DE3346336A1 - Verfahren zur herstellung von erythropoetin - Google Patents
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Description
Anmelder: SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO., LTD.
1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-ku, Sapporo, Hokkaido, Japan
Verfahren zur Herstellung von Erythropoetin
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines in hohem Maße reinen Erythropoetins durch wirksames
Aufsammeln von Erythropoetin aus einem Erythropoetin enthaltenden Material mit einer Affinitätschromatographie,
wobei ein Adsorptionsmittel mit einem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper verwendet wird.
Erythropoetin (hier im folgenden abgekürzt als EPO bezeichnet) ist bekannt als ein Beschleunigungsfaktor für Erythrozytbildung,
und EPO ist eine Art von Hormonen, die auf die erythrozytären Stammzellen in dem Knochenmark wirkt, um deren
Differenzierung in die erythrozytären Zellen zu beschleunigen,
Obgleich die chemische Struktur von EPO noch nicht vollständig geklärt ist, ist EPO selbst ein saures Glycoproteid mit
einem Molekulargewicht von 30.000 bis 40.000, das vorwiegend in den Niere erzeugt wird und in weitem Maße als ein
Heilmittel für Anämiepatienten, für postoperative Patienten und Patienten, die Homo-Dialyse nach Nierenexstirpation
erhalten, angewendet werden kann.
Natürlich wird die Bildung von EPO in einem lebenden Körper durch das Gleichgewicht zwischen dem Bedarf und der Versorgung
mit Sauerstoff in dem lebenden Körper beeinflußt, und demzufolge wird die Bildung von EPO beschleunigt, wenn
sich der lebende Körper in einem Zustand der Hypoxie befindet, und im Gegensatz dazu, wird die Bildung von EPO herabgesetzt,
wenn sich der lebende Körper in einem Zustand des zu hohen Sauerstoffgehaltes befindet. Beispielsweise wird in
einem anämischen Patienten die Bildung von EPO beschleunigt und als Folge davon EPO in seinen Urin ausgeschieden.
Es ist bereits ein Verfahren zum Isolieren von EPO mit einer stabilisierten Aktivität aus dem menschlichen Urin, der EPO
enthält, bekannt (es wird z.B. auf das US-Patent No. 3,865,801 verwiesen), bei dem eine Lösung des Roh-EPO, die von dem
das EPO enthaltenden menschlichen Urin in einer phosphätgepufferten
Salzlösung erhalten wird, als eine Originaloder Ursprungsflüssigkeit verwendet wird, zu der Natriump-Aminosalicylat
hinzugegeben wird, die gemischte Lösung mit Phenol extrahiert wird und der Extrakt gegen die phosphatgepufferte
Salzlösung dialysiert wird, woraufhin das Aufsammeln von EPO aus dem Dialysat folgt.
Da jedoch der Gehalt an EPO in üblichem menschlichem Urin extrem niedrig ist und in der Größenordnung von etwa 0,01
bis 0,02 Gew.-% des gesamten Proteins in dem Urin liegt, ist es jedoch schwierig, EPO durch das beschriebene bekannte
RAH ORIGiNAL
Verfahren effektiv herzustellen, und insbesondere ist das
Verfahren kein Verfahren für die Praxis als ein Verfahren zum Herstellen von EPO zur Anwendung als das oben angegebene
Heilmittel. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß EPO zur Zeit nur als ein chemisches Reagenz hergestellt wird.
Als Ergebnis der Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden
Erfindung zum effektiven Aufsammeln von EPO mit einem hohen Reinheitsgrad aus verschiedenen Materialien, die EPO
enthalten, gelang es den Erfindern, EPO mit einer hohen Reinheit in wirkungsvoller Weise aus dem EPO enthaltenden
Material aufzusammeln, indem eine Säulenchromatographie angewendet wurde, bei der ein Adsorptionsmittel mit einem
monoklonen Anti-EPO-Antikörper verwendet wurde, und dies
führte zu der vorliegenden Erfindung.
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum wirksamen Abtrennen von EPO von einem Material,
das EPO enthält, zu schaffen und die hoch-gereinigte EPO-Zubereitung zu gewinnen. Merkmale und Gegenstände der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Der Ausdruck "EPO enthaltendes Material" bezeichnet, wie er
hier verwendet wird, den Urin normaler Personen, den Urin von anämischen Patienten, das rohe davon erhaltene Urin-Erythropoetin,
die überstehende Flüssigkeit der Kultur von den EPO erzeugenden Zellen, die Körperflüssigkeit von einem
Tier, dem die EPO erzeugenden Zellen transplantiert worden
sind, das Extraktfluid der Gewebe von dem der Transplantation
unterworfenen Tier und Urin desselben.
Bei der vorliegenden Erfindung werden hauptsächlich die Fälle, bei denen der Urin des anämischen Patienten als das EPO
enthaltende Material verwendet wurde, im folgenden erklärt,
es soll hierbei jedoch bemerkt werden, daß die Quelle für EPO gemäß der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt
ist.
Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von in hohem Maße reinem Erythropoetin
aus einem Erythropoetin enthaltenden Material, da,s folgendes umfaßt:
in Kontaktbringen des Erythropoetin enthaltenden Materials mit einem Adsorptionsmittel mit monoklonem Anti-Erythropoetin-Antikörper,
wobei dieser monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper von Hybridoma hergestellt ist und dieses Hybridoma
durch Zellverschmelzung einer Myelomzelle und einer Milzzelle eines Experimentier-Tieres, das durch Erythropoetin
immunisiert worden ist, erhalten wird, Adsorbieren dieses Erythropoetins auf dem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper
in dem Adsorptionsmittel, Auswaschen des Erythropoetins von dem Adsorptionsmittel
und
Aufsammeln des ausgewaschenen Erythropoetins.
Aufsammeln des ausgewaschenen Erythropoetins.
Der monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper (hier im folgenden als monokloner Antikörper bezeichnet), der zum Gebundenwerden
an das Adsorptionsmittel bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird von den Hybridomazellen hergestellt,
die durch ZeI!verschmelzung einer gezüchteten oder
gebildeten Myelomzelle (oder von Myelomzellen) und einer Zelle (oder Zellen) der Milz eines Experimentier-Tieres
wie einer Maus oder einer Ratte erhalten werden, die durch Verabreichen von EPO als einem Antigen immunisiert worden
ist, welches von dem Urin, z.B. dem Urin eines anämischen Patienten, aufgesammelt worden ist und das aufgesammelte
EPO gereinigt worden ist. Die Zellverschmelzung oder Zellfusion wird vorzugsweise zwischen den Zellen von einem Tier
BAD ORIGINAL
oder Tieren der gleichen Art durchgeführt. Die Zellen der Milz, die hier verwendet werden (hauptsächlich B-Zellen),
werden von der Milz eines Experimentier-Tieres wie einer Maus nach etwa 3 Tagen der letzten Immunisierung derselben erhalten,
wozu intraperitoneale Injektion einer Emulsion verwendet wird, die durch Lösen des gereinigten EPO in einer wässrigen
phosphat-gepufferten Salzlösung (sogenannte PBS von englisch "phosphate-buffered saline solution") und Beimischen
von Freund1schem Adjuvans zu der gelösten Lösung hergestellt
worden ist. Zusätzlich wird es bei der Immunisierung des Tieres bevorzugt, die Injektion in einem regelmäßigen
Intervall, zum Beispiel von 2 Wochen, zu wiederholen, um die Immunisierung ausreichend durchzuführen.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Myelomzelle ist eine Art von bösartigen Tumorzellen und besitzt eine
große Vermehrungsgeschwindigkeit. Als Myelomzellen von Mäusen können beispielsweise die Stämme wie P2~X63-Ag8,
P3-NSI/1-Ag 4-1, X 63-Ag 8 653 und dergleichen nach Kultivierung
zur Vermehrung verwendet werden.
Die Zellverschmelzung der Zelle(n) der Milz und der Myelomzelle
(n) kann durch das allgemein bekannte Verfahren wie folgt durchgeführt werden:
Das Gewebe der Milz wird in kleine Stücke zerschnitten in einer Mischung von dem Serum von Rinderföt (hier im folgenden
als FCS bezeichnet) und RPMI 1640 synthetisches Kulturmedium (hier im folgenden als RPMI 1640 Medium bezeichnet),
wozu Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100μg/ml), 2 mM
Glutamin und 1 mM Pyruvinsäure hinzugegeben worden sind, und es wird weiter abgetrennt oder in kleine Zellen zer*
strömt. Die erhaltenen einzelnen Zellen werden in das RPMI 1640 Medium dispergiert, und die Zellen von dem Myelom
werden der Dispersionslösung beigemischt. Nachdem die Mischung
dem Zentrifugieren unterworfen worden ist/ wird die gebildete überstehende Flüssigkeit dekantiert, und ein
wässriges 50 Gew.-% Polyäthylenglycol 1500 wird zu der Mischung aus den Zellen als ein Verschmelzungs- oder Fusionseinleitungsmittel
hinzugegeben, um die Zellverschmelzung durchzuführen.
In dem nächsten Schritt werden von der Mischung aus Zellen, die der Zellverschmelzung unterworfen worden waren, Hybridomazellen
durch das allgemein bekannte HAT-Auswahlverfahren
ausgewählt. HAT-Auswahl kann durchgeführt werden, indem eine Mikrotiterplatte verwendet wird. Die Mischung der
Zellen, die der Zellverschmelzung unterworfen worden waren, werden beispielsweise auf einer Mikrotiterplatte, die mit
Ver—
96 Bohrungen oder/tiefungen versehen ist, verteilt und verstreut
und in einem HAT(Hypoxanthin-aminopterin-thymidin) Kulturmedium etwa 2 Wochen lang gezüchtet. Nachdem die Vertiefungen
ausgesucht und festgestellt worden sind, in denen die der Zellverschmelzung unterworfenen Zellen wachsen und
wuchern, ohne abzusterben, werden die Hybridomazellen von diesen Vertiefungen aufgesammelt.
Das Verfahren zum Auswählen der Zellen mit einer Fähigkeit zur Erzeugung der monoklonen Anti-EPO-Antikörper von den
erhaltenen HybridomazeIlen wird im folgenden beschrieben:
Nachdem die Aktivität der Hybridomazellen durch Festphaseverfahren,
ob ein Antikörper zu EPO erzeugt wird, geprüft und festgestellt worden ist, werden die geprüften
Hybridomazellen in die Bauchhöhle einer Maus transplantiert, um Aszitesfluid in der Maus zu erzeugen, und es werden
Proteine von dem aufgesammelten Aszitesfluid durch ein allgemein bekanntes Verfahren wie z.B. ein Fraktionierverfahren
mit Ammoniumsulfat aufgesammelt. Die aufgesammelten Pro-
BAD ORIGiNiAL
4 9 ft «
teinebestehen hauptsächlich aus einem Immunoglobulin
(IgB). Die hauptsächlich IgB als einen Antikörper enthaltenden Proteine werden an ein Adsorptionsmittel wie AFPI-GEL
(hergestellt von Bio-RAD Co.) oder SEPHADEX (hergestellt
von Farmacia Co. ) gebunden, um ein Adsorptionsmittel mit
Antikörper zu erhalten. Das erhaltene Adsorptionsmittel mit dem darauf gebundenen Antikörper wird in eine Säule gepackt,
und dann wird durch Hindurchleiten einer authentischen Zubereitung von EPO durch die vorbereitete Säule und
Prüfen, ob die vorbereitete Säule die Fähigkeit zur Adsorption von EPO besitzt, untersucht, ob die erhaltenen Hybridomazellen
die Fähigkeit besitzen, den Anti-EPO-Antikörper zu erzeugen. Dann werden die den Anti-EPO-Antikörper erzeugenden
Hybridomazellen der Monoklonisierung (dem Monoklonen) durch die allgemein bekannten Grenzverdünnungsverfahren
unterworfen, und die monokIonisierten Hybridomazellen
werden auf ihre stabilisierte Produktionsfähigkeit des monoklonen Antikörpers durch das Feste-Phase-Verfahren
und das Adsorptionsverfahren untersucht, wobei die Antikörper adsorbiert habende Säule für das Prüfen der Adsorptionsfähigkeit
für EPO verwendet wird. Der erforderliche Antikörper kann kontinuierlich zu irgendeiner Zeit durch
Schmelzen der gefrorenen Zellen, Kultivieren der Zellen und Transplantieren der Zellen in die Bauchhöhle einer Maus
geliefert werden, da die erhaltenen Hybridomazellen in einem gefrorenen Zustand konserviert werden können.
Der monoklone Anti-EPO-Antikörper, der durch Transplantieren
der monoklonisierten Zellen mit einer Fähigkeit zur Erzeugung des Anti-EPO-Antikörpers in die Bauchhöhle einer
Maus nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird, wird gereinigt und danach wird der gereinigte
monoklone Anti-EPO-Antikörper an ein Adsorptionsmittel wie AFFI-GEL oder SEFADEX gebunden, um ein spezifisches
Adsorptionsmittel herzustellen, an das der Antikörper ge-
bunden ist. Das spezifische Adsorptionsmittel wird zum Adsorbieren
von EPO von EPO enthaltenden Materialien verwendet, um EPO zu gewinnen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird EPO von Materialien,
die EPO enthalten, durch ein immuno-adsorptionsmittel-chromatographisches
Verfahren aufgesammelt, wobei eine Säule verwendet wird, die mit dem spezifischen Adsorptionsmittel
bepackt ist, an das der monoklone Anti-EPO-Antikörper gebunden ist, wie es vorstehend beschrieben wurde. Als das
EPO enthaltende Material, das als das Ausgangsmaterial bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, können, wie vorstehend beschrieben, Urin von einem anämischen Patienten sowie Urin von normalen Personen,
die überstehende Flüssigkeit, die von dem Kulturmaterial von EPO-erzeugenden Zellen, Körperfluid von Tieren, denen
die EPO-erzeugenden Zellen transplantiert worden sind, Extraktflüssigkeit der Gewebe des genannten Tieres und der
Urin desselben außer dem Urin eines Anämiepatienten genannt werden.
Bei der Behandlung eines dieser EPO enthaltenden Materialien mit dem Adsorptionsmittel, an das der monoklone Anti-EPO-AntikÖrper
gebunden worden ist, wird der Urin, z.B. der Urin eines anämischen Patienten, filtriert und das Piltrat
wird kondensiert und einer Entsalzungsbehandlung oder SDS-Behandlung unterworfen, und dann wird die so behandelte
Probe auf das Adsorptionsmittel der Säule aufgebracht. Zusätzlich kann zum Inaktivmachen der Protease in dem Urin
der Urin mit Phenol behandelt werden oder der Erhitzung vor dem Aufbringen auf das Adsorptionsmittel der Säule unterworfen
werden.
BAD
ma η ' *» β ρ· it
3348336
/Μ
Das vorbehandelte EPO enthaltende Material, wird, wie vorstehend erwähnt, bei der vorliegenden Erfindung durch die
Säule geleitet, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das der monoklone Anti-EPO-Antikörper gebunden worden
ist, und als eine Folge davon adsorbiert der Antikörper selektiv EPO. Deshalb ist es nicht notwendig, den Schritt
des Hindurchleitens zu wiederholen, und auf dem Adsorptionsmittel adsorbiertes EPO wird ausgewaschen, indem eine
Wasch- oder Spüllösung wie z.B. eine Mischung aus wässriger 0,2M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15M Natriumchloridlösung
durch die Säule geleitet wird, und dann kann das Eluat von EPO in wirkungsvoller Weise und mit einer
hohen Reinheit aufgesammelt werden.
Nach dem Auswaschen von EPO kann das Adsorptionsmittel in der Säule zur Regenerierung behandelt werden, und das regenerierte
Adsorptionsmittel kann etwa 10 Mal wiederverwendet werden« Die Behandlung von dem einmal verwendeten Adsorptionsmittel
für die Regenerierung wird durchgeführt, indem eine Lösung wie eine gemischte Lösung von Essigsäure und
einer wässrigen Natriumchloridlösung durch die mit dem zu regenerierenden Adsorptionsmittel bepackte Säule geleitet
wird.
Die Reinheit des durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen EPO kann abgeschätzt werden, indem die EPO-Aktivitat(Einheit
engl.iünit) des Proteins in dem Eluat gemessen wird. Die EPO-Aktivität
wird durch eines der allgemein bekannten Verfahren gemessen, z.B. durch das Kolonieverfahren durch morpholo-
3 gische Beobachtung der erythrozytären Kolonien, das H-Thymidinverfahren
durch Prüfen der Aufnahme von H-Thymidin
59
in DNA der Kolonien und das Fe-Verfahren durch Prüfen
in DNA der Kolonien und das Fe-Verfahren durch Prüfen
59
der Aufnahmerate von Fe an Harn der Kolonien. Zusätzlich kann als Vergleichs- oder Standardsubstanz für die Messung
der Aufnahmerate von Fe an Harn der Kolonien. Zusätzlich kann als Vergleichs- oder Standardsubstanz für die Messung
OOHUJOU
- ve -
von EPO/EPO (Erythropoetin Step 3, hergestellt von Connort
Co. , Caitada) verwendet werden, das von dem Serum zubereitet
ist, welches von einem mit Phenylhydrazin behandelten anämischen Schaf aufgesammelt worden ist.
Durch die vorliegende Erfindung ist es also möglich, wirtschaftlich
EPO mit einer hohen Reinheit aus Materialien herzustellen, die eine sehr kleine Menge an EPO enthalten.
Weiterhin ist der Antikörper, der an das Adsorptionsmittel, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gebunden
ist, der monoklone Antikörper und demzufolge ist es möglich, den Antikörper mit der gleichen Eigenschaft zu
erhalten. Da es schließlich möglich ist, den Antikörper in einem stabilen Zustand zu erhalten, kann festgestellt werden,
daß die vorliegende Erfindung ein praktisches Verfahren zur Herstellung des gereinigten Erythropoetin liefert.
Die Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf die folgenden, die Erfindung nicht einschränkenden Beispiele
erläutert.
(I) Zubereitung des monoklonen Anti-EPO-Antikörpers
(1) Zubereitung von EPO für die Verwendung als ein
Antigen zur Erzeugung des monoklonen Anti-EPO-Antikörpers:
600 Liter von einem anämischen Patienten aufgesammelter Urin wurden durch eine Apparatur zum Ultra-Filtrieren
geleitet, um Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht von bis zu 10.000 für das Molekulargewicht zu entfernen,
und dann wurde der hindurchgeleitete Urin kondensiert. Der kondensierte Urin wurde mit einer geeigneten Menge
BAD ORIGINAL
Wasser verdünnt, und die Mischung wurde auf die gleiche Weise
wie oben kondensiert, um Entsalzung durchzuführen. 20 Liter des so erhaltenen Kondensats von Urin wurden dem Gefriertrocknen
unterworfen, um 31,0 g an gesamtem Protein im Urin in Form eines Pulvers zu erhalten, das eine EPO-Aktivität
von 1800000 Einheiten (Units)/31,0 g zeigte (EPO-Aktivität wurde hierbei im folgenden durch die Proteinbestimmungsausrüstung
, hergestellt von Bio-Rad Co., bestimmt).
Das erhaltene Pulver des Gesamt-Urinproteins wurde durch
Säulenchromatographie und SDS-Elektrophorese folgendermaßen gereinigt;
Das erhaltene Pulver des Gesamt-Urinproteins wurde in einer 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten Lösung (pH 6,8)
gelöst und die Lösung des Pulvers wurde durch eine Säule geleitet, die mit DEAE-Zellulose (Diäthylaminoäthylzellulose)
bepackt war, die vorher mit der 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten
Lösung (pH 6,8) äquilibriert worden war. Das Urinprotein in der Urinlösung wurde an der Säule adsorbiert,
und das adsorbierte Urinprotein wurde durch eine 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferte Lösung, die 200 mM
Natriumchlorid (pH 6,8) enthielt, ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität zeigte. Die Fraktion
enthielt 16,0 g Protein, und die spezifische Aktivität der Fraktion betrug 99 Einheiten (Units)/mg Protein.
Die Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der ersten Stufe erhalten worden war, wurde der Dialyse gegen Wasser
unterworfen, und das Dialysat wurde gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Nach Auflösen des
erhaltenen pulverförmigen Materials in einer gepufferten
AU-
Lösung, die 10 mM Natriumphosphat (pH 6,8) und 4M Natriumchlorid
enthielt, wurde die Lösung aus dem pulverförniigen Material durch eine Säule geleitet, die mit PHENYLSepharose
CL-4B bepackt worden war, die vorher mit einer gepufferten Lösung (pH 6,8), die 10 mM Natriumphosphat und 4M Natriumchlorid
enthielt, äquilibriert worden war, um das Protein darauf zu adsorbieren. Das adsorbierte Protein wurde mit
einer gepufferten Lösung (pH 7,1), die 10 mM Natriumphosphat und 0,5M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und dann mit
einer Mischung ausgewaschen, die aus einer wässrigen 10 mM Natriumhydroxidlösung, einer wässrigen 20 %igen Äthylenglycollösung
und einer wässrigen 6M Guanidinhydrochloridlösung bestand, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität
aufwies. Die Fraktion enthielt 2,3 g Protein, und die spezifische EPO-Aktivität der Fraktion war 421 Einheiten
(Units)/mg Protein.
Die Fraktion, die EPO-Aktivität aufwies und in der zweiten Stufe erhalten worden war, wurde der Dialyse gegen Wasser
unterworfen, und dann wurde das pulverförmige Material von dem Dialysat der Fraktion durch Gefriertrocknen erhalten.
Das erhaltene pulverförmige Material wurde in 5 mM natriumphosphat-gepufferter
Lösung (pH 6,9) gelöst, und die Lösung aus dem pulverförmiger! Material wurde gegen die gleiche
gepufferte Lösung dialysiert. Das erhaltene Dialysat wurde durch eine Säule geleitet, die mit Hydroxyapatit bepackt
war, das durch 5 mM natriumphosphat-gepufferte Lösung (pH 6,9) äquilibriert worden war, um eine nicht adsorbierte
Fraktion zu erhalten. Die erhaltene Fraktion enthielt 672 mg Protein, und die spezifische EPO-Aktivität betrug
1240 Einheiten (Units)/mg Protein.
BAD ORIGINAL
- >3 Vierte Stufe Säulenchromatographie
Die Fraktion, die EPO-Aktivität aufwies und in der dritten
Stufe gewonnen worden war, d.h. die die nicht adsorbierte Fraktion war, wurde gegen Wasser dialysiert, und das Dialysat
wurde gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Nach Auflösen des erhaltenen pulverförmigen
Materials in einer gepufferten Lösung, die aus einer wässrigen 10 mM Natriumphosphatlösung (pH 6,9) und einer wässrigen
150 mM Natriumchloridlösung bestand, wurde die zubereitete
Lösung durch eine Säule geleitet, die mit Sephadex G bepackt war, das durch die gleiche gepufferte Lösung wie
oben angegeben äquilibriert worden war, um Fraktionierung durch den Unterschied des Molekulargewichtes der gelösten
Stoffe durchzuführen, und dann wurde eine Fraktion erhalten, die EPO-Aktivität aufwies. Die Menge an Protein, das in der
erhaltenen Fraktion enthalten war, betrug 83 mg, und die spezifische EPO-Aktivität der Fraktion war 3000 Einheiten
(Units)/mg Protein.
Nachdem die Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der vierten Stufe erhalten worden war, der Dialyse gegen Wasser
unterworfen worden war, wurde das Dialysat gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Das erhaltene
pulverförmige Material wurde in einer wässrigen 5 mM Kalziumchloridlösung
(pH 7,0) gelöst, und die entstandene Lösung wurde gegen die gleiche wässrige Lösung dialysiert. Das erhaltene
Dialysat wurde auf pH 4,5 durch Zugabe von 0,1N Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und wurde durch eine
Säule geleitet, die mit SP-Sephadex bepackt war, das mit einer wässrigen 5 mM Kalziumchloridlösung (pH 4,5) äquilibriert
worden war. Das auf der Säule adsorbierte Material wurde mit einer 5 mM kalziumacetat-gepufferten. Lösung (pH 4,5)
gewaschen und wurde durch eine 20 mM kalziumacetat-gepufferte
Zi
Lösung (pH 5,5)ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten,
die EPO-Aktivität zeigte. Diese Fraktion enthielt 16 mg Protein und zeigte die spezifische Aktivität von EPO von
5100 Einheiten(Units)/mg Protein.
Nach Hindurchleiten der Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der fünften Stufe erhalten worden war, durch eine
Säule, die mit Sephadex G 50 bepackt war, das vorher mit PBS äquilibriert worden war, wurde die Säule mit der gepufferten
Lösung ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität zeigte.
Diese Fraktion wurde durch eine Säule geleitet, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt war, an dem der Antikörper gebunden
worden war, um Immuno-Adsorptionsmittel-Chromatographie durchzuführen / um dadurch eine nicht-adsorbierte Fraktion
zu erhalten. Die nicht-adsorbierte Fraktion enthielt 4 mg Protein, und eine spezifische EPO-Aktivität war 25000 Einheiten
(Units) /mg Protein.
Vorbereitung der Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt war, an das Antikörper gebunden waren:
Eine Maus wurde mit der Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und durch die Säulenchromatographie der fünften Stufe erhalten
worden war, immunisiert. Die Zellen der Milz wurden von der immunisierten Maus erhalten, und die Myelomzellen
wurden durch eine getrennte Kultur erhalten. Die erhaltenen Zellen der Milz und die erhaltenen Myelomzellen wurden der
Zellverschmelzung oder Zellfusion unterworfen, um Hybridomazellen (hybridoma cells) zu erhalten.
BAD ORIGINAL
Von den hergestellten Hybridomazellen wurden Antikörper erhalten, und danach wurden die erhaltenen Antikörper der
SDS-Elektrophorese unterworfen.
Als Ergebnis wurde ein Antikörper zu dem Protein, der eine
hoch-immusierende Aktivität zeigte, ausgewählt, wobei dieses Protein in dem Bereich auf der niederen Molekularseite, benachbart
au dem Gebiet, das die EPO-Aktivität auf der SDS-Gel-Elektrophorese
zeigte, gefunden wurde. Der ausgewählte Antikörper wurde an ein Gel von AFFI-GEL (hergestellt von
Bio-Rad Co.) gebunden, und das Gel mit dem Antikörper wurde fs
in eine Säule gepackt.
Eine Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte (eine nicht adsorbierte Fraktion), die wie oben beschrieben erhalten worden
war, wurde gegen Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde
gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Das erhaltene pulverförmige Material wurde in einer
tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten Lösung, die 2 % SDS (pH 6,8) enthielt, gelöst. Die zubereitete Lösung wurde der
13 % Polyacrylamid-Gel-SDS-Elektrophorese unterworfen, wo-
^*" bei nach den ——
üblichen Verfahren gearbeitet wurde.
Der Anteil des Gels, der EPO-Aktivität zeigte, wurde herausgeschnitten.
Nach Zugabe von PBS, und zwar 3 Mal so viel, wie die erhaltene Gelfraktion, zu der so erhaltenen Gelfraktion
wurde die entstandene Mischung fein klein-gemahlen, um ein Protein zu extrahieren. Der flüssige Extrakt enthielt
1,2 mg Protein und zeigte eine spezifische EPO-Aktivität von 50000 Einheiten (Units)/mg Protein. Nachdem der
flüssige Extrakt der Dialyse gegen Wasser unterworfen worden war, wurde das Dialysat gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges
Material zu erhalten.
Zubereitung von Hybridomazellen; Aufsammeln der Zellen der Milz
Eine Maus (BALB/C Maus) wurde durch die folgenden dreistufigen Verfahren immunisiert, wobei die gereinigte Probe von
dem wie oben beschrieben erhaltenen EPO als ein Antigen verwendet wurde.
Eine Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe von EPO
in PBS (einer wässrigen Phosphatpuffersalzlösung) mit einer Rate von 200 )ig/ml erhalten worden war, wurde mit Freund1schem
vollständigem Adjuvans gemischt, um eine Emulsion herzustellen, und 0,5 ml der zubereiteten Emulsion, entsprechend 50
EPO-Protein, wurden in die Bauchhöhle der Maus verabreicht.
Eine Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS mit einer Rate von 100 pg/ml erhalten worden war,
wurde mit Freund1schem vollständigem Adjuvans gemischt, um
eine Emulsion zu erhalten, und 0,5 ml der zubereiteten Emul
sion, entsprechend 25 pg EPO-Protein, wurden in die Bauchhöhle
der Maus nach 2 Wochen der ersten Stufe der Immunisierung verabreicht.
Nach 2 Wochen der zweiten Stufe der Immunisierung wurden 0,5 ml einer Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe
von EPO in PBS mit einer Rate von 50 pg/ml erhalten worden
war, entsprechend 25 pg EPO-Protein, weiter in die Bauche
höhle der behandelten Maus verabreicht, um die Behandlung der Immunisierung zu vervollständigen.
BAD ORIGINAL
«Α * 19
Nach 3 Tagen der Beendigung der Immunisierungsbehandlung
wurde die Milz der immunisierten Maus aseptisch herausgeschnitten.
Nach dem Waschen der herausgeschnittenen Milz mit einer Mischungslösung aus einem synthetischen Kulturmedium
(RPMI 1640 Lösung) und einer wässrigen 15 %igen Rinderfötserumlösung (FCS) wurde die gewaschene Milz in
der gleichen Mischlösung mit Scheren in kleine Stücke geschnitten, um gegeneinander isolierte Einzelzellen zu erhalten.
Nach dem zweimaligen Waschen der erhaltenen Einzelzellen mit der gleichen Mischlösung wurden die gewaschenen
Einzelzellen in RPMI 1640 Lösung dispergiert. Die An-
zahl der Zellen darin betrug 2,0 χ 10 .
Zubereitung von Myelorazellen
Myelomzellen (P3-NSI/! - Ag 4 - 1) wurden in der Mischung
von RPMI 1640 Lösung und FCS gezüchtet, und die wachsenden
Zellen wurden mit RPMI 1640 Lösung gewaschen. Die Anzahl der Zellen betrug 10 .
Nach dem Mischen der Dispersion aus den Zellen der Milz, die von der immunisierten Maus erhalten worden waren, mit
der Dispersion aus den gebildeten Maus-Myelomzellen in
RPMI 1640 Lösung wurde die Mischung dem Zentrifugieren unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen.
Die erhaltene Mischung aus den zwei Arten von Zellen wurde der Zellverschmelzung oder Zellfusion in einer wässrigen
50 %igen Lösung von Polyäthylenglycol 1500 unterworfen.
Nach dem Mischen der verschmolzenen Zellen, die durch die Zellverschmelzung erhalten worden waren,, mit einer HT-KuI-turmediumlösung
(RPMI 1640 Lösung, die Hypoxanthin, Thymidin
und eine wässrige 15 %ige Lösung aus Rinderfötserum enthielt)
wurde die flüssige Mischung auf 3 Mikrotiterplatten, von denen jede 96 Bohrungen oder Vertiefung/ besaß, verstreut
verteilt. Die Zellen wurden 2 Wochen lang in den jeweiligen
Vertiefungen auf den Platten gezüchtet, während HAT-Kulturmedium
(RPMI 1640 Lösung, die Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und eine wässrige 15 %ige Rinderfötserumlösung
enthielt) von dem zweiten Tag an hinzugegeben wurde, um dadurch die Auswahl durch HAT zu bewirken. Das Wachsen oder
Wuchern der Hybridomazellen wurde in 264 Bohrungen oder Vertiefungen festgestellt.
(3) Auswahl der Zellen mit der Fähigkeit, Antikörper zu erzeugen, aus den gewachsenen oder gewucherten Hybridomazellen»
Von den gewachsenen Hybridomazellen in den jeweiligen 264 Bohrungen oder Vertiefungen (sogenannte 264 Arten von Hybridomazellen)
wurden diejenigen Zellen ausgewählt, die einen Antikörper erzeugten, der an die gereinigte Probe von
EPO gebunden werden konnte, während eine Abschirmung durch ein Fest-Phasen-Verfahren unter Verwendung eines Biotin-Avidin-Systems
durchgeführt wurde. Als Folge davon wurden 19 Arten von Zellen als die Hybridomazellen ausgewählt, die
zum Erzeugen von Antikörper geeignet sind, und insbesondere 7 Arten von Zellen von den 19 Arten derselben wurden als
solche bestätigt, die eine stabilisierte Fähigkeit zur Erzeugung der Antikörper besaßen.
(4) Auswahl der Zellen, die den Anti-EPO-Antlkörper
erzeugen, durch Prüfen der Fähigkeit zur Adsorption von EPO:
Nach dem Herstellen einer Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das ein durch die einzelnen der 7 Ar-
BAD ORIGINAL
ten von Zellen erzeugte Antikörper durch die folgenden Verfahren gebunden worden ist, wurde die Fähigkeit der Säule
zum Adsorbieren von EPO untersucht, um die weitere Auswahl
der Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellen durchzuführen.
In die Bauchhöhle jeweils einer von 7 Mäusen wurden 5 χ 10 Zellen jeweils von einer der 7 Arten, die oben angegeben
waren, injiziert, um den Antikörper zu erzeugen, und nach
dem Aufsammeln des Aszitesfluids von der injizierten Maus wurde jede Aszites mit einer wässrigen 45%-gesättigten Lösung
von Ammoniumsulfat fraktioniert und 40 bis 60 mg einer Ig G Fraktion wurden jeweils als Antikörper erhalten. Nach
dem Binden der erhaltenen Ig G Fraktion an AFFI-GEL 10 (hergestellt von Bio-Rad Co.) durch die folgenden Verfahren
wurde das zubereitete Gel in eine Säule gepackt, um eine mit AFFI-GEL 10, an das der Antikörper gebunden worden ist,
bepackte Säule zu erhalten.
Das zubereitete AFFI-GEL 10, das auf ein Glasfilter gegeben
wurde, wurde mit Isopropy!alkohol unter Kühlen mit Eiswasser
gewaschen und wurde weiterhin dreimal mit Eiswasser gewaschen«, Das gewaschene AFFI-GEL 10 wurde in einem Volumenverhältnis
von 1:1 mit einer Flüssigkeit gemischt, die den erhaltenen Antikörper (Ig G Fraktion), 0,2 M Natriumhydrogencarbonat
und 0,3 M Natriumchlorid bei pH 8,3 enthielt. Die entstandene Mischung wurde 5 Stunden lang bei einer Temperatur
von 4°C gerührt, um das Binden des Antikörpers an AFFI-GEL 10 durchzuführen. Dann wurde die Mischung zentrifugiert,
um das Gel mit dem gebundenen Antikörper aufzusammeln, und nach dem Waschen des aufgesammelten Gels mit einer
Mischung aus einer wässrigen 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung zum
zweiten Mal wurde das gewaschene Gel gut mit einer wässrigen 0,1 M lithanolaminhydrochloridlösung (pH 8) 60 Minuten lang
bei Raumtemperatur zu dem Gel, an dem Antikörper gebunden ist, gemischt. Die entstandene Mischung wurde in eine Säule
gepackt, um eine Säule zum Adsorbieren von EPO herzustellen. Jede der zubereiteten 7 Säulen entsprach einer
der 7 Arten der vorstehend erwähnten Hybridomazellen, und die Fähigkeit der einzelnen Säulen, EPO zu adsorbieren,
wurde durch die folgenden Verfahren untersucht, wobei die gereinigte Probe von EPO, die in dem Verfahrensschritt (1)
erhalten worden war, verwendet wurde.
Nach dem Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS wurde die Lösung durch die Säule geleitet, die wie oben beschrieben
hergestellt und vorher mit PBS äquilibriert worden war, und dann wurde die Säule mit einer Mischung aus einer wässrigen
0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung ausgewaschen. Die EPO-Aktivität wurde
sowohl von der nicht-adsorbierten Fraktion als auch von der Eluat-Fraktion gemessen.
Als Ergebnis zeigten drei Säulen von den sieben wie oben
beschrieben hergestellten Säulen die Fähigkeit, EPO zu adsorbieren.
(5) Klonen der Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellen
Jede der drei Arten der vorstehend beschriebenen Anti-EPO-Antikörper
erzeugenden Hybridomazellen wurde dem Klonen durch übliche Verfahren des Grenzverdünnungsverfahrens
(englisch: limiting dilution method) wie folgt unterworfen.
Nach dem Dispergieren von 50 Zellen jeder Art von Hybrido-
ma und 10 Zellen des Thymus einer BALB/C Maus in 4 Wochen
nach der Geburt in 10 ml einer Mischung aus RPMI 160 Lösung und einer wässrigen 15%igen Lösung von FCS wurde die Disper
BÄD ORIGINAL
sion in 96 Bohrungen oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte
mit einer Rate von 0,1 ml/Vertiefung gegossen. Die Kultur
aus den Zellen wurde durchgeführt, während die gleiche Mischung in jedes Loch an dem fünften und zwölften Tag der
Kultur hinzugegeben wurde. Die wachsenden oder wuchernden Zellen von Hybridoma wurden auf ihre Fähigkeit, Anti-EPQ-Antikörper
zu erzeugen, durch das gleiche Pest-Phasen-Verfahren (englisch: solid-phase method) wie oben klassiert
und ausgesucht und weiter der Auswahl auf die Fähigkeit zur Erzeugung von Anti-EPO-Antikörper unterworfen, indem ihre
Fähigkeit, EPO zu adsorbieren, geprüft wurde, und dann wurde das Klonen durchgeführt«
Als ein Ergebnis wurden die drei Stämme E-1, E-2 und E-3
als geeigneter Stamm der Hybridomazellen für den Zweck der vorliegenden Erfindung erhalten.
Die Erzeugung des Antikörpers wurde in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei jeweils
die einzelnen Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellstämme E-I, E-2 und E-3 verwendet wurden. Jeder der Zellstämme wurde in
die Bauchhöhle von 20 Mäusen injiziert, .um Aszitesfluid hervorzurufen,
und die gesamte Menge von Aszitesfluid, die von den 20 Mäusen aufgesammelt wurde, wurde der Fraktionierung
mit der wässrigen 45%-gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat unterworfen, um eine Ig G Fraktion zu erhalten. Als Ergebnis
wurden 500 mg des monoklonen Antikörpers erhalten.
(II) Zubereitung einer Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das der monoklone Antikörper
gebunden war?
Durch die gleichen Verfahren, wie sie vorstehend erwähnt wurden, wurde jede der hergestellten Ig G Fraktionen an
ΪΨ
AFFI-GEL 10 gebunden, um jeweils 50 ml eines Gels zu erhalten,
an das jeder monoklone Antikörper in jedem monoklonen Antikörper erzeugenden Zellstamm gebunden war, und
das so mit gebundenem Antikörper versehene Gel wurde in eine Säule gepackt, um eine Säule für die Verwendung zum Adsorbieren
von EPO herzustellen.
Durch die gleichen Verfahren wie in (I), 1), wurden 50 mg
des pulverförmigen Gesamt-Urinproteins von einem anämischen
Patienten erhalten, und das pulverförmige Gesamt-Urinprotein,
das eine EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (ünits) zeigte, wurde in 10 ml PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung) gelöst.
Nachdem die Lösung über eine Nacht gegen 40 Liter PBS dialysiert worden war, wurde das Dialyeat dem Zentrifugieren
unterworfen, um 10 ml der überstehenden Flüssigkeit zu erhalten, die danach als Ursprungs- oder Originalflüssigkeit
verwendet wurde.
Nach dem Hindurchleiten von 20 ml PBS durch die Säule zum Adsorbieren von EPO, das durch die gleichen Verfahren wie
in (II) hergestellt worden war (0,8 cm innerer Durchmesser und 4 cm Länge, bepackt mit AFFI-GEL 10, gebunden an den
monoklonen Antikörper, der durch den Zellstamm E-1 erzeugt worden war), wurden mit einer Rate von 20 ml/h zum Äquilibrieren
damit 50 ml einer Mischung einer wässrigen 0,2 M Essigeäurelösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung
durch die Säule hindurchgeleitet, um die Säule zu waschen, und weiterhin wurden 20 ml PBS durch die Säule hindurchgeleitet,
um damit zu äguilibrieren.
Durch die vorher behandelte Säule wurden 10 ml der Ursprungsoder Originalflüssigkeit, die wie oben beschrieben hergestellt
worden war, mit einer Rate von 5 ml/h hindurchgelei-
BAD ORIGINAL
tet, und nach dem Waschen des adsorbierten Materials in der
Säule durch das Hindurchleiten von 20 ml PBS, anschließend 20 ml einer wässrigen mit 10 mM Phosphorsäure gepufferten
Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, mit 20 ml/h
und 20 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung mit
einer Rate von 20 ml/h in dieser angegebenen Reihenfolge
durch die Säule wurden 20 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M
Natriumchloridlösung mit einer Rate von 5 ml/h als ein
Eluationsmittel durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu
erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt.
und 20 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung mit
einer Rate von 20 ml/h in dieser angegebenen Reihenfolge
durch die Säule wurden 20 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M
Natriumchloridlösung mit einer Rate von 5 ml/h als ein
Eluationsmittel durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu
erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt.
Die EPO-Äktivität in dem erhaltenen Eluat betrug 1160 Einheiten
(Units), das bedeutet die Rückgewinnung von 40 %
der Aktivität der ursprünglichen Flüssigkeit mit 2900 Einheiten (Units). Darüber hinaus betrug die spezifische Aktivität von EPO in dem Eluat 45000 Einheiten (Units)/mg Protein, und die spezifische Aktivität von EPO in der ursprünglichen Flüssigkeit betrug 58 Einheiten (Units) pro mg Protein, und demzufolge wurde also die Reinheit von EPO durch die Verfahren auf das 780-fache erhöht.
der Aktivität der ursprünglichen Flüssigkeit mit 2900 Einheiten (Units). Darüber hinaus betrug die spezifische Aktivität von EPO in dem Eluat 45000 Einheiten (Units)/mg Protein, und die spezifische Aktivität von EPO in der ursprünglichen Flüssigkeit betrug 58 Einheiten (Units) pro mg Protein, und demzufolge wurde also die Reinheit von EPO durch die Verfahren auf das 780-fache erhöht.
Durch Verwendung einer Säule (0,8 cm innerer Durchmesser und 4 cm Länge mit einer Kapazität von 2 ml), die mit einem Gel
bepackt war, an das Antikörper gebunden war, der durch den Hybridomazellenstamm E-2 erzeugt worden war, hergestellt
durch die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1, wurden die folgenden Operationen durchgeführt.
durch die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1, wurden die folgenden Operationen durchgeführt.
In 10 ml PBS, das 2 % SDS enthielt, wurden 50 mg (die die
EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (Units) aufwiesen) des Pulvers von Gesamt-Urinprotein, das von dem Urin von dem anämischen Patienten durch die gleichen Verfahren wie in Bei-
EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (Units) aufwiesen) des Pulvers von Gesamt-Urinprotein, das von dem Urin von dem anämischen Patienten durch die gleichen Verfahren wie in Bei-
spiel 1 unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsvorrichtung
aufgesammelt worden war, gelöst, und nach Behandlung der
Lösung durch Erhitzen der entstandenen Lösung bei 100°C für 3 Minuten wurde die behandelte Lösung eine Nacht gegen 10
Liter PBS dialysiert. Nachdem das Dialysat dem Zentrifugieren unterworfen worden war, wurde die erhaltene überstehende
Flüssigkeit bis auf das fünffache Volumen mit PBS verdünnt, und die verdünnte Flüssigkeit wurde durch die vorstehend beschriebene
Säule, die wie in Beispiel 1 vorbehandelt worden war, mit einer Rate von 5 ml/h geleitet. Dann wurden nach
dem Hindurchleiten von 20 ml PBS, 20 ml einer wässrigen mit mM Phosphorsäure gepufferten Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid
enthielt, und 20 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge durch die Säule, um das
adsorbierte Material in der Säule zu waschen, 200 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und
einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung mit einer Rate von 20 ml/h als einem Eluationsmittel durch die Säule geleitet,
um ein Eluat zu erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt. Die EPO-Aktivität des erhaltenen Eluats betrug
2600 Einheiten(Units). Da die EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (Units) des ursprünglichen Pulvers war, betrug
die Aufsammelrate 90 %. Die spezifische Aktivität von EPO
in dem Eluat betrug 60000 Einheiten (Units)/mg Brotein. Die ursprüngliche Aktivität betrug 58 Einheiten (Units)/mg
Protein bei dem ursprünglichen Pulver, und demzufolge war die Reinheit von EPO sogar bis auf etwa das 1000-fache des
ursprünglichen Pulvers erhöht worden.
Unter Verwendung einer Säule ( 2 cm innerer Durchmesser und 6,4 cm Länge mit einer Kapazität von 20 ml), die mit einem
gebunden war Gel bepackt war, an das der Antikörper/, der durch den Hybridomazellenstamm
E-3 erzeugt worden war, hergestellt durch
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die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1/ wurden die folgenden
Operationen durchgeführt.
500 mg eines Pulvers von Gesamt-Urinprotein, das vom Urin
eines anämischen Patienten aufgesammelt worden war (EPO-Aktivität von 29000 Einheiten (units)), wurden In 50 ml PBS,
das 2 % SDS enthielt, gelöst, und die entstandene Lösung
wurde durch Erhitzen für 3 Minuten bei 100°C behandelt. Die behandelte Lösung wurde über eine Nacht gegen 40 Liter PBS
dialysiert und wurde dann dem Zentrifugieren unterworfen, um 50 Ml einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten.
Nach dem Verdünnen der überstehenden Flüssigkeit auf das
5-fache Volumen mit PBS wurde die verdünnte Flüssigkeit durch die vorbehandelte Säule mit einer Rate von 20 ml/h
geleitet. Nach dem Waschen der Säule durch Hindurchleiten von 200 ml PBS, 200 ml einer wässrigen 10 mM phosphorsäuregepufferten
Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und 200 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung durch
die Säule in der angegebenen Reihenfolge mit einer Rate von 100 ml/h wurden 200 ml einer Mischung aus einer wässrigen
0,2 M Essigsäurelösung und einer 0,15 M Natriumchloridlösung
durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt. Die EPO-Aktivltät des EPO
in dem Eluat betrug 25000 Einheiten (Units) , und der Rückgewinnungsprozentsatz an EPO betrug 86, bezogen auf den Betrag
von 29000 Einheiten (Units) der EPQ-Aktlvität in dem Ursprungs- oder Originaipulver. Die spezifische EPQ-Aktivität
in dem Eluat betrug 60000 Einheiten (Units)/ mg Protein, woraus eine hohe Reinheitsverbesserung von etwa dem Faktor
1000 in der Reinheit des EPO folgt.
Claims (5)
-
3346336 _ 6000 Frankfurt/Main 1 (0611) 235555 Kaiserstrasse 41 04-16759 mapat d • m ·* " Telefon mainpatent frankfurt Dr. Horst Schüler _ ^ Telex (0611) 251615 PATENTANWALT Telegramm (CCITT Gruppe 2 und 3) EUROPEAN PATENTATTORNEY Telekoplerer 225/0389 Deutsche Bank AG 282420-602 Frankfurt/M. Bankkonto Postscheckkonto S / 2468 hr Zeichen/Your ref. 20.12.1983 Unser Zeichen/Our ref. Dr.HS/ki Datum /Date Anmelder : SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO., LTD.1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-kuf Sapporo,
Hokkaido, JapanPatentansprücheVerfahren zur Herstellung von in hohem Maße reinem Erythropoetin aus einem Erythropoetin enthaltenden Material, dadurch gekennzeichnet , daß dieses Erythropoetin enthaltende Material mit einem Adsorptionsmittel mit monoklonem
Anti-Erythropoetin-Antikörper in Kontakt gebracht
wird, wobei der monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper aus Hybridoma hergestellt wird, das durch
Zellfusion oder Zellverschmelzung einer Myelomzelle und einer Milzzelle eines Experimentier-Tieres, das mit Erythropoetin immunisiert worden
ist, erhalten wird, das Erythropoetin auf diesen
monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper in dem
Adsorptionsmittel adsorbiert wird, das Erythropoetin von diesem Adsorptionsmittel ausgewaschen und
das ausgewaschene Erythropoetin aufgesammelt wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / daß das Adsorptionsmittel von dem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper und AFFI-GEL oder Sephadex hergestellt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , daß das Erythropoetin enthaltende Material durch eine Säule geleitet wird, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt ist.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß das adsorbierte Erythropoetin mit einer Mischung aus Essigsäure und einer wässrigen Lösung von Natriumchlorid ausgewaschen wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / daß das einmal verwendete Adsorptionsmittel regeneriert und das regenerierte Adsorptionsmittel wiederholt in dem Adsorptionsverfahrensschritt verwendet wird.BAD ΟΡ·0'ΜΛ|
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