JPS61501627A - ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エリスロボエチンの生産 本発明は１本発明者の係属中のｌりｔ３年１２月１３日付は米国特許第ｊ　Ａ　 ／、　０２　参号、ｔｙｒａ年２月２７日付は米国特願第ｊｒシｉｔｓ号および ｉｖｙφ年り月２を日付は米国特許第ｔ！よｒ参１号の部分継続出願に係るもの である。

背　景 本発明は一般に遺伝物質の操作に関し、更に詳しくは、天然エリスロボエチンの 一次構造配列の一部もしくは全部及び（又は）−以上の生物学的性質を有するポ リペプチドの生産を可能とする組換え法に関する。

ム、遺伝物質の操作 遺伝物質とは、細胞及びウィルスの構成成分の生産をプログラムしかつ誘導し、 更に細胞及びウィルスにおける応答を支配する化学物質、として広く定義するこ とができる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として知られる長鎖高分子物質は、リ ボ核酸（ＲＮム）でプログラムされるある種のウィルスを除き、全ての生細胞及 びウィルスにおける遺伝物質を構成する。ＤＮＡ高分子における繰返し単位は参 つの異なるヌクレオチドであシ、各ヌクレオチドはリン酸基がついたデオキシリ ボース糖に結合するプリン（アデニン又はグアニン）又はピリミジン（チミジン 又はシトシン）のいずれかからなる。直鎖高分子型でのヌクレオチドの結合は。

一つのヌクレオチドの！′リン酸と他のそれの３′水酸基との連結による。機能 的ＤＮＡは一本領ヌクレオチド（デオキシオリゴヌクレオチドとして知られてい る）の安定な二重らせん結合型をなしておシ、その結合はプリン及びピリミジン 塩基間の水素結合〔即ち、アデニン（ム）とチミン（Ｔｌ、又はグアニン（Ｇ） とシトシン（Ｃ）との間で起こる「相補的」結合〕による。慣習的に、ヌクレオ チドはそれらの構成成分たるプリン又はピリミジン塩基名で呼ばれ、二重５ＤＮ ＡＫおけるヌクレオチドの相補的結合（即ち、Ａ−Ｔ及びＧ−Ｃ）は「塩基対」 と称される。リボ核酸は。

リボース及びリン酸基と結合したアデニン、グアニン、シトシン及びチミンとは 別のウラシル（ｔｒ）からなる。

最も簡単に言うならば、ＤＮＡのプログラム機能は特定のＤＮＡヌクレオチド鎖 （遺伝子）が比較的不安定なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮム）高分子に転写さ ねろ過程で一般に発揮される。一方、ｍ　ＲＮムは。

アミノ酸から構造、調節及び触媒蛋白質を形成するための鋳凰として機能する。

このｍＲＮムの「翻訳」過程では、ｍＲＮＡ鎖に沿りて個々のアミノ酸を運搬配 列させて適切なアミノ酸配列からなるポリペプチドを形成させる小さなＲＮム鎖 （ｔＲＮＡ）の作用がある。

ＤＮＡから誘導され、ポリペプチドの「発現Ｊ　ｉＣＭ与する２０個のアミノ酸 のいずれか一つのｔＲＮム供給及び配向のための基礎となるｍＲＮムの「メツセ ージ」は、３つのヌクレオチド塩基連続群たるトリプレット（三量体）「コード ン」の形になっている。ある意味では、蛋白質の形成は、遺伝子のヌクレオチド 鎖によシブログラムされた遺伝情報の最終的「発現」形態である。

「プロモーターＪＤＮム配列は、ＤＮＡ高分子における遺伝子に通常は「前置」 されていて１ｍＲＮムへの転写開始部位をなしている。「レギュレーター」ＤＮ Ａ配列もまた所与のＤＮＡ高分子中の遺伝子の通常は「上流」にあって（Ｊ２０ ち、前置されている）、転写開始頻度（即ち速度）を決定づける蛋白質と結合す る。

−まとめに「プロモーター／レギュレーター」又は「フントロールＪＤＮム配列 と称され１機能的ＤＮＡ高分子での任意の遺伝子（即ち一連の遺伝子）Ｋ前置さ れるこれらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的には発現）が生じるか否かを決 するよ５に作用し合う。ＤＮＡ高分子の遺伝子に「追随コしてｍＲＮムへの転写 終了の暗号を与えるＤＮＡ配列は、転写「ターミネータ−」配列と呼ばれる。

最近ｉｏ年間における微生物学的操作の焦点は、それらのＤＮＡ中に所望の生成 物に関する遺伝暗号情報を最初から有しておらず、あるいは（＠乳類の培養細胞 において）通常相当程度まで染色体遺伝子を発現させることのない生物を用いて 、工業的及び薬学的に重要な物質を生産しようとすることにあった。簡潔に述べ ると、所望のポリペプチド生成物の構造を特定する遺伝子が「ドナー」生物から 単離されるか、あるいは化学的に合成され１次いで細菌、酵母菌又は哺乳類の培 養細胞のように好ましくは自己複製単細胞生物たる他の生物に安定的に導入され ることにある。一旦これがなされれば、「トランス７オーメーシ璽ン」又は［ト ランスフェクシ璽ン」を受けた単細胞宿主細胞内で遺伝子の発現に関与する既存 の機構は、ｍＲＮム転写の鋳型として外来性ＤＮＡを用い、しかる後アミノ酸残 基の連鎖に翻訳させて所望の生成物が得られるよ５に作用する。

選択された宿主生物の形質転換に用いられる遺伝物質の単離、合成、精製及び増 幅のための「組換えＤＮＡ」方法論に関する技術については、特許及び文献の刊 行物が豊富にある。ツーエン（Ｃｏｈ＠ｎ　）らの米国特許第４１ｓ２Ｊ７，２ ２０号は１例えば、選択された外来性ＤＮＡ１ｌｉを有する「ハイブリッド」ウ ィルス性又は環状プラスミドＤＮＡによる単細胞宿主生物の形質転換に関する。

ツーエンらの特許方法では、まず、ウィルス性又は環状プラスミドＤＮＡを酵素 的に開裂して直鎖状ＤＮＡ鎖を得ることによシ形質転換ベクターを製造する。所 望の生成物に暗号コードする配列を通常有している選択された外来の（「外来性 」又は「異質」）ＤＮＡ鎖は、類似酵素の作用によシ直鎖型とされる。

直鎖ウィルス性又はプラスミドＤＮＡは、修復過程で作用し得る連結酵素の存在 下にて外来ＤＮＡとインキ−ベートされ、ウィルス性又は環状ＤＮＡプラスミド に「スプライス」された選択的外来性ＤＮＡ断片を含む「ハイブリッド」ベクタ ーが得られる。

ハイブリッドベクターによる適合単細胞宿主生物の形質転換によって、宿主細胞 群で多数の外来性ＤＮＡのコピーが形成される。いくつかの場合において、望ま しい結果は外来ＤＮＡの増加という単純なものであシ、得られる「生成物」はＤ ＮＡである。更に多くの場合において、形質転換の目標は、外来ＤＮＡによシコ ードされた商業的に重要な蛋白質又はポリペプチドフラグメントの単離可能な量 での大規模合成が、外来性ＤＮＡの宿主細胞によシ発現されることである。例え ば、米国特許第し１舊７３７号（シャイン）、第４４コ７工！７３号（マニス） 、第各コタ１６！２号（）−二ン）及びｔｙｒｚ年／Ｉ月２日に公開された欧州 特許出願第ｏｙＪ、ｔｔ２号も参照のこと。

ＤＮＡベクターにスプライシングするための特定のＤＮＡ配列をつくるには多数 の技術によることができるが、予定された宿主に対する「ドナー」としての「異 質性」の度合、及び宿主において発現されるべきポリペプチドの大きさによって かな）左右される。単純化しすぎるということを承知していえば、３つの選択可 能な重要な方法、Ｊ２＋１１ち、（ｌ）ドナーのゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮ Ａの「単離Ｊ　、　（２）目的とするポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ鎖の 化学的合成、及び（３）ドナー細胞から単離されたｚｎＲＮＡの酵素的「逆転写 」による二重鎖ＤＮＡのイン・ビトロ合成を採択し得るとい５ことができる。ｍ ＲＮムの［相補的ＪＤＮムの形成を含む最後に述べた方法は、一般に「ｅＤＮム 」法と称される。

ＤＮＡ配列合成法は、所望のポリペプチド生成物のアミノ酸残基の完全な配列が 公知である場合にしばしば選ばれる方法である。共同所有に係る係属中のアルド ン（ム１ｉｏｎ　）らｋよる米国特許出願第ａｒｔ参！７号（ｔｙｒｚ年参月ｌ ！日出願、ｌりｔ３年１／月２弘日にＷＯＩｒ３１０弘ｏｊ３として公開された ＰＣＴＵＢｒＪｌｏｏｔＯｊｔに相当）のＤＮＡ合成方法は、例えば下記のよう な高度に望ましい結果を生じる優れた手段である。即ち、その結果とは、発現の ために遇ばれた宿主生物にて高度に発現する遺伝子中に共通して見出される代替 性のあるコードンを存在させることができ（例えば、酵母菌又は大腸菌の「優先 」コードｙを与える）、原核宿主細胞にょシ容易には加工されない非翻訳性の「 イントロン」配列（＠乳類のゲノムＤＮム鎖及びそのｍＲＮＡ転写体に共通して 存在する）の存在を避けることができ、ゲノムＤＮＡ及びｅＤＮムに共通してコ ードされているが、細菌又は酵母菌の宿主細胞にて目的とするポリペプチドから さほど容易には開裂されない非所望の「リーダー」ポリペプチド配列の発現を避 けることができ、所望のプロモーター／レギュレーター及びターミネータ−配列 と結合する好都合の発現ベクターＩＣＤＮＡを容易に導入させることができ、並 びに、所望のポリペプチドの７ラグメント及び類縁体をコードする遺伝子を容易 に調製できることである。

望まれるポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が公知でない場合は、ＤＮＡ配列 の直接的生産は不可能であｌ）、ｅＤＮＡ法によシボリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列を単離することが、したがって前記した高レベルでの微生物、における 発現を可能化する発現ベクターが容易に集合してしま５という欠点にもかかわら すに選択される方法となる。目的とするｅＤＮＤＮＡ配列離するための標準的操 作としては、高レベルでの遺伝子発現に応答するものとして選ばれるドナー細胞 中に多量に存在するｍＲＮ人の逆転写によシ得られるプラスミド由来ｅｐＮＡｒ ライブラリー」（例えば、比較的多量の成長ホルモン生成物を発現する脳下垂体 細胞由来のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー）の調製がある。ポリペプチド°アミノ 酸配列の実質的部分が公知である場合は、「標的ＪｅＤＮＡに存在すると推定さ れる配列の複製からなる標識化一本領ＤＮＡプローブ配列を、−重鎖型に変性さ せたｅＤＮムのクローンフビーにて行なわれるＤＮム／ＤＮムハイプリダイゼー シｌノ法にオイて使用してもよい〔一般に、ワイスマン（Ｗ＠１ｍｍｍａｎ　） 　らの米国特許第号３２偽４！ＪＣＪ号明細書における技術の開示及び論議、並 びにつｔレスら：「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、第６巻、第３ｚａ３ −３をタフ’ｉ１．／り７り年（Ｖａｌｉｓｅｓ　ａｔ　ｍ１Ｎａｅ−ムｅｉｄ ｓ　Ｒｅｓ、、　Ａ、　ｐｐ　３１４４３−３！！７（／り７り）、レイズら； 「ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、Ｊ（米国）、第７２巻、第３２７０−ｊコア参頁、／ＰＩλ 年、（Ｒ＠ｙ’ｓ　、　ａｔ　ａｌ、、　Ｐ、　Ｎ、ム、ｓ、（ｔｙ、ｓ、ム） 、Ｌヱ。

ｐ　ｐ　Ｊ　Ｊ　７０−　Ｊ　Ｊ　７　ｕ　（／　ｆ　ｒ　Ｊ　）　）及びジェ イら；「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、第１１巻。

第ＪＪＪｊ−２３３！頁、１９１３年（Ｊａｙ　＠ｔ　ｍｌ。

Ｎｕｔ、ムｃｉｄｓ　Ｒａｔ、、　／／　、　ｐ　ｐ　２　Ｊコ！−２３３１（ ｌｙｒ３））ｉｃ報告された長鎖オリゴヌクレオチドハイプリダイゼーシ璽ンプ ローブを用いた最近の実例を参照されたい。更に１診断に有効なりＮＡ／ＤＮム ハイプリダイゼーシ璽ン操作に関するフォールコー（Ｆ’ａｌｋｏｖ　）　らの 米国特許第号ｊ　ｒ　ｔ　ｊ　ｊ　７号明細書。

一本領ポリヌクレオチドプローブにおける光放射標識に関する欧州特許出願第０ ０７０１１１号及び００７０４１７号明細書、フロニー及びプラークハイプリダ ４ゼーシｗノ技術に関する。ニューヨーク州、フールドスフリングハーパー、コ ールドスフリングハーバ−研究所のデービス（Ｄａｖｌｌ）ら：［アｅマニュア ル・フを−・ジェネティック・エンジニアリング−アドバンスト−バクテリアル 拳ジェネテイックス」（ｌり１０年）第５ｒ−ｐｒ頁及び第１７＄−１７Ａ頁、 並びに−ＤＮＡ及びＲＮムのトランスファー及びハイブリダイゼーシ璽ンについ ての指針マニュアルとなる［シーツ・スクリーン」ハイフリダイゼーシ璽ントラ ンスファー膜物質に関するニュー・イングランド・ヌクレア（マサチューセッツ 州、ボストン）のカタログ第ＮＥＦ−タ７コ号も参照のこと〕。

組換えクローンのスクリーニングに関するノーイプリダイゼーシ冒ノ操作につい て更に重要な最近の進歩の中には、標識化された混合の合成オリゴヌクレオチド プローブな使用したものがあるが、各プローブは、一本ｇＤＮＡ及びＲＮ人の不 均一混合体を含むハイプリダイゼーシ璽ノ試料中の特定のＤＮＡ鎖に対して潜在 的に完全なる相補性を有している。これらの操作は、目的とするポリペプチドに ついて極めて低量のｍ　ＲＮム配列供給源から得られるｅＤＮムを検出する上で 特に有用であることが知られている。簡単に言えば、非特異的結合を回避し得る 厳格なハイプリダイゼーシ璽ン条件を適用するならば１例えば、その完全な相補 体である混合体中の一つのプローブと標的ＤＮＡとがたイプリダイズすることＫ よって、特定のｅＤＮムクローンのオートラジオグラフ１−による視覚化が可能 になる。一般に、ウォレスら；「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、第り巻 、第ｔ７デー！９７′Ｒ，／りｔ　ノ　年　、（Ｗａｌｌａｃ＠　、　ａｔ　ｍ ｌ　、、　Ｎｕｃ　、　ムｅｉｄｓ　Ｒ＠ｍ、。

Ｆ、ｐｐｒ７Ｆ−１７７（１５’ｒ／））、ｔｙグ２ら；「Ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、Ｊ （米国）、第７ｒ巻、ＰＰＡＡ／３−≦４／７．７２７１年、（８＋ｇｇｓ　、 　ａｔ　ｍｌ　、、　Ｐ。

Ｎ。ム、Ｓ、（■、Ｓ、ム−）、７１．ｐｐ＆ＡＩＪ　Ａｌ＝１７（ｌＰｔ）） 〕、チューら；「ネイチャー」、第コタタ巻、第１７１−１１０頁、ｉｙｒ、を 年、〔Ｃｈｏｏ　、ａｔ　ｍｌ　、、　Ｎａｔｕｒｅ　、　２タタ、ｐｐ／７１ −／ｒＯ（／？ｒＪ）］、クラチら；ｒｐ、Ｎ、ム、ｓ、Ｊ（米国）、第７５Ｐ 巻、第４９−ＡＩ−＆ＩＡｒμ頁、１９１２年、　（Ｋｗｒａｅｈｌ、＠ｔ　ｍ ｌ　、、Ｐ、Ｎ、Ａ、８．　（Ｕ、８．　ム。

）、７り、ｐｐ、（Ａｔ／−６４ｃ４ｇ（／９１コ）〕。

オークボら；「ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、Ｊ（米国）、第１０巻。

ｐｐコｌりｔ−２２００，１ｒｉｓ年、　（０ｂｋａｂｏ　。

ａｔ　ｍｌ　、、　Ｐ、　Ｎ、ム、ｓ、（ｔｒ、ｓ、ム　）ｅ　１０．ｐｐ２１ り≦−コ５ｏａ（ｔｙｒｉ）〕及びコーンブリットら、「Ｐ、Ｎ、ム、８．Ｊ（ 米国）、第ｔｏ巻、第３２１ｊ−３２２２頁、ｌり２３年（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔ ｔ　、ａｔ　ａｔ、。

Ｐ、　Ｎ、ム、Ｂ、（Ｕ、Ｅｌ、Ａ、）、ｒＯ，ｐｐｊ２／ｒ−３２２２（１９ １１年）ハ、目的とするｅ　Ｄ　Ｎ　Ａの存在を二つの部位で「陽性」と確認で きる一つのｌ／塩基鎖（ｌｌ−マー）と−緒に、一様に変異したＤＮＡ鎖なる／ ４塩基鎖（／Ｊ−マー）オリゴヌクレオチドプローブ３２本の混合「プール」を 用いると、ｅＤＮＡクローンの単１１ｉにおいて信頼すべき結果が得られたと報 告されたことから、様々な研究者にまで広がっていった。シンガーーサムら、ｒ ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、Ｊ（米国）。

＠ｔｏ巻、第１０２−１０６頁、ｔｙｒｉ年〔Ｓｌｎｇｅｔ　−Ｓａｍ　、　ａ ｔ　ｍｌ、　＊　Ｐ、　Ｎ、、ム、ｓ、（ｔｒ、ｓ、ム、）。

ｒＯｌｐ　ｐｒ　０２−１０６　（／　タ１３　）　）参照。

ゲノムＤＮＡ単離物を使用することは、組換え操作で用いられる特定のＤＮＡ配 列をつくる上記３つの方法において共通点が最も少ないものである。これは、哺 乳類ポリペプチドの微小生物での発現を行なわせようとする岨換え操作領域にお いて特に真実であって。

主に哺乳類ゲノムＤＮＡの複雑性に起因するものである。このように、信頼すべ き操作は、ヒト及び他の哺乳１１起源であるゲノムＤＮＡのファージ担持ライブ ラリーをつくるためにあるが〔例えば、「マニアティス・ライブラリー」と通常 呼ばれるヒトゲノムライブラリーを得る操作に関するローンら：［セルＪ、第１ ！巻、第１／！７−／１７４＆頁、ｌり７１年、　（Ｌａｖａ。

＊ｔｍｌ、、Ｃ＠ｌｌ、／ｊ、ｐｐｌ／！７−／／７４！（／り７１））１選択 的制限エンドヌクレアーゼブラグメント操作によるヒトゲノムライブラリーに関 スるカーノら：　［Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　（米国）、第７７巻、第！１７２−！ ／７６頁、／りｔｏ年、（Ｋａｒｎ　、　ａｔ　ｍｌ　、。

Ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、（Ｕ、８．Ａ、）、７７、ｐｐｊ／７２−ｊｔｘ（ｉｙｒｏ） ）、及びウシゲノムライブラリーの構築を述べたプラクトナーら：「サイエンス 」、第１りを巻、第１ｔｉ−ｔｔり頁、ｌり７７年〔Ｂ１ｊ＋ｔｔｎ＊ｒ、　ａ ｔ　ｍｌ、、　Ｂｅ１ｅｎｅａ＊　／　５’Ａ、ＰＰ’４’−／Ａり（ｌり７７ ）参照〕、アミノ酸又はＤＮＡ配列についてさほど予備的情報のないゲノムＤＮ Ａを単離し、ハイプリダイゼーシ璽ン操作に用いる試みはさほど成功していなか りた。−例として、レイデスら：「ジャーナル・オプ・モレキーマー・アンド・ アプライド・ジェネティクス」、第１巻、第Ｊ−ｔｒ頁、ｌり１１年（Ｆｌｄｄ ｔｓ　、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ｊ　、　Ｍｏｌ　、ａｎｄ　ムｐｐ。

Ｇ＠ｎｅｔｉｅｍ　、／　、　ｐ　ｐ　Ｊ　−／　Ｉ　（／りｒｔ）３では、α −サブユニットについて予め単離されたｅＤＮＡｔＪたる全体で１，２／塩基対 の７ラグメ／トを有する「全部の長さ」のプローブを用いて、マニアティス・ラ イブラリーから、ヒト脳下垂体糖蛋白質ホルモンのα−サブユニットをコードす る遺伝子の単離に成功したと報告している。別の例として、ボスら：「Ｐ、Ｎ、 人。

Ｓ、」（米国）、第１０巻、第ｔｚｚｔ−ｔｒｉｔｅ。

１９１３年（Ｄａｍ　、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ｐ、　Ｎ、ム、ｉ９．（Ｕ、Ｓ。

Ａ）、１０．ｐｐ／！３／−１！Ｊｊ（Ｉｆｔり　〕では、１７！塩基対の合成 オリゴヌクレオチドを用いた。ヒトＨＬム−ＤＨのヒトゲノムクローンの単離を 報告している。最後に、アンダーンンら：ｒＰ、Ｎ、Ａ。

Ｓ、」（米国）、第ｔｏ巻、第ｔｅ３ｔ−ｔｔ４Ｌｘ頁。

ｌり１３年（Ａｎｄ＠ｒｇ＋ｏｎ、ａｔ　ａｌ　、、　Ｐ、　Ｎ、Ａ、Ｓ、（Ｕ 。

Ｓ、Ａ）、１０．ｐｐＡｒＪｒ−Ａｒ４Ｌ２（／！１３）〕では、長さがｒ６塩 基対で、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の既知アミノ酸配列に基 づき構成された一本のプローブを用いてＢＰＴ　Ｉのゲノムクローンを単離した と報告している。その著者は、初期の標的たる耳下腺及び肺組織源におけるｍ　 ＲＮ　Ａが明らかに低量であることから、ｅＤＮムライブラリ−の合成に適した ｍＲＮムを単離できる可能性が少ないと結論づけており、更には以下のことを述 べて、標識化プローブ混合体を用いるゲノムライブラリープローブ化の成功の可 能性について言及している＝「より一般的には、混合配列オリゴヌクレオチドプ ローブが、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから未知配列蛋白質遺伝子を単離するた めに用いられていた。このようなプローブは。

典型的には、アミノ酸配列（ｊ〜６残基）をわずかに伸長させるのに可能な全て のコードンの組合せを示す長さがｒ〜３２のオリゴヌクレオチド、ｌ参〜１７の ヌクレオチドの混合体である。不正確な塩基対プローブを識別できる厳格なハイ プリダイゼーク１ン条件下では、これらの混合体によシ、低度から中度の複雑性 があるクローンライブラリーから特定の遺伝子配列を見つけ出すことができる。

しかしながら、それらの短鎖性と異質性とのために、混合グローブは哺乳類のゲ ノムはど複雑な鎖をプローブ化するのに要する特異性をしばしば欠如している。

このことは、相当するｍＲＮムを利用できない場合に、＠乳類の蛋白質遺伝子を 単離する上で、このような方法を実施不能とするものである。Ｊ（引例省略） このように、コードされたポリヌクレオチドのアミノ酸配列がさほど知られてお らず、またｍ　ＲＮ　Ａに富む組織源をｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの調製に使 用する上で容易に入手できないような場合において、迅速かつ効果的なａ　Ｄ　 Ｎ　Ａクローンを単離するのに有効な改良方法の技術的必要性が存在し続けてい る。このような改良方法は請求められている遺伝子によりてコードされたポリペ プチドのアミノ酸配列に関して乏しい情報しか得られていない哺乳類のゲノムク ローンの単ｆｌ＆にそれらが適用可能であれば、特に有用であろう。

Ｂ、目的とするポリペプチドとしてのエリスロボエチ血球増生、即ち赤血球の産 生は１人間が生きている限り、細胞破壊を補うために継続して行なわれる。血球 増生は、循環を妨げる根長くはない充分な数の赤血球を、適切な組織に酸素供給 する血液中で利用可能にさせる。非常に正確に制御された生理学的メカニズムで ある。赤血球の産生は骨髄で行なわれ、ホルモン、即ちエリスロボエチンで制御 されている。

エリスロボエチンは分子量約３４４０００の酸性糖蛋白質であって、α、β及び アシアロの３種の型として得られる。α及び１塁は炭水化物成分がわずかに異な っているが、同様の性質、即ち生物学的活性及び分子量を有している。アシアロ 型は末端の炭水化物（シアル酸）が除去されたα又はβ型である。エリスロポエ チンは１組織が実在数の赤血球から充分な酸素供給を受けている健康状態に体が ある場合、血漿中において極めて低濃度で存在している。この正常な低濃度であ っても、普通時間を経るにつれて減少する赤血球の補充を促進するには充分であ る。

エリスロボエチンの循環量は、血球の循環による酸素輸送量が減少する低酸素症 状態下では増加する。低酸素症は、出血による多量の血液の喪失、放射線への過 度露出による赤血球の破壊、高所もしくは長期の意識喪失による酸素摂取量の減 少又は各種貧血によって起こる可能性がある。組織が低酸素ストレスを受けると 、エリスロボエチンは、骨髄中の原始前駆細胞が。

ヘモグロビンをひき続いて成熟、合成し、赤血球として循環系に放出される前赤 芽球に変換されるのを促進するととによシ、赤血球の産生な増大させる。循環系 の赤血球数が正常組織での酸素要求量よシも多い場合は、循環系エリスロボエチ ンは減少する。

一般的には、テスタら：エクスペリメンタル・ヘマトロジー・、第を巻（第を増 刊号）、第１φダーｌ！λ’ｐｉ、ｔｒｉｏ年（Ｔｅ５ｔｓ　、　＠ｔ　ａｌ　 −、Ｅｘｐ　、　Ｈｅｍａｔｏｌ、。

ｒ（Ｓｍｐｐ、ｒ）、／＋＄−１１２（／り１０）　〕；）メンら：「ジャーナ ル・オブ拳バイオロジカル・ケミストリー」、第２！を巻、第コ弘号、第１コＡ ４ｊ−１２４７コ頁、ｌりｒｔ年、ゴールドワッサー：「ジャーナルーオプーセ ルラー０フイジオロジー」、第１ｔｏ巻（第１増刊号）、第１ＪＪ−ｉ３ｚ頁、 ｌりｔコ年、２インチェ「ブラッド」、第ｔ　ｏ巻、Ｋｔ号、第１２ａｔ−ｔ、 ２ａｔ真、１ｖｙｓ年、シトースキーラ＝「エクスベリメンタル・ヘマトロシ− 」、　ｔａｒｓ（第を増刊号）、第１２−４ａｐ、１９１０年、ツートン＝「ア ナルス・オプ・クリニカル・ラボラトリ−・サイエンス」、第１３巻、第３号、 第＃Ｊ２−参３ｒＢ、Ｉ’ｌｒ３年（Ｎａａｇｂｌｏｍ　＊　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ ｎ　、　Ｌｏｂ　。

８ｅｉ、、／Ｊ（ｊ、）ｅ　ＩＬＪ：１−８３１（／ＷＩＪ’）”：Ｊ、ワイス も二「アメリカン・ジャーナル・オプｅベテリナリー・す？−？Ｊ、第４Ｌ４１ −巻、第１０号、第１１３！−１１３１１ｉ、／り１３年（Ｖ＠ｉｎｓ　、　ｓ ｔ　ａｌ　、、　Ａｍ。

Ｊ、Ｖ＠ｔ、Ｒｓｓ、、４１４ｃ（／（７）、／ｒＪ２−／１３ｊ（／りｒ３） 〕、ラッピンら：「エクスベリメンタル響ヘマトロジー」、第１１巻、第７号、 第ＡＡ／−４ＡＡ貞、ｌり１３年、バシ、−ら：「アナルス・オブ・ニューヨー ク・アカデミー−オプ・サイエンス」。

第ａｉ４！巻、第ＡＡ−７！頁、ｔｙｒ３年（ＢｅＣ１ｎ　。

＊ｔｍ１．．　ムｎｕ、Ｎ、Ｙ　、　ムｃａｄ、Ｓｅ１．、　ｕ／ｕ、４６−７ ２（ｌりｔ３）〕、マーフィーら：「アクタ嗜ヘマトロジカ―ジャポニカ」、第 弘６巻、第７号、第１３１０−／ＪＰＩＧ頁、／り１３年（Ｎｓ＋ｒｐｂｙ　、 　ｅｔ　ｍｌ。

ムｅｔａ　＊　Ｂｔｅｍｍｔｏｌｏｇｉｅａ　Ｊｓｐｏｍｉｅａ　、　弘　＋（ ７）、１３ｒｏ−ｔｚｙｔ　（ｔｙｒｚ）”ｌデシプリスら：「プリティッシュ ・ジャーナル・オプーヘマトロジー」。

第３６巻、第コタｊ−Ｊａ＆頁、ｔｙｒｅ年〔Ｄ＊５ｓｙｐｒｌｓ　、　ａｔ　 ｍｌ　、、　Ｂｒ１ｔ　、　Ｊ　、ＩＩＩｍｅｍｓｔｅｌ、、　！　６゜２９ｊ −３０６（ｌＰｔ８）〕、及びエマヌエルら＝「アメリカン・ジャーナル・オプ ・フィジカルジー」。

第コ参７巻、第１号、第２部、第Ｆ／１ｒ−１７６頁。

１９１８１年（Ｅｍｍａｎｏｎｓｌ　、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ａｍ　、　Ｊ　。

Ｐｂｙｓｉｏｌ　、２　＋　７　（／　Ｐｔ　２　）　、Ｆ’　１６１−　／７ ４　（／　５２ｒ４ｃ））参照。

エリスロポエチンは赤血球形成過程で欠かせないものであるため、このホルモン は赤血球の産生能が低く又は欠陥がある血液疾患の診断及び治療に有効に適用す ることができる。一般的には、鎌型赤血球疾患の治療が可能なエリスロポエチン に関するペナサーダスら：「ブラッド」、第≦３巻、第！号、第ｔｔｔｒ−／１ ７１頁、／りｒｅ年（Ｐ＠ｎｎｓ＋ｔｈｍｒ　−Ｄａｓ＋　、　ａｔ　ｍｌ、。

Ｂｌｏｏｄ、ＪＪ（ｊ）、／／６！−／／７／（／りｔｕ）〕及びハディ：「ア メリカン・ジャーナル・オプ・ヘティアトリック・ヘマトロラー／オンコロジー 」。

第参巻、第１５Ｐ／−／り４ｊｉ、１１１２年（Ｈａｄｄｙ　。

４人ｗ、　Ｊｏｕｒ、　Ｐａｄ、　Ｂ＊ｍａｔｏｌ　、１０ｓｅ＠１．、　ｕ、 　／　タ　ｌ−／り４（ｌＰｔ２）〕、並びにエリスロボエチンに富む血漿の注 入によるイ、ン・ビボの応答を基礎とする尿毒症のヒツジの食餌療法について記 し、更に慢性腎疾患を伴う貧血の治療剤としてｉｔ−、、ａｏ日日間１０年位Ｅ ＰＯ／日の用量を提案するエツジ−バッハら＝「ジャーナル・オブ・クリニカル ・インベストメント」、第７４１−巻、第２号、第１ＡＪ４Ａ−４１Ｅ参／頁、 ｉｙｒ参年（Ｉｍｅｈｂａｃｈ、　ａｔ　ｍｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、。

７４Ｃ（Ｊ）、ｐｐ４ＡＪ４ｃｍ４Ｃ４Ｃ／（１５’ｒ弘）〕参照。

更には、クレーン：「ヘンリー・フォード拳ホスピタルｅメディカル・ジャーナ ル」、第３１巻、第３号。

第１７７−ｔｒｉｐ、ｌり１３年（Ｋｒｍｍ＊　、　ＨｅｎｒｙＦｏｒｄ　Ｈｏ ５ｐ、　Ｍａｄ、　Ｊ−、Ｊ／　（Ｊ）、　／　７７−Ｉｆｌ（ｌりｒ３）〕も 参照のこと。

最近、米国だけで毎年／、　ｊ　００．０００人の貧血患者に、有効量のエリス ロボエチンが治療目的で投与されるであろ５と予測された。例えば−「ザ・ワー ルドＯバイオチックｅレポートＪ　（Ｔｂ＠Ｗｏｒｌｄ　Ｂｌｏｔ＠ｅｈＲｅｐ ｏｒｔ　）　／りｒａ年、第２巻：米国（二、−ヨーク州、ニューヨーク、オン ラインーパプリケーシ璽ノズ社、ｔｙｒｅ年）のモリノン：［バイオプロセッシ ング−イノ・スペース・・・・・・アン・オーバービ、−（Ｂｌｏｐｒｏｃ＠ｓ ｓｉｎｇ　ｉｎ　５ｐｒｅ＠＝−１！Ｉ　Ｏｖｅｒｖｉｅｗ　）　Ｊ、第！ｔ！ ７−！７１頁参照。最近の研究によシ、各種の病態、疾患及び血液異常状態にお いて、エリスロボエチン治療の有効性を予想する基礎が与えられた。ペドバトら ：「アクタ・ヘマトロギカ」、第７７巻、第λ１ｉ−ｘ１３Ｗ、ｔＰｒａ年（β −サラセミア）〔Ｖ＠ｄｏｖｍｔｏ、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ａｅｔａ　、　Ｈｍ ｅｍａｔｏｌ　、　７／ｅ２１１−２１３（ｌＰｒ４Ｌ）〕、ビチｙｘキーら： ジャーナル・オプ・ペディアトリックス」、第１Ｏｊ巻。

第１号、第１ｚ−、ｔｔｊｌ、ｔｙｒ４ｃ年（嚢胞性線維症ティッシュ・ジャー ナル・オプ・オプステトリックス・アンド・ギネコロジー」、第２０巻、第参号 、第３０参−３ＩＩ頁、ｌり１３年（妊娠、月経における疾患）（Ｃｏｔｅｓ　 、　ａｔ　ｓｏｌ　、　Ｂｒ１ｔ　、　Ｊ、０ｂｓｔ＊ｔ。

Ｇｙｎ＠ａｅｏｌ　＋＠　タ＜７（４Ｃ）、　３ｏｏ−ｚｔｉ（ｉｖｙ３）〕、 ハガら：「アクタ・ペディアトリックス・スカンジナビア」、第７２巻、第１２ ７−１３１頁、７５Ｆｒ３年（早熟性早期貧血）　（Ｒａｇｓ　、　ａｔ　ａｌ 　、、ムｅｔａ　。

Ｐ＠ｄｉａｔｒ、　５ｃａｎｄ、、７２．１２７−１３　／　（／　９１Ｊ）） 、クラウスーウを一カーら：「アーカイプス・オプ・フィジカル・アンド・メデ ィカル・リハビリチーＶ璽７Ｊ、第ｔ！巻、第３７０−３７ｕ１ｉＳＩＰ！参年 （を髄損傷）　（Ｃｌａａｍ　−Ｗａｌｋｅｒ　、　ａｔ　ａｌ　、。

ムｒｅｂ、　Ｐｂｙｓ、Ｍｅｄ、　Ｒ＊ｂｍｂ１１．、　４１　、　３７０−Ｊ ７参（／りｒ４Ｌ）〕、ダンラ＝「ユーロピアン・ジャーナル僧オプ・アプライ ド。フィジオロジー」、第５２巻、第１７１−／１２頁、ｔｙｒ４！年（宇宙飛 行）（Ｄｔ＋ｎｎ、　ａｔ　ｍ１１Ｅｔ＋ｒ、　Ｊ＋Ａｐｐ１．Ｐｈｙｓｉｏｌ 。

ｒ、ｔ、ｔｙｒ−ｔｒｘ（ｔｙｒｅ）〕、ミラーら：「プリティッシュ・ジャー ナル・オプーヘマトロジー」。

第５２巻、第ｒａｔ−ｔり０頁、１９１２年（急性の血液喪失）　（Ｍｉｌｌｅ ｒ　、　ａｔ　ｍｌ　＋＠　Ｂｒ１ｔ　、Ｊ　。

Ｈａｓｍｓｔｅｌ、、　！２．　！ＩＬ！−！り０（／りｒｘ））。

ユドゥーメラ：「ジャーナル−オブ・レーバー−アンド・クリニカル・メディス ン」、第ｉｏ３巻、第φ号。

第３７９−！１０及び第！ｒ／−！Ｉ！頁、ｌりｔｕ年（Ｕｄｎｐａ、　ａｔ　 ｍｌ　、、　Ｊ、　Ｌｍｂ　、　Ｃ１１ＩＩ、　Ｍａｄ、。

／（７３（−）、１７４Ａ−１１Ｏａｎｄｊｒ／−１１１（ｌＰｒ４Ｉ−）〕、 リリップシラら＝「ブラッド」、第４３巻、第３号、第！Ｏコーｒａｙ貢、ｌり １３年（老化）　（Ｌｉｐｓｅｈｉｔｘ、　ａｔ　ａｔ、、　Ｂｌｏｏｄ、Ａ　 ３　（Ｊ　）＊ｚｏ２−ｔｏｙ（ｔｙｒｚ）〕、並びに、ダイニアツクら：「キ ャンサー」、第！１巻、第を号、第ｔｉ。

／−／１０＆頁、ｌり１３年（Ｄａｉｎｉａｋ、　ａｔ　ｍｌ　、。

Ｃａｎｃｅｒ、ｊ／（Ａ）、／１０１−／１０＆（１９１Ｊ））及びシュワルツ ら：「オトラリンゴロジー」。

第ｔｏｙ巻、第２４９−．１７２頁、１ｖｙ３年〔Ｓｃｈｗａｒｔｚ　、　ａｔ 　ｍｌ　、、　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ　、、　／　ＯＦ　ｅ　コ　ｔター２７ ２（ｌＰｔ３）〕（異常な血球増生を伴う各種新生物疾患状態）。

血漿又は尿から高収率でエリスロボエチンを得ようとする以前の試みは、むしろ 不成功に終った。複雑で高度な実験技術が必要とされるが、一般には不純で不安 定な微量のエリスロボエチン含有抽出物を集められるにしかすぎない。

米国特許第４０３４７１３号明細書には、ヒツジ血漿からエリスロボエチンを部 分的に精製するための方法が記載されているが、低収率でエリスロボエチン含有 粗製固体抽出物が得られるだけである。

尿からエリスロボエチンを単離する初期の試みでは、不安定で生物学的に不活性 なそのホルモ７製剤が得られた。米国特許第ｔｒｔｓｒｏｉ号明細書には、尿か ら回収されたエリスロポエチン含有粗製物質の生物学的活性を安定化させる方法 が開示されている。得られるエリスロボエチン含有粗製剤は、称するところで４ ’Ｌり０４のエリスロボエチン活性を有しており、しかも安定である。

再生不能性貧血患者の尿からヒトエリスロボエチンを精製する別の方法が、ミャ ケら、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリイ、第２ｊ２巻、第１ｊ 号、ｐｐ！！！ｒ−ｊｊ＆＃（／９７７年１月ｉ。

日）　（Ｍｉｙａｌｃｅ、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ｊ、　Ｂｌｏｌ　、　Ｃｈｅｗ 、、　Ｍｏｌコｊコ、　ＮＩｌ／ｊ、ｐｐ！！！！−！！＆参〕Ｋ記載されてい る。この７エ程の操作には、交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲｐ− ｆｌ過及び吸着クロマトグラフィーが含まれ、２／４ｓの収率で、７０．弘００ 単位／ｍＨの蛋白質価がある純粋なエリスロボエチン製剤が得られる。

タケザワらの米国特許第舊３２’ｙ、ｒａｏ号明細書には１弱塩基性イオン交換 物にて健康なヒトの尿試料から「エリスロボエチン生成物」を製造する方法が記 されておシ、エリスロボエチン阻害効果のない低分子量生成物が得られたと述べ られている。

１９１２年５月を日に公開されたスギモトらによる英国特許出願第二〇ｔよｔＪ ｒ７号明細書には、ハイブリッドとトリンパ芽球細胞の産生方法が述べてあシ、 哺乳類宿主増殖物か１０　細胞／ｍｌとなった後、培地に分配された細胞懸濁液 ／　ｍｌ　当シ３〜参コ０単位のエリスロボエチン産生量があると報告されてい る。達成されたとする最大の産生レベルでは、エリスロボエチン産生速度は、イ ン・ビボ増殖系から細胞が移し変えられたイン・ビトロ培地において、ａｙ−ｇ ｒｏａ０単位／１０　細胞／弘ｒ時間と計算された（対応する米国特許第舊Ｊ７ ７．１１３号明細書も参照）。多数の提案が新生物細胞をはじめとする組織源か らエリスロボエチンを単離するためになされたが、収率は極めて低かった。例え ば、ジェルクマｙら＝「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、第１Ｉ巻、第７ 号、第！ｔ／−１１ｔ頁、ｌりｔ３年（Ｊ＊ｌｋｍａｍ　、　ａｔ　ｍｌ　、ｅ Ｅｘｐｔ　、Ｈｅｍａｔｏｌ　、、　／　／　（７）　、　ｊ　ｒ　ｉ　−ｚ　 ｒ　ｒ　（ｉ？ｒＪ））、タンプラノら：ｒｐ、Ｎ、ム、８．Ｊ（米国）、第ｔ ｏ巻、第６２６ターｔコア３頁、ｌり２３年（Ｔａｍｂｏｕｒｌｎ　、　ａｔ　 ｍｌ　、、　Ｐ、Ｎ、ム、！１．（Ｕ、Ｓ、ム）。

ｔｏ、４コルターＡｘ７３（／Ｗ１３）〕、カツオカら＝「ガン」、第７弘巻、 第ｚｉｐ　−ｒａｔｅ、／？ｒ　３　年　（Ｋｍｔｍａｏｋａ、　ａｔ　ｍｌ、 、Ｇａｎｎ、　７１Ｌ、　！３１Ｌ−！φ／（／りｔ３）〕、ハギワラら＝「ブ ラッド」。

第６３巻、第参号、第ｔコｒ−ｒＪ！頁、ｌりを参年（Ｂａｇｉｖａｒａ、　ｅ ｔ　ｍｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　Ａ　３　（参　）、　１２１−ｒＪ！（ｌりｒ４ ｃ））、及びチ１＋１ツピンラ：「ブラッド」、第６ａ巻、第２号、第３参／− Ｊ弘７貢、ｌりｒ４ｃ年（Ｃｂｏｐｐｉｎ　、　ｍｔ　ｍｌ　、、　Ｂｌｅｅｄ 　、　ｔ　ｕ　（コ）。

３ａｔ−Ｊ４Ｅ７（／りｒｅ））参照。

精製エリスロボエチンの取得のために利用される他の単離技術としては、免疫学 的操作がある。ポリクローナル血清由来のエリスロボエチンに対する抗体は。

動物、好ましくはラット又はウサギにヒトエリスロボエチノを注射することによ シ得られる。注射されたヒトエリスロボエチンは動物の免疫系によシ外来抗原物 質として認識され、抗原に対する抗体の産生な誘導する。抗原物質による刺激に 感応する細胞が異なれば。

別の感応細胞から産生されたものとはわずかに異なる抗体が産生されて、循環系 に放出される。抗体活性）Ｌその血液を採取した場合に、動物の血清中に残存し ている。未・精製の血清、又は血清免疫グロブリンＧ画分として精製された抗体 製剤は次いでヒトエリスロボエチン検出分析に用いられ、それと複合化するが、 その物質には大きな欠点がある。この血清抗体は個々の細胞から産生された多数 の異なる抗体からなるが、その性質上ポリクローナルであって、エリスロボエチ ンのみではない粗抽出物中の成分と複合化する。

本発明の背景によって重要なのは１選択された抗原における一つの抗原決定基と 特異的に免並応答する一種の抗体のみを産生できるという継続細胞培養の開発技 術に関する最近の進歩である。一般的には、キスホルム：「バイテクノロジー」 、第３巻、第１号１ｇｒ７−４３頁、ｌデｔ３年（Ｃｈｉｓｈｏｌｍ　、　Ｈ１ ｇｋＴ＠ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ　Ｊ、Ｎｎｌ、　ｊ７−Ａ　Ｊ　（／　１ １３）〕参照。エリスロボエチンに対する「モノクローナル」抗体を得るために 細胞融合とハイブリッド形成技術を用い、更にヒトエリスロボエチンの単離と定 量化のためにこれらの抗体を用いる試みが行なわれた。−例として、ヒトエリス ロボエチンに対スるモノクローナル抗体を分泌するマウス−マウスハイプリドー マ細胞系の開発に成功したとい５報告が、リー−７７ン：「７エデラル・プロシ ーデインダス」の抄録第１４ｃ４３号、第４ｃノ巻、第、ｔｏ頁、１ｙｔａ年（ Ｌ＊＊　−Ｂａａｎｇ、Ａｂｓｔｒａｃｔ　ｆ＠／　参　６　Ｊ　ｏｆ　Ｆｅｄ 、Ｐｒｏｃ、。

４Ａｔ、ｚ２ｏ（ｔｙｒｘ）〕において抄録という形でなされた。別の例として 、モノクローナルエリスロボエチン抗体の産生及び使用に関する詳細な説明が、 ワイスら：　ｒＰ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　（米国）、第７２巻、第！４ｃａｔ−ｓａ ｔｙＢ、ｌり１２年（Ｗｅｉｓｓ　、ａｔ　ａｌ、。

Ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、（Ｕ、Ｓ、ム）、７り、！ｌｌ−４！−ｒａｔり（／りｒコ） 〕にある、ササキ：「ビオメゾイカ０ビオキミカーアクタ」、第１１巻、第８２ ０２−８２０６頁、ＩＰＩ３年（５ａｓａｋｌ　、　Ｂｌｏｍｅｄ　、　Ｂｌｏ ｅｈｉｍ　。

Ａｅｔａ１４Ｃコ（／／／１２）、８２０２−８２０４　（１５Ｐ１り”：Ｊ、 ’ｒナガワら：「ブラッド」、第ｔ＃巻。

第２号、第３１７−３６８頁、／９ｒｌＬ年（７＠ｎ＠ｇａｗａ。

ｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ、４弘（Ｊ）、！！７−３４＠（／りｒ４ｃ））、ヤナ ガワら＝「ジャーナル・オプ・バイオロジカルｅケミストリー」、第２！２巻、 第５号。

第２７０７−２７１０頁、ＩＰＩ４４年（Ｙａａａｇａｗａ　。

ａｔ　ｍｌ　、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈ＠ｗ　−、コ！り（ｔ）、２ｔ。

７−２７ｔｏ（ｔりｒ＃））、及び米国特許第１弓４ｔコμ号明細書も参照のこ と。

更に１本発明の背景にあって重要なのは、天然蛋白質、糖蛋白質及び核蛋白質中 のアミノ酸配列と実質上同一である合成ペプチドの免疫学的活性に関する報告で ある。更に具体的には、比較的低分子量のポリペプチドが、ウィルス抗原、ポリ ペプチドホルモン等のよ５な生理学上重要な蛋白質の免疫反応に対し、時間及び 程度の点で類似した免疫反応に関与していることが示された。このようなポリペ プチドの免疫反応の中には、免疫活性な動物において特異的抗体形成を刺激する ことが含まれる。例えば、ラーナーら：「セル」、第２３巻、第３Ｑターｓｉｏ 頁％　１９１１年（Ｌ＊ｒｎｓｒ。

・ｔＩＡｌ、、Ｃ＠ｌｌ、　２３．Ｊ（７５’−３１０（／りｒ／）〕、ロスら ＝「ネーチャー」、第λり昼巻、第６！参−Ａｊｊ頁、１９１１年（Ｒｏｓｓ　 、ａｔ　ａｌ　＋＠　Ｎａｔｕｒｅ　ｅコタ蓼、Ａｔ参−ｂｒｔ（ｔｙｒｔ）〕 、ウォルターら：ｒｐ、Ｎ、ム、Ｓ、Ｊ（米国）、第７７巻、第５ｔｙ７−！２ ００頁、ｌデｔｏ年（Ｗａｉｔｅｒ　、ｅｔ　ｍｌ　＋＠Ｐ、Ｎ、＾、８．（Ｕ 、Ｓ、Ａ）、７７、ｚｔり７−！２０ｏ（ｔｙｒｏ）〕、ラーナーら：ｒｐ、Ｎ 、ム、Ｓ、Ｊ（米国）、第７ｒ巻、第３弘０３−３＃０７貢、ｔｙｒ１年（Ｌ＠ ｒｎ＠ｒ　、　ａｔ　ｍｌ　、、　Ｐ、Ｎ１人、８．（Ｕ、Ｓ、ム）。

７Ｆ、３４ｃ０３−ＪＩＬＯ７（ＩＰ１／）〕、つｐ　Ｊｂ　ｐ−ら：ｒｐ、Ｎ 。ム、Ｓ、Ｊ（米国）、第７を巻、第弘１ｒ２−ａｒｒｔ１ｉ、／り１１年（Ｗ ａｉｔ＠ｒ　、　ｓｔ　ｍｌ　＋＠Ｐ、Ｎ、ム、Ｓ、（Ｕ、８．Ａ）、７１．４ ＡＩｒ２−４ｃｒｒａ（ｔｙｒｔ）〕、つ、ｙグら：ｒＰ、Ｎ、ム、８．Ｊ（米 国）、第７ｒ巻、第７１Ｌ／２−７８／を頁、１ｙｒ１年（Ｗｏｎｇ　、　ａｔ 　ｍｌ　＋＠　ｐ、Ｎ、ム、８．（ＪＳ、Ａ）。

７Ｆ、７４４／Ｊ−７１Ｌ／Ａ（１５Ｆｒ／））、グリーンら：「−にルＪ、第 ２を巻、第４ｃ７７−１４１７７４．／りｒ２年（Ｇｒｅｅｎ、　ａｔ　ｍｌ、 、　Ｃ＠ｌｌ、　２１．４Ａ７７−ｕｒ　７　（／　Ｆ　ｒ　２　）　）　、二 ｙグら：　「Ｐ、Ｎ、Ａ、８．Ｊ　（米国）、第７２巻、第！３２２−ｊ３２４ ３１．／９１２年（Ｎ１ｇｇ　、ａｔ　ｍｌ　、、Ｐ、Ｎ−ム、ｓ、（ｔｙ、ｓ 、ム　）。

７り、！３コ２−！３コａ（Ｚりｒ２）］、バロンら＝「セル」、第２ｒ巻、第 ３りｒ−４Ｃｏ　ａＢ、１９１２年（Ｂａｒｏｎ、　ａｔ　ｍｌ、、　Ｃ＋ｌｌ 、　２１．Ｊり！−＃Ｏφ（ＬりｆＪ））、ドリースマンら：「ネーチャー」。

第２２３巻、第１ｓｒ−ｔｔｏ頁、１９１２年〔Ｄｒ＊ｅ＠ｍａｎ　、　ａｔ　 ｍｌ　、、　Ｎｍｔ＋ｏｒ＊　、コタｔ、／！！−／６０（／りｔコ〕〕、及び ラーナー：「サイエンティフィック・アメリカン」、第２参１巻、第２号、第６ Ａ−７４Ｃｊｉ、１９１３年（Ｌ＊ｒｎ＊ｒ　、　８ｅｌ＊ｎｔｌｆｉｅＡｍ＠ ｒｌｅａｎ　＊　コＩＡｒ、ＮｎＪ、Ａ＆−７４ｃ（／りｒ３）〕参照。更には 、ペプチドホルモンの一次構造配列ではなく、その二次構造配列をおおむね有し ている合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性に関するカイザーら：「サイエ ンス」、第２２３巻、第２弘ター２！ｊｉｇ、／りｔｙ年（Ｋａｉｓｓｒ　、　 ｓｔ　ｍｌ　＋＄　８ｅｉ＠ｎｃ＠。

ココＪ、ＰＰコ弘５Ｆ−２！！（ｌりｒ参）〕も参照のこと。上記研究は、勿論 、エリスロボエチン（即ち実質的なアミノ酸配列の情報がまだ知られていなかっ た物質）以外の蛋白質アミノ酸配列に関するものである。

共同所有に係る係属中のエグリー（Ｅｇｒｉ・）Ｋよシｌりｒ３年２月参日に出 願され、欧州特許出願第０７１ｔ　ｍ−を号として１９１４４年を月２２日に公 開された米国特許出願第ｕｔ４７２１Ａ号明細書には、マウス−マウスハイブリ ドーマ細胞系（ム、　Ｔ、Ｃ０Ｃ６第ＨＢｒ、１０２号）が記載されておシ、こ の細胞系は下記アミノ酸配列： ＮＨ２−ム１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌ＊ｕ−目、ｓ−Ｃｙｇ−ム５ｐ− ８ｉｒ−ムｒｇ−Ｖａｔ−Ｌ＠ｗ−Ｇｌｔ＋−ムｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌ＠Ｉ−Ｌ＠ｕ −Ｇ１ｕ−ム１ｍ−Ｌｙｓ−Ｃｏｏｎ。

からなるポリペプチドとも特異的に免疫応答する高度に特異的なモノクローナル 抗エリスロボエチン抗体ヲ産生ずる。ポリペプチド鎚は、ミャケら＝「ジャーナ ル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー」、第２５コ巻、第ｚｚｓｒ−ｚｚｔ ｕ頁、１２７７年（Ｍｉｙｍｋ＊　。

ａｔ　ｍｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ＠ｗ、、２！２．　！！１！−ｒｓｔａ ｒｔり７７）〕の方法により単離され、ヒユーイック・エムら＝「ジャーナル・ オプ１バイオロジカルーケミストリー」、第コ！を巻、第７タタ０−７５’り７ 真、ｔｙｒｔ年（Ｈａｗｉｅｋ　、　Ｍ　、、　ａｔ　ｍｌ　＋＠　Ｊ　。

Ｂｌｅｌ、　Ｃｈ＠ｍ、、２！＆、　７タタ０−７Ｐり７（ＩＰＩ１）〕の操作 によジアミノ酸分析がガス相配列決定装置〔アプライド・バイオシステムス社（ ムｐｐｌｉ・ｄＢｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　、　Ｉｎｃ　）　）　によって行なわれ た成熟ヒトエリスロポエチンの最初の２０個のアミノ酸残基に対応するものであ る。別個のアミノ酸鎖に基づく１合成重を塩基鎖に対するポリクローナル抗体の 産生に関するスーラ：「グロシーディングス・オブ・ナシ、ナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ」（米国）、第１０巻、第３６３／−３４！！頁、１９１３ 年（Ｓｕｅ　。

ａｔ　ｍｌ　、、　Ｆｒｅｅ　、　Ｎａｔ　、ムｅｎｄ、　８ｅｉ　、（Ｕ、Ｓ 、　Ａ　）。

１０、ｐｐＪ＆！／−３４！！（ＩＰＩり〕及びシト９スキーら：［ジャーナル ・オプ・イムノロジカルΦメンッズ」、第ｊ５’巻、第１ｒ／−１１４頁、／り ｒ４Ａ年（８ｙｔｏｖｓｋｔ　、　ａｔ　ｍｌ　＋＠　Ｊ　、　Ｉｍｍｎｎｅｌ 　。

も参照。

上記ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、エリスロボエチンの定性及び定 量のためのイムノアッセイに使用される高度に有用性のある物質を提供し、更に エリスロボエチンのアフィニティー精！１においても有用性を有するが、更に分 析、臨床試験及び例えば疾患組織がエリスロボエチン産生をになうことができな い慢性腎疾患の治療のために、該物質の潜在的に広範な治療用途にとりて充分に 大量のエリスロボエチンを哺乳類源から単離することがこれらの物質によって容 易になし得るとい５のは成功しそうにない。したがって、哺乳類エリスロボエチ ンを充分に特定化でき、しかも可能性のある診断的及び臨床的用途のためｋそれ を大量に供給し得る上で最良の見通しは、大規模なその化合物の微小生物合成を もたらす組換え操作の実用化を成功させることにあると、当業者間では見られて いる。

ヒト及び他の哺乳類種のエリスａボエチンをコードしているＤＮＡ配列を実験的 に単離する実質的な努力がなされたよ５であるが、誰も成功しなかったようであ る。これは主に、エリスロボエチンをコードするＤＮＡ配列が従来の技術によシ 単離されるｅＤＮムライズラリーを構成するよ５なｍ　ＲＮ　Ａ　Ｋ富む組織源 、特にヒト組織源、の欠乏に起因するものである。更Ｋ、エリスロボエチンのア ミノ酸残基連鎖についてはほとんど未知であるため１例えばｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ特に ゲノムＤＮＡライブラリーのＤＮム／ＤＮムハイプリダイゼーシ冒ンスクリー二 ングにおいて安心して直ちに使用することができる長鎖ポリヌクレオチドプロー ブを調製することができない。実際の例として、ム、Ｔ、Ｃ３Ｃ０ＨＢｒ２０り で産生された上記モノクローナル抗体を得るために用いられる２０個のアミノ酸 配列は、上記アンダーノンらの方法における。不明確なｔ０塩基オリゴヌクレオ チドプローブの構築とは相客れないものである。エリスロボエチンのためのヒト 遺伝子はヒトゲノム内で「単独のコピー遺伝子」として存在しているらしく、い かなる場合も、ヒトエリスロボエチンをコードする遺伝子物質はゲノムライブラ リーに存在する総ヒトゲノムＤＮムのｏ、ｏｏｏｏｚｓ未満を構成するｋしかす ぎないと推定される。

現在までのところ、単離可能量の哺乳類エリスロボエチンの微生物発現における 使用に適したＤＮＡ配列を与える岨換え関連方法において、最も成功した既知報 告例でも、目標にはほど遠いものであったーー例として、ファーバーら：「エク スベリメンタル・ヘマトロジー」、第１１巻、第１４１−増刊号、抄録ｉｏｔ、 ／り１３年（Ｆａｒｂ＠ｒ　、　ａｔ　ａｉ　、ｅ　Ｅｘｐ　、　Ｈ＠ｍ５ｔｅ ｌ　、、　／／。

５ａｐｐ、１８．　ムｂｓｔｒａｅｔ　／　０　／　（／　５Ｆ　ｒ　Ｊ　）　 ）では。

フェニルヒドラジン処理ヒヒの腎臓組織からｍＲＮムを抽出し、このｍＲＮムを アフリカッメガエル（Ｘ＠ｒｓｏｐｕｍ　１ｍ＠マｌｓ　）卵母細胸に注入した が、それらの中に含まれエリスロボエチンの生物学的性質を示す「翻訳生成物」 の混合体がイン・ビトロで産生するのはむしろ一時的な結果であったと報告して いる。更に最近において、７アーバーら：「ブラッド」、第４２巻、第ｊ号、第 １増刊号、抄録３タコ、第１コ２ｍ’ｌ！ｉ、１り１３年（Ｆａｒｂ＠ｒ　、ａ ｔ　ｍｌ　、、　Ｂｌｏａｄ、　Ａ　２．　Ｎｎｊ。

８ｕｐｐ　−Ｎｎｊ　、　ムｂｓｔｒａｅｔ　Ｊタコ、ａｔ　ｐａｇｅ　／　Ｊ 　２　ｓ（ｌりｒ３）は、カエル卵母細胞によるヒト腎臓ｍＲＮＡのイン・ビト ロ翻訳について報告した。その得られた翻訳生成混合体には、注入されたｍＲＮ ムノＩ！Ｉｔ当シ、エリスロボエチン活性を有する翻訳生成物が２２０ｍＵ含有 されていると推定された。エリスロボエチンをコードしている外来性ｍＲＮムの このよ５なイン・ビトロ翻訳量が（従来報告された、必要とする生成物へのヒヒ ｍＲＮム翻訳量と比べて）著しく低いと認められたが、この結果は、ヒト腎臓を 、所望の遺伝子が単離され得る豊富なヒト腎ｅＤＮＡライブラ９−構成エリスロ ボエチン発現部位としてみなさせるものであると考えられた〔ファーパー：「ク リニカル・リサーチＪ、ＫＪ／巻、第参号、第７Ｊ　ＦＡ頁、／ｒｒＡ（／りｔ ３）〕も参照〕。

米国特許出願第ｊ　Ａ　／、　０２８号及び第ｚｒ２ｉｒｚ号の出願以後、大腸 菌内で、ヒトエリスロボエチンＣＤＮムとみなされていた物質のクローニングと 発現に関する一つの報告がなされた。簡単に言えば、多数のｅＤＮＡクローンが 大腸菌プラスミドに挿入され、β−ラクタマーゼ融合生成物がヒトエリスロボエ チンの非特異的「エピトープ」に対するモノクローナル抗体と免疫応答性を有す るととに着目されたのである。リーーファン＝「プロシーデインダス参オプ・ナ シ豐ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ」（米国）、第ｉｔ巻、第２７０１ −２７１λ％、１９ｒ＃年（Ｌｅｅ−Ｈｔ＋ａｎｇ　、　ＰｒｏＣ、Ｎａｔ　、 　ムｓａｄ　、　Ｓｃｉ　、（Ｕ、　Ｂ、ム）。

本発明は、その対立遺伝子変異体を４含む天然エリスロボエチンの一次構造形状 （即ち、アミノ酸残基の連続配列）の一部もしくは全部、及び−以上の生物学的 性質（例えば、免疫学的性質並びにイン・ビボ及びイン・ビトロでの生物学的活 性）を有する新規な精製単離されたポリペプチド生成物をはじめて提供するもの である。これらのポリペプチドは、ゲノムＤＮＡもしくはｅ　Ｄ　Ｎ　Ａのクロ ーニング又は遺伝子の合成によって得られる外来性ＤＮＡ＃の原核もしくは真核 宿主での発現生成物（例えば、細菌、＃母及び哺乳類の培養細胞による）である ということによっても独特に特徴づけられる。を椎動物（例えば、哺乳類及び鳥 類）細胞における微小生物発現生成物は、自然の哺乳類細胞環境又は血漿もしく は尿のような細胞外液におけるエリスロボエチンと関連性があるであろ５ヒト蛋 白質又は他の夾雑物とは全く関係がないということによって、更に特徴づけられ るかもしれない。典型的な酵母（例１１サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓｍｃ ｅａｒｏｍｙｅ＊ｓ　ｅ＠ｒ＊ｖＩｓ１ａｍ　）　：）又は原核生物（例えば、 大腸菌）を宿主細胞とする生成物は、いかなる哺乳類の蛋白質とも関連性を有し ていない、使用する宿主によりては、本発明のポリペプチドは哺乳類もしくは他 の真核生物の炭水化物によってグリフシル化され。

あるいはグリコジル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最 初にメチオニンアミノ酸残基（１番目の位置）を含んでいてもよい。

本発明の新規な糖蛋白質生成物には、その−以上の生物学的性質が得られるのに 充分な天然（例えばヒト）エリスロボエチンの複製である一次構造形状を有し。

天然（例えばヒト）エリスロボエチンのそれとは異なる平均的炭水化物組成を有 するものが含まれる。

誘発ＥｊｉＶＣよシ得られるを椎動物（例えば、ＣＯＳ　−７及びＣＨＯ）細胞 は、イン・ビトロで継続した増殖が可能であって常に入手し得る最初の細胞であ シ、培地で増殖させた場合、それらの培地中にて、ラジオイムノアラ七イにより 参ｒ時間でＩＯ個の細胞当り１００単位以上（好ましくはｊＱＯ単位以上、最も 好ましくはｔｏｏｏ−ｚｏｏｏ単位以上）のエリスロボエチンを産生ずることが できる。

更ｋ、本発明によって、初めて解明されたエリスロボエチンアミノ酸残基の連続 配列の全体的もしくは部分的複製である合成ポリペプチドが提供される。これら の配列は、天然エリスロボエチンの一次、二次又は三次構造形状特性を有してい るため、治療及び免疫過程でエリスロボエチノの生物学的活性なもしくは免疫学 的な代朋物として用いられるような、天然蛋白質に共通した生物学的活性及び（ 又は）免疫学的性質を有しているであろ５゜これに付随して、標準的手段によっ て得られ、このようなポリペプチドと免疫応答し、好マしくは天然エリスロボエ チンとも免疫応答するモノクローナル及びポリクローナル抗体が提供される。

本発明では、サル及びヒト種起源のクローンＤＮＡ配列並びにそれから適切に誘 導されたポリペプチド配列についても解明しておシ、それらはそれぞれサル及び ヒト種起源エリスロボエチンの一次構造形状を表わしている。

更に本発明によシ１本発明のＤＭＡ鎖を取シ込んだ新規な生物学的機能性のウィ ルス及び環状プラスミドＤＮＡのベクター、並びにそのようなベクターによ多安 定にトランス７オーメーシ嘗ン又はトランス７エクシ冒ンがなされた微生物（例 えば、細菌、酵母及び哺乳類の細胞）宿主生物も提供される。これに対応し。

外来性ベクター担持ＤＮＡ配列の大規模な発現を促進する条件下において、この ようなトランス７ｔ−メーシ璽ン又はトランス７エクシ璽ンされた微生物宿主を 培養増殖させることからなる有用なポリペプチドの新′規製造方法、並びに増殖 培地、細胞ライセード又は細胞膜両分から所望のポリペプチドを単離する新規な 方法が１本発明によって提供される。

本発明で得られる微生物発現ポリペプチドの単離精製は１例えばプレパラティプ ・クロマトグラフィー分離、並びにモノクローナル及び（又は）ポリクローナル 抗体製剤を用いる免疫学的分離のよ５な従来の手段によって行なってもよい。

エリスロボエチンのアミノ酸残基が解明されたので。

本発明によυ、エリスロボエチンをコードするＤＮＡ配列の全体的及び（又は） 部分的製造がなされるが、そのＤＮＡ配列には１選ばれた非哺乳類宿主による発 現に「好適な」フードンの取シ込み、制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部 位の具備及び容墨に発現するベクターの構成を促進する別の開始、終末又は中間 ＤＮＡ配列の具備というような有利な特性が備えられている。これに伴ない、本 発明は、−以上のアミノ酸残基の同−性又は位置に関して天然型とは異なるが。

天然型の一部もしくは全部の性質を有しているエリスロボエチンボリペプチド類 縁体もしくは誘導体（即ち、エリスロボエチンの特定の残基な全てではないが有 する削除類縁体、及び（又は）−以上の特定の残基が他の残基で置換された置換 類縁体、及び（又は）−以上のアミノ酸残基がポリペプチドの終末又は中間部位 に付加された付加類縁体）の微生物発現をコードしているＤＮＡ配列の製造法（ 並びにｅＤＮ人及びゲノムＤＭＡの部位特定突然変異誘発による生成法）を提供 する。

本発明の新規なりＮＡ配列は、エリスロボエチンの少なくとも一部の一次構造形 状及び−以上の生物学的性質を有するポリペプチド生成物の原核もしくは真核宿 主細胞における発現を確保するのに必要な全ての配列を含んでおり、この配列と しては（息）表Ｖ及び■に示したＤＮＡ配列又はそれらの相補鎖、（ｂＨａ）で 定義したＤＮＡ配列又はその７ラグメントと（本明細書で説明したよ５なハイプ リダイゼーシ璽ン条件又はよシ厳格な条件下で）ハイブリッド形成するＤＮＡ配 列、及び（ｃ）遺伝暗号の縮重は別にして、上記（、）及び（ｂ）で定義される ＤＭＡ鎖とハイブリッド形成するＤＮＡ配列が挙げられる。特に、（ｂ）′にお いては、サル及びヒトエリスロボエチンの対立遺伝子突然変異屋をコードし及び （又は）他の哺乳類種のエリスロボエチンをフードするゲノムＤＮＡｆｉが含ま れる。また、特に、（Ｃ）では、エリスロボエチン、エリスロポエチン７ラグメ ント及びエリスロボエチン類縁体をコードし、無を椎動物宿主においてメッセン ジャーＲＮＡの翻訳を促進するフードンを有していてもよい合成りＮＡ配列が含 まれる。

本発明には・１表■の上流鎖ヒトゲノムＤＮＡ配列のＤＮム相補体部分によりコ ードされたポリペプチド種、即チ、トラモンターノら：「ヌクレイツク・アシッ ズ書リサーチ」、第１２巻、第ｊＯφ２−！Ｏ！り頁。

１ｙｒ４Ｌ年（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ　ａｔ　ａｌ　、、　Ｎｕｅｌ＠ｉｅ　Ａ ｅｉｄｇＲｅｓ＊ｍｒｅｂ　、／　２．　ｐ　ｐ　ｊ　Ｏ＃ター！Ｏ！り（ｔｚ ｔ弘）〕に記されたような「相補的な逆方向蛋白質」が含まれる。

本発明には、エリスロボエチン治療、具体的には貧血症の状態及び最も具体的に は慢性腎疾患を伴うような貧血状態の治療に使用し得る、本発明のポリペプチド 生成物の有効量と適切な希釈剤、アジ為バンド及び（又は）担体とからなる医薬 組成物も含まれる。

本発明のポリペプチド生成物は、固体組織及び血液又は尿のような液体試料中の エリスロボエチンの定性及び定量に有用な試薬とするために、検出可能なマーカ ー物質と共有結合させて標識化してもよい（例えば１２５Ｉで放射線標識化する ）０本発明のＤＮＡ生成物もまた。（放射線標識及びビオチンのような非同位元 素標識のよった）検出可能なマーカーで標識化されていてもよく、ヒト、サル及 び他の哺乳類種の染色体地図におけるエリスロボエチノ遺伝子座及び（又は）そ れに関連した全ての遺伝子群の座を決定するために。

ＤＮＡハイプリダイゼーシ璽ン過程で用いられてもよい。それらはまた、ＤＮＡ レベルにおけるエリスロポエチン遺伝子の欠陥を見出すために用いることができ 。

更には隣接する遺伝子及びそれらの欠陥を見出すための遺伝子マーカーとして用 いることもできる。

本明細書で詳細に記したように、本発明では更に。

マルチブル一本領ポリヌクレオチドを含む不均一な細胞もしくはウィルス試料に おいて、配列未知の特定の一重鎖ヌクレオチドを検出するための重要な改良方法 も提供するが、この方法は下記のとおりである。

（畠）一様に変異した塩基鎖を有する標識化一本領ポリヌクレオチドプロープの 混合体が調製される。このプローブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特であ る。と推定される塩基配列に対して潜在特異的に相補的である。

（ｂ）　試料が固体基質に固定される。

（Ｃ）　それに固定された試料を有する基質が、該試料のポリヌクレオチドとの ハイプリダイゼーシ璽ンによらないで、ポリヌクレオチドが更にそれと結合する のを抑制するように処理される。

（、ｉ）　それに固定された試料を有する処理済みの基質が。

全体的に相補性のポリヌクレオチド間でのみハイブリッド形成し易い条件下で、 一時的に前記標識化プローブの混合体と接触させる。次いで （＠）特定のポリヌクレオチドが、それと蚊標識化プローブ混合物内の全体的に 相補的なプローブとのハイブリッド形成反応の存在を監視することによって検出 される。これは標識化プローブの基質との非特異的結合に起因する標識化物質の 背景密度と比較して特定のポリヌクレオチド位置における基質上の標識化物質の 密度が高いということによシ証明される。

この操作は、ＤＮム／ＤＮム、ＲＮム／ＲＮム又はＤＮム／ＲＮＡハイブリッド 形成において、１７〜２０塩基を有するＡ４Ｅ、ｉｘｒ、、ｔｚｔ、ｚｔｘ、１ ０２弘又はそれ以上の混合ポリヌクレオチドプローブを使用することが指示され た状況下で特に有効である。

以下に記すよ５に、上記改良方法により、サル種起源のエリスロボエチンをコー ドし、貧血サル腎細胞ｍＲＮムから誘導されたライブラリー内のｅＤＮムクロー ンを実際に同定することができた。より具体的にｔＬヒトエリスロボエチンのフ ラクシ冒ンを配列させて導かれたアミノ酸配列情報に基づ＜、１２１１本の一様 に変異した２　０−　ｍａｒプローブ混合体が、コロニーハイブリダイゼーシ璽 ン操作で用いられ、合計２００．０００のコロニーの中から７つのｒ＋（陽性〕 」エリスロボエチン・ｃＤＮＤＮＡ−ンが同定された。更に特記すべきは１本発 明の改良操作を実施すること忙よυ、ヒトゲノムライブラリーを構成する／、　 ｔ　００．０００の７クローンを迅速に単離することができたことである。

これは、ヒトエリスロボエチンの各種連続配列のアミノ酸分析による第二の１２ １本の／７−ｍ・ｒブローブドー緒に上記したｌコを本の２０−ｍ＠ｒプローブ 混合体を用いて実現されたものである。

上記で説明した操作は、＠乳類ゲノムクローンを単離するためのＤＮム／ＤＮ人 ハイブリッド形成過程において、多数の混合オリゴヌクレオチドグローブを使用 した最初の公知例であシ、シかもｅＤＮムクローンの単離において３２本以上の オリゴヌクレオチドプローブ混合体を使用した最初の公知例でもある。

本発明に多数の側面と利点があることは、本発明の実際に好ましい態様での実施 を説明している以下の詳細な説明を読むならば、当業者においては明らかとなる であろう。

発明の詳細な説明 本発明によれば、ヒト及びサル種エリスロボエチノ（以下１時々ｒＥＰＯＪと略 する）のポリペプチド配列の一部又は全部をコードしているＤＮＡ配列が単離さ れ、Ｉ！！ｆ定化された。更に、サル及びヒト起源ＤＮＡは、イン榔ビボ及びイ ン・ビトロのＥＰＯ生物学的活性のみならず、天然ＥＰＯの生物学的（例えば免 疫学的）特性も発揮する単離可能な量のポリペプチドを与える真核及び原核細胞 発現の主体をなした。

サル種起源のＤＮＡは、化学的に誘導された貧血状態を呈し、その血清が免疫学 的測定によると正常なサル血清と比べて高レベルのＥＰＯを含有するサルの腎組 織から得られたｍ　ＲＮ人により構成されたｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーから単 離された、ＥＰＯをコードするＤＮＡを含む所望ｅＤＮムクローンの単離は、ｌ Ｊｒ本が混合され、放射線標識化されたコ０−ｍ＠ｒのオリゴヌクレオチドプロ ーブのプールを用いて、ＤＮムＺＤＮムゴロニーハイプリダイゼーシ讐ンによシ 実現されタカ、コｏ　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏコロニーの迅速なス／　ＩＪ−二７／が 必要とされた。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、ヒ）ＫＰＯの酵素的切断 と小試料の配列化により得られたアミノ酸配列情報に基づいた。

ヒト種起源のＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された。ＥＰＯを コードするＤＮＡを含むクローンの単離は、ｌＪｒ本が混合された２　０−　ｍ ＠ｒのオリゴヌクレオチドプローブの上記プールと、各種の酵素によるヒトＥＰ Ｏ７ラグメントから得られたアミノ酸配列情報に基づ＜１．１１本の放射線標識 化１７−ｍ＠ｒプローブの第二のプールとを用いて、ＤＮムＺＤＮ人プラークハ イプリダイゼーシ１７によシ行なわれた。

陽性のコロニー及びプラークは、２０−ｍ＠ｒプローブのプール内の／Ａ塩基鎖 サブセットを用いたクローンＤＮＡのジデオキシ配列法によシ確認され１選択さ れたクローンは、それによシコードされるｇｐｏポリペプチドの一次構造形状を 減少させるヌクレオチド配列分析に供された。減少したポリペプチド配列は互い に、またヒトＥＰＯフラグメントのアミノ酸分析によシ得られた部分配列に対し ても高度の相補性ケ示した。

選択された陽性のサルｅＤＮ人クローン及び選択された陽性のヒトゲノムクロー ンは、それぞれ「シャトルＪＤＮムベクターに挿入され、このベクターは大腸菌 に導、入されて、培養哺乳類細胞をトランス７エクシ冒ンするために用いられた 。トランス７エクシ冒ンされた哺乳類細脂の培養増殖によシ、培養液／　ｍｌ　 当シ３０００ｍＨのＥＰＯを含有していると推定される培地上澄標品が得られた 。

以下の鎖側は本発明の説明のために掲げられておシ。

特にサルｅＤＮムクローン及びヒトゲノムクローンを：！−）’ｉるＥＰＯの同 定に先立つて実施される操作、この同定のための操作、並びに発現系の配列決定 、生成及びこの系におけるＥＰＯ発現の免疫学的確認に関するものである。

更に臭体的には１例１はヒ）ＥＰＯ７ラグメントのアミノ酸配列及びこの配列に 基づく放射線標識化プローブ混合体の調製に関する。例２は一般に％陽性サルｅ ＤＮムクローンの同定に必要な操作に関するものであ〕、このため動物の気量及 び動物血清の予備的ラジオイムノアッセイ（ＲＩム）分析に関する情報が得られ る。例３は、ｃＤＮムライブラリ−の調製、陽性クローンノコロ二−ハイプリダ イセーシ夏７．Ｘ／９−ユング及び確認、陽性ｅＤＮムクローンのＤＮＡ配列並 びにナルＥＰＯポリペプチドー次構造形状（アミノ酸配列）の情報に関する。例 弘は陽性ヒトゲノムクローンの同定に必要な操作に関するものであシ、このため ゲノムライブラリー、プラークハイプリダイゼーシ璽ン操作及び陽性クローンの 確認に関する情報が得られる。例！は、陽性ゲノムクローンのＤＮＡ配列及びサ ルＥＰＯ鎖の情報との違いも含めた、ヒトＥＰＯポリペプチドアｚノ酸配列の情 報に関する。例ｔは、陽性サルｅＤＮムクローンから得られたＥＰＯをフードす るＤＮＡを取シ込んだベクターの調製方法、ＣＯ５−７細胞をトランス７エクシ 璽ンするためのベクターの使用法及びトランスフェクシ冒７された細胞の培養増 殖法に関する。例７は、陽性ヒトゲノムクロー７から得られたＥＰＯをコードす るＤＮＡを取込んだベクターの調製方法、ＣＯ３−／細胞をトランス７エクシ璽 ンするためのベクターの使用法及びトランス７エクシ璽ンされた細胞の培養増殖 法に関する。例ｔは、例を及び７におけるトランス７エクシ璽ンされた細胞の培 養増殖によシ得られた培地上澄で実施されたイムノアッセイ法に関する。例りは １例を及び７における微生物発現によるＥＰＯのイン・ビトロ及びイン・ビボ生 物学的活性に関する。

例１０は、チャイニーズハムスルー卵巣（ｒｃａ。

」）細胞をはじめとする。ナル種ＥＰＯｅＤＮム及びヒト種ゲノムＤＮＡについ ての哺乳類宿主発現系の調製に関する。例１／は、大腸菌及び酵母菌の宿主細胞 での発現のための多数の優先フード７をはじめとする。

ヒト種ＥＰＯ及びＥＰＯ類縁体をコードする合成遺伝子の調製及びそれに基づく 発現系に関する。例１２は。

例ＩＩの系における発現生成物の免疫学的及び生物学的活性面に関する。

ヒ）ＥＰＯを尿から単離し、トリプシン切断させて。

約１００〜ｔｒｙビフモル量の１７個に分断されたフラグメントとし、単離した 。

フラグメントに任意に数字を付し、ガス相配列決定装置（アプライド・バイオシ ステムス）を用いて微細配列順序分析によジアミノ酸配列を分析し、以下の表１ １ＩＣ示した配列情報を得た。表では、単一文字符号が用いられておプ、ｒＸＪ は明確に決定されなかった残基を表わす。

表　Ｉ Ｔ４４ｍ　Ａ−Ｐ−Ｐ−Ｒ Ｔ≠ｂ　Ｇ−に−Ｌ−Ｋ Ｔ５’　Ａ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｑ−Ｋ Ｔ１３　Ｖ−Ｌ−Ｅ−Ｒ Ｔ／Ｊ　Ａ−Ｖ−３−Ｇ−Ｌ−Ｒ Ｔ／、ｒ　Ｌ−Ｆ−Ｒ Ｔ２／　Ｋ−Ｌ−Ｆ−Ｒ Ｔコよ　Ｙ−Ｌ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｋ ＴコＡａ　Ｌ−Ｉ−Ｃ−Ｄ−８−Ｒ Ｔコアｂ　Ｌ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ａ−Ｃ−ＲＴ２７　Ｔ−Ｉ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｔ− Ｆ’−ＲＴ２ｒ　Ｅ−Ａ−Ｉ−８−Ｐ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｍ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｌ− Ｒ ＴＪＯＥ−Ａ−Ｅ−Ｘ−１−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｘ−Ａ−Ｅ−Ｈ−Ｘ−８−Ｌ− Ｎ−Ｅ−Ｘ−１−Ｔ−Ｖ−Ｐ ＴＪ／　Ｖ−Ｙ−８−Ｎ−Ｆ−Ｌ−Ｒ Ｔｊｊ　５−Ｌ−Ｔ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｒ Ｔ３ｓ　Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｙ−Ａ−Ｗ−Ｋ ＴｊＪｒ　Ｇ−Ｑ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｘ−８−８−Ｑ−Ｐ−Ｗ−Ｅ−Ｐ−Ｌ− Ｑ−Ｌ−Ｈ−Ｖ−Ｄ−に −ブ Ｂ、オリゴヌクレオチドプロ　混合体の設計と調裏表ＩＫ示したアミノ酸配列に 関し、混合プローブ操作がｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ及び（又は）ゲノムＤＮＡライブラリ ーでのＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成操作に適用し得るかにつ込て確認する目 的で、遺伝暗号の縮重関係を精査した。この分析では、フラグメン）ＮｎＴ　Ｊ 　ｊの中に７つのアミノ酸残基（Ｖａｌ−Ａａｎ−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ａｉｍ 　−Ｔｒｐ　−Ｌｙｅ　）　が存在していたことが判明したが、この鎖はコ０塩 基対につ込て可能な７２２個のＤＮＡ鎖の５ちの一つをコードして偽るというこ とにより独特に特徴づけることができる。ｉｘｒ個の２０塩基鎖オリゴヌクレオ チドの第一の組は、したがって下記表■に示した配列に従い、固体支持体上での 標準ホスホアミデート法〔例えば、ビューケージら；「テトラヘドロン−ｖター ズ」、第２２巻、第１ｔｒｙ−ｉｒｔ２頁、１９１１年（Ｂｅａｕａａｇ＠、　 ａｔ　ｍｌ、、　Ｔｅｔｒｍｈｅｄｒｏｎ　Ｌ＠ｔｔ＠−ｒａ、　２　Ｊ　、　 ｐ　ｐ　／　Ｉ　ｊター／ｒｔ２（／りｔ／））参照〕によシ合成される。

表　■ ＠　＠　−Ｖａｌ−ムａｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｌｍ　ｌ　４ｊ’　ＣＡＡ　Ｔ ＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＡＣＣＴＴ−５′ＴＡ　Ａ　ム　Ｔ Ｑ　Ｇ ＣＧ 更に分析すると、フラグメントＮｏ−Ｔ　ｊ　ｒの中に１ｔつのアミノ酸残基（ Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌ＠ａ　）の存在が確認され、それ に基づけば、下記表■に示したよ５１Ｃ７λを個の混合オリゴヌクレオチドの／ ７−ｍ＠ｒプローブのプールを調製することができる。

ｊ’　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＡＣＣＣＴＴ　ＧＧＡ　ＧＡ　−よ′ＣＴ　ＣＴＡ オリゴヌクレオチドプローブを％Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＮ）を周 込て７！００〜１０００Ｃ１／ｍｍｏｌ　（Ｉ　ＣＮ　）のｒノ２Ｐ−ＡＴＰＫ よシ！′末端で標識化した。

例　コ Ａ、サルの処理操作及びＲＩＡ分析 メスのカニクイザル（Ｃｙｎｃｍｏｌｇｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ　）マカカ−７７シ キエラリアス（Ｍａｅａｅｍ　ｆａａｃｉｃｕｌａｒｌａｍ　）（２５〜３ｋｇ 、／、ｊ−２年齢）に　ｌ、Ｊ及びｊ８目；　ｔ　２．　ｒ　ｒｎｇ／’ｋｇの 用量でｐＨ７，０の塩酸フェニルヒドラジン溶液を皮下注射して地理した。ヘマ トクリット値をそれぞれ注射する前に測定した。７８目に、即ちヘマトクリット 値が初期値から２ｊ％低下した際、塩酸ケタミンコよｍｇ／ｋ　ｇを投与して、 血清及び腎臓な採取した。採取物を直ちに液体窒素で凍結し、−７０℃で保存し た。

Ｂ、ＥＰＯの８１人 試料中のＥＰＯ定量のためのラジオイムノアッセイ操作を以下の操作に従い実施 した。

エリスロボエチンの標準又は未知試料を３７℃で２時間抗血清と一緒にインキ島 ベートした後、試験管を氷冷し、″５ニー標識化エリスロボエチンを加え、管を １２時間以上０℃でインキ島ベートした。各試験管には、希釈免疫血清よＯμｌ 、　Ｉ−エリスロボエチンＩＯ，０００ｅｐｍ、ｈラシロールｊ＃１及びｇｐｏ 標準もしくは未知試料０〜コ！０μｌからなり、残部が０．　／ＩＢｇム含有Ｐ ＢＳであるインキ為ベート混合物！００１１１が入りていた。使用した抗血清は 、ヒト尿エリスロボエチンの純粋なｌ−標品で免疫されたウサギの第二試験血液 でありた。試験のための最終的抗血清希釈液は、抗体−結合　Ｉ−ＥＰＯが入力 能カウント数の１０〜コ０ｓを超えないよ５に調整された。一般に、これは／： １０，０００〜／　：　１００，０００の最終的抗血清希釈液に相当した。

抗体−結合１２５エーエリスロボエチンは、スタフ人（ｓｔａｐｈ　Ａ　）　／ 　ｊ　Ｏμｌの添加によシ沈殿した。ｇｏ分間インキュベートした後、試料を遠 心分離し、ペレットを０．／　ｊ　Ｍ　ＮａＣｌ、　２　ｒｎＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　 Ａ及びｏ、ｏ　ｒ　＊トリトンｘ−ｉｏｏ含有／　Ｏｒｎ　Ｍ　）リス−ＨＣ１ ０−７７ｍｌで二回洗浄した。洗浄したペレットをガンマーカウンターテ計測し 　１２５４−エリスロボエチン結合体の優をめた。免疫前の血清のカウント数を 、非特異的沈殿につ−て補正するため、全ての最終値から差し引い九未知試料の エリスロボエチン含量を標準曲線としてめた。

上記操作を、未処理サル血清のみならず、前記入部で得られたサル血清にも適用 した。正常血清値を分析すると含有量は約Ｊ　Ａ　ｍＵ／ｍ　１であったが、処 理サル血清では含有量は／　０００〜／　７０（１ｍＵ／ｍｌであった。

例３ Ａ、サルｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー メツセンジャーＲＮＡを、チャーブウィンら＝「バイオケミストリー」、第ｔｒ 巻、第ｊ２り≠頁、ｌり７り年（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ　、ａｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｅ ｈ＠ｍｔｍｔｒｙ、ｒ二ｒ。

ｐｊ２り４ｃ（ｌり７り）〕のチオシアン酸グアニジニウム法によつて正常な貧 血サル腎臓から単離し、ポリ（人）”ｍＲＮＡを、マニアテイスら：「そレキエ ラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニユアル」（ｌりｔ２年、ニューヨ ーク州、ハーノ（−、コールトスプリンゲス、コールトスプリンゲス・ハーノく −・ラボラトリ−）　（Ｍａｎｉａｔｌｓ、　ａｔ　ａｌ、、”　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　ＣＣ１ｏ−ｎ１ｎ　、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（ Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒ−ｂｏａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｌｎｇｓ　、　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、、　／りｔλ）〕第１ り７−／りを頁に記載されているよ５に、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムク ロマトグラフィーで二回精製した。ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを、オカヤマら ：「モレキュラー９アンドーセルラｉ１１バイオロジー」、第２巻、第１４１− １７０頁、ｔｙｒコ年（Ｏｋａｙａｍａ、ａｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃ ｓ＋１１．　Ｂｉｏｌ、、２　、ｐ　ｐｉｔｔ−ｉｙｏ＜１ｙｒ２＞〕の一般的 方法の修正法によシ調製した。本発明での好まし込操作のキーポイントは以下の とおルであった＝　（１）　１１　Ｕ　Ｃｒを唯一のベクターとして使用し、Ｐ ｉｔ　Ｉで切断し、次いでぶ０〜１０塩基鎖のオリゴｄＴの尾部をつけた、（２ ）Ｈ１ｎｃＩＩ切断によシベクターの一端からオリゴｄＴ尾部を取り除いた、（ ３）第一の鎖の合成とオリゴｄＧの尾部づけを公表された方法により実施した、 （４）　Ｒａｍ　Ｈｌ　切断によりベクターの一端からオリゴｄＧ尾部を取り除 いた、及び（５）　Ｄ　ＮＡによるＲＮＡ鎖の置換には、オリゴｄＧ尾部つきベ クターよりも３倍過剰の２つのリンカ−（ＧＡＴＣＴＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＣＣ ＣＣＣＣＣＣ及びＡＣＧＧＴＣＴＴＴＡ）を用−た。

Ｂ、サルｅ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーをスクリーニングするためのコロニーハイ プリダイゼーシ璽ントランスフォーメーションを受けた大腸菌を、！Ｏμｇ／ｒ ｎｌのアンピシリン含有栄養平板上に、ｌＯｌｏＸｌＯプレート当９りＯＯ０コ ロニーの密度で分散させた。ジーン拳スクリーン・フィルター（Ｇｏｎｅ　Ｓｅ ｒｍｏｎｆｌｌｔｅｒ　）　にニーイングランド・ヌクレア・カタログＮｎＮＥ Ｆ’−タ７コ）をＢＨＩ−ＣＡＭプレート〔バク）　（Ｂａｃｔｏ　）脳心臓浸 出液７７　ｇ　／　Ｌカザミノ酸λｇ／Ｌ及び寒天／　ｊｇ／Ｌ−クロラムフェ ニコール！００μｇ／ｍｌ含有〕にて予め湿潤させ、プレートからコロニーを採 取するのに用いた。コロニーを同一の培地で１２時間以上増殖させて、プラスミ ド複製数を増やした。

増殖シたコロニー（コロニ・サイド・アップ）を、以下の溶液でそれぞれ飽和さ れた２枚のワットマン３ＭＭ紙上にフィルターを連続的におくことにより処理し た： （１）５分間は７ｍＭグルコース−λｊｍＭ　トリス■Ｃ１（ｐＨ１，０）　− ／　ＯｒｎＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨＬＯ）、（２）１０分間は０．６　Ｍ　ＮａＯ Ｈ、及び（３）３分間は１．ＯＭトリスＨＣＩ（ｐＨ７，７）フィルターを次い で、ＩＯ”ＣｋＣ″Ｃコ時間減圧乾燥させた。

フィルターを次に、プロテイナーゼにで切断し、緩衝液Ｋ　（０，／　Ｍ　トリ スＨＣ１（ｐＨｒ、０　）　−０，／　ｊ　ＭＮａＣｌ　−／　ＯｍＭ　ＥＤＴ Ａ　（ｐＨｒ、２　）　−０，コ＊ＳＤＳ〕中にグロテアーゼ酵素ｊ０μｇ　７ ｍ　１を含む溶液で処理した。具体的には、溶液ｊｍｌを各フィルターに加え、 ５５℃で３０分間切断処理し、しかる後溶液を除去した。

フィルターを次いで、プレハイプリダイゼーシラン緩衝液（ｊｘ　Ｓ　Ｓ　ｐ　 ｖ、　−ｏ、ｓ％５ＤＳ−１００μｇ／ｍ　１ｓＢ大腸菌ＤＮＡ−よＸＢＦＰ） ４ｃｍｌで処理した。

プレハイブリダイゼーシ７ン処理を５！℃で、おおむね参時間以上行な−５その 後、グレハイプリダイゼーシ１ン緩衝液を除去した。

ハイブリッド形成操作を以下の方法で行なった。各フイ）Ｌｌｌ−に、表■の／ ２１のプループ配列（ｇｐｖ混合体とされる全ての混合体）をそれぞれ０．０２ 　ｊピコモル含有するハイプリダイゼーシ冒ン緩衝液（ｔＸＳ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　− ０，！チ５ＤＳ−酵母菌ｔＲＮＡ／７１７μｇ／ｍｌ　）　ｊ　ｍｌを加え、フ ィルターを≠ｊ℃で２０時間保持した。この温度は、全てのプローブについて計 測された解離温度（Ｔｄ）の最低のものよりコ℃低かった。

ハイブリッド形成後、フィルターを振盪器にて１０分間、室温で＋　ｘ　ｓ　ｓ 　ｃ　−ｏ、ｉチＳＤＳによフ３回洗浄し、ハイブリッド形成温度（４Ｌｒ”ｃ ）ＦＣて２〜３回ぶＸ５ＳＣ−／’％ＳＤＳで洗浄した。

フィルターのオートラジオグラフィーにより、スクリーニングされた２００，０ ００コロニーの中から７つの陽性クローンが見出された。

推定されるサルｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン（７３クローン）の一つの最初の配列分 析が、ウオレスら二「ジーン」、第１Ｇ巻、第コ１−２６頁、１ｙｒｔ年（Ｗａ ｌｌａｅａ　。

＊ｔａｌ−、Ｇ＠ｎｓ、／４．ｐｐ２／−２６（／Ｐｌｒ／）〕の方法を修正し て確認のために行われた。即ち、ｒ３のサルｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンからのプラ スミドＤＮＡをＥｃｏ　ＲＩ　で切断して直鎖状となし、沸騰水溶上で加熱して 変性させた。ヌクレオチド配列をサンガーら：「Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　（米国） 、第７≠頁、第Ｊ−ｍ−１６７頁、１２７７年（Ｓａｎｇｅｒ　、　ａｔ　ａｌ −、Ｐ−にんＳ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ　）　、　７上、ｐｐ−ｒ弘６３−ｊ４Ａ６７ （／り７７）〕のジデオキシ法で調べた。／Ｇの配列からなるＥＰＶプローブ混 合体の一部を連続的反応のプライマーとして用すた。

Ｃ，サルＥＰＯ（ＩＤＮＡ配列 ！ｒ３のクローンのヌクレオチド配列分析をメツシング：［メソッド・イン・エ ンザイモロジーＪＳｆａ１０１巻、第一〇−７１頁、／９１３年（Ｍｅｓｓｉｎ ｇ　、　Ｍｅ−ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、／Ｉ１．　ｐｐ２０− ７１　（／りｔ３）〕の方法に従って行なった。表■に示したのは、ｔ３のクロ ーンにおける約１ｔｏｏ塩基対のＥＣ。

ＲＩ　／　Ｈｌｎｄ　ｍクローン化フラグメントの予備的な制限地図分析結果で ある。制限エンドヌクレアーゼ酵素認識部位のおおよその位置は、３′塩基から ５′末端フラグメントのＥｃｏ　Ｒ１部位までの数によって表わされる。

ヌクレオチドの配列は、重複するフラグメントを重ね合せることを目的として、 個々の制限フラグメントを結げることによシ行なわれた。例えば、Ｃ１１３の制 限フラグメント（ｌｌｌまでの５ａｔＩＪ　Ａ　／　ｊコ弘までの５ｔａａ　Ｉ 　）におけるヌクレオチド分析で得られる鎖情報の重複、並びにＣ７ｊのフラグ メント（１１２４ＬまでのＡｌｕ　Ｉ　／　ｊ　ＯＪまでのｎｓｔｇｍ）Ｋおけ る逆方向の配列である。

１咀ｊＡ　／／／ ＳｍａＩ　／１０ ＢａｔＥＩＩ　２０３ ＳｍａＩ　３２弘 Ｐａｔｌ　弘２６ Ａｌｕ　Ｉ　≠３０ 拒Ｉ　弘≦を 約／Ｊｕコ塩基対（ｊ’　Ｓａｕ　ｊ　Ａ部位からＥｅｏ　ＲＩ部位及びＨｉｎ ｄ　ｍ部位までの範囲内で）の配列を決め、全ての解読可能な構造を分析して、 表Ｖに示したＤＮＡ及びアミノ酸鎖の情報を解明することができた。表中、成熟 ＥＰＯのアミノ末端と推定される最初のアミノ酸残基（前述したコＯのアミノ末 端残基配列分析と対比させて確認されるような）は、数値の＋ｌで示されている 。成熟蛋白質アミノ酸鎖にお−で一番目の残基である最初のアミノ末端アラニン 残基の「上流」に位置していてメチオニンを特定化するＡＴＧ：ｒ）’ｙ（−コ アで示される）の存在は、成熟ＢＰＯが循環系に入る前に切除されるコアのアミ ノ酸「リーダー」領域を含む前駆体型として、Ｆ：、ＰＯが細胞質中でまず発現 される可能性のあることを示している。ポリペプチド中の潜在的グリコジル化部 位は本で示されて−る。翻訳領域の分子量は２１／／７ダルトンであり、成熟サ ルＥＰＯを構成するポリペプチドのｉｔｓ残基の分子量は／１２３４ダルトンで あった。

表Ｖのポリベプキド鎖は、例えばホップら：「Ｐ。

Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｊ　（米国）、第７を巻、第３１２グー３ｔコを頁、ｔｙｒｉ年（ Ｈｏｐｐ、　ａｔ　ｍｌ、、Ｐ−Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　（Ｕ−８，人、）、７ｒ、 ｐｐＪｒ２４４−３１．１１（／１ｒｌ）〕、カイトら：「ジャーナル・オプ・ バイオロジー」、第１ｊ７巻、第１０３−−１３２頁、１１１２年（Ｋｙｔａ、 　ｅｔ　ａｌ−、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　／　ｊ　７、ｐｐｌｏｒ−ｔ ３ｘ（ｉりｔコ）〕及び（又は）ｓ−，−ら：「バイオケミストリー」、第１Ｊ 巻、第２２−ｕ４ｃｊ頁、ｌり７４Ｃ年（Ｃｈｏｕ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏ ｅｈ＠ｍ、／　Ｊ　％ｐ　ｐコココーコｕｐ（ｔり７４Ｌ）〕及び「アドパンシ ズ會イン・エンザイモロジー」、第Ｖ７巻、Ｂｉｏｌ−４１７頁、ｌり７ｌ年（ Ａｄｖａｎｃｅ　ｌｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　＃　７　、　ｐ　ｐ　＃ｚ −ｐｙｃｔり７ｒ）〕の方法によシ、高度に親水性の領域及び（又は）潜在的に 高度な免疫原性領域を示す二次構造特性の存在に関する分析が容易になるであろ ５゜ホップらの方法によるコンビ為−ター補助分析ハ、カリフォルニア州、ハロ アルド、エニバーシティアペニｓ、　／　２≠のインテリジェネティクス社から 入手可能なＰＥＰレファレンスのセクシオン４．７）Ｃ示されたプログラムによ り実施可能である。

ローンら：「セル」、第ｔｒ巻、第！！！−ｊｔ≠３頁、／り７り年（Ｌａｗｎ 、　ｓｔ　ａｌ−、Ｃｅ１ｌ、　／　ｒ　％ｐ　ｐ　ｊＪＪ−１４４３（ｌり７ り）〕の方法によシ調製されたｃｈ４！ムファージ由来ヒト胎児肝ゲノムライブ ラリーを得、プラークハイプリダイゼーシッン分析で使用するために保存した。

一色 ファージ粒子を溶解し、ＤＮＡを、シーンスクリーン・プラス・フィルタにニー イングランド・ヌクレア・カタログ階ＮＥＦ−タフ４）及びＮＺＹＡＭプレート ＋１（ｌリットルにつき、ＮａＣ１ｊ　ｇ　％ＭｇＣｌ２−４Ｈ２Ｏコｇ、ＮＺ −アミンムｔｏｇ、酵母エキスｒｇ、カザミノ酸２ｇ、マルトース２ｇ％及び寒 天）を使用するのではなく、ウー：「メソッズ・イン・エンザイモロジー」、第 ｔｒ巻、第Ｊｒ９−３９Ｊ−頁、／９７り年（Ｗｏｏ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｉｒ、　ｐ　ｐ　Ｊ　ｒター３２！（ｌり７り）〕 の方法によル、フィルター（フィルター当夛ｊｏ、　ｏ　ｏ　ｏプラーク）に固 定した。

風乾したフィルターを２０℃で１時間焼成し、吹込で例３のＢに記したように、 プロテイナーゼにで消化した。プレハイブリダイゼーションを５５℃で参時間以 上／ＭＮａＣ１−／チＳＤＳ緩衝液で行ない、しかる後衝液を除去した。ハイブ リッド形成及びノ飄イブリッ後洗浄を例３のＢに記したように行なった。ＥＰｖ で示されるｌコｒの２０−　ｍａｒプローブ混合体及び（ＥＰＱ混合体で示され る）表■の／２１の／　７−　ｍａｒプローブ混合体を周込た。ハイブリッド形 成は、ＥＰＶプローブ混合体を用い、４！ｒ”ｃで行なわれた。ＥＰＱプローブ 混合体ハイブリッド形成は≠ｔ℃、即ち混合体中の最低の計測Ｔｄ値よりｐ”Ｃ 低い温度、で行なわれた。再ハイブリッド形成のためのハイブリッド形成グロー ブの除去を、／Ｘ８ＳＣ−０，／チＳＤＳと一緒に２分間煮沸することによシ行 なった。フィルターのオートラジオグラフィーによシ、調べられた４！Ｏｏ、　 ｏ　ｏ　ｏのファージプラーク中３つの陽性クローン（いずれのプローブ混合体 とも反応する）が見出された。

ＥＰＯをコードしているような陽性クローンの確認が、ってなされた。この操作 によっても、ゲノムＤＮＡ鎖における多数のイントロンの存在が実証された。

例　！ （λｈＥ／で示される）陽性クローンの一つのヌクレオチド配列分析を行なった が、これまでに得られた結果は表ＶＩＫ示されている。

表■中、最初のＤＭＡ配列は、と）ＩＰＯ遺伝子の翻訳部分の直前の非翻訳配列 と思われる頂部の６２０塩基を示す、より具体的には、その配列は、リーダー配 列（「前記列」）における最初の４つのアミノ酸（−２７〜−２４）をコードす る翻訳ＤＩム領域まで続＜５’末端遺伝子からなっているようである。読取り開 始をコードする遺伝子の前に位置する鎖中の４つの塩基対はまだ明確には確認さ れなかったため、ｒＸＪで表わされている。次いで、約６３９塩基対（そのうち ４３９塩基対が配列されたが、残りの２００塩基対は「工、Ｓ、」で表わされて いる）からなるイントロンに続いており、翻訳されるポリペプチドの残基−２３ として示されたグルタミンのコドンの直前に位置している。その直後に続くエキ ソン鎖は、（成熟ヒトＥＰＯのアミノ酸鎖残基＋１として示される）アラニン残 基から、＋２６のスレオニンを特定化するコードンまでのアミノ酸残基なコード していることが判明し、しかる後具体的に示した２５６塩基からなる第二のイン トロンに続いている。このイントロンの後、２７〜５５のアミノ酸残基のエキソ ン配列が続き、その後６１２塩基対からなる第三のイントロンが始まる０次のエ キソンはヒトＩＰＯの５６〜１１５の残基なコードしており、次いで特定化され た１３４塩基からなる第四のイントロンが始まる。第四のイントロンに続くのは 、第１１６〜１６６の残基なコードするエキソンと「停止」コードン（〒ＧＡ） である、最後に、表■では、ヒトＩＰＯ遺伝子の非翻訳３Ｉ領埴と思われる　５ ６８塩基対鎖を明らかにしているが、ｒＸＪで示される２つの塩基対はまだ明確 には配列法めされなかった・表■はこのように、１６６個の特定のアミノ酸残基 の成熟ヒトＩＰＯ（推定分子量−１８，３９９）の−次構造形状（アミノ酸配列 ）を確認するのに役立つ６表で同時に示されているのが、ヒト遺伝子オペロンの プロモーター／オペレーター機能にとって重要なｓｌ　−３’Ｄｌｉム鎖に石う 、２７残基のリーダー配列をコードするＤＭＡ配列である。成熟ヒ）ＸＰＯポリ ペプチドの潜在的グリコジル化部位は、表中に＊で示されている。表■の特定の アミノ酸配列がヒトエリスロポエチンの自然発生的対立遺伝型のそれを構成して いる可能性があることに注意すべきである。この位置に関する支持が、残基１２ ６において表に示したセリンと対立するメチオニンを有する多（のエリスロボエ チン分子の発見に至った、尿中エリスロボエチンの単離物を配列するという長年 の努力の結果の末に見出された。

以下の表■はヒトおよびサルのＥＰＯにおけるポリペプチド配列の相同性の範囲 を示している。表中の上部の連続列において、−文字の符号は残基−２７で始ま るヒ）ＲＰＯについて誘導翻訳されたポリペプチド配列を示すために用いられて おり、下部の連続列は指定の残基−２７で始まるサルｉｐｏについて誘導された ポリペプチド配列を示している。＊は、配列相同性を強調するために用いられて いる。誘導されたヒトおよびすｆｉ／ｌ　Ｐ　Ｏ配列は、（ヒト）における部位 １１６で「付加的」リジン（Ｋ）残基な有していることに着目すべきである。表 ■と相互に参照することＫより、この残基が丁度ゲノム配列において推定される ｍＲＮムのスプライス部位にあることが明らかとなる。ヒトポリペプチド配列に おけるリジン残基の存在は、下記例７でヒトゲノムＤＮＡによりトランスフォー メーシ嘗ンされたａｏａ−１細砲から単離されたｍＲＮムより得られるヒトｃＤ Ｍム鎖クローンを配列するとと忙よりても更に確認された。

例　６ 例３の操作で得たサルｃＤｌｉＡによりコードされるｘｐｏポリペプチド物質な 単離可能な量で微生物合成するために量初の試みとして選択された発現系は、哺 乳類宿主細胞のうちの一種（即ち、００Ｂ−１細胞、Ａ、Ｔ、Ｏ，Ｏ，ＮＯ，０ ＲＬ−１６５０）であった。その細胞は。

大腸菌宿主（ＩＩＢＲ３２２由来ＤＩムの存在下にて）および哺乳類宿主（ｓｖ ４ｏウィルス由来ＤＮＡの存在下にて）内で自律的に複製することが可能な「シ ャトル」ベクターによりトランスフェクシ曹ンされた。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作により調製された０例３の８３のプ ラスミドクローンを大腸菌で増殖させ、約１．４ｋｂのサルｍｐｏをコードする ＤＮＡを１ａｏＲ工およびＨｌｎａ　ｍ切断により単離した１分別して単離され たのは、約４．ＱｋｂのｐＢＲ３２２由来ａｉｎａ■７’Ｓａｌ　Ｉフラグメン トであった。

約３０　ｂｐのＸａｏ　Ｒ工／５ａｘＩｒリンカ−」７ラグメントがＭ１３ｍｐ ＩＱＲ１Ｆ　ＤＮＡ　（ＰエンドＬラボラトリーズ）から得られた。このりンカ ーは連結したＩＬｅ＋ｏＲ工　粘著端を含んでおり、８８ｔ　１．８ｍａ　Ｉ、 ＢａｎＨＩおよびＸｂａ　Ｘ認識部位、更には８ａｌ　Ｅ　付着端に続いている 。上記３つのフラグメントは約５．４ｋｂの中間プラｘｊド（ｒｐｌＲ８Ｊ　） の形成のために連結されたが、このプラスミドにおいて、ＬＰＯＤＩムは有効な 制限エンドヌクレアーゼ認識部位の「バンク」近傍の一端に位置していた。ｐｌ Ｒ８を次いでＨｌ、ｎａｍおよび８ａｌ　ｌで消化すると、Ｉ！ｆＰｏ　ＤＮＡ および１ｃｏＲＩから８”ＸＩ（Ｍ１３ｍｌ）１０）までのリンカ−が得られた 。１０．４１ｃｂの７ラグメントを約４．９ｋｌ）の１１ＢＲ３２２のＢａｍ　 ＨＩ　／　８ａｌ　Ｉおよび約３０ｂｐの他のＭ　ｌ　３　！ＩＩＰ　１０−Ｂ ｉｎ＋１１１１／ＢａｎＥＬＩ　ＲＦ７ラグメントリンカーと結合させた。Ｍ１ ３リンカ−フラグメントは、ｍｉｎｄｍ粘着端、それに続（Ｐａｔ　１．Ｂ＆ｌ 　１％Ｘｂａ　Ｉ　認識部位およびＢａｍＨＩ粘着端という特徴を有していた。

結合生成物は、再び、制限部位バンク近傍の両端ＫＩＩｉＰＯＤＮＡを有００Ｂ −１細胞におけるＸＰＯＤＮム発現のために選択されたベクター（「ｐ　Ｄ　Ｓ 　Ｖ　Ｌ　Ｉ　Ｊ　）を予め調製し、大腸菌に文選側および自律的に複製させた 。これらの特徴は、ｐＢＲ３２２ヌクレオチド２４４８〜４３６２の領域に複製 起点とアンピシリン耐性遺伝子ＤＭＪｈ鎖が存在していることにある。この配列 は、ベクターに取込まれる前に、Ｈ１ｎａｍ認識部位をヌクレオチド２４４８に 直接接合させるリンカ−を付加することにより構造的に変換された０選択された ベクターの他の有用な特性としては、ｃｏｓ−１細胞において自律的に複製し、 また哨乳動物細胞中で機能するウィルス性プロモーター配列が存在し得る能力が あった。これらの特徴は、８Ｖ４Ｑゲノムにおけるヌクレオチド数５１７１〜２ ７０の３４２　ｂｐ配列に存在する複製ＤＮＡ配列および「後期遺伝子」ウィル ス性プロモーターＤＮＡ配列の起点により示される。唯一の制限部位（Ｂａｍｉ ＬＩ　）をベクターにつけ、市販のリンカ−〔コラボレーティプ・リサーチ（Ｃ ｏ１１ａｂｏｒａｔｉｎθＲｅ５ｅａｒｃｈ）］を用いてウィルス性プロモータ ー配列に直接接合させた。更にベクターには、「後期遺伝子」ウィルスｍＲＮム ボリアデニル化信号（通常、転写ターミネ−ターされる）を有する２３７塩基対 配列（ＳＶ４（１）ヌクレオチド数２５５３〜２７７０に由来する）が取込まれ ていた。このフラグメントは、ベクターにおいて、「後期遺伝子」ウィルス性プ ロモーターから唯一のＢａｍ　１１７部位までに対応し、適切に配向していた。

更に、ベクターには、ウィルス性プロモーターとターミネータ−との間の配列に おいて、唯一のＢａｍＨｉ部位に挿入された遺伝子の潜在的転写に関与しない部 位に別の哺乳類遺伝子が存在していた〔哺乳類遺伝子は、ガッサーら：「Ｐ、Ｎ 、ム、Ｂ、Ｊ（米国）Ｓ第７９巻、第６５２２−６５２６頁、１９８２年（Ｇａ ５５ｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、ｊｌ、Ｓ、　（σ、８．Ａ）。

７９、　ｐｌ）６５２２−６５２６　（１９８２））のように、プラスミドｐＭ Ｇ−１から単離された約２，５００ｂｐＯマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ ＩＩＬＰＲ）小遺伝子からなっていた〕。再び、プラスミドｐ　Ｄ　８　Ｖ　Ｌ 　１の大きな機能的成分は、５Ｖ４ＱＤＮムのヌクレオチド５１７１〜ｚ７０（ ３４２ｂｐ）および２５５３〜２７７０（２３７’ｌｌ）に沿ったｐＢＲ３２２ のヌクレオチド２４４８〜４３６２からなる。

例えば、上記マニアナイスらの方法により、ｉＰ。

をコードするＤＮＡをＢａｍＨｉフラグメントとしてプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ−Ｒ Ｐ　Ｏから単離し、ＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐ　Ｄ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　１ に結合させた。制限酵素分析を行ない、２つの得られたクローンベクター（複製 ベクターＥおよびＬ）が正確罠配向してＩＰＯ遺伝子が挿入されたことを確窮し た。プラスミドｐＤ８ｖＬ−Ｍ１ｍを示した第２図参照、誤まって配向したｎ’ Ｅｏ遺伝子を有するベクターは、正確に配向したＬＰＯＤＮＡ　を有するベクタ ーでトランスフォーメー　、シランされた宿主のＫＰＯ発現量を測定するための トランス７エクシｌン実験において、抑制的制御体として使用するために保存し た。

キャリアＤＮＡ（マウス肝および牌ＤＮＡ）と結合したベクターＨ，Ｌ、ＩＰ、 ！およびＯを用い、リン醸カルシウム微細沈澱法により、二重５　Ｑ　ｍｍプレ ートをトランスフエフシロンした。二重５０　！：ｌ！ＩＩプレートはまた、「 にせ」のトラン７オーメーシ１ノ抑制的制御体であるキャリアＤＮＡによっても トランス７エクシ冒ンされた。５日後、全ての培地について、天然ＥＰＯの免疫 学的性質を有するポリペプチドの有無に関し試験した。

Ａ、００Ｂ−１細胞を含む第−ｍｐｏ発現系ヒトゲノムもＤＮＡ　Ｉ！ＰＯクロ ーンによりコードされたヒトＩＰＯポリペプチド物質を単離可能な量で微小生物 合成する最初の試みのために選択された系は、また哺乳類宿主細胞（即ち、ｏｏ ｓ−１細胞、ム、Ｔ。

０、Ｏ，Ｎｏ、０ＲＬ−１６５０）でも発現した。ヒトＢＥＯ遺伝子を、まず、 大腸菌宿主（ｐＢＲ３２２由来ＤＮムの存在下にて）および哺乳類細胞系ａｏｓ −１（８ｖ４０由来ＤＩムの存在下にて）内で自律的に複製することが可能な「 シャトル」ベクターにてまずサブクローン化した。ｉＰｏ遺伝子含有シャトルベ クターを次いでｃｏｓ−１にトランス７エクシ曹ンした。ＢＰＯポリペプチド物 質がトランス７エクシｌンされた細胞から産生され、細胞培地に分泌された。

更に具体的には、発現ベクターは以下の操作によりｖ４裂された。ラムダクロー ンλｈｍｌから単離され、ヒトゲノムｍｐｏ遺伝子を含むＤＮＡをＢａｍＨＩお よびＨ１ｎａｍ制限エンドヌクレアーゼで消化して、全ＲＰＯ遺伝子を含む５． ５ｋｂＤＮム７ラグメントを単離した。このフラグメントな、同様に消化された 細菌プラスミドｐｉ］０８（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｂｅｔｈ ｓｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

工ｎｃ、））と混合し、結合させて、この制限フラグメントの簡便な供給源とな る中間プラスミド「ｐσ０Ｂ−ＢｎＢＪを得た。

ｃｏｇ−１細胞におけるＩＢＰＯＤＮＡ発現のために選択されるベクター（ｐ　 ８１４日Ｂｔ）を予め調製した。

プラスミドｐ　８７４８１　ｔは、大腸菌における選択および自律的な複製をな すＤＮＡ配列を含んでいた。これらの特徴は、細菌プラスミドｐＢＲ３２２のヌ クレオチド２４４８〜４３６２領域ＫＷ製起点およびアノビシリフ耐性遺伝子Ｄ Ｎム配列が存在していることにある。この配列を、ヌクレオチド２４４８に直接 連結したｍｉｎａｍ認識部位を付与するリンカ−の付加により構造的に変換した 。プラスミドｐ　８１４　ａ　ｌ　ｔも、００Ｂ−１細胞において自律的に複製 することができた。この特徴は、５ｖ４０のウィルス複製起点を含む３４２　ｂ ｐの７ラグメント（ヌクレオチド数５１７１〜２７０）にあった、このフラグメ ントを、　ｌ！１ａｏＲＩ認識部位をヌクレオチド２７０に接合させるリンカ− および８ａｌＩ認識部位をヌクレオチド５１７１に接合させるリンカ−を付加す ることにより変換した。８ｖ４０の１０６１ｂ１７ラグメントも、このベクター （ヌクレオチド数１７１１〜２７７２およびヌクレオチド数２７７２に続（Ｓａ ユ！認識部位を有するリンカ−）に存在していた。この７ラグメント中には、唯 一のＢａｍＨｌ認識配列も含まれていた。即ち、プラスミドｐ　８　ｖ４８１　 ｔ　ｋｔ、ヒ）　Ｅ　Ｐ　Ｏ遺伝子カｍ入すレルＢａｍＨＩおよびＨ１ｎｄｍ認 識部位、大腸菌内で複製および選択される配列、並びにｃｏｓ−１細胞内で複製 される配列を含んでいた。

ＢＰＯ遺伝子なｐＳＶ４８１１ｉｔに挿入するため、プラスミドｐＤ（３８−Ｈ ｕｍをＢａｍＥｌおよびＢｉｎｄｌｌ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡ ７ラグメントを；−ドする５、６ｋｂ（ＱＥＰＱを単離した。ｐ８Ｖ４ｓｉｔも ＢＩＬｍｌｉＩおよびＨｌｎａｍで切断しく全ての必要な機能を保有している） 、２５１３１）１１の大フラグメントを単離した。これらの７ラグメントを混合 連結させて、最終的ベクター「ｐ８７ｇＨｕｌＰＯＪを得た（第３図参照）。こ のベクターを大腸菌中で増殖させ、ベクターＤＮＡを単離した。制限酵素分析を 行ない、ｉｐｏ遺伝子の挿入を確認した。

プラスミドｐｓＶｇＨｕＲＰｏ　ＤＮＡを用い、ＣＣ０８−Ｘ胞においてヒ）Ｉ ＣＰＯポリペプチド物質を発現サセタ、更に具体的には、ｐ　８　Ｖ　ｇ　Ｈｕ 　ｌ　Ｐ　ＯＤＭＡをキャリアＤＮＡと連結させ、ｏｏｓ−１細胞の三重５９ｍ ｍプレートにトランスフエフシランした。

コントロールとして、キャリアＤＮＡのみを００８−１細胞にトランス７エクシ １ンした。細胞培地を５日後および７日後に採取し、天然ヒ）］ｌ１ＰＯの免疫 学的性質を有するポリペプチドの有無について試験した。

更に別の系が、００Ｂ−１細胞（ム、Ｔ、　Ｏ，０％Ｎｏ。

１：！ＲＬ−１６５０）において、ヒトゲノムＤＮＡ　ＩＰＯクローンによりコ ードされたヒトＩＣＰＯポリペプチド物質の改良生産法を得るために設計された 。

この迅速な操作系において、Ｘｐｏが、５．６ｋｌ）のＢａｎＨＩからＨｌｎｄ ｍまでの制限７ラグメント中に存在するそれ自身のプセモーターを用いて、ＱＯ ８−１細胞にて発現された。下記調製例では、ＲＰＯ遺伝子を、８ｖ４０後期プ ロモーターにより発現しうるように変換させる。

更に具体的には、クローン化された５、５ｋｂのＢａｎＨＩからＨｌｎｄｌ［Ｉ までのゲノムヒトＫＰＯ制限フラグメントを以下の操作により変換した。前記プ ラスミドｐＨｏｇ−ＨｕｌｆｔＢａｍＨ１およびＢｓ＋ｔｉｌ［制限エンドヌク レアーゼで切断した。ＢｓｔＲＩ［は、ペプチド前駆体をコードする開始ＡＴＧ まで５１方向に４４塩基対であり、Ｈ１ｎａｍ制限部位まで３１方向に約６８０ 塩基対である部位において、５．（、ｃｂｍｐｏ遺伝子を切断する。約４９００ 塩基対の７ラグメントを単離した。

８ａｌＩおよびＢａｔＥ［粘着端並びに内在ＢａｍＨ７ｉｉｇ識部位を有する合 成リンカ−ＤＮＡ７ラグメントを合成し、精製した。２つの７ラグメントを８ａ ｌ　Ｉ　およびＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＢＲ３２２と混合し、連結 させて、中間プラスミドｐＥＲｇＨＢを得た。

ゲノムヒトＫＰＯ遺伝子は、アミノ末端をコードする領域に近接したＢａｍＨ１ 部位まで３１方向に４４塩基対の一つのＡＴＧを含む完全な構造の遺伝子を保有 する４９００塩基対のＢａｍＨＩ切断フラグメントとして、それらから単離する ことができる。

このフラグメントを単離し、ＢａｍＨｉフラグメントとして、（例６で示した） 　ＢＩＬ！ＩＩＨＩ切断発現ベクタープラスミドｐＤ８ＶＬｌに挿入した。得ら れるプラスミド、即ち第４図に示すｐＢＶＬｇＨｕＥＰｏを用い、例６および７ ムに示したように、００日−１細胞からＫＰＯポリペプチド物質を発現させた。

例　８ 例６における６つのトランスフエフシランされた００８−１の培讐増殖培地を、 例２のＢに示した操作に従い、ラジオイムノアッセイによって分析した。各試料 を２５０，１２５．５０および２５２Ｉ濃度で分析した。不正確なＩＰＯ遺伝子 配向を有するベクターでトランス７エクク冒ンされたにせの細胞増殖物の上澄は 、明らかにＢＰＯ免疫応答性に関し陰性であった。

不正確な配列のＢＰＯＤＮムを有するベクター（ＨおよびＬ）でトランス７エク ク冒ンされた００Ｂ−１細胞の増殖物から得た２つの上澄のそれぞれの試料に関 し、抗体に対する１２５Ｉ−ＩＰＯ結合阻害率は７２〜８８％の範囲であり、全 ての値が標準曲線の上位に位置していた。培地上澄の正確なｘｐｏ６度は、この ため、信頼すべき程度までには調べることができなかった。

しかしながら、最大濃度（２５０μｍ）の計算値から控えめに推定すると、３０ ０ｍＯ／ｍｌであった。

例６の代表的培養液、並びに例７ムで得た５日目および７日目の培養液を１組換 えサルおよびヒトＩＬｐ。

物質および天然ヒトｚｐｏ標珈と比較するために％Ｒエムで試験し、結果を第１ 図のグラフで示した。即ち、結果は予期されたように、組換えサルＢＰＯは抗ヒ トＩＣＰＯ抗体と著しく競合したが、試験条件下では完全には結合を阻害できな いことを示した１ＭＡ換えヒトΣＰＯＫ関する最大の優阻害率はしかしながら、 ヒトＥＰＯ標準の値と極めて近似していた。用量応答曲線が平行関係であること は、共通の免疫学的な配列（エピトープ）の同一性を示唆している。サルＩ！ｐ ｏ培養液の先の評価をそれよりも高い希釈レベルで再度実施すると、２．９１　 ＝３．１２０７ｍ１の範囲であった。調べられたヒトミルｏ生産量は、５日間増 殖試料が３９２ｍ　Ｏ／　ｍ　ｌで、７日間増殖試料が５５７！ＱＯ／ｍｌであ った。例７Ｂの発現系におけるｍｐｏ測定値は同レベルかそれ以上であった。

例　９ 例６および７で得られた培養液を、ゴールドワツサーラ＝「エンドクリノロジー 」、第９７巻、第２号、１）ｐ３１５−３２３．１９７５年（Ｇｏｌｄｗａｓｓ ｅｒ、ａｔ６、ｌ　、、Ｘｎ＋１ｏａｒ　ｉｎｏｌｏｇ７　ｓ　９７　ｅ　２　 ｓ　ＰＩ’　３１５−３２３　（１９７５）］の方法によるＩＰＯ活性イン・ビ トロ分析に供した。被検培養液のサルｌ　Ｐ　Ｏｌ１ｌＩ、ｌ定値は３．２〜４ ．３０７ｍ１の範囲であった。ヒトＫＰＯ培養液もこのイン・ビトロ分析では活 性であり、この活性は抗凡ＰＯ抗体で中和することができた０例６０組換えサル 凡ＰＯ培養液も、フーツら；「ネーチャー」、第１９１巻、第１０６５−１０６ ７頁、１９６１年〔Ｃｏｔｅｓ、ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、１９１＊　Ｉ）’ Ｐ　１０６５−１０６７　（１９６１）］およびハモンドら：「アナルス・オプ ・ニューヨーク・アカデミ−・オプ・サイエンス」、第１４９巻、第５１６−５ ２７頁、１９６８年〔Ｈａｍｍｏｎｄ、ａｔａｌ、、ムｕｎ、Ｎ、Ｙ、ムｃａｄ 、８ａｉ。

、１４９，１１１１．５１６−５２７　（１９６８）］の一般的方法によるイン ・ビボ生物学的活性分析に供したところ、活性値は０．９４〜ｌ。２４０／＋１ １１の範囲であった。

例　ｌＯ 前述の語例において、組換えサルまたはヒ）Ｉ、ＰＯ物質を、００８−１細胞を トランス７エクク舊ンするのに用いたベクターからり（つた、これらのベクター は、細胞内におけるＢＴ４ＱのＴ抗原とベクター上の８７４０の複製起点との存 在によって、ＱＯ８−１細胞内で複製する。これらのベクターはｃｏｓ−１細砲 内で有効量のＺＰＯを産生ずるが、その発現はベクターが最終的に減少していく ため、まさしく一時的である（７〜１４日）、これに伴い、少量の００８−１が ベクターでトランス７エクク舊ンされた。本例では、チャイニーズハムスターの 卵巣（（１０）　Ｄ　Ｈ’Ｐ　Ｒ−細胞および選別可能なマーカーＤＨ１ＦＲを 用いた発現系を述べている〔関連する発現系も議論するためである。

いずれも米国特許第４，３９９，２１６号並びに１９８４年８月２９日に公開さ れた欧州特許出願第１１７０５８号、男１１７０５９号および第１１７０５８号 参照〕。

ウルラウプら＝「グロシーデイングス・オブ・ナシｌナル・アカデミ−・オプ・ サイエンジズ」（米国）、第７７巻、第４４６１頁、１９８０年（０ｒｌａｕ’ ｂ。

ａｔａｌ、、Ｐｒ０Ｑ、Ｎａｔ、ムｃａｄ、Ｅｌａｉ、（σ、Ｂ、ム、）Ｖｏｌ 、７７’、４４６］、（１９８０）：ｌＫ示さｈたＯＢＯＤＨＰＲ″″細胞（Ｄ ｕＸ−Ｂｌｌ）ＯＨＯ［１細胞は、構造遺伝子の突然変異によってジヒドロ葉酸 レダクターゼ酵素（ＤＨＰＲ）を欠如しており、このため培地中にグリシン、ヒ ボキサンチンおよびチミジンの存在を要求する。プラスミ）’　ｐ　Ｄ　８　’ Ｉ　Ｌ　−Ｍ　ｋ　Ｂ　（例６）またはｐＤｓＶＬ−ｇＨｕ３ＰＯ（例８）を、 ５　Ｑ　ｍｎ＋培養培養プレートビボキサンチン、チミジンおよびクリクン含有 培地で増殖するＯＨＯＤＥＦＲ−細胞内に、キャリアＤＩムと一緒にトランスフ ェクションした。プラスミドｐ　８　Ｖ　ｇ　Ｈｕ　ｌ　Ｐ　Ｏ（例７Ａ）を、 細菌プラスミドベクターｐＢＲ３２２（前記ガツサーらによる）でクローン化さ れたマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子含有プラスミドＩＩＭＧ２と混合し た。プラスミド混合体およびキャリアＤＮＡをＯＨＯＤＥＰＲ−細胞にトランス ７エクク舊ンした（一つのプラスミドを獲得した細胞は一般に第二のプラスミド をも獲得する）。３日後、細胞を、ヒポキサチンおよびチミジン欠如培地の数個 のｌ　ＯＯｍｍ培養プレートに、トリプシン処理して分散させた。ＤＨＰＲ遺伝 子およびそれによるＩＩ；Ｉ’Ｏ遺伝子で安定的にトランス７オーメーシＢンさ れたそれらの細胞のみがこの培地で生存する。

７〜２１日後、生存する細胞のコロニーが明確になりた。これらのトランスフォ ーマントコロニーは、トリプシン処理で分散された後、ヒボキサンチンおよびチ ミジン欠如培地中で継続して増殖することができ、新種ノ細胞株（例えば、ＯＨ ＯｐＤ８ＶＩ、−ＭｋｌＰｏ、０１１ｏ　ｐ８ＶｇＨｕ３Ｐｏ、ＱＨＯ−ｐＤｓ ＶＬ−ｇＨｕ五ＰＯ）が得られた。

上記細胞株の培養液を、組換えサルまたはヒト１ＰＯの有無についてＲＩＡで分 析した。ＯＨＯｐＤｓＶＬ−ＭｋＲＰＯ株培地ハ、ブー１７スミ）”ｐＤｓＶＬ −ＭｋｌＰＯでトランス７エクク舊ンされたｃｏｓ−１細胞から得たｘｐｏと同 様の免疫学的性質を有するＸＰＯを含有していた１代表的な６５時間培養液は０ −６００／ｍｘのす）ｖＢＰｏを含有していた。

ＯＨＯｐ１３ＶｇＥｕ凡ＰＯおよびＯＨＯｐＤｓＶＬ　−ｇ　ＨｕｌＰｏの培養 液は、プラスミドｐ８ＶｇＨｕｌ！ｊＰｏまたはｐＤ８ｖＬ−ｇＪＩｕＢＰｏで ）　５　：／　スフ　ｚりＶ　ｗ　７された００Ｂ−１細胞から得たものと同様 の免疫学的性質を有する組換えヒト３ＰＯを含有していた。ＲＩＡＫより測定す ると、代表的な０ＥＩＯｐ８ＶｇＨｕＢＰｏの３日間培養液は２．９９０／！Ｄ ｉの１＝）ＩＰＯを含有し、ＣＨｏ　ＰＤ８ＶＬ−ｇＩＬｕｌ！１ｉＰｏ　ｆ） 　５　、５　ａ間試料ハ１８．２［＋／Ｉ！＋１のヒトｌ１ＰＯを有していた。

前記細胞株から得られるｘｐｏ量は、遺伝子を増殖させて産生能の高い新規細胞 株つくることによって増加させることができる。ＤＩＩＩＦＲ遺伝子によりコー ドされた産物たるジヒドロ葉酸レダクターゼ酵素（ＤｌｉＦＲ）は、薬物メント レキセート（ＭＴＸ）で阻害することができる。更に具体的には、ヒボキサンチ ンおよびチミジン欠如培地で増殖した細胞は、ＭＴＸにより阻害されまたは殺さ れる。適切な条件下（例えば最低のＭＴｘ濃度）では、ＭＴＸに耐性でかつＭＴ Ｘ下でも増殖可能な細胞を得ることができる。これらの細胞は、ＤＥＩＦ’Ｒ遺 伝子数が増加し、その結果ＤＢ　ＰＲ酵素量が増加することにより、ＭＴＸ耐性 であることが判明する。残存した細胞を次いで、徐々に濃度を高めてＭＴＸで処 理してもよく、これＫより更に多量のＤＨＰＲ遺伝子を含む細胞株が得られる。

ＤＨＰＲ遺伝子と一緒に発現ベクター上に運搬され、またはＤＨＩＰＲ遺伝子で トランス７オーメーシＢンされた「パツセンジャー遺伝子」は、それらの遺伝子 コピー数の増加がしばしば見出された。

この増幅系の実施例として、細胞株ＯＨＯｐＤＢＹＬ−Ｍｋｌを徐々に増加させ たＭＴＸｉｌ１度（ＯｎＭ、　３ＱｎＭおよび１００１００ｎ供した。各増加段 階から得た代表的な６５時間培地試料をＲＴム分析すると、それぞれ０．６０． ２．４５および０．１９０７ｍｌ含有していた。

細胞株０１０　ｐＤＢＹＬ−ｇＨｕＫＰＯを、３Ｑｔ＋Ｍ、５０ｎＭ、１１００ ｎ、２００！ＩＭ、１／ＡＭ及び５／ＫＭ　にＭＴＸ濃度を増加させて試験に供 した。１００ｎ１００ｎ段階から得た代表的な３日間培地試料は、ＲＩムで調べ ると、３０８９　＊　１２９０／ｍｌのヒトｌｌ１ＰＯを含有していた。ｌ　Ｏ ＯｎＭおよびｌｐＭＭＴＸ段階から得た代表的な４８時間培地試料は、Ｒ１ムで 調べると（平均三回分析）、それぞれ４６６および１３５２σ／ｍｌのヒトＢＰ Ｏを含有していた。これらの操作では、ｌＸ　１０’個の細胞を６０ｍｍ培養皿 中の培地５ｍｌに接種した。２４時間後、培地を除去し、無血清培地（０，１Ｍ の非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された高グルコースＤＭｉＭ）５ ｍｌで置き換えた。

Ｈ，ＰＯを無血清培地で４８時間蓄積させた。培地なＲＩム分析用に集め、細胞 をトリプシン処理し、計数した。１００　ｎＭおよびｌμＭ　ＭＴ！で増殖した 細胞に関する４５７ｏ７’ｍｌおよびｔ　３’５２０／ｍｌ　の平均Ｒ１ム値か ら、それぞれ実際の収量２３３５０／プレートおよび６７５００／プレートがめ られた。−プレート当りの平均細胞数はそれぞれ１．９４Ｘ１０６および３．１ ２Ｘ　１０’であった。これらの培養条件下での有効産生速度は、したがって、 １２６４および２１６７０／１０’細胞／４８時間であった。

直ぐ上に記載した培養細胞は、遺伝的に不均一な群である。標准的スクリーニン グ操作が、最大量生能がおおむね均一なりローンを単離するために用いられてい る。米国食品薬局（０，８，Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇａｄｍｉｎｉｓｔｒａ ｔｉｏｎ）　、薬品および生物学センター（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇｓ 　！Ｌ：１（ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）、生物学研究調査庁（Ｏｆ　ｆ　ｉ　ｃ 　ｅ　ｏ　ｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｖｉｅｗ）、１９８ ４年６月１日、「生物の産生に用いられる株化細胞の特徴において考慮すべき点 （Ｐｏｉｎｔｓ　ｔｏ　０ｏｎｓｉｃＬｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅＣｈａｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　（！ｅ１１　Ｌｉｎｅｓ＋０ａｅｄ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕ ｃｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ）］のセクシヲンム、パート２参照。

前記ＢＰＯ産生ＯＢ、Ｏ細胞系の生産性は、適切な細細胞培養技術により改善す ることができる。哺乳類培養細胞の増殖には、成長培地に血清の存在を要する。

血清を含有しない培地でｃｎｏ細胞からエリスロボエチンを産生ずる方法は、培 地からのエリスロボエチンの精製を著しく容易化するものである。下記方法によ れば、産生に充分な多量の無血清培地において、経済的にエリスロボエチンを産 生させることができる。

標準的細胞培養条件下で増殖させたＣＦＬＯｐＤＢＹＬ−ｇＨｕ３Ｐｏ細胞株を 用い、スピナー細胞培養フラスコに接種する。この細胞を、５チ胎児牛血清、Ｌ −グルタミン、ペニシリンおよびストレプト１イシンが添加された高グルコース ＤＭＩＭおよびＨａｍ’ｓア１２１７）５０−５０混合物、０．０５　ｍＭ非必 須アミノ酸並びに適当な濃度のメントレキセートからなる培地が入ったスピナー 細胞培養フラスコ内で、懸濁細胞系として増殖させる。懸濁細胞培養では、ｍｐ ｏ産生ＣＨＯ細胞を容易に多量に増殖させることができる。懸濁液中で増殖した ＯＨＯ細胞！用い、培地２００　ｍｌが入ったｇ　ｓ　ｏ　ａｍ２　のローラー 瓶に１．５Ｘ１０７個の生育可能細胞の初期接種密度で、ローラー瓶に接種する 。細胞を３日間にわたり、付着細胞系として合流しあうまで増殖させる。この増 殖相に使用される培地は、懸濁増殖に用いられたものと同様である。３日の増殖 期間の最後に、血清含有培地を除去し、１００　ｍｌの無血清培地、即ち０−０ ５ｍＭ非必須アミノ酸およびＬ−グルタミンが添加された高グルコースＤＭＸＭ およびＨａｍ’ｓ　ＩＦ　１２の５０−５０混合物で置き換える。ローラー瓶を ローラー瓶インキュベーターに１〜３時間戻し、培地を再び除去し、新しい無血 清培地１００ｆｌｌで置き換える。無血清培地を１〜３時間時間インキ−ベート と、汚染血清蛋白質濃度が減少する。ローラー瓶を７日間インキエペーターに戻 し、その間にエリスロボエチンが無血清培地中で蓄積する。７日間の産生側の最 後に、調整済培地を除去し、第二の産生サイクルのために新しい無血清培地で置 き換える。この産生糸の実施例では、代表的な７日間無血清培地試料は。

ＲＩＡＫよると、３８９２＊　４０９σ／ｍｌのヒ）ＷＩＪスロボエチンを含有 していた。０．９〜１．８　Ｘ　１０　細胞／ａｍ２　の推定細胞密度に基づけ ば、各８５００ｎ２のローラー瓶は０．７５〜１．５　Ｘ　ｔｏ’個の細胞を含 有しており、したがって７日間の１００ｍ１の培養についての凡ＰＯ意生速度は ７５０〜１４７００／１０’細胞７４８時間であった。

ＩＱｎＭＭＴ！で処理すれた細胞株０１１０　ｐＤＦＪＶＬ−ＭｋｌＰＯの培養 液をＲ１ムイン・ビトロおよびイン・ビポＢＰＯ活性分析に供した。ｗＡ整決済 培地試料、Ｒ１ムで測定すると４ｘ、２＊　１．４０／！Ｉ１１、イン・ビトロ 生物学的活性分析で測定すると４１．２±０　、０６４０／ｍ１およびイン・ビ ポ生物学的活性分析で測定すると４２．５±５０／ｍｌ、のＭｋｌＣＰＯを含有 しテイタ。

ポリペプチド生成物のアミノ酸の配列を調べるとＨＰＯ生成物の存在が示されて おり、基本的な種では推定アミノ末漏アラニンに隣接する残基の「リーダー」配 列を有していた。これは、ａｇｏ細胞内でのポリペプチドの膜処理が不正確であ ることの結果なのか、あるいはヒトＢＰＯと比較したサルＲＰＯアミノ末端構造 の違いを反映しているのかはまだわかっていない。

細胞株Ｃ１ＨＯｐＤＢＶＬ−ｇＨｕｌｃＰｏの培養液を３つの分析に供した。５ ．５日間の試料は、培地中に組換えヒ）ＲＰＯを、ＲＩム分析で１８．２０／ｍ １、イｙ−ビトロ分析で１５．８±４，１５０７ｍ１およびイン・ビボ分析で１ ６．８　±３．Ｏｏ／ｍｌ含有していた。

徐＃に１００ｎＭＩ７１００ｎまで増加−！セテ得りＣａＯｐＤＢＶＬ−ｇＨｕ ｌＰｏ細胞の培養液を３つの分析に供した。３日間の試料は、組換えヒトＢＰＯ ｆｔＲＩＡで３０８９±１２９０／＋！＋１．イン・ビトロ分析で２５８９ｆ　 ７１．５　ＣＩ／ｎｉ１およびイｙ−ビボ分析で２０４０±１６００７ｍ１含有 していた。この生成物のアミノ酸配列は表■に示したアミノ末端と一致している 。

１０ｎＭＩ７）ＭＴＸ中、プラスミドｐＤ８ＶＬ−Ｍｋｌでトランスフエフシラ ンされた０１０細胞調整培地をプールし、数日間にわたりＭＴＸを透析すると、 ２２ｘ＊ｓ、１０７ｍ１　（ＩＰＯ−００Ｍ）のＩＰＯ活性がある培地が得られ た。正常Ｂａｘｂ／Ｃマウスのヘマトクリ、ト値に及ぼすＲＰＯ−ＯＣＭのイン ・ビポ効果を調べるため、以下の実験を行なった。トランスフエフシランしてな いＯＨＯ細胞の細胞調整培地（ＯＣＭ）およびＫＰＯ−ＣＯＭをＦＢ８で調製し た。ＯＯＭをフントロール群（マウス３匹）に用い、２つの用量のＩＬＰＯ−Ｏ ＣＭ（４単位（０）の注射および４４単位（σ）の注射）を実験群（１群２匹） に用いた。５週間の間、７匹のマウスを週３回腹腔内注射した。８回目の注射後 における、コントロール群の平均へマドクリット値は５０．４憾、４０群は５５ ．１％、および４４０群は６７．９チであった。

哺乳類細胞の発現生成物は、エタノール勾配をかけ、好ましくはＬＨ７でＨＰＬ Ｏ（０４）に付すことＫより、培地から実質的にｆｆ′＃された形で容易に回収 することができる。

予備実験を行ない、００Ｂ−１およびＣＨＯ細胞におけるヒ）ＩＰＯ遺伝子発現 調整培地から得られる組換え糖蛋白質生成物を、ウェスタン・プロット分析およ び５ＤＩ３−ＰＡＧＥによってヒト尿ＩＰＯ単離物と比較して、その特徴を調べ た。これらの研究では、ＣＨＯ由来ＢＰＯ物質はＣ０Ｂ−１発現生成物よりもや や高分子量であったが、この生成物はプールされたヒト尿抽出物よりもわずかに 大きいことが判明した。全ての生成物はやや不均一であった。シアル酸を除去す るためのノイラミニダーゼ酸素処理により、はぼ同じ分子量であるにもかかわら ず、いずれも得られたアシアロヒト尿抽出物よりも大であるｃｏｓ−１およびＣ ａＯ組換え生成物が得られた０組換えＯＨＯ生成物および尿抽出生成物を（両者 から炭水化物を全て除去するため）エンドグリコシダーゼ１酵素（ＩＬＯ３，２ ，１）処理して、本質的に同一の分子量を有する実質的均一生成物を得た。

精製されたヒト尿ＫＰＯおよび本発ＢＡＫよる組換え型のＯＨＯ細胞産生ＭＰＯ を、ネッサーら＝「アナリチカル・バイオケミストリー」、第１４２巻、第５８ −６７頁、１９８４年（Ｎｅａａｅｒ、ａｔ　ａｌ、。

ムｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１４２．５８−６７　（１９８４））の加水分解 方法を用いて修正したレディーンら二「メソッズ・イン・エンザイそロジーＪ、 第８３巻（Ｄｉｄ）、１１３９−１９１頁、１９８２年（Ｌｅｄｅｅｎ。

ｏｔａｌ、、Ｍｅｔｈｏａｓ　１ｎ　ｉｎｇｙｍｏｌｏｇｙ、＄３（Ｐａｒｔ　 Ｄ）、１３９−１９１　（１９８２））の方法により炭水化物分析に供した。尿 単離物について実験的にめた炭水化物組成値（生成物中の炭水化物上ル比で示さ れる）は次のとおりであった：ヘキソース１．７３゜Ｎ−アセチルグルコサミン ｌ、Ｎ−アセチルニエーラミン酸０．９３．フコース０、およびＮ−アセチルガ ラクトサミン０６組換え生成物（１００ｎＭのＭＴＸを含むＯＨＯｐＤＢＶＬ− ｇＨｕｌＰｏの３日間培地から得たもの）の値は次のとおりであった：ヘキソー ス１５゜０９、Ｎ−アセチルグルコサミンｌ、Ｎ−アセチルニエーラミン酸Ｑ、 ９９８．７コース０、およびＮ−アセチルガラクトサミン０゜これらの値は、上 記ウェスタンおよび５ｎｓ−ｐＡｏＩＬ分析ともに一致している。

本発明で得られる糖蛋白質生成物は、このように。

天然エリスロポエチンの一以上の生物学的性質を保有するのに充分なその複稟で ある一次構造形状を有し。

しかも天然エリスポエチンのものとは異なる平均的炭水化物組成を有する生成物 として理解される。

例　１１ 本例は、表ＶＩＫ示したヒト種ｍｐｏ配列をコードし、大腸菌および酵母菌〔サ ツカロマイセス・セレビシェ（８，ｃｏｒｅｖｉｓｉａｅ）”ｌ細胞での発現に おけるそれぞれの「優先」コードンで取込んでいる２つの構造遺伝子ヌクレオチ ド塩基集合体の全体的製造に関する。

また、ヒ）］１ｉＰＯ類縁体をコードする遺伝子の構造についても述べられてい る。簡単に言さと、用いられたプロトコールは、先に示したアルドンらの開示（ Ｗ０８３１０４０５３）Ｋ掲載されているものとほぼ同じであった。遺伝子はま ず成分オリゴヌクレオチドを組立ててマルチプル・ジス−プレックスとし、これ を次いで３つの別個のセクタ曹ンに組立てるように設計した。

これらのセフシランは容易に増幅するように設計してあり、増幅系から除くと、 連続的に、即ち適切な発現ベクターにおける多数の７ラグメント結合により組立 てることができた。

下記表■〜店は、いかなるリーダーまたは前記列も欠如しているが、−１位ＫＭ −のメチオニン塩基を有するヒ）ＦｉＰＯ翻訳生成物をコードする合成遺伝子の 設計と組立体を示している。更に遺伝子は実質的部分に大腸菌の優先コードンを 取込んでおり、このためその構築は「Ｂ　ＯＫ　Ｐ　ＯＪ遺伝子と呼ばれる。

辰　ＨＩ：：： Ｌ　ＡＡＴＴＣＴＡＱＡＡＡＣＣＡＴＧＡＣＳこＴＡ２ＴＡＡＡＡＴＡ２、　Ｃ ＣＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＣＡＴＧｊ；ＴＴＴＣＴＡＧ３、　ＡＴＧ ＧＣＴＣＣＣ；ＣＣＧＣＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＧＡＣ’Ｌ　−ＣＴＣＧＡＧＴ ＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧ５、　ＴＣＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧ ＧＡＡＣＧＴＴＡＣＣＴＧＣＴＧ６、　ＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＡＡＣＧＴＴ ＣＣＡＧＡＡＣＴ７、　ＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣ８ 、ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧ９、　ＡＣＣＡＣＴ（ １；ＧＴＴＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣｌｏ、　ＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴ ＧＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡｌｌ、　ＴＴｒＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣ ＧＣＴＡＣＣＧ１２、　ＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＴＡＡＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴ 表ＩＸ 匹叩１立し旦乙ユ １、　ＡＡＴＴＣＧま−ＡＣＣＡＧＡＣＡＣ口、へＡＧＧＴ２、　ＧＴＴＡＡＣ ＣＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＴＡにＧ３、　ＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡ ＡＡＣＧＴＡＴＡ、　ＴＴＣＣＡＴＡＣＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧ丁ＡＧＡＡ）− ＧＧＡＡＧＴＴＧこＴＣＡ　Ａ　ＣＡ　Ａ　Ｇ　ＣＡ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ 　Ｇ　Ｔ６、　にＡＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣ７、Ｔ ＴＧここＡＧこＧＴＣＴＧＧＣｔ倶Ｃ丁ＧＣＴＧ八ＧＣＧ８、　へ　ＧここＴＣ ＧＣＴＣ’ＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧ９、　ＡＧＧＣＴＧ丁、へＣ丁 ＧＣＧＴＧＧＣＩ−ＩＡＧＧこＡ１０　、　ＧＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＣＧ ＣＡＧＴＡＣＡＬ上、　ＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧこＣＧＴ １２、　ＴＴＣＣＣＡＣＧＧＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧ丁ＴＴＡＣＣＡＤ、　ＧＧＧ ＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＡＣ１４、ＧＣＴＴＴＧＴＣＡＡ ＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＬ５　、　ＡＡＡＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣ ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＬ６．　ＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＣＡＧＡ７Ａ ＣＴ衣　Ｘ工１ １．　ＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＴＣＴＧＣ２、ＡＣＧＣＡＧＣ ＡＧＡＧＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧ３、　ＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧ ＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧ４、　ＧＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＣ ＣＡＧＡＧこ５、　ＣＴＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴ６ 、　ＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＡ７、　ＧＣＴＧＣＡ ＣＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧ８、　ＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＧＣ ＴＡＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧ９、　ＣＴＧＡＴＡＣＣ丁ＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＧＴ ＴＴＣＧ１０、　ＡＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＧＣＧＧＡＡＧＧＴｌｌ、 　ＴＣＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＡ１２、　ＣＡＧＴＴ ＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧ丁ＴＡＧＡＧＴ１３、　ＡＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧ ＴＡＴＡＣＴＧＧＣＧＡＡＧＣ１４、ＧＧＣＡＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＡＴＡ ＣＡＧＴＴＴ１５、　ＡＴＧＣＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＴＡＡＴＡＧ１ ６、　丁ＣＧＡＣＴＡ丁ＴＡＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣス　ＸＥＥＵ Ｅ〇三ＰＯセクション　３ 表ｘｒｖ ＡＡＣＣＧＣＴＧＣＡ　ＧＣＴＧＣＡ丁ＧＴＴ　ＧＡＣＡＡＡＧＣＡＧ　ＴＡＴ ＣＴＧＧＣＣＴ　ＧＡＧＡＴＣＴＣ’ＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＧＴ　ＣＧＡＣＧＴ ＡＣＡＡ　ＣＴＧＴＴＴＣＧＴＣＡＴＡＧＡＣＣＣ；ＧＡ　Ｃ：ＴＣＴＡＧＡＧ ＡＣＡＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴ　ＣＧＧＴＧＣＡＣＡＧ　ＡＡ ＡＧＡＧＧＣＴＡ　ＴＣＴＣ丁ＣＣＧＣＣ丁ＧＡＴＧＡＧＡＣＧ　ＡＣＧＣＡＣ ＧＡＣＡ　ＣＣＣＡＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＴＣＣＧＡＴ　ＡＧＡＧＡＧＧＣＧＧ ＧＣＡＡＡＣＴＧＴＴ　ＴＣＧＴＧＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴ ＧＧＴＡＡ　ＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＡＣＡＡ　ＡＧＣＡＣＡＴＡＴ Ｇ　ＡＧＡＴＴＧＡＡＧＧ　ＡＣＧＣＡＣＣＡＴＴ　ＴＧＡＣＴＴ丁ＧＡＣ更に 具体的には１表■は、ヒト穫ポリペプチドのアミノ末端残基をコードするセクシ 璽ン１のｌ０ＩＰＯの遺伝子を得るために用いられるオリゴヌクレオチドを示し ている。オリゴヌクレオチドは二重鎖（ｌと２％３と４等）として組立てられ、 二重鎖は次いで結合され１表■のよ５なｍｃｘｐｏセクシ１ン１が得られた。

組立てセクシｌンは末端ＩＣｃｏ　ＲＩおよびＢａｍＨＩ　粘着端をそれぞれ含 み、ＢａａＲ１粘着端の「下流」にはｘｂａＩ制限酵素Ｖ識部位が存在し、Ｂａ ｚａｒ　粘着端の「上流」にはＫｐｍｌ認職部位が存在していることに注目され たい、セクシｌン１は、このセクシ萱ンの配列の確認のために用いられるＭ１３ ７アージベクターを用いて、容易に増幅させることができた。い（つかの困難な 点が、大腸菌由来ＲＦ　ＤＩムからＸｂ＆Ｉ／ＫｐｎＩ７ラグメントとしてセク シ曹ンを単離する上で表われたが、それはおそらく宿主内でのＫｐｎＩ認識部位 塩基がメチル化されるためであろう、−重鎖ファージＤＩムがしたがって単離さ れ、プライマー・エクステンシラン法によりイン・ビトロで二重鎖型とされ、し かる後所望の二重鎖フラグメントが容易に単離された０ ＢＯＢＰＯ遺伝子セクシ１ン２および３（表■およびＸｍ）を、表ＸおよびＸＨ のオリゴヌクレオチドからそれぞれ同様の方法で調製した。各セクションは配列 の確認に用いられるＭ１３ベクターで増幅され、ファージＤＩムから単離された 。表■から明らかなようＫ。

ｘａｘｐｏセクシ菖ン２はＨａｏＲＩおよびＢａｍ　Ｈｌ粘着端から構成されて おり、ＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして単離することができた。同様に 、ＢＣＥＰＯセクシ璽ン３をＢａｍＨＩおよび８ａｌ　Ｉ付着端から調製し、Ｂ ｇｌＩＩ／８１ＬＩＩ　７ラグメントとしテファージＲＦＤＮＡから単離するこ とができた。このように調製された３つのセフシランは、大腸菌翻訳開始のアミ ノ末端メチオニンコドン（ＡＴＧ）を含み、完全なヒト種ｘｐｏポリペプチドを コードするＤＩム連鎖（表て０として容易に組立てすることができる。開始ＡＴ Ｇの「上流」には、大腸菌の高度な発現ＯＭＰ−ｆ遺伝子におけるリポソーム結 合部位配列を実質的に二重化する一連の塩基対が存在していることにも注目され たい。

適切な発現ベクターを用いてｘｃｕｐｏを運搬することができる。特定のベクタ ーとして、チャールズ・エフ・モーリｘ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｆ、Ｍｏｒｒｉｓ） により１９８４年８月６日に出願され、同時に係属中の米国特許出願第６３６． ７２７号に記載された、プラスミドｐｃｐＭ４１４　（Ａ、Ｔ、Ｃ，０，４００ ７６）の誘導体である「温度感受性」プラスミドｐｏ］ＰＭ５３６をＢＯＢＰＯ 遺伝子発現用に選択した。より具体的にはｐＯＦＭ５３６をＸｂａ　！およびＭ ｉｎａｍ　で消化し、大フラグメントを単離して、ＫＯ３ＰＯ遺伝子と２つの部 分で結合さセルノニ用イタ。セフＶ　目７１　（ＸｂａＩ／ＫＰｎＩ　）、２（ Ｋ　ｐ　ｎ　Ｉ　／　Ｂ　ｇ　ｌ　ＩＦ　）および３　（ＢｇユＩＩ／８ａｌＩ ）をＭ２Ｓ内で正確な順序で予め組立てておき、ｘｐｏ遺伝子をそれから一本の ＸＢａ、■／Ｈ１ｎｃ１ｍ　７ラグメントとして単離した。このフラグメントは 、Ｍ１３ｍｐ９ファージ由来の５ａｌＩからｇｉｎ＋１ｍまでの部位のポリリン カーの部分を有していた。得られた発現プラスミドｐ５３６による発現の制御は ラムダＰＬプ田モーターによりなされたが、このプロモーター自体、Ｃ工８５７ リプレツサー遺伝子（例えば、大勝菌株１１２△Ｈｔｒｐから得られる）の支配 下にある。

上記合成ｘｃｙｃｐｏ遺伝子は、下記のような〔ムａｎ２、ｄｅｓ−Ｐｒ０２〜 １ｌｅ６　：］　ｈ　ＲＰ　Ｏおよび（Ｉｌｉｓ’）ｈｘｐｏのようなエリスロ ボエチン類縁体をコードするように様々に変更してもよい。

Ｘｂａｌ−！ｌ１ｎｄｌｌ挿入体として、ＧｍのＢＯＲＰＯ合成遺伝子を担持す るプラスミド５３６をＨ１ｎ６ｍおよびｘｈｏＩで消化した。後者のエンドヌク レアーゼは、ム８ｐ８をコードするコードンの最後の塩基からＡｒ　ｇ　１０コ ードンの二番目の塩基までの唯一の６塩基対認識部位においてｍｃｘｐｏ遺伝子 を切断する。Ｘｂａ　ｒ／ＸｈｏＺ　ｒリンカ−」配列を製造したが、それは次 の配列を有していた。

一リｔ、ｒ　＋１　２　７　８　．９ Ｍｅｔ　ムｌａ　ｊｋａｎ　ａｙｅ　ムｅｐ　Ｘｂａｉ５’−ＣＴＡＧ　ＡＴＧ 　ＧＯＴ　ＡＡＴ　ＴＧＣＧＡＯ−３’３’−ＴＡＯＯＧＡ　ＴＴＡ　Ａ（！Ｇ 　ＣＴＧ　ＡＧＣＴ−５’ＸｂａＩ／ＸｈＯＩ　ＩＪ　７ｔ）−およびＸｈＯＩ ／Ｈ１ｎｔ１ｍ　Ｈｃｎｐｏ遺伝子鎖フラグメントな、チャールズ・エフ・モー リス（Ｃｈａｒｌｅｓ　！Ｆ０Ｍｏｒｒｉｓ）　により１９８４年８月６日に出 願され、同時に係属中の米国特許出願第６３６．７２７号明細書に記載された、 プラスミドｐＯＦＭ４１４　の誘導体（Ａ、Ｔ、０，０．４００７６）であるプ ラスぐドｐｃＩＦＭ５２６のＸｂａｉおよびｌ１ｉｎｃ：ｍ切断により得られる 大７ラグメントに挿入し、所望の類縁体のＮｅｔ−”型の大腸菌発現をコードす るプラスミド担持ＤＩム配列を得た。

Ｂ、（Ｈｌｓ　）ｈｌＰＯ プラスミド５３６を、前記ＡのようにＨｌｎａｍおよびＸｈＯｌで切断した。Ｘ 　ｂ　ａ　Ｉ　／　Ｘ　ｂ　ＯＩリンカ−を製造したが、それは次の配列を有し ていた。

ｌヒＩ　＋１２３４５６７８９Ｘ駁Ｌ Ｍｅｔムｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏムｒｇ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｈ１ｓム８ｐ５’−０ ＴＡＧ　ＡＴＧ　ＧＯＴ　ＣＯＧ　０ＣｉＡ　ＣＧＴ　Ｃ！ＴＧ　ＡＴＣＯＡＴ 　ＧＡＯ−３’３’−、、ＴＡＯＯＧＡ　ＧＧＯＧＧＴ　ＧＯＡ　ＧＡＣＴＪＩ Ｇ　ＧＴＡ　ＯＴＧ　ＡＧＯＴ−５’リンカ−およびｘｈｏＩ７ｎ１ｎａｍ　Ｋ ＯＩＰＯ配列７ラグメントを次いでｐｏＩＦＭ５２６に挿入し、所望の類縁体の Ｍｅｔ−１型の大腸菌発現をコードするゲラスミ担持ＤＩム配列を得た。

酵母菌の優先コードンを取込んだ合成遺伝子（「８０ＲＰＯＪ）の構造は、以下 の表■〜ＸＸＩＫ示したとおりである。ｎａｘｐｏ遺伝子の場合と同様に、完全 な構築には３組のオリゴヌクレオチド（表ＸＶ％諜およびｍ）形成が含まれてお り、これをジュープレックスく形成し、各セフシラン（Ｇｍ、店およびＸＸ　） 　Ｋ組立てた。合成は、５ｃＢｐｏおよびＨ；０ＢＰＯの構造においていくらか 適合性のある（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）コードン（即ち、各遺伝子におけるセ クタ１ン２のオリゴヌクレオチド１−６と同様に、各遺伝子のセフシラン１のオ リゴヌクレオチド７−１２が一致する）を用いるととＫより、部分的に容易化さ れたことに注目されたい。

表、Ｘ■ ＝Ｃ＝０セクション　１　オリゴヌクレオ　ｒＬ、　ＡＡＴＴＣＡＡＧＣ丁ＴＧ ＧＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＴ２、　ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＴＴＴ丁ＡＴＣＣＡＡＧＣ ＴＴＧ３　、　ＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣ丁ＧＴＧＡＣＴＣ４、ＴＣＴＣ ＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＧ５、　ＧＡＧＡにＴＴＴＴＧＧＡＡＡ にＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧ６、　ＣＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣ；ＴＡＴＣ丁ＴＴＣＣＡ ＡＡＡＣ７、ＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣ８、ＧＴＧＧ ＴＧＡ丁ＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣ丁ＴＴＡＧ９、　ＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＴ Ｃ；ＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣｌｏ、　ＣＡＡＡ（−ＡＡＣＡＧＴＧＴｒＣＡ ＧＣＡＣＡＡＣＣＡｌｌ、　ＴＴＴＧ八ＡＣへＡＡＡＡＣＡＴ丁ＡＣＧＧＴＡＣ ＣＧ１２、　ＣＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＴＡＡ丁ＧＴＴＴＴＣＧＴＴ表　ＸＶＩ ｓｃ＝ｐｏセ　ジョン　１ 衣　ＸＶＩＩ Ｌ、　ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴ２、　ＧＴＴＡＡＣＣ ＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧ丁ＡＣＣＧ３、　ＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡ ＡＡＣＣＴＡＴ４、　ＴＴＣＣＡＴＡＣＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡ５、 　ＧＧＡＡＧＴＴＧＧ丁ＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴ６、　ＣＣＡ、Ａ ＡＣＴＴＣＡＡ、ＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＡＡＣ７、ＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴ ＴＴＧＧＣＣＴＴＧＴＴＡＴＣＴＧ８、　ＧＣＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＡＡＧＣ； ＣＣＡＡＡＣＣＴＴＧ９、　ＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＣＡＡＧＣＣ Ｔｌｏ、　ＡＡＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣＡｌｌ、　ＴＧＴ ＴＧＧＴＴＡＡＣＴＣ丁ＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＧ１２、　ＴＧＧＴＴＣＣＣ ＡＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＴＴＡＡＣＣ１３、ＡＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＴＴ ＧＣＡＣＧＴＣＧＡＴ１４、　ＣＴＴＴＡＴＣＧＡＣＧＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＡ １５、　ＡＡＡＧＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴＧ１６、　ＧＡＴ ＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＧＧ不ｚ　ＸＸ ＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴ　ＣＡＧＣＴ ズ　＾＾− ＣＴＡＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡ　ＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧ ＡＡＡＣＡ　ＡＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＣＧ丁ＧＣＴＣＡＡ　ＡＡＧＧＡＡＧＣＣ Ａ　ＴＴＴＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＧＣＴにＣＴ　ＴＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣ ＡＣＧＡＧＴＴ　ＴＴＣＣＴＴＣＧＧＴ　ＡＡＡＧＧＧＧＴＧＧ　ＴＣＴＧＣＧ ＡＣＧＡ　ＡＧＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴ　 ＧＡＴＡＣＣ丁ＴＣＡ　ＧＡＡＡＧＴＴＡ丁Ｔ　ＣＡＧＡＧＴＴＴＡＣＧＴＡＡ ＣＴＣＴＴＣ；　ＧＴＡＧＴＧＡＣＧＡ　ＣＴＡＴＧＧＡＡＧ丁　ＣＴＴＴＣＡ ＡＴＡＡ　ＧＴＣＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣ丁　ＴＧＡＧＡＧＧＴＡＡ 　ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＣ；　ＴＡＣＡＣＣＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＡＧＧ ＴＴＧＡＡＧＡ　ＡＣＴＣＴＣＣＡＴＴ　ＴＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＴにＧＣ ＣＡＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＡＣＣＣＣＧＡＣ ＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＧＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧ　ＴＣＴＡＴＴＣＧ ＧＧ　ＣＴＧＡＣＴＡＴＴＧ　ＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣ組立てられた８Ｃ３ＰＯセ クシヲンがＭ２Ｓにて配列され、セクタ、ン１．２および３はＨ１ｎｄｆｆｌ／ ＫｐｎＩ、にｐｎＩ／ＢｇｌＩＩおよびＢｇｌｌＩ／８ａｌＩフラグメントして ７アージから単離可能であった。

８ＣＩＰＯ遺伝子生成物にとり現在好ましい発現系は、グランド・ニー・ビッタ −により１９８３年４月２２日に出願され、同時に欧州特許出願第０１２３，２ ９４号として１９８４年ｌＯ月３１日に公開された、係属中の米国特許出願第４ ８７，７５３号明細書に記載されているよウナサッカロマイセス・セレビシェの α−因子分泌に基づく分泌系である。簡単に言えば、この系は、酵母α−因子遺 伝子生底物のリーダー配列をコードするＤＮＡが、発現すべき外来性遺伝子の暗 号領域の５９１１に直接位置している構造からなる。その結果、翻訳された遺伝 子生成物は、余剰生成物の分泌時に、内在酵母酵素によって「切り離される」リ ーダーまたはシグナル配列を含んでいる。この構築ではα−因子翻訳開始（ＡＴ Ｇ）コードンを利用しているため、５ＣＢＰＯ遺伝子の一１位にそのようなコー ドンを付与する必要がなかった。表ＸＸＩから明らか（なるであろうように、ア ラニン（＋ｌ）暗号配列は、α−因因子プロモーユニ続（α−因子リーダーの最 初の８０残基のＤＮＡを含むプラスミドに直接挿入されるりンカー配列の後にき ている。ｓｃｍｐｏ遺伝子発現のための特定の好ましい構築においては、前記８ ＣＥＰＯセクシ箇ンフラグメントおよびプラスミドｐｃｌｃ３のｌ１ｉｎｄｌｎ ／Ｂａ１ｌ　消化による大フラグメントからなる４部分の結合が行なわれる。得 られるプラスミドｐ　（Ｉ　Ｃ３／　８ＣＩＰＯから、α−因子プロモーター、 リーダー配列および８０ＩｉＰＯ遺伝子をＢａｍａＨＩ消化により単離しＢａ！ ｌ　ＨＩ消化プラスミドｐＹｌと連結させて、発現プラスミドｐＹＢ／ＢＱＨＰ Ｏを形成した。

例　１２ 本例は、例１１の発現系における、合成りＣＩＩＰＯおよび８ＣＢＰＯ遺伝子の 組換え生成物の発現に関する。

大腸菌宿主細胞に用いられる発現系において、例１１のプラスミドｐ５３６を、 ０１１３Ｓ’ｌ遺伝子を有する適切なプラスミドｐＭＷｌで予めトランスフォー メーシ冒ンされたＡＭ７大腸菌細胞に移入させたａＬＢプロス（アンピシリン５ ０μｇ　／　＊　ｌおよびカナマイシン５μｇ／重１、好ましくは１０ｍＭ　Ｍ ｇ８０４も添加）中の培養細胞を２８℃に維持し、Ｏ，Ｄ、６０ｇ＝０．１とな るまで培養細胞が増殖してから、培養温度を４２℃に上げてｇｐｏ発現を誘導し た。約４００．Ｄ、まで増殖した細胞は、約５ｍｇ１０Ｄ、リットルの１！ＰＯ 生成物（ゲルで評価）を産生した０ 細胞を採取し、分離し、フレンチプレス（１００ｏ。

ｐｓｉ、７００ｋｇ／ｃｍ２）で破壊し、リゾチームおよびＮＰ−４０洗浄剤で 処理した。２４０００ｘｇ遠心分離で得たベレットを塩酸グアニジンで溶解し、 Ｃ４（バイダック、Ｖｙｄａｃ）、リバース・フェース（Ｒｅｖ・ｒｇ＠　Ｐｈ ａｓｅ）ＨＰＬＣ（ＲｔｏＨＯ〜８０％、５０ｍＭＮＨ４人ｅ、ｐＨ４，５）に より一工程で更に精製した。

分離した蛋白質は９５％以上純粋な生成物であり、得られた生成物は、約３：ｌ の量比で、二つの異なるアミノ末端人−Ｐ−Ｐ−Ｒ・−・・−・およびＰ−Ｐ− Ｒ・−・・−・　を有していた。これらは後者のｈＦＰｏおよび〔ｄｅｓＡｌａ １〕ｈｘｐｏ生底物が観察されたことは、宿主ｍ胞におけるアミノ末ｇｓ「プロ セッシング」が、末端メチオニンおよびある場合には開始アラニンを除去するよ うく作用することを示している。単離−〇ラジオイムノアッセイ活性は１５００ ００〜１６（）ＯＬＩＯＵ／ｍｇ　であり、イン・ビトロ分析活性では３０００ ０〜６２０００Ｕ／ｉａｇであり、更にイン・ビボ分析活性では約１２０〜７２ ０Ｕ／ｍｇであった（参考のために、各分析におけるヒト尿単離物標単は７００ ００υ／鳳ｇである）。イン・ビボ分析における組換え生Ｈ，＠の用量応答曲想 は、ヒト尿ｘｐｏ樟準のものとは著しく異なっていた。

例１１のＡおよびＢで形成されたｍｐｏ燻似グラスミドを、ｐＭＷｌでトランス フォーメーク曹ンされたＡＭ７大腸菌細胞にそれぞれ移入させ、細胞を上記のよ うに培養した。鞘層単離物をＲＩ人およびイン・ビトロ分析で試験した。〔入ａ ｎ２、ｄ＠ｓ−Ｐｒｏ２−ｗ工１ｅ６）ｂｘｐｏ発現生成物の１’ｔＩ人および イン・ビ）０分析値はそれぞれ約１１０００Ｕ／ｍｇおよび６０００１１／ｘｇ 蛋白質であったが、［ｍｔｓ’ｌ　ｈ　Ｋ　Ｐ　Ｏの分析値はそれぞれ約４１０ ００１７／ｍｇおよび１４０００σ／ａｇ蛋白質であって、頌似生成物が分析に よろと「親」発現生先物のｌ／４〜”／１０　ｒ活性」であることが示された。

サツカロマイセス・セレビシェ宿主績ｉＫ用いられる発現系において、プラスミ ドｐＹＥ／ＢＣＥＰ’Ｏを二つの異なる株、即ちＹ８ＤＰ４（遺伝子型αｐｅｐ ＋−３１ｒｐｌ）およびｌｌ１ｓ１（遺伝子ｆｌｉａｃＬｐｅｐ４−３　ｚｒｐ ｌ）に移入させた。トランスフォーメーシ冒ンされたＹ８ＤＰ４宿主を、カザミ ノぼがＯ，ＳＳ　添加されたｐＨ６，５の８Ｄ培地［二為−ゴーク州、コールド スプリングハ、バエ、コ、ルド、スフリンク、ハーバ−・ラボラトリ−１［酵母 遺伝学の方法（Ｍ・ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｙ＠ａｓｔ　Ｃ）＠ｍｅｔｉｃｓ　）、第 ６２頁、１９８３年］で増殖させた。細胞が３６０．Ｄ、まで増殖したときに採 取した培地は、ｍｐｏ生成物を約２４４υ／ｍｘ（ｕＫＡで９７μｇ１０Ｄ・リ ットル）含有していた。６．５０、Ｄ、または６００．Ｔ）、　まで増殖した形 質転換ＲＫ８１細胞は、約８０〜９０１７／冨１のｍｐｏｇ度（ｘｚムで３４μ ｇ１０Ｄ・リットル）の培地を与えた。予備分析では、発現系により得られる生 成物は極めて不均一であったが、それはおそう（発現される蛋白質のグリコジル 化が様々であり、関連する炭水化物の中でマンノース含量が比峻的高かったため であろう。

！！ＢＩＯ１大腸Ｗ！！細胞に含まれるプラスミドＰαＣ３およびｐａｌを、１ ９８４年９月２７日の米国特許庁施行規則に従い、それぞれ寄託番号Ａ、’！’ 、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ。

３９８８１およびＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、３９８８２として、メリーランド州、 ロックビル、パーク四−ン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ？カルチ ャー・コレクシｌン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃ５ｘｌｔｕｒ・Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　）Ｋ寄託した。ＡＭ７細胞中のプラスミｔ’ＰｃＩＰＭ５２６、 ｚＭ１０３ａ胞中ノｐ　Ｃ７Ｍ５３６およびＪ　Ｍ　ｌ　０３ｍｍｍｍノルＹ　 ｉ　を同様ｖ−１それぞれＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、３３９３２．Ｎｏ。３３９３ ４およびＮｏ、３３９３３として、１９８４年１１月２１日に寄託した。サツカ ロマイセス・セレビクエ株τＢＦＤ４およびＲＫ８１をそれぞれ人、τ、Ｃ，Ｃ ０Ｎ０．２０７３４およびＮｏ、２０７３３として１９８４年１１月２１日に寄 託した。

多数の極めて貴重な生成物および操作法が様々な面で本発明により提供されるこ とは、前記実施例を考慮すれば容易に明らかとなるであろう。

本発明により提供されるポリペプチドは、それらが微生物で発現された生成物で あろうと、あるいは合成生ｌｆｔｍであろうと、本発明で初めて公けになった一 次、二次または三次構造形状を有する極めて有用な物質である。

前述のように、本発明の組換え体由来および合成生成物は、天然源からのＩＩＰ Ｏ単履物のイン・ビトロ生物学的活性を様々な程度で保有しており、したがって エリスロポエチン培養細胞の増殖に用いられる培地において、ＢＰＯ単離物に対 する代替物としての利用性を有するものと考えられる。同様に、本発明のポリペ プチド生成物が天然ｇｐｏ単離物のイン・ビボ活性を有する＠曲内において、そ れらはヒトをはじめとする哺乳動物におけるエリスロポエチン治療処置に用いる のに極めて好適であり、イン・ピボでのＥＰＯに起因する効果、例えば、網状赤 血球応答の刺激、鉄動態効果の促進（例えばプラズマ鉄回転効果および骨髄通過 時間効果）、赤血球質量変化、ヘモグロビンＣ合成促進（前記ニッシュバッハら 参照）および例１Ｏに示した哺乳動物におけるへマドクリット値の増加などのあ らゆる効果を促進させる。本発明の生成物で治療可能なヒトの分類の中には、一 般に輸血を要する患者、外傷者などの外科患者、透析患者などの、腎疾患々者お よび血友病、鎌型赤血球病、生理学的貧血などのような疾患に影響を及ぼす各検 車液組成を有する患者が含まれる。ＲＰＯ治療において、輸注治療に必要な最小 量で、感染物質による感染が抑制されることを期待することができる。本発明の 生成物は、組換え法により生産されたものであるため、発熱物質、天然阻害物質 が混入しておらず、このため天然白米生成物と比べ、高い総合的な治療効果を発 揮すると予想される。本発明の生底物によるエリスロボエチン治療は、低酸素環 境条件下にある個体において酸素供給能を高め、更には可能性として心臓脈管系 効果にも有効であると期待される。

本発明のポリペプチド生放物を投与するための好ましい方法は、非経口投与（例 えば、静注、筋注、皮下性または腹腔内性）であり、投与される組成物には、治 療有効量の生底物が、許容される希釈剤、担体および（または）アジ１バントと ともに通常含有されている、予備的な薬物動力学的研究では、サルＨＰＯ生成物 に関し、静注よりも筋注投与の場合に、イン・ビボでより長い半減期を示す。有 効量は治療条件忙よって実質上変動すると思われるが、治療量は実際には活性物 質ノｏ　、　１　（〜７ｔｒ）　〜１００　（〜ｒｏｏｏｒ：ｒ）　ｐｇ／ｋｇ 体重の範口内であると予想される。ヒト血漿アルブミンのような標単的希釈剤が 、塩水のような標準的担体な用いる場合に、本発明の医薬組成物として考えられ る。

本発明の組成物に使用するのに好適なアジ、バント物質には、テストステロン、 前駆細胸刺激剤、インク為すン様底長因子、プロスタグランジン類、セクト二ン 、サイクリック人ＭＰ、プロラクチンおよびトリョードチロニン、蛋びにメテル ン、スタノゾロールおよびナンド四ロンのように、再生不良性貧血の治療に一般 に用いられる薬物のよ５に、それぞれのエリスロボエテン刺激効果について注目 される化合物が挙げられる〔例えば、レセゴッチら＝「バンミナーバ・メチイカ 」、第２３巻、第２４３−２４８頁、１９８１年〔Ｒｅｓｅｇｏｔｔｉ、ａｔ　 ａｌ、、ＰａｎｍｉｎＰａｎｍｌｎｅｒｖａ、２３．２４３−２４８　（１９８ １）］、マツクゴニグルら：「キドニー・Ｉｎｔ、Ｊ　、第２５巻、第２号、第 ４３７−４４４頁、１９８４年（ｍＱｏｏｎｌｇｘｃｔ。

ａｔ　ａｌ、、Ｋｉｃｌｎｓｙ　工！ｌｉｔ、、２５（２）、４３７−４４４（ １９８４））、パブロビックーカンテラも：「エクスペリメンタル・へ！トロジ ーＪ、第８巻（才刊第８号）、第２８３−２９１頁、１９８０年（Ｐａｖｌｏｖ ｉａ−４ａｎｔｓ＋ｒａ、ａｔ　ａユ、、Ｉ！、ｘｐＬ　ｌｉｅｍａｔｏユ８． ８（８ｕｐｐ、８）、２８３−２９１　（１９８０））、およびクル／　：　「 ＦｉＢ８ｖｐ−ズ」、第１４１Ｌ巻、第１号、第１０５−１０８頁、１９８２年 ［Ｋｕｒｔｚ、？ｉＢ８　Ｌｓ−ｔｔ、ｓｒｇ、１４＆（１）、１０５−１０８ 　（１９８２）］参照〕。

更にアジ１バントとして考えられるものには、アドレナリン作動性物質、甲状腺 ホルモン、男性ホルモンおよびＢＰムのように、エリスロボエチンまたはアシア ロ−ＩＰＯの効果’ｖｉめること、即ちそれらの補助薬として作用すること、が 報告された物質〔ダン：「血球増生の最近（１）ｔａ念Ｊ　（Ｄｕｚ＞ｎ、”Ｃ ｕｒｒｅｎｔｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　１ｒｙｔｈｒｏｐｏｉｓ　ｅｉｇ”〕、 ジジノンワイリーおよびサンズ（イングランド、チチェスター、１９８３年）　 （Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎａ８ｏｎｓ　（Ｃｈｉｃｈ＠５ｔｅｒ、ＩＬｎｇ ユａｎｄ、１９８３）］、ウライ−ランら：「プルート」、第４４巻、第３号、 第１７３−１７５頁、１９８２年（Ｗｅｉｌａｎａ、ａｔａｌ、、Ｂｌｔｚｔ、 ４４（３）、１７３−１７５　（１９８２））、カルミンチ：「キドニー・工ｎ ｔ、Ｊ　、第２２巻、第３８３−３９１頁、１９８２年（Ｋａｌｍａｎｔｉ　、 Ｋｉｄｎｅｙ工ｎｔ、、２２，３８３−３９１　（１９８２）］、シシャクジ； 二ニー・イングランド・ジャーナル・オン・メディスン」、第２８９巻、第７２ −８０頁、１９７３年〔８ｈａｈｉ＋ｉｉ、Ｎｅｖ、ＩＣｎｇ、Ｊ、Ｍｅａ、、 ２８９．７２−８０（１９７３）］、フィッシャーら：「ステロイズ」、第３０ 巻、第６号、第８３３−８４５頁、１９７７年〔Ｆｉｅｈ８ｒ、ａｔ　ａｌ、、 日ｔｅｒｏｉｄｓ、３０（６）、８３３−８４５　（１９７７））、ウラペら： 「ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディスン」、第１４９巻、％１３ １４−１３２５頁、１９７９年（０ｒａｌｅ、ａｔａｌ、、：Ｊ、Ｌｘｐ、Ｍｅ ａ、、１４９．１３１４−１３２５　（１９７９））、および、ビラットら：「 エクスペリメンタル・へマトロジー」、第１０巻、第１号、第１３３−１゛　４ ０頁％　１９８２年（Ｂ１１１ａｔ、ａｔ　ａｍ、、Ｘｘｐｔ。

Ｂｉｏｍａｔｏ１．、１０（１）、１３３−１４０　（１９８２）　〕参照〕、 並びに「肝造血因子」と目される化合物類〔ツートンら：「アクタ・ヘマテイカ Ｊ、＄６９巻、第１７１−１７９頁、１９８３年［Ｎａｕｇｈｔｏｎ、ｅｔ　ａ ｌｏ、ムｅｔａ、ＨａｅｍａｔＩＩ＠　６９．第１７１−１７９頁（１９８３） 〕参照〕、「エリｘｖｘトロピン１ｊ＋Ｊ　（ｌｒｙｔｈｒｏ　−ｔｒｏ）ｉｎ ａ）（：！７ゴー）　（（３ｏｎｇｏｔｅ）ら：第７回内分泌学国際会襲（１９ ８４年７月１−７日、ケベック、ケベック市）の会誌、抄ｔｉｊ３６４、コンボ ート：「バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミエニケーシ璽ンズ 」、第１１５巻、第２号、第４４７−４８３頁、１９８３年（Ｏｏｎｇｏｔｅ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂ：Ｌｏｐｈｙｉ、Ｒｅｓ、Ｏｏｍｍ、、１１５（２）＊　４４７−４８３（１ ９８３）］およびココンボート：アナリチカル・バイオケミストトリー」、第１ ４０巻、第４２８−４３３頁、１９８４年（Ｏｏｎｇｏｔｏ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏ −ｃｈｅｍ、、　１４０　、４２８−４３３　（１９８４）　’）に記載〕およ び「エリＸ１ｆｆジｚニア撃Ｊ　（ｏｒ７ｔｈｒｏｇｅｎｉｎｇ）（ロスマンら ：ジャーナル・オン・サージカル・オンコロジー」、第２０巻、第１０５−１０ ８頁、１９８２年（Ｒｏｔｈｍａｎ、　ａｔ　ｅｃｌ、、　１．８ｕｒｇ、　０ ｎａｏ１．。

２０．１０５−１０８（１９８２））に記載〕が挙げられる。

予備スクリーニングでは、５−α−ジヒドロテストステロンまたはナンド四ロン で前処理された超低酸素赤血球増加マウスの造崩応答性を調べたが、前記本発明 のエリスロボエチンについて明確な結果か得られなかった・ 本発明ポリペプチドの診断的用途も同様に広範であり、ＲＩムおよびＲＩ、Ｉ８ ム等の各棹イムノアッセイ技術、並びに各種のイン・ビトロおよびイン・ビボ活 性分析において標識および未標＠型での使用が挙げられる。例えば、ダンら：「 エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、茅１１巻、第７号、第５９０−６００頁 、１９８３年（Ｄｕｎｎ　、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｘｐｔ−Ｅｌｅｎ＋ａｔｏ１ ．。

１１（７）、５９０−６００（１９８３））、ギプソンら：「パソレジー」、第 １６巻、第１５５−１５６頁％　１９８４年（Ｇｌ’ｔ）ｓｏｎ、　ａｔ　ａｌ 、、　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５゜１５５−１５６（１９８４）’ｌ　；クリス タル＝「エクスペリメンタル・ヘマトロジー」、第１１巻、第７号、第６４９− ６６０頁、１９８３年（Ｋｒｙｓｔａｌ、Ｅｘｐｔ−Ｈｅｍａｔｏｌ、、１１（ 〕）、〕６４９−６６０１９８３）”ｌ　：サイトーら：「ジャパニーズ・ジャ ーナル・オン・メディスン」、第２３巻、第１号、第１６−２１頁、１９８４年 （８ａｉｔｏ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊａｐ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　２３（１）、１６ −２１（１９８４））、ネーザンら：「ニエーイングランド・ジャーナル・オン ・メディスン」、第３０８巻、第９号％第５２０−５２２頁、１９８３年［Ｎａ ｔｈａｎ、ｅｔ　ａユ、、Ｎｅｗ　ｌｎｇ−Ｊ、Ｍａｄ、。

３０８（９）、５２０−５２２（１９８３））、およびそれに関する分析につい ての各庁文献参照、ここに初めて開示されたＩＰＯ残基配列からなる合成ペプチ ドをはじめとする本発明のポリペプチドは、また、ポリクローナル抗体、並びに 各種の連続的および非連続的ｉｐ。

エピトープに対して特異的な「バンク」たるモノクー−ナル抗体を得るために極 めて有用な純粋物質である。

−例として、ホップら＝「２％Ｎ１ム、Ｓ、」（米囚）。

第７８巻、第３８２４−３８２３頁、１９８１年〔Ｈ’ｐＩ’ｓ　ｅｔ　ａｍ、 、Ｐ、Ｎ、　ム、Ｓ（Ｏ，Ｓ、ム）、７８゜ｐｐ　３８２４−３８２８（１９８ １）”ｌによる水治療法に関し、またチェーら：「アナルス・Ｒｅｖ、バイオケ ミストリーＪ、第４７巻、第２５１頁、１９７８年（ｃｈｏｕ。

ａｔ　ａｌ＋、ムｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｃｃｈ＠＋＋、、４７ｅ　ｐ２５１（１９ ７８）〕による二次構造について５表■のアミノ酸配列の予備分析では、４１− ５７位、１１６−１１８位および１４４−１６６位の達硯残基配列の二重合成ペ プチドは高い抗原応答性を有しているであろうこと並びに合成ペプチドおよび完 全蛋白質と免疫応答する有用なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を与え るであろうことを示している。このような抗体は、ＢＰＯおよびＩＰＯ関連生成 物の検出およびアフィニティＮ製に有用であると予想される。

実除に、下記三種の合成ペプチドが製造′された：（１）　ｈＥＰｏ　４３−５ ７．　Ｖ−Ｐ−Ｄ−Ｔ−ＩＣ−Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｙ−Ａ４−に−Ｒ−Ｍ−恩−Ｖ−Ｇ ： （２）　ｈＢＰｏ　１１６−１２８．　Ｋ−ｉ、−Ａ−４−８−Ｐ−Ｆ−Ｄ−ム ームー８−ムーム；（３）　ｋｉ、ＩＬＰｏ　１４４−１５６．　Ｖ−！−８− Ｎ−Ｆ−Ｌ−Ｒ−０４−Ｌ−に−Ｌ４−Ｔ−Ｇ−蔦−ム−０−Ｒ−Ｔ−Ｇ−Ｄ− Ｒ。

上記ポリペプチドな用いた予備免疫に験では、１２５Ｉ−標識化ヒト尿ＩＰＯ単 一物を免疫沈降させるウサギ血清抗体能を測定すると、ｈＫＰＯ４１−５７に対 し比較的弱い陽性応答性を示し、ｈＸＰＯ１１６−１２８に対して明確な応答を 示さず、ｈｌｅＰＯ１４４−１６６に対しては強い陽性応答を示した。三種のペ プチドについての予備的なイン・ビボ活性試験では、単独ででもまた組合せでも 、さはど活性を示さなかった。

前記鎖側で得られた■乳＠ｙｓｐｏのアミノ酸残基の配列を銹導してみると、こ れは成熟ｘｐｏの一次構造形状を本質的に示しているが、表ＶのサルｆｉｉＰｏ の１６５７ξノ酸残基の特定配列および表■のヒト種ＥＰＯの１６６残基により 、本発明で得られる有用なポリペプチドの範囲が制限されるものではないことを 理解されたい０本発明には、ヒトｌ−インターフェロンのような生物学的活性哨 乳幸ポリペプチドの過去の研究により明らかにされたところからおそらくは存在 するであろうところのｘｐｏの各種天然対立遺伝子型が含まれる〔例えば、出願 第０　０７７　６７０号として公開され、　Ｘ２０１４０位にアルギニン残基な 有すると報告されたヒト免疫インターフェロ７種、およびグレーら：「ネイチャ ー」、第２９５巻、第５０３−５０８頁、１　ｇ　Ｂ　２４（Ｇｒａ７．ａｔ　 ａｌ、、口４ｕ　Ｔ　ｌｉｌ　＊２９５、：ｐｐ　５０３−５０８（１９８２） ）において、１４０位にグルタミンを有するとして報告された種と比較されたい １両種とも「成熟Ｊｌ−）ｙ−インターフェロン配列からなることを％徴とする ものである〕、成熟ＸＰＯポリペプチドの対ユ遺伝子型は、配列の長さに関しお よび（または）配列内のアきノ酸の欠如、置換、挿入または付加に関して、相互 に、また表Ｖおよび■の配列との間で異なっているであろう、その結果、グルコ シル化能において潜在的な多様性が生じる。前述したように、一つの推定される ヒトＳ凰Ｐｏの対立遺伝子屋には、１２６位にメチオニン残基を含むものが考え られる。予期したように、ｘｐｏをコードするＤＮムゲノムおよびｃＤＮム配列 の天然対立遺伝子型として、上に型の対車遺伝子ポリペプチドをコードするか、 あるいは特定の同様のポリペプチドを示す別のコードンを単に有するものも発生 しているようである。

成ｊｐｌＸＰｏの天然対立遺伝子型の他に１本発明では１４、ＰＯおよび「成熟 Ｊ］ＵＰＯ７ラグメントのポリペプチド類縁体のような他の「１ＰＯ生成物１」 を包含するものである。アルドンらによる前記公開出願（ＷＯ／８３１０４０５ ３）の方法により、−以上の残基の同一性または存在位飯（例えば、置換、末端 および中間的付加並びに削除）についてここに特定された成熟ｘｐ。

とは！Ａなる一次′ＪＰ造を有するポリペプチドの微小生物免税をコードしてい る遺伝子を容易に設計し、製造することができよう、あるいは、ｃＤＮムおよび ゲノムｘ、ｐｏ遺伝子の改変は、周知の特定部位突然変異誘発技術により容易に 実施でき、またｘｐｏ類縁体および誹導体を得るために利用することができる。

このような凡ＰＯ生成物は少なくとも一つの凡ＰＯの生物学的性質を有するが、 他の点では異っていてもよい０例えば、本発明で計画されるｍｐｏ生成物には、 例えば削除によって目線された形のもの〔Δａｎ　、　ａｓｓ−Ｐｒｏ２〜工ｌ ｅ’）ｈＲＰｏ、（ｄｏｓ−Ｔｈｒ”　〜ムｒｇ１６６〕ｈｘｐｏおよびｒΔ２ ７−５２７−５５ｈ　があって、％にこの＆者は完全なエキソンによってコード された残基な欠いたものである。また、本発明のｓｐａ生成物には、加水分解に 対しより安定なもの（したがって、天然ＥＰＯよりも著しい、即ち長い持続性を 有するであろう）、−以上のグリコジル化可能部位を削除して変換されたもの（ 酵母産生生成物ではより高い活性を有するようになるかもしれない）、−以上の システィン残基が削除されまたは例えばヒスチジンもしくはセリン残基テ置換さ れ（例えば、（Ｈｌｓ　：ｌｈＩ、ＰＯ類縁体）、微小生物系から更に容易に活 性型で単離され得るもの。

あるいは、−以上のチロシン残基がフェニルアラニンで試換され（例えば、類縁 体の（ｐｈｓ　）ｈｘｐｏ　および（Ｐｈ・１４５）ｈｉＰＯ）、多少なりとも 標的細胞のＩＬＰＯレセプターと容易に結合し得るもの、が含まれる。更には、 成熟凡ＰＯ内の一部のアミノ酸配列または二次構造のみを複製したものであって 、７ラグメントが一つの３！、ＰＯ活性（例えばレセプター結合性）を有し、他 の活性（例えば、造血機能）を有していないポリペプチドフラグメントも含まれ る。この点に関し特に重壁であるのは、表■のヒトゲノムＤＮＡ配列により解明 されたこれらの可能なｘｐｏフラグメントであり、即ちイントロン配列で示され かつ生物学的機能のうえで独立の「ドメイン」を構成する全体的ＩＰＯ配列の「 フラグメント」である。本発明のいかなる一以上の「Ｉ！、ＰＯ生成物」におけ るイン・ビボ活性が欠如しても、治療上の有用性（前記ウェイランドら参照）ま たはｇｐｏ分析もしくはｘｐｏ拮抗作用のような他の関連分野での有用性を全体 的には阻害しないことが注目される。エリスロボエチン拮抗剤は、赤血球増加症 または］ＩｃＰＯ過剰産生時の治療に極めて有用であろう〔例えば、アダムソン ：「ホスピタル・プラクティス」、第１８巷、第１２号、第４９−５７頁、１９ ８３年（ａｄａｍｓｏｎ、　Ｈｏ５ｐ、Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　１３（１２）、４ ９−５７（１９８３）］およびヘルマンら＝「クリニカル・アンド・ラボラトリ −・ヘマトロジー」、第５巻、第３３５−３４２頁、１９８３年（Ｈｅｌｌ−ａ ｔａｎｎ、ａｔ　！ＬＸ、、０１１ｚ＋、Ｌａ’ｂ、Ｈａｅｍａｔ、、５゜３３ ５−３４２（１９８３））参照〕。

本発明の他の面によれば、ここに記載された、ヒトおよびサルｉＰｏポリペプチ ドをコードするクローンＤＮＡ配列は、天然生成物の単離物についてのｌθ年間 にわたる分析にもかかわらず今まで利用できなかった哺乳類エリスロポエチンア ミノ酸配列に関し、それらが与える情鏝において極めて価値が高い。このＤＮＡ 配列はまた、各種組換え技術によって大倉のエリスｎボエチンを微生物合成する のに段車つ生成物としても極めて価値がある。即ち、本発明で得られるＤＮＡ配 列は、新規でかつ有用なウィルス性および環状プラスミドＤＮＡベクター、新規 でかつ有用なトランス７オーメーシ冒ンおよびトランス７エクシ璽ンサレタ微小 生物真核宿主細胞（培地で増殖される細菌、酵母細胞および晴乳翰細胞が含まれ る）およびＲＰＯおよびｉｐｏ生成物の発現が可能な微小生物宿主細胞の新規で かつ有用な培養増殖方法を得る上で有益である０本発明のＤＮＡ配列は、ここに 具体的に説明したヒトおよびサル種以外の硼乳動物埒におけるｘｐｏおよび関連 蛋白質をコードするａＤＮムおよびゲノムＤＮＡ配列を単離する上で、標識化プ ローブとして使用するのに極めてチした物質でもある。大発明のＤＮＡ配列が。

６桟の別の蛋白質合成方法において（例えば昆虫の細胞）、あるいはヒトおよび 匍の哺乳動物でまだ見出されていない遺伝子治多において使用される（囲は計算 できない１本発明のＤＮＡ配列は、エリスロボエチンおよびエリスロボエチン生 成物を大ｆＫｔ生ずる真核「原生」として＠診する遺伝子変異噴孔動物種を得る 上で有用であると予想されろ。一般的には、パーミターら：「サイエンス」、第 ２２２巻、第４６２５号、第８０９−８１４頁、１９８３年［：　Ｐａ１ｍ１ｔ ｅｒ。

ａｔ　ａｌ、、８ｃｉｅｎａｅ、２２２（４６２５）＊　８０９−８１４（１９ ８３）］参照。

この観点からすれば、したがって、特定の実施例の開示は本発明の範囲を制限す るものでないことは明日であり、多数の改変および変更が当業者において考えら れる。−例として、実施例で得られるＤＮＡ配列はｃＤＭムおよびゲノムＤＮＡ 配列が含まれ、それは本出瓶がＤＮＡ配列の３１３１造に必要なアミノ酸１列情 報を提供するためのものだからであるが５本発明にはＨＰＯアミノ酸配列配列報 に基づいて調製されるような合成りＩム配列も含まれる。これらは、ＮＰＯをコ ードしく例１２のように）、また−以上の天然ＢＰＯの生物学的性質を有するけ れども他の性質（即ち、程度の異なる他の性質を有すること）は有しないＲＰＯ フラグメントおよびｘｐｏポリペプチド類縁体（即ち、「ｘｐｏ生成物」をコー ドするものであろう。

本発明で得られるＤＮＡ配列には、このように、エリスロポエチンの少なくとも 一部の一次構造配列と一以上のその生物学的性質を有するポリペプチド生成物を 原核または真核宿主細胞において発現させる上で使用するのに適し、かつ（ａ） 表Ｖおよび■に示したＤｌｉＡ配列、Ｃｂ）　（ａ）で定義したＤＮＡ配列また はそのフラグメントとハイブリッド形成するＤＮＡ配列、および（０）遺伝暗号 の縮重は別にして、（ａ）および（１））で定義されたＤＮＡ配列とハイブリッ ド形成するであろうＤＮＡ配列の中から選択されるＤＮＡ配列が全て含まれる。

この点に関し注目すべきは、例えば存在するサルおよびヒトＸＰＯ対立遺伝子配 列並びに他の哺乳動物１遺伝子配列が、表■および■の配列およびそのフラグメ ントとハイブリッド形成すると期待されることである。更に、遺伝暗号の縮重は 別にして、５ＣＸＰＯおよびＲＣ３ＰＯ７伝子並びに各Ｈｕｐｏフラグメントお よび類縁体をコードする合成もしくは突然変異のａＤＮムまたはゲノムＤｌｉム 配列は上記ＤＮム配列ともハイブリッド形成するであろう、このようなハイプリ ダイゼーシ箇ンは、サルおよびヒトの′ＬｐｏをコードするＤＭＡの最初の単離 に関してここに記載された条件またはより厳格な条件下で、所望ならば背景のハ イブリッド形成を抑制して容易に実施することができるであろう。

＃Ｊ様の意味で、前記鎖側は、細菌性プラスミドおよびウィル性ゲノム起源のハ イブリッドベクターに挿入されたＤＭＡの崎乳艷物細胞発現に関し、ＢＰＯ生成 物ｙｔ微小生物発現させる発明！説明するものであるが、広範な発現系が本発明 の概念の中に含まれる。特に、培養された各檜ＭＥ＊、酵母菌および哺乳動物細 胞に適用される均−源からのベクターを含む発現糸、並びにベクターを含まない 発現系（例えば、リン酸カルシウムでトランヌフェクシ罵ンされた細胞）が含ま れる。

この点に関し、例えば、サル宿主培養細胞およびヒト宿主培養細胞においてサル 起源ＤＭＡが発現するのは現実には［外来性ＪＤＮムによる発現の場合であると 理解されたいが、その理由は高レベルの発現がめられるＩＰＯＤＮＡは宿主ゲノ ムに起源を有さないからである０本発明の発現系は、ＩＰＯ生成物が細胞質で形 成されて宿主細胞のｆＩ胞質または膜Ｋ（例えば、細菌ペリプラズム空隙に蓄積 される）、または前記培地上ｉＫ、または緑膿菌（Ｐ、ａｏｒｕｇｉｎｏｓａ） 発現系〔グレイら：「バイオテクノロジー」、第２巻、第１６１−１６５頁、１ ９８４年［Ｇｒａｙ、ｅｔ　ａｌ、。

ＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌＯｇ７．２．　ｐｐ１６１−１６５（１９８４）〕〕のよ うＫどちらかといえば、まれな柔に、グリコジル化されたｘｐｏ生成物およびグ リコジル化されないｘｐｏ生成物が蓄積されるという笑ａ態様を意図するもので ある。

本発明のハイブリッド形成改搾方法は、実際には上記Ｄ）ｊム／　Ｄ　Ｎムスク リーニングに用いられたが、これはＲＮＡ／ＲＮムおよびＲＮ　Ａ　／　Ｄ　Ｎ ムスクリーニングにて同様Ｋｉ用可能である。ここに説明したような混合プロー ブ技術は、一般に、より迅速Ｋかつ信頼をもってポリヌクレオチドを単離できる ハイブリッド形成過程において多くの改ｐ点を有している。これらの多数の個々 の操作上の改良点としては、改良されたコロニー移転および保存方法、および同 様のフィルターで再グローブ化でき、フィルターの碌返し使用が可能で、新規な グロテアーゼ処理にも適用できるシーンスクリーン（Ｇｅｎｅ　８ｃｒａｅｎ） およびジ−７Ｘクリーン・プラ２（Ｇａｐｅ　Ｂａｒｅ＠ｎ　Ｐｌｕｓ）のよう なナイロン゛基質フィルターの使用〔例えば、タウプら二「アナリテイカル・バ イオケミストリーＪ、Ｋｓｚ６巻、第２２２−２３０頁、１９８２年（Ｔａｕｂ 、ａｔａｌ、、轟ｎａｌ、Ｂｉｏａｈｅｍ、、１２６．１１Ｐ　２２２−　２３ ０（１９８２）：）と比較されたい〕、および多数の混合プローブ（例えば３２ を超える数）のそれぞれの極めて（ｆｆｉイｌａｆ　（０、０２５ピコモルのオ ーダー）での使用。

および、用いられる全ての混合プローブの中の最低の計副解離渉度に非常に近い 厳格なる参度下での（即ち、４℃以下、好ましくはそれよりも２℃以下での）ハ イブリダイゼーシヨンおよびボストハイブリダイゼーク璽ン工程の実施、が挙げ られる。これらの改良点を組合わせろと、それらの！施によるものとは予想でき ない程の結果が得られる。このことは、比較的低めの充分ｔなるメツセンジャー 只ＨＡ種に同量のｃＤＮムスクリーンを用いると好結果が得られたと今までに報 告されたグローブ数の４倍葉を含む混合プローブ操作を、１．５００，０００の ファージプラークのゲノムライブラリースクリーニングにおいて唯一の進伝子配 夕０を単離するのに適用すると成功した。という事５ＡＫより詳細に説明される 。この作画は、前記アンダーソンらの、「混合プローブスクリーニング法は相当 するＲＮＡの遺伝子が乳用できない限り、哺乳類蛋白質遺伝子を単にするのは実 際上不可ｎ［である」との論評の公開と実質上同時に行なわれたものである。

国際調査報告 Ｉ噛畔−翻−＾−儲−購−ｐＣＴ／マ１≦ＦＩ４１０２０２１＋＋′□１Ａ−１ １ゝＰＣＴ／υ５８４１０２０２１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然エリスロポエチンの部分的もしくは全体的な一次構造状と一種またはそ れより多くの生物学的性質とを有し、外来性ＤＮＡ配列の原核生物的もしくは真 核生物的発現による生成物であるということによって特徴づけられる、精製単離 されたポリペブチド。 ２．いかなる哺乳類蛋白質とも会合していないということにより更に特徴づけら れる、請求の範囲第１項記載のポリペブチド。 ３．外来性ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ鎖である、請求の範囲第１項記載のポリペブド 。 ４．外来性ＤＮＡ配列が合成ＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項記載のポリペ プチド。 ５．外来性ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項記載のポリ ペブチトド。 ６．外来性ＤＮＡ配列が自律複製性環状ＤＮＡプラスミドまたはウィルス性ベク ターに担持されている、請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ７．表ＶＩに示したようなヒトエリスロポエチンまたはあらゆるその自然発生的 対立遺伝子変異体の一次構造形状の一部もしくは全部を有する、請求の範囲第１ 項記載のポリベブチド。 ８．表Ｖに示したサルエリスロポエチンまたはあらゆるそり自然発生的対立遺伝 子変異体の一次構造形状の一部もしくは全部を有する、請求の範囲第１項記載の ポリペブチド。 ９．天然エリスロボエチンの免疫学的性質を有する、請求の範囲第１項記載のポ リペブチド。 １０．天然エリスロポエチンのイン．ビポ生物学的活性を有する、請求の範囲第 １項記載のポリペブチド。 １１．天然エリスロポリチンのイン．ビトロ生物学的活性を有する、請求の範囲 第１項記載のポリペプチド。 １２．検出可能な標識物質と共有結合していることを更なる特徴とする、請求の 範囲第１項記載のポリペブチド。 １３．前記検出可能な標識が放射性標識である、請求の範囲第１２項配置のポリ ペブチド。 １４．天然エリスロポエチンの少なくとも一部の一次構造形状および一種または それより多い生物学的性質を有するポリペブチド生成物の原核または真核宿主細 胞における発現を生起させるのに使用されるＤＮＡ配列。たゞし、このＤＮＡ配 列は、下記から選ばれたものである。 （ａ）表ＶおよびＶＩに示されたＤＮＡ配列またはそれらの相補鎖、 （ｂ）（ａ）で定義されたＤＮＡ配列またはそのフラグメントとハイプリダイズ するＤＮＡ配列、および （ｃ）遺伝暗号の縮重は別にして、（ａ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列 とハイプリダイズするであろうＤＮＡ配列。 １５．宿主細胞に前記ポリペプチド生成物を発現させる態様で請求の範囲の第１ ４項記載のＤＮＡ配列によりトランスフォーメーションまたはトランスフエクシ ョンされた原核または真核宿主細胞。 １６．原核または真核宿主における請求の範囲第１４項記載のＤＮＡ配列の発現 によるポリペブチド生成物。 １７．エリスロポエチンの一部もしくは全部の一次構造形状および一種またはそ れより多くの生物学的性質を有するポリペブチドの原核または真核宿主における 発現をコードしている、精製単離されたＤＮＡ配列。 １８．請求の範囲第１７項記載のｃＤＮＡ配列。 １９．請求の範囲第１８項記載のサル種エリスロポエチンをコードするＤＮＡ配 列。 ２０．表Ｖに示された蛋白質をコードする部位を有する、請求の範囲第１９項記 載のＤＮＡ配列。 ２１．請求の範囲第１７項記載のグノムＤＮＡ配列。 ２２．請求の範囲第２１項記載のヒト種エリスロポエチンをコードするＤＮＡ配 列。 ２３．表ＶＩに示された蛋白質をコードする部位を有する、請求の範囲第２２項 記載のＤＮＡ配列。 ２４．請求の範囲第１４項記載の作成されたＤＮＡ配列。 ２５．大腸菌細胞での発現に適した一種またはそれより多いコードンを有する、 請求の範囲第２４項記載の作成されたＤＮＡ配列。 ２６．ヒト種エリスロポエナンの発現をコードしている、請求の範囲第２５項記 載の作成されたＤＮＡ配列。 ２７．表ＸＩＶに示した蛋白質をコードする部位を有する、請求の範囲第２６項 記載の作成されたＤＮＡ配列。 ２８．酵母細胞における発現に適した一種またはそれより多いコードンを有する 、請求の範囲第２４項記載の作成されたＤＮＡ配列。 ２９．ヒト種エリスロボエチンの発現をコードしている、請求の範囲第２８項記 数の作成されたＤＮＡ配列。 ３０．表ＸＸＩに示した蛋白質をコードする部位を有する、請求の範囲第２９項 記載の作成されたＤＮＡ配列。 ３１．検出可能な標識物質と共有結合している、請求の範囲第１７項記載のＤＮ Ａ配列。 ３２．検出可能な標識が放射性標識である、請求の範囲第３１項記載のＤＮＡ配 列。 ３３．請求の範囲第３１項記載の一本鎖ＤＮＡ配列。 ３４．天然エリスロポエチンのポリペプチドフラグメントまたはそのポリぺブチ ド類縁体をコードしているＤＮＡ配列。 ３５．【配列があります】または【配列があります】をコードしているＤＮＡ配 列。 ３６．作成された配列である、請求の範囲第３４項記載のＤＮＡ配列。 ３７．請求の範囲第１４項、第１７項、第３４項または第３５項のいずれかに記 載のＤＮＡ配列を有する、生物学的機能性環状ブラスミドまたはワィルス性ＤＮ Ａベクター。 ３８．請求の範囲第３７項記載のＤＨＡベクターにより、安定したトランスフォ ーメーションまたはトランスツュクションがなされた原核または真核宿主細胞。 ３９．請求の範囲第１７項または第３４項記載のＤＮＡ配列の原核または真核宿 主細胞における発現によるポリぺブチド生成物。 ４０．天然エリスロポエチンの一次構造形状を充分に複製していてその一種また はそれより多い生物学的性質を保有し得る一次構造形状を有し、かつ天然エリス ロポエチンのものとは異なる平均的炭水化物組成を有する糖蛋白質生成物。 ４１．天然ヒトエリスロポエチンの一次構造形状を充分に複製していてその一種 またはそれより多い生物学的性質を保有し得る一次構造形状を有し、かつ天然ヒ トエリスロポエチンのものとは異なる平均的炭水化物組成を有する糖蛋白質生成 物。 ４２．イン・ビトロで継続的に増殖することができ、しかも培養増殖させた場合 に、それらの生育培地において４８時間で放射性免疫試験測定により、細胞１０ ６個当り１００単位より多いエリスロポエチンの産生が可能である脊椎動物細胞 。 ４３．４８時間で、細胞１０６個当り５００単位より多いエリスロボエチンの産 生が可能な、請求の範囲第４２項記載の脊椎動物の細胞。 ４４．４８時間で、細胞１０６個当り１０００単位より多いエリスロボエチンり 産生が可能な、請求の範囲第４２項記載の脊椎動物細胞。 ４５．哺乳類または鳥類の細胞である、請求の範囲第４２項記載の脊椎動物細胞 。 ４６．Ｃ０Ｓ−細胞またはＣＨＯ細胞である、請求の範囲第４５項記載の脊椎動 物細胞。 ４７．表Ｖに示したアミノ酸配列の一部、もしくは全部を有し、かつ天然サルエ リスロポエチンの一種またはそれより多いイン．ビポもしくはイン．ビトロ生物 学的活性を有する合成ポリペブチド。 ４８．完全に配列番号１〜２０内の残基配列以外の、表ＶＩに示したアミノ酸配 列の一部もしくは全部を有し、かつ天然ヒトエリスロポエチンの生物学的性質を 有する合成ポリペプチド。 ４９．完全に配列番号１〜２０内の残基以外の、表ＶＩに示した一部もしくは全 部のアミノ酸配列の二次形状の一部もしくは全部を有し、かつ天然ヒトエリスロ ポエチンの生物学的性質を有する合成ポリペブチド。 ５０．適切な栄養条件下で請求の範囲第３７項記載のＤＮＡベクターによりトラ ンスフォーメーションまたはトランスフェクションがなされた原核または真核宿 主細腕を増殖させ、前記ベクターＤＮＡ配列の発現により所望のポリベブチド生 放物を単離することからなる、天然エリスロボエチンの一次構造形状の一部もし くは全部および一種またはそれより多い生物学的性質を有するボリペチトドの生 産方法。 ５１．エリスロポエチンとの、並びに配列：【配列があります】 に完全に包含されるアミノ酸残基配列からなるあらゆるポリペブチド以外の、天 然エリスロポエチンに存在するアミノ酸残基配列の実質的な複製である一次構造 形状を有する合成ポリペブチドとの、免疫応答性により特徴づけられる抗体物質 。 ５２．モノクローナル抗体である、請求の範囲第５１項記載の抗体。 ５３．ポリクローナル抗体である、請求の範囲第５１項記載の抗体。 ５４、エリスロポエチンおよび配列： 【配列があります】 から選択される配列を有する合成ポリペブナドと免疫応答性である、請求の範囲 第５１項記載の抗体。 ５５．請求の範囲第１項、第１６項、再３９項、第４０項または第４１項記載の ポリペブチドの有効量、並びに薬学上許容される希釈剤、アジュバントまたは担 体からなる医薬組成物。 ５６．請求の範囲第１項、第１６項、第３９項、第４０項または第４１項記載の ポリベブチドを有効量投与することからなる哺乳動物のエリスロポエチン治療方 法。 ５７．治療がヘマトクリット値を高めることからなる、請求の範囲第５６項記載 の方法。 ５８．表ＶもしくはＶＩに示した精製単離ＤＮＡ配列、そのフラグメントまたは この配列もしく１はフラグメントの相補鎖。 ５９．請求の範囲第５８項記載のＤＮＡ配列の原核または真核宿主細胞における 発現によるポリペブチド生成物。 ６０．マルチブルー本鎖ボリヌクレオチドを有する不均一な細胞もしくはウィル スの試料における未知配列の特定の一本鎖ボリヌクレオチドを検出するための改 良方法であって、下記の（ａ）〜（ｅ）を含むものにおいて、この改良が３２を 越える混合プローブを用いかつ下記の（１）〜（４）の一つまたはそれより多く を実施することからなるものである、改良方法。 （ａ）一様に変異した塩基配列を有する標識化一本鎖ポリヌクレオチドプローブ の混合体が調製される。このプローブの各々は、被検ポリヌクレオチドに独特で あると推定される塩基配列に対して溶在特異的に相補的である。 （ｂ）試料が固体基質に固定される。 （ｃ）試料固定してある基質が、該試料のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼ ーションは別として、ポリヌクレオチドが更にそれと結合するのを抑制するよう に処理される。 （ｄ）試料を固定してある処理済みの基質が、全体的に相補性のボリヌクレオチ ド間でのみハイブリダイゼーションし易い条件下で、一時的に前記標識化プロー ブの混合体と接触せしめられる。 （ｅ）特定のポリヌクレオチドが、それと該標識化プローブ混合物内の全体的に 相補的なプローブとのハイブリダイゼーション反応の存在を監視することによっ て検出される。これは、標識化プローブの基質との非特異的結合に起因する標識 化物質の背景密度と比較して特定のボリヌクレオチド位置における基質上の標識 化物質の密度が高い、ということにより証明される。 （１）前記固体基質としてナイロン基紙を用いる。 （２）工程（ｃ）でプロテアーゼにより処理する。 （３）それぞれが約０．０２５ピコモル濃度の標識化プローブを用いる。 （４）工程（ｄ）におけるハイプリノイゼーション条件の一つとして、使用され る全てのプローブ中て表低のＴｄ計算値から４℃離れた温度付近の巌格な温度を 適用する。