DD224769A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen myeloische leukaemiezellen des menschen - Google Patents
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Abstract
Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Antikoerpern hoher Spezifitaet in guten Ausbeuten. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Balb/c-Maeusen, die mit humanen myeloischen Leukaemiezellen immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre Bindungsspezifitaet an verschiedene Zelltypen bestimmt und die spezifischen Hybridome fuer die Antikoerperproduktion auswaehlt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik und Therapie.
Description
BÖTTGER, Volker
HERIUG, Silvia
Dr. MICHEEL, Burkhard
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen myeloische Leukämiezellen des Menschen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen myeloische Leukämien des Menschen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik und Therapie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Verschiedene Leukämien humanen Ursprungs können in der Zellkultur unbegrenzt gehalten werden. Die Linie K562 wurde nrsprünglich von einem Patienten mit- chronisch-myeloischer Leukämie (CiIL) angelegt (LOZZIO u. LOZZIO, Blood 1975,' !£, 321)· Sie besitzt Eigenschaften einer pluripotenten Stammzelle.
Verschiedene monoklonale Antikörper gegen humane Leukämiezellen sind bekannt, es wurden auch schon derartige Antikörper gegen K562-Zellen beschrieben (YOUlTG et al., Proc. Nat.Acad.Sci. 1981, 78, 7073; SCHIElILE u. MÜLLER-RUCHHOLTZ, J. Cancer Res.Clin.Oncol. 1981, 101, 109). Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgte durch die bekannten Techniken der Zellfusion und Selektion antikörperproduzierender Hybridome. Die bisher beschriebenen Anti-K562-Antikörper reagieren jedoch nicht ausschließlich mit Leukämiezellen und sind daher für eine medizinische Diagnostik und Therapie nur bedingt einsetzbar.
c —
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper hoher Spezifität gegen bestimmte Leukämiezellen herzustellen. Diese Antikörper sollen für die immunhistologische und serologische Diagnostik und möglicherweise nach Kopplung mit einem zytοtoxischen Reagens für die Therapie derartiger Leukämien geeignet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen K562- und andere myeloische Leukämiezellen ist dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit K562-Zellen immunisiert wurden, mit X63-Ag8.653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert und die erhaltenen Hybridome in Mikrotestplatten' aussät. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit Radioimmun-, Immunofluoreszenz- und Rosettentests nachgewiesen. Die reaktiven Hybridome werden kloniert, ihre Spezifität wird erfindungsgemäß mit einer Vielzahl von normalen und leukämischen Zellen und mit Hilfe obengenannter serologischer Tests ermittelt. Die spezifischen Hybridome werden ausgewählt, weitervermehrt, in flüssigem Stickstoff gelagert und bei Bedarf zur Produktion größerer Antikörpermengen auf Mäusen in Aszitesform transplantiert. Bei der Immunisierung von Mäusen mit der Zellinie K562, die zahlreiche Eigenschaften von Stammzellen besitzt, ist die
die
Bildung von verschiedenen Antikörpern zu erwart en ,=&& unterschiedliche weiße Blutzellen sowie Leukämieζeilen verschiedenen histologischen Ursprungs erkennen. Die Bildung von Antikörpern, die nur mit K562-Zellen oder nur mit bestimmten Leukämiezellen reagieren, ist dabei sehr unv/ahrscheinlich.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden:
1) Herstellung der Hybridome aus Milzzellen von BaIb/c-Mäusen und X63-Ag8.653 Myelomzellen. Fusion, Kultivierung, Klonierung etc. in Anlehnung an die Originalarbeit KÖHLER und MILSTEIlT, Nature 1975, 256, 495. Die Myelomlinie X63-Ag8.653 wurde von KEAEBEY et al., J.Immunol. 1979, 123, 1547, hergestellt.
2) Die Selektion antikörperproduzierender Hybridome erfolgte mit einem Radioimmuntest, bei dem vitale K562-Zellen nacheinander mit dem Kulturüberstand der Hybridome und
1 25 anschließend mit J-markierten Anti-Maus-Ig-Antikörpern inkubiert wurden.
3) Die Ermittlung der ileaktionsspezifität der identifizierten Antikörper erfolgte durch Austesten von verschiedenen kultivierten Zellinien, normalen weißen Blutzellen und Leukämiezellen unterschiedlichen histologischen Ursprungs mit dem Radioimmuntest, dem Rosettenimmuntest (Inkubation der vitalen Zellen mit den Antikörpern und anschließend mit Protein-A-markierten Rinder- oder Schaferythrozyten) und in erster Linie mit dem indirekten Immunofluoreszenztest an fixierten Zellen (Inkubation der auf Objektträger angetrockneten und Azeton-fixierten Zellen mit den Antikörpern und anschließend mit Pluoreszsin-markierten Anti-Maus-Ig-Antikörpern)· Die Auswertung erfolgte mit einem Gammastrahlen-Zählgerät unter dem Lichtmikroskop oder unter dem Fluoreszenzmikroskop entsprechend dem angewendeten Test.
Bezeichnung der
Antikörper
ZIK-C1-A/D9 (Laborbezeichnung J; Ig-Subklasse: IgG 1)
ausschließlich K562 und myelöische Leukämieζeilen (von 35 getesteten Leukämien zeigten 24 eine positive Reaktion, d.h. etwa 70 %)
ZIK-C1-A/C5 K562 und weiße
(Laborbezeichnung C; Blutzellen der
Ig-Subklasse: lymphatischen
IgG 2a Reihe
ZIK-C1-A/H5 . K562 und weiße (Laborbezeichnung H) Blutzellen der
granulozytären
Reihe
Dieser Antikörper bietet sich damit für eine Anwendung in der Diagnostik und Therapie myeloischer Leukämien geradezu an.
Diese Antikörper sind für immunhistologische Untersuchungen in der. Hämatologie anwendbar.
4) Herstellung der Antikörper
Die Gewinnung der Antikörper erfolgte aus der Kulturflüssigkeit der kultivierten bzw. aus der Aszitesflüssigkeit der transplantierten Hybridome entsprechend üblicher Methoden (KENTTETT, McKEARU u. 3ECHT0L: Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A Nev/ Dimension in Biological Analyses. Plenum Press, New York u. London 1981).
5) Anwendungsm'dglichkeiten der erhaltenen Antikörper:
Alle erhaltenen Antikörper können für immunhistologische Tests bei hämatologischen Untersuchungen herangezogen werden. Besonders der Antikörper ZIK-C1-A/D9 bietet sich für eine immunhistologische bzw. serologische Differenzierung von myeloischen Leukämien an. Nach Kopplung mit toxischen Substanzen erscheint eine Anwendung in der Therapie myeloischer Leukämien ebenfalls sinnvoll, entweder durch In-vivo-Injektion oder durch In-Vitro-Behandlung autologer Knochenmarktransplantate bei Patienten mit diesen Erkrankungen.
Claims (2)
- -S-Erfindungsauspruch1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen myeloische Leukämiezellen des Menschen, dadurch gekennzeichnet,daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen.,; die mit humanen myeloischen Leukämiezellen (in diesem Pail. der Zellinie K562) immunisiert wurden, mit X63-Ag8«653 Myelomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikörperproduzierenden Hybridome selektiert, ihre Bindungsspezifität an verschiedene Zelltypen bestimmt, die spezifischen Hybridome auswählt und in bekannter Weise kultiviert oder auf Mäusen in Aszitesform transplantiert.
- 2. Verfahren nach Punkt 1·,dadurch gekennzeichnet, . i'daß man durch Immunisierung mit einer Zellinie mit Stammzellcharakter (K 562) monoklonale Antikörper erhält, die unterschiedliche weiße Blutzellen sowie Leukämieζeilen einer ganz bestimmten histologischen Spezifität (myeloische Leukämien) erkennen können.
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|---|---|---|---|---|
| CN117256565A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-22 | 广东药科大学 | 一种人源ezh2条件性过表达的慢性髓系白血病小鼠模型的构建方法 |
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1984
- 1984-04-24 DD DD26222784A patent/DD224769A1/de not_active IP Right Cessation
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