JPH08289780A - 微生物等の検出方法、この検出方法に用いる抗体、及びこの抗体を産生する新規ハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被検液中の微量な微生物，ウイルス等の検
出、測定を迅速かつ高感度に行なうことができる新規な
抗ＤＮＡ抗体を提供する。 【構成】 自己免疫疾患動物である全身性エリテマトー
デス（ＳＬＥ）の病態モデルＭＲＬマウスの抗ＤＮＡ抗
体産生Ｂ細胞と、マウス由来の骨髄種細胞株ＰＡＩの細
胞との融合細胞である新規ハイブリドーマにより産生さ
れたＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検液中の微生物，ウ
イルス等を、迅速かつ高感度に検出する方法、この検出
方法に用いる抗体、及びこの抗体を産生する新規ハイブ
リドーマに関し、例えば、水、純水、超純水中の微生
物，ウイルス等の検出，測定を行なう方法に関する。

【０００２】

【発明の背景と従来技術】細菌を含めた微生物は、数の
多少に差はあるものの、あらゆる領域に普遍的に存在し
ており、種々の製造産業において常に製品中の混入微生
物の管理に頭を悩ませている。

【０００３】例えば、食品、清涼飲料水等の飲料水、医
薬用水などでは、安全衛生上の観点から、混入微生物の
除去管理は特に厳重である。また電子部品製造業などに
おいては、例えば半導体デバイス等の電子部品の洗浄に
使用される純水，超純水に微生物が混入していると、微
小な配線に短絡等の欠陥を招いて製品歩留を低下させる
という理由から、洗浄水中の微生物有無については厳重
な管理が行われている。

【０００４】このような微生物混入の防止を管理する場
合にあっては、用水等の製造工程に除菌、殺菌の工程を
設けることと、この除菌や殺菌の処理が確実に行われて
いるか否かを検出，評価して、用水製造工程にフィード
バックすることとが必要になる。

【０００５】従来、このようなフィードバック管理のた
めの微生物の混入検出，測定の方法は、一般に培養法に
依存している。

【０００６】この培養法は、被検液を寒天培地に塗沫す
るか、マイクロフィルター等でろ過し、捕捉した微生物
をフィルターごと培地上に移して２日から５日間培養
し、しかる後、培地あるいはフィルター上に形成された
コロニーを目視で数えて被検液中の細菌数を算出する方
法である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上述の培養法
は、細菌がコロニーを形成して目視で確認できる大きさ
になるまでに、一般細菌であっても２日〜５日間の日数
を要することが避けられない。このため例えば食品や医
薬の分野では細菌検査の結果が得られるまで製品の出荷
が滞ってしまうという問題を招き、また純水や超純水を
洗浄用水として使用する半導体デバイス等の製造分野で
は、すでに製品の洗浄に使用してしまった純水中等の細
菌数を後から確認することになってしまうという不都合
がある。

【０００８】このように、従来行われている培養法によ
る微生物の混入測定の方法では、少しでも早く検査，測
定結果を判定して製品の流通を円滑に行うことが求めら
れる工業的な規模での管理システムとして不十分である
ため、迅速にかつ正確な方法の開発が強く望まれていた
が、現在までのところこれに代わる適当な方法は提案さ
れていない。

【０００９】また、現在までのところ指摘されていない
が、純水，超純水を洗浄水として用いる代表的には半導
体デバイス等の製造分野の用水では、このような高純度
水が一般細菌の成育に必要な溶存酸素濃度、栄養素濃度
の極めて低い特殊な環境であることに原因した問題にも
本発明者は着目した。すなわち、このような環境下で生
育する細菌の多くは通常の培養条件では成育できないた
め、数日程度の経過観察によるコロニー目視の方法では
確認できないが、このような細菌であっても長期間使用
の結果として製品の致命的な欠陥（例えばコンピュータ
のＣＰＵ欠陥）となる場合もあるから、このような細菌
の存在を無視できないとすれば、従来の培養法による微
生物混入防止の管理システムではこの問題に全く対応で
きないという致命的な問題を含んでいるからである。

【００１０】これらのことから、本発明者は、従来採用
されている培養法では満足できない種々の問題、例えば
迅速かつ正確な微生物の検出、あるいは培養法では本来
検出が困難な種類の微生物の検出ができる微生物等の混
入防止を管理するシステムの提供を目的として本発明者
は鋭意研究を進めた。

【００１１】この過程において、培養法以外に微生物を
検出する方法として従来知られる以下の〜につきま
ず検討した。：特定遺伝子を増幅して検出するＰＣＲ
法（ポリメラーゼ チェーン リアクション）による方
法、：免疫学的な手法による方法、：特殊な蛍光色
素などにより細菌細胞を染色し、顕微鏡等により観察す
る方法、：生物エネルギーであるＡＴＰのレベルを測
定し細菌数を算出する方法、である。

【００１２】しかし、上記のうちのＰＣＲ法は特定の
塩基配列をもったＤＮＡ断片を用いて特定の細菌を検出
する方法であり、の方法は特定の細菌だけに特異的に
反応する抗体を利用して該特定の細菌を検出方法であっ
て、これらはいずれも特定細菌だけを検出する方法であ
るため普遍的に存在している細菌の検出には利用できな
いために本発明の目的を達成する方法として適当でな
い。また上記の方法は、細菌の種を区別しないで計測
できる利点があるものの、共存微粒子と細菌等の区別が
容易でないだけでなく、顕微鏡を用いて観察する必要が
あってその識別のための視野が非常に限られた狭い範囲
となるために、微量に存在するかもしれない微生物等を
検出するためには観察領域をもれなく観察する必要があ
ることに対応できず、結果として正確な測定結果が得ら
れないという問題がある。更に上記の方法は、細菌中
に含まれている生物エネルギーであるＡＴＰは極僅かで
あるために、高感度な光学系を用いたとしても検出する
には細菌細胞１０００個分のＡＴＰが必要と考えられる
ため混入細菌数が水１リットルあたり１個以下という極
めて少ないレベルで細菌数の測定評価を行うことが求め
られる超純水等では全く利用できないし、より致命的な
問題として増殖能を保ちながら殆どＡＴＰを含まない胞
子の場合は大量に存在していても検出は不可能という問
題も指摘される。

【００１３】以上のように、本発明の用途とは異なる他
の微生物検出法ないしこれに類する方法をそのまま応用
することでは、普遍的に存在している細菌細胞１個１個
について種類を区別することなく検出する一方で、共存
する微粒子等と明確に区別して細菌等を特異的に検出で
きる精度と感度を兼ね備えた検出系は確立することがで
きず、本発明の目的とする微生物混入防止の管理システ
ムを確立するという要望を満足することができなかっ
た。

【００１４】本発明は、以上のような従来技術や種々の
関連技術の下で、普遍的に存在する細菌等の微生物を、
その種類を限定することなくしかも細菌が１個であって
も検出可能であり、また共存する微粒子等とは明瞭に区
別して微生物を検出する新規な検出方法を提供するもの
であり、更にまた、顕微鏡観察によるため例えば１５ｍ
ｍのフィルター中から０．１μｍ四方が限界であった従
来の方法では、工業的規模での微生物検出の実際面での
利用ができなかったことに比べて、同程度の大きさのフ
ィルター中の１０％〜１００％という広い視野での計測
を実質的に可能とでき、微生物混入防止の管理システム
の工業的規模での実施に初めて有効な新規な微生物の検
出方法の提供を目的としてなされたものである。

【００１５】以上の観点から、本発明者は、上記新規な
微生物の検出方法の開発にあたって、まず第一に、特定
の種類に限定されることなく普遍的に微生物を認識でき
る探査因子の開発を目指し、このような探査因子とし
て、微生物中に普遍的に含まれているＤＮＡに対する特
異的結合能を有するモノクローナル抗体の利用を考え
た。

【００１６】ここで注目される従来技術として、目的は
異なるが、ＤＮＡに特異的な結合能を有する抗体として
プロジェン（ＰＲＯＧＥＮ）社製のＩｇＭ型ＤＮＡモノ
クローナル抗体が既に市販されており容易に入手可能で
あることが挙げられる。

【００１７】したがって、本発明の目的に沿ってそのＩ
ｇＭ型ＤＮＡ抗体の利用が可能であれば本発明の目的達
成に有利である。

【００１８】しかしながら、このＩｇＭ型ＤＮＡ抗体分
子は、ＩｇＧ抗体分子の５量体様構造をとった巨大分子
であり、測定系の高感度化には適当でないという問題が
あって本発明の目的を達成する抗体としては有効ではな
く、またこれがもつ５量体様構造は抗体の化学修飾を困
難にしており、この市販ＩｇＭ抗体には酵素などの標識
物質を結合させることができないために、本発明の目的
を達成する抗体として該市販ＩｇＭ抗体は応用できなか
った。実際にも、このプロジェン社製のＩｇＭ型ＤＮＡ
抗体は、全身性エリテマトーデスという病気の診断用と
いう限られた用途用として利用されているに過ぎず、標
識されたレパートリーの発売はされていない。

【００１９】本発明者は、以上のことから、特定種類に
限定されることなく普遍的に微生物のＤＮＡに対しての
特異的結合能を有していて、しかも酵素等の適当なマー
カー物質で標識することが可能な抗ＤＮＡ抗体の開発を
目的として、本発明を完成するに至ったものである。

【００２０】すなわち、本発明の目的は、かかる抗ＤＮ
Ａ抗体に適当な標識を結合させた標識抗ＤＮＡ抗体を提
供し、またかかる標識抗ＤＮＡ抗体をマーカーとして用
いて細菌を検出する方法を提供するところにある。

【００２１】また本発明の別の目的は、純水などの利用
水の微生物，ウイルス等による汚染状態を、特定のウイ
ルス等に限定されることなく検出可能とすることを通じ
て、食品製造に用いられる水、清涼飲料等の食品製造
業、電子部品製造業や医薬品製造業などの分野において
利用されている水，純水，超純水等の高純度水中に含ま
れることがある微生物，ウイルス等を、迅速かつ高感度
に検出できる方法を提供し、更に、上記の水，純水，超
純水等の高純度水中に含まれることがある微生物，ウイ
ルス等を迅速かつ高感度に検出可能ととして、飲料水、
清涼飲料、酒類、水道水、電子部品や医薬品などの製品
に対する信頼性を向上させ、あるいは製品歩留りを向上
させるところにある。

【００２２】

【課題を解決するための手段及び作用】ＤＮＡはすべて
の生物に共通して存在する物質であって、一般的には抗
原性がなく、通常の動物に注射しても免疫系を刺激する
ことがないため抗ＤＮＡ抗体を作製することができない
ことが一般に知られている。

【００２３】そこで、本発明においては、自己免疫疾患
動物の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の病態モデル
マウスであるＭＲＬマウスの抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞
と、同系統のマウス由来の骨髄種細胞株ＰＡＩ（財団法
人がん研究進行財団国立衛生試験所細胞バンク：細胞番
号ＪＣＲＢ０１１３）との細胞融合によって、ＩｇＧ型
の抗ＤＮＡ抗体を恒常的に産生する新規なハイブリドー
マを取得したものであり、これを「ＭＮ−１」と命名
し、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（寄
託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９１）。

【００２４】本発明の特徴の一つは，この新規ハイブリ
ドーマ（以下「ＭＮ−１」と略称する場合がある）を提
供するところにある。

【００２５】また本発明の他の特徴の一つは、この新規
ハイブリドーマ「ＭＮ−１」が産生するＩｇＧ型抗ＤＮ
Ａ抗体を提供するところにある。この新規ハイブリドー
マが産生する抗ＤＮＡ抗体はＩｇＧ型であって、上述し
たプロジェン社製のＩｇＭ型抗ＤＮＡ抗体に比べ、標識
の結合が可能でありまた検出感度も優れているため、被
検液中の微生物，ウイルスなどを検出する以下の検出方
法に好ましく使用できる。

【００２６】ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体は、公知の酵素，
放射性物質，蛍光物質，発光物質，金属コロイド等を標
識物質として結合した標識抗ＤＮＡ抗体として用いるこ
とができ、微生物，ウイルス等の破砕処理をした液にこ
の標識抗ＤＮＡ抗体を添加し、該標識物質をマーカーと
して該液中の微生物，ウイルスを、免疫反応を利用して
測定することができる。すなわち標識抗ＤＮＡ抗体を用
いることによって、微生物，ウイルス等の破砕処理を施
した溶液を上記請求項４〜６の手法で処理することによ
り含有微生物，ウイルス等の検出，測定を行うことがで
き、また上記請求項７の手法で処理することにより同様
にフィルター上に捕捉した微生物，ウイルス等の検出，
測定を行うことができる。このような微生物，ウイルス
等の検出方法は本発明の他の特徴の一つである。

【００２７】また、上記抗ＤＮＡ抗体は、一般的な標識
抗抗体抗体、具体的には一般に入手可能なマウス由来の
抗体と免疫反応する他動物由来の標識マウス抗抗体抗
体、とよく免疫反応するものであるから、被検液中のＤ
ＮＡと免疫反応した抗ＤＮＡ抗体とこの標識抗抗体抗体
を免疫反応させる上記請求項４〜７の手法を用いて該被
検液中のＤＮＡを検出することができる。かかる検出方
法も本発明の特徴の一つである。

【００２８】本発明において、微生物，ウイルス等と
は、細菌、黴、胞子、原生動物、動物ウイルス、バクテ
リオファージ等を含み、生物活性を有する細胞、ウイル
ス等、生物活性を失った細胞、ウイルス等も含む他、さ
らにその断片等であってもＤＮＡを含むものであれば検
出対象として上記した微生物，ウイルス等の概念に含む
ものとする。

【００２９】上記請求項４〜７でいう微生物、ウイルス
等の破砕処理とは、例えばタンパク質変性剤等の薬品に
よる処理、超音波による処理、高熱による処理、凍結融
解による処理、加圧減圧による処理、ガラス，アルミナ
等の微粒子の衝突による処理、等々の方法を特に限定さ
れることなく用いることができる。

【００３０】上記ＭＮ−１の産生する抗ＤＮＡ抗体を用
いて請求項４〜７の検出方法を実施することができる。

【００３１】請求項４の方法は、例えば、微生物，ウイ
ルス等に対してＤＮＡを露出させる破砕処理を行った被
検液と、ＤＮＡと免疫反応するＭＮ−１産生抗ＤＮＡ抗
体の希薄濃度液と、この抗ＤＮＡ抗体と免疫反応する抗
抗体抗体であって酵素，放射性物質，蛍光物質，発光物
質、金属コロイド（以下「酵素等」という）のいずれか
が標識として結合された標識抗抗体抗体の希薄濃度液と
を混合させて免疫反応を行わせることで実施される。こ
の操作により、溶液中に希薄に存在する抗ＤＮＡ抗体−
標識抗抗体抗体の複合体は微生物，ウイルス等のＤＮＡ
分子上に集中してＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体−標識抗抗体抗
体の複合体からなる標識物質の塊を形成し、これは、周
辺に希薄に存在する標識物質とは明らかに区別できる標
識物質の塊として、例えばフローセルのような微細な環
境を測定し得る測定容器中での微量発光検出、蛍光検
出、視差屈折率検出、放射性同位元素検出、等により塊
としてあるいはその塊の数として検出することができ
る。この検出方法は、被検液が連続的に流れる系におい
て微生物，ウイルス等を連続的に検出することが求めら
れる用途において特に有効である。

【００３２】またこの請求項４の方法は、ＭＮ−１産生
抗ＤＮＡ抗体をそのまま用いることに代えて、この抗Ｄ
ＮＡ抗体に上記した酵素等を標識した標識抗ＤＮＡ抗体
として用い、被検液中のＤＮＡとこの標識抗ＤＮＡ抗体
とを免疫反応させることにより、ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ
抗体の複合体を生成させることによっても実施すること
ができる。

【００３３】請求項５〜７の方法は、被検液中のＤＮＡ
と標識を含む複合体を固相化して検出，測定を行うこと
を特徴とするものである。これらにおいて用いる固相と
しては、反応室を形成するウエルの底面、壁面、粒状体
の表面の他、シートの表面等を用いることもできる。固
相にＤＮＡあるいは抗ＤＮＡ抗体を結合させる方法とし
ては、適当濃度で該物質を含有する液体を例えば固相で
あるウエルに添加するか、あるいは固相である粒状体，
シート等を該物質を含む液体中に浸漬して３０分から３
日間静置した後、これらの固相と該物質を含む溶液を分
離洗浄する方法などを挙げることができる。

【００３４】請求項６の方法において、固相化したＭＮ
−１産生抗ＤＮＡ抗体にＤＮＡを結合させて複合体を形
成させる方法は、例えば固相が抗ＤＮＡ抗体を固相化し
たウエルである場合には該ウエルにＤＮＡを含む被検液
を添加し、あるいは固相が抗ＤＮＡ抗体を固相化した粒
状体，シート等である場合には被検液中に該粒状体，シ
ート等を浸漬し、免疫反応が十分平衡に達するのに十分
な時間静置した後、固液分離し、洗浄することで実施で
きる。

【００３５】また請求項５〜７の固相表面に直接結合し
たＤＮＡ、あるいは上記固相化抗ＤＮＡ抗体を介して結
合されたＤＮＡに対して、抗ＤＮＡ抗体と標識抗抗体抗
体、あるいは標識抗ＤＮＡ抗体を結合させて複合体を形
成させる方法としては、例えば、固相化されたＤＮＡに
対してこれに結合する抗ＤＮＡ抗体及び標識抗抗体抗体
を過剰に含む溶液を免疫反応が平衡に達するまで（例え
ば３０分〜３日間）接触させ、あるいは固相化されたＤ
ＮＡに対しこれに結合する標識抗ＤＮＡ抗体を過剰に含
む溶液を同様に免疫反応が平衡に達するまで接触させ、
これらの後、免疫反応しなかった遊離の物質を固液分離
して洗浄することで実施できる。

【００３６】以上の操作における固液分離、洗浄は、固
相がウエルのような容器の形状をとる場合には、（固相
に結合されていない）遊離の物質（抗ＤＮＡ抗体，標識
抗抗体抗体、あるいは標識抗ＤＮＡ抗体等）を含む溶液
を除去し、必要に応じて分離除去を確実にするために一
又は複数回の洗浄を行った後、これらを含まない別の溶
液に置き換える操作をいう。固相が粒状体，シート等で
ある場合は、これを充填した容器中で上記と同じ固液分
離，洗浄の操作を行うことができる他、粒状体，シート
等を別の溶液が添加されている容器に移し替える操作に
より行うこともできる。

【００３７】請求項７の方法において、フィルター（一
般的にはマイクロフィルター）上に捕捉された微生物，
ウイルス等を破砕処理して露出させたＤＮＡを該マイク
ロフィルター上に結合させる方法としては、このフィル
ターがナイロン，ポリフッ化ビニリデン等のＤＮＡを強
く吸着する性質を示す素材で構成されている場合には、
破砕処理法に限定されることなく、特に結合のための処
理を行うことなく破砕の終了と同時にＤＮＡはフィルタ
ー上に結合される。またフィルターがニトロセルロー
ス，酢酸セルロース等のセルロース系の素材で構成され
ている場合には、破砕処理法に特に限定されるものでは
ないが、好ましくは、破砕と同時にＤＮＡを２本鎖から
１本鎖に変性させる薬品を用いた破砕処理を行うことが
好ましい。これにより変性した１本鎖ＤＮＡは上記素材
に対する吸着性が大きいので、フィルターに対する結合
が確実に得られる。このような薬品を用いずに破砕処理
を行う場合には、破砕処理後に該フィルターを真空条件
下で４０〜１００℃に加熱することがよく、これにより
セルロース系素材のフィルターにＤＮＡが良好に結合さ
れる。またマイクロフィルターにはポリカーボネートの
素材のものを用いることもできるが、この素材はそのま
まではＤＮＡに対する吸着性を示さないので、上記した
真空条件下での加熱処理が行なわれる。

【００３８】以上のように説明される本発明の検出方法
の具体的一例を代表的に述べれば、内壁に抗ＤＮＡ抗体
を結合（固相化，不動化）したウエル室内に、破砕処理
を行って露出させたＤＮＡを含む被検液を添加して固相
化抗ＤＮＡ抗体−ＤＮＡの免疫反応をさせ、次いで被検
液を固液分離・洗浄した後、上記固相化抗ＤＮＡ抗体−
ＤＮＡに、例えば標識物質として酵素を標識した標識抗
ＤＮＡ抗体を免疫反応させて固相化抗ＤＮＡ抗体−ＤＮ
Ａ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成させ、遊離の標識
抗ＤＮＡ抗体を固液分離・洗浄除去した後、基質溶液を
加え、この複合体に含まれる酵素の活性により基質溶液
に現れる例えば蛍光強度の変化によりＤＮＡの存在を検
出し、あるいはＤＮＡ量を測定するＥＬＩＳＡ法を挙げ
ることができる。

【００３９】本発明の新規ハイブリドーマＭＮ−１が産
生するＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体、これを酵素等で標識した
標識抗ＤＮＡ抗体は、上述したように特定の微生物，ウ
イルス等に制約されることなく、培養細胞の生菌数を迅
速に検出、測定することができ、細胞培養操作の適正
化、必要生菌数確保に要する培養時間の予測などを速や
かに行なうことができる。

【００４０】また、本発明の検出方法によれば、水、純
水や超純水等の高純度水中における微生物，ウイルス等
の存在を感度よく検出することができる。

【００４１】

【実施例】以下本発明を更に詳細に説明する。

【００４２】実施例１ （ＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体産生ハイブリドーマ「ＭＮ−
１」の作製）本発明においては、ケラーとミルスタイン
（KohlerとMilstein）らの方法（Nature,256,495,1975
）に従ってＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体を産生するハイブリ
ドーマ株「ＭＮ−１」を以下のようにして樹立した。

【００４３】すなわち、動物として、通常では発現され
ないＤＮＡに対する抗体を成長に従って発現する全身性
エリテマトーデス（ＳＬＥ）の病態モデル、ＭＲＬマウ
ス（ＭＲＬ／l-MpjUmmCrj-lpr/lpr ）の１０週齢のもの
を入手した。入手時には病変は認められなかったが、飼
育観察を続けるうち、紅斑、脱毛、結節の腫張などＳＬ
Ｅに特異の症状を呈するようになった。２０週齢時には
症状は特に顕著となり、抗ＤＮＡ抗体産生Ｂ細胞の数が
充分に増加したと考えられたのでこの時点で脾臓を摘出
し、摘出後、脾臓をハサミで裁断し、ＲＰＭ１１６４０
培地中ピンセットで押し潰して細胞を抽出した。次いで
大きな断片を除去し、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心に
より細胞を集めた。細胞数は約２×１０⁸ であった。

【００４４】別にマウス由来の骨髄腫細胞株ＰＡＩ（Ｊ
ＣＲＢ０１１３）を、１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地で培養しておき、５×１０⁷ の細胞を集
め、ＲＰＭ１１６４０培地で１回洗浄した後、脾臓細胞
と混合した。

【００４５】混合した細胞を１５００ｒｐｍの遠心を行
って回収し、再度ＲＰＭ１１６４０培地によって洗浄
し、さらに０．３Ｍ蔗糖で洗浄した。最終的に４ｍｌの
０．３Ｍ蔗糖に懸濁し、細胞融合装置の電極チャンバー
内に移し、直流電圧７００Ｖ、３０μｓｅｃ、ｌ回のパ
ルスで電気的に細胞を融合した。細胞を２０％の仔牛胎
児血清を含むＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン−
０．４μＭアミノプテリン−１６μＭチミジン添加ＲＰ
Ｍ１１６４０）に懸濁して２００ｍｌとし、室温で１時
間静置した。次に、健常マウス２匹分の脾臓細胞をフィ
ーダー細胞として加え、穏やかに撹拌、均一にしてから
９６穴のマイクロプレートの各穴に２００μｌずつ撒き
込んだ。

【００４６】撒き込み後、５日目にはほとんど全ての穴
に１個以上のハイブリドーマのコロニーが認められた。
コロニーが充分成育し、しかも同一の穴に共存している
他のコロニーと重ならないうちに、第ｌ回目のスクリー
ニングを行った。

【００４７】スクリーニングはＥＬＩＳＡ法によった。
すなわち超音波破砕により断片化した２重鎖ＤＮＡ（仔
牛胸腺由来）、およびこれを熱変性して得た単鎖ＤＮＡ
をそれぞれ２０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（リン酸緩衝
化生理食塩水）に混合した。これを９６穴ＥＬＩＳＡプ
レートの各穴に５０μｌずつ添加して穴底にＤＮＡを吸
着させた。１０％仔牛胎児血清によりブロッキング処理
を施したのちスクリーニングに供した。

【００４８】上記のように調製したＥＬＩＳＡプレート
にハイブリドーマの培養プレートの各穴より５０μｌず
つ培養上清を添加した。３７℃で１時間静置した後、各
穴を１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。１０％仔牛胎
児血清を含むＰＢＳ中に３０００〜５０００倍希釈した
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ
＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ抗体溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を
２次抗体として５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間静
置した後、ＰＢＳで４回洗浄した。最後に西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの発色試薬（０．４ｍｇ／ｍｌのｏ−フ
ェニレンジアミンおよび０．０ｌ％の過酸化水素を含む
０．ｌＭリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ４．８）１００μｌ
を各穴に添加して発色反応を行わせ、発色を得た培養穴
を抗ＤＮＡ抗体産生細胞陽性と判定した。

【００４９】次に、陽性と判定したうちから発色の強い
もの４８個を選び出し、培養を継続して２回目のスクリ
ーニングを同様の方法で行った。２回目のスクリーニン
グでも再度陽性を示した細胞集団については順次クロー
ニング、スクリーニングを繰り返し行った。３回目のク
ローニングの後、１個の細胞から増殖したのが確実であ
り、抗ＤＮＡ抗体を効率よく生産しているものを細胞株
として樹立した。最終的に得られた株は３種であった。
得られた３種について、その生産している抗体のクラス
を、ウサギの（抗マウスＩｇＧ，抗マウスＩｇＭ，抗マ
ウスＩｇＡ）抗体を用いた市販サブクラス決定用キット
を用いて決定した。その結果、２種はＩｇＭ型であり、
１種はＩｇＧ型であった。ＩｇＭ型抗体は上述の如く操
作性が悪いなどの理由で本発明の目的には適用できない
ので、ＩｇＧ型の抗体を生産しているハイブリドーマ細
胞を採って、このＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体産生ハイブリド
ーマを「ＭＮ−１」と命名し、上述の通り工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１４６９１）。

【００５０】実施例２ （抗体の取得）上記ハイブリドーマ「ＭＮ−１」は、産
生するＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体（以下「ＭＮ−１抗体」と
略記する）を細胞外に分泌するので、この細胞培養液を
ＭＮ−１抗体を含む溶液としてそのまま利用することも
できる。しかし培養液中の抗体濃度は希薄であり、また
培養液中に共存している血清成分から抗体を分離精製す
ることが困難であるため大量調製には不向きである。

【００５１】そこで、以下のようにしてハイブリドーマ
を同系統のマウス腹腔に移植し、大量のＭＮ−１抗体を
マウス腹水より得た。

【００５２】すなわち、ＭＮ−１細胞をＨＴ培地（１０
０μＭヒポキサンチン−１６μＭチミジン、１０％仔牛
胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０）で培養増殖し、Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスｌ頭あたり１０⁷ の細胞を腹腔に移植し
た。結果として、マウスｌ頭あたり、約４ｍｌの腹水が
採取できた。

【００５３】得られた腹水４５ｍｌを２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液ｐＨ７．５に透析した後、同じ緩衝液で容量を
１５０ｍｌとした。同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−
セファセル（ファルマシア社製）のカラムに通じ、非吸
着成分を除去した後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの
濃度勾配により、吸着成分を溶出した。溶出してきた画
分についてＥＬＩＳＡ法によりＤＮＡ結合抗体の有無を
調べ、抗体量の多い画分を集めて濃縮し、透析によって
塩化ナトリウムを除去した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４
（ＩＢＦ）による分子ふるいクロマトグラフィーに供し
た。ＤＮＡ結合抗体を含む画分を回収し、これを精製標
品とした。最終的にタンパク質量として７８．５ｍｇの
ＭＮ−ｌ抗体（ＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体）を回収した。

【００５４】実施例３ （標識ＭＮ−１抗体の調製）上記により精製したＭＮ−
１抗体を用いて、過ヨウ素酸酸化法およびマレイミドヒ
ンジ法の２通りの方法で、標識酵素の西洋ワサビペルオ
キシダーゼを結合させた標識ＭＮ−１抗体（標識抗ＤＮ
Ａ抗体）を調製した。

【００５５】過ヨウ素酸酸化法による酵素標識 １４ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
３．５ｍｌの水に溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウ
ム０．７ｍｌを加えた。室温で２０分間撹伴した後、ｌ
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．４に対し４℃で一晩
透析した。０．ｌＭ炭酸ナトリウムを加えてｐＨ９．０
に調整し、濃縮して容量を３．５ｍｌとした。

【００５６】別に、上記ＭＮ−１抗体の精製標品３０ｍ
ｇを、０．０ｌＭの炭酸重炭酸ナトリウム緩衝液３．５
ｍｌに溶解し、先に調整したＨＲＰ溶液と混合した。室
温で２時間撹拌した後、４℃に冷却し、４ｍｇ／ｍｌの
水素化ホウ素ナトリウム０．４ｍｌを加えた。ＰＢＳに
対して透析した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４による分子
ふるいクロマトグラフィーを行って、酵素標識されたＭ
Ｎ−１抗体画分を回収した。ＥＬＩＳＡによるＤＮＡ結
合活性と標識ＨＲＰの酵素活性の両者を併せもつ画分
を、ＨＲＰ標識ＭＮ−１の指標として回収した。得られ
たＨＲＰ標識ＭＮ−１抗体はタンパク質量として１６ｍ
ｇであった。

【００５７】マレイミドヒンジ法による酵素標識 上記ＭＮ−１抗体の精製標品５０ｍｇを０．ｌＭクエン
酸緩衝液２５ｍｌに溶解し、６ｍｇのペプシンを加え
た。３７℃で２．５時間消化した後、８ｍｌのトリス塩
酸緩衝液ｐＨ８．０を加え、容量１０ｍｌまで濃縮し
た。０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡
化したウルトロゲルＡｃＡ４４で分子ふるいクロマトグ
ラフィーを行って、ペプシン消化後残ったＭＮ−ｌの抗
原結合断片の２量体（Ｆａｂ’）₂ を回収した。回収し
た画分を０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に
透析した後、０．９ｍｌまで濃縮した。タンパク質濃度
は１０ｍｇ／ｍｌであった。５ｍＭＥＤＴＡを含む０．
ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に溶解した０．
ｌＭ２−メルカプトエチルアミン１０μｌを添加して、
３７℃で９０分間静置した。この処理により２量体は還
元されて単量体Ｆａｂ’に変換し、末端にチオール基が
露出する。還元処理後、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．ｌＭ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したセファ
デックスＧ−２５（ファルマシア社製）のカラムに通
じ、単量体となったＦａｂ’を回収した。濃縮してタン
パク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｌの溶液とした。

【００５８】別に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）８ｍｇを１．２ｍｌの０．ｌＭリン酸ナトリウム緩
衝液に溶解し、８０μｌのジメチルホルムアミドに溶解
したＮ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレートを加え、３
７℃で２時間静置し、ＨＲＰへのマレイミド基導入反応
を行った。反応中生じた凝集体を遠心によって除去した
後、０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡
化したセファデックス−Ｇ２５カラムに通じてＨＲＰを
回収し、濃縮してＨＲＰ濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。

【００５９】ついで上記Ｆａｂ’溶液０．６ｍｌとマレ
イミド基導入ＨＲＰ溶液０．６ｍｌを混合し、３０℃で
１時間Ｆａｂ’とＨＲＰの結合反応を行った。反応後
０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４カラムにより分子ふるいクロ
マトグラフィーを行って、Ｆａｂ’−ＨＲＰ結合体を回
収した。ＤＮＡ結合活性とＨＲＰ活性の両者を該結合体
の指標とした。得られた結合体はタンパク質量として１
２ｍｇであった。

【００６０】以上の過ヨウ素酸酸化法、マレイミドヒン
ジ法のいずれの方法で酵素標識してもＭＮ−１抗体のＤ
ＮＡ結合活性が阻害されることはなかった。

【００６１】実施例４ （標識ＭＮ−１抗体を用いたＤＮＡの検出）実施例２で
得たＭＮ−１抗体、及び実施例３で得た酵素標識した標
識ＭＮ−１抗体を用い、ＥＬＩＳＡ法により被検液中の
ＤＮＡの検出を行なった。

【００６２】被検液は、サケ精巣のＤＮＡを０、１、
５、１０、５０、１００、５００、１０００μｇ／ｍｌ
の各濃度でＰＢＳに溶解した８種を調製した。

【００６３】それぞれの溶液５０μｌをＥＬＩＳＡプレ
ートの穴に添加し、３７℃でｌ時間静置して穴底にＤＮ
Ａを吸着させた後、１０％仔牛胎児血清を含むＰＢＳで
ブロッキング処理を施した。

【００６４】このプレートに、上記ＭＮ−１抗体を１０
％仔牛胎児血清を含むＰＢＳ中にそれぞれｌ、５、１
０、５０、１００μｇ／ｍｌになるように調製したもの
をそれぞれ加え、３７℃で１時間置いた後、ＰＢＳで３
回洗浄して過剰のＭＮ−１抗体を除去した。次いで西洋
ワサビペルオキシダーゼ標識した標識ＭＮ−１抗体を反
応させて標識を含む複合体を生成させ、ＰＢＳにより余
剰の標識ＭＮ−１抗体を除去した後、基質として０．４
ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミンおよび０．１％の
過酸化水素を含む０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ
４．８）１００μｌを添加して発色の程度を４９０ｎｍ
の吸収により測定した。

【００６５】各ＤＮＡ濃度、各抗体濃度における酵素に
よる発色の程度を測定した結果として得られた検量線を
図１に示す（抗体量ｌμｇ／ｍｌでは検量線が作製でき
なかった）。

【００６６】比較例１ 上記ＭＮ−１抗体に代えてＰＲ０ＧＥＮ社製のＩｇＭ型
マウスモノクローナル抗体を用いた他は実施例４と同様
にしてＤＮＡの検出を行なった。なおＩｇＭ型マウスモ
ノクローナル抗体には酵素標識ができないので西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識した２次抗体を反応させてＥＬ
ＩＳＡを行った。結果として得られた検量線を図１に示
した。

【００６７】これらの実施例４及び比較例１の結果から
分かるように、各抗体濃度において、ＩｇＭ型抗ＤＮＡ
抗体、ＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体（ＭＮ−ｌ抗体）ともに優
れた定量性を示したが、ＭＮ−ｌ抗体の与える吸収は常
にＩｇＭよりも高く、また定量性に優れていることが明
らかであった。

【００６８】実施例５ （ＨＲＰ標識ＭＮ−１を用いた大腸菌マイクロコロニー
の検出）大腸菌Ｂ株をニュートリエントブロス（Ｄｉｆ
ｃｏ）培地中、３７℃で好気的に培養した。対数増殖期
の菌体を１００個または４００個相当、０．４５μｍフ
ィルターの表面上に捕集した。フィルターの裏面より培
地を接触させ、３７℃で培養し、一定時間ごとにフィル
ターを取り出して純水で洗浄した後、ＭＮ−１抗体によ
る検出試験に供した。

【００６９】すなわち、溶菌液（１％ラウリル硫酸ナト
リウム−０．２Ｎ水酸化ナトリウム）を含ませたろ紙パ
ッド上に、菌体の捕集面を上にしてフィルターを接触さ
せ、室温で２０分間放置して菌体内のＤＮＡフィルター
面に露出させた。５ｍｌのＰＢＳに浸け込んでゆっくり
振盪して２回洗浄した後、３％Ｔｗｅｅｎ２０、１０％
仔牛胎児血清を含むＰＢＳ中でフィルターにブロッキン
グ処理を施した。１０％仔牛胎児血清を含むＰＢＳにＭ
Ｎ−１抗体をｌμｇ／ｍｌになるように調製し、フィル
ター１枚につき５ｍｌを添加した。室温で３０分間振盪
してＤＮＡとＭＮ−１抗体を充分に反応させた後、過剰
のＭＮ−１抗体をＰＢＳによる洗浄で除去した。標識Ｍ
Ｎ−１抗体として、アルカリホスファターゼ標識ウサギ
抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
溶液を、１０％仔牛胎児血清を含むＰＢＳ中に３０００
倍希釈して、フィルターｌ枚あたり５ｍｌ加えた。室温
で３０分間振盪し、過剰の２次抗体をＰＢＳによる洗浄
によって除去した。

【００７０】最後にアルカリホスファターゼの発色試薬
（ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸：ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を添
加して染め出されるスポットの有無を調べた。

【００７１】培養後、０、２、４時間までのフィルター
ではスポットは検出されなかったが、培養後６時間のフ
ィルターでは、菌数１００のサンプルでは８３、７０、
菌数４００のサンプルでは３５０、３８０のスポット、
培養後８時間のフィルターでは菌数１００のサンプルで
は９２、１１０、菌数４００のサンプルでは３００、３
８０のスポットがそれぞれ確認できた。

【００７２】比較例２ 実施例５と同様に、大腸菌Ｂ株をニュートリエントブロ
ス（Ｄｉｆｃｏ）培地中、３７℃で好気的に培養した。
対数増殖期の菌体を１００個または４００個相当、０．
４５μｍフィルターの表面上に捕集した。フィルターの
裏面より培地を接触させ、３７℃で培養し、一定時間ご
とにフィルターを取り出し、目視でコロニーの有無を観
察した。

【００７３】その結果培養後８時間でも目視ではコロニ
ーは観察されず、１４時間以降にようやく観察できた。

【００７４】培養後１４時間の目視によるコロニー数
は、菌数１００のサンプルでは９５、１０２、菌数４０
０のサンプルでは４０２、４１０であり、上記実施例５
の同時間における検出結果とよく一致した。

【００７５】以上の実施例５及び比較例２の結果から、
ＭＮ−１抗体を用いた検出法では、目視で観察できなか
った培養初期の段階でもコロニーの検出が可能であり、
生菌数の検出において従来法よりも優位であることが実
証された。

【００７６】

【発明の効果】本発明によれば、ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗
体及びこれを産生する新規ハイブリドーマを提供するこ
とができ、更にこの抗ＤＮＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法
の実施に有効な酵素で標識した標識抗ＤＮＡ抗体を提供
できるという効果がある。

【００７７】また、かかる抗ＤＮＡ抗体を用いること
で、特定の微生物，ウイルス等に制約されることなく、
培養細胞の生菌数を迅速に測定することができ、培養操
作の適正化や、必要な培養量の確保に要する培養時間の
予測などを通じて、試験や実験などの計画立案、作業の
能率化を効果的に図ることができるという効果が得られ
る。

【００７８】また、純水などの高純度水が微生物，ウイ
ルス等により汚染されていることの有無を容易かつ迅速
に検出できるという効果がえられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４、及び比較例１のＥＬＩＳＡ法により
生成した免疫反応複合体に含まれる酵素による基質発色
程度を測定して得た検量線を示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/04 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 1/68 9453−4Ｂ 1/70 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/564 Ｚ 33/564 33/569 Ｂ 33/569 Ｇ 33/577 Ｂ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 自己免疫疾患動物の全身性エリテマトー
   デス（ＳＬＥ）の病態モデルＭＲＬマウスの抗ＤＮＡ抗
   体産生Ｂ細胞と、同系統のマウス由来の骨髄種細胞株Ｐ
   ＡＩの細胞との融合細胞であって、ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ
   抗体を産生することを特徴とする工業技術院生命工学工
   業技術研究所寄託ＦＥＲＭ Ｐ１４６９１の新規ハイブ
   リドーマ。
2. 【請求項２】 請求項１のハイブリドーマが産生するＩ
   ｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体。
3. 【請求項３】 請求項２の抗ＤＮＡ抗体に酵素，放射性
   物質，蛍光物質，発光物質、金属コロイドのいずれかを
   標識物質として結合したことを特徴とする標識抗ＤＮＡ
   抗体。
4. 【請求項４】 微生物，ウイルス又はこれらのＤＮＡ断
   片を含む被検液に対しＤＮＡを露出させる破砕処理を行
   った後、下記ａ，ｂのいずれかの免疫反応により生成し
   た複合体に含まれる標識物質をマーカーとして被検液中
   のＤＮＡを検出することを特徴とする微生物等の検出方
   法 ａ：前記被検液中に含まれるＤＮＡと、このＤＮＡと免
   疫反応するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体と、この抗ＤＮＡ抗
   体と特異的に免疫反応しかつ酵素，放射性物質，蛍光物
   質，発光物質、金属コロイドのいずれかが標識として結
   合された標識抗抗体抗体とにより、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗
   体−標識抗抗体抗体の複合体を生成する免疫反応 ｂ：前記被検液中に含まれるＤＮＡと、このＤＮＡと免
   疫反応するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体であって酵素，放射
   性物質，蛍光物質，発光物質、金属コロイドのいずれか
   を標識物質として結合した標識抗ＤＮＡ抗体とにより、
   ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成する免疫反
   応。
5. 【請求項５】 微生物，ウイルス又はこれらのＤＮＡ断
   片を含む被検液に対しＤＮＡを露出させる破砕処理を行
   い、露出したＤＮＡを固相表面に結合させる固相化処理
   を行った後、下記ｃ，ｄのいずれかの免疫反応により生
   成した複合体に含まれる標識物質をマーカーとして被検
   液中のＤＮＡを検出することを特徴とする微生物等の検
   出方法 ｃ：固相化された上記ＤＮＡと、この固相化ＤＮＡと免
   疫反応するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体と、この抗ＤＮＡ抗
   体と特異的に免疫反応しかつ酵素，放射性物質，蛍光物
   質，発光物質、金属コロイドのいずれかが標識として結
   合された標識抗抗体抗体とにより、固相化ＤＮＡ−抗Ｄ
   ＮＡ抗体−標識抗抗体抗体の複合体を生成する免疫反応 ｄ：固相化された上記ＤＮＡと、このＤＮＡと免疫反応
   するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体であって酵素，放射性物
   質，蛍光物質，発光物質、金属コロイドのいずれかを標
   識物質として結合した標識抗ＤＮＡ抗体とにより、固相
   化ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成する免疫反
   応。
6. 【請求項６】 微生物，ウイルス又はこれらのＤＮＡ断
   片を含む被検液に対しＤＮＡを露出させる破砕処理を行
   い、ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体を表面に結合した固相の表
   面でこの固相化した抗ＤＮＡ抗体と上記露出したＤＮＡ
   を免疫反応により結合させた後、下記ｅ，ｆのいずれか
   の免疫反応により生成した複合体に含まれる標識物質を
   マーカーとして被検液中のＤＮＡを検出することを特徴
   とする微生物等の検出方法 ｅ：固相化された上記抗ＤＮＡ抗体を介して固相表面に
   結合されたＤＮＡと、このＤＮＡと免疫反応するＩｇＧ
   型の抗ＤＮＡ抗体と、この抗ＤＮＡ抗体と特異的に免疫
   反応しかつ酵素，放射性物質，蛍光物質，発光物質、金
   属コロイドのいずれかが標識として結合された標識抗抗
   体抗体とにより、固相化抗ＤＮＡ抗体−ＤＮＡ−抗ＤＮ
   Ａ抗体−標識抗抗体抗体の複合体を生成する免疫反応 ｆ：固相化された上記抗ＤＮＡ抗体を介して固相表面に
   結合されたＤＮＡと、このＤＮＡと免疫反応するＩｇＧ
   型の抗ＤＮＡ抗体であって酵素，放射性物質，蛍光物
   質，発光物質、金属コロイドのいずれかを標識物質とし
   て結合した標識抗ＤＮＡ抗体とにより、固相化抗ＤＮＡ
   抗体−ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成する免
   疫反応。
7. 【請求項７】 フィルターに捕捉した被検液中の微生
   物，ウイルス又はこれらのＤＮＡ断片の破砕処理を行っ
   て露出させたＤＮＡを該フィルターに結合させた後、下
   記ｇ，ｈのいずれかの免疫反応により生成した複合体に
   含まれる標識物質をマーカーとして被検液中のＤＮＡを
   検出することを特徴とする微生物等の検出方法 ｇ：フィルターに結合された上記ＤＮＡと、このＤＮＡ
   と免疫反応するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体と、この抗ＤＮ
   Ａ抗体と特異的に免疫反応しかつ酵素，放射性物質，蛍
   光物質，発光物質、金属コロイドのいずれかが標識とし
   て結合された標識抗抗体抗体とにより、ＤＮＡ−抗ＤＮ
   Ａ抗体−標識抗抗体抗体の複合体を生成する免疫反応 ｈ：フィルターに結合されたＤＮＡと、このＤＮＡと免
   疫反応するＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体であって酵素，放射
   性物質，蛍光物質，発光物質、金属コロイドのいずれか
   を標識物質として結合した標識抗ＤＮＡ抗体とにより、
   ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成する免疫反
   応。
8. 【請求項８】 請求項４ないし７のいずれかにおいて、
   ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体が請求項２の抗ＤＮＡ抗体であ
   り、かつ標識抗ＤＮＡ抗体が請求項３の標識抗ＤＮＡ抗
   体であることを特徴とする微生物等の検出方法。