JPH0484767A - リステリア属生菌の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、リステリア属の細菌の存在を迅速かつ容易
に調べる検出法に関する１食物中、その他の試料中で夾
雑が考えられるリステリア属の生菌の存在を調べるため
に、特にはイムノアッセイを利用する。この際、　１）
マクロファージ様細胞内におけるリステリア属生菌の選
択的増殖、２）続いて、増殖した細菌の菌体またはその
産物の検出を特徴とする検出法が使われる。

［従来の技術とその問題点］ 病原菌の存在が重篤な疾患を引き起こすことがよく知ら
れており、そのため、臨床検体（血液、組織、尿、その
他の生体からの抽出物、体液など）、および農産物検体
（食品など）中の病原菌を検出する必要が生じる。

しかし、食品中などの病原菌を検出するために現在行わ
れている試験では、一般にその終了までに多くの日数を
要する。試料の採取と測定の実施との間で、新鮮な食品
や乳製品は流通チェーンに入り、大衆に消費される。　
１回の試験で病原菌の存在が認められると、製品の広範
な回収をやむなくすることがあり、悪くすると、試験結
果が出る前に、細菌感染症の集団の発生をみる場合もあ
る。

これは、生鮮食品や野菜中で最近数多くみられたリステ
リア菌感染症の大発生について言えることである。その
大発生は、一般に４０％を上回る死亡率につながる。こ
の死亡率は、新生児、妊婦、高齢者、および免疫力の低
下した患者でいっそう高まる。また、自然流産でさえも
、無症候性の患者を生み出す結果となる。その証拠に、
全自然流産の２％がリステリア感染症に起因することが
推定されている。

上記のように、食品中の病原菌を検出するための従来の
検出法は、基本的にインキュベーションを必要とするた
めに、長い検出時間を要する。このインキュベーション
は、傷ついた細菌の回収、競合する各種微生物中でこれ
らの細菌の増殖、および細菌数の増加を可能とし、同定
を容易にする目的で行われる。多くの場合、標的細菌を
同定するには、連続して２．３回別個にインキュベーシ
ョンをする必要がある。

食品中のリステリア菌を検出するための標準的なＦＤＡ
法（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｃａｌ　Ａｎａｌｉｔｉ
ｃａｌ　Ｍａｎｎｕａｔ、６版、　１９８４年；補遺、
　９月、　１９８７年）では、　２５ｇまたは２５１の
食品試料を２２５１の強化肉汁培地と混合する。この試
料と肉汁との混合物を７日間インキュベーションする。

　１日日と７日日の終わりに、肉汁培養物の試料をベト
リ皿中の選択的増殖性のある寒天培地の上に擦り付け、
さらに２日間インキュベーションする。リステリア菌の
コロニーを同定できれば、もとの食品試料中にリステリ
ア菌の存在することが確かめられる。しかし、この同定
は主観的であるため、間違った結論を得ることがあって
、この手法で試料のリステリア陰性を確認するのに最低
７日を要する。

食品中の細菌を検出するための方法として、最近では、
イムノアッセイを使用する。目的とする細菌の抗原に対
する抗体は、これらの方法でなんらかの２段階検出法と
して一般に使用されている。

すなわち、１種類の抗体を固定化し、標的の細菌抗原を
捕獲する作用をもたせる。これによって、食品試料から
標的抗原の分離が可能となる。この抗原（エピトープは
同一のことも異なることもある）に対する第２の抗体を
、目ｓＩによる放射線測定またはセイヨウワサビ・パー
オキシダーゼによる酵素的測定などの方法で標識する。

さらに、固定化抗体を加えるならば、抗原複合体も固定
化される。以降の段階で未標識抗体を除去する。結合し
た状態の標識を測定し、一般に標準試料（陽性または陰
性の対照）と比較して、標的細菌の存在を判定する。２
段階検出法に使われる２種類の抗体のうち少なくとも１
つは、標識細菌に特異的でなければならない、この型の
イムノアッセイは。

直接検定法として知られている。拮抗検出法など、その
他の方法も使用できるが、感受性は低く技術的に実用向
きではない。

実際には、これらの検出法には検出限界があるため、食
品試料からの標的細菌を培養する必要がある。最近のイ
ムノアッセイの中には、インキュベーション時間の短い
ものもあり、個々のインキュベーション回数が少なくて
すむのもある。しかし、これらの検出法でも、試験の終
了までになお約４８時間を要する。

リステリア菌の検出に汎用される、いわゆる「迅速」イ
ムノアッセイでは、ＦＤＡ法と同様に、食品試料２５ｇ
または２５ｍ１を強化肉汁培地２２５１と混合する。こ
の培養混合物を２４時間インキュベーションする。この
２５０１の培養液から１■ｌをとって、９１の選択培地
を添加する。この時点で、全容量１０１の継代培養液（
通常、０．　２〜１．　０＋ａｌ）の全画数検体にイム
ノアッセイを行って、リステリア菌の有無を調べる。

要約すると、いわゆる「迅速」イムノアッセイは、食品
試料中の細菌の有無を調べる方法であって、どれも少な
くとも１つ（通常、２ないし３）の希釈試料（増殖培地
中）を必要とし、その後に、最終培養液分画を利用した
検出法を行う、実際の検定試料は、もとの食品試料の微
量に相当する。

従って、　ｌ工程（または数工程）の細菌培養を行って
も、この希釈率を上回る細菌数が得られなけ。

ｔＬ　Ｉｆならず、一定の培養回数が必要となる。

［問題点を解決するための手段〕 従来技術におけるこれらの欠点は、リステリア属生薗を
検出するための迅速かつ正確な方法を提供する二の発明
によって、解決をみる。

従って、病原性が予想されるリステリア菌の存在を迅速
に検出する方法を提供することが、この発明の１つの目
的である。

この発明のもう１つの目的は、もとの試料がら直接濃縮
したリステリア属の菌からリステリア生菌を、短時間の
選択的培養工程によって検出する方法を提供することで
ある。

これらの目的を達成するために、以下のような方法を提
供する。　−抗体の使用によって試料がらりステリア菌
を選択的に除き、これらリステリア菌をマクロファージ
様細胞（貪食作用によってリステリア菌を摂取する、他
のあらゆる種類の細胞）中でこれらリステリア菌を選択
的に増殖させ、その細胞からリステリア菌を放出させた
後に、リステリア菌に特異的な標識抗体または抗体群を
使ってその有無を調べる。

また、重合した細胞性アクチンまたはリステリアの溶血
素を介在したリステリア菌の検出法も使用できる。

上記のごとく、この発明の１つの目的は、食品試料中に
おけるリステリア菌の存在を迅速に同定する検出法を提
供することである。これには、極めて短時間でリステリ
ア菌の選択的な培養を必要とするが、これによって、新
鮮な食品の出荷に先だって、試験結果の解釈が可能にな
る。

この発明によれば、液体または液化した食品試料からの
細菌を固体支持体上で直接濃縮することによって、希釈
倍率の影響を抑えられる０食品試料からの濃縮と分離を
行って、その後、捕獲リステリア菌を検出する工程を経
る。

この発明に従って、リステリア菌を固定化および濃縮し
てから、これを、顕微鏡のスライドグラス上またはマイ
クロプレートの壁に付着して活発に増殖しているマクロ
ファージ様細胞に加えた。

マクロファージ様細胞がリステリア菌を貪食するように
短時間のインキュベーション工程（１時間以下）を行っ
た後、細菌抗体を含む細胞増殖培地を加えて、マクロフ
ァージ様細胞に飲み込まれなかった細菌を死滅させた。

リステリア菌は、一種の酵素である溶血素を分泌するの
で、マクロファージ様細胞の液胞膜を溶解し、細胞質内
部に侵入することができる。細胞質に入ったリステリア
菌は、強化液体培地中での増殖速度に匹敵する速度で増
殖し、分裂可能である。摂取後８時間以内に、リステリ
ア菌の細胞数は、１０００倍に達することもある。さら
に、未知のリステリア菌の細胞産物の作用によって、マ
クロファージ様細胞内で細胞性アクチンの重合が起きる
。この重合アクチンは、繊維状化し、続いて、これら繊
維がリステリア菌菌体の一端で凝集し、リステリア菌細
胞を押し出す、この過程は、　リステリア菌を隣接のマ
クロファージ様細胞に転移させる伝達手段となる（エル
・ジー・チルネイおよびデイ−・ニー・ボルトノイ、Ｊ
、　　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　　１０９号、　
１５９７−１６０８ページ、　１９８９年）。

従って、リステリア菌を検出するための標的は、増殖し
たリステリア菌菌体、リステリア菌の細胞性アクチン繊
維、またはマクロファージ様細胞の液胞膜を破壊するた
めにリステリア菌が放出した溶血素であるといえる。

リステリア菌検定法の選択性は、使用する抗体の特異性
、マクロファージ様細胞内での増殖の特異性、およびア
クチンの重合化ならびに繊維化の特殊性から生じる６ 上記のような記載に基づくと、この発明は、般に以下の
工程から成る。

１）試料を、必要に応じて、液状化する。

２）この液体試料を、標的のリステリア菌細胞に対する
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を固定化した
固体の支持体と混合する。そこで、標的のリステリア菌
菌体が存在していれば、固体支持体に固定化される。続
いて、固定化された細菌が付着した固体支持体を洗浄し
て、食品試料の残りを除去する。

３）固体支持体が微小球から成るものでなければ、抗体
によって固定化されたリステリア菌細胞は、固定化支持
体から放出される。

４）放出されたリステリア菌菌体、または微少球に結合
したリステリア菌を、ガラスまたはプラスチックに、付
着したマクロファージ様細胞の培養物へ添加する。

５）マクロファージ様細胞にリステリア菌菌体を貪食さ
せるために短時間、のインキュベーションを行った後、
増殖培地を除去して細菌の抗生物質を含む培地と交換す
るか、抗生物質を増殖培地に加えることもできる。この
工程では、マクロファージ様細胞に取り込まれなかった
細菌が除がれ、もとの細胞増殖培地で除去されず外液に
残ったすべての細菌も殺される。

抗体をコートした磁気粒子を微小球とすれば、これらの
粒子に結合したリステリア菌細胞は、マクロファージ様
細胞を付着したガラスまたはプラスチックといっそう効
果的に接触するようになる。

これは、リステリア菌を結合した磁気粒子と初期の短時
間のインキュベーション中にかけられる磁場との間に、
付着マクロファージ様細胞を置くことによって可能であ
る。

６）マクロファージ様細胞の液胞内でリステリア菌が酵
素（溶血素）を分泌し、この酵素が液胞膜を溶かして、
　細胞質中にリステリア菌を放出させル、ソこで、リス
テリア菌の増殖と複製が始まる。

リステリア菌は、マクロファージ様細胞内で極めて効率
的に増殖し、その倍加時間は約５０分である。こうして
、マクロファージ様細胞による摂取後８時間で、リステ
リア菌は１０００倍に増殖する。

７）マクロファージ様細胞をガラスまたはプラスチック
表面に付着させ、リステリア菌をその細胞内に止めたま
ま、培地を除く。

８）マクロファージ様細胞を破壊（水またはメタノール
の添加によって）し、リステリア菌に対する標識抗体に
よって、重合化アクチン繊維の検出によって、またはリ
ステリア菌の分泌溶血素の検出によって、リステリア菌
の有無を調べる。

上記で方法について説明したように、この発明の方法の
特徴は、特には、　１種類または数種類の抗体を使って
最初に試料からリステリア菌を選別することである。こ
の工程で使われる抗体は、リステリアに対する完全な特
異性を有する抗体である必要はない、その後の選択的で
特異性のある工程を経るため、最終的に、病原性が予想
されるリステリア菌だけを見いだす検出法の特異性が発
揮されよう、この発明の方法をいっそう特徴づける点は
、病原性が予想されるリステリア菌に選択的な細胞内増
殖培地とも言えるマクロファージ様細胞の使用である。

これらの特性を利用して、この発明の方法を、病原性が
予想されるリステリア菌の生菌株を迅速で特異的に検出
する手段に適用することができる。

［発明の詳細な説明］ マクロファージ様細胞の小量培養液を使った、病原性が
予想されるリステリア菌株の検出を示す具体例 第１工程：液状化 この発明の検出法は、固体および液体の様々な試料（食
品、農産物ならびに様々な臨床検体）中に含まれるリス
テリア菌の検出に利用される。試料が液体である場合、
これをそのままこの発明の方法に適用するか、希釈して
から使用する。一方、試料が固体の場合は、ブレンダー
の使用といった既知の標準的な方法によって、それをま
ず液状化する（例えば、水に対して）、液体または液状
試料は、粗いろ紙、ガラス、その他の支持フィルターを
通して濾過し１粒子を除去する。この発明の好ましい方
法（抗体結合の磁気微粒子による、リステリア菌細胞の
捕獲）を使用すれば、粒子を除去するこの濾過工程は、
必ずしも必要ではない。

試料が環境中にある試料であるならば、表面を拭き取っ
たものまたは切片を採取用緩衝液中で混合してから、液
状の食品試料として処理する。

第２工程：抗体を使った固定化 固定化抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体
）を使って、試料がらりステリア菌を分離する。この工
程では、リステリア属のすべての菌株を確認するために
１種類以上の抗体を使用しなければならない、検出法の
この工程では完全な特異性を必要としないので、他の細
菌の詔ａ（例えば、交叉反応性）も、この工程で許容し
得る。

第１工程で使用した抗体は、細胞表面の抗原を認識し、
これらの抗体はこの発明の好ましい方法で使われる微小
球に固定化する。そして、この微小球を試料と混合し、
なんらかの方法で試料混合物から分離して、標的リステ
リア菌細胞の捕獲を行う、特には、磁気粒子の微粒子を
固定化の支持体として使用することもできる。

短時間のインキュベーションで、液体または液状試料を
抗体の付いた磁気粒子と混合した後、その抗体粒子と結
合リステリア菌とを磁場の印加によって試料から分離す
る。抗体を付着させたその他のビーズ（ラテックス、ガ
ラス、架橋デキストラン、アガロース、および多糖類）
を使って、　リステリア菌を捕獲してから、遠心または
濾過による試料混合物からの分離を行うこともできる。

また、これらのビーズを充填したカラム上でリステリア
菌細胞を捕獲した後、試料の濾過を行って、試料混合物
からリステリア菌の分離と濃縮を行うこともできる。さ
らに、硝酸もしくは酢酸セルロース、グラスファイバー
、または抗すステリア菌抗体を有するナイロン膜上で試
料を濾過したのち、試料混合物からリステリア菌菌体を
分離することもできる。

リステリア菌を捕獲し、検出する抗体として、ポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を、目的とする感受性
の程度など様々な要因に応じて使用することができる。

ポリクローナル抗体を使用する場合、これらは、既知の
方法によって調製することができる０例えば、ビー、エ
イ・フルンら著（Ｍｅｔｈｏ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　ｘイチ’７７ン・プラキスおよびジェー・ラ
ンボン編、１０４−１４２ページ、１９８７年）が記載
した方法などを使用することができる。

モノクローナル抗体の調製法は既に知られており、この
発明でモノクローナル抗体を使用する場合、それはミル
スタインとケーラーの原報であるネーチャー　（２６５
巻、　４９５−４７９ページ、　１９７５年）に発表さ
れた方法に従って調製する。基本的な操作は、免疫原性
物質を動物（通常、マウス）に注射することを含む、こ
の免疫原に対する抗体の産生に適した時間を経たのち、
マウスを殺す、脛臓を切除して細胞を取り出し、これを
ミエローマ細胞と融合させる。融合で得られたハイブリ
ドーマは生体外で増殖可能であって、単一の細胞はそれ
ぞれ１種類の特異的抗体に対する遺伝情報を発現する。

あるハイブリドーマ細胞が産生ずる抗体は、ｅ抗原の単
一抗原決定基を認識するにすぎないであろう。

各ハイブリドーマ細胞を培養して得られた細胞は、標的
抗原決定基をしらべるためのスクリーニングにかけられ
る。標的抗原陽性のハイブリドーマをさらにスクリーニ
ングして、親和性の高い細胞を同定する。この発明で使
用するモノクローナル抗体は、少なくとも１０’　ｌ／
ｍｏｌの親和性をもつことになろう、こういった性質を
示すモノクローナル抗体は、実際の検定条件でスクリー
ニングし、その条件が抗体の結合特性（すなわち、親和
性）を変更するものであるか否を決定したり、夾雑が予
想される抗原との交叉反応性を有するものを排除する。

この発明の検出法の第２工程では、１種類の抗体または
抗体の組み合わせを固体の支持体に結合させ、試料から
リステリア菌細胞を捕獲するためにこれらを使用する。

検出法のこの工程で使用する、１種類または数種類の抗
体は、リステリア菌の細胞表面抗原に対するものであっ
て、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよ
い、ポリクローナル抗体は、弱毒化した完全なリステリ
ア菌細胞に対してものを調製する。免疫原となるリステ
リア菌に対する力価Ｌｏｇ、＝１３に近いポリクローナ
ル血清が、この方法を使って産生されている。

モノクローナル抗体は、上記の方法を使っても産生でき
る。これによって、目的のリステリア菌株を特異的に捕
獲するチャンスが生まれる。マウスを免疫するために用
いられる抗原は、目的のリステリア菌株の弱毒化した全
細胞または特異的細胞表面抗原であってもよい。

リステリア菌細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体
は、最初に細胞を培養することによって調製する。続い
て、これら細胞の弱毒抽出物は、マウスを免疫するため
に使用する０次いで上述のハイブリドーマの産生、およ
びモノクローナル抗体のクローニングならびにスクリー
ニングを行う。

リステリア菌の細胞壁に含まれるティコ酸に対する抗体
も、当該分野の技術者には周知の方法によって産生され
る。免疫処理は、ケイ・エイチ・シュライファーおよび
オー・カンドラ−の方法（Ａｒｃｈ、　　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、、　　５７巻、　３３５−３６３ページ、　１
９６７年）で作製したリステリア菌細胞壁の調製物を使
って実施される。これら細胞壁の調製物は、細胞壁のペ
プチドグリカン・マトリクスに共有結合したティコ酸（
ＴＡ）を含む、免疫処理の際、ペプチドグリカンは、免
疫原担体としての役割を果たす、抗体の特異性をより高
めることは、免疫孔側として精製ティコ酸を使って可能
となる。このために、細胞壁を化学的に分解することも
できる（　１０１７ｍｏｌのグリシン・塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ２゜５）、続いて、ティコ酸を精製し、免疫原として
使用する。免疫反応を強めるために、これらの精製ティ
コ酸を免疫原担体のタンパクに結合することもできる０
例えば、消化したティコ酸の還元糖末端基を、上記のよ
うに、ロイら（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ。

ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６２巻、　２７０−２７５
ページ、　１９６７年）の方法を使った還元的アミノ化
によって、担体タンパクに結合させることができる。こ
の方法は、カミサンゴら（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、、　２１巻、　１３５−１３７ページ、１
９８５年）によって、　リステリア菌に適用したもので
ある。この方法では、ティコ酸を、水素化シアノホウ素
ナトリウムの存在下でＢＳＡなどの担体タンパクと反応
させる。その結果、免疫処理に使用する、共有結合のテ
ィコ酸−タンパク複合体が得られる。

細胞壁のペプチドグリカン（ＰＧ）に対するモノクロー
ナル抗体は、上記のように、細胞壁を調製することによ
って作製する。　１０ｍＭグリシン・塩酸緩衝液、ｐＨ
２，５で細胞壁を処理した後、遠心を行うと、ティコ酸
は、上清中に、不溶性ペプチドグリカンはペレット中に
分離する。このペレットを再懸濁して、免疫原として使
用する。このペプチドグリカンをさらに高速液体クロマ
トグラフィーまたは電気泳動によって精製することも、
ペプチドグリカン・マトリクスから得られた開裂断片を
精製して使用することもできる。免疫原としてのペプチ
ドグリカンの使用は、エイチ・アイ・ベルゲラント（Ｊ
、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　１０４巻
、５７−６３ページ、　　１９８７年）によって示され
ている。

細胞壁に対するモノクローナル抗体も、ショックマンら
の米国特許第４，５９６，７６９号に記載された方法に
基づいて調製できる。こうして調製した抗体は、この発
明に基づいて、試料から選択的にリステリア菌を捕獲し
たり、夾雑が見込まれる１種類以上のリステリア菌株の
選択的同定のための検出法で使用される。この検出は、
様々な型の検出法に基づいて実施することができる。特
に、リステリア菌細胞の捕獲に優れた方法では、微°小
球または磁気粒子に結合させた抗体を使用する。しかし
、細菌細胞を捕獲して濃縮するために固定化抗体が利用
可能な他の方法も可能である。この方法では、リステリ
ア菌細胞を捕獲するために液状化試料中に懸濁した、ラ
テックス、ポリアクリルアミド、アガロース、その他の
デキストランなどの微小球を使用し、続いて、標的リス
テリア菌細胞を濃縮するために遠心を行う、そしてさら
に、抗体でコートシた棒またはへらを液体または液状化
試料中で撹拌して、標的リステリア菌細胞を回収するこ
ともで、きる、また、抗体の付着した、ニトロセルロー
ス、セルロースアセテート、ナイロン、その他の物質の
膜を介して試料を濾過する方法も適用され得る。アフィ
ニティークロマトグラフィーによる標的リステリア菌の
回収も行われる。

抗体を捕獲するために優れた固定化支持体は、磁気ビー
ズまたはポリアクリルアミドのビーズである。しかし、
抗体を固定化するために、その他の支持体も使用するこ
とができる。抗体をポリアクリルアミドのビーズまたは
他の支持体に結合させる方法は、当該の技術者に周知の
ものである。

ジェー・バウミンガーとエム・ウイルチェク（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７０巻、　
１５１−１５９ページ、　１９８０年）が記載するよう
に、ポリアクリルアミド。

ビーズに抗体を結合させるために、カルボジイミドを使
用することもできる。別の例として、一般に生体高分子
を多糖類に結合させる方法も挙げられる（米国特許第３
，６４５，８５２号）。

この発明の１つの好ましい態様では、抗体を磁気ビーズ
に固定化する。これは、米国特許第３，９７０．５１８
号、第４，０１８，８８６号、第４，８５５，０４５号
、および第４．２３０．６８５号に記載された方法など
、そのための既決によって実施できる。特に好ましい態
様では、磁気粒子への抗体の付着は、プロティンＡの中
間体を介して行う、すなわち、まずプロティンＡを磁気
粒子に付着させ、続いて任意の抗体をプロティンＡに結
合させる。プロティンＡ中間体の使用は、付着抗体によ
る捕獲の効率を非常に高める。

（フォルスゲンら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　９９：
１９（１９７７））プロティンＡは、　ＩｇＧのサブク
ラス抗体のＦｃ領域に結合し、これらの抗体のＦａｂ領
域を伸長させ、露呈させる。その結果、抗体の正しい立
体配置および粒子からの伸長によって、結合抗体とそれ
らの標的との間の有効な相互作用が可能となる。ある方
法では、磁気を帯びた粒径的１μｍの酸化鉄粒子が、初
めに３−アミノブロビルトリエトキシラン、続いて、グ
ルタルアルデヒドとの化学反応によって銹導される。銹
導磁気粒子をプロティンＡと混合し、プロティンＡが共
有結合した磁気粒子が得られる。ここで、この抗体をプ
ロティンＡ磁気粒子に加え、短時間インキュベーション
した後、プロティンＡ−複合体が生じる。　（エイチー
ｘイチ・ライ−タル、Ｍｅｔｈ、ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、４４：　１３４−１４８（１９７６））　、　　
付着プロティンＡ抗体を有するこれら銹導粒子は、この
まま細菌細胞の捕獲に使用できる。

第３工程：リステリア菌細胞の放出 捕獲されて、抗体で固定化されたリステリア菌細胞は、
固体支持体が微粒子でないかぎり、固定化支持体から放
出される。この工程で、食物または環境試料から濃縮さ
れたリステリア菌細胞は、培養されたマクロファージ様
細胞との適合性に害を与えないような方法で処理しなけ
ればならない（以下の第４工程参照）、この発明の好ま
しい方法では、リステリア菌の捕獲に使用する固体支持
体は、磁気粒子の微粒子である。この支持体または他の
材料（ラテックスなど）の微粒子を使用すると、抗体の
結合した洗浄したリステリア菌細胞は、マクロファージ
様細胞に直接加えることができる。固体支持体が巨大粒
子または濾過膜物質から作られていれば、マクロファー
ジ様細胞の小量培養物への添加に先だって、この支持体
から細胞を除去する必要がある。こういった固体支持体
からリステリア菌細胞を除去する方法には、　「アンチ
ボディー」−実験手順−、イー・ハルロウおよびニー・
レーン編、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
、　　５４９ページ、　　１９８８年）に記載されてい
るように、ｐＨの調節、タンパク分解酵素、塩、界面活
性剤などの使用が考えられる。

第４工程：マクロファージ様細胞によるリステリア菌の
装置 上記のように、この発明の方法の特性は、病原性が予想
されるリステリア菌細胞を選択的に培２．黄するための
マクロファージ様細胞の使用である。

リステリア菌の細胞は、宿主細胞の細胞質内で生育、分
裂および増殖する寄生生物に属する細胞内寄生細菌であ
る。宿主細胞に装置されると、この細菌は、液胞膜を脱
出し、生育、分裂および増殖を繰り返すために、液胞膜
を溶解する酵素（溶血素）を産生じなければならない、
細胞質内に取り込まれると、これらの細菌が病原性を発
揮するためには、細胞間での移動を可能としなければな
らない、　リステリア菌の病原株は、　リステリア菌（
宿主細胞の細胞質内に封入）が隣接宿主細胞へ移りやす
くなるような方法で、宿主細胞の重合化アクチン繊維を
運動させることによって、そういった移動を可能として
いる。移動を完了したリステリア菌細胞は、移動先の宿
主細胞の液胞膜と、移動前の宿主細胞の液胞膜との療法
によって封入される。そこで、リステリア菌は、溶血素
を産生じて放出し、膜を通過して、新しい宿主の細胞質
に入り、増殖と分裂を開始する。こうして、サイクルは
反復し、約５０分の倍加時間で、　リステリア菌細胞数
が増加する。こういった増殖サイクルは、　リステリア
菌がマクロファージ様細胞を移動することなしには、進
行しない、　（エル、ジー・チルネイおよびデイ−・エ
イ・ボルトノイ、Ｊ、ｏｆＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、、１０
９．（１９８９））、　　生体外で培養可能ないかなる
リステリア菌もこの発明に使用することができる。ここ
で使用されるマクロファージ様細胞の例として、マウス
Ｊ７７４細胞系が挙げられる（ビー・ジェー・ラルフら
、　Ｊ、Ｉｓａ＋ｕｎｏ１．、　１１４，８９８−９０
５（１９７５））　。

要するに、病原性が予想されるリステリア菌株の検出の
ためにマクロファージ様細胞を使用することによって、
現在の技術による方法よりも優れた。以下のような利点
が生まれる。　　１）病原性が予想されるリステリア菌
株（宿主の細胞内に侵入し得る）などの細胞肉寄生菌の
増殖、分裂、および細胞間移動の特異性、この特徴をリ
ステリア菌に選択的な細菌捕獲法と組み合わせることに
より、病原性が予想されるリステリア菌株に対する高い
特異性がもたらされる。２）強化増殖培地、細胞質への
侵入、増殖、分裂、その他の細胞に移動し得る競合細菌
がほとんど存在しないので、固体支持体に最初に捕獲さ
れたリステリア菌は、急速な成長が可能であって、強化
増殖培地での純粋なリステリア菌の増殖と類似した性質
を有する。３）こういったマクロファージ様細胞内での
培養工程は、その他の培養工程も、上記のような試料の
希釈工程も必要としない、４）最終培地の極一部を分析
する方法とは異なって、マクロファージ様細胞内での細
菌の培養は、実際には微量培養であるので、すべてのリ
ステリア菌が検定可能である。

５）リステリア菌細胞の検出は、様々な方法（以下に説
明）によって実施することができる。これには限定され
ないが、単一の感染マクロファージ様細胞から発光する
、病原性が予想されるリステリア菌細胞の集合（マイク
ロコロニー）を極めて高感度に検鏡レベルで視覚化する
方法などが含まれる。

これらの改良によって、この発明は、既存の従来法に比
べて極めて短時間（おそらく、８時間以下）で試料から
採取した、病原性が予想されるリステリア菌の検出を可
能とする。

この発明の検出法には、マウス腫瘍細胞系、Ｊ７７４（
ＡＴＣＣ−ＴｒＢ６７）　（デイ−・ニー・ボルトノイ
ら。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６７．１４５９−１４７１（１９
８８））、　ｐ３８８Ｄｌ（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ４６）　
Ｃｘイチ・ニス・コーレンら、　Ｊ、　ｏｆ　ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　　１１４，８９４−８９７（１９２５））、
　ＲＡｉｔ’　　２６４．７（ＡＴＣＣ−ＴＩ８７１）
　（ダブリュ・シー・ラシュケら、Ｃｅ１ｌ、　１５゜
２６１−２６７（１９８７））など、様々なマクロファ
ージ様細胞系が使用される。この発明のために、マクロ
ファージ様細胞には以下のような特徴がなければならな
い。

１）リステリア菌を貴食できること。

２）リステリア菌の細胞内での増殖を可能とするこ　と
。

３）１つの細胞から別の細胞へ、特に、宿主の細胞質を
残さず、細胞間をリステリア菌が移動し、細胞内にとど
まれること、この検出法に基づいて、これらマクロファ
ージ様細胞の微量培養物は、標準ＥＬＩＳＡ法に使用す
るマイクロタイタープレートなどの、単数または複数の
六のあるプラスチックプレート中に入れたり、適当な細
胞増殖培地を含む培養皿に浸漬したスライドグラス上に
滴下することもできる。この発明の好ましい方法では、
短時間のインキュベーションの間、抗体をコートした磁
気微粒子に結合したリステリア菌は、これと磁場との間
で最初に短時間のインキュベーションを行って、マクロ
ファージ様細胞を付着させたガラスまたはプラスチック
と接触させると効果的である。それによっ・て、マクロ
ファージ様細胞に接触するリステリア菌体は、装置され
る。

このように、この発明の検出法では、リステリア菌細胞
（抗体の結合した支持体から放出されるか、抗体の結合
した微小球との結合を維持している）をマクロファージ
様細胞の培養液に加えた後。

この培養液をインキュベーションして、マクロファージ
様細胞にリステリア菌を装置させる。インキュベーショ
ンは、ＤＭＩ培地（３０−４０℃、好ましくは３７℃）
中、高湿度下、および濃度５％ＣＯ１の添加などの既決
に従って実施できる。

第５工程：リステリア菌を含むマクロファージ様細胞の
選択 十分にインキュベーション（通常、３０分ないし２時間
）した後、増殖培地を除去し、抗生物質を含む培地と交
換し、マクロファージ様細胞によって内包されていない
細菌を取り除く、すでに知られている様々な抗生物質１
例えば、ゲンタマイシン、ナリジクス酸、ペニシリンお
よびストレプトマイシンなどを使用することができる。

第６エ程： リステリア菌は、マクロファージ様細胞の液胞内に取り
込まれると、酵素（溶血素）を産生じ、これが液胞膜を
溶解し、細胞質内にリステリア菌を放出する。溶血素は
、リステリア・モノサイロゲネス（Ｌ、　ｍｏｎｏｃｙ
ｔｏｇｅｎｅｓ）など一連のリステリア属だけが産生ず
る。病原性となるためには、リステリア菌は溶血素を産
生じなければならない、さらに、リステリア菌は、連続
的に細胞を標的とするために、侵入性を獲得する必要が
ある。従って、病原性が予想されるリステリア菌だけが
、細胞の液胞を脱出して、増殖と分裂を繰′り返して、
隣接の細胞に移動する。

リステリア菌の病原株は、この移動を以下のような機構
で行う、細胞膜がリステリア菌を封入しやすいように、
アクチンを重合化した宿主細胞を隣接する宿主細胞に接
近させ、続いて、この隣接細胞が、リステリア菌を封入
した細胞突起物の末端を装置する。リステリア菌は、新
たに侵入した細胞内で増殖と分裂を繰り返す０倍加時間
は、約５０分である。従って、最初の感染から８時間以
内に、リステリア菌の細胞数は１０００倍に増加する。

第７エ程ニ ガラスまたはプラスチック表面に付着したマクロファー
ジ様細胞、および細胞質内のリステリア菌をそのままの
状態にして、培地を除去する。

第８工程：　マクロファージ様細胞の破壊培地が除去さ
れても、マクロファージ様細胞（よ、細胞質内にリステ
リア菌を内包して、ガラスまたはプラスチック容器の表
面に付着している８次の段階で、　リステリア菌を検出
するには、リステリア菌細胞をマクロファージ様細胞か
ら放出させることが必要である。この操作を行うために
、細胞がやっと浸るくらいの量の氷またはメタノールを
。

細胞の入った容器に加える。これによって、マクロファ
ージ様細胞が破壊され、捕獲されたリステリア菌が放出
される（その後、検出される）、メタノールを使用した
場合、マクロファージ様細胞およびリステリア菌は、検
出のために表面に固定される。

リステリア菌の検出 リステリア菌をマクロファージ様細胞から放出させた後
、リステリア菌の存在は、目的とする特異性の程度、お
よび検出標的として使用するリステリア菌の菌体成分に
応じて様々な手段によって検出することができる。マク
ロファージ様細胞を固定して染色し、これを直接検鏡し
　リステリア菌微小コロニーの有無を調べることが可能
である。

リステリア菌の菌体に対する抗体、または重合アクチン
繊維などの細胞成分に対する抗体を使って検出を行うこ
とが好ましい。

捕獲したリステリア菌の検出に抗体を使用する場合、ポ
リクローナルまたはモノクローナル抗体を使うことがで
きる。これらの抗体は、検出分子を使って直接または間
接的に標識する。また、ポリクローナル抗体を使うか、
モノクローナル抗体を使うかの選択は、目的のリステリ
ア菌株の特異性の程度、および標的リステリア菌に対す
る抗体の結合特性によって決まる。さらに、細胞の繊維
性アクチンに対する抗体も、アクチンの網状繊維の結合
を介して捕獲抗体を検出するために使用できる。この網
状繊維には、増殖、分裂、および宿主のマクロファージ
様細胞間での移動を経るリステリア菌が結合している。

標識ファロイデイン（アクチン結合毒素）、または標識
ミオシンも、抗アクチン抗体の代わりに使用できる。

捕獲され、マクロファージ様細胞中で増殖した、細菌、
またはリステリア菌の結合したアクチン網状繊維を検出
するために、直接または間接標識抗体を使用することに
加え、染色したスライドグラスを直接検鏡することによ
って、リステリア菌を検出することができる。ここで、
この発明の検出法を使用する場合、試料から捕獲したリ
ステリア菌を含むカバーグラス上でマクロファージ様細
胞を感染させ、　リステリア菌を増殖、分裂させて、隣
接の細胞に移動させた後、カバーグラスを固定して染色
し、リステリア菌の有無を識別する。リステリア菌がち
との試料中に存在していて、固体支持体上で捕獲され、
マクロファージ様細胞によって取り込まれていれば、リ
ステリア菌の小塊（マイクロコロニー）の形成は、カバ
ーグラスの検鏡によって確認できよう。

リステリア菌を実際に検出するには、この後に多数の手
順を組み込むことができる。それらの概略をフローチャ
ートとして、第４図に示す。

この発明のリステリア菌の１つの好ましい検出法は、リ
ステリア菌細胞壁の構造的特殊性、特にはペプチドグリ
カン（ＰＥＧ）成分とティコ酸（ＴＡ）成分の使用、更
には捕獲標的抗原基としてペプチドグリカン−テイコ酸
複合体（ＰＥＧ−ＴＡ）を利用して、リステリア菌株を
選択的に検出することである。また、その方法では、リ
ステリア菌株に多種の異なったティコ酸が存在すること
も利用できる。リステリア菌株の細胞壁成分は、ジアミ
ノピメリン酸タイプのペプチドグリカン、リビトール含
有ティコ酸、リボティコ酸およびタンパクである。こう
いった成分についての概説は、エフ・フィーダー著、　
ｒ　ＩｎｆｅｃｔｉｏｎＪ　１６巻　１９８８年、補遺
２，３９２−２９７ページ、およびこの明細書の第１図
に示されている。

第２図に示すように、細胞壁はペプチドグリカンのマト
リクスを含み、それに、多数のティコ酸分子が結合して
いる。第３図には、リステリアの１菌株における個々の
ティコ酸分子に共有結合したペプチドグリカンマトリク
ス部分の化学構造の１例を示す、ティコ酸分子は、リビ
トールまたは置換型リビトールから成る糖部分を含む、
単一のティコ酸分子では、リビトールまたは置換型リビ
トールが、約３０回繰り返し構造をとる。さらに、別の
リステリア菌株では、リビトールに代わる様々な糖が存
在する。

この発明は、リステリア菌細胞壁の構造的特徴を利用し
、リステリア菌株の検出を可能にする検出法を、そして
目的に応じて、リステリア菌の菌株の相違を検出する方
法を提供する。リステリア菌は、数種の菌株のみに病原
性があるので、病原菌株だけを検出することができる。

これには、これら病原菌株の特徴的なティコ酸構造が利
用される。

特に、様々なリステリア菌株のりビトール置換体を示す
第４図を参照にすると、Ｓ　Ｖ　ｌ　／　２　ａおよび
４ｂは、もっとも一般的な病原株であって、Ｓ５は主に
動物の病原体で、残りの菌株が病原性を認めることはま
れである。

菌体および細胞壁成分の検出および選択は、抗体の使用
によって行い、目的とする感受性の程度などの様々な因
子に応じて、検出法の各工程でポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体のいずれかを使った方法によって
も実施できる。

従って、好ましい検出法は、一般に以下の操作手順から
成る。

１）マクロファージ様細胞を破壊しリステリア菌を放出
させた後、放出したリステリア菌に処理（好ましくは、
ムタノリシンで）して、標的抗原、すなわち、ペプチド
グリカン−テイコ酸複合体を細菌の細胞壁から放出させ
る。

２）こうして処理した複合体を、アフィニティークロマ
トグラフィーなどによって、ペプチドグリカン（ＰＥＧ
）成分に対する抗体の結合した親和性支持体と接触させ
る。これによって、ペプチドグリカン成分が抗体に捕獲
される。

３）ＰＥＰ−ＴＡ複合体のティコ酸に対する標識抗体を
含む溶液を、上記のクロマトグラフィーにかけると、こ
れらの標識抗体は、捕獲されたＰＥＰ−ＴＡ複合体のテ
ィコ酸部分に結合する。

４）続いて、親和性支持体を溶出副で処理し、支持体か
ら上記の標識を溶出させる。そして、病原細菌の存在を
示す直接の指標として、標識モノクローナル抗体を検出
できる。

従って、マクロファージ様細胞を破壊し、リステリア菌
株を放出し、ムタノリシン溶液を加えて特異的細胞壁成
分を産生ずるリステリア菌の細胞壁を破壊してから、検
出操作を行う、この消化産物は、細胞壁ティコ酸に共有
結合した細胞壁ペプチドグリカンの単一およびｌまたは
複数の単位である。ペプチドグリカン−テイコ酸複合体
（ＰＥＰ−ＴＡ）は、イムノアッセイの場合、細菌の標
的抗原といえる。上記の溶液を除去して、これを、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体を固定化したカラ
ムにかける。なお、この抗体は、アガロース・ビーズな
どの固体支持体に共有結合したＰＥＰ−ＴＡのペプチド
グリカン成分に対する抗体である。緩衝液をカラムに通
し、捕獲ＰＥＰ−ＴＡ複合体以外で残存するすべての細
胞成分を除去する。

続いて、リステリア菌のティコ酸に対するモノクローナ
ル抗体を含む溶液をカラムに通す、これらの抗体は、リ
ステリア菌株に対して特異性を有する。上記および第４
図に示したように、ティコ酸の構造は、リステリア菌量
でばらついているので、様々なリステリア菌の検出する
には、２種類以上の抗体を必要とする１選択されたどの
細菌も検出することであれば、これら細菌のすべてに対
して抗体が使われる。

その溶液をカラムに流し、カラムを徹底的に洗浄して、
ＰＥＰ−ＴＡ複合体のＴＡ酸成分特異的に共有結合しな
かった標識抗体のすべてを除く。

試験の最終的な特異性は、操作のこの工程で決まる。

続いて、少量の溶出液をカラムに通過させ、ティコ酸抗
体に結合した上記の指標分子、または標識ティコ酸抗体
を除去する。放出された標識分子を含む溶出液を集めて
、標識を定量する。この測定値は、リステリア菌株の存
在を示す直接の指標ともいえるが、一連の対照カラムに
対して比較することができる。

リステリア菌の細胞壁成分を検出する代わりに、溶血素
の存在を調べてリステリア菌を検出することができる。

この場合、溶血素に対する抗体を利用すれば、ペプチド
グリカン抗体の代用となろう。

リステリア菌の産生じた溶血素に対するモノクローナル
抗体を含むカラムを上記のペプチドグリカン抗体の代わ
りに使用すると、マクロファージ様細胞を水で溶解した
後に、溶解した細胞と溶液をアフィニティーカラムにか
ける。続いて、洗浄してから、標識した抗溶血素モノク
ローナル抗体指標（様々なエピトープと親和性を有する
）をカラムにかける。その後の検出は、以下のように行
う。

二の発明のもう１つの変形例は、抗すステリア菌抗体の
結合した磁気微粒子を、水で溶解したマクロファージ様
細胞を含む溶液に加えて、リステリア菌を捕獲すること
である。そこで、捕獲された細胞は、磁場によって、溶
液から分離する１例えば、この分離は、マクロファージ
様細胞が関与する初期の工程で使用するマイクロプレー
トの下から磁場をかけることによって、実施できる。磁
、気位子に付着したリステリア菌を分離したら、次に洗
浄が必要となる。最終段階である細胞の検出は上記の方
法で行い、感染時および細胞移動過程でリステリア菌に
よって産生された網状アクチンは、標識抗アクチンモノ
クローナル抗体、標識アクチン結合ミオシン、または標
識ファロイデイン（アクチン結合毒素）によって検出す
ることができる。網状アクチンの検出によって、アクチ
ン分子の繰り返し構造、およびリステリア菌に結合した
アクチンの量に起因したシグナルの増幅が生じる。

マクロファージ様細胞をメタノールで処理すると、リス
テリア菌は、プラスチックまたはガラスの表面に固着す
る。この段階では、顕微鏡下での細菌のいかなる検出方
法も利用できる０例えば、リステリア菌表面に対する蛍
光標識抗体を、スライドグラスにのせ、インキュベーシ
ョンおよび洗浄工程を経たのち、スライドグラスの検鏡
によって、リステリア菌を蛍光小塊として検出し、これ
をリステリア菌のマイクロコロニーと判定する。

リステリア菌菌体をマイクロプレートの表面に固定した
場合、酵素標識抗体を加えて、リステリア菌表面に結合
させることができる。続いて、添加した基質に応じて、
産物の蛍光性、発色性、その他の性質を、溶液中で検出
する。

上記の方法において、リステリア菌細胞表面に対する抗
体は、シグナルまたは指標の役目をかねる。また、既知
のイムノアッセイで使用する標識によって直接または間
接に標識する手法もある。

直接標識（抗すステリア菌表面抗体に直接付着させた標
識）として、蛍光性、化学発光性、生物発光性、放射能
活性、金属、ビオチン、または酵素などの分子が挙げら
れる。これらの抗体、その他の高分子にこれらの標識を
結合させる方法は、当該分野の技術者には周知である０
例えば、フルオレセイン・イソチオシアネートに関して
は、ダブリュ・ヒーヤーマンら（ＣＩｉｎ、Ｅｘｐ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

４、４５７　（１９６９））の方法、テトラメチル・ロ
ーダミンに関しては、ジェー・ダブリュ・ゴッヂング（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　１３．２１５
　（１９７６））の方法、および酵素に関しては、イー
・エングラル（Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　７０．４１９−４３９　（１
９８０））の方法が挙げられる。

これらの指標抗体は、間接的にも標識できる。

この場合、実際の検出分子は、第２の抗体、その他の分
子に結合しており、抗リステリア菌表面抗体に対する結
合親和性を持っている。第２の抗体を使用する場合、該
第２抗体は、抗すステリア菌表面抗体を作製した動物か
らの抗体のクラスに対する一般的な抗体であることが好
ましい、また、上記で説明したこの発明の方法では、標
識した指標分子は、上記の方法が実際に利用できるもの
であれば、重合アクチンに親和性のある分子も可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はリステリア菌細胞壁の微細構造を、第２図はリ
ステリア菌細胞壁に含まれるペプチドグリカンの分子構
造を、第３図はリステリア菌のティコ酸に結合したペプ
チドグリカン部分の構造を、第４図はリステリア菌の検
出手順の流れ図を、それぞれ示す。 ＦＩＧ、　１ 工ニｆ・べ゛７°ゲｐブ・１７７シ ９＞、、ｏ７ 、−〆フ”イク面覧 知／１２７１Ｌ トＩＧ、５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リステリア菌株の検出法であって、 ａ）リステリア菌とマクロファージ様細胞との混合物を
   インキュベーシヨンして、該マクロファージ様細胞に該
   リステリア菌を貪食させ、該リステリア菌を該マクロフ
   ァージ様細胞内で分裂させる、 ｂ）前記マクロファージ様細胞を破壊して、前記リステ
   リア菌を放出させる、および ｃ）前記リステリア菌の有無を調べる、工程から成るリ
   ステリア菌株の検出法。 （２）リステリア菌株の検出法であって、 ａ）リステリア菌の存在が見込まれる試料からリステリ
   ア菌を捕獲する、 ｂ）前記捕獲リステリア菌をマクロファージ様細胞と混
   合し、該マクロファージ様細胞に該リステリア菌を貪食
   させ、該リステリア菌を分裂させる、 ｃ）前記マクロファージ様細胞を破壊して、前記の貪食
   されたリステリア菌を放出させる、および ｄ）前記リステリア菌の有無を調べる、工程から成るリ
   ステリア菌株の検出法。 （３）リステリア菌株の検出法であって、 ａ）リステリア菌の存在が見込まれる試料からリステリ
   ア菌を捕獲する、 ｂ）前記捕獲リステリア菌をマクロファージ様細胞と容
   器中で混合してインキユベーシヨンし、該マクロファー
   ジ様細胞に該リステリア菌を貪食させ、該リステリア菌
   を分裂させる、 ｃ）前記の貪食リステリア菌を含むマクロファージ様細
   胞を前記容器の表面に固定する、および ｄ）前記リステリア菌の有無を調べる、工程から成るリ
   ステリア菌の検出法。 （４）リステリア菌に対する抗体を固定化した固体支持
   体に前記試料をさらすことによって、前記リステリア菌
   を該試料から捕獲することを特徴とする、請求項１また
   は２記載の検出法。 （５）前記支持体に磁気ビーズが含まれることを特徴と
   する、請求項４記載の検出法。 （６）前記マクロファージ様細胞が、Ｊ７７４、Ｐ３８
   ８Ｄ１およびＲＡＷ２６４．７の細胞系群より選ばれる
   、請求項２または３記載の検出法。 （７）前記マクロファージ様細胞を水による処理で破壊
   することを特徴とする、請求項２記載の検出法。 （８）前記マクロファージ様細胞をメタノールによる処
   理で固定することを特徴とする、請求項３記載の検出法
   。 （９）前記マクロファージ様細胞を固定した後、リステ
   リア菌の存在を検鏡によって判定することを特徴とする
   、請求項８記載の検出法。 （１０）前記マクロファージ様細胞を固定した後、リス
   テリア菌の存在を、リステリア菌細胞膜成分の溶血素ま
   たは重合化アクチンの有無を調べることによって判定す
   ることを特徴とする、請求項２記載の検出法。 （１１）前記マクロファージ様細胞を固定した後、リス
   テリア菌の存在を、リステリア菌体、リステリア菌細胞
   膜成分または重合化アクチンの繊維に対する標識抗体で
   該固定細胞を処理して判定することを特徴とする、請求
   項３記載の検出法。 （１２）前記マクロファージ様細胞を破壊した後、該破
   壊マクロファージ様細胞および放出リステリア菌と、リ
   ステリア菌に対する抗体を固定化した固体支持体とを混
   合することによって放出リステリア菌を再捕獲し、続い
   て、リステリア菌細胞膜成分または重合化アクチンの繊
   維を検出することによって、再捕獲されたリステリア菌
   の有無を調べることを特徴とする、請求項１０記載の検
   出法。 （１３）前記リステリア菌細胞膜の検出が、 ａ）前記の再捕獲リステリア菌を処理して、該リステリ
   ア菌からペプチドグリカン−テイコ酸（ＰＥＰ−ＴＡ）
   複合体を放出させること、 ｂ）前記ＰＥＰ−ＴＡ複合体とペプチドグリカンに特異
   的な抗体とを混合して、該ＰＥＰ−ＴＡ複合体を捕獲す
   ること、 ｃ）前記の捕獲ＰＥＰ−ＴＡ複合体と、テイコ酸に対す
   る標識抗体とを混合して、該標識抗体を該捕獲ＰＥＰ−
   ＴＡ複合体に結合させること、 ｄ）作製したＰＥＰ−ＴＡ−標識抗体複合体を処理して
   、前記標識を放出させること、および ｅ）前記標識を測定して、試料中のリステリア菌株を検
   出または定量すること、によって行われる、請求項１２
   記載の検出法。 （１４）前記の再捕獲リステリア菌の処理を、分解酵素
   によって行う、請求項１３記載の検出法。 （１５）前記リステリア菌細胞壁成分の検出が、 ａ）前記の放出リステリア菌を処理して、該リステリア
   菌からペプチドグリカン−テイコ酸（ＰＥＰ−ＴＡ）複
   合体を放出させること、 ｂ）前記ＰＥＰ−ＴＡ複合体とペプチドグリカンに特異
   的な抗体とを混合して、該ＰＥＰ−ＴＡ複合体を捕獲す
   ること、 ｃ）前記の捕獲ＰＥＰ−ＴＡ複合体と、テイコ酸に対す
   る標識抗体とを混合して、該標識抗体を該捕獲ＰＥＰ−
   ＴＡ複合体に結合させること、 ｄ）作製したＰＥＰ−ＴＡ−標識抗体複合体を処理して
   、前記標識を放出させること、および ｅ）前記標識を測定して、試料中のリステリア菌株を検
   出または定量すること、によって行われる、請求項１０
   記載の検出法。 （１６）前記の放出リステリア菌の処理を分解酵素によ
   って行う、請求項１５記載の検出法。 （１７）前記分解酵素がムタノリシンである、請求項１
   ４または１６記載の検出法。 （１８）前記テイコ酸に対する抗体が、病原性リステリ
   ア菌株に見いだされるテイコ酸に特異的である、請求項
   １３または１５記載の検出法。 （１９）前記標識抗体が、蛍光性、化学発光性、生物発
   光性、放射線活性、金属、ビオチンまたは酵素分子であ
   る、請求項１１、１３、および１５のいずれか１項記載
   の検出法。（２０）リステリア菌を検出する方法であっ
   て、 ａ）病原性が予想されるリステリア菌株を、リステリア
   菌に対する抗体を固定化した固体支持体と混合し、前記
   試料からのリステリア菌を捕獲する、 ｂ）前記捕獲リステリア菌を、該リステリア菌を貪食し
   得るマクロファージ様細胞と混合する、 ｃ）前記リステリア菌とマクロファージ様細胞との混合
   物を、該マクロファージ様細胞が該リステリア菌を貪食
   するに足る時間インキュベーシヨンする、 ｄ）前記混合物を抗体と混合して、前記マクロファージ
   様細胞に貪食されなかった細菌を殺す、 ｅ）前記混合物を容器内でインキユベーシヨンし、前記
   リステリア菌を分裂させる、 ｆ）前記マクロファージ様細胞を破壊し、貪食されたリ
   ステリア菌を放出するか、前記容器の表面にマクロファ
   ージ様細胞を固着させる、 ｇ）リステリア菌を検出する、工程から成るリステリア
   菌の検出法。 （２１）前記固体支持体が磁気ビーズから成る、請求項
   ２０記載の検出法。 （２２）前記マクロファージ様細胞を、水での処理によ
   って破壊するかまたはメタノールでの処理によって固定
   する、請求項２１記載の検出法。 （２３）前記マクロファージ様細胞が、Ｊ７７４、Ｐ３
   ８８Ｄ１およびＲＡＷ２６４．７の細胞系群から選ばれ
   る、請求項２１記載の検出法。 （２４）前記マクロファージ様細胞を固定した後、リス
   テリア菌の存在を、検鏡によって、またはリステリア菌
   、細胞壁成分もしくは重合化アクチン繊維に対する抗体
   による前記固定細胞の処理によって判定する、請求項２
   １記載の検出法。 （２５）前記マクロファージ様細胞を固定した後、リス
   テリア菌の存在を、リステリア菌細胞壁成分、溶血素、
   または重合化アクチン繊維の検出によって判定する、請
   求項２１記載の検出法。