JPH0686480B2 - エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 - Google Patents
エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体Info
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- JPH0686480B2 JPH0686480B2 JP58026399A JP2639983A JPH0686480B2 JP H0686480 B2 JPH0686480 B2 JP H0686480B2 JP 58026399 A JP58026399 A JP 58026399A JP 2639983 A JP2639983 A JP 2639983A JP H0686480 B2 JPH0686480 B2 JP H0686480B2
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- erythropoietin
- antibody
- cells
- monoclonal antibody
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体
に関する。
に関する。
エリスロポエチン（EPO）は、赤血球生成促進因子よも
呼ばれ、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血
球系細胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、
主として腎で生成されると考えられている。EPO生成を
調節するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠
乏状態に陥ると生成が亢進し、逆に酸素過剰状態になる
と生成が減少する。例えば、貧血患者では、EPO生成が
増加し、EPOが尿に排泄されるようになる。EPOは市販さ
れており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質である
が、化学構造は完全には解明されていない。EPOは、貧
血患者、手術後患者、腎摘出後の人口透析患者に広く適
用可能な医薬である。
呼ばれ、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血
球系細胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、
主として腎で生成されると考えられている。EPO生成を
調節するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠
乏状態に陥ると生成が亢進し、逆に酸素過剰状態になる
と生成が減少する。例えば、貧血患者では、EPO生成が
増加し、EPOが尿に排泄されるようになる。EPOは市販さ
れており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質である
が、化学構造は完全には解明されていない。EPOは、貧
血患者、手術後患者、腎摘出後の人口透析患者に広く適
用可能な医薬である。
尿中にEPOが含まれていることは前記のとおりである
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約0.01〜
0.02重量％程度とみられる。このため、尿からEPOを有
効に得ることは困難であり、通常のクロマト吸着法で
は、EPOを高純度で効率よく採取することはできない。
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約0.01〜
0.02重量％程度とみられる。このため、尿からEPOを有
効に得ることは困難であり、通常のクロマト吸着法で
は、EPOを高純度で効率よく採取することはできない。
本発明者らは、免疫特異的に高純度EPOを吸着物として
取得するためのモノクローナル抗体について検討を行っ
てきた。特定の処理を行ったEPOで免疫した実験動物
（マウス）の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合さ
せ、モノクローナル抗EPO抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生したモノ
クローナル抗EPO抗体について、これを結合させて抗体
吸着カラムを作成し、これに貧血患者の尿タンパク質を
通したところ、目的のEPOが特異的に吸着され、収率よ
く高純度EPOを取得できた。そして、かかるモノクロー
ナル抗体がハイブリドーマ細胞から安定的に得られるこ
とを知見し、本発明を完成させた。
取得するためのモノクローナル抗体について検討を行っ
てきた。特定の処理を行ったEPOで免疫した実験動物
（マウス）の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合さ
せ、モノクローナル抗EPO抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生したモノ
クローナル抗EPO抗体について、これを結合させて抗体
吸着カラムを作成し、これに貧血患者の尿タンパク質を
通したところ、目的のEPOが特異的に吸着され、収率よ
く高純度EPOを取得できた。そして、かかるモノクロー
ナル抗体がハイブリドーマ細胞から安定的に得られるこ
とを知見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記要旨のものである。
ｉ）部分精製エリスロポエチンをソジウム ドデシル
サルフェート（SDS）電気泳動処理した後に、エリスロ
ポエチンに近接して低分子側に泳動される画分に対して
結合するモノクローナル抗体を作製し、ii）このモノク
ローナル抗体を用いたカラムクロマトにより、部分精製
されたエリスロポエチンをさらに精製してこのエリスロ
ポエチンに近接して泳動される画分を除き、iii）この
エリスロポエチンに近接して泳動される画分を除いたエ
リスロポエチンをさらにSDS電気泳動処理してエリスロ
ポエチンに相当する画分を切り出してエリスロポエチン
を抽出し、iv）この抽出したエリスロポエチンで実験動
物を免疫し、その脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融
合させて得られたハイブリード細胞から産生され、SDS
処理されたエリスロポエチンを特異的に吸着する性質を
示すエリスロポエチン製造用抗エリスロポエチンモノク
ローナル抗体。
サルフェート（SDS）電気泳動処理した後に、エリスロ
ポエチンに近接して低分子側に泳動される画分に対して
結合するモノクローナル抗体を作製し、ii）このモノク
ローナル抗体を用いたカラムクロマトにより、部分精製
されたエリスロポエチンをさらに精製してこのエリスロ
ポエチンに近接して泳動される画分を除き、iii）この
エリスロポエチンに近接して泳動される画分を除いたエ
リスロポエチンをさらにSDS電気泳動処理してエリスロ
ポエチンに相当する画分を切り出してエリスロポエチン
を抽出し、iv）この抽出したエリスロポエチンで実験動
物を免疫し、その脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融
合させて得られたハイブリード細胞から産生され、SDS
処理されたエリスロポエチンを特異的に吸着する性質を
示すエリスロポエチン製造用抗エリスロポエチンモノク
ローナル抗体。
このモノクローナル抗体は、抗EPOモノクローナル抗体
であって、尿その他のEPO含有物からSDS処理したEPO
（例えばEPOを２％SDSを含むリン酸緩衝液中で加熱処理
したもの）を吸着分として高純度に取得することができ
るのでEPO製造用モノクローナル抗体として有効であ
る。このようにしてSDS処理したEPOをモノクローナル抗
体カラムにかけ吸着させ、これを溶出するとEPOとSDSと
が分離し、高純度のEPOを得ることができる。このEPO特
異的モノクローナル抗体を得るにあたり、抗原とするEP
Oは特に、SDS電気泳動を行った際にEPOに近接して低分
子側に泳動される画分に対するモノクローナル抗体を得
て、このモノクローナル抗体のカラムに、カラムクロマ
ト等によって部分精製したEPOをかけ、EPOに接近して泳
動する物質を極力除いている。そのため、EPOに近接し
てSDS電気泳動される画分は存在しない。この結果、抗E
POモノクローナル抗体を作成する抗原としての純度は、
これまでにないほど精製される。さらにこのようにして
得られた精製EPOをSDS電気泳動により泳動させ、このEP
Oをとり出し免疫源とすることにより、EPOの抗原として
の作用は一層増強される。このようにすると貧血患者の
尿から回収率90％程度の高収率で比活性60,000単位/mg
タンパク質程度の高い比活性のEPOを得ることができ
る。
であって、尿その他のEPO含有物からSDS処理したEPO
（例えばEPOを２％SDSを含むリン酸緩衝液中で加熱処理
したもの）を吸着分として高純度に取得することができ
るのでEPO製造用モノクローナル抗体として有効であ
る。このようにしてSDS処理したEPOをモノクローナル抗
体カラムにかけ吸着させ、これを溶出するとEPOとSDSと
が分離し、高純度のEPOを得ることができる。このEPO特
異的モノクローナル抗体を得るにあたり、抗原とするEP
Oは特に、SDS電気泳動を行った際にEPOに近接して低分
子側に泳動される画分に対するモノクローナル抗体を得
て、このモノクローナル抗体のカラムに、カラムクロマ
ト等によって部分精製したEPOをかけ、EPOに接近して泳
動する物質を極力除いている。そのため、EPOに近接し
てSDS電気泳動される画分は存在しない。この結果、抗E
POモノクローナル抗体を作成する抗原としての純度は、
これまでにないほど精製される。さらにこのようにして
得られた精製EPOをSDS電気泳動により泳動させ、このEP
Oをとり出し免疫源とすることにより、EPOの抗原として
の作用は一層増強される。このようにすると貧血患者の
尿から回収率90％程度の高収率で比活性60,000単位/mg
タンパク質程度の高い比活性のEPOを得ることができ
る。
本発明において、モノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ細胞より産生される。
マ細胞より産生される。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、
SDS電気泳動による処理を行ったEPO、例えば貧血患者尿
より得て同処理を行ったEPOで免疫した実験動物の脾臓
細胞と、ミエローマ（骨髄腫）細胞とを細胞融合して作
られる。この場合の実験動物は、例えば、マウスやラッ
ト等であり、細胞融合は、同種の動物の細胞間で行わせ
るのが好ましい。例えば、マウスの脾臓細胞とマウスの
ミエローマ細胞との間で、細胞融合させる。ミエローマ
細胞は、悪性腫瘍細胞の一種であって、増殖性に富む細
胞である。
SDS電気泳動による処理を行ったEPO、例えば貧血患者尿
より得て同処理を行ったEPOで免疫した実験動物の脾臓
細胞と、ミエローマ（骨髄腫）細胞とを細胞融合して作
られる。この場合の実験動物は、例えば、マウスやラッ
ト等であり、細胞融合は、同種の動物の細胞間で行わせ
るのが好ましい。例えば、マウスの脾臓細胞とマウスの
ミエローマ細胞との間で、細胞融合させる。ミエローマ
細胞は、悪性腫瘍細胞の一種であって、増殖性に富む細
胞である。
マウスに対する免疫（抗原抗体反応）は、SDS電気泳動
処理をしたEPO、例えば貧血患者の尿より精製したEPO標
品を抗原として使用し、これをマウスに投与して行う。
処理をしたEPO、例えば貧血患者の尿より精製したEPO標
品を抗原として使用し、これをマウスに投与して行う。
このSDS電気泳動処理したEPOは次のようにして調製され
る。例えば本発明の実施例に記載される方法に準じてハ
イブリドーマ細胞を作成し、これから得られるエリスロ
ポエチンに近接して低分子側に泳動される画分に対する
モノクローナル抗体を結合してなる吸着カラムを調製す
る。この吸着カラムに貧血者の尿を限外濾過して濃縮
し、アフィニティーカラムクロマト処理等により部分精
製したEPOを通しEPOに近接して低分子側に泳動される画
分を除去したEPOを得る。このEPOをSDS電気泳動にか
け、EPOに相当する画分からSDS電気泳動処理したEPOを
取り出す。
る。例えば本発明の実施例に記載される方法に準じてハ
イブリドーマ細胞を作成し、これから得られるエリスロ
ポエチンに近接して低分子側に泳動される画分に対する
モノクローナル抗体を結合してなる吸着カラムを調製す
る。この吸着カラムに貧血者の尿を限外濾過して濃縮
し、アフィニティーカラムクロマト処理等により部分精
製したEPOを通しEPOに近接して低分子側に泳動される画
分を除去したEPOを得る。このEPOをSDS電気泳動にか
け、EPOに相当する画分からSDS電気泳動処理したEPOを
取り出す。
マウスへの抗原投与は、通常腹腔内注射により行われ、
免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあけ
て、数回注射をする。注射液は、前記の処理をしたEPO
タンパク質を、例えばPBSと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水
に溶解し、これにフロイントのアジュバンドを混合し
て、エマルジョンを形成させて調製する。
免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあけ
て、数回注射をする。注射液は、前記の処理をしたEPO
タンパク質を、例えばPBSと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水
に溶解し、これにフロイントのアジュバンドを混合し
て、エマルジョンを形成させて調製する。
このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了後、
約３日後に、脾臓を摘出し、この脾臓細胞（主にＢ細
胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間で
細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、P3−X63−Ag8、P3−NSI/−Ag4−１、X63−Ag8 653
などを培養して増殖させたものを使用する。
約３日後に、脾臓を摘出し、この脾臓細胞（主にＢ細
胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間で
細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、P3−X63−Ag8、P3−NSI/−Ag4−１、X63−Ag8 653
などを培養して増殖させたものを使用する。
細胞融合は、公知の技法に従って行われる。通常、ペニ
シリン（100単位/ml）及びストレプトマイシン（100μg
/ml）さらに2mMグルタミン、1mMピルビン酸を添加したR
PMI−1640合成培養液（以下RPMI−1640液と記す）と牛
胎児血清（FCS）との混合液中で前記脾臓組織を細断
し、単細胞化して充分細胞を分散したのち、RPMI−1640
液に分散し、これに前記ミエローマ細胞を混合し、遠心
後、上清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリ
エチレングリコール1500の50重量％溶液を添加して、細
胞融合させる。
シリン（100単位/ml）及びストレプトマイシン（100μg
/ml）さらに2mMグルタミン、1mMピルビン酸を添加したR
PMI−1640合成培養液（以下RPMI−1640液と記す）と牛
胎児血清（FCS）との混合液中で前記脾臓組織を細断
し、単細胞化して充分細胞を分散したのち、RPMI−1640
液に分散し、これに前記ミエローマ細胞を混合し、遠心
後、上清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリ
エチレングリコール1500の50重量％溶液を添加して、細
胞融合させる。
かくして作られた融合細胞の中から雑種の、いわゆるハ
イブリドーマ細胞を公知のHAT選択によって選び出す。
イブリドーマ細胞を公知のHAT選択によって選び出す。
HAT選択は、マイクロタイタープレートを使用して行う
ことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を96穴
マイクロタイタープレート上にまいて、HAT（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で培養を行
い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しないで増殖し
ている穴を確認し、ハイブリドーマを得る。
ことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を96穴
マイクロタイタープレート上にまいて、HAT（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で培養を行
い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しないで増殖し
ている穴を確認し、ハイブリドーマを得る。
次に、かくして選ばれたハイブリドーマについて、EPO
と特異的に結合する抗体を産生するか否かをソリッドフ
ェーズ法にて検定したのち、さらに本ハイブリドーマを
マウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から公知
の方法、例えば、硫安分画法により、タンパク質を得
る。このものは、主として免疫グロブリン（IgG）であ
る。この抗体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸
着剤をカラムに充填し、抗体吸着カラムを作成し、この
カラムに、EPO標品を通し、EPOの吸着能を調べ、ハイブ
リドーマが抗EPO抗体を産生するか否かを検定する。こ
の目的に使用される吸着剤としては、例えばアフイゲル
（バイオラッド社製）、セファデックス（ファルマシア
社製）がある。このようにして得られた抗EPO抗体産生
ハイブリドーマは、さらに公知の限外希釈法によりモノ
クローナル化を行う。抗EPO抗体の産生能は、前記のソ
リッドフェーズ法及び抗体吸着カラムへのEPOの吸着能
で検定を行う。この中から、安定して、モノクローナル
抗体を産生する細胞を選出する。細胞は、凍結保存が可
能であるので、必要に応じて融解し、マウスの腹腔内に
移植すれば、必要な抗体を永続的に供給することができ
る。
と特異的に結合する抗体を産生するか否かをソリッドフ
ェーズ法にて検定したのち、さらに本ハイブリドーマを
マウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から公知
の方法、例えば、硫安分画法により、タンパク質を得
る。このものは、主として免疫グロブリン（IgG）であ
る。この抗体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸
着剤をカラムに充填し、抗体吸着カラムを作成し、この
カラムに、EPO標品を通し、EPOの吸着能を調べ、ハイブ
リドーマが抗EPO抗体を産生するか否かを検定する。こ
の目的に使用される吸着剤としては、例えばアフイゲル
（バイオラッド社製）、セファデックス（ファルマシア
社製）がある。このようにして得られた抗EPO抗体産生
ハイブリドーマは、さらに公知の限外希釈法によりモノ
クローナル化を行う。抗EPO抗体の産生能は、前記のソ
リッドフェーズ法及び抗体吸着カラムへのEPOの吸着能
で検定を行う。この中から、安定して、モノクローナル
抗体を産生する細胞を選出する。細胞は、凍結保存が可
能であるので、必要に応じて融解し、マウスの腹腔内に
移植すれば、必要な抗体を永続的に供給することができ
る。
以上のようにして選出された、モノクローナル抗体EPO
抗体産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にして
マウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗体EPO抗体
を得た。
抗体産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にして
マウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗体EPO抗体
を得た。
このものを吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を作成
する。これを原料のEPO含有物、好ましくは貧血患者の
尿又はその処理物を接触させ、EPOを吸着させて、次い
で溶出すると、吸着画分として高純度EPOを効率的に取
得することができる。
する。これを原料のEPO含有物、好ましくは貧血患者の
尿又はその処理物を接触させ、EPOを吸着させて、次い
で溶出すると、吸着画分として高純度EPOを効率的に取
得することができる。
本発明において、実験動物の免疫に用いるEPOとして
は、正常人尿若しくは貧血患者尿又はその各処理物、或
は、EPO産生細胞の培養上精液又はEPO産生細胞移植植物
の体液、組織抽出液若しくは尿などから由来するものが
挙げられる。例えば、貧血患者尿を濾過、濃縮、脱塩し
て得た全尿タンパク質又はその含有液が使用される。尿
中のプロテアーゼを失活させるため予めフェノール処理
又は加熱処理を行ってもよい。
は、正常人尿若しくは貧血患者尿又はその各処理物、或
は、EPO産生細胞の培養上精液又はEPO産生細胞移植植物
の体液、組織抽出液若しくは尿などから由来するものが
挙げられる。例えば、貧血患者尿を濾過、濃縮、脱塩し
て得た全尿タンパク質又はその含有液が使用される。尿
中のプロテアーゼを失活させるため予めフェノール処理
又は加熱処理を行ってもよい。
本発明の抗体を用いてEPOを製造するには、アフィニテ
ィクロマト法の通常の技法を適用することができる。こ
の際、前記の尿処理液をカラムに通し、EPOを吸着し、
溶出液としてEPOを取得する。
ィクロマト法の通常の技法を適用することができる。こ
の際、前記の尿処理液をカラムに通し、EPOを吸着し、
溶出液としてEPOを取得する。
使用した吸着カラムは再生させて10回程度再使用するこ
とができる。再生は、例えば酢酸と食塩水との混合液を
通すことにより行われる。
とができる。再生は、例えば酢酸と食塩水との混合液を
通すことにより行われる。
以上のごとき、抗体吸着法では、モノクローナル抗EPO
抗体がEPOを特異的に吸着する結果、カラムを１回通す
だけで、溶出液としてEPOを特異的に高純度で効率よく
取得することができる。
抗体がEPOを特異的に吸着する結果、カラムを１回通す
だけで、溶出液としてEPOを特異的に高純度で効率よく
取得することができる。
EPOの純度は、液中のタンパク質のEPO活性（単位）を測
定することにより決めることができる。EPOの活性の測
定法としては、マウス胎児肝細胞を用い、赤血球系コロ
ニーを形態学的に観察するコロニー法、3H−チミジンの
DNAへの取り込み率を調べる3H−チミジン法、59Feのヘ
ムへの取り込み率を調べる59Fe法等が知られている。EP
O活性は、59Fe法又は3H−チミジン法で測定される。
定することにより決めることができる。EPOの活性の測
定法としては、マウス胎児肝細胞を用い、赤血球系コロ
ニーを形態学的に観察するコロニー法、3H−チミジンの
DNAへの取り込み率を調べる3H−チミジン法、59Feのヘ
ムへの取り込み率を調べる59Fe法等が知られている。EP
O活性は、59Fe法又は3H−チミジン法で測定される。
EPO測定の標準物質としては、フェニルヒドラジン処理
した貧血ヒッジの血清から調製されたEPO（カナダ、コ
ンノート社製エリスロポエチン ステップ３）を用いる
ことができる。
した貧血ヒッジの血清から調製されたEPO（カナダ、コ
ンノート社製エリスロポエチン ステップ３）を用いる
ことができる。
次に本発明を実施例によって説明する。
実施例１（本発明抗体の製造と使用） 〔抗原タンパク質（EPO）の調製〕 貧血患者の尿600lを限外濾過装置に通し、分子量10,00
までの低分子物質を除去することにより濃縮を行い、さ
らに水を加えて同様に濃縮することにより脱塩を行っ
た。得られた尿濃縮液20lを凍結乾燥して全尿タンパク
質粉末31.0g（EPO活性1,800,000単位/31.0g）を得た。
（なお、タンパク量は以下の操作に従いバイオラッド社
製プロテインアッセイキットにより測定した。） （第１回クロマト） この粉末を5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液に溶解し、
予め5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液で平衡化したDEAE
−セルロース充填カラムに通して、尿タンパク質を吸着
させた後、200mM NaClを含む5mMトリス−HCl（pH6.8）
緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含ま
れるタンパク質は、16.0gであり、EPO比活性は、99単位
/mgタンパク質であった。
までの低分子物質を除去することにより濃縮を行い、さ
らに水を加えて同様に濃縮することにより脱塩を行っ
た。得られた尿濃縮液20lを凍結乾燥して全尿タンパク
質粉末31.0g（EPO活性1,800,000単位/31.0g）を得た。
（なお、タンパク量は以下の操作に従いバイオラッド社
製プロテインアッセイキットにより測定した。） （第１回クロマト） この粉末を5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液に溶解し、
予め5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液で平衡化したDEAE
−セルロース充填カラムに通して、尿タンパク質を吸着
させた後、200mM NaClを含む5mMトリス−HCl（pH6.8）
緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含ま
れるタンパク質は、16.0gであり、EPO比活性は、99単位
/mgタンパク質であった。
（第２回クロマト） 得られた前記EPO活性画分を水に対し透析し、透析物を
凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を、10mM燐酸ナトリ
ウム（pH6.8）と4M NaClからなる緩衝液に溶解し、予め
10mM燐酸ナトリウム（pH6.8）と4M NaClからなる緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースCL−4B充填カラムに
通してタンパク質を吸着させた後、10mM燐酸ナトリウム
（pH7.1）と0.5M NaClからなる緩衝液で洗浄し、次いで
10mM NaOH、20重量％エチレングリコール及び6M塩酸グ
アニジンからなる混合液で溶出し、EPO活性画分を得
た。このものに含まれるタンパク質は、2.3gであり、EP
O比活性は、421単位/mgタンパク質であった。
凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を、10mM燐酸ナトリ
ウム（pH6.8）と4M NaClからなる緩衝液に溶解し、予め
10mM燐酸ナトリウム（pH6.8）と4M NaClからなる緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースCL−4B充填カラムに
通してタンパク質を吸着させた後、10mM燐酸ナトリウム
（pH7.1）と0.5M NaClからなる緩衝液で洗浄し、次いで
10mM NaOH、20重量％エチレングリコール及び6M塩酸グ
アニジンからなる混合液で溶出し、EPO活性画分を得
た。このものに含まれるタンパク質は、2.3gであり、EP
O比活性は、421単位/mgタンパク質であった。
（第３回クロマト） 得られた前記EPO活性画分を水に対して透析し、透析物
を凍結乾燥させて、粉末を得た。このものを5mM燐酸ナ
トリウム（pH6.9）緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対し
透析した。予め5mM燐酸ナトリウム（pH6.9）緩衝液で平
衡化したヒドロキシルアパタイト充填カラムに前記透析
溶液を通し、非吸着画分を得た。このものに含まれるタ
ンパク質は、672mgであり、EPO比活性は、1,240単位/mg
タンパク質であった。
を凍結乾燥させて、粉末を得た。このものを5mM燐酸ナ
トリウム（pH6.9）緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対し
透析した。予め5mM燐酸ナトリウム（pH6.9）緩衝液で平
衡化したヒドロキシルアパタイト充填カラムに前記透析
溶液を通し、非吸着画分を得た。このものに含まれるタ
ンパク質は、672mgであり、EPO比活性は、1,240単位/mg
タンパク質であった。
（第４回クロマト） 得られた前記EPO活性画分（非吸着画分）を水に対し透
析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを10
mM燐酸ナトリウム（pH6.9）と150mM NaClからなる緩衝
液に溶解した。予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセフ
ァデックスG100充填カラムに、前記溶液を通し、分子量
による分画を行い、EPO活性画分を得た。このものに含
まれるタンパク質は、83mgであり、EPO比活性は、3,000
単位/mgタンパク質であった。
析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを10
mM燐酸ナトリウム（pH6.9）と150mM NaClからなる緩衝
液に溶解した。予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセフ
ァデックスG100充填カラムに、前記溶液を通し、分子量
による分画を行い、EPO活性画分を得た。このものに含
まれるタンパク質は、83mgであり、EPO比活性は、3,000
単位/mgタンパク質であった。
（第５回クロマト） 前記EPO活性画分を水に対して透析後、透析物を凍結乾
燥して粉末を得た。このものを5mM CaCl2（pH7.0）水溶
液に溶解した後同じ水溶液に対し透析し、次いで0.1NHC
lでpH4.5に調製した。予め5mM CaCl2（pH4.5）水溶液で
平衡化したSP−セファデックス充填カラムに、前記調製
後の液を通し、吸着後、5mM酢酸カルシウム（pH4.5）緩
衝液で洗浄し、次いで20mM酢酸カルシウム（pH5.5）緩
衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含まれ
るタンパク質量は、16mgであり、EPO比活性は、5,100単
位/mgタンパク質であった。
燥して粉末を得た。このものを5mM CaCl2（pH7.0）水溶
液に溶解した後同じ水溶液に対し透析し、次いで0.1NHC
lでpH4.5に調製した。予め5mM CaCl2（pH4.5）水溶液で
平衡化したSP−セファデックス充填カラムに、前記調製
後の液を通し、吸着後、5mM酢酸カルシウム（pH4.5）緩
衝液で洗浄し、次いで20mM酢酸カルシウム（pH5.5）緩
衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含まれ
るタンパク質量は、16mgであり、EPO比活性は、5,100単
位/mgタンパク質であった。
（第６回クロマト） 前記EPO活性画分を、予めPBSで平衡化したセファデック
スG50充填カラムに通した後、前記の緩衝液で溶出してE
PO活性画分を得た。
スG50充填カラムに通した後、前記の緩衝液で溶出してE
PO活性画分を得た。
（第７回クロマト） 第５回クロマト後のEPO標品で免疫したマウスを用いて
ハイブリドーマ細胞を作成し、これより得られる抗体の
うちから、SDS電気泳動を行ったときEPO活性に近接して
低分子側に見出される免疫力の高い主要タンパク質を結
合するところの抗体を選び出し、この抗体をアフイゲル
−10（バイオラッド社製）に結合させて抗体結合吸着カ
ラムを作った。
ハイブリドーマ細胞を作成し、これより得られる抗体の
うちから、SDS電気泳動を行ったときEPO活性に近接して
低分子側に見出される免疫力の高い主要タンパク質を結
合するところの抗体を選び出し、この抗体をアフイゲル
−10（バイオラッド社製）に結合させて抗体結合吸着カ
ラムを作った。
この吸着カラムに第６回クロマトにより得られたEPO活
性画分を通し、未吸着画分としてEPO活性画分を得た。
性画分を通し、未吸着画分としてEPO活性画分を得た。
（SDS電気泳動によるEPOの処理） 得られたEPO活性画分を水に対し透析し、透析物を凍結
乾燥して粉末を得た。このものを２重量％SDSを含むト
リス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解し、常法により13重
量％ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動を行い、EPO活
性画分のゲルを切り出した。ゲルに対し、３倍量のPBS
を添加し、ゲルを磨細し、タンパク質を抽出した。抽出
液中のタンパク質は、1.2mgであり、EPO比活性は、50,0
00単位/mgタンパク質であった。抽出液を水に対し透析
後凍結乾燥して粉末を得た。
乾燥して粉末を得た。このものを２重量％SDSを含むト
リス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解し、常法により13重
量％ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動を行い、EPO活
性画分のゲルを切り出した。ゲルに対し、３倍量のPBS
を添加し、ゲルを磨細し、タンパク質を抽出した。抽出
液中のタンパク質は、1.2mgであり、EPO比活性は、50,0
00単位/mgタンパク質であった。抽出液を水に対し透析
後凍結乾燥して粉末を得た。
前記のSDS電気泳動処理後のEPO標品を抗原として使用
し、マウス（BAL B/Cマウス）に対し、次のとおり３回
の免疫を行った。
し、マウス（BAL B/Cマウス）に対し、次のとおり３回
の免疫を行った。
第１回:PBS（リン酸塩緩衝食塩水）中に精製EPOタンパ
ク質を200μg/mlで溶解し、これにフロイント完全アジ
ュバンドを混合して得たエマルジョンをマウスに対し0.
5ml（EPOタンパク質50μｇ）を腹腔内注射で投与した。
ク質を200μg/mlで溶解し、これにフロイント完全アジ
ュバンドを混合して得たエマルジョンをマウスに対し0.
5ml（EPOタンパク質50μｇ）を腹腔内注射で投与した。
第２回:PBS中に精製EPOタンパク質を100μg/mlで溶解
し、これにフロイント完全アジュバンドを混合して得た
エマルジョンを２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタ
ンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
し、これにフロイント完全アジュバンドを混合して得た
エマルジョンを２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタ
ンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
第３回:PBS中に精製EPOタンパク質50μg/mlで溶解した
後、さらに２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタンパ
ク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
後、さらに２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタンパ
ク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの脾臓細胞
を無菌的に摘出し、合成培養液RPMI−1640液と15重量％
牛胎児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中
で、脾臓組織をハサミで細断して単細胞化を行い、該混
合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI−1640
液に分散した。細胞数は、2.0×108個であった。
を無菌的に摘出し、合成培養液RPMI−1640液と15重量％
牛胎児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中
で、脾臓組織をハサミで細断して単細胞化を行い、該混
合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI−1640
液に分散した。細胞数は、2.0×108個であった。
別にマウスのミエローマ細胞（P3−NSI/1−Ag4−１）を
前記RPMI及びFCSの混合液中で培養し、増殖した細胞をR
PMI−1640液で洗浄した。細胞数は1.0×108個であっ
た。
前記RPMI及びFCSの混合液中で培養し、増殖した細胞をR
PMI−1640液で洗浄した。細胞数は1.0×108個であっ
た。
次に、前記で調製した免疫マウス脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを、RPMI−1640液に分散し、混合したの
ち、遠心し、上清を除去した。混合細胞を、ポリエチレ
ングリコール1500の50重量％溶液中で、細胞融合させた
後、融合細胞群をHT培養液（ヒポキサンチンとチミジン
及び15重量％牛胎児血清を含むRPMI−1640液）に混合
し、混合液を３枚の96穴マイクロタイタープレートにま
いて、２日目以降、HAT培地（ヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン及び15重量％牛胎児血清を含むRPMI
−1640液）を添加して各穴で２週間培養してHAT選択を
行った。増殖したハイブリドーマ細胞を264穴において
確認した。
ローマ細胞とを、RPMI−1640液に分散し、混合したの
ち、遠心し、上清を除去した。混合細胞を、ポリエチレ
ングリコール1500の50重量％溶液中で、細胞融合させた
後、融合細胞群をHT培養液（ヒポキサンチンとチミジン
及び15重量％牛胎児血清を含むRPMI−1640液）に混合
し、混合液を３枚の96穴マイクロタイタープレートにま
いて、２日目以降、HAT培地（ヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン及び15重量％牛胎児血清を含むRPMI
−1640液）を添加して各穴で２週間培養してHAT選択を
行った。増殖したハイブリドーマ細胞を264穴において
確認した。
前記で得た264種類のハイブリドーマより、特定の細
胞、すなわち精製EPO標品と特異的に結合しうる抗体を
産生するハイブリドーマを選び出すために、ビオチン−
アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法により、
スクリーニングを行った。その結果、目的に適合したも
のとして、19種類の細胞が選出され、そのうち７種類が
安定的に抗体産生を行うことを認めた。
胞、すなわち精製EPO標品と特異的に結合しうる抗体を
産生するハイブリドーマを選び出すために、ビオチン−
アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法により、
スクリーニングを行った。その結果、目的に適合したも
のとして、19種類の細胞が選出され、そのうち７種類が
安定的に抗体産生を行うことを認めた。
前記７種類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作成し、
EPO活性の吸着能を検定し、抗EPO抗体産生細胞の選択を
行った。
EPO活性の吸着能を検定し、抗EPO抗体産生細胞の選択を
行った。
すなわち、それぞれの細胞について、７匹のマウスに対
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り５×106個腹腔
内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を採
取し、これを45重量％飽和硫安水溶液で硫安分画に付
し、それぞれの種類の細胞について抗体としてIgG画分
を40〜60mg得た。前記で得られたIgG画分をアフィゲル1
0（バイオラッド社製）と結合し、抗体吸着カラムを作
成した。すなわち、アフィゲル10をガラスフィルター上
で氷水冷却下イソプロパノールで洗浄し、さらに氷水で
３回洗浄しゲルを回収した。このゲルと、前記で得た抗
体を含む液（0.2M NaHCO3 pH8.3−0.3M Nacl）とを等
容量で混合し、４℃で５時間攪拌しながら、結合反応を
行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した。このものを0.
1M NaHCO3と0.15M NaClの混合液で２回洗浄後、0.1Mエ
タノールアミン−塩酸塩（pH8）と室温で60分間よく混
合して抗体結合ゲルを得た。このゲルをカラムに充填し
て、抗体吸着カラムを作成した（７種類のハイブリドー
マにつき、各１本、合計７本）。ここで得た７本の抗体
吸着カラムに対して、前記精製EPO標品を用いEPO活性吸
着能を検定した。
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り５×106個腹腔
内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を採
取し、これを45重量％飽和硫安水溶液で硫安分画に付
し、それぞれの種類の細胞について抗体としてIgG画分
を40〜60mg得た。前記で得られたIgG画分をアフィゲル1
0（バイオラッド社製）と結合し、抗体吸着カラムを作
成した。すなわち、アフィゲル10をガラスフィルター上
で氷水冷却下イソプロパノールで洗浄し、さらに氷水で
３回洗浄しゲルを回収した。このゲルと、前記で得た抗
体を含む液（0.2M NaHCO3 pH8.3−0.3M Nacl）とを等
容量で混合し、４℃で５時間攪拌しながら、結合反応を
行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した。このものを0.
1M NaHCO3と0.15M NaClの混合液で２回洗浄後、0.1Mエ
タノールアミン−塩酸塩（pH8）と室温で60分間よく混
合して抗体結合ゲルを得た。このゲルをカラムに充填し
て、抗体吸着カラムを作成した（７種類のハイブリドー
マにつき、各１本、合計７本）。ここで得た７本の抗体
吸着カラムに対して、前記精製EPO標品を用いEPO活性吸
着能を検定した。
すなわち、EPO標品をPBSに溶解し、この液を予めPBSで
平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は0.2M酢酸と
0.15M NaClとの混合液で行い、未吸着画分及び溶出画分
のEPO活性を測定した。ここで得た７種のカラムのうち
３種類についてEPO活性の吸着を認めた。
平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は0.2M酢酸と
0.15M NaClとの混合液で行い、未吸着画分及び溶出画分
のEPO活性を測定した。ここで得た７種のカラムのうち
３種類についてEPO活性の吸着を認めた。
前記３種類の抗EPO抗体産生ハイブリドーマについて、
常法に従い、限外希釈法によりクローニングを行った。
常法に従い、限外希釈法によりクローニングを行った。
すなわち、ハイブリドーマ細胞50個と４週令BALB/Cマウ
スの胸腺より常法により調製した胸腺細胞108をRPMI−1
640液と15重量％FCSとの混合液10mlに分散し、96穴マイ
クロタイタープレートの各穴に0.1mlずつまき、５日目
及び12日目にRPMI−1640液と15重量％FCSの混合液（培
養液）を添加し増殖したハイブリドーマ細胞について、
前記と同様にしてソリッドフェーズ法による抗EPO抗体
産生細胞のスクリーニングを行い、さらに、EPO吸着能
による抗EPO抗体産生細胞の選択を行いクローニングを
行った。このようにして、前記３種類の抗EPO抗体産生
ハイブリドーマより、それぞれ細胞株Ｅ−１、Ｅ−２、
Ｅ−３を樹立した。
スの胸腺より常法により調製した胸腺細胞108をRPMI−1
640液と15重量％FCSとの混合液10mlに分散し、96穴マイ
クロタイタープレートの各穴に0.1mlずつまき、５日目
及び12日目にRPMI−1640液と15重量％FCSの混合液（培
養液）を添加し増殖したハイブリドーマ細胞について、
前記と同様にしてソリッドフェーズ法による抗EPO抗体
産生細胞のスクリーニングを行い、さらに、EPO吸着能
による抗EPO抗体産生細胞の選択を行いクローニングを
行った。このようにして、前記３種類の抗EPO抗体産生
ハイブリドーマより、それぞれ細胞株Ｅ−１、Ｅ−２、
Ｅ−３を樹立した。
前記のクローニングにより得た、抗EPO抗体産生細胞株
（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）を用いて、抗体産生を行っ
た。すなわち、前記と同様に、マウスの腹腔内で抗体産
生をさせ、45重量％硫安分画によりIgG画分を得た。各
細胞株IgGについてマウス20匹を用い、500mgのモノクロ
ーナル抗体を得た。
（Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）を用いて、抗体産生を行っ
た。すなわち、前記と同様に、マウスの腹腔内で抗体産
生をさせ、45重量％硫安分画によりIgG画分を得た。各
細胞株IgGについてマウス20匹を用い、500mgのモノクロ
ーナル抗体を得た。
前記と同様の操作でIgGをアフィゲル10との結合を行わ
せ、各モノクローナル抗体について50mlの抗体結合ゲル
を得た。
せ、各モノクローナル抗体について50mlの抗体結合ゲル
を得た。
このゲルをカラムに充填し、吸着カラムを作成した。
原料液を調製するため本実施例の抗原タンパク質の調製
の冒頭で記載した限外濾過装置を用いて調製した全尿タ
ンパク粉末50mg（2.900単位）を２％SDSを含むPBS10ml
に溶解し、常法で処理し、外液40lのPBSに対し、１夜透
析を行い、遠心後、上清液を得、原料液10mlを得た。
の冒頭で記載した限外濾過装置を用いて調製した全尿タ
ンパク粉末50mg（2.900単位）を２％SDSを含むPBS10ml
に溶解し、常法で処理し、外液40lのPBSに対し、１夜透
析を行い、遠心後、上清液を得、原料液10mlを得た。
前記で作成した抗体吸着カラム（0.8cm×4cm床容量2m
l、Ｅ−１）にPBS20mlを20ml/hrで流し平衡化し、次い
で0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液50mlを同じ速度で流
し、洗浄した後、さらにPBS20mlを同様に流し平衡化し
た。
l、Ｅ−１）にPBS20mlを20ml/hrで流し平衡化し、次い
で0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液50mlを同じ速度で流
し、洗浄した後、さらにPBS20mlを同様に流し平衡化し
た。
このように前処理した吸着カラムに、２％SDSを含むPBS
に溶解後、常法で処理し透析して調製した原料液10mlを
5ml/hrの流速で通した。次に、PBS20ml、0.5M NaClを含
む10mMリン酸緩衝液20ml、0.15M NaCl20mlの順に20ml/h
rでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混
合液20mlを5ml/hrの流速で流し、溶出液として高純度の
EPOを含む液を得た。
に溶解後、常法で処理し透析して調製した原料液10mlを
5ml/hrの流速で通した。次に、PBS20ml、0.5M NaClを含
む10mMリン酸緩衝液20ml、0.15M NaCl20mlの順に20ml/h
rでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混
合液20mlを5ml/hrの流速で流し、溶出液として高純度の
EPOを含む液を得た。
本液中のEPO活性は1,160単位であった。これを原料液の
それの2,900単位に対比すると、回収率は40％であっ
た。また、本液中のEPO比活性は45,000単位/mgタンパク
質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比
すると、EPO純度は、780倍向上したことがわかる。
それの2,900単位に対比すると、回収率は40％であっ
た。また、本液中のEPO比活性は45,000単位/mgタンパク
質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比
すると、EPO純度は、780倍向上したことがわかる。
実施例２（本発明抗体の製造と使用） 実施例１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体吸着カ
ラム（0.8cm×4cm床容量2ml、Ｅ−２）を用いて、次の
とおり操作を行った。原料を調製するため実施例１と同
様に、限外濾過装置を用いて調製した全尿タンパク質粉
末5mg（2,900単位）を２重量％SDSを含むPBS10mlに溶解
し、100℃３分間加熱処理後外液10lのPBSに対し、１夜
透析を行い、遠心後、上清液10mlを得た。本溶液をPBS
で５倍希釈した後、実施例１と同様にして前処理を行っ
た前記抗体吸着カラムに対し、5ml/hrの流速で通した。
次に、PBS20ml、0.5M NaClを含む10mMリン酸緩衝液20m
l、0.15M NaCl20mlの順に20ml/hrでカラムを洗浄した
後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液20mlを5ml/hrで流
し、溶出液として高純度のEPOを含む液を得た。本液中
のEPO活性は2,600単位であった。これを原料液のそれの
2,900単位に対比すると、回収率90％であった。また、
本液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパク質であ
り、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比する
と、EPO純度は、約1,000倍向上したことがわかる。
ラム（0.8cm×4cm床容量2ml、Ｅ−２）を用いて、次の
とおり操作を行った。原料を調製するため実施例１と同
様に、限外濾過装置を用いて調製した全尿タンパク質粉
末5mg（2,900単位）を２重量％SDSを含むPBS10mlに溶解
し、100℃３分間加熱処理後外液10lのPBSに対し、１夜
透析を行い、遠心後、上清液10mlを得た。本溶液をPBS
で５倍希釈した後、実施例１と同様にして前処理を行っ
た前記抗体吸着カラムに対し、5ml/hrの流速で通した。
次に、PBS20ml、0.5M NaClを含む10mMリン酸緩衝液20m
l、0.15M NaCl20mlの順に20ml/hrでカラムを洗浄した
後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液20mlを5ml/hrで流
し、溶出液として高純度のEPOを含む液を得た。本液中
のEPO活性は2,600単位であった。これを原料液のそれの
2,900単位に対比すると、回収率90％であった。また、
本液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパク質であ
り、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対比する
と、EPO純度は、約1,000倍向上したことがわかる。
実施例３（本発明抗体の製造と使用） 実施例１で作成した抗体結合ゲルを充填した抗体吸着カ
ラム（2cm×6.4cm、床容量20ml、Ｅ−３）を作成し、実
施例１と同様にして、前処理を行い、使用した。原料液
は、実施例２と同様に、全尿タンパク質粉500mg（29,00
0単位）を２重量％SDSを含むPBS50mlに溶解し、100℃３
分間加熱処理後、外液40lに対し、１夜透析を行い、遠
心後、上清液50mlを得、PBSで５倍希釈した。本原料液
を前記処理ずみ抗体吸着カラムに対し、20ml/hrの流速
で通した。次いで、PBS200ml、0.5M NaClを含む10mMリ
ン酸緩衝液200ml、0.15M NaCl200mlの順に、100ml/hrで
カラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液
200mlを20ml/hrで流し、溶出液として高純度のEPOを含
む液を得た。
ラム（2cm×6.4cm、床容量20ml、Ｅ−３）を作成し、実
施例１と同様にして、前処理を行い、使用した。原料液
は、実施例２と同様に、全尿タンパク質粉500mg（29,00
0単位）を２重量％SDSを含むPBS50mlに溶解し、100℃３
分間加熱処理後、外液40lに対し、１夜透析を行い、遠
心後、上清液50mlを得、PBSで５倍希釈した。本原料液
を前記処理ずみ抗体吸着カラムに対し、20ml/hrの流速
で通した。次いで、PBS200ml、0.5M NaClを含む10mMリ
ン酸緩衝液200ml、0.15M NaCl200mlの順に、100ml/hrで
カラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaClとの混合液
200mlを20ml/hrで流し、溶出液として高純度のEPOを含
む液を得た。
本液中のEPO活性は、25,000単位であった。これを原料
液のそれの29,000単位に対比すると、回収率86％であっ
た。また、本液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパ
ク質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対
比すると、EPO純度は、約1,000倍向上したことがわか
る。
液のそれの29,000単位に対比すると、回収率86％であっ
た。また、本液中のEPO比活性は、60,000単位/mgタンパ
ク質であり、原料液のそれの58単位/mgタンパク質と対
比すると、EPO純度は、約1,000倍向上したことがわか
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 新実験化学講座20 生物化学（Ｉ）Ｐ. 83〜88（社団法人日本化学会編 昭和53年 ６月20日丸善株式会社発行)
Claims (3)
- 【請求項１】ｉ）部分精製エリスロポエチンをソジウム
ドデシル サルフェート（SDS）電気泳動処理した際
に、エリスロポエチンに近接して低分子側に泳動される
画分に対して結合するモノクローナル抗体を作製し、i
i）このモノクローナル抗体を用いたカラムクロマトに
より、部分精製されたエリスロポエチンをさらに精製し
てこのエリスロポエチンに近接して泳動される画分を除
き、iii）このエリスロポエチンに近接して泳動される
画分を除いたエリスロポエチンをさらにSDS電気泳動処
理してエリスロポエチンに相当する画分を切り出してエ
リスロポエチンを抽出し、iv）この抽出したエリスロポ
エチンで実験動物を免疫し、その脾臓細胞とミエローマ
細胞とを細胞融合させて得られたハイブリード細胞から
産生され、SDS処理されたエリスロポエチンを特異的に
吸着する性質を示すエリスロポエチン製造用抗エリスロ
ポエチンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】部分精製エリスロポエチンが、貧血患者の
尿を限外濾過して濃縮し、アフィニティカラムクロマト
処理して得られるエリスロポエチンである特許請求の範
囲１に記載されるモノクローナル抗体。 - 【請求項３】比活性約60,000単位/mgタンパク質の高純
度エリスロポエチンを得ることのできる特許請求の範囲
１に記載されるモノクローナル抗体。
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-
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Non-Patent Citations (1)
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| 新実験化学講座２０生物化学（Ｉ）Ｐ．８３〜８８（社団法人日本化学会編昭和５３年６月２０日丸善株式会社発行） |
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