM-10: 10,000 molecular weight cut-off, Amicon, Bedford, MA)로서 1:5로 농축시켜 표 1에 나타내었다.

2. 겔 크로마토그래피에 의한 분리(Fractionation by gel chromatography)

시편 1 및 시편 2에서 농축된 추출물을 4mol/L 구아니딘-염산(guanidine-HCl, pH 5.2, 시편 1: 0.1mg/ml, 시편 2: 1mg/ml)에 녹여 세파덱스 G-75 겔 크로마토그래피(Sephadex G-75 gel chromatography: 2.5 x 100 cm)를 이용하여 흐름을30ml/L로 조정하여 4.0ml으로 분획하고, 280nm에서 UV 분광측정기(Ultrospec2000 UV/Visible Spectrophotometer, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 이용하여 분석하여 표 1 및 도 1에 나타내었다.

	초기량 (g)	Gu-HCl 추출물 (L)	농축 단백질의 량 (mg/ml)
시편 1	300	2	1.0
시편 2	600	4	3.5

표 1에 나타낸 바와 같이 시편 1에서 추출된 단백질량은 1.0mg/ml이었고, 시편 2에서는 3.5mg/ml이었다. 즉, 시편 1과 동일한 량의 시편 2를 사용하더라도 시편 1보다 높은 농축 단백질을 얻을 수 있다.

또한, 도 1에 도시한 바와 같이, 세파덱스 G-75 겔 크로마토그래피로 분석한 바와 같이 시편 1에서는 29-30에서 정점을 이루고 있으며, 시편 2에서는 38-39에서 정점을 이루고 있다.

3. 총 단백질의 검정(Bioassay of total protein)

50-200㎛의 다공성 표면을 가진 성형가공된 키토산을 단백질 전달물질(carrier)로 사용하였다. 체중 200g 내외의 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley rat)를 럼푼(20 mg/ml, Rompun, Baeyer Korea Co., Seoul, Korea)과 케타민(100 mg/ml, Ketalar, Yuhan Co., Seoul, Korea)을 1:4로 혼합한 주사액 0.1ml/100g을복강내 주입하여 전신마취를 유도한 후, 시편 1의 단백질(200mg)을 24시간 흡착한 지름 8.0㎜, 높이 2.0㎜의 키토산 원판과 시편 2의 단백질(200mg)을 24시간 흡착한 지름 8.0㎜, 높이 2.0㎜의 키토산 원판을 허벅지 근육에 매식하였다.

수술 후 2, 4, 6 및 8주가 되는 시기에 전신마취 주사액을 과량 주사하여 각각 2마리씩 희생한 후, 방사선 사진(거리 20cm, 70 kVp, 10mA)을 촬영하고 조직편을 채취하여 10% 중성 포르말린에 24시간 고정한 후, 5% 질산에 넣어 탈회과정을 거치고 파라핀 포매를 하여 4㎛ 두께로 절단한 후에 hematoxilin-eosin(HE) 염색법으로 염색하고 광학현미경하에서 관찰하여 각각 도 2a 내지 도 3d에 나타내었다.

도 2a 내지 도 2d는 키토산에 시편 1을 매식하고 6주 후에 채취한 표본을 X-레이 방사선을 조사한 마이크로 사진을 나타낸 것으로, 화살표는 불투명한 물질을 나타낸다.

도 2a 내지 도 2d를 간단히 설명하면, 도 2a는 키토산 블록이 섬유조직(화살표)에 둘러싸여 있는 것을 나타내고, 도 2b는 HE 염색으로 원조직을 40배 확대한 것이고, 도 2c는 도 2b의 HE 염색으로 원조직을 400배 확대한 것이고, 도 2c는 석회질이 제거된 부분을 HE 염색으로 원조직을 400배 확대한 것으로 얇은 조골 세포림이 키토산 블록에서 관찰되었으며, 도 2d는 석회질이 제거된 부분을 HE 염색으로 원조직을 400배 확대한 것이다.

또한, 도 3a 내지 도 3d는 시편 2를 매식하고 6주 후에 채취한 표본을 X-레이 방사선을 조사한 마이크로 사진을 나타낸 것으로, 화살표는 불투명한 물질을 나타낸다.

도 3a 내지 도 3d를 간단히 설명하면, 도 3a는 키토산 블록이 섬유조직(화살표)에 둘러싸여 있는 것을 나타내고, 도 3b는 HE 염색으로 원조직을 40배 확대한 것으로 라이닝세포(화살표)가 키토산 블록에서 관찰되지 않고, 도 3c는 석회질이 제거된 부분을 HE 염색으로 원조직을 200배 확대한 것이며, 도 3d는 석회질이 제거된 부분을 HE 염색으로 원조직을 400배 확대한 것이다.

도 2와 같이, 시편 1을 매식 후 채취한 표본에서는 골형성 소견을 보였으나, 성형가공된 키토산만을 매식한 군에서는 골형성의 소견을 보이지 않았으며, 도 3과 같이, 단백질을 흡착한 군에서는 6주 방사선 사진에서 방사선 불투과성을 보여 골 형성이 됨을 알 수 있었다..

4. SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

주요 분획을 래밀리 시스템(Laemmli system)을 따른 호퍼 SE 280 Tall Mighty 소형 전기영동장치(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA)를 사용하여 12% 아실아미드 그래디언트 겔(acrylamide gradient gel) SDS-PAGE법으로 전기영동하였다(3시간 동안 4℃에서 70V로 0.1% SDS 당 20mmol/l 트리스-글리신, pH 8.5로 함).

전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue R 250(30% 메탄올/10% 아세트산)을 사용하여 2 시간동안 염색을 한 후 5% 메탄올/ 7% 아세트산을 사용하여 탈색하여 단백질띠의 분석을 도 4에 나타내었고, 아미노산의 순서를 분석하여 도 5에 나타내었다.

도 4에 도시한 바와 같이, 시편 1에서 추출된 단백질 SDS-PAGE에서 분자량 14-66 kD사이에 명확한 단백질띠로 분리되었다. 이때, SM 1과 2는 치아로부터 추출된 단백질이고, SM 3과 4는 법랑질을 제거한 치아로부터 추출한 단백질이다. 또한 도 5에 도시한 바와 같이 아미노산 분석결과 66 kD의 분자량을 갖는 단백질이 가장 뚜렷하게 나타났다.

5. 블롯 방법(Blotting method)

전기영동으로 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride, 0.45㎛)막에 반건조 블롯 장치(mini VE, 호퍼 사이언티픽 인스트루먼트사)를 이용하여 흡착시켰다(0.8 mA/㎠). PVDF막을 증류수에 수세한 후 Coomassie BR을 사용하여 염색한 후 각각의 단백질의 위치를 확인하였다. 필요한 부위를 잘라서 50% 에탄올로 소독을 한 후 20℃ 에서 보관하였다.

6. 치아단백질의 기능규명(Bioassay of tooth protein)

PVDF막에 분리 흡착된 각 단백질의 조직반응을 관찰하기 위하여 66kD의 단백질띠 부분을 잘라내어 흰쥐 근육 내에 삽입하고 1, 2, 3, 4주 후, 그 조직반응을 방사선학적 방법 및 조직학적 방법으로 관찰하여 도 6에 나타내었다.

그 결과, PVDF막 자체는 매식시 이물반응을 보이지 않았다. 그러나, 분리 흡착시킨 치아단백질을 근육조직 내에 매식했을 때, 알부민을 흡착시킨 PVDF막 주변에는 다핵거대세포가 출현하였으나, 치아에서 추출한 단백질과 알부민을 혼합하여흡착시킬 때에는 매식체 주변에서 석회화 양상을 관찰할 수 있었다.

도 6a와 같이 실험 1주일에서 PVDF막 주변에 섬유아세포(fibroblast)와 중간엽 세포(mesenchymal cell)가 모여있었고, 2주일에서 알부민을 흡착시킨 PVDF막 주변에는 다핵 거대세포가 출현하였다. 3, 4주에서 PVDF막 주위로 섬유성막이 형성되었다.

대조군으로 PVDF막만 매식한 경우에는 도 6b와 같이 염증반응은 보이지 않았고, 2, 3, 4주가 경과되어도 염증반응은 보이지 않고 섬유화만 관찰되었다.

상기 치아 단백질을 western blotting 시 BMP4(골 형성 단백질 4) antibody에 반응하는 걸로 보아 치아단백질내에는 골형성단백질이 포함되어 있음을 알 수 있고, 따라서 치아 단백질은 그 자체가 석회화 및 골 형성에 관여하는 기능이 있음을 알 수 있다.

7. 아미노산 순서(Amino acid sequencing)

흡착된 단백질은 PVDF막에서 1mm 크기로 잘라서 아미노산 분석기에서 아미노산 순서를 확인하였다.

시편 1을 PVDF막에 흡착시키 것 중 가장 뚜렷한 양상을 보인 띠를 아미노산 서열을 분석하여 처음 12개의 순서를 얻어 전체 서열을 찾아보았다. 66 kD 단백질은 표 2와 같이 사람 알부민으로 판명되었다.

66kDprotein

1 510Ala-His-Lys-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp

8. 치아단백질의 의학적 응용

1) 치아단백질은 골형성 단백질 및 알부민 등을 포함하는 혼합 단백질로서 그 자체만으로 석회화 및 골화하는 기능이 있다는 특징을 골 형성이나 석회화를 필요로 하는 곳에 이용할 수 있다.

2) 치아단백질을 골 형성물질로 이용하는 방법으로 전달물질 혹은 골 대체물질에 코팅하거나 함유시켜 골을 형성시키는데 이용하는 방법으로 교통사고나 종양으로 인한 골 결손부위를 재건하는데 이용한다.

3) 치아단백질은 치아의 치수노출시 이를 펄프 캡핑(pulp caping)하는데 이용 가능하고 전달물질(carrier) 혹은 펄프 캡핑(pulp caping) 물질에 코팅하거나 함유시켜 이용한다. 즉, 전달물질로 키토산 가루나 겔을 이용하여 여기에 치아 단백질을 함유시켜 펄프 캡핑한다. 파이버(fiber)나 파이브렐(fibril) 형태의 키토산에 이 치아단백질을 함유시켜 일부 펄프 챔버(Pulp chamber)를 제거하고 나머지 부위를 보존하고자 할 때도 이용한다.

4) 치아단백질은 치아의 근관치료시 이용가능하고 즉 전달물질 혹은 근관충전제에 코팅하거나 함유시켜 이용한다. 즉 전달물질로 키토산 콘이나 겔(gel)을 이용하여 여기에 치아 단백질을 함유시켜 근관을 충전한다. 파이버(fiber)나 파이브렐(fibril) 형태의 키토산을 콘모양으로 만들어 여기에 이 치아단백질을 함유시켜 치아의 근관 내부에 필링(filling)한다. 키토산은 그 자체만으로도 항균 및 창상 치유 효과가 있어 근관내의 염증이나 삼출물(exudate)을 파이버 형태의 키토산 콘으로 흡착시켜 제거한후 이를 필링 물질로 이용한다. 즉 키토산 뿐만 아니라 기타 치아 루트카날 필링물질(root canal filling material)에 이 치아 단백질을 코팅하거나 함유시켜 필링한다.

5) 치아단백질은 치아주위 조직의 염증으로 인한 치조골 결손시 치조골이 형성되도록 전달물질에 코팅하거나 함유시켜 이용한다. 즉 전달물질로 키토산을 파이버(fiber)나 파이브렐(fibril) 형태 혹은 겔이나 멤브레인(membrane) 형태로 만들어 여기에 이 치아단백질을 함유시켜 치아 주위의 치조골 결손 부위에 삽입하거나 도포하여 골 형성을 유도한다.

6) 치아단백질은 발치후 발치한 곳의 치유 및 골 형성을 촉진하도록 전달물질에 코팅하거나 함유시켜 이용한다. 즉, 전달물질로 키토산 콘이나 겔을 이용하여 여기에 치아 단백질을 함유시켜 발치공간을 필링한다. 파이버나 파이브렐 형태의 키토산을 콘모양 혹은 거즈모양으로 만들어 여기에 이 치아단백질을 함유시켜 치아의 발치한 공간에 필링한다. 즉 치아 발치창 속에 키토산의 창상 치유 기능을 이용하고 치아단백질의 골 형성 기능을 가미하도록 이 전달물질에 치아 단백질을 코팅하거나 함유시켜 발치 창상의 출혈 방지 및 창상속으로 이물질 삽입기능과 함께 골 형성을 유도하는 골 대체물로 이용한다.

7)치아 단백질은 조직공학적 혹은 생체 분자공학적 치아 제작시(bioengineering of the tooth) 치아형성제작에 이용한다. 태아의배(embryo)에서 턱 뼈가 되고 그 부위에서도 치아가 되는 브랜치얼 아크(branchial arch) 부위를 organ culture하여 치아를 생체분자공학적으로 제작할 경우 이 치아 단백질을 비드(bead) 에 함유시켜 이 비드를 치아가 형성될 부위에 적용하여 치아의 성장발육을 유도함으로써 치아 성장 및 주위의 골 조직 형성 촉진에 이용한다.

또한 원하는 모양의 뼈나 턱뼈를 만들 경우, 그 모양의 거푸집(scaffold)을 만들어 여기에 이 치아 단백질을 코팅하거나 함유시켜 필요한 장기를 조직공학적으로 만드는데 이용한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 치아 단백질 추출방법은 법랑질을 제거하지 않고도 치아단백질을 추출할 수 있어 시간과 노력을 절약할 수 있고 그 분리 흡착방법은 단백질을 용이하게 분리 흡착할 수 있으며 분리 흡착된 단백질의 양은 아미노산 분석 및 생체 실험을 할 수 있는 정도로 충분한 이점이 있다.

또한, PVDF막 자체는 매식시 이물반응을 보이지 않을 뿐만 아니라, 분리 흡착시킨 치아단백질을 근육조직 내에 매식했을 때, 알부민을 포함하는 혼합된 치아단백질을 흡착시켜 매식했을 때 매식체 주변에서 석회화양상을 관찰할 수 있는 특징을 상기 기술한 바와 같이 의학적 용도로 이용할 수 있는 이점이 있다.

또한, PVDF막을 이용함으로써 전기 영동으로 분리한 단백질을 쉽게 흡착할 수 있고, 생체내 매식시 이물반응 없이 분리한 단백질을 그대로 함유한 채로 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 또한, 동시에 PVDF막을 이용하여 분리된 단백질을 생체검증에 간편하게 이용할 할 수 있다.

따라서 치아 단백질은 그 자체가 석회화 및 골 형성에 관여하는 기능이 있음을 알 수 있고 이를 이용하여 골 형성이 필요로 하는 곳이나 석회화를 필요로 하는 곳에 이용할 수 있다.

이때 이 치아단백질 자체만으로 이용할 수 있으나 이를 전달할 수 있는 전달물질을 이용하면 더 안전하게 치아단백질의 성능을 유지할 수 있다. 본 실험 증례에서는 키토산을 전달물질로 이용하여 실험하였는데 이 키토산을 우리가 응용하고자 하는 용도에 맞게 전달물질 형태를 디자인하여 이용함으로써 키토산 자체의 창상치유 능력, 항균능력, 생체적응성, 생체흡수성 성능을 이용하여 여기에 이 치아단백질을 코팅하거나 함유시켜 골 형성이나 석회화 성능을 극대화할 수 있는 이점이 있다. 이때, 전달물질은 그 형태를 파이버형태, 파이브렐형태, 섬유모양, 거즈모양, 스폰지형태, 종이 형태, 겔형태, 액체형태, 연고형태, 고체 형태 및 상기 혼합형태의 생체 이용가능한 천연고분자 혹은 고분자, 세라믹, 금속, 섬유, 종이, 콜라겐, 실라스틱, 생체조직 및 이의 혼합물질을 이용하여 다양하게 이용할 수 있다.

Claims (13)

1. 발치된 치아를 법랑질을 제거하지 않고 치아 전체를 증류수로 세척하는 단계;

   상기 치아를 분쇄하여 수세하고 유기용매를 사용하여 탈지한 후, 탈회하는 단계;

   상기 탈회된 시편을 다시 탈지하고 수세한 후에 단백질을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 단백질의 추출방법.
2. 제 1 항에 있어서, 주요분획을 전기영동하는 단계와, 상기 전기영동으로 분리된 치아 단백질을 폴리불화비닐라덴(Polyvinylidene difluoride; PVDF)막에 흡착시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 치아 단백질의 추출방법.
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