CN101015683B - 人rtn4b蛋白在制备创伤愈合药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程和医药领域，具体地，本发明涉及人蛋白RTN4B在制备创伤愈合药物中的应用。创伤愈合是一个非常复杂的过程。创伤不仅使生物体局部发生一系列变化，同时还可引发不同程度的全身性反应，并且创伤部分会给患者带来不同程度的痛苦感，因此，患者总是希望创伤尽快愈合。本发明的RTN4B可以促进血管生成，增强血管细胞的粘附和迁移能力，可以用于制备促进创伤愈合的药剂，帮助患者缩短疗程，减轻痛苦。

Description

人RTN4B蛋白在制备创伤愈合药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和医药领域，具体地，本发明涉及人蛋白RTN4B在制备创伤愈合药物中的应用。

背景技术

RTN家族是一个近年来所发现的新的基因家族。其中神经内分泌特异性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被统一命名为RTN1，是该家族的第一个成员。根据NSP基因组序列、cDNA序列和核酸序列数据库比较，发现了另外三个人RTN家族成员(NSP类基因I，II，III)。其中两个(NSP-like基因I，II)相继被克隆，并被命名为RTN2和RTN3。RTN2同样有三个C-末端相同的异构体。但RTN3至今没有发现变异剪接本。值得注意的是，RTN2和RTN3的C-末端也发现了两个独立的穿膜区域，这被认为与内质网相关。

RTN4是人RTN家族中新近发现的又一个成员。它类似于RTN1和RTN2，同样有C-末端相同的三个异构体(即RTN4A，4B，4C)。RTN4异构体与RTN1/NSP，RTN2，RTN3异构体一样有着共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。这预示着它如RTN1一样，在联系蛋白与内质网中扮演了重要的角色。RTN4与人其他RTN的N-端无明显的同源性(＜40％)，但是这些区域具有与RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，这一区域发现富含碱性氨基酸残基，脯氨酸和丝氨酸。此外，在这些区域中还发现了大量的蛋白磷酸化位点。并且有报道发现体内RTN1A和RTN1B确实是被磷酸化的。RTN4A，4B，4C的理论等电点分别是4.43，4.71和9.32，这与RTN1，RTN2预计的等电点基本相似。

创伤愈合是一个非常复杂的过程。创伤不仅使生物体局部发生一系列变化，同时还可引发不同程度的全身性反应；在这一过程有许多细胞参与，每种细胞又分泌多种因子，这些细胞之间、因子之间、细胞和因子之间存在错综复杂的关系，因此它涉及细胞运动、粘附、通讯、增殖和分化等细胞生物学的各个方面。

发明内容

本发明的目的是提供人RTN4B蛋白的一种新用途。

本发明提供了人RTN4B蛋白在制备创伤愈合药物中的应用。

本发明中，鸡胚尿囊膜(CAM)试验表明，人蛋白RTN4B可明显促进鸡胚尿囊膜处的血管生成；小鼠角膜实验表明，人蛋白RTN4B可明显促进小鼠角膜处的血管生成；划痕实验表明，人蛋白RTN4B可明显促进血管内皮细胞迁移；细胞粘附实验表明，人蛋白RTN4B可明显增强细胞的粘附力。可见，RTN4B(NCBI登陆号AAG12177)可以促进创伤处血管愈合。

本发明中，术语“RTN4B蛋白”指可促进创伤愈合的、序列与(NCBI登陆号AAG12177)所示多肽序列至少70％同源性的RTN4B多肽及其变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式还包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RTN4B DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人RTN4B多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供人RTN4B蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人RTN4B多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的具有代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的RTN4B蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，酵母表达系统可将RTN4B基因表达为蛋白。

本发明的RTN4B基因可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的RTN4B基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的RTN4B核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

在本发明中，术语“RTN4B基因”指编码具有促进创伤愈合活性的多肽的编码核苷酸序列，如核苷酸的序列号为(NCBI登陆号-AF148538)的序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出RTN4B的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与-AF148538开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与-AF148538开放阅读框序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码序列号为AAG12177氨基酸序列的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

获得了RTN4B基因序列后，就可以将RTN4B基因序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。一旦获得了含有RTN4B基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人RTN4B或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人RTN4B基因产物或片段。较佳地，指那些能与人RTN4B基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人RTN4B蛋白的分子，也包括那些并不影响人RTN4B蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人RTN4B基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人RTN4B基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人RTN4B或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人RTN4B功能的抗体以及不影响人RTN4B功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人RTN4B基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人RTN4B基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中表达的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人RTN4B核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。

本发明中，所述的创伤愈合药物是将RTN4B蛋白与药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。

本发明中，所述的药物是片剂、针剂、粉剂、口服液或者注射剂。

本发明中，所述的药物中RTN4B蛋白的用量为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。

本发明中，所述的创伤愈合药物是血管生成促进药物。

本发明蛋白，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人RTN4B蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人RTN4B蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人RTN4B蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的人RTN4B可以作为创伤愈合药物，尤其是血管生长促进药物。

本发明的RTN4B可以作为靶标，筛选抑制血管生长的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤：A选择候选化合物；B提供检测RTN4B表达量或者活性的体系；C用RTN4B的检测体系选择候选化合物；D确定RTN4B表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。

本发明中，可将候选化合物的计算机模拟三维结构与RTN4B蛋白的计算机模拟三维结构结合，候选化合物的计算机模拟三维结构与RTN4B蛋白的活性部位紧密结合的，该候选化合物即为抑制血管生长药物的活性成分。

本发明中，将得到的候选化合物加入含有RTN4B蛋白的溶液中，然后，检测RTN4B蛋白的表达量或者活性，RTN4B蛋白的表达量或者活性下降的候选化合物为抑制血管生长药物的活性成分。

所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反义寡核苷酸、核酶或者与RTN4B核苷酸序列互补的其它核酸分子；氨基酸包括肽、抗体、互作蛋白等；小分子化合物则包括天然和人工的合成的。

作为靶标的除了RTN4B蛋白，还可以是RTN4B基因、RTN4B的mRNA、RTN4B的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述“特异性片断”是指可以区别本发明的RTN4B与其它基因的片断。

创伤愈合是一个非常复杂的过程。创伤不仅使生物体局部发生一系列变化，同时还可引发不同程度的全身性反应，并且创伤部分会给患者带来不同程度的痛苦感，因此，患者总是希望创伤尽快愈合。本发明的RTN4B可以促进血管生长，增强血管细胞的粘附和迁移能力，可以用于制备促进创伤愈合的药剂，帮助患者缩短疗程，减轻痛苦。

附图说明

图1是.鸡胚尿囊膜(CAM)试验结果。其中，RTN4B是滤纸上加入2ul RTN4B(200ng/ul)；bf是滤纸上加入2ul bFGF(25ng/ul)；PBS是滤纸上加入2ul PBS。

图2是角膜及泪膜的组织学结构示意图。其中，1是脂层(lipid layer)；2是水层(aqueous layer)；3是粘液层(mucous layer)；4是上皮细胞层(epithelium)；5是Bowman氏膜(Bowman s membrane)；6基质层(stroma)；7Descernet氏膜(Descernet’s membrane)；8内皮细胞层(enclothelium)。

图3是RTN4B诱导小鼠角膜的血管生成图。使用hydron作为缓释物。A：PBS。B：200ng RTN4B。

图4是细胞粘附比率图。其中，黑色表示HUVEC(人原代脐静脉内皮细胞ATCCCRL-1730)，ECV304(人脐静脉内皮细胞株，CRL-1998)。

图5是划痕实验结果图。

图6是细胞迁移比率图。其中，11是阴性对照，12是RTN4B(250ng/L)，13是RTN4B(500ng/L)，14是VEGF(100ng/L)。5h和9h分别是5个小时和9个小时。

具体实施方式

实施例1鸡胚尿囊膜(CAM)试验

材料：

1.海兰白壳种蛋，购自上海家禽育种有限公司。

2.弯头镊子，剪刀。

3.酒精面球。

4.打孔器。

5.培养皿。

6.地赛米松磷酸钠注射液。

7.Whatman一型滤纸。

8.bFGF。

步骤：

1.准备滤纸：用70％乙醇消毒的打孔器准备合适数量的滤纸(直径5mm)，放在培养皿中高压湿热灭菌并烘干。在超净工作台上向每一片滤纸上加地赛米松磷酸钠注射液8ul/片，在无菌层流下风干30分钟。

2.在37.5摄氏度和51％的相对湿度下，培养海兰白壳种蛋。在胚胎发育第3天开窗放入滤纸。具体的操作是用70％的酒精面球擦拭鸡蛋的气室端和准备开窗的部位。在气室端钻孔并将鸡蛋平放使开窗部位朝上放置约5分钟。用美工刀片在开窗部位刻出一个边长约1cm的方框，尽量不要碰割破下面的壳膜。用带齿的镊子沿方框的边将其掀开，用洗耳球从气室端的孔抽气，使绒毛尿囊膜与壳膜分离并下沉。用透明胶带密封气室端的孔和窗口。

3.在胚胎发育第10天，向滤纸片上分别加bFGF(25ng/ul)、RTN4B(200ng/ul)和PBS各2ul，在超净工作台上风干10分钟。打开窗口的透明胶带，用弯头镊子将滤纸片放在尿囊膜上血管较少的部位，用透明胶带封口，然后放回培养箱继续培养。

4.计数：在胚胎发育第13天，将鸡蛋取出，去掉透明胶带，加入1ml4％多聚甲醛，固定10分钟后，将窗口周围的蛋壳拨开，把滤纸片和周围的组织剪下放在装有4％多聚甲醛的皿里。用PBS洗后，放在载玻片上，用体示显微镜观察并拍照。计数滤纸片下的血管分支数。

结果：如图1所示，黑色线条为生成的血管。可见，放入含有RTN4B滤纸片的胚胎中，血管生长明显比其它胚胎的血管生长要快。

实施例2角膜实验

材料：

KM小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司

Hydron，全称是Poly(2-hydroxypropyl methacrylate)，sigma公司

步骤：

1.准备hydron，点蛋白

hydron全称是Poly(2-hydroxypropyl methacrylate)，购自sigma公司。Hydron又名hydrogel(水凝胶)，是通过发生水化作用形成起缓释作用的凝胶，从而控制释放速度。

将32mg硫糖铝溶解在72μl的PBS中混匀，hydron用无水乙醇配制成12％的溶液。取两种溶液各50μl等体积混合。

在超净工作台上，将混合液点在parafilm膜上，约0.5mm直径，每个pellet约含有0.5μl混合液，尽量突出。点好后，在紫外照射下吹20分钟。

在pellet上点蛋白，小鼠角膜模型中bFGF比VEGF作用强，所以一般bFGF用10-80ng，VEGF用160ng左右。大剂量的促血管生成因子在做抑制的实验的时候使用。我们的bFGF用量为50ng。

2.麻醉小鼠。

一般选用6-8周的雌性小鼠，体重约22-33g。bFGF促新生血管的作用与小鼠品系有关，常用小鼠中以C57BL和Balb/c最好。

麻醉剂的注射剂量与小鼠的体重成正比，我们用的麻醉剂(盐酸氯氨酮：地西泮＝2∶1)腹腔注射KM小鼠的经验剂量在120μl左右。全麻后的小鼠再用lidocain·Hcl进行局部麻醉，并扩瞳。

3.手术放载体。

角膜的结构如图2。角膜是无血管的透明组织，其养分靠角巩膜缘血管网扩散提供。操作方法是：用注射器的针头，使其斜面向内，沿眼球的切面向一侧做口袋，跟角巩膜缘的距离约0.5-0.7mm，注入RTN4B。如果为了避免由于机械损伤造成的假阳性，可以将距离适当拉大。

4.手术后的小鼠在当天和第二天在伤口处涂抹红霉素或金霉素眼膏，以后每天滴加地塞米松一次，以便消除炎症反应。一般3-4d开始产生微血管，7-10d血管长至pellet，超过10d没有血管的视为阴性。

5.手术后1w，拍照，摘除眼球，用4％多聚甲醛固定，4℃保存，备做组化分析。可以通过苏木精/伊红染色，或者用巨噬细胞特异性标志物抗体、antiCD31抗体(IHC，BD公司，Biosciences，550389)来区分新生血管和炎症反应。

6.计算

a.S＝C/12×3.1416×[r²-(r-L)²]；其中，S：Area，面积，单位为mm²(平方毫米)；C：clock hours of neovascularization，新血管形成钟点数，每一钟点等于30度；r：Radius of cornea，角膜半径；L：maximal vessel length，最大血管长度。

b.S＝0.2×3.1416×VL×CN；其中，S：Area，面积，单位为mm²(平方毫米)；CN：clock hours of neovascularization，新血管形成钟点数，每一钟点等于30度。VL：maximal vessel length，最大血管长度。

结果显示，如图3所示，与未加入RTN4B的小鼠角膜相比，用了RTN4B后，小鼠角膜的血管数量和血管长度明显增加，面积也大大增加。

实施例3细胞粘附实验

1.rtn4b蛋白用pbs做梯度稀释，终浓度分别为60和600nM，并设立阴性对照(pbs和bsa)和阳性对照af(Casade biologics，5006-100)。取96孔板一块，将上述溶液各取50微升加入不同孔中，每组五个复孔。之后置于4度包被过夜。

2.第二天将包被液吸去，用PBS洗涤各孔，洗两遍，每孔加入150微升浓度为1毫克每毫升的BSA(牛血清白蛋白)之后置于37度封闭1小时。

3.在封闭过程中，消化细胞ECV304至单细胞，用血细胞计数板计数细胞数，计算细胞浓度。

4.将所需细胞液吸出，1000转每分钟离心5分钟，去除上清，加入所需体积无血清培养基，重悬细胞。

5.封闭完成后，将96孔板取出，吸取多余bsa，加入细胞悬液，每孔10⁴细胞。之后置于37度培养2小时。

6.弃去培养基，加入pbs，100微升每孔，洗两遍，加入MTS(Promega，G5430)，4小时后酶标仪(Bio-rad，型号550)测定吸光值。

7.将数值进行分析，统计，作图。

结果显示，用了RTN4B的细胞，与只用PBS的相同细胞相比，粘附率(剩余细胞数量/初始(或者对照)细胞数量)大大增加。而且，RTN4B的用量越多，粘附率增加越多。详见图4。

实施例4划痕实验

将ecv304细胞重悬于DMEM+10％FBS，种在35mm的平皿中，每个皿种约4×10⁵个细胞。细胞贴壁8个小时后，用PBS洗两遍，加入无血清DMEM，使细胞饥饿24小时。之后用牙签在皿上划去一层细胞，PBS洗两遍以去除细胞残渣。加入蛋白后0h，4h，8h，12h和23h拍照，以记录不同时间划痕的愈合情况。每个视野下的迁移面积等于初始面积减去不同时间拍照时的面积，比较不同实验组之间的结果。

在宽度相同的条件下，迁移率可以采用

迁移率＝(初始距离减去不同时间拍照时的距离)/初始距离的公式计算。所用显微镜是Moticam，1300，所用相机为Motic，AE31。以VEGF为阳性对照。分析软件：Motic Image。

结果显示，用了RTN4B的细胞，与只用PBS的相同细胞相比，迁移率大大增加。而且，RTN4B的用量越多，迁移率增加越多。详见图5和图6。

Claims (4)

1.RTN4B在制备血管促进生成药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述的血管促进生成药物是将RTN4B蛋白与药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述的药物是片剂、针剂、粉剂或者口服液。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述的药物中RTN4B蛋白的含量为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。

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