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Die Erfindung bezieht sich auf ein Listeria-spezifisches
Antigen, Antikörper gegen dieses, ein Assay-Verfahren zum Nachweis
von Listeria in einer Probe und auf Testgarnituren und deren
Komponenten zur Verwendung in einem solchen Assayverfahren.
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Listeria monocytogenes hat als menschliches Pathogen wachsende
Aufmerksamkeit erhalten. Es wurde von mehreren dokumentierten
Listerioseausbrüchen in den U.S.A. berichtet, bei denen mit
Listeria verunreinigte Nahrungsmittel als Quelle der Infektion
identifiziert wurden. 1981 gab es einen größeren Ausbruch, der
mit Kohl in Verbindung gebracht wurde, 1983 mit Milch und 1985
gab es mehr als 100 Fälle, die auf verunreinigten Käse
zurückgeführt wurden.
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Das FDA der USA hat bekanntgegeben, daß die Toleranz für
Listeria in Nahrungsmitteln gleich Null ist. Es hat kürzlich mehrere
Rückberufungen von Listeria enthaltenden Nahrungsmitteln seitens
des amerikanischen FDA gegeben, wobei es sich generell um
Milchprodukte handelte, insbesondere Käse und Eiscreme, wovon einige
importiert waren. Es hat auch eine Anzahl von durch Firmen
initiierte Rückberufungen von Nahrungsmittelprodukten gegeben.
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Obwohl ganz offensichtlich eine Notwendigkeit für ein
verläßliches Verfahren zur Identifikation von Listeria in
Nahrungsmitteln besteht, gibt es derzeit kein einfaches oder allgemein
anerkanntes Verfahren des Züchtens oder des Nachweises von
Listeria. Die "Association of Official Analytic Chemists" (AOAC), die
Organisation, die Analyseverfahren für die
Nahrungsmittelindustrie bewertet, hat noch kein Verfahren zur Züchtung von
Listeria aus Nahrungsmitteln anerkannt. Das vom FDA vorgeschlagene
Verfahren erfordert eine langwierige kalte Anreicherungszüchtung
vor dem Testen. Andere Verfahren erfordern komplizierte
Instrumente zur Datenanalyse.
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Listeria ist ein grampositives, keine Sporen bildendes,
bewegliches Stäbchen, das die Fähigkeit besitzt, über ein breites
Temperaturspektrum, (4ºC bis 45ºC) zu wachsen. Es wurde berichtet,
daß es bezügliche seinem Antigene mit anderen grampositiven
Organismen, wie Staphylococcus aureus und Streptococcus fecalis
verwandt ist. Daraus folgt, daß eine immundiagnostische
Annäherung an eine Identifizierung von Listeria sehr spezifische
Antikörper und/oder ein Antigen erfordert, das für diesen Organismus
sehr spezifisch ist. Wir haben eine Anzahl muriner, monoklonaler
Antikörper hergestellt und charakterisiert, die ein
gattungsspezifisches Listeria-Antigen identifizieren, beide können
erfolgreich zur Entwicklung eines diagnostischen Assays für Listeria
eingesetzt werden.
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In Chem. Abs. 93 (1980), Abstrakt Nr. 5779r und in Chem. Abs. 91
(1979), Abstrakt Nr. 1191153p wird ein Listeria-spezifisches
Antigen von ungefähr 17 kD offenbart, das Immunogenität gegenüber
Menschen und Hasen zeigt, die mit L. monocytogenes infiziert
sind. In Chem. Abs. 90 (1979) offenbart Abstrakt Nr. 119493m
eine immunelektrophoretische Untersuchung eines Hitzeextrakts
von L. monocytogenes. Jedoch wurden die gefällte Proteinbanden
von den Autoren nicht weiter charakterisiert.
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Wir haben monoklonale Mausantikörper hergestellt, die mit
Hitzeextrakten von allen Listeria-Spezies, außer L. denitrificans,
reagieren. Diese Monoklonalen reagieren alle mit einem
bestimmten Protein, das einen Molekulargewichtsbereich von 30 bis 38 kD
hat, der sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden
Bedingungen gemessen wurde. Dieses Antigen wurde in allen
Spezies, mit geringen Variationen des Molekulargewichts unter den
Spezies, identifiziert. Dieses Antigen ist dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens drei immunogene Epitope besitzt. Die
Antikörper reagierten daher spezifisch mit einem der drei Epitope.
Von Antigenen mit niedrigerem Molekulargewicht wurde gezeigt,
daß sie einen Molekulargewichtsbereich von ungefähr 17 kD bis
ungefähr 30 kD besitzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß
sie ein Epitop mit der gleichen Immunreaktivität besitzen, wie
eines der drei Epitope des 30 kD- bis 38 kD-Proteins.
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Fig. 1 ist ein Western Blot-Profil der Reaktivität von
Hitzeextraktproteinen von Listeria monocytogenes. Die Spalte ganz
rechts zeigt das Profil des gesamten Hitzeextraktes. Spalten 1
bis 15 zeigen die Immunreaktivitäten der angezeigten Antikörper
mit dem Hitzextrakt.
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Fig. 2 zeigt die Immunreaktivität des monoklonalen Antikörpers
10-12C mit den Hitzextrakten der angezeigten Listeria-Spezies
und anderen Bakterien.
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Fig. 3 zeigt die Immunreaktivität des monoklonalen Antikörpers
10-12C mit den aufgeführten Spezies von Listeria.
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Fig. 4 zeigt die Immunreaktivität von 3 der Monoklonalen, die
verschiedene Epitope auf dem Hauptantigen erkennen, mit den
Spezies von Listeria, die durch die Nummern 1-7 angegeben sind:
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1. Listeria monocytogenes (Typ 1);
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2. Listeria monocytogenes (Typ 2);
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3. Listeria monocytogenes (Typ 4a);
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4. Listeria monocytogenes (Typ 4c);
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5. Listeria monocytogenes (Typ 4d);
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6. Listeria monocytogenes (Typ 4e);
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7. Listeria grayi (Typ 5).
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Das gegenwärtige, vom FDA anerkannte Nachweisverfahren für viele
Nahrungsmittel erfordert Züchtung durch Kälteanreicherung
während mindestens 7 Tagen vor dem Testen. Das ist arbeitsintensiv
und zeitraubend und verzögert die Freigabe des fertigen
Produktes. Zur Zeit gibt es keinen schnellen und genauen Test für
Listeria, wie z. B. ein Test, der monoklonale Antikörper verwendet.
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Hinsichtlich des Ziels, einen schnellen Immunassay für den
Listeria-Nachweis zu entwickeln, haben wir monoklonale Antikörper
entwickelt und charakterisiert, die Listeria-Spezifität zeigen.
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Wir haben diese monoklonalen Antikörper durch enzymgebundene
immunabsorbierende Assays (ELISA) in einem breiten
Reaktionsbereich mit einer Liste von Listeria-Serotypen (1-5) ausgiebig
getestet. Wir haben sechzehn monoklonale Antikörper
identifiziert (Tabelle 1), die mit Hitzextrakten von allen
Listeria-Spezies, einschließlich L. monocytogenes (Serotypen 1-4), L.
grayi (Serotyp 5), L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri und L.
innocua, mit der einzigen Ausnahme von L. denitrificans,
reagieren. Von L. denitrificans, das von der ATCC erhalten wurde,
wurde als "nicht übereinstimmend mit der Beschreibung der
Gattung Listeria" berichtet (ATCC Catalogue of Bacteria, Phages,
and rDNA Vectors, 16. Auflage, 1985, S. 96). Das Nichtreagieren
der monoklonalen Antikörper gegen Listeria mit diesem
Hitzextrakt kann daher auf die falsche Einordnung von L. denitrificans
in die Gattung Listeria zurückzuführen sein.
Tabelle 1
Untersuchung der ELISA-Reaktivität der MoAbs
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Hybridomabezeichnung MoAb Isotyp
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2-1C IgG&sub1;
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2-3H IgG&sub1;
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3-1D IgG&sub1;
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7-5H IgG&sub1;
-
7-6H IgG&sub1;
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7-8H IgG2a
-
8-7A IgG2a
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8-8A IgG&sub1;
-
8-6D IgG2a
-
8-9D IgG&sub1;
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8-4H IgG&sub1;
-
9-5E IgG&sub1;
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10-2A IgG2a
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10-11A IgG&sub1;
-
10-7C IgG&sub1;
-
10-12C IgG&sub1;
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Wir bestätigten die Spezifität von Listeria durch ELISA-Testen
der monoklonalen Antikörper gegen eine umfassende Liste
relevanter grampositiver und gramnegativer Organismen, von denen viele
oft auf Voranreicherungsmedien wachsen, wenn Listeria gezüchtet
werden soll. Nachdem alle 16 Monoklonalen nicht signifikant mit
allen Hitzeextrakten, die keine Listeria enthielten, reagierten,
kann geschlossen werden, daß sie ein gattungsspezifisches
Antigen von Listeria erkennen.
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Von den für Listeria spezifischen monoklonalen Antikörpern
zeigten die IgG2a-Monoklonalen auch eine Reaktion mit S. aureus
(Tabelle 2); jedoch konnte dies auf die Anwesenheit von
Zellwandmaterial in dem Hitzeextrakt zurückgeführt werden, der die
Antikörper gebunden hatte.
Tabelle 2 Nicht spezifische Bindung von Protein A
Hybridoma Kontrolle Kontrolle
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Schlüssel: - = < 0.2
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+1 = 0.2 bis 0.5
-
+2 = 0.5 bis 1.0
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+3 = 1.0 bis 2.0
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+4 = > 2.0
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Nachdem dieses durch Zentrifugation eliminiert worden war,
schlossen wir, daß die Bindung der IgG2a-Monoklonalen an S.
aureus durch Protein A in der Zellwand vermittelt wurde, von dem
bekannt ist, IgG2a-Antikörper mittels ihres Fc-Teils zu binden
[J. Goding (1987), J. Immunol. Meth. 20 : 241]. Unsere
Schlußfolgerung wurde durch die Tatsache unterstützt, daß keiner der für
Listeria spezifischen IgG&sub1; monoklonalen Antikörper, die im
allgemeinen Protein A mit geringerer Affinität binden als IgG2a
[Goding, (1987)], eine positive Reaktion mit S. aureus zeigten.
Wir haben auch einen monoklonalen Antikörper 10-7C
identifiziert, der alle grampositiven Organismen zu erkennen schien. 10-
7C reagierte weiterhin, trotz Zentrifugation, sowohl mit
Listeria- als auch mit S.aureus-Hitzextrakten.
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Wir charakterisierten Antigene, mit denen unsere
Listeria-spezifischen Monoklonalen in der Western Blot-Analyse reagierten.
Alle 16 Listeria-spezifischen monoklonalen Antikörper erkannten
ein Protein in dem Molekulargewichtsbereich von 30 bis 38 kD,
sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden
Bedingungen. Die IgG2a-Monoklonalen und einige der
IgG&sub1;-Monoklonalen haben auch Antigene mit niedrigerem Molekulargewicht im
Größenbereich von ungefähr 17 kD bis zur Größe
des
Hauptantigens gebunden. Das Hauptantigen wurde in zwei
Molekulargewichtsbereichen gefunden, abhängig von der getesteten
Listeria-Spezies. In L. monocytogenes (Serotypen 1-4), L. ivanovii, L.
seeligeri, und L. innocua ist dieses Antigen ungefähr 30 bis 34 kD
groß. In L. grayi und L. murrayi ist es ungefähr 34 bis 38 kD
groß.
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Aufgrund von Subisotopanalysen-, ELISA- und Western
Blot-Ergebnissen scheint es mindestens drei Gruppen von
Listeria-spezifischen monoklonalen Antikörpern zu geben. Eine Gruppe (Gruppe I)
besteht aus IgG&sub1;-Monoklonalen, die im allgemeinen geringere
ELISA-Signale verursachten und nur mit dem gattungsspezifischen
Antigen in dem Bereich von 30 bis 38 kD reagieren (siehe Fig.
1, zum Beispiel monoklonaler Antikörper 9-5E). Die zweite Gruppe
(Gruppe 11) besteht aus IgG&sub1;-Monoklonalen, die im allgemeinen
mittlere ELISA-Signale verursachen und in erster Linie das 30
bis 38 kD-Antigen banden, aber auch 2 bis 4 Antigene mit
niedrigerem Molekulargewicht erkannten (siehe Fig. 1, zum Beispiel
monoklonaler Antikörper 10-12C). Die dritte Gruppe (Gruppe III)
besteht aus IgG2a-Monoklonalen, die im allgemeinen höhere ELISA-
Werte verursachten und in erster Linie das 30 bis 38 kD große
Antigen gebunden haben, aber auch mindestens 4 Antigene mit
niedrigerem Molekulargewicht erkannten (siehe Fig. 1, zum
Beispiel monoklonaler Antikörper 10-2A). Die Existenz von
mindestens drei Epitopspezifitäten wurde weiterhin durch die
erfolgreiche Anwendung verschiedener dieser Monoklonalen in einem 2-
seitigen Sandwich-ELISA untermauert, die die gleiche Spezifität
wie hier für die individuellen Monoklonalen beschrieben,
zeigten. Außerdem wurde der grampositiv spezifische Monoklonale 10-
7C sowohl durch ELISA- als auch Western Blot-Ergebnisse, als
eindeutig an ein anderes Antigen als Listeria spezifische
monklonale Antikörper bindend, charakterisiert.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Listeria mit großer
Spezifität in einer Probe nachgewiesen werden, indem gegen das
obengenannte Antigen gerichtete Antikörper angewendet werden.
Mit Vorteil können monoklonale Antikörper verwendet werden und
insbesondere kann Gebrauch von monoklonalen Antikörpern gemacht
werden, die zu den oben genannten Gruppen I, II und/oder III
gehören.
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Ganz im Besonderen kann von einem oder mehreren der 16 Listeria
spezifischen Antikörper Gebrauch gemacht werden, die ein
gattungsspezifisches Proteinantigen in dem Bereich von 30 bis 34
oder 34 bis 38 kD, abhängig von der Spezies, definieren.
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Für diesen Listeria-Nachweis kann von jeder geeigneten
Immunoassayform Gebrauch gemacht werden. Eine für diesen Zweck sehr gut
geeignete Form ist der sogenannte Sandwich-Assay, der äußerst
zweckmäßig Enzyme, radioaktive Atome oder Gruppen,
fluoreszierende Verbindungen, Farbstoffe oder Metall- oder Färbepartikel
als Markierung verwendet. Alternativ kann auch der sogenannte
Inhibitionsassay verwendet werden, worin das Listeria-Antigen
der Probe mit dem erfindungsgemäßen Listeria-Antigen um die
Bindung an einen gemeinsamen Antikörper konkurriert. Bei dieser
Form ist entweder das erfindungsgemäße Antigen oder der
Antikörper dagegen an eine feste Phase gebunden und die andere
Verbindung ist an eine Markierung, wie zuvor beschrieben, gebunden.
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In einem weiteren alternativen Assay-Verfahren wird Listeria in
der Probe durch Agglutination oder Agglutinationsinhibition
nachgewiesen. Bei der Agglutination wird Listeria mit
Antikörpern in Kontakt gebracht, worauf Aggregation von
Listeria-Antigenen und Antikörpern auftritt und gegebenenfalls in der Bildung
eines Sedimentes resultiert. Sedimentation des Aggregats kann
durch die Verwendung von Antikörpern verstärkt werden, die an
Partikel wie Latices, Erythrocyten, Solpartikel von Farbstoffen,
Metalle oder Metallverbindungen usw. gebunden sind. Auf der
anderen Seite wird die zu untersuchende Probe in dem
erfindungsgemäßen Agglutinationinhibitionsassay mit einer Mischung aus
partikelgebundenem Listeria-Antigen und Antikörpern dagegen in
Kontakt gebracht, wobei die Mischung aggregiert und letztlich in
Abwesenheit von Listeria in der Probe sedimemtiert. Diese
Agglutination wird in Gegenwart von freien Listeria-Antigenen in der
Probe inhibiert.
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In allen der oben beschriebenen Assayverfahren kann ein
Nahrungsmittelprodukt oder ein Teil davon als Probe verwendet
werden, welches gegebenenfalls vorbehandelt sein kann, um die
Listeria-Antigene freizusetzen.
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Testgarnituren zur Durchführung der obenbeschriebenen Assays wie
auch neue Komponenten zur Verwendung in einer solchen
Testgarnitur sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
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Neue Komponenten der Testgarnituren sind, gemäß dieser
Erfindung, die obengenannten Antigene oder Fragmente davon oder
Antikörper dagegen, die an einen festen Träger, an eine Markierung
oder an einen Partikel gebunden sind. Geeignete feste Träger
sind in diesem Zusammenhang Reagenzgläser, Vertiefungen von
Mikrotiterplatten, Kugeln, Stäbe, Stangen, usw.
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Geeignete Testgarnituren für Sandwich-Assays können als
wesentliche Komponenten die folgenden umfassen:
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a. an einen festen Träger gebundenes Antigen gemäß der
Erfindung oder einen Antikörper dagegen und
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b. markierten Antikörper gegen besagtes Antigen oder:
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a. an einen festen Träger gebundenen Antikörper gemäß der
Erfindung und
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b. ein markiertes Antigen gemäß der Erfindung.
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Testgarnituren für Agglutinationsassays enthalten
geeigneterweise Antikörper gemäß der Erfindung, die an Partikel gebunden
sind.
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Das Antigen gemäß der Erfindung kann aus der Listeria-Spezies
mit Hilfe biochemischer, dem Fachmann bekannter Verfahren
gereinigt werden. Insbesondere kann Gebrauch von immunabsorbierenden
Verfahren gemacht werden, worin das Antigen von säulengebundenen
Antikörpern (vorzugsweise monoklonale Antikörper der Gruppen I,
II und III, beispielhaft vertreten durch die Antikörper 9-5E,
10-12C bzw. 10-2A) gefangen wird und anschließend von der Säule
durch Brechen der Antigen-Antikörperverbindung eluiert wird.
Beispiele
Bakterienkulturen
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Kulturen von Listeria und anderen Organismen (siehe Tabelle 3)
wurden auf Agarplatten oder als Stabkulturen bei 4ºC auf
tryptischer Soja-Bouillon (TSB) (BBL) + 0,6% Hefeextrakt (YE) (BBL) +
1,5% Bacto-Agar (Difco) gehalten.
Tabelle 3 Bakterienkulturen
Bezeichnung Organismus Typ Stamm
Bezeichnung Organismus Typ Stamm
Herstellung von bakteriellen Hitzextrakten
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Röhrchen mit 10 ml TSB + 0,6% YE wurden von Agarplatten oder
Stabkulturen geimpft und die Organismen 4 Tage bei 22ºC
gezüchtet. Die Röhrchen wurden dann 10 Minuten mit 1000 UpM bei 25ºC
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in
1,0 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
resuspendiert. Die resuspendierten Pellets wurden 30 Minuten in einem
kochenden Wasserbad erhitzt und bei 4ºC bis zur Verwendung
aufbewahrt.
Zellkulturen
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P3X63Ag8.653 Mausmyelomzellen und L929 Mausfibroblasten (ATCC,
Rockville, MD. USA) wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco-
Medium (Iscove's) gezüchtet (Mediatech Inc., Herndon, VA, USA),
das 10% foetales Rinderserum (FBS) (HyClone Laboratories, Inc.,
Logan, UT, USA) enthielt. Die Kulturen wurden in 75 mm²
-Kulturflaschen (Corning Glassworks, Corning, NY, USA) in einem
befeuchteten CO&sub2;-Inkubator (Queue Systems, Inc., Parkersburg, WV,
USA) bei 37ºC in einer Atmosphäre von 93% Luft/7% CO&sub2; gehalten.
Zur Fusion wurden Myelomzellen in der logarithmischen
Wachstumsphase (< 5 · 10&sup5; Zellen/ml) verwendet. Zur Herstellung von
konditioniertem Medium wurden L929-Zellen 3 bis 4 Tage als Monolayer
gezüchtet. Das Medium wurde dann geerntet, steril filtriert
(0,22 M) und tiefgekühlt (-20ºC) aufbewahrt.
Tiere
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Weibliche BALB/c (Charles River, Cambridge, Mass., USA) oder
CD2F1 (CBA · BALB/c)-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden
verwendet. Zur Ascites-Produktion wurden CD2F1-Mäuse mit 2, 6,
10, 14-Tetramethylpentadecan (Pristan) (Alderich Chemical Co.,
Milwaukee, WI, USA) 10 bis 14 Tage vor der Injektion von Zellen
vorbereitet.
Immunisierungen
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BALB/c-Mäusen wurden 100 ul eines Hitzeextraktes von Listeria
monocytogenes (L1, Dr. R. Flowers, Silliker Lab., Chicago
Heights, IL, USA) durch subcutane Injektion verabreicht, dann
wurde nach den Wochen 4, 10 und 15 eine Wiederholungsimpfung mit
dem gleichen Antigen durch intraperitoneale Injektion
durchgeführt. Die Milz der besten, durch ELISA-Aktivität festgestellten
Immunresponder wurde 3 Tage nach der letzten
Wiederholungsimpfung entfernt und zur Hybridoma-Fusion verwendet.
Zellfusion
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Mausmyelomzellen und immune Milzellen wurden in 50%
Polyäthylenglykol (PEG 1000) (Kodak) in einem Verhältnis von 1 : 5 unter
Anwendung einer Modifikation des von Köhler und Milstein [G.
Köhler und C. Milstein (1975), Nature 256 : 495] beschriebenen
Verfahrens fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden in 150 ml
Iscove's + 20% FBS resuspendiert und in zehn 96-Vertiefungen
umfassende Mikrotitrationskulturplatten (Corning) in einer Dichte
von 2,2 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung verteilt. Nach 24 Stunden wurde
HAT-Selektionsmedium zugegeben [Iscove's + 20% FBS, das
Hypoxanthin (H), Aminopterin (A) und Thymidin (T) enthält] und das
Medium alle 3 bis 4 Tage gewechselt, bis makroskopisches Wachstum
sichtbar wurde. Zellkulturen, die positives Wachstum in HAT
zeigten, wurden auf anti-Listeria-monoklonale Antikörper, wie
unten beschrieben, untersucht. Positive Kulturen wurden auf 24
Vertiefungen umfassende Kulturplatten (Corning) ausgedehnt und
zweimal durch begrenzende Verdünnung in Iscove's, das 50% L929-
konditioniertes Medium, 20% FBS und HT enthielt, unter Entzug
von Aminopterin, kloniert.
ELISA-Untersuchung der Hybridomazellen
Erste Untersuchung
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Hybridomakulturen, die makroskopisches Wachstum zeigten, wurden
mit Hilfe von ELISA nach reaktionsfähigen, monoklonalen
Antikörpern unter Verwendung von hitzeextrahierten, an
Mikrotiterplatten gebundene Listera-Antigene untersucht. Zu diesem Zweck
wurden Immulon 2-Polystyrolplatten (flacher Boden) (Dynatech
Laboratories, Inc. Alexandria, VA, USA) über Nacht (4ºC) mit einem
Hitzeextrakt von L1, der 1 : 1000 mit PBS verdünnt wurde (100
ul/Vertiefung), überzogen. Die Platten wurden dann mit PBS, das
3% Fischgelatine enthielt, 60 Minuten (22ºC) blockiert, dann mit
Hybridomaüberständen (100 ul/Vertiefung) 60 Minuten (37ºC)
inkubiert. Nach 3maligem Spülen wurden die Platten 60 Minuten (37ºC)
mit 0,1 ug/ml an Meerrettichperoxidase konjugierte polyklonale
Ziegenantikörper an Maus-IgG+IgM+IgA (Hyclone Laboratories,
Inc., Logan, UT, USA) inkubiert. Anschließend an fünf Spülungen
wurden die Platten 30 Minuten (22ºC) mit Tetramethylbenzidin-
Substratlösung (100 ul/Vertiefung) (Organon Teknika Corp.,
Durham, NC, USA) entwickelt und die Farbreaktion mit 4N H&sub2;SO&sub4; (100
ul/Vertiefung) beendet. Werte der optischen Dichte (O.D.) wurden
bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines
automatisierten Plattenlesers (Modell EL309, BioTek Instruments, Inc.,
Burlington, VA, USA), der mit Luft abgeglichen wurde, bestimmt.
Ein positiver Wert wurde als O.D.-Ablesung größer als 0,2
interpretiert.
Zweite Untersuchung der Hybridomazellen
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Kulturen, die eine positive Reaktion in der ersten Untersuchung
zeigten, wurden nochmals gegen eine Reihe von Listeria- und
nicht-Listeria-Hitzeextrakten wie oben beschrieben getestet. Die
Reihe bestand aus L. monocytogenes, L. innocua, Streptococcus-
Spezies, Pseudomonas-Spezies, Salmonella typhi und Escherichia
coli.
Spezifitätstestung von anti-Listeria monoklonalen Antikörpern
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Positive monoklonale Antikörper der zweiten Untersuchung wurden
gegen eine umfassende Reihe von Listeria-Hitzeextrakten unter
Verwendung des gleichen ELISA-Formats getestet. Die getesteten
Organismen schlossen 26 verschiedene Präparate von L.
monocytogenes, 2 von L. ivanovii, und je 1 von L. innocua, L. grayi, L.
denitrificans, L. murrayi und L. seeligeri ein.
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Eine umfassende Reihe grampositiver Organismen, die in der
gleichen Bouillon wachsen und Bedenken bezüglich Kreuzreaktionen
auslösen könnten, wurden mit ELISA unter Verwendung von
Hybridomaüberständen, dem oben beschriebenen Verfahren folgend,
getestet. Diese Reihe bestand aus Micrococcus varians, Streptococcus
cremoris, S. pyogenes, S. bovis, S. thermophilus, S. fecalis,
Staphylococcus epidermis, S. haemolyticus, S. aureus,
Actinomyces pyogenses, Bacillus cereus, Lactobacillus casei und
Erysipelothrix rhusiopathiae.
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In einigen Fällen wurden die Hitzeextrakte von S. aureus und L.
monocytogenes zuerst 5 Minuten bei 12'000 · g und 22ºC
(Mikrofuge, Beckman Instruments) zentrifugiert, um bakterielle
Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dann zum
Überziehen der Platten (1 : 1000) verwendet und die Inkubation mit
Hybridomaüberständen wie oben beschrieben durchgeführt.
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Eine Reihe von Hitzextrakten gramnegativer Organismen, die
Pseudomonas fluorescens, Citrobacter freundii, Enterobacter
aerogenes, Escherichia coli und Salmonella typhi einschlossen, wurde
unter Verwendung des gleichen ELISA-Formats getestet.
Herstellung und Reinigung monoklonaler Antikörper
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Asciteswachstum von Hybridomaklonen zur Herstellung von
Milligramm-Mengen monoklonaler Antikörper wurde durch Injizieren von
3,0 · 10&sup6; Zellen in mit Pristan vorbereitete CDF2-Mäuse und
Ernten der Flüssigkeiten nach 10 bis 14 Tagen erreicht. Monoklonale
Antikörpertiter wurden mit Hilfe von ELISA unter Verwendung
eines L. monocytogenes-Hitzeextrakts (L1), der an
Mikrotitrationsplatten, wie oben beschrieben, gebunden war, bestimmt.
Monoklonale Antikörper wurden mit
Protein-A-Sepharose®-Chromatographie
(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, USA) affinitätsgereinigt
und bei -70ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Immunochemische Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern
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Subisotypenanalyse von monoklonalen Antikörpern wurde
durchgeführt, indem eine im Handel erhältliche
Doppelimmundiffusionsgarnitur (ICN Immunobiologicals, Lisle, IL. USA) verwendet
wurde. Eine Identifizierung der Zielantigene wurde durch Western
Blot-Analyse von L. monocytogenes-Hitzextrakten (L1) von SDS-
PAGE-Gelen erhalten. Proteine wurden auf einem nicht
kontinuierlichen SDS-Gradient-Polyacrylamidgel (5 bis 15%) [U.K. Laemmli,
(1970), Nature 227 : 680] elektrophoretisch aufgetrennt und dann
auf Nitrocellulose durch Elektroblotten übertragen [H. Towbin,
T. Staehelin und J. Gordon, (1979), P.N.A.S. 76 : 4350]. Die Blots
wurden 2 Stunden (37ºC) in PBS, das 5% fettfreie Trockenmilch
enthielt, blockiert, zweimal mit PBS + 0,05% Tween®20 gespült,
dann wie folgt markiert: 1 cm große Streifen des präparativen
Blots wurden mit individuellen Hybridomaklonüberständen 2
Stunden (37ºC) unter Schütteln inkubiert, dann zweimal wie oben
gespült und weitere 60 Minuten bei 37ºC mit 0,25 ug/ml
HRP-konjugierten Ziegenantikörper auf Maus-IgG + IgM (H+L) (Kirkegaard
and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA) inkubiert.
Anschließend an zwei Spülungen wurden die Blots mit PBS, das
0,06% Diaminobenzidin (Sigma) und 0,03% H&sub2;O&sub2; enthielt, gefärbt
(22ºC).
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Verschiedene Reihen von Hitzeextrakten verschiedener Listeria-
und nicht Listeria-Organismen wurden analytischer
SDS-Gradienten-PAGE- und Western Blot-Analyse, wie oben beschrieben,
unterzogen. Die Reihen bestanden aus L. monocytogenes (Serotypen 1-
4), L. grayi, L. ivanovii, L. innocua, L. denitrificans, L.
seeligeri, L. murrayi, Streptococcus pyogenes, Staphylococus
aureus, Lactobacillus casei, Erysipelothrix rhusiopathiae,
Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi und Citrobacter freundii.
Ausgesuchte, gereinigte monoklonale Antikörper (5 ug/ml) wurden
dann verwendet, um diese Reihe, wie oben beschrieben,
immunzufärben.
Reinigung und Konjugation von Antikörpern
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10-15 ml Ascites wurden 1:2 mit Bindungspuffer, pH 9 (Affi-Gel
Protein A MAPS II Buffers, BioRad Laboratories, Richmond, CA,
USA) gemischt und auf eine 30 ml Protein A-Säule (Sepharose®
4B-Cl-Protein A, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA)
geladen. Die Antikörper wurden unter Verwendung des
Eluierungspuffers, pH 3,0 (BioRad) eluiert. Das Protein wurde bei 280 nm
überwacht und die Fraktionen gesammelt.
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In einigen Fällen wurden die Antikörper weiter an Meerrettich-
Peroxidase (Sigma Type VI, St. Louis, MO, USA) unter Anwendung
des Verfahrens von P.K. Nakane und A. Kawaoi [(1974), J.
Histochem. Cytochem. 22:1084] konjugiert.
ELISA als Einstufenfang-Verfahren
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Immulon Mikrotiterplatten® (Dynatech) wurden über Nacht (4ºC)
mit Protein A gereinigtem 10-12C (Gruppe II) (100
ul/Vertiefung), verdünnt auf 10 ng/ml in 0,05 M
Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6), überzogen. Die Platten wurden 30
Minuten bei Raumtemperatur mit einem Proteinpuffer blockiert.
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Nach dem Absaugen der Blockierungslösung wurden 100 ul des
Hitzeextrakts und 100 ul des HRP-Konjugats 10-2A (Gruppe III) (0,25
ug/ml) gleichzeitig zugegeben (Einstufen-ELISA) und 60 Minuten
bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten 6mal
gespült, und 100 ul/Vertiefung Tetramethylbenzidin
(KPL)-Substrat wurden zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert, dann wurden 100 ul/Vertiefung 2N H&sub2;SO&sub4;
zugegeben. Die optische Dichte wurde bei 450 nm in einem
automatischen Plattenlesegerät (Bio-Tek) gemessen, das mit Luft
abgeglichen wurde. 100 ul PBS wurde als Negativkontrolle verwendet.
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Modifizierungen dieses Verfahrens wurden in einigen Fällen durch
Verwendung eines anderen monoklonalen Antikörpers auf den
Platten durchgeführt, um das Antigen zu fangen, oder unter
Verwendung einer Kombination von Monoklonalen von zwei oder drei
verschieden Gruppen. Ähnliche Änderungen dieses Verfahrens wurden
häufig durchgeführt, indem andere HRP-konjugierte Monoklonale
entweder einzeln oder in Kombination verwendet wurden.
Ergebnisse
Untersuchung der Hybridomkulturen
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Von 511 getesteten Hybridomas zeigten 37 positive
ELISA-Reaktionsfähigkeit mit den Hitzeextrakten L. monocytogenes (L1).
Positive wurden dann vermehrt und gegen eine kleine Reihe von
Listeria- und nicht Listeria-Hitzeextrakten getestet, um ihre
Spezifität zu bestimmen. Sechzehn der 37 monoklonalen
Hybridomantikörper zeigten Spezifität für Listeria. Alle 16 reagierten
sowohl mit L. monocytogenes als auch mit L. innocua. Die übrigen
21 monoklonalen Antikörper zeigten unterschiedliche
Reaktionsprofile mit nicht Listeria-Hitzeextrakten (Streptococcus,
Pseudomonas, Salmonella, Escherichia). Einer von diesen (10-7C), der
sowohl mit Listeria als auch mit Streptococcus reagierte, wurde
für weitere Untersuchungen zurückbehalten.
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Eine umfassende Reihe von Listeria-Hitzeextrakten wurde
verwendet, um die 16 anti-Listeria monoklonalen Antikörper im ELISA
auf eine breite Reaktionsfähigkeit hin zu testen. Alle
Serotypen von L. monocytogenes (1-4) und alle anderen Spezies von
Listeria, außer L. denitrificans, wurden durch die 16
monoklonalen Antikörper nachgewiesen.
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Eine Reihe von Hitzeextrakten grampositiver Organismen, die
häufig in vorangereicherten Bouillons von Nahrungsmittelproben
vorkommen, wurden im ELISA auf Kreuzreaktivität mit den 16
anti-Listeria monoklonalen Antikörpern getestet. Alle 16 reagierten
nicht spezifisch mit diesen Hitzeextrakten. Jedoch zeigten die
IgG2a-Monoklonalen, einschließlich einer irrelevanten IgG2a-
Kontrolle, eine positive Reaktion mit dem S.
aureus-Hitzeextrakt. Diese Reaktion wurde durch Zentrifugation des
Hitzeextraktes beseitigt, um alles Zellwandmaterial vor der Verwendung
zum Überziehen von ELISA-Platten zu beseitigen. Zentrifugation
des Listeria-Hitzeextraktes beeinflußte die Antikörperbindung
jedoch nicht (Tabelle 2). Es ist auch interessant zu erwähnen,
daß 10-7C (IgG&sub1;) an alle getesteten grampositiven Organismen
gebunden hat, einschließlich S. aureus. Die Reaktionsfähigkeit
von 10-7C mit S. aureus wurde nicht durch vorhergehende
Zentrifugation des Hitzeextraktes beseitigt.
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Eine Reihe von Hitzeextrakten gamnegativer Organismen wurde
ebenfalls auf Kreuzreaktivität im ELISA unter Verwendung der 16
anti-Listeria monoklonalen Antikörper getestet. Keiner der anti-
Listeria Monoklonalen rief eine positive Reaktion mit einem
dieser Organismen hervor.
Isotyp- und Western Blot-Analyse
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Isotyp-Analyse der klonierten Hybridoma-Überstände zeigte, daß
alle 16 IgG-Monoklonale erzeugten. Zwölf waren IgG&sub1; und 4 IgG2a.
Gereinigte monoklonale Antikörper von allen 16 Hybridomaklonen
wurden verwendet, um den Listeria monocytogenes-Hitzeextrakt
(L1) in Western Blots zu sondieren. Die 16 Listeria-spezifischen
Monoklonalen erkannten ein Proteinantigen mit einem
Molekulargewicht im Bereich von 30 bis 38 kD, sowohl unter reduzierenden
als auch nicht-reduzierenden Bedingungen. Außerdem erkannten
die IgG2a-(Gruppe III) Monoklonalen und einige der IgG&sub1;- (Gruppe
II) Monoklonalen auch Banden mit niedrigerem Molekulargewicht
(Fig. 1).
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Um die Antigenverteilung und -größe weiterhin zu analysieren,
wurden Hitzeextrakte sowohl von Listeria als auch nicht Listeria
elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit ausgewählten
anti-Listeria-Monoklonalen sondiert. Nur von den
Listeria-Hitzeextrakten konnte nachgewiesen werden, daß sie das Antigen
enthielten, das von den Monoklonalen (Fig. 2) erkannt wurde.
Interessanterweise wurde eine geringe Variation des
Molekulargewichts des Hauptantigens (30 bis 38 kD) zwischen den
verschiedenen Serotypen von L. monocytogenes (Fig. 3) beobachtet. Es
ist weiterhin interessant zu bemerken, daß die L. grayi und L.
murrayi-Antigene etwa 5 kD größer als alle Antigene von L.
monocytogenes sind. In Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen
enthielt L. denitrificans das von den anti-Listeria Monoklonalen
(Fig. 3) erkannte Antigen nicht. Darüberhinaus enthielt keiner
der nicht Listeria-Hitzeextrakte dieses Antigen (Fig. 2). Diese
Ergebnisse waren übereinstimmend, unabhängig davon, welcher
anti-Listeria monoklonale Antikörper getestet wurde. 10-7C
jedoch, der ein anderes ELISA-Reaktivitätsprofil hat, reagierte
mit keinem der Polypeptidantigene von Listeria in den Western
Blots (Fig. 1).
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Das 30 bis 34 kD- und 34 bis 38 kD-Hauptantigen, dessen
molekulare Größe geringfügig, aber reproduzierbar mit der Spezies
variiert, umfaßt immer drei Epitope. Jeder monoklonale
Antikörper, der als immunspezifisch gegen dieses Antigen identifiziert
wurde, reagierte mit einem dieser drei Epitope. Zwei dieser drei
so definierten Epitope erscheinen auch in Antigenen mit einem
Molekulargewicht im Bereich zwischen 17 kD und dem
Molekulargewicht des Hauptantigens.
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Typische ELISA-Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Ergebnisse des Einstufenfang-ELISA
Organismus Verdünnung
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Wenn ein Antikörper der Gruppe 11 (10-12C) auf der Platte als
ein Fänger verwendet wird und ein anderer Antikörper der Gruppe
111 (10-2A) HRP-markiert und als Konjugat angewendet wird,
werden die Hitzeextrakte aller getesteten Listeria mit diesem Assay
mühelos als positiv identifiziert und Hitzeextrakte aller
getesteten
nicht Listeria mühelos als negativ identifiziert. In den
meisten Fällen könnten die Listeria-Hitzeextrakte um 2-4 log 10-
Verdünnungen verdünnt werden und positiv bleiben.
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Hinterlegungen von F61/9-5E (9-5E), F61/10-12C (10-12C) und
F6/10-2A (10-2A) wurden bei der ATCC in Rockville, USA unter den
Nummern HB 9493 bzw. HB 9494 und HB 9492 am 7. August 1987
getätigt.