JPH09127117A - 胞子の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被検液中の胞子を迅速かつ高感度に検出する
方法を提供する。 【構成】 細胞構造が強固な胞子を、栄養細胞または菌
糸に変換する処理を行った後、ＤＮＡを露出させ、次い
でＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体、及び酵素等で標識されかつ
該抗ＤＮＡ抗体に対する抗体と免疫反応させて、この標
識をマーカーとして被検液中の胞子を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、水、純水、超純
水，空気等のサンプル中に存在する胞子を検出する方法
に関する。

【０００２】

【従来技術】微生物，細菌，カビ、あるいは細菌，カビ
より生ずる胞子は、あらゆる領域に普遍的に存在する物
質であるため、種々の製造業の分野において製品中への
これらの混入防止対策、管理が課題となる。例えば電子
部品等の製造業においては、半導体デバイス等の電子部
品の洗浄に使用される純水，超純水に細菌粒子等が混入
していると、微小な配線に短絡等の欠陥を招いて製品歩
留を低下させる原因となる。また食品製造、医薬品製造
の分野では製品の安全性の確保の面から厳重な管理が求
められる。クリーンルームなどでは空気中の浮遊胞子等
の測定が必要とされる場合がある。

【０００３】このような微生物等の混入を防止するため
に、上記用水（純水，超純水等）を用いる製造業ではそ
の用水製造工程に除菌、殺菌の工程を設けるのが普通で
あり、また同時に、除菌や殺菌が確実に行われているか
否かを検出，評価して、用水製造工程にフィードバック
する管理も必要とされ、従来一般的には培養法による微
生物混入の検出，測定が行なわれている。

【０００４】この培養による微生物混入検出法は、被検
液を寒天培地に塗沫するか、マイクロフィルター等でろ
過し捕捉した微生物をフィルターごと培地上に移して２
日から５日間培養し、しかる後、培地あるいはフィルタ
ー上に形成されたコロニーを目視で数えて被検液中の細
菌数を算出する方法である。しかしこの培養法では、細
菌がコロニーを形成して目視で確認できる大きさになる
までに一般的な細菌であっても２日〜５日間の日数を要
し、増殖の遅い微生物ではより長い培養時間を必要とす
るので、これに代わる迅速な微生物混入検出法として、
例えばＡＴＰを利用した化学発光法（以下「ＡＴＰ法」
という）や抗ＤＮＡ抗体を利用した化学発光法（以下
「抗ＤＮＡ抗体法」という）も考えられている。

【０００５】前者のＡＴＰ法は、生菌中に含まれている
生物エネルギーであるＡＴＰを抽出し光に変換して微生
物を検出，算出する方法であり、また後者の抗ＤＮＡ抗
体法は、微生物細胞に普遍的に含まれるＤＮＡに標識抗
体で印付けをした上で、例えば標識である酵素に対する
特異的な発光基質を添加して微生物細胞を発光輝点とし
て検出する方法であり、細胞１個からでも高感度に検出
が可能な方法である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし上記のＡＴＰ法
あるいは抗ＤＮＡ抗体法はいずれも培養法に比べて迅速
な検出が可能という優れた利点があるものの、これらの
方法を実際に適用するにはいまだ多くの解決すべき課題
がある。例えば、ＡＴＰ法では微生物細胞１個あたりに
含まれるＡＴＰは少なく高感度な光学系を用いても微小
量（例えば細胞数が１０以下）の検出は困難である他、
ＡＴＰをほとんど含まない例えば胞子の検出はできない
ため、微小量の検出が必要とされる場合や胞子の検出が
求められる分野では全く採用することができない。この
問題を工業的見地から考えると、胞子は耐薬剤性，耐熱
性を有していて、滅菌処理後にも生き残って製品の安全
性や耐久性を損なう可能性があり、例えば半導体などで
はカビの発生による配線の短絡等を招く物質として無視
できない。

【０００７】一方、上記抗ＤＮＡ抗体法は、理論上、死
菌と生菌の区別はできないものの区別を必要としない分
野や死菌を含めた全微生物を検出することが望まれる分
野、例えば電子部品の洗浄用水、医薬用水等の高純度水
（超純水等）における微生物管理においては、細胞１個
からでも検出可能な高感度検出法として有益な方法であ
る。しかし実際には、ＤＮＡ標識付けのための特異的な
結合能を有していて上記抗ＤＮＡ抗体法に適用できる適
当なものがない。例えば、ＤＮＡに特異的な結合能を有
する抗体として入手可能なものとして知られるＩｇＭ型
ＤＮＡモノクローナル抗体（ＰＲＯＧＥＮ社製）は、Ｉ
ｇＧ抗体分子の５量体様構造をとった巨大分子であるた
め、測定系の高感度化には適当でなく本発明の目的を達
成する抗体としては有効ではない。またその５量体様構
造は抗体の化学修飾を困難にしており酵素などの標識物
質を結合させることができない。

【０００８】そこで本発明者は、微生物のＤＮＡに対す
る特異的結合能を有しかつ酵素等の適当な標識物質の結
合が可能なＩｇＧ抗体型の抗ＤＮＡ抗体（工業技術院生
命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９１の
ハイブリドーマが産生する抗ＤＮＡ抗体：このハイブリ
ドーマを「ＭＮ−１」と命名した）を開発し、これによ
って抗ＤＮＡ抗体法によるサンプル中の微量微生物等の
検出を実施可能とした。

【０００９】ところで、上記抗ＤＮＡ抗体法において
は、細胞構造を破壊してＤＮＡを露出させる処理が不可
欠であって、一般的な微生物と異なり細胞構造が強固な
胞子においてはそのＤＮＡの適当な露出処理が容易でな
いという問題があるため他の微生物等と同様に検出する
ことはできないという課題の解決が求められる。すなわ
ち、枯草菌、カビより生成される胞子は、高分子多糖と
タンパク質より構成される細胞壁に幾重にも取り囲まれ
た強固な構造を取っており、熱、化学薬品に対して極め
て抵抗性が強く、酸、アルカリ、界面活性剤、還元剤、
加水分解酵素などを用いても破壊は困難なためである。
なお言うまでもなく酸，アルカリの存在下で加熱する強
度な破壊法を実施するなどの方法で胞子の細胞構造を破
壊することは一応可能であるが、このような過激な処理
では同時にＤＮＡをも破壊せしめる結果となってしま
い、抗ＤＮＡ抗体を用いてこれを検出する方法には適用
することができない。

【００１０】本発明は以上のような種々の問題から、超
純水等の用水や空気中に含まれることがあり、製品の安
全性や耐久性を損なう物質として無視できない胞子の検
出を可能とする方法を提供することを目的としてなされ
たものである。

【００１１】すなわち本発明は、胞子細胞中のＤＮＡを
破壊することなしに、強固な外壁構造を有する胞子のＤ
ＮＡを露出することができ、これによって胞子検出を可
能とする方法を提供することを目的とする。

【００１２】また本発明の別の目的は、胞子の検出を迅
速に行うことができる方法を提供するところにある。

【００１３】更に本発明の別の目的は、上記した胞子の
迅速な検出を通じて、胞子のみならずその他の微生物を
含む可能性のある超純水等の用水に対する除菌，滅菌処
理を効率的に実施するのに有効な方法を提供するところ
にある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記の目的を実現する本
発明の胞子検出方法の特徴の一つは、例えば超純水等の
サンプル中に存在する胞子を、栄養細胞又は菌糸に変換
する処理を行った後、該栄養細胞又は菌糸を破壊してＤ
ＮＡを露出させ、次いでＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体、及び
標識物質で標識された該抗ＤＮＡ抗体に対する抗体との
免疫反応によりＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体−標識抗抗体抗体
の複合体を生成させ、該複合体に含まれる標識物質をマ
ーカーとして被検液中の胞子を検出するところにある。

【００１５】上記において、胞子を栄養細胞又は菌糸に
変換する処理法は、例えば、当該胞子を含む菌体液にア
ミノ酸や糖類を添加して１０〜６０℃で放置する方法を
一例として挙げることができ、これにより容易に変換処
理を行うことができる。この糖類やアミノ酸等の栄養塩
類の添加処理は、個体数を増加させる一般的な意味にお
いての「培養」と手法は類似するがその技術的意義は全
く異なるものあって、胞子を栄養細胞又は菌糸に変換す
ることが目的であり、したがって処理時間は、細胞数の
増加による検出の正確さなどへの悪影響がないようにす
ることを考慮して、処理温度にもよるが通常は室温ない
し６０℃程度の処理温度範囲で５分〜４時間の範囲とす
ることが好ましい。糖類やアミノ酸等の栄養塩類の添加
がないと上記変換は起こり難い。なお、胞子の発芽ある
いは栄養細胞への変換は加熱処理により促進されるとさ
れているので、必要に応じて上記処理以前に熱誘導処理
を行なって変換促進を図ってもよい。

【００１６】本発明者がかかる発明をなすに至ったの
は、上述した胞子の細胞構造が強固である故に直接的に
ＤＮＡを露出させる適当な方法がないのに対し、胞子を
栄養細胞又は菌糸に変換すればその細胞構造は比較的容
易に破壊できてＤＮＡ露出により上記抗ＤＮＡ抗体法を
好適に適用できるようになることに着目したところにあ
る。すなわち本発明は、ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体（標識
物質で標識されたものを含む）を胞子検出に利用しなが
ら、この新規な方法を胞子検出の迅速化に最適に利用す
ることが肝要となるからである。

【００１７】ここでＤＮＡの露出というのは、細胞壁等
により保護されているＤＮＡを以下に述べる免疫反応が
可能な必要十分な状態にすることをいい、例えばタンパ
ク質変性剤等の薬品による処理、超音波による処理、高
熱による処理、凍結融解による処理、加圧減圧による処
理、ガラス，アルミナ等の微粒子の衝突による処理、等
々の方法を特に限定されることなく用いることができる
が、栄養細胞あるいは菌糸の外壁構造は、アルカリ、界
面活性剤などを用いる穏和な処理で容易に破壊でき、こ
れによればＤＮＡへの損傷は最小であるため好ましい。

【００１８】上記のマーカーとしての標識物質として
は、酵素，放射性物質，蛍光物質，発光物質、金属コロ
イドを例示することができるが、一般的には酵素が好ま
しく用いられる。

【００１９】本発明のもう一つの特徴は、胞子のＤＮＡ
と免疫反応する上記抗ＤＮＡ抗体及び標識抗抗体抗体を
用いることに代え、ＩｇＧ型の抗ＤＮＡ抗体であって標
識物質が結合された標識抗ＤＮＡ抗体を用いて、免疫反
応によりＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成さ
せ、該複合体に含まれる標識物質をマーカーとして被検
液中の胞子を検出するところにある。

【００２０】本発明方法の意義を例を挙げて言えば、半
導体デバイス等の電子部品の洗浄に使用される純水，超
純水の水質管理を行う際に、例えば、比較的低レベルの
紫外線照射，フィルター除去などの滅菌処理による細菌
等の対策を通常的に行いながら、並行して胞子の混入監
視を行うことで、胞子混入が検出されない状態での安価
な運転コストによる稼働と、胞子混入が検出された際の
強度な滅菌，除菌（除去）対策の実行という、場合に応
じた処理を可能とする方法として実施することが可能と
なり、あるいは微生物滅菌を当然に達成しかつ胞子除去
（除菌）も可能な強度な滅菌，除菌（除去）対策を実行
しながら、その有効性を確認する方法として工業的に有
益に実施することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】

実施形態１ 上記の標識物質をマーカーとしたサンプル中の胞子の検
出は、複合体を固体表面に結合させることなく行うこと
ができる。

【００２２】すなわち、本例は、胞子を含む被検液にア
ミノ酸や糖類等の栄養素を添加して、５分〜４時間、１
０〜６０℃に保持することで該胞子を栄養細胞又は菌糸
に変換した後、該被検液に界面活性剤及びアルカリより
なる溶菌液を加えて栄養細胞又は菌糸を破壊してＤＮＡ
を露出させ、次いで被検液中に、ＤＮＡと免疫反応する
上述のＭＮ−１産生抗ＤＮＡ抗体の希薄濃度液、及び、
この抗ＤＮＡ抗体と免疫反応する抗抗体抗体であって酵
素，放射性物質，蛍光物質，発光物質、金属コロイド
（以下「酵素等」という）のいずれかが標識として結合
された標識抗抗体抗体の希薄濃度液を混合し、免疫反応
を行わせることで実施することができる。この操作によ
り、溶液中に希薄に存在する抗ＤＮＡ抗体−標識抗抗体
抗体の結合物は、胞子由来のＤＮＡ分子上に集中して、
ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体−標識抗抗体抗体の複合体からな
る標識物質の塊を形成することになって、周辺に希薄に
存在する標識物質とは明らかに区別できる標識物質の塊
となる。

【００２３】したがって、例えばフローセルのような微
細な環境を測定し得る測定容器中での微量発光検出、蛍
光検出、視差屈折率検出、放射性同位元素検出等によ
り、塊としてあるいはその塊の数として検出することが
できる。この検出方法は、被検液が連続的に流れる系に
おいて、胞子を連続的に検出することが求められる用途
において特に有効である。

【００２４】またこの方法においては、ＭＮ−１産生抗
ＤＮＡ抗体及び該抗ＤＮＡ抗体と免疫反応する上記標識
抗抗体抗体をそのまま用いることに代えて、この抗ＤＮ
Ａ抗体に、上記した発光物質等を標識した標識抗ＤＮＡ
抗体として用い、被検液中のＤＮＡとこの標識抗ＤＮＡ
抗体とを免疫反応させることにより、ＤＮＡ−標識抗Ｄ
ＮＡ抗体の複合体を生成させることによっても実施する
ことができる。

【００２５】これらの方法において用いられる上記標識
としては、酵素，放射性物質，蛍光物質，発光物質が好
ましく用いられるが、特に酵素及び蛍光物質が好まし
い。

【００２６】実施形態２ 本発明の方法は、胞子由来のＤＮＡを含む複合体を固体
表面に結合した状態として（固相化して）行うこともで
きる。

【００２７】複合体の固相化のために、ＤＮＡを固体表
面に直接結合させる場合は、例えば胞子をフィルター表
面に捕捉し、該胞子を栄養細胞又は菌糸に変換させた
後、ＤＮＡを露出させる破壊処理を行う方法を一例的に
挙げることができる。

【００２８】すなわち、反応室を形成するウエルの底
面、壁面、粒状体の表面、あるいはシート，フィルター
の表面等を固相として用い、この固相に胞子由来のＤＮ
Ａを結合させる方法として、適当濃度で胞子由来のＤＮ
Ａを含有する被検液を、例えば固相であるウエルに添加
するか、あるいは固相である粒状体，シート，フィルタ
ー等に浸漬などにより接触させ、３０分から１日間静置
した後、これらの固相と該物質を含む溶液を分離洗浄す
る方法などを挙げることができる。

【００２９】胞子由来のＤＮＡを固相化した後は、該Ｄ
ＮＡに対して、抗ＤＮＡ抗体と標識抗抗体抗体、あるい
は標識抗ＤＮＡ抗体を結合させる上記実施形態１と同様
の免疫反応を行わせればよい。すなわち、抗ＤＮＡ抗体
及び標識抗抗体抗体を過剰に含む溶液を免疫反応が平衡
に達するまで（例えば３０分〜１日間）接触させ、ある
いは、標識抗ＤＮＡ抗体を過剰に含む溶液を同様に免疫
反応が平衡に達するまで接触させ、これらの後、免疫反
応しなかった遊離の物質を固液分離して洗浄すればよ
い。

【００３０】以上の操作における固液分離、洗浄は、固
相がウエルのような容器の形状をとる場合には、（固相
に結合されていない）遊離の物質（抗ＤＮＡ抗体，標識
抗抗体抗体、あるいは標識抗ＤＮＡ抗体等）を含む溶液
を除去し、必要に応じて分離除去を確実にするために一
又は複数回の洗浄を行った後、これらを含まない別の溶
液に置き換える操作を行うことで実施できる。固相が粒
状体，シート等である場合は、これを充填した容器中で
上記と同じ固液分離，洗浄の操作を行うことができる
他、粒状体，シート等を別の溶液が添加されている容器
に移し替える操作により行うこともできる。

【００３１】フィルター（一般的にはマイクロフィルタ
ー）上に胞子由来のＤＮＡを結合させる方法としては、
このフィルターがナイロン，ポリフッ化ビニリデン等の
ＤＮＡを強く吸着する性質を示す素材で構成されたもの
を用いれば、胞子をフィルターに捕捉させた後に破砕処
理を行うことで、特に結合のための処理を行うことな
く、破砕の終了と同時にＤＮＡはフィルター上に結合さ
せることができる。

【００３２】またフィルターがニトロセルロース，酢酸
セルロース等のセルロース系の素材で構成されている場
合には、破砕処理法に特に限定されるものではないが、
好ましくは、破砕と同時にＤＮＡを２本鎖から１本鎖に
変性させる薬品を用いた破砕処理を行うことが好まし
い。これにより変性した１本鎖ＤＮＡは上記素材に対す
る吸着性が大きいので、フィルターに対する結合が確実
に得られる。このような薬品を用いずに破砕処理を行う
場合には、破砕処理後に該フィルターを真空条件下で４
０〜１００℃に加熱することがよく、これによりセルロ
ース系素材のフィルターにＤＮＡが良好に結合される。
またマイクロフィルターにはポリカーボネートの素材の
ものを用いることもできるが、この素材はそのままでは
ＤＮＡに対する吸着性を示さないので、上記した真空条
件下での加熱処理が行なわれる。

【００３３】本例においては、標識物質としては上記し
た種々のものを用いることができるが、特に酵素を用い
てＥＬＩＳＡを行うのがより高感度な検出を可能とする
ために好ましい場合が多い。

【００３４】本例の方法によれば、水、純水や超純水等
の高純度水中における微量な胞子の存在を感度よく検出
することができる。

【００３５】実施形態３ 胞子由来のＤＮＡを含む複合体を固体表面に結合する固
相化は、上記実施形態２のＤＮＡを直接結合させる方法
に代えて、固体表面に結合した抗ＤＮＡ抗体を介して間
接的に固体表面に胞子由来のＤＮＡを結合させることが
でき、この方法により固相化した後、上記実施形態２と
同様の操作を行うことができる。

【００３６】本例においては、標識物質としては上記し
た種々のものを用いることができるが、特に酵素を用い
てＥＬＩＳＡを行うことによってより高感度な検出を可
能とすることができるので好ましい場合が多い。

【００３７】ＥＬＩＳＡによる胞子由来のＤＮＡ検出法
の具体例としては、例えば、反応室の内壁に抗ＤＮＡ抗
体を結合（固相化，不動化）したウエル室内に、胞子を
栄養細胞または菌糸に変換した後破砕処理を行って露出
させたＤＮＡを含む被検液を添加して、固相化抗ＤＮＡ
抗体−ＤＮＡの免疫反応をさせ、次いで被検液を固液分
離・洗浄した後、上記固相化抗ＤＮＡ抗体−ＤＮＡに、
例えば、抗ＤＮＡ抗体と標識抗抗体抗体、あるいは標識
物質として酵素を標識した標識抗ＤＮＡ抗体を免疫反応
させて、固相化抗ＤＮＡ抗体−ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体−
標識抗抗体抗体の複合体を生成させるか、固相化抗ＤＮ
Ａ抗体−ＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体を生成さ
せ、遊離の標識抗ＤＮＡ抗体を固液分離・洗浄除去した
後、基質溶液を加え、この複合体に含まれる酵素の活性
により基質溶液に現れる例えば蛍光強度の変化によりＤ
ＮＡの存在を検出し、あるいはＤＮＡ量を測定するＥＬ
ＩＳＡ法を挙げることができる。

【００３８】

【実施例】

参考例１（ＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体産生ハイブリドーマ
「ＭＮ−１」の作製） ケラーとミルスタイン（KohlerとMilstein）らの方法
（Nature,256,495,1975）に従ってＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗
体を産生するハイブリドーマ株「ＭＮ−１」を以下のよ
うにして樹立した。

【００３９】すなわち、全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）の病態モデル、ＭＲＬマウス（ＭＲＬ／l-MpjUmmCr
j-lpr/lpr ）の１０週齢のものを入手し、紅斑、脱毛、
結節の腫張などＳＬＥに特異の症状を呈するようにな
り、症状が特に顕著となった２０週齢時点で脾臓を摘出
し、摘出後、脾臓をハサミで裁断し、ＲＰＭ１１６４０
培地中ピンセットで押し潰して細胞を抽出した。次いで
大きな断片を除去し、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心に
より細胞を集めた。細胞数は約２×１０⁸ であった。

【００４０】別にマウス由来の骨髄腫細胞株ＰＡＩ（Ｊ
ＣＲＢ０１１３）を、１０％仔牛胎児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地で培養しておき、５×１０⁷ の細胞を集
め、ＲＰＭ１１６４０培地で１回洗浄した後、脾臓細胞
と混合した。

【００４１】混合した細胞を１５００ｒｐｍの遠心を行
って回収し、再度ＲＰＭ１１６４０培地によって洗浄
し、さらに０．３Ｍ蔗糖で洗浄した。最終的に４ｍｌの
０．３Ｍ蔗糖に懸濁し、細胞融合装置の電極チャンバー
内に移し、直流電圧７００Ｖ、３０μｓｅｃ、ｌ回のパ
ルスで電気的に細胞を融合した。細胞を２０％の仔牛胎
児血清を含むＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン−
０．４μＭアミノプテリン−１６μＭチミジン添加ＲＰ
Ｍ１１６４０）に懸濁して２００ｍｌとし、室温で１時
間静置した。次に、健常マウス２匹分の脾臓細胞をフィ
ーダー細胞として加え、穏やかに撹拌、均一にしてから
９６穴のマイクロプレートの各穴に２００μｌずつ撒き
込んだ。

【００４２】撒き込み後、５日目にはほとんど全ての穴
に１個以上のハイブリドーマのコロニーが認められた。
コロニーが充分成育し、しかも同一の穴に共存している
他のコロニーと重ならないうちに、第ｌ回目のスクリー
ニングを行った。

【００４３】スクリーニングはＥＬＩＳＡ法によった。
すなわち超音波破砕により断片化した２重鎖ＤＮＡ（仔
牛胸腺由来）、およびこれを熱変性して得た単鎖ＤＮＡ
をそれぞれ２０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ（リン酸緩衝
化生理食塩水）に混合した。これを９６穴ＥＬＩＳＡプ
レートの各穴に５０μｌずつ添加して穴底にＤＮＡを吸
着させた。１０％仔牛胎児血清によりブロッキング処理
を施したのちスクリーニングに供した。

【００４４】上記のように調製したＥＬＩＳＡプレート
にハイブリドーマの培養プレートの各穴より５０μｌず
つ培養上清を添加した。３７℃で１時間静置した後、各
穴を１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。１０％仔牛胎
児血清を含むＰＢＳ中に３０００〜５０００倍希釈した
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ
＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ抗体溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を
２次抗体として５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間静
置した後、ＰＢＳで４回洗浄した。最後に西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの発色試薬（０．４ｍｇ／ｍｌのｏ−フ
ェニレンジアミンおよび０．０ｌ％の過酸化水素を含む
０．ｌＭリン酸クエン酸緩衝液ｐＨ４．８）１００μｌ
を各穴に添加して発色反応を行わせ、発色を得た培養穴
を抗ＤＮＡ抗体産生細胞陽性と判定した。

【００４５】次に、陽性と判定したうちから発色の強い
もの４８個を選び出し、培養を継続して２回目のスクリ
ーニングを同様の方法で行った。２回目のスクリーニン
グでも再度陽性を示した細胞集団については順次クロー
ニング、スクリーニングを繰り返し行った。３回目のク
ローニングの後、１個の細胞から増殖したのが確実であ
り、抗ＤＮＡ抗体を効率よく生産しているものを細胞株
として樹立した。最終的に得られた株は３種であった。
得られた３種について、その生産している抗体のクラス
を、ウサギの（抗マウスＩｇＧ，抗マウスＩｇＭ，抗マ
ウスＩｇＡ）抗体を用いた市販サブクラス決定用キット
を用いて決定した。その結果、２種はＩｇＭ型であり、
１種はＩｇＧ型であった。ＩｇＭ型抗体は上述の如く操
作性が悪いなどの理由で本発明の目的には適用できない
ので、ＩｇＧ型の抗体を生産しているハイブリドーマ細
胞を採って、このＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体産生ハイブリド
ーマを「ＭＮ−１」と命名し、上述の通り工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１４６９１）。

【００４６】参考例２ （抗体の取得）上記ハイブリドーマ「ＭＮ−１」を同系
統のマウス腹腔に移植し、大量のＭＮ−１抗体をマウス
腹水より得た。

【００４７】すなわち、ＭＮ−１細胞をＨＴ培地（１０
０μＭヒポキサンチン−１６μＭチミジン、１０％仔牛
胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０）で培養増殖し、Ｂａ
ｌｂ／ｃマウスｌ頭あたり１０⁷ の細胞を腹腔に移植し
た。結果として、マウスｌ頭あたり、約４ｍｌの腹水が
採取できた。

【００４８】得られた腹水４５ｍｌを２０ｍＭトリス塩
酸緩衝液ｐＨ７．５に透析した後、同じ緩衝液で容量を
１５０ｍｌとした。同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−
セファセル（ファルマシア社製）のカラムに通じ、非吸
着成分を除去した後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの
濃度勾配により、吸着成分を溶出した。溶出してきた画
分についてＥＬＩＳＡ法によりＤＮＡ結合抗体の有無を
調べ、抗体量の多い画分を集めて濃縮し、透析によって
塩化ナトリウムを除去した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４
（ＩＢＦ）による分子ふるいクロマトグラフィーに供し
た。ＤＮＡ結合抗体を含む画分を回収し、これを精製標
品とした。最終的にタンパク質量として７８．５ｍｇの
ＭＮ−ｌ抗体（ＩｇＧ型抗ＤＮＡ抗体）を回収した。

【００４９】参考例３ （標識ＭＮ−１抗体の調製）上記により精製したＭＮ−
１抗体を用いて、過ヨウ素酸酸化法およびマレイミドヒ
ンジ法の２通りの方法で、標識酵素の西洋ワサビペルオ
キシダーゼを結合させた標識ＭＮ−１抗体（標識抗ＤＮ
Ａ抗体）を調製した。

【００５０】過ヨウ素酸酸化法による酵素標識 １４ｍｇの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
３．５ｍｌの水に溶解し、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウ
ム０．７ｍｌを加えた。室温で２０分間撹伴した後、ｌ
ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．４に対し４℃で一晩
透析した。０．ｌＭ炭酸ナトリウムを加えてｐＨ９．０
に調整し、濃縮して容量を３．５ｍｌとした。

【００５１】別に、上記ＭＮ−１抗体の精製標品３０ｍ
ｇを、０．０ｌＭの炭酸重炭酸ナトリウム緩衝液３．５
ｍｌに溶解し、先に調整したＨＲＰ溶液と混合した。室
温で２時間撹拌した後、４℃に冷却し、４ｍｇ／ｍｌの
水素化ホウ素ナトリウム０．４ｍｌを加えた。ＰＢＳに
対して透析した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４による分子
ふるいクロマトグラフィーを行って、酵素標識されたＭ
Ｎ−１抗体画分を回収した。ＥＬＩＳＡによるＤＮＡ結
合活性と標識ＨＲＰの酵素活性の両者を併せもつ画分
を、ＨＲＰ標識ＭＮ−１の指標として回収した。得られ
たＨＲＰ標識ＭＮ−１抗体はタンパク質量として１６ｍ
ｇであった。

【００５２】マレイミドヒンジ法による酵素標識 上記ＭＮ−１抗体の精製標品５０ｍｇを０．ｌＭクエン
酸緩衝液２５ｍｌに溶解し、６ｍｇのペプシンを加え
た。３７℃で２．５時間消化した後、８ｍｌのトリス塩
酸緩衝液ｐＨ８．０を加え、容量１０ｍｌまで濃縮し
た。０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡
化したウルトロゲルＡｃＡ４４で分子ふるいクロマトグ
ラフィーを行って、ペプシン消化後残ったＭＮ−ｌの抗
原結合断片の２量体（Ｆａｂ’）₂ を回収した。回収し
た画分を０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に
透析した後、０．９ｍｌまで濃縮した。タンパク質濃度
は１０ｍｇ／ｍｌであった。５ｍＭＥＤＴＡを含む０．
ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に溶解した０．
ｌＭ２−メルカプトエチルアミン１０μｌを添加して、
３７℃で９０分間静置した。この処理により２量体は還
元されて単量体Ｆａｂ’に変換し、末端にチオール基が
露出する。還元処理後、５ｍＭＥＤＴＡを含む０．ｌＭ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したセファ
デックスＧ−２５（ファルマシア社製）のカラムに通
じ、単量体となったＦａｂ’を回収した。濃縮してタン
パク質濃度１０ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｌの溶液とした。

【００５３】別に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）８ｍｇを１．２ｍｌの０．ｌＭリン酸ナトリウム緩
衝液に溶解し、８０μｌのジメチルホルムアミドに溶解
したＮ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレートを加え、３
７℃で２時間静置し、ＨＲＰへのマレイミド基導入反応
を行った。反応中生じた凝集体を遠心によって除去した
後、０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０で平衡
化したセファデックス−Ｇ２５カラムに通じてＨＲＰを
回収し、濃縮してＨＲＰ濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。

【００５４】ついで上記Ｆａｂ’溶液０．６ｍｌとマレ
イミド基導入ＨＲＰ溶液０．６ｍｌを混合し、３０℃で
１時間Ｆａｂ’とＨＲＰの結合反応を行った。反応後
０．ｌＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４カラムにより分子ふるいクロ
マトグラフィーを行って、Ｆａｂ’−ＨＲＰ結合体を回
収した。ＤＮＡ結合活性とＨＲＰ活性の両者を該結合体
の指標とした。得られた結合体はタンパク質量として１
２ｍｇであった。

【００５５】以上の過ヨウ素酸酸化法、マレイミドヒン
ジ法のいずれの方法で酵素標識してもＭＮ−１抗体のＤ
ＮＡ結合活性が阻害されることはなかった。

【００５６】参考例４ ［胞子の調整］枯草菌Bacillus sub. の胞子を以下のよ
うに調整した。

【００５７】枯草菌Bacillus sub. の胞子をニュートリ
エントブロスで好気的に培養し、対数増殖期に達したBa
cillus sub. Ｗ１６８（J.Bacteriol.,246、10、3189-319
5 ）の菌体液０．２ｍｌを、寒天平板培地（１リットル
中にバクトトリプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒
天１５ｇを含む）に塗布し、３７℃で１週間培養した。
この培養操作により、殆どの栄養細胞は胞子に変換し
た。栄養細胞から胞子への変換は位相差顕微鏡により確
認した。

【００５８】形成された胞子は、寒天平板培地より掻取
り、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に懸濁した後、
遠心により回収した。ＰＢＳに懸濁、遠心による回収と
いう操作を２回繰り返して胞子を十分に洗浄し、これを
胞子の標品とした。

【００５９】実施例１ ［胞子の栄養細胞への変換］上記により得られた胞子の
所定数（下記表１参照）を、ＰＢＳに懸濁しポアサイズ
０．４５μｍのニトロセルロースフィルター上に捕集さ
せた後、このフィルターをニュートリエントブロス寒天
平板培地に捕集面を上にして乗せ、３７℃で３時間培養
することによって胞子を栄養細胞に変換させた。

【００６０】［胞子の検出］上記培養の後、フィルター
を溶菌剤（０．２ＮＮａＯＨ−１％ＳＤＳ）に５分間室
温で浸漬し、細胞構造を破壊してＤＮＡを露出させ、次
いで溶菌剤を除去し、ＰＢＳで置換して５分間静置する
操作を２回繰り返し、フィルター上に残留している過剰
の溶菌剤を除去した後、ＰＢＳを仔牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を主成分とするブロッキング剤（１０％ＢＳ
Ａ−３％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）に浸し、室温で１時
間振盪してブロッキング処理を施した。

【００６１】ブロッキングの後に酵素標識抗ＤＮＡ抗体
を含む抗体溶液（０．５％ＢＳＡ−０．６μｇ／１０ｍ
ｌ Anti-DNA-Antibody-PBS）に漬け込み、２時間室温で
振盪してＤＮＡと酵素標識抗体を反応させた。抗体溶液
を除去し、洗浄剤（３％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）で洗
浄して、ＤＮＡと反応しないで残った過剰の抗体を除い
た。洗浄の後、過酸化水素とルミノールよりなる酵素の
発光基質を添加して発光反応を行わせ、発光輝点を計測
した。発光輝点の計測はバイオセルカウンタ（オルガノ
株式会社製）で行った。

【００６２】得られた結果を表１に示す。この表１にお
いて、試験番号１，２は胞子を栄養細胞に変換させる培
養を行った本発明の実施例の検出、計測した結果であ
り、試験番号３，４は、胞子を捕集したあと栄養細胞に
変換させるための培養をしないで検出、計測した比較例
の結果を示している。なお試験５，６はブランクであ
る。

【００６３】

【表１】

【００６４】表１に示される結果から、ブランク膜（試
験５，６）では培養の有無に拘わらず、わずかな発光輝
点しか認められないことが分かる。

【００６５】一方、胞子を捕集してから３時間の培養
（栄養細胞への変換処理）を行った膜（試験１，２）
は、捕集した胞子の数にほぼ相当する発光輝点が計測さ
れていることが認められる。他方、胞子を捕集してから
培養（栄養細胞への変換処理）をしなかった膜（試験
３，４）では、培養した膜と比較して発光輝点の数は著
しく少なく、検出効率が充分でないことが分かる。

【００６６】これらの試験１，２と試験３，４の対比に
よれば、３時間の培養（栄養細胞への変換処理）を行う
ことによって胞子は栄養細胞に変換し、そのために溶菌
処理による細胞壁の破壊、ＤＮＡの露出が充分に行わ
れ、満足できる検出効率が得られたものと推定される。

【００６７】そしてこの３時間という培養時間は、従来
の培養法で結果が得られるまでに３，４日を要していた
ことに比べて、極めて短い時間（例えばサンプル採取の
当日中に結果が得られる）であるため、本発明方法が、
サンプル中の胞子を検出する短時間検出法として極めて
有効であることが実証的に確認された。

【００６８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、超純水等の用水
中に含まれることがあって製品の安全性や耐久性を損な
う物質として無視できないものでありながら、従来にお
いては迅速な検出が不可能であった胞子を、迅速かつ高
感度に検出することが可能となり、例えば、電子部品等
の製造業における半導体デバイス等の電子部品の洗浄に
使用される純水，超純水の水質管理、食品製造、医薬品
製造の分野における用水の水質管理に有益である。

【００６９】また本発明の胞子の迅速な検出を通じて、
胞子のみならずその他の微生物を含む可能性のある超純
水等の用水に対する除菌，滅菌処理が、有効かつ効率的
に実施可能となる効果がある。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプル中に存在する胞子を栄養細胞又
   は菌糸に変換する処理を行った後、該栄養細胞又は菌糸
   を破壊してＤＮＡを露出させ、次いでＩｇＧ型の抗ＤＮ
   Ａ抗体、及び標識物質で標識された該抗ＤＮＡ抗体に対
   する抗体との免疫反応によりＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体−標
   識抗抗体抗体の複合体を生成させ、該複合体に含まれる
   標識物質をマーカーとして被検液中の胞子を検出するこ
   とを特徴とする胞子の検出方法。
2. 【請求項２】 サンプル中に存在する胞子を栄養細胞又
   は菌糸に変換する処理を行った後、該栄養細胞又は菌糸
   を破壊してＤＮＡを露出させ、次いでＩｇＧ型の抗ＤＮ
   Ａ抗体であって標識物質が結合された標識抗ＤＮＡ抗体
   との免疫反応によりＤＮＡ−標識抗ＤＮＡ抗体の複合体
   を生成させ、該複合体に含まれる標識物質をマーカーと
   して被検液中の胞子を検出することを特徴とする胞子の
   検出方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２において、ＤＮＡを固体
   表面に直接結合させるか、または固体表面に結合した抗
   ＤＮＡ抗体を介して間接的に固体表面に結合させる固相
   化処理を行った後、複合体を生成する上記免疫反応を行
   わせることを特徴とする胞子の検出方法。
4. 【請求項４】 請求項３において、ＤＮＡを固体表面に
   直接結合させる固相化処理が、胞子をフィルター表面に
   捕捉し、該胞子を栄養細胞又は菌糸に変換させた後、Ｄ
   ＮＡを露出させる処理であることを特徴とする胞子の検
   出方法
5. 【請求項５】 請求項１ないし４のいずれかにおいて、
   標識物質は、酵素，放射性物質，蛍光物質，発光物質、
   金属コロイドのいずれかであることを特徴とする胞子の
   検出方法。
6. 【請求項６】 請求項１ないし５のいずれかにおいて、
   抗ＤＮＡ抗体が、工業技術院生命工学工業技術研究所寄
   託ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９１のハイブリドーマの産生す
   る抗ＤＮＡ抗体であることを特徴とする微生物等の検出
   方法。