DD271709B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen pmsg - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch mit PMSG reagieren. Die monoklonalen Antikörper können zur quantitativen Bestimmung von PMSG durch einen Enzymlmmunassay in der veterinärmedizinischen Diagnostik, zur affinitätschromatographischen Isolierung und Hochreinigung dieses Hormons, ai«r auch zur Steuerung des Sexualzyklus von weiblichen Nutztieren eingesetzt werden.

Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen

Zur Wertbemessung von PMSG-Präparaten werden ausschließlich Bioassays eingesetzt, die kosten- und zeitaufwendig, ungeriu schlecht standardisierbar und ethisch anfp.ntbsr sind. Die alternative Wertbemessung des PMSG mittels radio- oder enzymimmunologischer Methoden setzt einen hol· in Reinheitsgrad der Reagenzien voraus, der auf konventionellem Wege, d. h. durch chromatographische Reinigung bzw. dur ;h JIe Immunisierung von Tieren nicht oder nur mit unvertretbar hohem Aufwand erreichbar ist. Dies liegt offenbar in erster Linie an der Erfassung von PMSG bzw. von Bestandteilen des Hormons, die zwar noch antigen sind, aber keine biologische Wirkung aufweisen. Mittels konventioneller Antiseren gelingt die Unterscheidung von wirksamen und unwirksamen Komponenten des PMSG nicht, auch ist eine molekulare Differenzierung damit nicht möglich. Außerdem besitzen solche konventionellen Antiseren generell eine Reihe weiterer Nachteile, so sind Antiseren von differenten Tieren nicht identisch, im Gegenteil, es können beträchtliche Unterschiede hinsichtlich des Gehaltes an Antikörpern, in quantitativer und qualitativer Hinsicht, bestehen. Diese Schwankungen und die Chargenabhängigkeit der Antiseren erlauben keine durchgehende Standardisierung der auf ihnen aufbauenden Assays. Monoklonal Antikörper, die von permanent wachsenden und produzierenden Hybridomen sezerniert werden, stehen in praktisch ausreichender Menge und über einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum zur Verfügung, so daß sich auf ihrer Grundlage reproduzierbare und standardisierbare Immunassays aufbauen lassen.

Es ist bereits bekannt, wie monoklonal Antikörper hergestellt werden. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, [1975], S.495) beschrieben.

Es ist bisher ein monoklonaler Antikörper, der mit PMSG reagiert, bekannt geworden (MOYAERT et al., Zuchthygiene 20,49-53, 1985). Dieser monoklonal Antikörper ist jedoch hinsichtlich seiner Bindungsreaktivität nicht genau beschrieben, sondern es wird als ein Kriterium eine neutralisierende (blockierende) Wirkung der PMSG-Bindung in vitro in einem Enzymimmunassay erwähnt sowie seine Effekte be· In-vivo-Applikation bei Kühen beschrieben.

Ziel der Erfindung Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper gegen PMSG gestattet. Die monoklonalen Antikörper sollen sich sowohl zur quantitativen Bestimmung von PMSG mittels eines Radio- oder Enzymimmunassays als auch zur affinitätschromatographischen Isolierung und Hochreinigung nach Ankopplung an einen

festen Träger eignen.

Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die Produktionskontrolle und die Herstellung von

hochgereinigten, indikationsspezifischen PMSG-Präparaten wesentlich verbessert werden.

Durch die Injektion geeigneter monoklonaler Antikörper in weibliche Nutztiere soll eine Steuerung des Sexualzyklus verbessert

werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung Hegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Herstellung monoklonal Antikörper gegen PMSQ anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridoma erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und

deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafterweise möglich ist. Unter der Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonal Antikörper erzeugt werden, die mit PMSG spezifisch reagieren und sich zur quantitativen Bestimmung, zur Isolierung sowie lur partiellen oder vollständigen Blockierung der biologischen Aktivität des

PMSG eignen. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren isoliertes PMSG kovalent an HMmozyanin

gekoppelt wird und dieses hochmolekulare Konjugat als Imtniinogen zur Immunisierung verwendet wird. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse zur Immunisierung verwendet. Die Hyperimmunisierung der Tiere wird durch mehrmalige Gabe des Immunogens induziert.

Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit murinen Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, (19791, S. 1548) werden in RPMM640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS)

gezogen.

Die Fusion wird durch Polyethylenglykol oder durch Feldsprungtechnik ausgelöst. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidln enthält (UTTLEFIELD, Science 145, (1964], S.709),

werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myejomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone

selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen gewünschten Eigenschaften sezernieren. Die Selektion erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-Ml-Kulturen aufgeteilt werden.

Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern

getestet, die sich an festphasenadsorbiertes PMSG binden. Hierzu werden die Kulturüberstände mit einem entsprechenden

Enzymimmunassay getestet. Durch Gegentestung mit einer geeigneten Palette von anderen Substanzen wird die Spezifität für

das PMSG nachgewiesen.

Unter den antikörperproduzierenden Hybridomen werden dann in einem zweiten Selektionsschritt diejenigen Hybridome

ausgewählt, deren Antikörpe^r auch in der Lage sind, nach Bindung an eine feste Phase, z.B. an Plastoberflächen, die mit Anti-

Mausimmunglobulin beschichtet worden sind, PMSG aus einem Gemisch spezifisch, mit hoher Effektivität zu isolieren. Die Testung, ob PMSG aus dem Testgemisch isoliert wurde, erfolgt mittels Bioassay. In einem weiteren Selektionsschritt wird getestet, ob die monoklonalen Antikörper auch die biologische Wirkung des PMSG

blockieren können.

Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die

gewünschten monoklonalen Antikörper stabil in hoher Konzentration sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome erhielten die

Bezeichnung H-BL-FMSG/1 bis 3. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder

/n-v/Vo-Kultur der Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 ausgerichtet ist.

Die Hybridome H-BL-PMSG/1 bis 3 werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw.

liegen kyrokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-PMSG/1 bis 3 haben die

Registriernummern ZIM0272, ZlM0271 und ZIM 0270 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Der monoklon« !e Antikörper BL-PMSG/1 weist folgende wertvol'en und überraschenden Eigenschaften auf: Er bindet festphasengebundenes und gelöstes PMSG spezifisch, wobei er auch in oberflächengebundener Form PMSG bindet

und damit zur affinitätschromatographischen Isolierung des PMSG geeignet ist.

Er bindet an einen Epitop (A) des PMSG, der für die biologische Wirkung des PMSG essentiell ist. BL-PMSG/1 blockiert die /n-v/Vo-Wirkung von PMSG. Im Gegensatz dazu binden die monoklonalen Antikörper BL-PMSG/2 und BL-PMSG/3 an Epitope des PMSG, die sich von dem PMSG/1 -Epitop (A-Epitop) unterscheiden. Beide Antikörper behindern die Bindung von PMSG an den monoklonelen Antikörper BL-PMSG/1 nicht. Sie können somit als Detektionsreagenzien für PMSG, welches durch BL-PMSG/1 isoliert wurde, in einem Enzym- oder Radioimmunassay vorteilhaft eingesetzt werden. BL-PMSG/2 und BL-PMSG/3 reagieren dabei ihrerseits mit unabhängigen Epitopen des PMSG, so daß sie bei gleichzeitiger Anwendung als Detektionsantikörper eine Sensitivitätssteigerung bzw. bei alternativem Einsatz die differentielle Diagnostik und Abtrennung ermöglichen. Ausführungsbeispiel Testung der Bindung der monoklonalen Antikörper an verschiedene Substanzen

1. Mikrotiterplatten aus Polystyren werden mit verschiedenen Hormonen und Serumproteinen beschichtet. Dazu werden die Kavitäten der Platte mit 0,25 ml der Antigene (1 bis 50 mg/l), in Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH 9,6) gelöst, gefüllt und für 2 h bei Raumtemperatur oder 16h bei +4°C inkubiert. Im Anschluß werden die Kavitäten ausgesaugt und dreimal mit je* 0,3ml PBS (0,15 mol/l NaCI, 0,01 mol/l Phosphat, pH 7,4) gewaschen.

2. Die antikörperhaltigen Lösungen (Zellkulturüberstand oder Ascites) werden in unterschiedlichen Verdünnungen in die Kavitäten der beschichteten Platte gefüllt (jeweils ΙΟΟμΙ) und für 2h bei Raumtemperatur gehalten, anschließend abgesaugt und dreimal mit je 0,3ml PBS/0,05% Tween 80 gewaschsn.

3. Zugabe von ΙΟΟ-μΙ-POD-markieitenAnti-Mausimmunglobulin-Antikörpern. Nach einer Reaktion von 2h bei Raumtemperatur werden die Kavitäten abgesaugt und, wie unter 2 angegeben, gewaschen.

4. Inkubation mit 0,2ml Substrat-Chromogen-Gemisch, bestehend aus H₂O₂ und o-Phenyldiamin, Abstoppen der Reaktion nach ausreichender Entwicklungszeit (15-45min) mit 100μΙ H₂SO₄ (5mol/l) und Messung der Extinktion bei 492nm.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epitope des PMSG (Pregnant Mare's Serum Gonatropln) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit PMSG, Fusion der aus der Milz gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonal Antikörper sezernieren, die spezifisch mit Epitopen des PMSG reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß ein kovalent gekoppeltes PMSG-Carrierkonjugat als Immunogen verwendet wird; daß die Selektion erstens durch einen monoklonalen Antikörper mit besonderer Eignung als Detektionsreagenz für festphasengebundenes PMSG erkennenden Assay irfolgt; in einem zweiten Selektionsschritt Hybridome ausgewählt werden, deren monoklonal Antikörper in festphasengebundener Form PMSG aus einem Gemisch spezifisch und effektiv isolieren; in einem dritten Selektionsschritt Hybridome für in einem PMSG-spezifischen Bioassay die Hormonwirkung hemmenden monoklonalen Antikörper selektiert werden; in einem vierten Selektionsschritt nachgewiesen wird, daß die selektierten monoklonalen Antikörper unterschiedliche Epitope erkennen und sich wechselseitig nicht behindern; daß die Hybridome H-BL-PMSG/1 (ZIM 0272), H-BL-PMSG/2 (ZIM 0271) und H-BL-PMSG/3 (ZIM 0270) ausgewählt und zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper BL-PMSG/1-3 eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung der BALB/c-Mäuse ein kovalentes PMSG-Hämozyanin-Konjugat verwendet wird.