DD259136B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer die alpha-kette der hormone tsh, fsh, lh und hcg - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren гиг Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit der α-Kette des humanen TSH, (Thyreoidea stimulierendes Hormon) reagieren, ohne durch einen an einem ß-Kettenepitop gebundenen Antikörper behindert zu werden. Solche monoklonalen Antikörper können nach Ankopplung eines geeigneten Markers als Nachweisantikörper in Immunassays zur quantitativen Bestimmung von TSH dienen. Aufgrund der Ähnlichkeit der α-Kette von TSH und der α-Kette der Gonadotropine FSH, LH und HCG können solche monoklonalen Antikörper auch als Nachweisantikörper in Immunassays für diese Gonadotropine eingesetzt werden. Die quantitative Bestimmung von TSH und den Gonadotropinen ist für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das TSH wird von den basophilen Zellen des Hypophysenvorderlappens gebildet. Es ist ein Glycoprotein, welches aus je einer α- und ß-Kette, die nicht kovalent verbunden sind, besteht. Während die α-Kette auch Bestandteil anderer Proteohormone, wie der Gonadotropine LH, FSH und HCG ist, ist die ß-Kette für die spezifische Hormonwirkung des TSH verantwortlich. Das Molekulargewicht der ß-Kette beträgt etwa 14.500Da, das der α-Kette 14.000Da und das des kompletten TSH 28.900 DA. Die α-Kette wird im Überschuß produziert, so daß auch die freie Form im Serum vorkommen kann. Zudem läßt das Vorkommen der α-Kette als Bestandteil der ebenfalls im Serum vorhandenen Gonadotropine die Verwendung von Anti-a-Ketten-Antikörpern nur als Nachweisantikörper zu, wobei die Spezifität der Reaktion durch den Fangantikörper bestimmt wird. FürdieTSH-Bestimmung ist somit ein Immunassay geeignet, bei dem die Spezifität durch einen Anti-ß-Ketten-Antikörper als Fänger bestimmt wird und der Nachweis des gebundenen TSH über einen Anti-a-Ketten-Antikörper erfolgt. Somit wird gewährleistet, daß nur intaktes, biologisch wirksames TSH nachgewiesen wird. Gleiches gilt auch analog für die Gonadotropine FSH, LH und HCG. Immunassays für TSH, wie z. B. der von der Firma Boehringer Mannheim, verwenden konventionelle, polygonale Antiseren gegen die a-Kettenepitope als Nachweisreagenz. Die Herstellung solcher Antiseren ist aufgrund der notwendigen Absorption zur Erzielung der a-Spezifität aufwendig, teuer und nicht praktikabel. Außerdem sind solche konventionellen Antiseren nicht identisch zu reproduzieren, was den Test chargenabhängig macht. Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die in reproduzierbarer Weise von Hybridomen produziert werden, würde eine elegante und kostengünstige Lösung dieses Problems darstellen.

Es sind bereits monoklonale Antikörper bekannt, die Epitope der α-Kette von TSH, FSH, LH und HCG erkennen. Sie sind nach der von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], 495) entwickelten Methodik hergestellt. So wird in der DD-PS 244564 beschrieben, daß der Hybridklon B9-AB9 monoklonale Antikörper produziert, die HCG, LH, FSH, TSH mit unterschiedlicher Intensität binden. Dabei ist die Bindungsstärke zu TSH am geringsten. - In der EP O 173973 werden monoklonale Antikörper beschrieben, die mit der α-Kette von TSH reagieren. Aus einer Vielzahl von Hybridomen, hergestellt nach der KÖHLER-MILSTEIN-Zellfusionstechnik (a. a. O.) haben die besten monoklonalen Antikörper eine Affinitätskonstante zur α-Kette des TSH von 3,8 · 10⁹ bzw. 4,5 oder 3,8 · 10⁸l/Mol. Das ist für eine quantitative Bestimmung kein völlig befriedigender Wert.

In einer Reihe von Publikationen werden monoklonale Antikörper beschrieben, die nach der KÖHLER-MILSTEIN-Zellfusionstechnik dergestalt erhalten werden, daß Versuchstiere mit HCG immunisiert werden (Norman, R. J. et al., CMn. Chem, 33[7], 1987,1147-51; Belanger, A. et al., J. Immunoassay 7[1-2], 1986,37-55; Gupta, S. K., Indian J. Med. Res. 81,1985,281-85; Teh, CZ. et al., J. Appl. Biochem. 6(1-2], 1984,48-55; Domingo, M.T. et al., Protides Biol. Fluids 31,1983,1035-38; Wang, L et al., a. a. 0.30,1982,549-93; Kofler, R. et al., Am. J. Reprod. Immunol. 2(4], 1982,212-16). Das erfolgt offenbar aus ökonomischen Gründen. Die erhaltenen monoklonalen Antikörper sind vordergründig zur HCG-Bestimmung vorgesehen. Obwohl die α-Ketten der vier in Rede stehenden Proteohormone viele Ähnlichkeiten aufweisen, sind sie nach neueren Erkenntnissen nicht identisch. Insbesondere prägen sich Unterschiede dann aus, wenn die ß-Kette bereits an einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, was auf die Bindung der α-Kette an monoklonale Antikörper einen erkennbaren, wenn auch nicht vorhersehbaren Einfluß ausübt. Die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern, die an a-Kettenepitope des TSH mit hoher Effektivität binden, wäre ein entscheidender technischer Fortschritt bei der Entwicklung von Immunassays, da alle Immunreagenzien dann als reproduzierbare monoklonale Antikörper vorliegen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für Determinanten der α-Kette des humanen TSH sowie der α-Ketten der humanen Gonadotropine LH, FSH und HCG gestattet. Die Antikörper sollen nicht mit Epitopen, die auf den ß-Ketten der genannten Proteohormone lokalisiert sind, kreuzreagieren. Weiterhin sollen solche a-Kettenepitope von dem monoklonalen Antikörpern erkannt werden, bei denen keine sterische Behinderung durch vorher gebundene Anti-ß-Ketten-Antikörper eintritt. Im Interesse kurzer Reaktionszeiten sollen die monoklonalen Antikörper eine hohe Affinität aufweisen. Die Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein. Weiterhin sollen sie kopplungsfähig sein, um sie mit geeigneten Substanzen, wie z. B. Enzyme oder Radioisotope, ohne Aktivitätsverlust zu markieren. Durch die Bereitstellung solcher monoklonaler Antikörper soll die Diagnostik von TSH und den Gonadotropinen LH, FSH und HCG im Serum verbessert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonaie Antikörper erzeugt werden, die mit Epitopen der α-Ketten von TSH, LH, FSH und HCG spezifisch reagieren. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß isolierte gereinigte α-Ketten oder eines der genannten Hormone kovalent an hochmolekulare Carriermoleküle, z. B. Thyreoglobulin, gekoppelt werden. Mit diesem immunogenen Konjugat werden vorzugsweise 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse immunisiert. Das Antigenkonjugat wird als Emulsion mit komplettem Freundschen Adjuvans appliziert. Die Hyperimmunisierung erfolgt durch mehrfache Antigengabe. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert.

Die geeigneten Maus-B-Myelomzellen P3-Х63-Ag8,653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979] 1548), werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin undThymidin enthäl (LITTLEFIELD, Science 145, [1964] 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die Selektion erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden.

Die Überstände der Kulturen, die Hybridzellen enthalten, werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit a-Kettenepitopen der Proteohormone TSH, LH, FSH und HCG reagieren. Hierzu wird erfindungsgemäß ein Test eingesetzt, der in der ersten Stufe auf der Bindung von den in den zu testenden Hybridzellkulturüberständen enthaltenen monoklonalen Antikörpern an festphasengebundenes TSH beruht. Das TSH kann dabei direkt oder über einen ß-spezifischen Antikörper an die feste Phase gekoppelt werden. Der Nachweis der gebundenen monoklonalen Mausantikörper erfolgt durch einen markierten Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper.

Antikörperhaltige Hybridomkulturen werden ausgewählt und die Antikörper in der zweiten Selektionsstufe überprüft, ob sie außer an TSH auch an LH, FSH und HCG binden. Dazu werden die zu testenden Kulturüberstände mit Proben der radioiodierten Hormone inkubiert und anschließend mit Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper in Anwesenheit von Polyethylenglykol ausgefällt. Kulturen, deren monoklonale Antikörper alle Proteohormone mit vergleichbarer Effektivität binden, werden weitergezogen. In der dritten Selektionsstufe wird getestet, ob die vorselektierten monoklonalen Antikörper mit radioiodierten, isolierten α- oder ß-Ketten reagieren. Dazu wird das gleiche Testsystem wie für Stufe 2 eingesetzt. Nur α-Ketten spezifische Kulturen werden weiterkultiviert. Unter den verbleibenden monoklonalen Antikörpern werden in der vierten Selektionsstufe diejenigen ausgewählt, die die höchste Affinität aufweisen.

Nach dieser Selektionsstrategie als geeignet befundene antikörperbildende Hybridzellkulturen werden mehrfach nach der Grenzverdünnungsmethode rekloniert. Dabei werden Hybridomsubklone ausgewählt, die außer den beschriebenen Spezifitäts- und Affinitätskriterien stabil monoklonale Antikörper in hoher Menge sezernieren.

Besonders geeignet für die Erfüllung der eingangs erwähnten Zielstellungen haben sich Hybridome H-BL-PH(a) 24,152 und 261 erwiesen. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper, die mit a-Kettenepitopen des TSH und der Genadotropine LH, FSH und HCG reagieren, basiert auf der Kultivierung der 3 genannten Hybridome. Sie werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Sie liegen kryokonserviert vor und sind zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-PH(a) 24,152,261 bzw. die sie sezernierenden Hybridome haben die Registriernummern DDR - 0145, DDR - 0146 und DDR - 0147 in der Liste der monoklonalen Antikörper, die im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR geführt wird, erhalten. Für die Kultivierung ist zweckmäßig als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 χ 10~⁵M Mercaptoethanol und lOOmg/IGentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes

Serum, ζ. B. Pferdeserum mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei 37°C zu kultivieren. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kulturdauer von 3-4 Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt. Die monoklonalen Antikörper BL-PH(a) 24,152 und 261 sind im Kulturüberstand bis zu 200 цд/ті enthalten und können aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden. Zur Gewinnung größerer Mengen dieser monoklonalen Antikörper werden die obengenannten Hybridome in BALB/c-Mäuse injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliqudium, Pristan o.dgl. vorbehandelt werden. Nach der Aszitesbildung wird dieser durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend aus Zellen der Hybridome H-BL-PH(a) 24,152 oder 261 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue vorbehandelte Mäuse injiziert werden. Der zellfreie Überstand, der entweder den monoklonalen Antikörper BL-PH(a) 24, BL-PH(a) 152 oder BL-PH(a) 261 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen. Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage. Die Arszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-20 mg der monoklonalen Antikörper. Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20 mg/ml.

Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse gegen NH₄HCO₃-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +4⁰C haltbar ist.

Die nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-PH(a) 24,152 und 261 besitzen eine hohe Spezifität für die Epitope der α-Kette von TSH, LH, FSH und HCG (Tab. 1). Die monoklonalen Antikörper binden nicht die isolierte ß-Kette des TSH, wohl aber die α-Kette (Tab. 1). Die Antikörper sind hoch affin (K_A < 101° M"¹). Alle 3 monoklonalen Antikörper können kovalent mit Enzymen, wie z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, oder Radioisotopen, wie z. B. ¹²⁵I, gekoppelt werden und als Nachweisreagenzien zur quantitativen Bestimmung sowohl von TSH als auch der Gonadotropine LH, FSH oder HCG eingesetzt werden.

Tabelle 1

Bindung (%) von "'!-markierten LH, FSH, HCG und HCG(ß) von TSH und dessen α- und ß-Kette

	LH	FSH	HCG	HCG(ß)	TSH	TSH(a)	TSH(ß)
BL-PH(a)24	79,0	62,0	73,0	0,1	70,0	82,0	1,9
BL-PH(a)152	75,0	59,0	65,0	0,1	68,0	75,0	1,8
BL-PH(a)261	72,0	65,0	71,0	0,1	72,0	78,0	2,2

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für Epitope der α-Ketten der Proteohormone TSH, FSH, LH und HCG durch Immunisierung von Mäusen mit einem Antigen, welches die α-Kette der genannten Proteohormone enthält, Fusion von aus der Milz immunisierten Mäusen gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Separierung gebildeter Hybridzellen von nicht fusionierten Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonale Antikörper sezernieren, die spezifisch mit Epitopen der α-Kette der genannten Proteohormone reagieren, dadurch gekennzeichnet,

daß zur Immunisierung ein konvalent gekoppeltes hochimmunogenes TSH Carrierkonjugat als Immunogen eingesetzt wird,

durch die Gestaltung einer Testhierarchie die Hybridome H-BL-PH(a) 24,152,261 ausgewählt werden, deren monoklonale Antikörper spezifisch für die α-Kette von TSH, FSH, LH und HCG und als Nachweisreagenzien geeignet sind,

indem in einer ersten Selektionsstufe ein Assay verwendet wird, der monoklonale Antikörper mit besonderer Eignung als Detektionsreagens für festphasengebundenes TSH erkennt, woran sich ein zweiter Schritt anschließt,

mit dessen Hilfe diejenigen Hybridome ausgewählt werden, deren Antikörper in gleicher Weise mit FSH, LH und HCG sowie der isolierten α-Kette, nicht jedoch mit den ß-Ketten dieser Hormone oder mit Determinanten anderer Proteine reagieren und schließlich in einem dritten Schritt nur hoch affine Antikörper selektiert werden,

wobei die monoklonalen Antikörper BL-PH(a) 24,152,261 als vorteilhaft einsetzbar erkannt werden und durch Kultur der zugehörigen Hybridome in vitro oder in vivo hergestellt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,

daß zur Immunisierung der BALB/c-Mäuse ein kovalentesTSH-Thyreoglobulin-Konjugat verwendet wird.