DD238864B1 - Verfahren zur immunhistochemischen differenzierung verschiedener epithelien mittels monoklonaler antikoerper - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Nutzung monoklonaler Antikörper gegen individuelle Zytokeratine (charakteristische Proteine von Epithelzellen). Anwendungsgebiete sind die medizinische Diagnostik und die biologisch-medizinische Grundlagenforschung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die einwandfreie Identifizierung der verschiedenen histologischen Differenzierungslinien ist von erheblicher Bedeutung für das Verständnis der normalen Histogenese und der Pathogenese von Geweben. Wegen des Fehlens geeigneter Marker war die Zuordnung pathologisch veränderter Zellen zu deren Stammzellen oft nicht sicher möglich. Ein besonderes Problem stellt die histologische Zuordnung bei in vitro kultivierten Zellen dar, da sehr viele Marker unter In-vitro-Bedingungen nicht stabil sind. Mit der Entdeckung der Intermediärfilamente hat sich diese Situation grundlegend verändert, da diese sehr stabile gewebsspezifische, immunologisch faßbare Marker darstellen (OSBORN, M. u. WEBER, K., Lab. Investig. 48,372-394,1983). Die Intermediärfilamente der Epithel- u. Mesothelzellen bestehen aus Zytokeratinen und lassen sich mit konventionellen Antiseren öder monoklonalen, gegen alle oder ein breites Spektrum der Zytokeratine gerichteten Antikörper immunhistochemisch nachweisen und von Geweben anderer Herkunft abgrenzen. Solche Antiseren sind kommerziell erhältlich. Verschiedene Epithelien (Plattenepithel, Gallengangsepithel, Kolonepithel bzw. deren maligne Entartungen) enthalten charakteristische Muster individueller Zytokeratine. Diese können jedoch bisher nur mittels biochemischer Methoden aufgetrennt und unterschieden werden (MOLL, R., FRANKE, W. W., SCHILLER, D. L., GEIGER, B. und KREPTER, R.: Cell 31,11-24, 1982), was sehr aufwendig ist und keine Zuordnung zu einzelnen Zellen oder histologischen Strukturen ermöglicht. Die verschiedenen Zytokeratin-Proteine haben jedoch sowohl gemeinsame als auch individuelle Antigen-Determinanten. Wenn es gelingt, monoklonale Antikörper gegen die letzteren zu erhalten, so steht eine einfache und elegante Möglichkeit der Typisierung von Epithelien zur Verfugung.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonale Antikörper gegen individuelle Zytokeratine herzustellen und diese zur histologischen Typisierung verschiedener Epithelien und ihrer pathologischen Veränderungen sowie zur Identifizierung von Zellen epithelialer Herkunft in der Zellkultur einzusetzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur immunhistochemischen Differenzierung verschiedener Epithelien mittels monoklonaler Antikörper ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Hybridomklon A53-B/A2 (hinterlegt im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter der Nr.0070/Liste 1985/) in vitro kultiviert, den gebildeten monoklonalen Antikörper isoliert und mit diesem die zu untersuchenden Präparate reagieren läßt.

Der Hybridomklon A53-B/A2 sowie weitere Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen individuelle Zytokeratine produzieren, werden gewonnen, indem man Balb/c-Mäuse mit einer epithelialen Zellinie, die dieses Protein besitzt, oder mit einer Zytoskelettpräparation daraus immunisiert, die Milzzellen dieser Mäuse mit Maus-Plasmozytomzellen fusioniert, antikörperproduzierende Klone heranzüchtet und die Spezifität der gebildeten Antikörper in einem geeigneten Testsystem ermittelt. Die Teststrategie besteht in folgenden Schritten:

1) Indirekter Immunfluoreszenztest an epithelialen und (als Negativkontrolle) nichtepithelialen Zellen zur Suche nach epithelspezifischen Antikörpern

2) Indirekter Immunfluoreszenztest an einer geeigneten epithelialen Zellinie zur Identifizierung der Antigenlokalisation innerhalb der Zelle zur Suche nach Antikörpern gegen Intermediärfilamente

3) Indirekter Immunfluoreszenztest an epithelialen Zellinien oder Gefrierschnitten epithelialer Gewebe, deren Zytokeratin bekannt ist, zur Selektion.von monoklonalen anti-Zytokeratin-Antikörpern eingeschränkter Spezifität

4) Absicherung der Spezifität mittels Bindung an durch Gelelektrophorese getrennte Zytokeratine. Auf diese Weise erhaltene spezifische Hybridomklone (z. B. A53-B/A2) werden rekloniert, vermehrt und in flüssigen Stickstoff konserviert.

Der Hybridomklon A53-B/A2 (ZIM-Liste 1985: 0070) produziert einen monoklonalen Antikörper mit folgenden Eigenschaften: _a) Maus-Antikörper des Isotyps IgG 2 a b) Der Antikörper reagiert spezifisch mit Zytokeratin Nr. 19.

c) Der Antikörper reagiert in der Immunhistologie positiv mit fötaler Epidermis, einfachen Epithelien wie Gallengangs-und Amnionepithel sowie mit Mesothel, aber nicht mit adulter Epidermis und mit Hepatozyten. Er reagiert weiterhin positiv mit den meisten Karzinomen, ist aber negativ mit der Zellinie HeLa.

d) A53-B/A2 zeigt bei anderen Mammaliern (Meerschwein, Ratte) ein ähnliches Reaktionsmuster.

Die eigentliche Produktion der Antikörper erfolgt vorzugsweise in vitro. Das zentrifugierte Kulturmedium kann im indirekten immunhistologischen Test an Gefrierschnitten unmittelbar eingesetzt werden. Nach Reinigung des monoklonalen Antikörpers und Kopplung mit einem geeigneten Marker kann der Test auch direkt (in einem Inkubationsschritt) durchgeführt werden, wodurch der Test insgesamt weniger als eine Stunde dauert. Tests an in vitro kultivierten Zellen erfordern eine geeignete Fixierung und Permeabilisierung.

Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper gegen individuelle Zytokeratine erlauben eine verhältnismäßig einfache detaillierte Untersuchung epithelialer(und mesathelialer) Zellen unter normalen und pathologischen Zuständen sowie nach In-vitro-Kultivierung, insbesondere die Zuordnung von Zellen unbekannter Herkunft zu einem bestimmten Epitheltyp. Derartige Untersuchungen waren bisher nicht möglich. Konventionelle (polygonale) Antiseren sind für diesen Zweck infolge ihrer ungenügend definierten Spezifität nicht geeignet. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper sind für diagnostische, zytodiagnostische, histogenetische und histopathologische Untersuchungen von großem theoretischem und praktischem Wert.

Ausführungsbeispiel

1) Herstellung von Hybridomen gegen Zytokeratin Nr. 19:

Balb/c-Mäuse werden mit Zellen der Mamma-Karzinom-Zellinie MCF-7 immunisiert, die nur die Zytokeratine Nr.8, 18 und 19 besitzt (Moll, R., Franke, W. W., Schiller, D. L., Geiger, B. und Krepter, R.: Cell 31,11-24,1982). Milzzellen der immunisierten Maus werden mit Maus-Plasmozytomzellen der Zellinie X 63-Ag 8.653 (Kearney, J. F., Rad bruch, Α., Liesegang, B. und Rajewsky, K.: J. Immunol. 123,1 548-1 550,1979) fusioniert (Elektrofusion) (Zimmermann, U., Biochim. Biophys. Acta 694, 227-277', 1982) und die Hybridome in einem Selektivmedium (Azaserin-Hypoxanthin-Medium) angezüchtet.

2) Auswahl von Hybridomen geeigneter Spezifität:

Mediumproben der erhaltenen Hybridome werden einem mehrstufigen Screening mittels Immunofluoreszenztests an Zellinien sowie weiteren Tests an Gefrierschnitten von Geweben unterworfen. Dabei wird nach Antikörpern gesucht, die nur mit bestimmten Epitheltypen reagieren. Da von vielen epithelialen Zellinien und Geweben das Zytokeratinmuster bekannt ist (Moll, R., Franke, W. W., Schüler, D. L., Geiger, B. und Krepier, R.: Cell 31, 11-24, 1982), läßt sich auf diese Weise eine Zuordnung erreichen, die durch direkte Bindungsversuche an elektrophoretisch getrennten Zytokeratinen abgesichert werden kann. Geeignete Hybridome werden mindestens zweimal kloniert und erweitert. Ein Teil der Zellen wird durch Tieftemperaturkonservierung in Reserve gehalten. Die Produktion des Antikörpers erfolgt vorzugsweise in vitro, da Aszitesflüssigkeit andere störende Anitkörper enthalten kann.

Derauf die genannte Weise erhaltene Hybridom kl on A53-B/A2 wurde am 28.6.85 im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter der Nr.0070 (ZIM-Liste 1985) hinterlegt.

3) Testdurchführung:

Objektträger mit Gefrierschnitten der zu untersuchenden Gewebe werden kurz fixiert (5% Formaldehyd, 5min), gewaschen und mit dem monoklonalen Antikörper (Kulturüberstand) in einer Feuchtkammer bei 4⁰C für 30min inkubiert, dreimal mit isotonischem Puffer gewaschen, danach mit einem markierten Antiserum gegen Maus-Immunglobulin (als Markierung eignet sich u.a. Fluoreszeinisothiozyanat) inkubiert, wiederum dreimal gewaschen und nach Einbettung mikroskopiert. Zellkulturen können auf Objektträgern oder Deckgläsern angezüchtet und nach Entfernen des überschüssigen Mediums rasch luftgetrocknet werden; die Fixierung erfolgt hier am besten in Methanol bei -2O⁰C für 5min.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur immunhistochemischen Differenzierung verschiedener Epithelien mittels monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß man den Hybridomklon A53-B/A2 (hinterlegt im Zentralinstitut für Molekularbiologie unter der Nr.0070/Liste 1985/) in vitro kultiviert, den gebildeten monoklonalen Antikörper isoliert und mit diesem die zu untersuchenden Präparate reagieren läßt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion des monoklonalen Antikörpers mit Gefrierschnitten von Geweben oder anderen geeigneten Zeil- oder Gewebspräparaten durchgeführt wird.