DD259139B1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen common acute lymphoblastic leukemia-associated antigen - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit einem Antigen, welches für die neoplastischen Lymphozyten von Non-T, Non-B Akuter Lymphoblastischer Leukämie (Bezeichnung als Common Acute Lymphoblastic Leukemia-associated Antigen (CALLA) typisch sind, reagieren und dadurch zur Charakterisierung dieses Typs der Akuten Lymphoblastischen Leukämien, einschließlich der quantitativen Bestimmung des Anteils leukämischer Blasten, eingesetzt werden können, was Bedeutung für die Art der einzuleitenden Therapiemaßnahmen besitzt. Auch eine therapeutische Nutzung des monoklonalen Antikörpers selbst ist in Betracht zu ziehen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmocytomzellinie Hybridzellen erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezernieren. Diese Prinziplösung führte zur Herstellung verschiedener Hybridomlinien, die Antikörper definierter Spezifität produzieren.

So existieren eine Reihe monoklonaler Antikörper, die der näheren Charakterisierung von Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien, welche den Hauptanteil aller Typen von Akuter Lymphoblastischer Leukämie beim Menschen ausmachen, dienen. Der überwiegende Teil der Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien (ca.80%) exprimiert ein charakteristisches Oberflächenantigen, das als Common Acute Lymphoblastic Leukemia-associated Antigen (CALLA) bezeichnet wird. Dieses Antigen wird auch bei ca. 40% der Chronischen Myeloischen Leukämien (CML) im Stadium der Blastkrise exprimiert.

Seit dem 1. Internationalen Leukozytenworkshop werden alle monoklonalen Antikörper, die mit CALLA reagieren, dem CD 10 (nT, gp 100) zugeordnet. (Bernard A., Boumsell, L., Hill, C: Joint report of the First International Workshop on human leucocyte differentiation antigens by the investigators of the participating laboratories. In: Bernard A., Boumsell L., Dausset J., Milstein C, Schlossmann S. F. Eds. Leucocyte typing: human leucocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies. Springer Verlag Berlin 1984, S. 9)

Der bekannteste monoklonale Antikörper gegen das CALLA von Non-T, Non-B Akuter Lymphoblastischer Leukämie ist der Antikörper J 5 (Ritz J., Pesando J. M., Notis-Mc Conarty J., Lazarus H., Schlossmann S. F.: A monoclonal antibody to human acute

lymphoblastic leukemia antigen. Nature 283 [1980], 583). Dieser monoklonal Antikörper wird in größerem Maßstab von der Firma Coulter Electronics, Inc. vertrieben. Das von J 5 erkannte Antigen ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 95-100000Da (Newmann R. A., Sutherland R., Greaves M. F.: The biochemical characterization of a cell surface antigen associated with acute lymphoblastic leukemia and lymphocyte precursors. J.Immunol. 125, [1981], 2024]. Dieses Oberflächenantigen ist kein leukämiespezifisches Antigen, sondern wird auch auf einer kleinen Population (< 5 %) von Zellen des Knochenmarkes nichtleukämischer Kinder und junger Erwachsener ausgeprägt.

Wahrscheinlich ist der Besitz dieses immunologischen Markers ein Charakteristikum normaler Knochenmarkszellen-Vorläufer, die dann an der leukämischen Transformation beteiligt sind (Janossy, C, Bollum, F., Bradstock K., Mc Michael, A., Rapson, N., Greaves, M. F.: Terminal transferase-positive human bone marrow cells exhibit the antigenic phenotype of common acute lymphoblastic leukemia. J. Immunol. 123, [1979] 1525). Auch eine Verbreitung des CALLA auf verschiedenen nichthämatopoetischen Geweben ist bereits seit einiger Zeit bekannt (Metzgar, R. S., Borowitz, M. J., Jones, N. H., Dowell, B. L.: Distribution of cammon acute lymphoblastic leukemia antigen in nonhematopoitic tissues, J. Exp.Med. 154, [1981], 1249). Aus dem unterschiedlichen Glykosylierungsgrad des Antigens bei den verschiedenen Geweben resultiert der Schwankungsbereich des Molekulargewichtes.

Neben der bekannten Reaktion von J 5 mit verschiedenen humanen Non-T-, Non-B-Zellinien (z. B.REH, Nalm-6 u.dgl.) ist auch eine Reaktivität mit isolierten Granulozyten und ausgewählten humanen Zellinien festzustellen, für die die Expression des CALLA nicht anderweitig nachgewiesen wurde (Braun, M. P., Martin, P. J., Ledbetter, J. A., Hansen, J. A.: Granulocytes and cultured human fibroblasts express common acute lymphoblastic leukemia-associated antigens. Blood 61, [1983], 718). Es wurden auch Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen von verschiedenen etablierten T-Zellinien mit dem monoklonalen Antikörper J 5 beobachtet.

Aus der immensen Bedeutung von monoklonalen Antikörpern des CD 10 für eine schnelle Diagnosemöglichkeit von Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien mit Besitz des CALLA, sowie auch für prognostische Aussagen (Greaves, M. F., Janossy, G., Peto, J., Kay, H.: Immunologically defined subclasses of acute lymphoblastic leukemia in children: their relationship to presentation features and prognosis. Br. J. Haematol.48, [1981], 179), erwächst die Notwendigkeit einer ausreichenden Verfügbarkeit dieser monoklonalen Antikörper in der klinischen Praxis.

Eine Verfügbarkeit der monoklonalen Antikörper in größeren Mengen ist auch unter dem Aspekt einer möglichen Verwendung im Rahmen einer Serotherapie (Ritz, J., Pesando, J. M., Sallam, S. E., Clavell, L. A., Notis-Mc Conarty, J., Rosenthal, P., Schlossman, S. F.: Serotherapy of acute lymphoblastic leukemia with monoclonal antibody. Blood 58, [1981] 141) oder anderen Therapievarianten, wie ζ. B. der Reinigung des Knochenmarkes von Leukämieblasten bei autologer Knochenmarkstransplantation, unbedingt erforderlich.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen das CALLA (Mol-Gew. ca. 100 000 Da) von Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien gestattet. Dabei soll eine gleichbleibende Qualität gewährleistet sein. Die Anti-CALLA-Antikörper sollen eine bessere Spezifität als die bekannten CD 10-Antikörper aufweisen, besonders soll Nebenreaktivität mit T-Zellen ausgeschlossen sein. Die Antikörper sollen mit Fluoreszenzfarbstoffen und anderen Markierungssubstanzen bei völligem Erhalt der Aktivität kopplungsfähig sein. Die monoklonale Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest für CALLA- positive Non-T, Non-B Akute Lymphoblastische Leukämien eignen. Die Affinität der Antikörper soll höher sein als der bekannten, so daß verkürzte Reaktionszeiten den Nachweis wesentlich rationalisieren.

Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die Diagnostik von Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien qualifiziert und ein schnellerer und wirkungsvollerer therpeutischer Eingriff ermöglicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonalen Antikörper erzeugt werden, die mit dem größten Teil der Non-T, Non-B Akuten Lymphoblastischen Leukämien reagieren.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß entsprechend den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphoblasten aus dem peripheren Blut eines Patienten mit CALLA-positiver Non-B Akuter Lymphoblastischer Leukämie isoliert werden.

Mit den so gewonnenen Leukämieblasten werden vorzugsweise 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse immunisiert. Dabei erfolgt die Immunisierung durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert.

Die geeigneten Maus-B-Myelomzellen P3-X63-Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die Selektion erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200/u.l-Kulturen aufgeteilt werden.

Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit dem CALLA von Non-T, Non-B-Zellen reagieren.

Hierzu werden zunächst alle Kulturüberstände mit Zellen der humanen Non-T-, Non-B-Zellinie REH, sowie parallel dazu mit humanen Blutlymphozyten getestet. Es werden nur die Kulturen weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit den humanen peripheren Blutlymphozyten, wohl aber mit der Mehrheit der REH-Zellen reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den

entsprechenden Zellen erfolgt mittels indirekter Immunfluoreszenztechnik. Mit Hilfe dieser Technik werden die so selektierten Kulturen kontinuierlich überprüft. Unter den in beschriebener Art vorselektierten Hybridomen werden nun erfindungsgemäß solche gesucht, deren Antikörper auch in der Lage sind, mit Granulozyten und der humanen T-Zellinie CEM zu reagieren. Im dritten Selektionsschritt werden unter den so selektierten Hybridomen erfindungsgemäß solche gesucht, deren Antikörper in der Lage sind, mit dem Zelloberflächenprotein der Non-T-, Non-B-Zellen von ca. 100000Da zu reagieren. Dazu werden die Oberflächenproteine von REH-Zellen nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert. Die Nonidet-P-40-Lysate solcher markierten REH-Zellen werden mit den zu untersuchenden Hybridomkulturüberständen inkubiert und anschließend die monoklonalen Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von unspezifisch gebundenen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodezylsulfat-Puffer aufgelöst und einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-15%) unterzogen.

Anhand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht des radioiodierten, durch den monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten Zelloberflächenantigens der Non-T-, Non-B-Zellen bestimmt. Es werden nur solche Hybridome ausgewählt, die mit einem Zelloberflächenantigen reagieren, das im unreduzierten und reduzierten Zustand ein app. Molekulargewicht von ca. 10000Da aufweist.

Zur Überprüfung der Eignung der so selektierten Hybridome für die Charakterisierung von Non-T, Non-B Akuter Lymphoblastischer Leukämie werden Testungen an Leukämieblasten aus dem peripheren Blut der Patienten mit klinisch gesicherter Akuter Lymphoblastischer Leukämie von Non-T-, Non-B-Typ durchgeführt. Die nach allen Selektionsschritten verbleibenden geeigneten Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten Antikörper stabil produzieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-CALLA bezeichnet. Besonders geeignet ist der Zeilklon H-BL-CALLA/1. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper gegen das CALLA von Non-T, Non-B Akuter Lymphoblastischer Leukämie BL-CALLA/1 basiert auf einem Verfahren, welches auf die Verwendung der Hybridoms H-BL-CALLA/1 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-CALLA/1 wird an der Sektion Biowissenschaften der KMU Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviert vor und ist zugänglich.

Der produzierte monoklonale Antikörper BL-CALLA/1 hat die Registriernummer DDR-0149 im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Das Hybridom H-BL-CALLA/1 produziert bei In-vitro-Kultur bis zu 100 Mg/ml monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1. Es handelt sich um einen IgG-Antikörper. Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen wird das Hybridom H-BL-CALLA/1 in histokompatible BALB/c-Mäuse i. p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinumsubliquidum,Pristan o. dgl. vorbehandelt wurden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-CALLA/1 bestehen. Diese Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt einer weiteren Reinigung unterzogen. Dafür kommen Salzpräzipitationen, DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage.

Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10mg BL-CALLA/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipiert, z. B. mit 40-50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse gegen NH^jHCOyLösung führt zu einem Produkt, das in lyophilisierter Form bei 4°C haltbar ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die zur Antikörperproduktion befähigten Hybridomzellen H-BL-CALLA/1 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das Antikörper-haltige Kulturmedium mit 40—50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ behandelt und somit eine Gammaglobulinfraktion ausgefällt. Eine weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographieo.dgl. möglich.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendund von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 x 10"⁵M Mercaptoethanol und 100mg/l Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetals Kälberserum mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35 und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu kultivieren. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei eine Kulturdauer von 3—4 Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt.

Der nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellte monoklonale Antikörper BL-CALLA/1 weist das in Tabelle 1 angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Mit permanent wachsenden humanen Zellinien reagierte er in der in Tabelle 2 dokumentierten Art und Weise.

Der monoklonale Antikörper BL-CALLA/1 weist eine erstaunlich hohe Affinität gegenüber humanen Non-T, Non-B-Zellen auf. Abbildung 1 zeigt vergleichend die Reaktivität von BL-CALLA/1 und J 5 (CD 10) gegenüber der Non-T-, Non-B-Zellinie REH. Daraus ist ersichtlich, daß BL-CALLA/1 die gleichen Zellen wesentlich stärker anfärbt, was auf eine höhere Affinität des Antikörpers zurückgeführt werden kann. Isolierte Granulozyten werden von BL-CALLA/1 in gleichem Maße wie auch von J 5 erkannt.

Es ist hervorzuheben, daß die monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1 innerhalb der getesteten humanen T-Zellinien nur mit der Zellinie CEM reagiert. Im Gegensatz dazu zeigt J 5 neben dieser Reaktivität auch eine komplexe unspezifische Markierung der Zellinie MOLT-4, wie Abb. 2 verdeutlicht.

Das von den monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1 gebundene Zelloberflächenantigen ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 10000Da und entspricht dem CALLA.

Tabelle 1

Indirekte Immunfluoreszenz von monoklonalen Antikörpern BL-CALLA/1 mit verschiedenen Blutzellen

Zellen % markierte Zellen

Erythrozyten	0
Thrombozyten	0
Monozyten	0
Granulozyten	>80

Lymphozyten (peripheres Blut) 0

Legenden zu den Abbildungen

Abb. 1. Markierung von CALLA-positiven Non-T-, Non-B-Zellen der permanenten Zellinie REH mit dem monoklonalen Antikörper BL-CALLA/1. Im Vergleich die schwächere Markierung mit dem monoklonalen Antikörper J 5. Als Kontrolle für die nichtmarkierten REH-Zellen wurde inertes Mausimmunglobulin verwendet. Alle 3 Proben wurden mit FITC-markierten Anti-Mausimmunglobulin entwickelt und die Histogramme mit dem FACS440 aufgenommen.

Abb. 2. Nachweis der Nichtreaktivität des monoklonalen Antikörpers BL-CALLA/1 mit der permanent wachsenden T-Zellinie MOLT-4. Im Gegensatz dazu zeigt der monoklonale Antikörper J S eine schwache Markierung. Als Kontrolle diente inertes Mausimmunglobulin. Alle 3 Proben wurden mit FITC-markierten Anti-Mausimmunglobulin entwickelt und die Histogramme mit dem FACS440 aufgenommen.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Common Acute Lymphoblastic Leukemia-associated Antigen von non-T, non-B Lymphozyten durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit Leukämieblasten von Patienten mit non-T, non-B akuter lymphoblastischer Leukämie, Fusion von aus der Milz der Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Separierung gebildeter Hybridzellen von nicht fusionierten Myelomzellen sowie Selektierung und Kultivierung der Hybridome, die den gewünschten Antikörper produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-CALLA/1, das ein Zelloberf lächenglykoprotein von 100 Kd besitzt, ausgewählt wird.

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