DE3346336A1

DE3346336A1 - Verfahren zur herstellung von erythropoetin

Info

Publication number: DE3346336A1
Application number: DE19833346336
Authority: DE
Inventors: Hideo Uji Kyoto Chiba; Ryuzo Kyoto Sasaki; Masatsugu Kawagoe Saitama Ueda
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1983-02-21
Filing date: 1983-12-22
Publication date: 1984-08-23
Also published as: US4465624A; JPS59155395A; GB2135676A; JPH0686480B2; GB8403579D0; FR2541285A1; FR2541285B1; DE3346336C2; GB2135676B

Description

Anmelder: SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO., LTD.

1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-ku, Sapporo, Hokkaido, Japan

Verfahren zur Herstellung von Erythropoetin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines in hohem Maße reinen Erythropoetins durch wirksames Aufsammeln von Erythropoetin aus einem Erythropoetin enthaltenden Material mit einer Affinitätschromatographie, wobei ein Adsorptionsmittel mit einem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper verwendet wird.

Erythropoetin (hier im folgenden abgekürzt als EPO bezeichnet) ist bekannt als ein Beschleunigungsfaktor für Erythrozytbildung, und EPO ist eine Art von Hormonen, die auf die erythrozytären Stammzellen in dem Knochenmark wirkt, um deren Differenzierung in die erythrozytären Zellen zu beschleunigen,

Obgleich die chemische Struktur von EPO noch nicht vollständig geklärt ist, ist EPO selbst ein saures Glycoproteid mit einem Molekulargewicht von 30.000 bis 40.000, das vorwiegend in den Niere erzeugt wird und in weitem Maße als ein Heilmittel für Anämiepatienten, für postoperative Patienten und Patienten, die Homo-Dialyse nach Nierenexstirpation erhalten, angewendet werden kann.

Natürlich wird die Bildung von EPO in einem lebenden Körper durch das Gleichgewicht zwischen dem Bedarf und der Versorgung mit Sauerstoff in dem lebenden Körper beeinflußt, und demzufolge wird die Bildung von EPO beschleunigt, wenn sich der lebende Körper in einem Zustand der Hypoxie befindet, und im Gegensatz dazu, wird die Bildung von EPO herabgesetzt, wenn sich der lebende Körper in einem Zustand des zu hohen Sauerstoffgehaltes befindet. Beispielsweise wird in einem anämischen Patienten die Bildung von EPO beschleunigt und als Folge davon EPO in seinen Urin ausgeschieden.

Es ist bereits ein Verfahren zum Isolieren von EPO mit einer stabilisierten Aktivität aus dem menschlichen Urin, der EPO enthält, bekannt (es wird z.B. auf das US-Patent No. 3,865,801 verwiesen), bei dem eine Lösung des Roh-EPO, die von dem das EPO enthaltenden menschlichen Urin in einer phosphätgepufferten Salzlösung erhalten wird, als eine Originaloder Ursprungsflüssigkeit verwendet wird, zu der Natriump-Aminosalicylat hinzugegeben wird, die gemischte Lösung mit Phenol extrahiert wird und der Extrakt gegen die phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert wird, woraufhin das Aufsammeln von EPO aus dem Dialysat folgt.

Da jedoch der Gehalt an EPO in üblichem menschlichem Urin extrem niedrig ist und in der Größenordnung von etwa 0,01 bis 0,02 Gew.-% des gesamten Proteins in dem Urin liegt, ist es jedoch schwierig, EPO durch das beschriebene bekannte

RAH ORIGiNAL

Verfahren effektiv herzustellen, und insbesondere ist das Verfahren kein Verfahren für die Praxis als ein Verfahren zum Herstellen von EPO zur Anwendung als das oben angegebene Heilmittel. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß EPO zur Zeit nur als ein chemisches Reagenz hergestellt wird.

Als Ergebnis der Untersuchungen der Erfinder der vorliegenden Erfindung zum effektiven Aufsammeln von EPO mit einem hohen Reinheitsgrad aus verschiedenen Materialien, die EPO enthalten, gelang es den Erfindern, EPO mit einer hohen Reinheit in wirkungsvoller Weise aus dem EPO enthaltenden Material aufzusammeln, indem eine Säulenchromatographie angewendet wurde, bei der ein Adsorptionsmittel mit einem monoklonen Anti-EPO-Antikörper verwendet wurde, und dies führte zu der vorliegenden Erfindung.

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum wirksamen Abtrennen von EPO von einem Material, das EPO enthält, zu schaffen und die hoch-gereinigte EPO-Zubereitung zu gewinnen. Merkmale und Gegenstände der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Der Ausdruck "EPO enthaltendes Material" bezeichnet, wie er hier verwendet wird, den Urin normaler Personen, den Urin von anämischen Patienten, das rohe davon erhaltene Urin-Erythropoetin, die überstehende Flüssigkeit der Kultur von den EPO erzeugenden Zellen, die Körperflüssigkeit von einem Tier, dem die EPO erzeugenden Zellen transplantiert worden sind, das Extraktfluid der Gewebe von dem der Transplantation unterworfenen Tier und Urin desselben.

Bei der vorliegenden Erfindung werden hauptsächlich die Fälle, bei denen der Urin des anämischen Patienten als das EPO

enthaltende Material verwendet wurde, im folgenden erklärt, es soll hierbei jedoch bemerkt werden, daß die Quelle für EPO gemäß der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt ist.

Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von in hohem Maße reinem Erythropoetin aus einem Erythropoetin enthaltenden Material, da,s folgendes umfaßt:

in Kontaktbringen des Erythropoetin enthaltenden Materials mit einem Adsorptionsmittel mit monoklonem Anti-Erythropoetin-Antikörper, wobei dieser monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper von Hybridoma hergestellt ist und dieses Hybridoma durch Zellverschmelzung einer Myelomzelle und einer Milzzelle eines Experimentier-Tieres, das durch Erythropoetin immunisiert worden ist, erhalten wird, Adsorbieren dieses Erythropoetins auf dem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper in dem Adsorptionsmittel, Auswaschen des Erythropoetins von dem Adsorptionsmittel und
Aufsammeln des ausgewaschenen Erythropoetins.

Der monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper (hier im folgenden als monokloner Antikörper bezeichnet), der zum Gebundenwerden an das Adsorptionsmittel bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird von den Hybridomazellen hergestellt, die durch ZeI!verschmelzung einer gezüchteten oder gebildeten Myelomzelle (oder von Myelomzellen) und einer Zelle (oder Zellen) der Milz eines Experimentier-Tieres wie einer Maus oder einer Ratte erhalten werden, die durch Verabreichen von EPO als einem Antigen immunisiert worden ist, welches von dem Urin, z.B. dem Urin eines anämischen Patienten, aufgesammelt worden ist und das aufgesammelte EPO gereinigt worden ist. Die Zellverschmelzung oder Zellfusion wird vorzugsweise zwischen den Zellen von einem Tier

BAD ORIGINAL

oder Tieren der gleichen Art durchgeführt. Die Zellen der Milz, die hier verwendet werden (hauptsächlich B-Zellen), werden von der Milz eines Experimentier-Tieres wie einer Maus nach etwa 3 Tagen der letzten Immunisierung derselben erhalten, wozu intraperitoneale Injektion einer Emulsion verwendet wird, die durch Lösen des gereinigten EPO in einer wässrigen phosphat-gepufferten Salzlösung (sogenannte PBS von englisch "phosphate-buffered saline solution") und Beimischen von Freund¹schem Adjuvans zu der gelösten Lösung hergestellt worden ist. Zusätzlich wird es bei der Immunisierung des Tieres bevorzugt, die Injektion in einem regelmäßigen Intervall, zum Beispiel von 2 Wochen, zu wiederholen, um die Immunisierung ausreichend durchzuführen.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Myelomzelle ist eine Art von bösartigen Tumorzellen und besitzt eine große Vermehrungsgeschwindigkeit. Als Myelomzellen von Mäusen können beispielsweise die Stämme wie P2~X63-Ag8, P₃-NSI/1-Ag 4-1, X 63-Ag 8 653 und dergleichen nach Kultivierung zur Vermehrung verwendet werden.

Die Zellverschmelzung der Zelle(n) der Milz und der Myelomzelle (n) kann durch das allgemein bekannte Verfahren wie folgt durchgeführt werden:

Das Gewebe der Milz wird in kleine Stücke zerschnitten in einer Mischung von dem Serum von Rinderföt (hier im folgenden als FCS bezeichnet) und RPMI 1640 synthetisches Kulturmedium (hier im folgenden als RPMI 1640 Medium bezeichnet), wozu Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100μg/ml), 2 mM Glutamin und 1 mM Pyruvinsäure hinzugegeben worden sind, und es wird weiter abgetrennt oder in kleine Zellen zer* strömt. Die erhaltenen einzelnen Zellen werden in das RPMI 1640 Medium dispergiert, und die Zellen von dem Myelom

werden der Dispersionslösung beigemischt. Nachdem die Mischung dem Zentrifugieren unterworfen worden ist/ wird die gebildete überstehende Flüssigkeit dekantiert, und ein wässriges 50 Gew.-% Polyäthylenglycol 1500 wird zu der Mischung aus den Zellen als ein Verschmelzungs- oder Fusionseinleitungsmittel hinzugegeben, um die Zellverschmelzung durchzuführen.

In dem nächsten Schritt werden von der Mischung aus Zellen, die der Zellverschmelzung unterworfen worden waren, Hybridomazellen durch das allgemein bekannte HAT-Auswahlverfahren ausgewählt. HAT-Auswahl kann durchgeführt werden, indem eine Mikrotiterplatte verwendet wird. Die Mischung der Zellen, die der Zellverschmelzung unterworfen worden waren, werden beispielsweise auf einer Mikrotiterplatte, die mit

Ver—

96 Bohrungen oder/tiefungen versehen ist, verteilt und verstreut und in einem HAT(Hypoxanthin-aminopterin-thymidin) Kulturmedium etwa 2 Wochen lang gezüchtet. Nachdem die Vertiefungen ausgesucht und festgestellt worden sind, in denen die der Zellverschmelzung unterworfenen Zellen wachsen und wuchern, ohne abzusterben, werden die Hybridomazellen von diesen Vertiefungen aufgesammelt.

Das Verfahren zum Auswählen der Zellen mit einer Fähigkeit zur Erzeugung der monoklonen Anti-EPO-Antikörper von den erhaltenen HybridomazeIlen wird im folgenden beschrieben:

Nachdem die Aktivität der Hybridomazellen durch Festphaseverfahren, ob ein Antikörper zu EPO erzeugt wird, geprüft und festgestellt worden ist, werden die geprüften Hybridomazellen in die Bauchhöhle einer Maus transplantiert, um Aszitesfluid in der Maus zu erzeugen, und es werden Proteine von dem aufgesammelten Aszitesfluid durch ein allgemein bekanntes Verfahren wie z.B. ein Fraktionierverfahren mit Ammoniumsulfat aufgesammelt. Die aufgesammelten Pro-

BAD ORIGiNiAL

4 9 ft «

teinebestehen hauptsächlich aus einem Immunoglobulin (IgB). Die hauptsächlich IgB als einen Antikörper enthaltenden Proteine werden an ein Adsorptionsmittel wie AFPI-GEL (hergestellt von Bio-RAD Co.) oder SEPHADEX (hergestellt von Farmacia Co. ) gebunden, um ein Adsorptionsmittel mit Antikörper zu erhalten. Das erhaltene Adsorptionsmittel mit dem darauf gebundenen Antikörper wird in eine Säule gepackt, und dann wird durch Hindurchleiten einer authentischen Zubereitung von EPO durch die vorbereitete Säule und Prüfen, ob die vorbereitete Säule die Fähigkeit zur Adsorption von EPO besitzt, untersucht, ob die erhaltenen Hybridomazellen die Fähigkeit besitzen, den Anti-EPO-Antikörper zu erzeugen. Dann werden die den Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Hybridomazellen der Monoklonisierung (dem Monoklonen) durch die allgemein bekannten Grenzverdünnungsverfahren unterworfen, und die monokIonisierten Hybridomazellen werden auf ihre stabilisierte Produktionsfähigkeit des monoklonen Antikörpers durch das Feste-Phase-Verfahren und das Adsorptionsverfahren untersucht, wobei die Antikörper adsorbiert habende Säule für das Prüfen der Adsorptionsfähigkeit für EPO verwendet wird. Der erforderliche Antikörper kann kontinuierlich zu irgendeiner Zeit durch Schmelzen der gefrorenen Zellen, Kultivieren der Zellen und Transplantieren der Zellen in die Bauchhöhle einer Maus geliefert werden, da die erhaltenen Hybridomazellen in einem gefrorenen Zustand konserviert werden können.

Der monoklone Anti-EPO-Antikörper, der durch Transplantieren der monoklonisierten Zellen mit einer Fähigkeit zur Erzeugung des Anti-EPO-Antikörpers in die Bauchhöhle einer Maus nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird, wird gereinigt und danach wird der gereinigte monoklone Anti-EPO-Antikörper an ein Adsorptionsmittel wie AFFI-GEL oder SEFADEX gebunden, um ein spezifisches Adsorptionsmittel herzustellen, an das der Antikörper ge-

bunden ist. Das spezifische Adsorptionsmittel wird zum Adsorbieren von EPO von EPO enthaltenden Materialien verwendet, um EPO zu gewinnen.

Bei der vorliegenden Erfindung wird EPO von Materialien, die EPO enthalten, durch ein immuno-adsorptionsmittel-chromatographisches Verfahren aufgesammelt, wobei eine Säule verwendet wird, die mit dem spezifischen Adsorptionsmittel bepackt ist, an das der monoklone Anti-EPO-Antikörper gebunden ist, wie es vorstehend beschrieben wurde. Als das EPO enthaltende Material, das als das Ausgangsmaterial bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können, wie vorstehend beschrieben, Urin von einem anämischen Patienten sowie Urin von normalen Personen, die überstehende Flüssigkeit, die von dem Kulturmaterial von EPO-erzeugenden Zellen, Körperfluid von Tieren, denen die EPO-erzeugenden Zellen transplantiert worden sind, Extraktflüssigkeit der Gewebe des genannten Tieres und der Urin desselben außer dem Urin eines Anämiepatienten genannt werden.

Bei der Behandlung eines dieser EPO enthaltenden Materialien mit dem Adsorptionsmittel, an das der monoklone Anti-EPO-AntikÖrper gebunden worden ist, wird der Urin, z.B. der Urin eines anämischen Patienten, filtriert und das Piltrat wird kondensiert und einer Entsalzungsbehandlung oder SDS-Behandlung unterworfen, und dann wird die so behandelte Probe auf das Adsorptionsmittel der Säule aufgebracht. Zusätzlich kann zum Inaktivmachen der Protease in dem Urin der Urin mit Phenol behandelt werden oder der Erhitzung vor dem Aufbringen auf das Adsorptionsmittel der Säule unterworfen werden.

BAD

ma η ' *» β ρ· it

3348336

/Μ

Das vorbehandelte EPO enthaltende Material, wird, wie vorstehend erwähnt, bei der vorliegenden Erfindung durch die Säule geleitet, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das der monoklone Anti-EPO-Antikörper gebunden worden ist, und als eine Folge davon adsorbiert der Antikörper selektiv EPO. Deshalb ist es nicht notwendig, den Schritt des Hindurchleitens zu wiederholen, und auf dem Adsorptionsmittel adsorbiertes EPO wird ausgewaschen, indem eine Wasch- oder Spüllösung wie z.B. eine Mischung aus wässriger 0,2M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15M Natriumchloridlösung durch die Säule geleitet wird, und dann kann das Eluat von EPO in wirkungsvoller Weise und mit einer hohen Reinheit aufgesammelt werden.

Nach dem Auswaschen von EPO kann das Adsorptionsmittel in der Säule zur Regenerierung behandelt werden, und das regenerierte Adsorptionsmittel kann etwa 10 Mal wiederverwendet werden« Die Behandlung von dem einmal verwendeten Adsorptionsmittel für die Regenerierung wird durchgeführt, indem eine Lösung wie eine gemischte Lösung von Essigsäure und einer wässrigen Natriumchloridlösung durch die mit dem zu regenerierenden Adsorptionsmittel bepackte Säule geleitet wird.

Die Reinheit des durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen EPO kann abgeschätzt werden, indem die EPO-Aktivitat(Einheit engl.iünit) des Proteins in dem Eluat gemessen wird. Die EPO-Aktivität wird durch eines der allgemein bekannten Verfahren gemessen, z.B. durch das Kolonieverfahren durch morpholo-

3 gische Beobachtung der erythrozytären Kolonien, das H-Thymidinverfahren durch Prüfen der Aufnahme von H-Thymidin

59
in DNA der Kolonien und das Fe-Verfahren durch Prüfen

59
der Aufnahmerate von Fe an Harn der Kolonien. Zusätzlich kann als Vergleichs- oder Standardsubstanz für die Messung

OOHUJOU

- ve -

von EPO/EPO (Erythropoetin Step 3, hergestellt von Connort Co. , Caitada) verwendet werden, das von dem Serum zubereitet ist, welches von einem mit Phenylhydrazin behandelten anämischen Schaf aufgesammelt worden ist.

Durch die vorliegende Erfindung ist es also möglich, wirtschaftlich EPO mit einer hohen Reinheit aus Materialien herzustellen, die eine sehr kleine Menge an EPO enthalten. Weiterhin ist der Antikörper, der an das Adsorptionsmittel, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gebunden ist, der monoklone Antikörper und demzufolge ist es möglich, den Antikörper mit der gleichen Eigenschaft zu erhalten. Da es schließlich möglich ist, den Antikörper in einem stabilen Zustand zu erhalten, kann festgestellt werden, daß die vorliegende Erfindung ein praktisches Verfahren zur Herstellung des gereinigten Erythropoetin liefert.

Die Erfindung wird nun konkreter unter Bezugnahme auf die folgenden, die Erfindung nicht einschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

(I) Zubereitung des monoklonen Anti-EPO-Antikörpers

(1) Zubereitung von EPO für die Verwendung als ein Antigen zur Erzeugung des monoklonen Anti-EPO-Antikörpers:

600 Liter von einem anämischen Patienten aufgesammelter Urin wurden durch eine Apparatur zum Ultra-Filtrieren geleitet, um Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht von bis zu 10.000 für das Molekulargewicht zu entfernen, und dann wurde der hindurchgeleitete Urin kondensiert. Der kondensierte Urin wurde mit einer geeigneten Menge

BAD ORIGINAL

Wasser verdünnt, und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie oben kondensiert, um Entsalzung durchzuführen. 20 Liter des so erhaltenen Kondensats von Urin wurden dem Gefriertrocknen unterworfen, um 31,0 g an gesamtem Protein im Urin in Form eines Pulvers zu erhalten, das eine EPO-Aktivität von 1800000 Einheiten (Units)/31,0 g zeigte (EPO-Aktivität wurde hierbei im folgenden durch die Proteinbestimmungsausrüstung , hergestellt von Bio-Rad Co., bestimmt).

Das erhaltene Pulver des Gesamt-Urinproteins wurde durch Säulenchromatographie und SDS-Elektrophorese folgendermaßen gereinigt;

Erste Stufe Säulenchrcmatographie

Das erhaltene Pulver des Gesamt-Urinproteins wurde in einer 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten Lösung (pH 6,8) gelöst und die Lösung des Pulvers wurde durch eine Säule geleitet, die mit DEAE-Zellulose (Diäthylaminoäthylzellulose) bepackt war, die vorher mit der 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten Lösung (pH 6,8) äquilibriert worden war. Das Urinprotein in der Urinlösung wurde an der Säule adsorbiert, und das adsorbierte Urinprotein wurde durch eine 5 mM tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferte Lösung, die 200 mM Natriumchlorid (pH 6,8) enthielt, ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität zeigte. Die Fraktion enthielt 16,0 g Protein, und die spezifische Aktivität der Fraktion betrug 99 Einheiten (Units)/mg Protein.

Zweite Stufe Säulenchromatographie

Die Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der ersten Stufe erhalten worden war, wurde der Dialyse gegen Wasser unterworfen, und das Dialysat wurde gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Nach Auflösen des erhaltenen pulverförmigen Materials in einer gepufferten

AU-

Lösung, die 10 mM Natriumphosphat (pH 6,8) und 4M Natriumchlorid enthielt, wurde die Lösung aus dem pulverförniigen Material durch eine Säule geleitet, die mit PHENYLSepharose CL-4B bepackt worden war, die vorher mit einer gepufferten Lösung (pH 6,8), die 10 mM Natriumphosphat und 4M Natriumchlorid enthielt, äquilibriert worden war, um das Protein darauf zu adsorbieren. Das adsorbierte Protein wurde mit einer gepufferten Lösung (pH 7,1), die 10 mM Natriumphosphat und 0,5M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und dann mit einer Mischung ausgewaschen, die aus einer wässrigen 10 mM Natriumhydroxidlösung, einer wässrigen 20 %igen Äthylenglycollösung und einer wässrigen 6M Guanidinhydrochloridlösung bestand, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität aufwies. Die Fraktion enthielt 2,3 g Protein, und die spezifische EPO-Aktivität der Fraktion war 421 Einheiten (Units)/mg Protein.

Dritte Stufe Säulenchromatographie

Die Fraktion, die EPO-Aktivität aufwies und in der zweiten Stufe erhalten worden war, wurde der Dialyse gegen Wasser unterworfen, und dann wurde das pulverförmige Material von dem Dialysat der Fraktion durch Gefriertrocknen erhalten. Das erhaltene pulverförmige Material wurde in 5 mM natriumphosphat-gepufferter Lösung (pH 6,9) gelöst, und die Lösung aus dem pulverförmiger! Material wurde gegen die gleiche gepufferte Lösung dialysiert. Das erhaltene Dialysat wurde durch eine Säule geleitet, die mit Hydroxyapatit bepackt war, das durch 5 mM natriumphosphat-gepufferte Lösung (pH 6,9) äquilibriert worden war, um eine nicht adsorbierte Fraktion zu erhalten. Die erhaltene Fraktion enthielt 672 mg Protein, und die spezifische EPO-Aktivität betrug 1240 Einheiten (Units)/mg Protein.

BAD ORIGINAL

- >3 Vierte Stufe Säulenchromatographie

Die Fraktion, die EPO-Aktivität aufwies und in der dritten Stufe gewonnen worden war, d.h. die die nicht adsorbierte Fraktion war, wurde gegen Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Nach Auflösen des erhaltenen pulverförmigen Materials in einer gepufferten Lösung, die aus einer wässrigen 10 mM Natriumphosphatlösung (pH 6,9) und einer wässrigen 150 mM Natriumchloridlösung bestand, wurde die zubereitete Lösung durch eine Säule geleitet, die mit Sephadex G bepackt war, das durch die gleiche gepufferte Lösung wie oben angegeben äquilibriert worden war, um Fraktionierung durch den Unterschied des Molekulargewichtes der gelösten Stoffe durchzuführen, und dann wurde eine Fraktion erhalten, die EPO-Aktivität aufwies. Die Menge an Protein, das in der erhaltenen Fraktion enthalten war, betrug 83 mg, und die spezifische EPO-Aktivität der Fraktion war 3000 Einheiten (Units)/mg Protein.

Fünfte Stufe Säulenchromatographie

Nachdem die Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der vierten Stufe erhalten worden war, der Dialyse gegen Wasser unterworfen worden war, wurde das Dialysat gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Das erhaltene pulverförmige Material wurde in einer wässrigen 5 mM Kalziumchloridlösung (pH 7,0) gelöst, und die entstandene Lösung wurde gegen die gleiche wässrige Lösung dialysiert. Das erhaltene Dialysat wurde auf pH 4,5 durch Zugabe von 0,1N Chlorwasserstoffsäurelösung eingestellt und wurde durch eine Säule geleitet, die mit SP-Sephadex bepackt war, das mit einer wässrigen 5 mM Kalziumchloridlösung (pH 4,5) äquilibriert worden war. Das auf der Säule adsorbierte Material wurde mit einer 5 mM kalziumacetat-gepufferten. Lösung (pH 4,5) gewaschen und wurde durch eine 20 mM kalziumacetat-gepufferte

Zi

Lösung (pH 5,5)ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität zeigte. Diese Fraktion enthielt 16 mg Protein und zeigte die spezifische Aktivität von EPO von 5100 Einheiten(Units)/mg Protein.

Sechste Stufe Säulenchromatographie

Nach Hindurchleiten der Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und in der fünften Stufe erhalten worden war, durch eine Säule, die mit Sephadex G 50 bepackt war, das vorher mit PBS äquilibriert worden war, wurde die Säule mit der gepufferten Lösung ausgewaschen, um eine Fraktion zu erhalten, die EPO-Aktivität zeigte.

Diese Fraktion wurde durch eine Säule geleitet, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt war, an dem der Antikörper gebunden worden war, um Immuno-Adsorptionsmittel-Chromatographie durchzuführen / um dadurch eine nicht-adsorbierte Fraktion zu erhalten. Die nicht-adsorbierte Fraktion enthielt 4 mg Protein, und eine spezifische EPO-Aktivität war 25000 Einheiten (Units) /mg Protein.

Vorbereitung der Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt war, an das Antikörper gebunden waren:

Eine Maus wurde mit der Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte und durch die Säulenchromatographie der fünften Stufe erhalten worden war, immunisiert. Die Zellen der Milz wurden von der immunisierten Maus erhalten, und die Myelomzellen wurden durch eine getrennte Kultur erhalten. Die erhaltenen Zellen der Milz und die erhaltenen Myelomzellen wurden der Zellverschmelzung oder Zellfusion unterworfen, um Hybridomazellen (hybridoma cells) zu erhalten.

BAD ORIGINAL

Von den hergestellten Hybridomazellen wurden Antikörper erhalten, und danach wurden die erhaltenen Antikörper der SDS-Elektrophorese unterworfen.

Als Ergebnis wurde ein Antikörper zu dem Protein, der eine hoch-immusierende Aktivität zeigte, ausgewählt, wobei dieses Protein in dem Bereich auf der niederen Molekularseite, benachbart au dem Gebiet, das die EPO-Aktivität auf der SDS-Gel-Elektrophorese zeigte, gefunden wurde. Der ausgewählte Antikörper wurde an ein Gel von AFFI-GEL (hergestellt von

Bio-Rad Co.) gebunden, und das Gel mit dem Antikörper wurde fs

in eine Säule gepackt.

Reinigung von EPO durch SDS-Elektrophorese,

Eine Fraktion, die EPO-Aktivität zeigte (eine nicht adsorbierte Fraktion), die wie oben beschrieben erhalten worden war, wurde gegen Wasser dialysiert, und das Dialysat wurde gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten. Das erhaltene pulverförmige Material wurde in einer tris-chlorwasserstoffsäure-gepufferten Lösung, die 2 % SDS (pH 6,8) enthielt, gelöst. Die zubereitete Lösung wurde der 13 % Polyacrylamid-Gel-SDS-Elektrophorese unterworfen, wo-

^*" bei nach den —— üblichen Verfahren gearbeitet wurde.

Der Anteil des Gels, der EPO-Aktivität zeigte, wurde herausgeschnitten. Nach Zugabe von PBS, und zwar 3 Mal so viel, wie die erhaltene Gelfraktion, zu der so erhaltenen Gelfraktion wurde die entstandene Mischung fein klein-gemahlen, um ein Protein zu extrahieren. Der flüssige Extrakt enthielt 1,2 mg Protein und zeigte eine spezifische EPO-Aktivität von 50000 Einheiten (Units)/mg Protein. Nachdem der flüssige Extrakt der Dialyse gegen Wasser unterworfen worden war, wurde das Dialysat gefriergetrocknet, um ein pulverförmiges Material zu erhalten.

Zubereitung von Hybridomazellen; Aufsammeln der Zellen der Milz

Eine Maus (BALB/C Maus) wurde durch die folgenden dreistufigen Verfahren immunisiert, wobei die gereinigte Probe von dem wie oben beschrieben erhaltenen EPO als ein Antigen verwendet wurde.

Erste Stufe der Immunisierung

Eine Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS (einer wässrigen Phosphatpuffersalzlösung) mit einer Rate von 200 )ig/ml erhalten worden war, wurde mit Freund¹schem vollständigem Adjuvans gemischt, um eine Emulsion herzustellen, und 0,5 ml der zubereiteten Emulsion, entsprechend 50 EPO-Protein, wurden in die Bauchhöhle der Maus verabreicht.

Zweite Stufe der Immunisierung

Eine Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS mit einer Rate von 100 pg/ml erhalten worden war, wurde mit Freund¹schem vollständigem Adjuvans gemischt, um eine Emulsion zu erhalten, und 0,5 ml der zubereiteten Emul sion, entsprechend 25 pg EPO-Protein, wurden in die Bauchhöhle der Maus nach 2 Wochen der ersten Stufe der Immunisierung verabreicht.

Dritte Stufe der Immunisierung.

Nach 2 Wochen der zweiten Stufe der Immunisierung wurden 0,5 ml einer Lösung, die durch Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS mit einer Rate von 50 pg/ml erhalten worden war, entsprechend 25 pg EPO-Protein, weiter in die Bauche höhle der behandelten Maus verabreicht, um die Behandlung der Immunisierung zu vervollständigen.

BAD ORIGINAL

«Α * 19

Nach 3 Tagen der Beendigung der Immunisierungsbehandlung wurde die Milz der immunisierten Maus aseptisch herausgeschnitten. Nach dem Waschen der herausgeschnittenen Milz mit einer Mischungslösung aus einem synthetischen Kulturmedium (RPMI 1640 Lösung) und einer wässrigen 15 %igen Rinderfötserumlösung (FCS) wurde die gewaschene Milz in der gleichen Mischlösung mit Scheren in kleine Stücke geschnitten, um gegeneinander isolierte Einzelzellen zu erhalten. Nach dem zweimaligen Waschen der erhaltenen Einzelzellen mit der gleichen Mischlösung wurden die gewaschenen Einzelzellen in RPMI 1640 Lösung dispergiert. Die An-

zahl der Zellen darin betrug 2,0 χ 10 .

Zubereitung von Myelorazellen

Myelomzellen (P₃-NSI/! - Ag 4 - 1) wurden in der Mischung von RPMI 1640 Lösung und FCS gezüchtet, und die wachsenden Zellen wurden mit RPMI 1640 Lösung gewaschen. Die Anzahl der Zellen betrug 10 .

Zellverschmelzung

Nach dem Mischen der Dispersion aus den Zellen der Milz, die von der immunisierten Maus erhalten worden waren, mit der Dispersion aus den gebildeten Maus-Myelomzellen in RPMI 1640 Lösung wurde die Mischung dem Zentrifugieren unterworfen, um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen.

Die erhaltene Mischung aus den zwei Arten von Zellen wurde der Zellverschmelzung oder Zellfusion in einer wässrigen 50 %igen Lösung von Polyäthylenglycol 1500 unterworfen.

Nach dem Mischen der verschmolzenen Zellen, die durch die Zellverschmelzung erhalten worden waren,, mit einer HT-KuI-turmediumlösung (RPMI 1640 Lösung, die Hypoxanthin, Thymidin

und eine wässrige 15 %ige Lösung aus Rinderfötserum enthielt) wurde die flüssige Mischung auf 3 Mikrotiterplatten, von denen jede 96 Bohrungen oder Vertiefung/ besaß, verstreut verteilt. Die Zellen wurden 2 Wochen lang in den jeweiligen Vertiefungen auf den Platten gezüchtet, während HAT-Kulturmedium (RPMI 1640 Lösung, die Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und eine wässrige 15 %ige Rinderfötserumlösung enthielt) von dem zweiten Tag an hinzugegeben wurde, um dadurch die Auswahl durch HAT zu bewirken. Das Wachsen oder Wuchern der Hybridomazellen wurde in 264 Bohrungen oder Vertiefungen festgestellt.

(3) Auswahl der Zellen mit der Fähigkeit, Antikörper zu erzeugen, aus den gewachsenen oder gewucherten Hybridomazellen»

Von den gewachsenen Hybridomazellen in den jeweiligen 264 Bohrungen oder Vertiefungen (sogenannte 264 Arten von Hybridomazellen) wurden diejenigen Zellen ausgewählt, die einen Antikörper erzeugten, der an die gereinigte Probe von EPO gebunden werden konnte, während eine Abschirmung durch ein Fest-Phasen-Verfahren unter Verwendung eines Biotin-Avidin-Systems durchgeführt wurde. Als Folge davon wurden 19 Arten von Zellen als die Hybridomazellen ausgewählt, die zum Erzeugen von Antikörper geeignet sind, und insbesondere 7 Arten von Zellen von den 19 Arten derselben wurden als solche bestätigt, die eine stabilisierte Fähigkeit zur Erzeugung der Antikörper besaßen.

(⁴) Auswahl der Zellen, die den Anti-EPO-Antlkörper erzeugen, durch Prüfen der Fähigkeit zur Adsorption von EPO:

Nach dem Herstellen einer Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das ein durch die einzelnen der 7 Ar-

BAD ORIGINAL

ten von Zellen erzeugte Antikörper durch die folgenden Verfahren gebunden worden ist, wurde die Fähigkeit der Säule zum Adsorbieren von EPO untersucht, um die weitere Auswahl der Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellen durchzuführen.

In die Bauchhöhle jeweils einer von 7 Mäusen wurden 5 χ 10 Zellen jeweils von einer der 7 Arten, die oben angegeben waren, injiziert, um den Antikörper zu erzeugen, und nach dem Aufsammeln des Aszitesfluids von der injizierten Maus wurde jede Aszites mit einer wässrigen 45%-gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat fraktioniert und 40 bis 60 mg einer Ig G Fraktion wurden jeweils als Antikörper erhalten. Nach dem Binden der erhaltenen Ig G Fraktion an AFFI-GEL 10 (hergestellt von Bio-Rad Co.) durch die folgenden Verfahren wurde das zubereitete Gel in eine Säule gepackt, um eine mit AFFI-GEL 10, an das der Antikörper gebunden worden ist, bepackte Säule zu erhalten.

Das zubereitete AFFI-GEL 10, das auf ein Glasfilter gegeben wurde, wurde mit Isopropy!alkohol unter Kühlen mit Eiswasser gewaschen und wurde weiterhin dreimal mit Eiswasser gewaschen«, Das gewaschene AFFI-GEL 10 wurde in einem Volumenverhältnis von 1:1 mit einer Flüssigkeit gemischt, die den erhaltenen Antikörper (Ig G Fraktion), 0,2 M Natriumhydrogencarbonat und 0,3 M Natriumchlorid bei pH 8,3 enthielt. Die entstandene Mischung wurde 5 Stunden lang bei einer Temperatur von 4°C gerührt, um das Binden des Antikörpers an AFFI-GEL 10 durchzuführen. Dann wurde die Mischung zentrifugiert, um das Gel mit dem gebundenen Antikörper aufzusammeln, und nach dem Waschen des aufgesammelten Gels mit einer Mischung aus einer wässrigen 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung zum zweiten Mal wurde das gewaschene Gel gut mit einer wässrigen 0,1 M lithanolaminhydrochloridlösung (pH 8) 60 Minuten lang

bei Raumtemperatur zu dem Gel, an dem Antikörper gebunden ist, gemischt. Die entstandene Mischung wurde in eine Säule gepackt, um eine Säule zum Adsorbieren von EPO herzustellen. Jede der zubereiteten 7 Säulen entsprach einer der 7 Arten der vorstehend erwähnten Hybridomazellen, und die Fähigkeit der einzelnen Säulen, EPO zu adsorbieren, wurde durch die folgenden Verfahren untersucht, wobei die gereinigte Probe von EPO, die in dem Verfahrensschritt (1) erhalten worden war, verwendet wurde.

Nach dem Lösen der gereinigten Probe von EPO in PBS wurde die Lösung durch die Säule geleitet, die wie oben beschrieben hergestellt und vorher mit PBS äquilibriert worden war, und dann wurde die Säule mit einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung ausgewaschen. Die EPO-Aktivität wurde sowohl von der nicht-adsorbierten Fraktion als auch von der Eluat-Fraktion gemessen.

Als Ergebnis zeigten drei Säulen von den sieben wie oben beschrieben hergestellten Säulen die Fähigkeit, EPO zu adsorbieren.

(5) Klonen der Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellen

Jede der drei Arten der vorstehend beschriebenen Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Hybridomazellen wurde dem Klonen durch übliche Verfahren des Grenzverdünnungsverfahrens (englisch: limiting dilution method) wie folgt unterworfen.

Nach dem Dispergieren von 50 Zellen jeder Art von Hybrido-

ma und 10 Zellen des Thymus einer BALB/C Maus in 4 Wochen nach der Geburt in 10 ml einer Mischung aus RPMI 160 Lösung und einer wässrigen 15%igen Lösung von FCS wurde die Disper

BÄD ORIGINAL

sion in 96 Bohrungen oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einer Rate von 0,1 ml/Vertiefung gegossen. Die Kultur aus den Zellen wurde durchgeführt, während die gleiche Mischung in jedes Loch an dem fünften und zwölften Tag der Kultur hinzugegeben wurde. Die wachsenden oder wuchernden Zellen von Hybridoma wurden auf ihre Fähigkeit, Anti-EPQ-Antikörper zu erzeugen, durch das gleiche Pest-Phasen-Verfahren (englisch: solid-phase method) wie oben klassiert und ausgesucht und weiter der Auswahl auf die Fähigkeit zur Erzeugung von Anti-EPO-Antikörper unterworfen, indem ihre Fähigkeit, EPO zu adsorbieren, geprüft wurde, und dann wurde das Klonen durchgeführt«

Als ein Ergebnis wurden die drei Stämme E-1, E-2 und E-3 als geeigneter Stamm der Hybridomazellen für den Zweck der vorliegenden Erfindung erhalten.

Die Erzeugung des Antikörpers wurde in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei jeweils die einzelnen Anti-EPO-Antikörper erzeugenden Zellstämme E-I, E-2 und E-3 verwendet wurden. Jeder der Zellstämme wurde in die Bauchhöhle von 20 Mäusen injiziert, .um Aszitesfluid hervorzurufen, und die gesamte Menge von Aszitesfluid, die von den 20 Mäusen aufgesammelt wurde, wurde der Fraktionierung mit der wässrigen 45%-gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat unterworfen, um eine Ig G Fraktion zu erhalten. Als Ergebnis wurden 500 mg des monoklonen Antikörpers erhalten.

(II) Zubereitung einer Säule, die mit einem Adsorptionsmittel bepackt ist, an das der monoklone Antikörper gebunden war?

Durch die gleichen Verfahren, wie sie vorstehend erwähnt wurden, wurde jede der hergestellten Ig G Fraktionen an

ΪΨ

AFFI-GEL 10 gebunden, um jeweils 50 ml eines Gels zu erhalten, an das jeder monoklone Antikörper in jedem monoklonen Antikörper erzeugenden Zellstamm gebunden war, und das so mit gebundenem Antikörper versehene Gel wurde in eine Säule gepackt, um eine Säule für die Verwendung zum Adsorbieren von EPO herzustellen.

Aufsammeln von EPO;

Durch die gleichen Verfahren wie in (I), 1), wurden 50 mg des pulverförmigen Gesamt-Urinproteins von einem anämischen Patienten erhalten, und das pulverförmige Gesamt-Urinprotein, das eine EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (ünits) zeigte, wurde in 10 ml PBS (phosphat-gepufferte Salzlösung) gelöst. Nachdem die Lösung über eine Nacht gegen 40 Liter PBS dialysiert worden war, wurde das Dialyeat dem Zentrifugieren unterworfen, um 10 ml der überstehenden Flüssigkeit zu erhalten, die danach als Ursprungs- oder Originalflüssigkeit verwendet wurde.

Nach dem Hindurchleiten von 20 ml PBS durch die Säule zum Adsorbieren von EPO, das durch die gleichen Verfahren wie in (II) hergestellt worden war (0,8 cm innerer Durchmesser und 4 cm Länge, bepackt mit AFFI-GEL 10, gebunden an den monoklonen Antikörper, der durch den Zellstamm E-1 erzeugt worden war), wurden mit einer Rate von 20 ml/h zum Äquilibrieren damit 50 ml einer Mischung einer wässrigen 0,2 M Essigeäurelösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung durch die Säule hindurchgeleitet, um die Säule zu waschen, und weiterhin wurden 20 ml PBS durch die Säule hindurchgeleitet, um damit zu äguilibrieren.

Durch die vorher behandelte Säule wurden 10 ml der Ursprungsoder Originalflüssigkeit, die wie oben beschrieben hergestellt worden war, mit einer Rate von 5 ml/h hindurchgelei-

BAD ORIGINAL

tet, und nach dem Waschen des adsorbierten Materials in der Säule durch das Hindurchleiten von 20 ml PBS, anschließend 20 ml einer wässrigen mit 10 mM Phosphorsäure gepufferten Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, mit 20 ml/h
und 20 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung mit
einer Rate von 20 ml/h in dieser angegebenen Reihenfolge
durch die Säule wurden 20 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M
Natriumchloridlösung mit einer Rate von 5 ml/h als ein
Eluationsmittel durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu
erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt.

Die EPO-Äktivität in dem erhaltenen Eluat betrug 1160 Einheiten (Units), das bedeutet die Rückgewinnung von 40 %
der Aktivität der ursprünglichen Flüssigkeit mit 2900 Einheiten (Units). Darüber hinaus betrug die spezifische Aktivität von EPO in dem Eluat 45000 Einheiten (Units)/mg Protein, und die spezifische Aktivität von EPO in der ursprünglichen Flüssigkeit betrug 58 Einheiten (Units) pro mg Protein, und demzufolge wurde also die Reinheit von EPO durch die Verfahren auf das 780-fache erhöht.

Beispiel 2

Durch Verwendung einer Säule (0,8 cm innerer Durchmesser und 4 cm Länge mit einer Kapazität von 2 ml), die mit einem Gel bepackt war, an das Antikörper gebunden war, der durch den Hybridomazellenstamm E-2 erzeugt worden war, hergestellt
durch die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1, wurden die folgenden Operationen durchgeführt.

In 10 ml PBS, das 2 % SDS enthielt, wurden 50 mg (die die
EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (Units) aufwiesen) des Pulvers von Gesamt-Urinprotein, das von dem Urin von dem anämischen Patienten durch die gleichen Verfahren wie in Bei-

spiel 1 unter Verwendung einer Ultrafiltrierungsvorrichtung aufgesammelt worden war, gelöst, und nach Behandlung der Lösung durch Erhitzen der entstandenen Lösung bei 100°C für 3 Minuten wurde die behandelte Lösung eine Nacht gegen 10 Liter PBS dialysiert. Nachdem das Dialysat dem Zentrifugieren unterworfen worden war, wurde die erhaltene überstehende Flüssigkeit bis auf das fünffache Volumen mit PBS verdünnt, und die verdünnte Flüssigkeit wurde durch die vorstehend beschriebene Säule, die wie in Beispiel 1 vorbehandelt worden war, mit einer Rate von 5 ml/h geleitet. Dann wurden nach dem Hindurchleiten von 20 ml PBS, 20 ml einer wässrigen mit mM Phosphorsäure gepufferten Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und 20 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge durch die Säule, um das adsorbierte Material in der Säule zu waschen, 200 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung mit einer Rate von 20 ml/h als einem Eluationsmittel durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt. Die EPO-Aktivität des erhaltenen Eluats betrug 2600 Einheiten(Units). Da die EPO-Aktivität von 2900 Einheiten (Units) des ursprünglichen Pulvers war, betrug die Aufsammelrate 90 %. Die spezifische Aktivität von EPO in dem Eluat betrug 60000 Einheiten (Units)/mg Brotein. Die ursprüngliche Aktivität betrug 58 Einheiten (Units)/mg Protein bei dem ursprünglichen Pulver, und demzufolge war die Reinheit von EPO sogar bis auf etwa das 1000-fache des ursprünglichen Pulvers erhöht worden.

Beispiel 3

Unter Verwendung einer Säule ( 2 cm innerer Durchmesser und 6,4 cm Länge mit einer Kapazität von 20 ml), die mit einem

gebunden war Gel bepackt war, an das der Antikörper/, der durch den Hybridomazellenstamm E-3 erzeugt worden war, hergestellt durch

BAD ORIGINAL

die gleichen Verfahren wie in Beispiel 1/ wurden die folgenden Operationen durchgeführt.

500 mg eines Pulvers von Gesamt-Urinprotein, das vom Urin eines anämischen Patienten aufgesammelt worden war (EPO-Aktivität von 29000 Einheiten (units)), wurden In 50 ml PBS, das 2 % SDS enthielt, gelöst, und die entstandene Lösung wurde durch Erhitzen für 3 Minuten bei 100°C behandelt. Die behandelte Lösung wurde über eine Nacht gegen 40 Liter PBS dialysiert und wurde dann dem Zentrifugieren unterworfen, um 50 Ml einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten.

Nach dem Verdünnen der überstehenden Flüssigkeit auf das 5-fache Volumen mit PBS wurde die verdünnte Flüssigkeit durch die vorbehandelte Säule mit einer Rate von 20 ml/h geleitet. Nach dem Waschen der Säule durch Hindurchleiten von 200 ml PBS, 200 ml einer wässrigen 10 mM phosphorsäuregepufferten Lösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und 200 ml einer wässrigen 0,15 M Natriumchloridlösung durch die Säule in der angegebenen Reihenfolge mit einer Rate von 100 ml/h wurden 200 ml einer Mischung aus einer wässrigen 0,2 M Essigsäurelösung und einer 0,15 M Natriumchloridlösung durch die Säule geleitet, um ein Eluat zu erhalten, das in hohem Maße reines EPO enthielt. Die EPO-Aktivltät des EPO in dem Eluat betrug 25000 Einheiten (Units) , und der Rückgewinnungsprozentsatz an EPO betrug 86, bezogen auf den Betrag von 29000 Einheiten (Units) der EPQ-Aktlvität in dem Ursprungs- oder Originaipulver. Die spezifische EPQ-Aktivität in dem Eluat betrug 60000 Einheiten (Units)/ mg Protein, woraus eine hohe Reinheitsverbesserung von etwa dem Faktor 1000 in der Reinheit des EPO folgt.

Claims

3346336 _ 6000 Frankfurt/Main 1 (0611) 235555 Kaiserstrasse 41 04-16759 mapat d • m ·* " Telefon mainpatent frankfurt Dr. Horst Schüler _ ^ Telex (0611) 251615 PATENTANWALT Telegramm (CCITT Gruppe 2 und 3) EUROPEAN PATENTATTORNEY Telekoplerer 225/0389 Deutsche Bank AG 282420-602 Frankfurt/M. Bankkonto Postscheckkonto S / 2468 hr Zeichen/Your ref. 20.12.1983 Unser Zeichen/Our ref. Dr.HS/ki Datum /Date

Anmelder : SNOW BRAND MILK PRODUCTS CO., LTD.

1-1, Naebo-cho 6-chome, Higashi-ku_f Sapporo,
Hokkaido, Japan

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von in hohem Maße reinem Erythropoetin aus einem Erythropoetin enthaltenden Material, dadurch gekennzeichnet , daß dieses Erythropoetin enthaltende Material mit einem Adsorptionsmittel mit monoklonem
Anti-Erythropoetin-Antikörper in Kontakt gebracht
wird, wobei der monoklone Anti-Erythropoetin-Antikörper aus Hybridoma hergestellt wird, das durch
Zellfusion oder Zellverschmelzung einer Myelomzelle und einer Milzzelle eines Experimentier-Tieres, das mit Erythropoetin immunisiert worden
ist, erhalten wird, das Erythropoetin auf diesen
monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper in dem
Adsorptionsmittel adsorbiert wird, das Erythropoetin von diesem Adsorptionsmittel ausgewaschen und
das ausgewaschene Erythropoetin aufgesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / daß das Adsorptionsmittel von dem monoklonen Anti-Erythropoetin-Antikörper und AFFI-GEL oder Sephadex hergestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , daß das Erythropoetin enthaltende Material durch eine Säule geleitet wird, die mit dem Adsorptionsmittel bepackt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß das adsorbierte Erythropoetin mit einer Mischung aus Essigsäure und einer wässrigen Lösung von Natriumchlorid ausgewaschen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet / daß das einmal verwendete Adsorptionsmittel regeneriert und das regenerierte Adsorptionsmittel wiederholt in dem Adsorptionsverfahrensschritt verwendet wird.

BAD ΟΡ·0'ΜΛ|