CN100577212C - E4bp4基因在胚胎着床过程中的功能及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了E4BP4基因的新用途，其可被用作调节胚胎着床(即胚胎植入)的调节剂。在胚胎着床前期阻断E4BP4基因的表达或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，可抑制胚胎着床，反之则促进着床；在胚胎着床后期阻断E4BP4基因的表达或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，可促进胚胎着床，反之则抑制着床。本发明首次发现E4BP4基因及其表达产物参与调控胚胎着床，因而为胚胎着床过程的控制提供了新的依据。

Description

E4BP4基因在胚胎着床过程中的功能及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及E4BP4基因在胚胎着床过程中的功能及其应用。

背景技术

胚胎着床(又称胚胎植入)是哺乳动物生殖过程中所特有的一个重要步骤，是指处于活化状态的胚胎与处于接受态的子宫相互作用，最后导致胚胎滋养层与子宫内膜建立紧密联系的过程。它是哺乳动物和人类特有的一个生殖生理步骤，也是进行生育调控的理想环节。着床过程是一个复杂的生理过程，涉及胚胎与子宫间极其复杂而精细的协同作用，包括胚胎的发育、分化，子宫内膜的同步变化，以及胚胎与子宫间的相互作用。研究和了解这些变化和相互作用的分子基础，将有助于揭示细胞的生长、分化、迁移和侵入性，细胞间的相互识别、粘附、信息交换、信号转导，以及局部免疫调节和免疫耐受的形成等具共性的生理机制，因而能为发展生育调节新技术和肿瘤治疗新技术提供新途径和新思路。并且，因着床过程完成后才算真正怀孕，所以针对胚胎着床过程进行生育调控，不存在伦理问题，是一个理想的生育调控作用环节。

腺病毒E4启动子结合蛋白-4基因(E4BP4，adenovirus E4 promoter-bindingprotein 4)，又名NFIL3或NFIL3/E4BP4。最初被发现能识别和抑制腺病毒E4启动子，并因此而得名，它是一种由462个氨基酸构成的蛋白分子，为DNA结合蛋白bZIP转录因子超家族的成员之一(Cowell，I.G.，1992，Transcriptionalrepression by a novel member of the bZIP family of transcription factors.Mol.CellBiol.，12：3070-3077)，可通过与cAMP应答元件/活性转录因子样位点结合而抑制启动子的活性。目前已在多种细胞中发现E4BP4蛋白具有抑制细胞凋亡、促进细胞存活和增殖的作用，包括造血细胞(Kuribara.，R.等，1999，Two distinctinterleukin-3-mediated signal pathways，Ras-NFIL3(E4BP4)and Bcl-xL，regulatethe survival ofmurine pro-B lymphocytes.Mol.Cell Biol.，19：2754-2762)、血管平滑肌细胞、B淋巴细胞(Cowell，I.G.，2002，E4BP4/NFIL3，a PAR-related bZIPfactor with many roles.Bioessays，24：1023-1029.)、神经元细胞(Junghans，D.，S.Chauvet，E.Buhler，K.Dudley，T.Sykes&C.E.Henderson，2004，The CES-2-related transcription factor E4BP4is an intrinsic regulator of motoneuron growthand survival.Development，131：4425-4434)等。同时，细胞内钙离子可以通过CaM途径诱导E4BP4基因的表达，而且Th2细胞因子白介素-4(IL-4)对E4BP4基因的表达也有很强的诱导作用，E4BP4蛋白分子可能通过与诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因启动子结合而抑制该基因的表达。

虽然已有研究报道表明，在大鼠胚胎中也有E4BP4基因的表达，并在胚胎神经元细胞中的表达量最高，是一种参与调节运动神经元存活和生长的胚胎内源性调节因子(Junghans，D.，等，2004，The CES-2-related transcription factorE4BP4 is an intrinsic regulator of motoneuron growth and survival.Development，131：4425-4434.)，但至今未发现有关于E4BP4基因及其表达产物参与调控胚胎着床过程的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供E4BP4基因的一种新的用途，用于调控胚胎着床(即胚胎植入)过程。

在本发明的第一方面，提供一种E4BP4基因或其编码蛋白的用途，所述的E4BP4基因或其编码蛋白被用作调节胚胎着床的调节剂。

在本发明的第二方面，提供一种E4BP4基因或其编码蛋白的用途，所述的E4BP4基因或其编码蛋白被用于制备调节胚胎着床的药物。

在本发明的第三方面，提供一种E4BP4拮抗剂的用途，所述的E4BP4拮抗剂被用作调节胚胎着床的调节剂。

在本发明的第四方面，提供一种E4BP4拮抗剂的用途，所述的E4BP4拮抗剂被用于制备调节胚胎着床的药物。

在本发明的一个优选例中，所述的调节胚胎着床的药物选自：避孕药、或辅助生育药。

在本发明的一个优选例中，所述的拮抗剂是E4BP4的反义核酸、或抗E4BP4多肽的抗体。

在另一优选例中，在胚胎着床前期(对于人，于月经周期第19天～第24天)，给予所述的E4BP4拮抗剂，阻断E4BP4基因的表达，或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，从而抑制胚胎着床，达到避孕目的。

在另一优选例中，在胚胎着床后期(对于人，于月经周期第26天～第28天)，给予所述的E4BP4拮抗剂，阻断E4BP4基因的表达，或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，从而促进胚胎着床，达到辅助生育目的。

在本发明的第五方面，提供一种E4BP4激动剂的用途，所述的E4BP4激动剂被用作调节胚胎着床的调节剂。

在本发明的第六方面，提供一种E4BP4激动剂的用途，所述的E4BP4激动剂被用于制备促进胚胎着床的药物。

在本发明的一个优选例中，所述的药物选自：避孕药、或辅助生育药。

在另一优选例中，在胚胎着床前期(对于人，于月经周期第19天～第24天)，给予所述激动剂，促进E4BP4基因的表达，或向细胞内定向导入E4BP4蛋白或其类似物，可促进胚胎的着床，从而达到辅助生育目的。

在另一优选例中，在胚胎着床后期(对于人，于月经周期第26天～第28天)，给予所述激动剂，促进E4BP4基因的表达，或向细胞内定向导入E4BP4蛋白或其类似物，可抑制胚胎的着床，从而达到避孕目的。

在本发明的第七方面，提供一种药物组合物，它含有安全有效量的E4BP4多肽、其激动剂或其拮抗剂，以及药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了不同孕期小鼠子宫和胚胎组织中E4BP4基因表达水平的Northern印迹分析。其中，1：未孕成年雌小鼠子宫；2：孕第1天小鼠子宫；3：孕第2天小鼠子宫；4：孕第3天小鼠子宫；5：孕第4天小鼠子宫；6：孕第6天小鼠子宫着床位点；7：孕第6天小鼠子宫非着床位点；8：孕第7天小鼠子宫着床位点；9：孕第7天小鼠子宫非着床位点；10：孕第7天小鼠胚胎；11：孕第8天小鼠子宫着床位点；12：孕第8天小鼠子宫非着床位点；13：孕第8天小鼠胚胎；14：孕第9天小鼠子宫着床位点；15：孕第9天小鼠子宫非着床位点；16：孕第9天小鼠胚胎。

图2显示了孕早期小鼠子宫组织中E4BP4蛋白表达水平的Western印迹分析。其中，(A)各样品的Western印迹，(B)各样品的考马斯亮蓝染色。1：未孕成年雌小鼠子宫；2：孕第2天小鼠子宫；3：孕第3天小鼠子宫；4：孕第4天小鼠子宫；5：孕第6天小鼠子宫非着床位点；6：孕第6天小鼠子宫着床位点；7：孕第7天小鼠子宫非着床位点；8：孕第7天小鼠子宫着床位点。

图3显示了小鼠子宫组织中E4BP4 mRNA的原位(in situ)杂交分析。其中，A.孕第1天子宫；B.孕第4天子宫；C.孕第5天子宫着床位点；D.孕第6天子宫着床位点；E.孕第7天子宫着床位点；F.孕第8天子宫着床位点；G.人工蜕膜化对照子宫组织；H.人工蜕膜化子宫组织；I.孕第8天子宫着床位点(阴性对照)。并且，图中1为子宫腔；g为腺体；sc为基质细胞；dc为蜕膜细胞；em为胚胎；标尺＝10μm。箭头所指处为杂交信号。

图4显示了E4BP4蛋白在着床期小鼠子宫组织中的表达。其中，A.孕第5天子宫非着床位点；B.孕第5天子宫着床位点；C.孕第6天子宫非着床位点；D.孕第6天子宫着床位点；E.孕第6天子宫着床位点(阴性对照)；F.孕第7天子宫着床位点。并且，图中1为子宫腔；g为腺体；sc为基质细胞；dc为蜕膜细胞；em为胚胎；标尺＝10μm。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现腺病毒E4启动子结合蛋白-4基因(E4BP4基因)参与调控胚胎着床过程中的蜕膜化反应，从而可调控胚胎的着床。基于此完成本发明。

在本发明中，术语“E4BP4蛋白”、“E4BP4多肽”、“E4BP4因子”或“腺病毒E4启动子结合蛋白-4”等可互换使用，都指具有腺病毒E4启动子结合蛋白-4氨基酸序列(如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始的甲硫氨酸。此外，这些术语还包括在其他哺乳动物(如狗、牛、羊、猴)中的具有调控胚胎着床功能的同系物或同源蛋白。

小鼠E4BP4基因cDNA序列(GenBank登录号：AY061760)如SEQ ID NO：1；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。人E4BP4基因cDNA序列(GenBank登录号：X64318)如SEQ ID NO：3；其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：4。小鼠E4BP4基因与人EABP4基因具有同源性。小鼠E4BP4基因cDNA序列中的第1位碱基“T”至第1397位“T”的长度为1397bp的cDNA序列与人E4BP4基因cDNA序列中的第208位碱基“T”至第1604位“T”的长度为1397bp的cDNA序列有79％的同源性。小鼠E4BP4基因编码的氨基酸序列(462aa)与人E4BP4基因编码的氨基酸序列(462aa)有81％的同源性。

人和小鼠的E4BP4蛋白分子中都含有2个功能区域，第一个功能域是由53个aa残基组成的碱性亮氨酸拉链结构域(basic region leucin zipper，BRLZ)(氨基酸序列下划线标出的第一段序列)；第二个功能域是由333个aa残基组成的受白介素-3调控的转录因子序列(Vertebrate interleukin-3regulated transcriptionfactor)(氨基酸序列下划线标出的第二段序列)。

应理解，由于人和鼠等哺乳动物的E4BP4蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。

一类特别优选的蛋白是E4BP4类似物，即在其他哺乳动物(如牛、羊、兔、狗、猴等)中E4BP4的同源蛋白。这些其他物种的同源蛋白的编码序列，可根据E4BP4的序列，通过杂交或扩增的方法而获得，进而通过常规重组方法获得这些同源蛋白。

如本文所用，“分离的E4BP4蛋白或多肽”是指E4BP4多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化E4BP4多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括E4BP4多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然E4BP4因子相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“E4BP4多肽”指具有调控胚胎着床功能的E4BP4因子活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的多肽。该术语还包括具有与E4BP4因子相同功能的、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括E4BP4因子的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与E4BP4 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗E4BP4多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含E4BP4多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了E4BP4多肽的可溶性片段。通常，该片段具有E4BP4多肽序列的至少约50个连续氨基酸，通常至少约100个连续氨基酸，较佳地至少约150个连续氨基酸，更佳地至少约200个连续氨基酸，最佳地至少约300个连续氨基酸。

本发明还涉及E4BP4多肽的类似物。这些类似物与天然E4BP4多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的E4BP4核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

E4BP4多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接作为调控胚胎的着床过程的药物，比如通过阻断E4BP4基因的表达，或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，影响子宫内膜的蜕膜化而干扰胚胎的着床过程，从而达到避孕目的；以及用于筛选促进或对抗E4BP4因子功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组E4BP4因子筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激E4BP4因子功能的多肽分子。另一方面，本发明还包括对E4BP4DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于E4BP4基因产物或片段。较佳地，指那些能与E4BP4基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制E4BP4因子的分子，也包括那些并不影响E4BP4因子功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的E4BP4基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的E4BP4基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达E4BP4因子或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256：495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断E4BP4功能的抗体以及不影响E4BP4功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用E4BP4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与E4BP4基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗E4BP4的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的E4BP4。

本发明中的抗体作为E4BP4的拮抗剂，还可用于抑制胚胎着床，从而用于避孕。给予适当剂量的抗体可以阻断E4BP4的产生或活性。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与E4BP4生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。例如，能与E4BP4结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、阴道内或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明E4BP4多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的E4BP4蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

E4BP4的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的，通过调节E4BP4的表达来调节受孕和避孕。

本发明还涉及定量和定位检测E4BP4水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括放射免疫测定等方法。试验中所检测的E4BP4水平，可以用作解释E4BP4因子在不孕等疾病中的重要性和用于诊断。

一种检测检测样品中是否存在E4BP4因子的方法是利用E4BP4因子的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与E4BP4因子特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在E4BP4因子。

E4BP4基因主要在妊娠早期的小鼠子宫内膜子宫腔周围的基质细胞及其蜕膜化后形成的初级蜕膜细胞中表达，而未受孕小鼠子宫组织中则未检测到该基因的表达。在妊娠初始期，E4BP4基因的表达水平最初是随着孕期的增加而逐步提高，至孕第6天(以查见阴栓为孕第1天)，即胚胎着床后期和原羊膜腔形成期，其表达量达到最高值，随后开始降低，至孕第9天，即使在胚胎着床位点也已检测不到该基因的表达。同时，E4BP4基因在人工诱导蜕膜化的假孕小鼠子宫内膜蜕膜化区也有较高水平的表达，表明该基因的表达与基质细胞的蜕膜化有关。

由于蜕膜与母胎间的营养供应和免疫耐受有关，因此子宫内膜的蜕膜化对于妊娠的建立和维持至关重要。在蜕膜化过程中，蜕膜细胞是以不依赖于胚胎的形式同时经历增殖和凋亡。由于目前已在多种细胞中发现E4BP4具有抑制细胞凋亡、促进细胞存活和增殖的作用，因此可知，在小鼠孕第1天-孕第4天期间，E4BP4基因在子宫组织中的表达逐步增强，有助于基质细胞的增殖，为蜕膜化作准备；在孕第5天和孕第6天，E4BP4基因主要在蜕膜细胞中的高表达，将有效抑制蜕膜细胞的凋亡，从而促进蜕膜的形成；而自孕第7天开始，E4BP4基因在蜕膜细胞中的表达急速下调，则有助于蜕膜的退化，以协调蜕膜细胞的数量和胚胎滋养层细胞对子宫内膜组织的侵润性。此外，因E4BP4蛋白可通过与诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因启动子的结合而抑制iNOS基因的表达(见Wallace等人，BBRC232：403，1997)，因此，E4BP4基因在孕第6天后的表达水平快速下调，将有利于iNOS基因的高表达，从而能提高细胞内NO的合成，促进胚胎的着床。

因此，在胚胎着床前期，如果能阻断E4BP4基因的表达，或封闭其表达产物E4BP4蛋白的生物功能，就可能通过影响子宫内膜的蜕膜化而干扰胚胎的着床过程，从而达到避孕目的。在胚胎着床后期，如果能促进E4BP4基因的表达，或向细胞内定向导入具有与E4BP4蛋白相同生物功能的类似物，就可能通过抑制iNOS基因的表达而抑制胚胎的着床和胎儿的发育，同样可达到抗着床避孕的目的。

此外，胚胎组织与肿瘤组织都是高度增殖和高度分化的组织，而且都属于异常组织，并对正常机体组织有侵润性，只是胚胎组织对子宫内膜组织的侵润是有限制的，而肿瘤组织对人体组织的侵润是无限制的。鉴于E4BP4基因具有调节胚胎滋养层细胞对子宫内膜组织侵润性的作用，因而其可能在调节肿瘤组织对机体组织的侵入方面中也具有潜在的应用价值。

本发明的主要优点在于：首次发现腺病毒E4启动子结合蛋白-4基因(E4BP4基因)及其表达产物参与调控胚胎着床中的蜕膜化反应，因而为胚胎着床过程的控制提供了新的依据。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

E4BP4基因的表达

本发明人分别从转录和翻译水平检测和比较了E4BP4基因在小鼠围着床期子宫组织中的表达状况。取8～10周龄的成年ICR小鼠，雌、雄小鼠按2∶1比例合笼饲养，次日早晨通过检查雌小鼠阴道栓以判断是否交配，并以见栓当日作为孕第1天。对于未孕雌小鼠，以及孕第1天-孕第4天小鼠，分别于当天上午8:00以脱颈法处死后，收集其子宫组织。对于孕第5天和孕第6天小鼠，分别于当天上午8:00先从尾静脉注射芝加哥蓝溶液(1％生理盐水，每只小鼠注射0.1ml)后，以脱颈法处死，收集呈蓝色的着床部位和不着色的非着床部位子宫组织。对于孕第6天-孕第9天小鼠，其着床部位和非着床部位可以肉眼分辨，分别于当天上午8:00以脱颈法处死后，收集着床部位和非着床部位的子宫组织，并将孕第7-第9天的胚泡从相应的着床部位组织中分离出来。对于假孕小鼠，则于假孕第4天上午8:00，在其一侧子宫腔内注射25μl芝麻油，另一侧子宫不注射芝麻油，作为人工蜕膜化对照。然后于假孕第8天上午8:00处死小鼠，注油的一侧子宫角应发生蜕膜化，另一侧子宫角应没有变化，分别收集两侧子宫组织，即为人工蜕膜化子宫组织及其对照组子宫组织。收集到的组织样品用于Northern印迹分析、Western印迹分析、原位(in situ)杂交分析和免疫组织化学分析。

结果见图1-4。图1为不同孕期小鼠子宫和胚胎组织中E4BP4基因转录水平的Northern印迹分析结果；图2为孕早期小鼠子宫组织中E4BP4蛋白表达水平的Western印迹分析结果；图3为小鼠子宫组织中E4BP4 mRNA的原位杂交分析结果；图4为小鼠子宫组织中E4BP4蛋白的免疫组织化学分析结果。由图可知，E4BP4基因主要在妊娠早期的小鼠子宫内膜子宫腔周围的基质细胞及其蜕膜化后形成的初级蜕膜细胞中表达，而未受孕小鼠子宫组织中则未检测到该基因的表达。在妊娠初始期，E4BP4基因的表达水平最初是随着孕期的增加而逐步提高，至孕第6天(以查见阴栓为孕第1天)，即胚胎着床后期和原羊膜腔形成期，其表达量达到最高值，随后开始降低，至孕第9天，即使在胚胎着床位点也已检测不到该基因的表达。

此外，还发现E4BP4基因在人工诱导蜕膜化的假孕小鼠子宫内膜蜕膜化区也有较高水平的表达(图3)，表明该基因的表达与基质细胞的蜕膜化有关。由于目前已在多和细胞中发现E4BP4具有抑制细胞凋亡、促进细胞存活和增殖的作用，因此结合前面的结果可知，在小鼠孕第1天-孕第4天期间，E4BP4基因在子宫组织中的表达逐步增强，有助于基质细胞的增殖，为蜕膜化作准备；在孕第5天和孕第6天，E4BP4基因主要在蜕膜细胞中的高表达，可有效抑制蜕膜细胞的凋亡，从而促进蜕膜的形成；而自孕第7天开始，E4BP4基因在蜕膜细胞中的表达急速下调，则有助于蜕膜的退化，以协调蜕膜细胞的数量和胚胎滋养层细胞对子宫内膜组织的侵润性。

此外，E4BP4蛋白可通过与诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)基因启动子的结合而抑制iNOS基因的表达(见Wallace等人，BBRC232：403，1997)，因此，E4BP4基因在孕第6天后的表达水平快速下调，有利于iNOS基因的高表达，从而能提高细胞内NO的合成，促进胚胎的着床。

实施例2

E4BP4mRNA的反义寡核苷酸链在小鼠体内对胚胎的着床呈抑制作用

针对小鼠mRNA编码区中20个核苷酸序列：5’-AUCAAAAAGGAGCCCGCACC-3’(SEQ ID NO：5)，本发明人合成了其反义DNA片段：5’-GGTGCGGGCTCCTTTTTGAT-3’(SEQ ID NO：6)。同时，合成了随机序列的对照DNA片段：5’-TGAGGAGCAGCCCACAGAAG-3’(SEQ IDNO：7)。以美国Madison公司的Mirus TransIT^R Polymer为转染剂，进行了体内E4BP4基因功能封闭实验，方法如下：

(1)将10μL(1μg/μL)Mirus TransIT^R Polymer溶液和20μL Delivery溶液混合后，分别加入10μL反义DNA溶液、10μL对照DNA溶液、10μL DNA-溶液，配制成三种不同的注射溶液；

(2)于孕第4天下午3:00～4:00，将注射溶液注入小鼠的子宫腔内，每侧子宫腔注射40μL溶液，同一小鼠的两侧子宫腔内注射同一种溶液；

(3)于孕第8天上午9:00处死小鼠，取出子宫组织，对每侧子宫内的胚胎数进行计数。

结果如表1所示。

表1

组别	注射溶液	受试子宫角数(n)	平均每个子宫角中的胚胎数(X±SD)	P<sup>a</sup>	抑制率<sup>b</sup>
						空白对照组	10μL转染剂+20μL Delivery溶液+10μL DNA-溶液	30	4.3±2.4	-	-
反义DNA组(低)	10μL转染剂+20μL Delivery溶液+10μL(10μg)反义DNA溶液	20	2.5±2.3	P＜0.05	42％
						反义DNA组(高)	10μL转染剂+20μL Delivery溶液+10μL(33μg)反义DNA溶液	50	1.3±1.3	P＜0.01	70％
对照DNA组(低)	10μL转染剂+20μL Delivery溶液+10μL(10μg)对照DNA溶液	20	3.7±3.5	P＜0.05	14％
						对照DNA组(高)	10μL转染剂+20μL Delivery溶液+10μL(33μg)对照DNA溶液	50	2.9±2.6	P＜0.05	33％

表中，a：与空白对照组相比；b：与空白对照组相比

将反义DNA组(低)与对照DNA组(低)相比，抑制率为32％；将反义DNA组(高)与对照DNA组(高)相比，抑制率为55％；显示出一定的剂量效应。

这表明，E4BP4反义核酸能够明显降低正常着床的胚胎数。

实施例3筛选E4BP4的拮抗剂

按实施例2所述方法，将以下两组物质(替换反义核酸和转染剂)施用于怀孕小鼠，然后观察对胚泡着床的体内抑制作用：(a)候选物质+E4BP4因子；(b)E4BP4因子。

如果组(a)的胚泡着床率在统计学上显著低于组(b)的胚泡着床率，则表明该候选物质是E4BP4的拮抗剂。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市计划生育科学研究所

<120>E4BP4基因在胚胎着床过程中的功能及其应用

<130>059723

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1665

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>1

tttctgatgc agctgagaaa aatgcagacc atcaaaaagg agcccgcacc cctagatcct   60

accagcagct cagacaagat gctgctgctg aactctgcct tagctgaggt ggccgaggac  120

ctagcctcag gtgaagattt gctcctgaac gaagggagca tggggaaaaa caaatcctcg  180

gcgtgtcgga gaaaacggga attcattccg gacgagaaga aagacgccat gtattgggag  240

aaacggcgga aaaacaacga agctgccaaa agatctcggg agaagcgccg cctcaatgac  300

ctggttttgg agaacaagct gattgccctg ggagaagaaa atgccacttt aaaagctgag  360

ctgctctccc tgaaattaaa gtttggttta attagctcca cggcgtatgc ccaagaaatc  420

cagaaactca gtaattccac agctgtctac tttcaggact accagacatc caaggctgcc  480

gtgagctctt ttgtggacga gcatgagcct gcgatggtag ccggaagttg catctcagtc  540

atcaagcact ctccccagag ctcgctctcc gatgtgtcag aggtgtcctc ggtggagcac  600

actcaggaaa gccccgcaca gggaggctgc cggagccctg agaacaagtt ccctgtgatc  660

aagcaggagc ccgtggagtt ggagagcttt gccagggagg ccagggagga gcggggcacg  720

tattccacct ccatctacca gagctacatg ggaagctctt tctccactta ctcccactcc  780

ccacccctct tgcaggtcca tgggtccact agcaactccc caagaacctc agaggccgat  840

gagggtgtag tgggcaagtc ttctgatggg gaagacgaac aacaggtccc taagggcccc  900

atccattctc cagtggagct gcaacgggtt cacgccacgg tggtgaaggt tccggaagtg  960

aacccttctg ccttaccgca caagcttcgg attaaagcca aggccatgca ggtcaaagtg  1020

gaggctttgg acagcgagtt tgaaggcatg cagaaactct cttcacccgc cgatgcgatc    1080

gccaaaagac attttgacct ggagaaacat ggaacctcgg gtatggccca ttcctccctc    1140

cctcctttct cagtgcaggt gacgaacatt caagattggt ccctcaaatc ggaacactgg    1200

catcacaaag aactgagcag caaaactcag agtagcttca aaacaggtgt ggtggaagtc    1260

aaagacggtg gctataaggt ttccgaagct gagaatttgt atttgaagca gggaatagca    1320

aacttatctg cagaggtggt ctcgctcaag agattcatag ccacacaacc gatctcggct    1380

tcggactcca ggtaaatggc tgctgaccga gctatgcatg gaggaggagg ctgttggtac    1440

catactgaat ttccactgga cctctaaagt catttcactg tagtgtacac aacggcgtct    1500

gtctgggtgt ccttgtgtgc acgcgctgaa gacttgatgc cctcactctg cctggcgtgt    1560

agtcagatag ccccccacag aggctgtaca tactgaacgt tatttttgct ctattataaa    1620

gtgtgtatgt tgccagtttc aataaaggat tggtggcaag cacaa                    1665

<210>2

<211>462

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>2

Met Gln Leu Arg Lys Met Gln Thr Ile Lys Lys Glu Pro Ala Pro Leu

1               5                   10                  15

Asp Pro Thr Ser Ser Ser Asp Lys Met Leu Leu Leu Asn Ser Ala Leu

            20                  25                  30

Ala Glu Val Ala Glu Asp Leu Ala Ser Gly Glu Asp Leu Leu Leu Asn

        35                  40                  45

Glu Gly Ser Met Gly Lys Asn Lys Ser Ser Ala Cys Arg Arg Lys Arg

    50                  55                  60

Glu Phe Ile Pro Asp Glu Lys Lys Asp Ala Met Tyr Trp Glu Lys Arg

65                  70                  75                  80

Arg Lys Asn Asn Glu Ala Ala Lys Arg Ser Arg Glu Lys Arg Arg Leu

                85                  90                  95

Asn Asp Leu Val Leu Glu Asn Lys Leu Ile Ala Leu Gly Glu Glu Asn

        100                 105                 110

Ala Thr Leu Lys Ala Glu Leu Leu Ser Leu Lys Leu Lys Phe Gly Leu

        115                 120                 125

Ile Ser Ser Thr Ala Tyr Ala Gln Glu Ile Gln Lys Leu Ser Asn Ser

    130                 135                 140

Thr Ala Val Tyr Phe Gln Asp Tyr Gln Thr Ser Lys Ala Ala Val Ser

145                 150                 155                 160

Ser Phe Val Asp Glu His Glu Pro Ala Met Val Ala Gly Ser Cys Ile

                165                 170                 175

Ser Val Ile Lys His Ser Pro Gln Ser Ser Leu Ser Asp Val Ser Glu

            180                 185                 190

Val Ser Ser Val Glu His Thr Gln Glu Ser Pro Ala Gln Gly Gly Cys

        195                 200                 205

Arg Ser Pro Glu Asn Lys Phe Pro Val Ile Lys Gln Glu Pro Val Glu

    210                 215                 220

Leu Glu Ser Phe Ala Arg Glu Ala Arg Glu Glu Arg Gly Thr Tyr Ser

225                 230                 235                 240

Thr Ser Ile Tyr Gln Ser Tyr Met Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr Ser

                245                 250                 255

His Ser Pro Pro Leu Leu Gln Val His Gly Ser Thr Ser Asn Ser Pro

            260                 265                 270

Arg Thr Ser Glu Ala Asp Glu Gly Val Val Gly Lys Ser Ser Asp Gly

        275                 280                 285

Glu Asp Glu Gln Gln Val Pro Lys Gly Pro Ile His Ser Pro Val Glu

    290                 295                 300

Leu Gln Arg Val His Ala Thr Val Val Lys Val Pro Glu Val Asn Pro

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Ser Ala Leu Pro His Lys Leu Arg Ile Lys Ala Lys Ala Met Gln Val

                325                 330                 335

Lys Val Glu Ala Leu Asp Ser Glu Phe Glu Gly Met Gln Lys Leu Ser

            340                 345                 350

Ser Pro Ala Asp Ala Ile Ala Lys Arg His Phe Asp Leu Glu Lys His

        355                 360                 365

Gly Thr Ser Gly Met Ala His Ser Ser Leu Pro Pro Phe Ser Val Gln

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Val Thr Asn Ile Gln Asp Trp Ser Leu Lys Ser Glu His Trp His His

385                 390                 395                 400

Lys Glu Leu Ser Ser Lys Thr Gln Ser Ser Phe Lys Thr Gly Val Val

                405                 410                 415

Glu Val Lys Asp Gly Gly Tyr Lys Val Ser Glu Ala Glu Asn Leu Tyr

            420                 425                 430

Leu Lys Gln Gly Ile Ala Asn Leu Ser Ala Glu Val Val Ser Leu Lys

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Arg Phe Ile Ala Thr Gln Pro Ile Ser Ala Ser Asp Ser Arg

    450                 455                 460

<210>3

<211>1923

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<222>(1833)..(1833)

<223>n is a，c，g，or t

<400>3

gcccctttct ttctcctcgt cggcccgaga gcaggaacac gataacgaag gaggcccaac   60

ttcattcaat aaggagcctg acggatttat cccagacggt agaacaaaag gaagaatatt  120

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cctacacaca tagatagggt aaggttgttt ctgatgcagc tgagaaaaat gcagaccgtc  240

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tctgctttaa cggaagtgtc agaagactcc acaacaggtg aggacgtgct tctcagtgaa  360

ggaagtgtgg ggaagaacaa atcttctgca tgtcggagga aacgggaatt cattcctgat  420

gaaaagaaag atgctatgta ttgggaaaaa aggcggaaaa ataatgaagc tgccaaaaga  480

tctcgtgaga agcgtcgact gaatgacctg gttttagaga acaaactaat tgcactggga  540

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agctccacag catatgctca agagattcag aaactcagta attctacagc tgtgtacttt  660

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aaa                                                                1923

<210>4

<211>462

<212>PRT

<213>智人

<400>4

Met Gln Leu Arg Lys Met Gln Thr Val Lys Lys Glu Gln Ala Ser Leu

1               5                   10                  15

Asp Ala Ser Ser Asn Val Asp Lys Met Met Val Leu Asn Ser Ala Leu

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Arg Lys Asn Asn Glu Ala Ala Lys Arg Ser Arg Glu Lys Arg Arg Leu

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Ala Thr Leu Lys Ala Glu Leu Leu Ser Leu Lys Leu Lys Phe Gly Leu

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Ile Ser Ser Thr Ala Tyr Ala Gln Glu Ile Gln Lys Leu Ser Asn Ser

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Ser Val Ile Lys His Ser Pro Gln Ser Ser Leu Ser Asp Val Ser Glu

            180                 185                 190

Val Ser Ser Val Glu His Thr Gln Glu Ser Ser Val Gln Gly Ser Cys

        195                 200                 205

Arg Ser Pro Glu Asn Lys Phe Gln Ile Ile Lys Gln Glu Pro Met Glu

    210                 215                 220

Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Glu Pro Arg Asp Asp Arg Gly Ser Tyr Thr

225                 230                 235                 240

Ala Ser Ile Tyr Gln Asn Tyr Met Gly Asn Ser Phe Ser Gly Tyr Ser

                245                 250                 255

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            260                 265                 270

Arg Thr Ser Glu Thr Asp Asp Gly Val Val Gly Lys Ser Ser Asp Gly

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Glu Asp Glu Gln Gln Val Pro Lys Gly Pro Ile His Ser Pro Val Glu

    290                 295                 300

Leu Lys His Val His Ala Thr Val Val Lys Val Pro Glu Val Asn Ser

305                 310                 315                 320

Ser Ala Leu Pro His Lys Leu Arg Ile Lys Ala Lys Ala Met Gln Ile

                325                 330                 335

Lys Val Glu Ala Phe Asp Asn Glu Phe Glu Ala Thr Gln Lys Leu Ser

            340                 345                 350

Ser Pro Ile Asp Met Thr Ser Lys Arg His Phe Glu Leu Glu Lys His

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                405                 410                 415

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Arg Leu Ile Ala Thr Gln Pro Ile Ser Ala Ser Asp Ser Gly

450                 455                 460

<210>5

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggtgcgggct cctttttgat                     20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tgaggagcag cccacagaag                     20

Claims (2)

1.一种E4BP4拮抗剂的用途，其特征在于，所述的拮抗剂是E4BP4的反义核酸、其序列如SEQ ID NO：6所示，所述的E4BP4拮抗剂被用于制备调节胚胎着床的药物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物是：避孕药。

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