JP2002051798A - 骨芽細胞分化促進剤の探索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 短時間で行うことのできる骨芽細胞分化促進
剤の探索方法を提供すること。 【解決手段】 骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作
用を指標とする骨芽細胞分化促進剤の探索方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は骨芽細胞分化促進剤
の探索方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨粗鬆症等の骨代謝異常症の治療法とし
ては、女性ホルモン（エストロゲン等）、蛋白同化ステ
ロイド、活性型ビタミンD類、カルシトニン、カルシウ
ム剤、ビスホスフォン酸類、ビタミンK₂、イプリフラボ
ン、副甲状腺ホルモン、フッ素等の薬剤等の投与による
ものがあげられる。

【０００３】エストロゲンは、閉経後の女性におけるエ
ストロゲン量低下に伴う閉経後骨粗鬆症に対して、欠乏
したエストロゲンを補充する方法（エストロゲン補充療
法）で用いられるが、子宮出血や乳房膨張等不快な副作
用を引き起こし、子宮膜癌や乳癌を誘発させる可能性が
ある（特開平11-80005）。蛋白同化ステロイドも副作用
を引き起こす（特開平11-180872）。

【０００４】1α-ヒドロキシビタミンD₃、1α, 24(R)-
ジヒドロキシビタミンD₃、1α, 25-ジヒドロキシビタミ
ンD₃等の活性型ビタミンD類は、小腸ではカルシウムの
吸収促進作用を有し、骨では骨吸収、骨形成を調節する
等の作用を有するため、骨密度および骨強度を向上させ
るが、患者の血中カルシウム濃度を上昇させる副作用が
ある（特開平11-60489）。また、活性型ビタミンD₃は局
所投与では骨吸収作用を示すため、経皮、外用での投与
が難しい（特開平11-180872）。

【０００５】カルシトニンはその投与方法が筋肉内注射
であるために、長期に亘る投与が必要とされ、骨粗鬆症
の治療においては、患者に与える負担が大きい等の課題
を有している（特開平11-130670）。また、カルシトニ
ンは薬剤の耐性が出現しやすい（特開平11-180872）。
さらに、カルシトニンは高カルシウム血症、高カルシウ
ム尿症を起こしやすく、それに伴う尿路結石等の副作用
の発現が問題となっている（特開平11-12192）。

【０００６】カルシウム剤を用いた、高齢者や閉経後女
性の骨粗鬆症に対するカルシウム補充療法が有効である
と報告されており、主要な骨基質構成成分の１つである
カルシウムの製剤は他の上記薬剤に比べて安全性が高い
という点から注目されている（特開平11-12192）。しか
し、カルシウム剤は高カルシウム血症、高カルシウム尿
症を起こしやすく（特開平11-180872）、また、骨強度
を高める効果も十分ではない（特開平11-9221）。

【０００７】ビスホスフォン酸類は、活性化した破骨細
胞に対して特異的に作用し、その活性を抑制することで
骨吸収を抑制すると考えられ、骨粗鬆症をはじめカルシ
ウム代謝異常に基づく疾患の治療薬として用いられてい
る（特開平11-60489）。しかしながら、ビスホスフォン
酸類は骨形成を阻害する欠点があり（特開平11-18087
2）、骨量減少は抑制されるが、低下した骨量の回復は
難しいと考えられている（特開平11-209284）。

【０００８】ビタミンK₂は骨の形成を促進し、骨の破壊
や吸収を抑制する作用を有しており、その骨破壊吸収抑
制作用はイソプレン基を有する側鎖が破骨細胞形成抑制
作用に関与することによることが報告されている。しか
しながら、ビタミンK₂は血液凝固作用を有しており、ワ
ーファリンの投与を受けている患者には投与が禁忌であ
る点に課題がある（特開平11-130670）。

【０００９】骨形成促進作用をもつ蛋白質［骨形成因子
（BMPs）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF）等］が知
られているが、蛋白質製剤には経口吸収性、安定性、生
産コスト等の問題がある（特開平11-209284）。骨代謝
改善薬を目指した低分子化合物では、骨芽細胞増殖促進
剤として、アミド化合物（特開平11-80107）、破骨細胞
形成抑制剤として、イソプレノイド化合物（特開平11-1
30670）、骨吸収抑制剤として、ヒドロキシ-2-ピリドン
誘導体（特開平11-180872）、インドール誘導体（特開
平4-211651）、骨粗鬆症治療薬として、チアゾール化合
物（特開平11-209284）、(R)-8-ヒドロキシ-2,6-ジメチ
ル-2-オクテン酸（特開平11-209324）等が報告されてい
る。

【００１０】骨形成および骨吸収に関与する主要な細胞
は、それぞれ骨芽細胞および破骨細胞である。骨形成過
程は、非石灰化骨基質（類骨）の形成とその石灰化に大
別される。骨芽細胞は主要な骨基質蛋白として、Ｉ型コ
ラーゲン、オステオポンチン、骨シアル酸含有プロテイ
ン、オステオネクチン、デコリン、バイグリカン、オス
テオカルシン等骨基質に含まれる有機成分の90％以上を
生産する。これら骨基質蛋白は非石灰化骨基質（類骨）
を形成し、骨芽細胞はそれら骨基質を石灰化し、最終的
には周囲の骨基質に埋め込まれて骨細胞となる。そのた
め、この骨芽細胞の増殖・分化を促進させる薬剤は骨形
成を促進させる根本的な骨粗鬆症治療薬および予防薬と
なり得る。また、骨形成促進剤は骨折の治癒を早め、偽
関節の治療、歯周病による歯槽骨減少の治療にも有効で
あると考えられている。

【００１１】骨芽細胞の増殖促進の指標としては、培養
細胞の増殖測定に、一般的に用いられる、細胞数、DNA
量、蛋白質量、チミジン取り込み量等が知られている
が、カルシウムチャンネルに対する作用に基づく、骨芽
細胞の増殖促進指標は知られていない。骨芽細胞の分化
促進の指標としては、アルカリフォスファターゼ活性の
亢進、石灰化、オステオカルシン、オステオポンチン等
の蛋白質、遺伝子の発現等が知られているが、カルシウ
ムチャンネルに対する作用に基づく、骨芽細胞の分化促
進指標は知られていない。また、骨芽細胞は分化するの
に3〜40日を要し、いずれの指標を利用しても短時間に
化合物の骨芽細胞分化促進活性を測定することは困難で
あった。

【００１２】ある種のジヒドロピリジン、フェニルアル
キルアミン、ベンゾチアゼピン等は血管平滑筋のL型カ
ルシウムチャンネルに拮抗的に作用し、降圧作用を示す
ことが報告されている［CLINICAL CALCIUM, 7, 7-10 (1
997)］。骨芽細胞にカルシウムチャンネルが発現してい
ることは報告されているが［Seminers in Nephrology,
18, 178-190 (1998)］、カルシウムチャンネルの骨芽細
胞分化に対する作用は未解明であった。

【００１３】L型カルシウムチャンネル作動薬であるジ
ヒドロピリジン（DHP）系化合物BayK8644は、骨芽細胞
のカルシウムチャンネルに対してカルシウムイオン流入
促進作用を示すとともに、骨芽細胞の分化を促進するこ
とが報告されている［Bone, 5,S418 (1998)］。また、D
HPに属するベニジピン、アムロジピン、ニフェジピンの
うち、ベニジピンのみが骨芽細胞分化促進作用を有する
ことが報告されている［Calcified Tissue Internation
al, 62, 554-556 (1998)］。骨代謝異常症の治療薬とし
て、現在十分に満足できる薬剤はなく、骨疾病・骨障害
の治療薬および予防薬、特に抗骨粗鬆症剤の探索方法が
強く望まれている。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、短時
間で行うことのできる骨芽細胞のカルシウムチャンネル
拮抗作用を指標とした骨芽細胞分化促進剤の探索方法を
提供することにある。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明において、発明者
らは鋭意検討の結果、骨芽細胞において、カルシウムチ
ャンネル拮抗作用と骨芽細胞分化促進作用が相関するこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明は以下の発明に関する。

【００１６】（１） 骨芽細胞のカルシウムチャンネル
拮抗作用を指標とする骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００１７】（２） 骨芽細胞に、被験化合物を作用さ
せ、当該細胞におけるカルシウムイオン流入量を測定
し、該被験化合物がカルシウムイオン流入を抑制す化合
物であるか判定し、カルシウムイオン流入を抑制する化
合物を骨芽細胞分化促進剤として選択することを特徴と
する上記（１）記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００１８】（３） 骨芽細胞における、被験化合物の
カルシウムチャンネルに対する結合能を測定し、該被験
化合物がカルシウムチャンネルに対する結合能を有する
化合物であるか判定し、結合能を有する化合物を骨芽細
胞分化促進剤として選択することを特徴とする上記
（１）記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００１９】（４） 骨芽細胞の細胞株がMC3T3-E1細胞
である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の骨芽細胞
分化促進剤の探索方法。

【００２０】（５） 被験化合物がジヒドロピリジン、
ベンゾチアゼピンおよびフェニルアルキルアミンから選
ばれる構造を有する化合物である上記（１）〜（４）の
いずれかに記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００２１】（６） 被験化合物が骨芽細胞カルシウム
チャンネル抗体である上記（１）〜（４）のいずれかに
記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００２２】（７） 被験化合物が骨芽細胞カルシウム
チャンネル拮抗ペプチドである上記（１）〜（４）のい
ずれかに記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。被験化合物としては、例えば、ジヒドロピリジ
ン、ベンゾチアゼピンおよびフェニルアルキルアミンか
ら選ばれる構造を有する化合物、骨芽細胞カルシウムチ
ャンネル抗体、骨芽細胞カルシウムチャンネル拮抗ペプ
チド等があげられる。

【００２４】本発明に用いられる骨芽細胞としては、骨
芽細胞に分化可能な細胞であれば、種や細胞株を問わず
利用できる。例えば、個体より調製した初代培養の骨芽
細胞を含む細胞群の培養系や樹立された細胞株が利用で
きる。初代培養骨芽細胞は、骨を有する生物であればい
かなる種からも調製することができる。好ましくは、ヒ
ト、サル、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等の組織から
調製できる。細胞株では、ゲッシ類のMC3T3-E1細胞、CR
P7/4、CRP10/30、ROS 17/2.8、UMR-106、RCJ3.1、RCB2.
2、C3H10T1/2、ROB-C26、C2C12、ST-2等があり、ヒトの
HOBITS、SV-HFO、hFOBs、MG-63、Saos-2、U2-OS、HOS T
E85、Trabecule、HBDC、hMS（OB）、SaM-1等が知られて
おり、好ましくはカルシウムチャンネルが発現している
ことが知られているUMR-106およびMC3T3-E1［Connectiv
e Tissue Research, 35, 107-111(1996)］、さらに好ま
しくは生体と同様の過程を経て分化するMC3T3-E1細胞を
用いることができる。MC3T3-E1細胞は、該分化段階に応
じて、コラーゲン、アルカリホスファターゼ、オステオ
カルシン等を発現し、最終的に石灰化を起こし、生体内
と同様の過程を経て分化することから、in vitroでの骨
芽細胞の分化について広く用いられている［日本臨床,
56, 1447-1453 (1998)］。

【００２５】初代培養骨芽細胞の調製は既存のいかなる
方法でも利用できる。初代培養細胞の調製方法としては
骨組織より酵素消化により直接細胞を採取する酵素消化
法、培養した小骨片から遊出した細胞を利用する骨移植
片培養法等がある。酵素消化法では、例えば新生児マウ
スあるいはラットから以下のような方法で行うことがで
きる。頭蓋骨を無菌的に取り出し、リン酸緩衝生理食塩
水（以下、PBSと略す）にエチレンジアミン四酢酸四ナ
トリウムを最終濃度0.4 mmol/Lとなるように添加した液
に入れ、37℃の恒温槽で3〜60分間、好ましくは約10分
間振とうする。この処理を1〜5回、好ましくは3回繰り
返した後、頭蓋骨をPBS溶液で洗浄後、1〜2000 U/ml、
好ましくは約200 U/mlのコラゲナーゼ溶液を含むPBS溶
液中で37℃、3〜60分間、好ましくは約10分間振とうす
る。この酵素溶液を回収し、さらに新しい酵素溶液を加
え、3〜60分間、好ましくは約10分間酵素処理する。こ
の酵素処理を2〜10回、好ましくは3〜6回繰り返し、骨
芽細胞の割合が高くなる画分、通常2〜10回目、好まし
くは3〜6回目の消化液に含まれる細胞を骨芽細胞様細胞
として回収する。回収された細胞をPBSで洗浄し、1〜30
%の非働化ウシ胎児血清（以下、FBSと略す）を含むα-
最小必須培地（α-MEM培地）に懸濁し、フラスコ中で37
℃、5%CO₂下で培養する。骨移植片培養法では、例えば
ヒトあるいはラット、マウス等の骨片（骨膜を含む）か
ら以下のような方法で行うことができる。実体顕微鏡で
骨片を2〜3mm大に細切する。ディッシュあるいはプレー
トに数個の骨片を入れ、1〜30%のFBSを含むα-MEM培地
中、37℃、5%CO₂下で培養する。数日後、骨片から細胞
が多数遊出してくる。遊出した細胞を分散するためPBS
で洗浄し、トリプシン（trypsin）-エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）溶液を添加し、37℃で3〜60分間、好まし
くは約10分間培養する。小骨片を除去後、細胞をピペッ
ティングで分散する。滅菌メッシュで細胞塊を除去後、
細胞を1〜30%のFBSを含むα-MEM培地中、37℃、5%CO₂下
で培養する。

【００２６】骨芽細胞の培養方法は、既存の培養方法で
あればいかなる方法でもよい。好ましくは、個々の骨芽
細胞について公知の方法で培養できる。例えばMC3T3-E1
細胞では、1〜30% FBS、α-MEM培地中で、CO₂インキュ
ベータ（5% CO₂, 37℃）を用いて継代培養でき、細胞濃
度が1×10⁴〜5×10⁴個/cm²の範囲で維持できるように2
〜4日に１回継代すればよい。また、UMR-106では、1〜3
0% FBS、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）/Ham's F
12培地中で、CO₂インキュベータ（5% CO₂, 37℃）を用
いて継代培養でき、細胞濃度が5×10⁴〜2×10⁵個/cm²の
範囲で維持できるように2〜4日に１回継代すればよい。

【００２７】骨芽細胞分化促進剤の探索は、以下のよう
にして行うことができる。すなわち、骨芽細胞に被験化
合物を作用させ、骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗
作用を測定し、被験化合物がカルシウムチャンネル拮抗
作用を有する化合物であるかを判定し、カルシウムチャ
ンネル拮抗作用を有する化合物を骨芽細胞分化促進剤と
して選択することにより、骨芽細胞分化促進剤を探索す
ることができる。

【００２８】骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作用
の測定方法としては、カルシウムチャンネル拮抗作用の
測定方法として既存の方法であればいかなる方法も利用
することができ、例えばカルシウムチャンネルに対する
結合能を測定する方法、カルシウムチャンネルを通した
細胞内へのカルシウムイオンの流入の被験物質による抑
制を測定する方法等があげられる。被験物質のカルシウ
ムチャンネルに対する結合能は、放射能等でラベルした
既知のカルシウム拮抗剤のカルシウムチャンネルからの
解離促進能等によって測定することができる。カルシウ
ムイオンの流入を起こさせる方法としては、例えばカル
シウムチャンネル作動薬とカリウムイオンによりカルシ
ウムイオン流入を起こさせる方法、細胞外に高濃度のカ
リウムイオンを添加することによりカルシウムイオン流
入を起こさせる方法、バリノマイシン等のカリウムイオ
ノフォアを細胞に添加することによりカルシウムイオン
流入を起こさせる方法、バリウムイオン添加によりカル
シウムイオン流入・バリウムイオン流入を起こさせる方
法、微小電極により膜電位を脱分極させることによりカ
ルシウムイオン流入を起こさせる方法、生理活性物質
（例えば、副甲状腺ホルモン、活性型ビタミンD₃、EGF
等）によりカルシウムイオン流入を起こさせる方法等が
あげられる。好ましくは、カルシウムチャンネル作動薬
とカリウムイオンによるカルシウムイオン流入を検出す
る系において、被検物質によるカルシウムイオン流入の
抑制を調べる方法等がある。

【００２９】カルシウムイオン流入の検出方法として
は、既存のいかなる方法も利用でき、例えばパッチクラ
ンプ法によるカルシウム電流の抑制の測定、カルシウム
インジケーターであるエクオリン、カルシウムグリー
ン、fura-2、fura-2PE、fluo-3、quin-2等を用いた細胞
内カルシウム濃度測定等があげられる。例えば、fura-2
を用いてMC3T3-E1細胞内カルシウム濃度の変化を測定す
る場合には、1ウェルあたり1×10⁵〜1×10⁶個のMC3T3-E
1細胞をセルデスクの入った24ウェルプレートで1〜30%
FBSを含むα-MEM培地中で一晩〜一週間培養する。細胞
をハンクス平衡塩類溶液（以下、HBSSと略す）で1〜5回
洗浄し、200μL〜1 mLのfura-2等のカルシウム蛍光指示
薬1〜20μmol/Lを含むHBSSを入れ、室温あるいは37℃で
30分間〜1時間インキュベートする。fura-2溶液を除去
後、HBSSで1〜5回洗浄し、200μL〜1 mLのHBSSを加えさ
らに37℃で20〜30分間インキュベートする。セルデスク
を取り出し、2〜3 mLのHBSSの入った石英ガラス製のキ
ュベットに入れ、蛍光測定装置にセットする。細胞を37
℃で2〜5分間インキュベートし、ジメチルスルホキシド
（DMSO）に溶解した試験化合物を加え（DMSO最終濃度0.
1 %〜1 %）、さらに30秒〜2分間インキュベートする。C
a流入刺激物質（最終濃度10〜40 mmol/L KCl、100 nmol
/L〜10μmol/L BayK 8644）を加え、Ca流入量を測定す
る。溶媒対照群のCa流入量を100%としたときの試験化合
物によるCa流入量を算出し、Ca拮抗作用を評価すること
ができる。

【００３０】本発明により探索されうる化合物として
は、カルシウムチャンネル拮抗作用を有する物質であれ
ばいかなるものも包含される。例えば、ジヒドロピリジ
ン（DHP）に属するベニジピン、ニフェジピン、アムロ
ジピン、メピロジピン、シルニジピン、ニトレンジピ
ン、ニモジピン、イスラジピン、ニカルジピン、フェロ
ジピン、マニジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、バ
ルニジピン、アラニジピン、エホニジピン等、フェニル
アルキルアミンに属するベラパミル等、ベンゾチアゼピ
ンに属するジルチアゼム、ベラパミル、ベプリジル等、
抗体、ペプチド等があげられ、それらの水和物または溶
媒和物も包含される。また、これらの物質の２以上を適
宜組み合わせて用いてもよい。

【００３１】本発明の方法により探索された骨芽細胞分
化促進剤として有用な物質は、それ自体を医薬として投
与してもよいが、通常は、有効成分である上記物質と製
剤学的に許容される製剤用添加物とを含む医薬組成物の
形態で投与することが望ましい。このような医薬組成物
には、他の医薬の有効成分、例えば、鎮痛剤、骨吸収抑
制剤、抗生物質、抗菌剤、抗炎症剤等の１種または２種
以上を適宜配合することが可能である。

【００３２】生体内に適用するための医薬組成物は、有
効成分である上記物質を製剤学的に許容される製剤用添
加物の１種または２種以上と混合し、製剤学の分野にお
いて汎用の製剤方法に従って容易に製造することができ
る。本発明の方法により探索された骨芽細胞分化促進剤
の投与経路は特に限定されず、治療および／または予防
に際して最も効果的な経路を適宜選択することが望まし
いが、好ましくは経口投与があげられる。経口投与に適
する医薬組成物としては、例えば、カプセル剤、散剤、
錠剤、顆粒剤、シロップ剤等をあげることができ、非経
口投与に適する医薬組成物としては、例えば、直腸内投
与剤、注射剤、点滴剤等をあげることができるが、本発
明の医薬の形態はこれらに限定されることはない。

【００３３】経口投与に適当な医薬組成物のうち、例え
ばシロップ剤等の液体製剤は、水；蔗糖、ソルビット、
果糖等の糖類；ポリエチレングリコール、プロピレング
リコール等のグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆
油等の油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防
腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレ
ーバー類等の製剤用添加物を用いて製造することができ
る。カプセル剤、錠剤、散剤、および顆粒剤等の固形製
剤は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤；
でんぷん、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤；ステアリン酸
マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコー
ル、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合
剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可
塑剤等を用いて製造することができる。

【００３４】非経口投与に適する医薬組成物のうち、注
射剤、点滴剤等の形態の液体製剤は、好ましくは滅菌さ
れた等張の液体製剤として調製することができる。例え
ば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩水とブ
ドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体を用いて調製す
ることができる。直腸内投与剤は、例えばカカオ脂、水
素化脂肪または水素化カルボン酸等の担体を用いて、通
常は坐剤の形態として調製することができる。なお、非
経口投与用の医薬組成物の製造においても、経口剤で例
示した希釈剤、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊
剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択さ
れる１種または２種以上の製剤用添加物を適宜用いるこ
とができる。もっとも、医薬組成物の製造に用いられる
製剤用添加物は上記のものに限定されることはなく、当
業者に利用可能なものであればいかなるものを用いても
よい。

【００３５】本発明の方法により探索された骨芽細胞分
化促進剤の投与量および投与回数は特に限定されない
が、一般的には、経口投与の場合には成人（60kg）一日
当り6-6000mg、好ましくは60-3000mgが適当である。上
記の投与量を１日１回ないし数回にわけて投与すること
ができる。もっとも、上記の投与量および投与回数は、
投与経路、患者の年齢および体重、治療および／または
予防すべき骨疾患、骨障害の程度や基礎疾患の種類等の
因子を考慮して適宜増減することが望ましい。

【００３６】以下に、実施例、参考例と試験例を示す
が、これらの例は、本特許の範囲を限定するものではな
い。

【００３７】

【実施例】実施例１：骨芽細胞のカルシウムチャンネル
拮抗作用による骨芽細胞分化促進剤の探索方法 骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作用をもつ化合物
の探索には、骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1［Jpn. Oral Bi
ol., 23, 899-901 (1981)］を用いた。

【００３８】カルシウムチャンネル拮抗作用をもつ化合
物の探索は、細胞内カルシウム濃度指示薬fura-2を負荷
した細胞へのカルシウムイオン流入の抑制を指標とする
ことで行った。すなわち、1ウェルあたり5×10⁵個のMC3
T3-E1細胞をセルデスクの入った24ウェルプレートで10%
FBS（PAA Laboratories）を含むα-MEM培地中で一晩培
養した。細胞をHBSSで1回洗浄し、500μLの10μmol/L f
ura-2を含むHBSSを入れ、37℃で1時間インキュベートし
た。fura-2溶液を除去後、HBSSで1回洗浄し、500μLのH
BSSを加え、さらに37℃で20分〜30分間インキュベート
した。セルデスクを取り出し、2 mLのHBSSの入った石英
ガラス製のキュベットに入れ、蛍光測定装置［CAF-11
0、日本分光（株）］にセットした。細胞を37℃で2分間
インキュベートし、DMSOに溶解した試験化合物を加え
（DMSO最終濃度0.1 %）、さらに1分間インキュベートし
た。カルシウムイオン流入刺激物質（最終濃度40 mmol/
L KCl, 10μmol/L BayK 8644）を加え、カルシウムイオ
ン流入量を測定した。溶媒対照群のCa流入量を100%とし
たときの試験化合物によるカルシウムイオン流入量を算
出し、カルシウム拮抗作用を評価した。

【００３９】結果を図１に示す。図１から明らかなよう
に、ベニジピン、ニフェジピン、ジルチアゼム、ベラパ
ミルおよびアムロジピンは骨芽細胞に対して濃度依存的
にカルシウムイオン流入抑制作用を示した。ベニジピン
は低濃度からカルシウムイオン流入を抑制し、高い活性
を示した。一方、ニフェジピン、ジルチアゼム、ベラパ
ミル、アムロジピンは高濃度で効果を示し、それらの活
性はほぼ同等であった。

【００４０】参考例１：錠剤 常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。(R.S.)
3-エチル-5-メチル-2-(2-アミノエトキシメチル)-4-(2
-クロロフェニル)-1,4-ジヒドロ-6-メチル-3,5-ピリジ
ンジカルボン酸 ベンゼンスルホネート（アムロジピ
ン）10g、ラクトース316.8gおよび馬鈴薯でんぷん60gを
混合し、これにヒドロキシプロピルセルロースの10％水
溶液120gを加える。この混合物を常法により練合し、造
粒して乾燥させた後、整粒し打錠用顆粒とする。これに
ステアリン酸マグネシウム1.2gを加えて混合し、径8mm
の杵をもった打錠機（菊水社製RT-15型）で打錠を行っ
て、錠剤（１錠あたり活性成分5 mgを含有する）を得
る。

【００４１】参考例２：カプセル剤 常法により、次の組成からなるカプセル剤を調製する。
アムロジピン50g、アビセル1145gおよびステアリン酸マ
グネシウム5gを常法により混合する。この混合物をカプ
セル充填機（Zanasi社製、LZ-64型）により、ハードカ
プセル４号（１カプセルあたり120mg容量）に充填し、
カプセル剤（１カプセルあたり活性成分5mgを含有す
る）を得る。

【００４２】参考例３：肛門坐剤 常法により、次の組成からなる直腸投与用の製剤を調製
する。ウィテプゾール ^TM H15（ダイナマイトノーベル社
製）673.55gおよびウィテプゾール^TM E75（ダイナマイ
トノーベル社製）288.65gを40〜50℃で溶融させる。こ
れに1,4-ジヒドロ-2,6-ジメチル-3,5-ピリジンジカルボ
ン酸4-(2-ニトロフェニル)ジメチルエステル（ニフェジ
ピン）10g、第一リン酸カリウム13.6gおよび第二リン酸
ナトリウム14.2gをそれぞれ均一に混合分散させる。つ
いで該混合分散したものをプラスチック製の坐剤の型に
充填した後、徐々に冷却して肛門坐剤（１製剤あたり活
性成分10mgを含有する）を得る。

【００４３】試験例１：選択された化合物の骨芽細胞分
化促進作用 骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作用をもつ化合物
の骨芽細胞分化促進作用の試験は、骨芽細胞の分化マー
カーであるアルカリホスファターゼ（以下、ALPと略
す）活性と細胞のDNA量を測定することで行った。すな
わち、1ウェルあたり1.7×10⁴個のMC3T3-E1細胞を96ウ
ェルプレートで10% FBSを含むα-MEM培地中で培養し
た。培養開始4日後にDMSOに溶解した試験化合物（DMSO
最終濃度0.1 %）および0.1%ウシ血清アルブミンを含む
α-MEM培地中に交換し、37℃のCO₂インキュベーターで1
0日間培養した。この培養期間中に試験化合物を含む培
地を2度交換した。その後、細胞を1回PBSで洗浄し、1ウ
ェルあたり150μLの6.7 mmol/Lのp-ニトロフェニルリン
酸溶液を加え、15〜30分間室温で反応させた。反応を1
ウェルあたり50μLの1 mol/LのNaOHを入れることで停止
し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定
した。吸光度からp-ニトロフェノールの生成量を計算
し、ALP活性を求めた。試験化合物のDNA量に対する影響
の測定はFratzl-Zelmanらの方法［Bone, 20, 225-236
(1997)］に従った。すなわち、ALP活性測定と同様の方
法で細胞を生育させたあと、PBSで洗浄し、-20℃で凍結
させた。細胞を室温に取り出し、1ウェルあたり50μLの
5μg/mLのHoechst33258溶液を加え、蛍光強度をマイク
ロプレートリーダーで測定した（励起光355 nm、蛍光波
長460 nm）。DNA量をウシ胸腺DNAを用いて作製した検量
線から求めた。

【００４４】分化促進活性を単位DNA量あたりのALP活性
で比較した結果を図２および図３に示す。数値はベニジ
ピンでの最大活性を100%としたときの値で表されてい
る。図２および図３から明らかなように、ベニジピン、
ニフェジピン、ジルチアゼム、ベラパミル、アムロジピ
ンは濃度依存的に骨芽細胞の分化を促進した。ベニジピ
ンは低濃度から単位DNA量あたりのALP活性を促進し、高
い活性を示した。一方、ニフェジピン、ジルチアゼム、
ベラパミル、アムロジピンは高濃度で効果を示し、それ
らの活性はほぼ同等であった。実施例１および本試験例
１の結果から、構造の異なるカルシウムチャンネル拮抗
剤の間にも、カルシウムチャンネル拮抗作用と骨芽細胞
分化促進活性に相関があることが示された。

【００４５】試験例２：カルシウムチャンネル作動薬の
骨芽細胞分化促進作用 試験例１と同様の方法により、ALP活性に対するカルシ
ウムチャンネル作動薬BayK8644の効果を検討した。結果
を図４に示す。カルシウムチャンネル作動薬のBayK8644
はそれ自体でALP活性に影響を及ぼさないが、500 pmol/
Lのベニジピンによる分化促進を濃度依存的に抑制し、5
μmol/Lで完全に抑制した。このことからも、骨芽細胞
分化促進作用がカルシウムチャンネル拮抗作用によるも
のであることが強く示唆された。

【００４６】

【発明の効果】本発明は、短時間で行うことのできる骨
芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作用を指標とした骨
芽細胞分化促進剤の探索方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】種々の化合物の細胞内カルシウムイオン流入に
対する効果を表すグラフである。縦軸は薬剤無添加時の
カルシウムイオン流入量に対する割合（％）を、横軸は
ｌｏｇ（濃度（mol/L））を表す。

【図２】種々の化合物のALP活性に対する効果を表すグ
ラフである。縦軸はベニジピンによる最大反応に対する
割合（％）を、横軸はｌｏｇ（濃度（mol/L））を表
す。

【図３】種々の化合物のALP活性に対する効果を表すグ
ラフである。縦軸はベニジピンによる最大反応に対する
割合（％）を、横軸はｌｏｇ（濃度（mol/L））を表
す。

【図４】BayK8644の単独および 500 pmol/Lのベニジピ
ンとの共存下でのALP活性に対する効果を表すグラフで
ある。縦軸は500 pmol/LベニジピンによるALP促進活性
に対する割合（％）を、横軸はｌｏｇ（BayK8644の濃度
（mol/L））を表す。

【符号の説明】

―■―：ベニジピン ―□―：ジルチアゼム ―●―：ベラパミル ―○―：ニフェジピン ―△―：アムロジピン ―◆―：BayK8644+500 pmol/Lベニジピン ―◇―：BayK8644のみ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 19/10 ４Ｃ０８６ 43/00 １１１ 43/00 １１１ ４Ｃ２０６ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ Ｘ // Ｃ０７Ｄ 211/90 Ｃ０７Ｄ 211/90 281/10 281/10 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/06 (Ｃ１２Ｑ 1/02 (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 小坂 信夫 静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵 工業株式会社医薬総合研究所内 (72)発明者 田中 博之 静岡県駿東郡長泉町下土狩1188 協和醗酵 工業株式会社医薬総合研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 BB14 BB50 BB51 CB01 CB13 DA36 FB01 4B063 QA01 QQ61 QQ79 QR48 QR77 QS22 QS33 QS36 QX02 4B065 AA91X CA24 4C036 AB03 AB05 AB10 AB14 AB20 4C054 AA07 BB03 CC01 DD04 DD08 DD12 EE19 FF05 FF11 FF17 4C086 AA02 BC25 BC26 BC92 NA14 ZA97 ZC02 ZC50 4C206 AA02 HA13 KA01 MA51 MA55 MA57 MA72 NA14 ZA97 ZC02 ZC50

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨芽細胞のカルシウムチャンネル拮抗作
   用を指標とする骨芽細胞分化促進剤の探索方法。
2. 【請求項２】 骨芽細胞に、被験化合物を作用させ、当
   該細胞におけるカルシウムイオン流入量を測定し、該被
   験化合物がカルシウムイオン流入を抑制す化合物である
   か判定し、カルシウムイオン流入を抑制する化合物を骨
   芽細胞分化促進剤として選択することを特徴とする請求
   項１記載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。
3. 【請求項３】 骨芽細胞における、被験化合物のカルシ
   ウムチャンネルに対する結合能を測定し、該被験化合物
   がカルシウムチャンネルに対する結合能を有する化合物
   であるか判定し、結合能を有する化合物を骨芽細胞分化
   促進剤として選択することを特徴とする請求項１記載の
   骨芽細胞分化促進剤の探索方法。
4. 【請求項４】 骨芽細胞の細胞株がMC3T3-E1細胞である
   請求項１〜３のいずれかに記載の骨芽細胞分化促進剤の
   探索方法。
5. 【請求項５】 被験化合物がジヒドロピリジン、ベンゾ
   チアゼピンおよびフェニルアルキルアミンから選ばれる
   構造を有する化合物である請求項１〜４のいずれかに記
   載の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。
6. 【請求項６】 被験化合物が骨芽細胞カルシウムチャン
   ネル抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の骨芽細
   胞分化促進剤の探索方法。
7. 【請求項７】 被験化合物が骨芽細胞カルシウムチャン
   ネル拮抗ペプチドである請求項１〜４のいずれかに記載
   の骨芽細胞分化促進剤の探索方法。