DE3851492T2 - Ein gattungsspezifisches Listeria-Antigen, identifiziert durch monoklonale Antikörper. - Google Patents

Ein gattungsspezifisches Listeria-Antigen, identifiziert durch monoklonale Antikörper.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Listeria-spezifisches Antigen, Antikörper gegen dieses, ein Assay-Verfahren zum Nachweis von Listeria in einer Probe und auf Testgarnituren und deren Komponenten zur Verwendung in einem solchen Assayverfahren.
  • Listeria monocytogenes hat als menschliches Pathogen wachsende Aufmerksamkeit erhalten. Es wurde von mehreren dokumentierten Listerioseausbrüchen in den U.S.A. berichtet, bei denen mit Listeria verunreinigte Nahrungsmittel als Quelle der Infektion identifiziert wurden. 1981 gab es einen größeren Ausbruch, der mit Kohl in Verbindung gebracht wurde, 1983 mit Milch und 1985 gab es mehr als 100 Fälle, die auf verunreinigten Käse zurückgeführt wurden.
  • Das FDA der USA hat bekanntgegeben, daß die Toleranz für Listeria in Nahrungsmitteln gleich Null ist. Es hat kürzlich mehrere Rückberufungen von Listeria enthaltenden Nahrungsmitteln seitens des amerikanischen FDA gegeben, wobei es sich generell um Milchprodukte handelte, insbesondere Käse und Eiscreme, wovon einige importiert waren. Es hat auch eine Anzahl von durch Firmen initiierte Rückberufungen von Nahrungsmittelprodukten gegeben.
  • Obwohl ganz offensichtlich eine Notwendigkeit für ein verläßliches Verfahren zur Identifikation von Listeria in Nahrungsmitteln besteht, gibt es derzeit kein einfaches oder allgemein anerkanntes Verfahren des Züchtens oder des Nachweises von Listeria. Die "Association of Official Analytic Chemists" (AOAC), die Organisation, die Analyseverfahren für die Nahrungsmittelindustrie bewertet, hat noch kein Verfahren zur Züchtung von Listeria aus Nahrungsmitteln anerkannt. Das vom FDA vorgeschlagene Verfahren erfordert eine langwierige kalte Anreicherungszüchtung vor dem Testen. Andere Verfahren erfordern komplizierte Instrumente zur Datenanalyse.
  • Listeria ist ein grampositives, keine Sporen bildendes, bewegliches Stäbchen, das die Fähigkeit besitzt, über ein breites Temperaturspektrum, (4ºC bis 45ºC) zu wachsen. Es wurde berichtet, daß es bezügliche seinem Antigene mit anderen grampositiven Organismen, wie Staphylococcus aureus und Streptococcus fecalis verwandt ist. Daraus folgt, daß eine immundiagnostische Annäherung an eine Identifizierung von Listeria sehr spezifische Antikörper und/oder ein Antigen erfordert, das für diesen Organismus sehr spezifisch ist. Wir haben eine Anzahl muriner, monoklonaler Antikörper hergestellt und charakterisiert, die ein gattungsspezifisches Listeria-Antigen identifizieren, beide können erfolgreich zur Entwicklung eines diagnostischen Assays für Listeria eingesetzt werden.
  • In Chem. Abs. 93 (1980), Abstrakt Nr. 5779r und in Chem. Abs. 91 (1979), Abstrakt Nr. 1191153p wird ein Listeria-spezifisches Antigen von ungefähr 17 kD offenbart, das Immunogenität gegenüber Menschen und Hasen zeigt, die mit L. monocytogenes infiziert sind. In Chem. Abs. 90 (1979) offenbart Abstrakt Nr. 119493m eine immunelektrophoretische Untersuchung eines Hitzeextrakts von L. monocytogenes. Jedoch wurden die gefällte Proteinbanden von den Autoren nicht weiter charakterisiert.
  • Wir haben monoklonale Mausantikörper hergestellt, die mit Hitzeextrakten von allen Listeria-Spezies, außer L. denitrificans, reagieren. Diese Monoklonalen reagieren alle mit einem bestimmten Protein, das einen Molekulargewichtsbereich von 30 bis 38 kD hat, der sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen gemessen wurde. Dieses Antigen wurde in allen Spezies, mit geringen Variationen des Molekulargewichts unter den Spezies, identifiziert. Dieses Antigen ist dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens drei immunogene Epitope besitzt. Die Antikörper reagierten daher spezifisch mit einem der drei Epitope. Von Antigenen mit niedrigerem Molekulargewicht wurde gezeigt, daß sie einen Molekulargewichtsbereich von ungefähr 17 kD bis ungefähr 30 kD besitzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein Epitop mit der gleichen Immunreaktivität besitzen, wie eines der drei Epitope des 30 kD- bis 38 kD-Proteins.
  • Fig. 1 ist ein Western Blot-Profil der Reaktivität von Hitzeextraktproteinen von Listeria monocytogenes. Die Spalte ganz rechts zeigt das Profil des gesamten Hitzeextraktes. Spalten 1 bis 15 zeigen die Immunreaktivitäten der angezeigten Antikörper mit dem Hitzextrakt.
  • Fig. 2 zeigt die Immunreaktivität des monoklonalen Antikörpers 10-12C mit den Hitzextrakten der angezeigten Listeria-Spezies und anderen Bakterien.
  • Fig. 3 zeigt die Immunreaktivität des monoklonalen Antikörpers 10-12C mit den aufgeführten Spezies von Listeria.
  • Fig. 4 zeigt die Immunreaktivität von 3 der Monoklonalen, die verschiedene Epitope auf dem Hauptantigen erkennen, mit den Spezies von Listeria, die durch die Nummern 1-7 angegeben sind:
  • 1. Listeria monocytogenes (Typ 1);
  • 2. Listeria monocytogenes (Typ 2);
  • 3. Listeria monocytogenes (Typ 4a);
  • 4. Listeria monocytogenes (Typ 4c);
  • 5. Listeria monocytogenes (Typ 4d);
  • 6. Listeria monocytogenes (Typ 4e);
  • 7. Listeria grayi (Typ 5).
  • Das gegenwärtige, vom FDA anerkannte Nachweisverfahren für viele Nahrungsmittel erfordert Züchtung durch Kälteanreicherung während mindestens 7 Tagen vor dem Testen. Das ist arbeitsintensiv und zeitraubend und verzögert die Freigabe des fertigen Produktes. Zur Zeit gibt es keinen schnellen und genauen Test für Listeria, wie z. B. ein Test, der monoklonale Antikörper verwendet.
  • Hinsichtlich des Ziels, einen schnellen Immunassay für den Listeria-Nachweis zu entwickeln, haben wir monoklonale Antikörper entwickelt und charakterisiert, die Listeria-Spezifität zeigen.
  • Wir haben diese monoklonalen Antikörper durch enzymgebundene immunabsorbierende Assays (ELISA) in einem breiten Reaktionsbereich mit einer Liste von Listeria-Serotypen (1-5) ausgiebig getestet. Wir haben sechzehn monoklonale Antikörper identifiziert (Tabelle 1), die mit Hitzextrakten von allen Listeria-Spezies, einschließlich L. monocytogenes (Serotypen 1-4), L. grayi (Serotyp 5), L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri und L. innocua, mit der einzigen Ausnahme von L. denitrificans, reagieren. Von L. denitrificans, das von der ATCC erhalten wurde, wurde als "nicht übereinstimmend mit der Beschreibung der Gattung Listeria" berichtet (ATCC Catalogue of Bacteria, Phages, and rDNA Vectors, 16. Auflage, 1985, S. 96). Das Nichtreagieren der monoklonalen Antikörper gegen Listeria mit diesem Hitzextrakt kann daher auf die falsche Einordnung von L. denitrificans in die Gattung Listeria zurückzuführen sein.
  • Tabelle 1 Untersuchung der ELISA-Reaktivität der MoAbs
  • Hybridomabezeichnung MoAb Isotyp
  • 2-1C IgG&sub1;
  • 2-3H IgG&sub1;
  • 3-1D IgG&sub1;
  • 7-5H IgG&sub1;
  • 7-6H IgG&sub1;
  • 7-8H IgG2a
  • 8-7A IgG2a
  • 8-8A IgG&sub1;
  • 8-6D IgG2a
  • 8-9D IgG&sub1;
  • 8-4H IgG&sub1;
  • 9-5E IgG&sub1;
  • 10-2A IgG2a
  • 10-11A IgG&sub1;
  • 10-7C IgG&sub1;
  • 10-12C IgG&sub1;
  • Wir bestätigten die Spezifität von Listeria durch ELISA-Testen der monoklonalen Antikörper gegen eine umfassende Liste relevanter grampositiver und gramnegativer Organismen, von denen viele oft auf Voranreicherungsmedien wachsen, wenn Listeria gezüchtet werden soll. Nachdem alle 16 Monoklonalen nicht signifikant mit allen Hitzeextrakten, die keine Listeria enthielten, reagierten, kann geschlossen werden, daß sie ein gattungsspezifisches Antigen von Listeria erkennen.
  • Von den für Listeria spezifischen monoklonalen Antikörpern zeigten die IgG2a-Monoklonalen auch eine Reaktion mit S. aureus (Tabelle 2); jedoch konnte dies auf die Anwesenheit von Zellwandmaterial in dem Hitzeextrakt zurückgeführt werden, der die Antikörper gebunden hatte. Tabelle 2 Nicht spezifische Bindung von Protein A Hybridoma Kontrolle Kontrolle
  • Schlüssel: - = < 0.2
  • +1 = 0.2 bis 0.5
  • +2 = 0.5 bis 1.0
  • +3 = 1.0 bis 2.0
  • +4 = > 2.0
  • Nachdem dieses durch Zentrifugation eliminiert worden war, schlossen wir, daß die Bindung der IgG2a-Monoklonalen an S. aureus durch Protein A in der Zellwand vermittelt wurde, von dem bekannt ist, IgG2a-Antikörper mittels ihres Fc-Teils zu binden [J. Goding (1987), J. Immunol. Meth. 20 : 241]. Unsere Schlußfolgerung wurde durch die Tatsache unterstützt, daß keiner der für Listeria spezifischen IgG&sub1; monoklonalen Antikörper, die im allgemeinen Protein A mit geringerer Affinität binden als IgG2a [Goding, (1987)], eine positive Reaktion mit S. aureus zeigten. Wir haben auch einen monoklonalen Antikörper 10-7C identifiziert, der alle grampositiven Organismen zu erkennen schien. 10- 7C reagierte weiterhin, trotz Zentrifugation, sowohl mit Listeria- als auch mit S.aureus-Hitzextrakten.
  • Wir charakterisierten Antigene, mit denen unsere Listeria-spezifischen Monoklonalen in der Western Blot-Analyse reagierten. Alle 16 Listeria-spezifischen monoklonalen Antikörper erkannten ein Protein in dem Molekulargewichtsbereich von 30 bis 38 kD, sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Die IgG2a-Monoklonalen und einige der IgG&sub1;-Monoklonalen haben auch Antigene mit niedrigerem Molekulargewicht im Größenbereich von ungefähr 17 kD bis zur Größe des Hauptantigens gebunden. Das Hauptantigen wurde in zwei Molekulargewichtsbereichen gefunden, abhängig von der getesteten Listeria-Spezies. In L. monocytogenes (Serotypen 1-4), L. ivanovii, L. seeligeri, und L. innocua ist dieses Antigen ungefähr 30 bis 34 kD groß. In L. grayi und L. murrayi ist es ungefähr 34 bis 38 kD groß.
  • Aufgrund von Subisotopanalysen-, ELISA- und Western Blot-Ergebnissen scheint es mindestens drei Gruppen von Listeria-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu geben. Eine Gruppe (Gruppe I) besteht aus IgG&sub1;-Monoklonalen, die im allgemeinen geringere ELISA-Signale verursachten und nur mit dem gattungsspezifischen Antigen in dem Bereich von 30 bis 38 kD reagieren (siehe Fig. 1, zum Beispiel monoklonaler Antikörper 9-5E). Die zweite Gruppe (Gruppe 11) besteht aus IgG&sub1;-Monoklonalen, die im allgemeinen mittlere ELISA-Signale verursachen und in erster Linie das 30 bis 38 kD-Antigen banden, aber auch 2 bis 4 Antigene mit niedrigerem Molekulargewicht erkannten (siehe Fig. 1, zum Beispiel monoklonaler Antikörper 10-12C). Die dritte Gruppe (Gruppe III) besteht aus IgG2a-Monoklonalen, die im allgemeinen höhere ELISA- Werte verursachten und in erster Linie das 30 bis 38 kD große Antigen gebunden haben, aber auch mindestens 4 Antigene mit niedrigerem Molekulargewicht erkannten (siehe Fig. 1, zum Beispiel monoklonaler Antikörper 10-2A). Die Existenz von mindestens drei Epitopspezifitäten wurde weiterhin durch die erfolgreiche Anwendung verschiedener dieser Monoklonalen in einem 2- seitigen Sandwich-ELISA untermauert, die die gleiche Spezifität wie hier für die individuellen Monoklonalen beschrieben, zeigten. Außerdem wurde der grampositiv spezifische Monoklonale 10- 7C sowohl durch ELISA- als auch Western Blot-Ergebnisse, als eindeutig an ein anderes Antigen als Listeria spezifische monklonale Antikörper bindend, charakterisiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Listeria mit großer Spezifität in einer Probe nachgewiesen werden, indem gegen das obengenannte Antigen gerichtete Antikörper angewendet werden. Mit Vorteil können monoklonale Antikörper verwendet werden und insbesondere kann Gebrauch von monoklonalen Antikörpern gemacht werden, die zu den oben genannten Gruppen I, II und/oder III gehören.
  • Ganz im Besonderen kann von einem oder mehreren der 16 Listeria spezifischen Antikörper Gebrauch gemacht werden, die ein gattungsspezifisches Proteinantigen in dem Bereich von 30 bis 34 oder 34 bis 38 kD, abhängig von der Spezies, definieren.
  • Für diesen Listeria-Nachweis kann von jeder geeigneten Immunoassayform Gebrauch gemacht werden. Eine für diesen Zweck sehr gut geeignete Form ist der sogenannte Sandwich-Assay, der äußerst zweckmäßig Enzyme, radioaktive Atome oder Gruppen, fluoreszierende Verbindungen, Farbstoffe oder Metall- oder Färbepartikel als Markierung verwendet. Alternativ kann auch der sogenannte Inhibitionsassay verwendet werden, worin das Listeria-Antigen der Probe mit dem erfindungsgemäßen Listeria-Antigen um die Bindung an einen gemeinsamen Antikörper konkurriert. Bei dieser Form ist entweder das erfindungsgemäße Antigen oder der Antikörper dagegen an eine feste Phase gebunden und die andere Verbindung ist an eine Markierung, wie zuvor beschrieben, gebunden.
  • In einem weiteren alternativen Assay-Verfahren wird Listeria in der Probe durch Agglutination oder Agglutinationsinhibition nachgewiesen. Bei der Agglutination wird Listeria mit Antikörpern in Kontakt gebracht, worauf Aggregation von Listeria-Antigenen und Antikörpern auftritt und gegebenenfalls in der Bildung eines Sedimentes resultiert. Sedimentation des Aggregats kann durch die Verwendung von Antikörpern verstärkt werden, die an Partikel wie Latices, Erythrocyten, Solpartikel von Farbstoffen, Metalle oder Metallverbindungen usw. gebunden sind. Auf der anderen Seite wird die zu untersuchende Probe in dem erfindungsgemäßen Agglutinationinhibitionsassay mit einer Mischung aus partikelgebundenem Listeria-Antigen und Antikörpern dagegen in Kontakt gebracht, wobei die Mischung aggregiert und letztlich in Abwesenheit von Listeria in der Probe sedimemtiert. Diese Agglutination wird in Gegenwart von freien Listeria-Antigenen in der Probe inhibiert.
  • In allen der oben beschriebenen Assayverfahren kann ein Nahrungsmittelprodukt oder ein Teil davon als Probe verwendet werden, welches gegebenenfalls vorbehandelt sein kann, um die Listeria-Antigene freizusetzen.
  • Testgarnituren zur Durchführung der obenbeschriebenen Assays wie auch neue Komponenten zur Verwendung in einer solchen Testgarnitur sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Neue Komponenten der Testgarnituren sind, gemäß dieser Erfindung, die obengenannten Antigene oder Fragmente davon oder Antikörper dagegen, die an einen festen Träger, an eine Markierung oder an einen Partikel gebunden sind. Geeignete feste Träger sind in diesem Zusammenhang Reagenzgläser, Vertiefungen von Mikrotiterplatten, Kugeln, Stäbe, Stangen, usw.
  • Geeignete Testgarnituren für Sandwich-Assays können als wesentliche Komponenten die folgenden umfassen:
  • a. an einen festen Träger gebundenes Antigen gemäß der Erfindung oder einen Antikörper dagegen und
  • b. markierten Antikörper gegen besagtes Antigen oder:
  • a. an einen festen Träger gebundenen Antikörper gemäß der Erfindung und
  • b. ein markiertes Antigen gemäß der Erfindung.
  • Testgarnituren für Agglutinationsassays enthalten geeigneterweise Antikörper gemäß der Erfindung, die an Partikel gebunden sind.
  • Das Antigen gemäß der Erfindung kann aus der Listeria-Spezies mit Hilfe biochemischer, dem Fachmann bekannter Verfahren gereinigt werden. Insbesondere kann Gebrauch von immunabsorbierenden Verfahren gemacht werden, worin das Antigen von säulengebundenen Antikörpern (vorzugsweise monoklonale Antikörper der Gruppen I, II und III, beispielhaft vertreten durch die Antikörper 9-5E, 10-12C bzw. 10-2A) gefangen wird und anschließend von der Säule durch Brechen der Antigen-Antikörperverbindung eluiert wird.
  • Beispiele Bakterienkulturen
  • Kulturen von Listeria und anderen Organismen (siehe Tabelle 3) wurden auf Agarplatten oder als Stabkulturen bei 4ºC auf tryptischer Soja-Bouillon (TSB) (BBL) + 0,6% Hefeextrakt (YE) (BBL) + 1,5% Bacto-Agar (Difco) gehalten. Tabelle 3 Bakterienkulturen Bezeichnung Organismus Typ Stamm Bezeichnung Organismus Typ Stamm
  • Herstellung von bakteriellen Hitzextrakten
  • Röhrchen mit 10 ml TSB + 0,6% YE wurden von Agarplatten oder Stabkulturen geimpft und die Organismen 4 Tage bei 22ºC gezüchtet. Die Röhrchen wurden dann 10 Minuten mit 1000 UpM bei 25ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 1,0 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Die resuspendierten Pellets wurden 30 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt und bei 4ºC bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • Zellkulturen
  • P3X63Ag8.653 Mausmyelomzellen und L929 Mausfibroblasten (ATCC, Rockville, MD. USA) wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco- Medium (Iscove's) gezüchtet (Mediatech Inc., Herndon, VA, USA), das 10% foetales Rinderserum (FBS) (HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA) enthielt. Die Kulturen wurden in 75 mm² -Kulturflaschen (Corning Glassworks, Corning, NY, USA) in einem befeuchteten CO&sub2;-Inkubator (Queue Systems, Inc., Parkersburg, WV, USA) bei 37ºC in einer Atmosphäre von 93% Luft/7% CO&sub2; gehalten. Zur Fusion wurden Myelomzellen in der logarithmischen Wachstumsphase (< 5 · 10&sup5; Zellen/ml) verwendet. Zur Herstellung von konditioniertem Medium wurden L929-Zellen 3 bis 4 Tage als Monolayer gezüchtet. Das Medium wurde dann geerntet, steril filtriert (0,22 M) und tiefgekühlt (-20ºC) aufbewahrt.
  • Tiere
  • Weibliche BALB/c (Charles River, Cambridge, Mass., USA) oder CD2F1 (CBA · BALB/c)-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden verwendet. Zur Ascites-Produktion wurden CD2F1-Mäuse mit 2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan (Pristan) (Alderich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) 10 bis 14 Tage vor der Injektion von Zellen vorbereitet.
  • Immunisierungen
  • BALB/c-Mäusen wurden 100 ul eines Hitzeextraktes von Listeria monocytogenes (L1, Dr. R. Flowers, Silliker Lab., Chicago Heights, IL, USA) durch subcutane Injektion verabreicht, dann wurde nach den Wochen 4, 10 und 15 eine Wiederholungsimpfung mit dem gleichen Antigen durch intraperitoneale Injektion durchgeführt. Die Milz der besten, durch ELISA-Aktivität festgestellten Immunresponder wurde 3 Tage nach der letzten Wiederholungsimpfung entfernt und zur Hybridoma-Fusion verwendet.
  • Zellfusion
  • Mausmyelomzellen und immune Milzellen wurden in 50% Polyäthylenglykol (PEG 1000) (Kodak) in einem Verhältnis von 1 : 5 unter Anwendung einer Modifikation des von Köhler und Milstein [G. Köhler und C. Milstein (1975), Nature 256 : 495] beschriebenen Verfahrens fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in 150 ml Iscove's + 20% FBS resuspendiert und in zehn 96-Vertiefungen umfassende Mikrotitrationskulturplatten (Corning) in einer Dichte von 2,2 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung verteilt. Nach 24 Stunden wurde HAT-Selektionsmedium zugegeben [Iscove's + 20% FBS, das Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T) enthält] und das Medium alle 3 bis 4 Tage gewechselt, bis makroskopisches Wachstum sichtbar wurde. Zellkulturen, die positives Wachstum in HAT zeigten, wurden auf anti-Listeria-monoklonale Antikörper, wie unten beschrieben, untersucht. Positive Kulturen wurden auf 24 Vertiefungen umfassende Kulturplatten (Corning) ausgedehnt und zweimal durch begrenzende Verdünnung in Iscove's, das 50% L929- konditioniertes Medium, 20% FBS und HT enthielt, unter Entzug von Aminopterin, kloniert.
  • ELISA-Untersuchung der Hybridomazellen Erste Untersuchung
  • Hybridomakulturen, die makroskopisches Wachstum zeigten, wurden mit Hilfe von ELISA nach reaktionsfähigen, monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von hitzeextrahierten, an Mikrotiterplatten gebundene Listera-Antigene untersucht. Zu diesem Zweck wurden Immulon 2-Polystyrolplatten (flacher Boden) (Dynatech Laboratories, Inc. Alexandria, VA, USA) über Nacht (4ºC) mit einem Hitzeextrakt von L1, der 1 : 1000 mit PBS verdünnt wurde (100 ul/Vertiefung), überzogen. Die Platten wurden dann mit PBS, das 3% Fischgelatine enthielt, 60 Minuten (22ºC) blockiert, dann mit Hybridomaüberständen (100 ul/Vertiefung) 60 Minuten (37ºC) inkubiert. Nach 3maligem Spülen wurden die Platten 60 Minuten (37ºC) mit 0,1 ug/ml an Meerrettichperoxidase konjugierte polyklonale Ziegenantikörper an Maus-IgG+IgM+IgA (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA) inkubiert. Anschließend an fünf Spülungen wurden die Platten 30 Minuten (22ºC) mit Tetramethylbenzidin- Substratlösung (100 ul/Vertiefung) (Organon Teknika Corp., Durham, NC, USA) entwickelt und die Farbreaktion mit 4N H&sub2;SO&sub4; (100 ul/Vertiefung) beendet. Werte der optischen Dichte (O.D.) wurden bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines automatisierten Plattenlesers (Modell EL309, BioTek Instruments, Inc., Burlington, VA, USA), der mit Luft abgeglichen wurde, bestimmt. Ein positiver Wert wurde als O.D.-Ablesung größer als 0,2 interpretiert.
  • Zweite Untersuchung der Hybridomazellen
  • Kulturen, die eine positive Reaktion in der ersten Untersuchung zeigten, wurden nochmals gegen eine Reihe von Listeria- und nicht-Listeria-Hitzeextrakten wie oben beschrieben getestet. Die Reihe bestand aus L. monocytogenes, L. innocua, Streptococcus- Spezies, Pseudomonas-Spezies, Salmonella typhi und Escherichia coli.
  • Spezifitätstestung von anti-Listeria monoklonalen Antikörpern
  • Positive monoklonale Antikörper der zweiten Untersuchung wurden gegen eine umfassende Reihe von Listeria-Hitzeextrakten unter Verwendung des gleichen ELISA-Formats getestet. Die getesteten Organismen schlossen 26 verschiedene Präparate von L. monocytogenes, 2 von L. ivanovii, und je 1 von L. innocua, L. grayi, L. denitrificans, L. murrayi und L. seeligeri ein.
  • Eine umfassende Reihe grampositiver Organismen, die in der gleichen Bouillon wachsen und Bedenken bezüglich Kreuzreaktionen auslösen könnten, wurden mit ELISA unter Verwendung von Hybridomaüberständen, dem oben beschriebenen Verfahren folgend, getestet. Diese Reihe bestand aus Micrococcus varians, Streptococcus cremoris, S. pyogenes, S. bovis, S. thermophilus, S. fecalis, Staphylococcus epidermis, S. haemolyticus, S. aureus, Actinomyces pyogenses, Bacillus cereus, Lactobacillus casei und Erysipelothrix rhusiopathiae.
  • In einigen Fällen wurden die Hitzeextrakte von S. aureus und L. monocytogenes zuerst 5 Minuten bei 12'000 · g und 22ºC (Mikrofuge, Beckman Instruments) zentrifugiert, um bakterielle Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dann zum Überziehen der Platten (1 : 1000) verwendet und die Inkubation mit Hybridomaüberständen wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Eine Reihe von Hitzextrakten gramnegativer Organismen, die Pseudomonas fluorescens, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli und Salmonella typhi einschlossen, wurde unter Verwendung des gleichen ELISA-Formats getestet.
  • Herstellung und Reinigung monoklonaler Antikörper
  • Asciteswachstum von Hybridomaklonen zur Herstellung von Milligramm-Mengen monoklonaler Antikörper wurde durch Injizieren von 3,0 · 10&sup6; Zellen in mit Pristan vorbereitete CDF2-Mäuse und Ernten der Flüssigkeiten nach 10 bis 14 Tagen erreicht. Monoklonale Antikörpertiter wurden mit Hilfe von ELISA unter Verwendung eines L. monocytogenes-Hitzeextrakts (L1), der an Mikrotitrationsplatten, wie oben beschrieben, gebunden war, bestimmt. Monoklonale Antikörper wurden mit Protein-A-Sepharose®-Chromatographie (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) affinitätsgereinigt und bei -70ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
  • Immunochemische Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern
  • Subisotypenanalyse von monoklonalen Antikörpern wurde durchgeführt, indem eine im Handel erhältliche Doppelimmundiffusionsgarnitur (ICN Immunobiologicals, Lisle, IL. USA) verwendet wurde. Eine Identifizierung der Zielantigene wurde durch Western Blot-Analyse von L. monocytogenes-Hitzextrakten (L1) von SDS- PAGE-Gelen erhalten. Proteine wurden auf einem nicht kontinuierlichen SDS-Gradient-Polyacrylamidgel (5 bis 15%) [U.K. Laemmli, (1970), Nature 227 : 680] elektrophoretisch aufgetrennt und dann auf Nitrocellulose durch Elektroblotten übertragen [H. Towbin, T. Staehelin und J. Gordon, (1979), P.N.A.S. 76 : 4350]. Die Blots wurden 2 Stunden (37ºC) in PBS, das 5% fettfreie Trockenmilch enthielt, blockiert, zweimal mit PBS + 0,05% Tween®20 gespült, dann wie folgt markiert: 1 cm große Streifen des präparativen Blots wurden mit individuellen Hybridomaklonüberständen 2 Stunden (37ºC) unter Schütteln inkubiert, dann zweimal wie oben gespült und weitere 60 Minuten bei 37ºC mit 0,25 ug/ml HRP-konjugierten Ziegenantikörper auf Maus-IgG + IgM (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) inkubiert. Anschließend an zwei Spülungen wurden die Blots mit PBS, das 0,06% Diaminobenzidin (Sigma) und 0,03% H&sub2;O&sub2; enthielt, gefärbt (22ºC).
  • Verschiedene Reihen von Hitzeextrakten verschiedener Listeria- und nicht Listeria-Organismen wurden analytischer SDS-Gradienten-PAGE- und Western Blot-Analyse, wie oben beschrieben, unterzogen. Die Reihen bestanden aus L. monocytogenes (Serotypen 1- 4), L. grayi, L. ivanovii, L. innocua, L. denitrificans, L. seeligeri, L. murrayi, Streptococcus pyogenes, Staphylococus aureus, Lactobacillus casei, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi und Citrobacter freundii. Ausgesuchte, gereinigte monoklonale Antikörper (5 ug/ml) wurden dann verwendet, um diese Reihe, wie oben beschrieben, immunzufärben.
  • Reinigung und Konjugation von Antikörpern
  • 10-15 ml Ascites wurden 1:2 mit Bindungspuffer, pH 9 (Affi-Gel Protein A MAPS II Buffers, BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) gemischt und auf eine 30 ml Protein A-Säule (Sepharose® 4B-Cl-Protein A, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA) geladen. Die Antikörper wurden unter Verwendung des Eluierungspuffers, pH 3,0 (BioRad) eluiert. Das Protein wurde bei 280 nm überwacht und die Fraktionen gesammelt.
  • In einigen Fällen wurden die Antikörper weiter an Meerrettich- Peroxidase (Sigma Type VI, St. Louis, MO, USA) unter Anwendung des Verfahrens von P.K. Nakane und A. Kawaoi [(1974), J. Histochem. Cytochem. 22:1084] konjugiert.
  • ELISA als Einstufenfang-Verfahren
  • Immulon Mikrotiterplatten® (Dynatech) wurden über Nacht (4ºC) mit Protein A gereinigtem 10-12C (Gruppe II) (100 ul/Vertiefung), verdünnt auf 10 ng/ml in 0,05 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6), überzogen. Die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Proteinpuffer blockiert.
  • Nach dem Absaugen der Blockierungslösung wurden 100 ul des Hitzeextrakts und 100 ul des HRP-Konjugats 10-2A (Gruppe III) (0,25 ug/ml) gleichzeitig zugegeben (Einstufen-ELISA) und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten 6mal gespült, und 100 ul/Vertiefung Tetramethylbenzidin (KPL)-Substrat wurden zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurden 100 ul/Vertiefung 2N H&sub2;SO&sub4; zugegeben. Die optische Dichte wurde bei 450 nm in einem automatischen Plattenlesegerät (Bio-Tek) gemessen, das mit Luft abgeglichen wurde. 100 ul PBS wurde als Negativkontrolle verwendet.
  • Modifizierungen dieses Verfahrens wurden in einigen Fällen durch Verwendung eines anderen monoklonalen Antikörpers auf den Platten durchgeführt, um das Antigen zu fangen, oder unter Verwendung einer Kombination von Monoklonalen von zwei oder drei verschieden Gruppen. Ähnliche Änderungen dieses Verfahrens wurden häufig durchgeführt, indem andere HRP-konjugierte Monoklonale entweder einzeln oder in Kombination verwendet wurden.
  • Ergebnisse Untersuchung der Hybridomkulturen
  • Von 511 getesteten Hybridomas zeigten 37 positive ELISA-Reaktionsfähigkeit mit den Hitzeextrakten L. monocytogenes (L1). Positive wurden dann vermehrt und gegen eine kleine Reihe von Listeria- und nicht Listeria-Hitzeextrakten getestet, um ihre Spezifität zu bestimmen. Sechzehn der 37 monoklonalen Hybridomantikörper zeigten Spezifität für Listeria. Alle 16 reagierten sowohl mit L. monocytogenes als auch mit L. innocua. Die übrigen 21 monoklonalen Antikörper zeigten unterschiedliche Reaktionsprofile mit nicht Listeria-Hitzeextrakten (Streptococcus, Pseudomonas, Salmonella, Escherichia). Einer von diesen (10-7C), der sowohl mit Listeria als auch mit Streptococcus reagierte, wurde für weitere Untersuchungen zurückbehalten.
  • Eine umfassende Reihe von Listeria-Hitzeextrakten wurde verwendet, um die 16 anti-Listeria monoklonalen Antikörper im ELISA auf eine breite Reaktionsfähigkeit hin zu testen. Alle Serotypen von L. monocytogenes (1-4) und alle anderen Spezies von Listeria, außer L. denitrificans, wurden durch die 16 monoklonalen Antikörper nachgewiesen.
  • Eine Reihe von Hitzeextrakten grampositiver Organismen, die häufig in vorangereicherten Bouillons von Nahrungsmittelproben vorkommen, wurden im ELISA auf Kreuzreaktivität mit den 16 anti-Listeria monoklonalen Antikörpern getestet. Alle 16 reagierten nicht spezifisch mit diesen Hitzeextrakten. Jedoch zeigten die IgG2a-Monoklonalen, einschließlich einer irrelevanten IgG2a- Kontrolle, eine positive Reaktion mit dem S. aureus-Hitzeextrakt. Diese Reaktion wurde durch Zentrifugation des Hitzeextraktes beseitigt, um alles Zellwandmaterial vor der Verwendung zum Überziehen von ELISA-Platten zu beseitigen. Zentrifugation des Listeria-Hitzeextraktes beeinflußte die Antikörperbindung jedoch nicht (Tabelle 2). Es ist auch interessant zu erwähnen, daß 10-7C (IgG&sub1;) an alle getesteten grampositiven Organismen gebunden hat, einschließlich S. aureus. Die Reaktionsfähigkeit von 10-7C mit S. aureus wurde nicht durch vorhergehende Zentrifugation des Hitzeextraktes beseitigt.
  • Eine Reihe von Hitzeextrakten gamnegativer Organismen wurde ebenfalls auf Kreuzreaktivität im ELISA unter Verwendung der 16 anti-Listeria monoklonalen Antikörper getestet. Keiner der anti- Listeria Monoklonalen rief eine positive Reaktion mit einem dieser Organismen hervor.
  • Isotyp- und Western Blot-Analyse
  • Isotyp-Analyse der klonierten Hybridoma-Überstände zeigte, daß alle 16 IgG-Monoklonale erzeugten. Zwölf waren IgG&sub1; und 4 IgG2a. Gereinigte monoklonale Antikörper von allen 16 Hybridomaklonen wurden verwendet, um den Listeria monocytogenes-Hitzeextrakt (L1) in Western Blots zu sondieren. Die 16 Listeria-spezifischen Monoklonalen erkannten ein Proteinantigen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30 bis 38 kD, sowohl unter reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen. Außerdem erkannten die IgG2a-(Gruppe III) Monoklonalen und einige der IgG&sub1;- (Gruppe II) Monoklonalen auch Banden mit niedrigerem Molekulargewicht (Fig. 1).
  • Um die Antigenverteilung und -größe weiterhin zu analysieren, wurden Hitzeextrakte sowohl von Listeria als auch nicht Listeria elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit ausgewählten anti-Listeria-Monoklonalen sondiert. Nur von den Listeria-Hitzeextrakten konnte nachgewiesen werden, daß sie das Antigen enthielten, das von den Monoklonalen (Fig. 2) erkannt wurde. Interessanterweise wurde eine geringe Variation des Molekulargewichts des Hauptantigens (30 bis 38 kD) zwischen den verschiedenen Serotypen von L. monocytogenes (Fig. 3) beobachtet. Es ist weiterhin interessant zu bemerken, daß die L. grayi und L. murrayi-Antigene etwa 5 kD größer als alle Antigene von L. monocytogenes sind. In Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen enthielt L. denitrificans das von den anti-Listeria Monoklonalen (Fig. 3) erkannte Antigen nicht. Darüberhinaus enthielt keiner der nicht Listeria-Hitzeextrakte dieses Antigen (Fig. 2). Diese Ergebnisse waren übereinstimmend, unabhängig davon, welcher anti-Listeria monoklonale Antikörper getestet wurde. 10-7C jedoch, der ein anderes ELISA-Reaktivitätsprofil hat, reagierte mit keinem der Polypeptidantigene von Listeria in den Western Blots (Fig. 1).
  • Das 30 bis 34 kD- und 34 bis 38 kD-Hauptantigen, dessen molekulare Größe geringfügig, aber reproduzierbar mit der Spezies variiert, umfaßt immer drei Epitope. Jeder monoklonale Antikörper, der als immunspezifisch gegen dieses Antigen identifiziert wurde, reagierte mit einem dieser drei Epitope. Zwei dieser drei so definierten Epitope erscheinen auch in Antigenen mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 17 kD und dem Molekulargewicht des Hauptantigens.
  • Typische ELISA-Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Ergebnisse des Einstufenfang-ELISA Organismus Verdünnung
  • Wenn ein Antikörper der Gruppe 11 (10-12C) auf der Platte als ein Fänger verwendet wird und ein anderer Antikörper der Gruppe 111 (10-2A) HRP-markiert und als Konjugat angewendet wird, werden die Hitzeextrakte aller getesteten Listeria mit diesem Assay mühelos als positiv identifiziert und Hitzeextrakte aller getesteten nicht Listeria mühelos als negativ identifiziert. In den meisten Fällen könnten die Listeria-Hitzeextrakte um 2-4 log 10- Verdünnungen verdünnt werden und positiv bleiben.
  • Hinterlegungen von F61/9-5E (9-5E), F61/10-12C (10-12C) und F6/10-2A (10-2A) wurden bei der ATCC in Rockville, USA unter den Nummern HB 9493 bzw. HB 9494 und HB 9492 am 7. August 1987 getätigt.

Claims (7)

1. Für Listeria-Spezies charakteristisches Antigen, das mit mindestens einem der monoklonalen Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 9-5E, 10-12C und 10-2A, die bei der ATCC unter der Nummer HB 9493 bzw. HB 9494 und HB 9492 hinterlegt sind, reagiert, wobei besagtes Antigen ein Protein umfaßt, das in Hitzeextrakten von Listeria gefunden wurde, das ein Molekulargewicht von ungefähr 30 bis ungefähr 38 kD hat und drei immunogen unterschiedliche Epitope umfaßt, mit welchen Antikörper, die in Milzzellen mit besagtem Hitzextrakt von Listeria immunisierten Mäusen erzeugt wurden, besonders reaktionsfähig sind, und wobei besagtes Antigen in Hitzeextrakten aller Listeria-Spezies, außer L. denitrificans, gefunden wird.
2. Antikörper, der mit dem Listeria-Antigen gemäß Anspruch 1 immunreaktiv ist.
3. Monoklonaler Antikörper gegen das Antigen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Epitopspezifität eines monoklonalen Antikörpers, der aus der Gruppe, bestehend aus 9-5E, 10-12C und 10-2A, die bei der ATCC unter den Nummern HB 9493 bzw. HB 9494 und HB 9492 hinterlegt sind, ausgewählt ist.
4. Der monoklonale Antikörper gemäß Anspruch 3, hergestellt durch Immunisieren eines Tieres mit Hitzeextrakten von Listeria, Unsterblichmachen der Antikörper erzeugenden Zellen von besagten Lebewesen, Züchten der unsterblich gemachten Zellen, um Antikörper zu erzeugen und Auswählen der unsterblich gemachten Zellen, die mit dem Antigen immunreagierende Antikörper erzeugen.
5. Immunassayverfahren zum Nachweis von Listeria in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Probe mit mindestens einem Antikörper, der mit dem Antigen gemäß Anspruch 1 immunreagiert, inkubiert wird.
6. Test-Garnitur zum Nachweis von Listeria, die mindestens einen Antikörper umfaßt, die mit dem Antigen gemäß Anspruch 1 immunreagiert.
7. Immunoreagens, das ein Antigen gemäß Anspruch 1 oder einen Antikörper umfaßt, der immunreaktiv mit besagtem, an einen festen Träger, eine Markierung oder einen Partikel gebundenen Antigen ist.
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