JP2011521239A

JP2011521239A - 検体分類の正確性を向上する方法及び試薬キット

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Publication number: JP2011521239A
Application number: JP2011509836A
Authority: JP
Inventors: 標揚林
Original assignee: 標揚林
Priority date: 2008-05-21
Filing date: 2008-10-20
Publication date: 2011-07-21
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Abstract

本発明は検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白を結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を開示し、検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量を検出するステップと、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白含有量の比を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してＲＯＣ曲線を描き、且つ曲線下の面積ＡＵＣを計算するステップと、ＡＵＣ値、感度及び特異性に基づいて検体に対して分類を行うステップとを含む。本発明はさらに検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を検出するための試薬キットを開示する。

Description

本発明は生物医薬技術分野に属し、具体的に言うと、本発明は検体分類の正確性を向上する方法、及び検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白を検出するための試薬キットに係る。

肝癌（ＨＣＣ）はよくある、且つ致命の悪性腫瘍である。統計によると、毎年約５００，０００の肝癌患者が新たに増加し、且つ約５００，０００人が該疾病によって死亡している（Parkin, D. M., Bray, F., Ferlay, J., and Pisani, P. (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94, 153-156.を参照する）。従来の肝癌診断手段は超音波検出及びアルファ胎児性蛋白（ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）検出を含み、２つは通常、結合して使用される（Spangenberg, H. C., Thimme, R., and Blum, H. E. (2006) Serum markers of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 26, 385-390.を参照する）。アルファ胎児性蛋白を生物マーカーとしてＲＯＣ曲線によって肝癌診断を行った時に、その検出陽性閾値は一般的に２０ｎｇ／ｍｌである（陳季武、範培昌、アルファ胎児性蛋白を快速で検出する免疫クロマトグラフィー試験片の研究開発、［分析科学学報］、２００２年第４期、Ｐ．２７３−２７６を参照する）。超音波とアルファ胎児性蛋白との結合検出の感度及び特異性がそれぞれ５０−８５％及び７０−９０％であったが、その偽陽性及び偽陰性率が４０％にも達している（Tu, D. G., Wang, S. T., Chang, T. T., Chiu, N. T., and Yao, W. J. (1999) the value of serum tissue polypeptide specific antigen in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer 85, 1039-1043; Buscarini, L., Sbolli, G., Cavanna, L., Civardi, G., Di Stasi, M., Buscarini, E., and Fornari, F. (1987) Clinical and diagnostic features of 67 cases of hepatocellular carcinoma. Oncology 44, 93-97.を参照する）。そのため、検出がより便利で、感度及び特異性がより高く、且つ正確率がより高い肝癌診断手段に対する要望は科学技術者に対していよいよ差し迫ってきている。

ＹＫＬ−４０がヒト軟骨糖蛋白３９（ＨｃＧＰ−３９）（またはキチナーゼ様蛋白質、ｃｈｉｔｉｎａｓｅ３−ｌｉｋｅ１とも呼ばれる）の略称であり、またはＣＨＩ３Ｌ１、ＹＫＬ４０とも略称される。研究によると、血清におけるＹＫＬ−４０のレベルは、骨関節炎、原発性大腸癌、乳腺癌、再発卵巣癌などのような複数の疾病状況に関するため、一部の疾病の診断、予後評価、治療効果のモニタリング及び疾病経過のモニタリングに用いられることができることを発見した。例えば、卵巣癌の診断及び予後に用いられることができる（程明剛など、卵巣癌患者の診断及び予後における血清ＹＫＬ−４０の応用。［広東医学］２００８年２９巻２期、Ｐ．２５５−２５６を参照する）。イェール大学医学院研究者は２００７年１１月１５日に出版された［ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン］（The New England Journal of Medicine）に、臨床試験結果は、該分子が重篤な喘息の生理反応を決定する時に重要な作用を有し、普通の人と比べると、喘息病患者のＹＫＬ−４０血清がより多く、同時に喘息の重篤な程度とも関連することを示したという文章を発表した（生物通ネットワーク：http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-11/20071116165039.htmを参照する）。米国カリフォルニア大学サンディエゴ校Ｊｏｈａｎｓｅｎ等は、ＹＫＬ−４０が癌胎児抗原（ＣＥＡ）及び乳酸脱水素酵素から独立した生物マーカーであり、ＹＫＬ−４０レベルが高い一般の人々は、その胃腸管腫瘍罹患のリスクが２．７倍に増加し、且つ胃腸管腫瘍と診断された後の予後がよくない（中国医学トリビューンオンライン版を参照する。ネットワーク：http://www.cmt.com.cn/article/080221/a080221b0301.htm）。人々はさらに、血清ＹＫＬ−４０レベルはさらに肝臓繊維化指標とすることができることを発見した（Johansen, J. S., Christoffersen, P., Moller, S., Price, P. A., Henriksen, J. H., Garbarsch, C., and Bendtsen, F. (2000) Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology 32, 911-920.を参照する）が、肝癌診断におけるＹＫＬ−４０検出の応用に関する報道は現在までになされていない。

ＭＡＳＰ２はマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ２（mannan-binding lectin associated serine protease-2）の略語であり、ヒトの免疫欠損病に関し、人間の体の自然免疫防御において重要な役割を果たしている（蔡学敏等、ヒトマンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ２Ｎ端断片の原核発現、［免疫学雑誌］、２００７年０３期Ｐ．２３５〜２３８を参照する）が、肝癌診断におけるその応用に関する報道はまだない。

本発明者の研究は、ＭＡＳＰ２遺伝子が肝臓において特異的に発現されている遺伝子であることを明らかにした。大量の研究によって、該２種の蛋白はともに肝癌症状と関係し、肝癌患者の血清におけるＹＫＬ−４０の含有量が正常の検体より明らかに高く、一方、肝癌患者人体におけるＭＡＳＰ２の発現量が正常の検体より低いことを本発明者は偶発的に発見した。よって我々は、癌症における１種の高発現蛋白（この蛋白はある癌症に対してのみ特異的でなくてもよく、異なる癌症においてともに高発現であってもよい）と、１つの組織または器官特異的発現蛋白の該組織または器官における低発現（組織または器官特異的機能を実行する特異的蛋白の癌症による減少）とを連係することによって、癌症を診断する結合生物マーカーとし、癌検出の感度及び特異性を向上できる仮説を提出した。ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の２種の蛋白を例とし、肝癌臨床応用の生物マーカーとすることができるか、及びその結合検出が疾病の診断及び予後の正確性を向上できるかを観察した。

前記発見に基づき、本発明の主要な目的は、検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白を結合検出することによって検体分類の正確性を向上する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白を検出するための試薬キットを提供することにある。

本発明の更なる１つの目的は、検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を結合検出することによって検体の分析感度を向上する方法を提供することにある。

本発明のもう１つの更なる目的は、検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を検出するための試薬キットを提供することにある。

前記目的を実現するため、本発明は以下のような技術案を採用する。

検体分類の正確性を向上する方法において、検体における蛋白ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合検出することを特徴とする。

前記結合検出は、
（１）検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量を検出するステップと、
（２）検出されたＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量に対して数学分析を行うステップと、
（３）数学分析の結果に基づき、測定検体に対して分類を行うステップと、
を含む。

癌症を含む疾病の診断、予後評価、治療効果のモニタリング及び疾病経過のモニタリングにおける前記方法の応用である。

検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白を検出するための試薬キットであって、
（１）ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合できる抗体と、
（２）ＹＫＬ−４０及び／またはＭＡＳＰ２が（１）により限定された抗体に結合された時に、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２に結合することができる標識抗体と、
を含む。

個体の癌検出の感度を向上する方法であって、
（１）個体の検体における癌高発現の蛋白含有量を測定するステップと、
（２）個体の検体における、特定組織または器官の特異的発現の蛋白含有量を測定するステップと、
（３）検出された検体における癌高発現蛋白含有量及び組織または器官特異的発現の蛋白含有量に対して数学分析を行うステップと、
（４）数学分析結果に基づき、個体を癌症または健康に分類するステップと、
を含む、方法。

検体における癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を検出するための試薬キットであって、
（１）癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白を結合できる抗体と、
（２）癌高発現蛋白及び／または組織もしくは器官特異的発現蛋白が（１）により限定された抗体に結合された時に、癌高発現蛋白及び組織または器官特異的発現蛋白に結合することができる標識抗体と、
を含む、試薬キット。

研究は、本発明の方法及び試薬キットを採用して個体の検体における蛋白ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合検出することによって、癌診断の感度、特異性及び正確率を有効に向上でき、且つ複数の疾病の診断、予後評価、治療効果評価及び疾病経過のモニタリングに普及させることができることを示した。

図１は肝癌患者の血清検体に対してＹＫＬ−４０検出を行ったＲＯＣ曲線画面である。図２は肝癌患者の血清検体に対してＭＡＳＰ２検出を行ったＲＯＣ曲線画面である。図３は肝癌患者の血清検体に対してＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２結合検出を行ったＲＯＣ曲線画面である。

以下は具体的な実施例にあわせて、本発明に対してさらに説明する。以下の実施例は本発明を説明することにのみ用いられるため、本発明の範囲を限定するものではない。

周知のように、個体が癌症になりはじめ、または癌症の臨床段階になった時に、癌ウイルスまたは癌遺伝子が高発現され、このような高発現された蛋白、例えばＹＫＬ−４０は癌症の生物マーカーとすることができ、一方、該個体の関係組織または器官の機能が低下することによって、該組織または器官における特異的発現の蛋白、例えば肝臓において特異的に発現するＭＡＳＰ２の発現レベルが低下するため、組織または器官特異的発現蛋白の低発現レベルは癌生物マーカーとする潜在力を同様に持っている。本分野の当業者が熟知のように、単一の生物マーカーの検出は時には偽陽性または偽陰性の増加になり、検出の正確率の下降に至るため、個体検体における癌高発現の蛋白、例えばＹＫＬ−４０の含有量と特定組織または器官の特異的発現蛋白、例えば肝臓において特異的に発現するＭＡＳＰ２の低発現レベルとを同時に検出する、すなわち、従来の対形成されたマーカーのベースにさらに新マーカーを加えることによって検出の感度を向上することは、癌検出の感度を向上でき、これは下記の実施例において検証されるであろう。

無論、本発明の個体癌検出感度の向上方法と関連試薬キットは各種の癌症と器官病変の診断、予後評価、治療効果評価及び疾病経過のモニタリングに応用できる。

例えば、血液検体の結合検出を例とし、ある特定組織または器官の癌症または疾病に対する本発明の適用は、個体血液検体における癌症または疾病の高発現の蛋白または遺伝子を検出するステップと、特定組織または器官の特異的蛋白または遺伝子の血液における低発現を検出するステップと、検出された蛋白含有量または遺伝子の発現結果に対して数学分析を行うステップと、数学分析結果に基づき、測定された個体検体に対して分類を行い、癌症または疾病の診断結果を下すステップと、を含む。このような結果は健康、癌症または疾病の前期、癌症または疾病の中期、癌症または疾病の晩期などに分けることができる。

理解すべきは、本明細書における述語「結合検出」の含意は、検体における特定蛋白の含有量を検出することを含むだけでなく、さらに検出された蛋白含有量にする数学分析を含んでもよく、且つ、さらに数学分析の結果に基づき、測定された検体に対して分類を行うことを含んでもよい。

ＥＬＩＳＡ
本発明はＥＬＩＳＡ技術を使用して、個体検体に対して癌高発現蛋白、例えばＹＫＬ４０、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばＭＡＳＰ２の検出を行う。

酵素結合免疫吸着検査法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）は分子生物学分野における常用の蛋白質含量分析方法であり、抗原測定に使用されてもよいし、抗体測定に使用されてもよい。試薬の由来、検体の性状及び検査に必要な条件に基づき、本発明は複数種の異なるタイプ、例えば二重抗体サンドイッチエライザ法、２部位１ステップ法、間接抗体法、競合法、捕捉法によるＩｇＭ抗体検出、及びビオチン・アビジンシステムを用いたＥＬＩＳＡなどを採用できる。

試薬キット
好ましくは、本発明のＥＬＩＳＡは試薬キットを用いて完成し、快適な操作が実現されることによって、従来の実験検出の煩雑を避ける。本発明のＥＬＩＳＡ試薬キットはＹＫＬ４０免疫酵素標識試薬キットと、ＭＡＳＰ２免疫酵素標識試薬キットと、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２免疫酵素標識試薬キットとを含む。疾病診断の感度、特異性及び正確率を向上するため、好ましくは、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２検出試薬キットを使用し、２群の検出結果がそれぞれまたは同時に得られることによって、快適な効果を達成できる。

本発明のＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２検出試薬キットは少なくとも、
（１）ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合できる抗体と、
（２）ＹＫＬ−４０及び／またはＭＡＳＰ２が（１）により限定された抗体に結合された時に、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２に結合することができる標識抗体と、
を含む。

前記試薬キットはさらに、
（３）既知量のＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を含有する溶液によって構成され、遺伝子組換え微生物発現、動物またはヒトの体液から由来できる標準検体と、
（４）報告方法とする酵素標識用試薬、例えばペルオキシダーゼ、または抗体と結合して抱合体を形成することができる蛍光標識のような測定用抗体標識と、
を含む。

さらに好ましくは、試薬キットは、（５）スペースが１種または複数種の容器、９６ウェルプレートまたはプレートバーを収納できる限定スペースに分けられ、該容器が薬瓶、テストチューブ及び類似物で、各容器には本発明の方法に用いられる１つの単一な成分が含有されている、携帯工具と、（６）呈色試薬、酵素阻害剤、緩衝液、希釈剤、洗浄試薬及び類似物のような補助試薬と、（７）ボトル、テストチューブ及び類似物に書かれてもよいし、１枚の単独の用紙、または容器の外部または内部に書かれてもよいし、ＣＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、画像などのようなマルチメディアの形式であってもよい使用説明書と、のうちの少なくとも１つを含む。

好ましくは、抗体は固相担体に固定され、捕捉抗体に形成されることができる。

前記抗体はＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２を結合できるいずれかの抗体断片を含み、且つ組み換え体、キメラ抗体、ヒト抗体及びマウス抗体であってもよい。前記抗体はモノクロナール抗体またはポリクローナル抗体であってもよく、モノクロナール抗体が好ましい。

好ましくは、抗体抱合体がＥＬＩＳＡ読み取り装置、例えば、マイクロプレートリーダーによって光度測定されることができる。

検体
本発明に使用される検体は全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液または涙のような複数種の形式を含むことができ、好ましくは血清である。

検体の調製方法は遠心などのような一般的な方法であってもよく、例えば、文献Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing" in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R., Saunders (1994)；Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds), 1981, 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology, H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981, 74(C)を参照する。

ＲＯＣ曲線
ＥＬＩＳＡによって検体における癌高発現蛋白、例えばＹＫＬ４０、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばＭＡＳＰ２の濃度を検出した後、検出された検体における癌高発現蛋白、例えばＹＫＬ４０、及び組織または器官特異的発現蛋白、例えばＭＡＳＰ２の濃度に対して数学分析方法によって統計学処理を行うことができ、これをベースにして検体分類意義を有するレベルわけ標準を得る。好ましくはこのような数学方法はコンピューターによって完成され、例えばこれらのデータでＲＯＣ曲線を作成することによって、個体の検体に対して分類を行う。

ＲＯＣ曲線の全称は受信者動作特性曲線（receiver operator characteristic curve）であり、受信者操作特性曲線とも呼ばれ、主に臨床生物化学診断試験に応用される。ＲＯＣ曲線は真陽性率（感度、または敏感性とも呼ばれ、sensitivity）及び偽陽性率（１−特異性、specificity）連続変数を反映する総合指標であり、構図法によって感度と特異性との相互関係を表しており、一連の異なる境界値（閾値または臨界値、cut-off value，診断試験結果が正常であるか異常であるかを区別する臨界値である）を連続変数とすることによって、一連の感度及び特異性を算出し、さらに感度を縦軸とし、１−特異性を横軸とすることによって作成された曲線であり、曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の正確性が高い。ＲＯＣ曲線において、座標図左上方に最も接近する点が感度及び特異性がともに高い臨界値である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値が１．０〜０．５で、ＡＵＣ＞０．５の場合は、ＡＵＣが１に接近するほど、診断効果がよい。ＡＵＣ値が０．５〜０．７であった場合は正確性が低い。ＡＵＣ値が０．７〜０．９であった場合は一定の正確性がある。ＡＵＣが０．９以上であった場合は、正確性が比較的高い。

ＲＯＣ曲線の評価方法は伝統的な評価方法と異なっており、実際の状況に応じ、中間状態が許容され、試験結果を複数の順序分類、例えば、正常、ほぼ正常、疑わしい、ほぼ異常及び異常の５つのステージに分けることができる。

前記順序分類は疾病の診断にとって、陰性、不確定、陽性に分けられ、さらに、癌診断にとって、癌症、健康に分けられる。

よって、検体における蛋白ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の検出を例とし、本発明の検体分類正確性を向上する方法は、
（１）検体における蛋白ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の含有量をそれぞれ検出するステップと、
（２）ＹＫＬ４０とＭＡＳＰ２蛋白含有量との比を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してＲＯＣ曲線を作成し、且つ曲線下面積ＡＵＣを算出するステップと、
（３）所望の感度及び特異性に基づいて測定検体に対して分類する（癌症または健康）ステップと、を含む。

ＲＯＣ曲線の作成は従来の技術分野のソフトウエアまたはシステム、例えばＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医学統計ソフトウエア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER_POWER.SAS、CREATE_ROC.SAS、GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA)などを使用することができる。

肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング
医学分野における本発明の具体的な応用は、主に肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリングの方面に体現され、操作方法及び該方法を実現する器具−試薬キットを含む。周知のように、肝炎の疾病経過は肝癌転換と密接に関連し、典型的な疾病経過は肝炎（例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎）→肝硬化→肝癌である。本発明者の研究は、肝炎ウイルスの発現も肝癌検出の生物マーカーとすることができ、それをＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の発現と結合して結合検出を行うことによって肝癌診断の成功率を顕著に向上させることができる。よって、本発明はさらに肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング用方法を提供し、個体血液検体における肝炎の発現を検出するステップと、個体血液検体におけるＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の発現を検出するステップと、検出された肝炎ウイルス発現レベルとＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の発現レベルとに対して数学分析を行うステップと、数学分析の結果に基づき、測定された血液検体に対して分類を行い、肝癌の判断結果を下すステップと、を含み、このような結果は肝癌前期、肝癌中期、肝癌晩期などに分けることができる。

そのうち、肝炎ウイルスの発現は本技術分野の標準方法、例えば標準の血液検体検査試験紙法、血液検体検査試薬キット法、及びルーチンの血液検体化学分析法などを採用してもよい。

明らかに分かるように、血液検体における肝炎ウイルス発現、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２の発現を１つの試薬キットに整合して検出することによって、肝癌検出の便利性、時効性及び経済性が実現される。よって、本発明はさらに肝癌の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリング用結合検出試薬キットを提供し、少なくとも（１）肝炎ウイルス、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合できる抗体と、（２）肝炎ウイルス及び／またはＹＫＬ−４０及び／またはＭＡＳＰ２が（１）により限定された抗体に結合された時に、肝炎ウイルス及び／またはＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２に結合することができる標識抗体と、を含む。好ましくは、試薬キットはさらに、（３）既知量の肝炎ウイルス、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を含有する溶液によって構成され、遺伝子組換え微生物発現、動物またはヒトの体液から由来できる標準検体と、（４）報告方法とする酵素標識用試薬、例えばペルオキシダーゼ、または抗体と結合して抱合体を形成することができる蛍光標識のような測定用抗体標識と、を含む。

以下は個体の血清を検体として肝癌診断を行うことを例として、本発明に対してさらに説明する。

実施例１
検体の採取
浙江大学医学院第１付属病院でランダムに２５例の５０〜６０歳の肝癌患者の血清１ｍＬを採取して陽性対照とし、別に１５例の５０〜６０歳の健康ボランティアの正常血液検体１ｍＬを採取し、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の濃度測定を行う。

ＹＫＬ−４０含有量の測定
メーカーの指導に基づき、Ｑｕｉｄｅｌ社（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）のＹＫＬ−４０試薬キットを使用し、且つＢｉｏ−Ｒａｄ６８０型マイクロプレートリーダー（米国）で以下のステップを含むＥＬＩＳＡ操作を行う。

１．冷蔵条件に貯蔵した試薬キットを取り出し、放置し、温度を室温（２０〜２５℃)まで回復させ、検査待ちの検体総数と品質基準数を計算する。各検体は１つの抗原被覆ウェルが必要で、毎回の実験は陽性対照、陰性対照及び校正品が必要であり、必要なマイクロウェル数量を確定する。プレートバーの温度が室温までに上げられたときに、プレートバーの保護袋を開け、抗原被覆のマイクロウェルプレートバーを取り出す。今回の実験に必要がない試薬バーをこの新たに密封できる袋に入れ、密封し、再び２〜８℃に保存する。
２．順に２０μＬの標準液、対照液及び血清検体をマイクロウェルプレートに注入する。該プロセスは必ず３０分以内に完了しなければならない。
３．各マイクロウェルに１００μＬの捕捉液を注入し、ピペットでウェルにおいて繰り返して吹き出して均一に混合させる。
４．マイクロウェルプレート用蓋でカバーして、室温（１８〜２５℃)下で５５〜６５分間培養する。
５．以下のステップに従い、手動でプレートを３回洗浄する。
Ａ．激しく揺れ動かし、且つプレート内の液体を廃棄する。
Ｂ．ウェルに洗浄液をいっぱいに注ぎ、ウェルには残留気泡がないことを保証する。
Ｃ．前記２つのステップを２回繰り返す。
Ｄ．ウェルにおける洗浄液を揺れ動かし且つ除去し、全ての洗浄液を叩いて取り除くように、プレートを逆転してティッシュペーパーにおいて軽く叩く。マイクロウェルを観察し、残留の洗浄液がないことを確保する。
６．酵素標識抗体複合物のボトルに再生緩衝液７ｍＬを加え、室温下で保存して使用待ちとする。
７．希釈された酵素複合物を同様な順でマイクロウェルプレートに１００μＬを加える。
８．マイクロウェルプレート用蓋でカバーして、室温（１８〜２８℃)下で５５〜６５分間培養する。
９．基質を調製し、基質緩衝液に１枚の基質固体を加え、３０〜６０分後溶解され、激しく揺れ動かし、溶液を完全に混合させる。
１０．ステップ５におけるＡ〜Ｄの方法に従ってプレートを洗浄する。
１１．同様な速度及び順で基質溶液１００μＬを各ウェルに注入する。
１２．マイクロウェルプレートを室温（１８〜２８℃)下で５５〜６５分間培養させる。
１３．同様な速度及び順で停止液１００μＬを各ウェルに注入する。検体の完全な混合を確保するように、停止液を注入した後マイクロウェルプレートを軽く叩く。
１４．マイクロプレートリーダーの検出波長を４０５ｎｍに設定し、各ウェルのＯＤ値を検出する。停止液を加えた後の１５分以内にデータを取る。
１５．１つの直線検量線「Ｙ＝ｍｘ＋ｂ」によってＹＫＬ−４０またはＭＡＳＰ２の結果を分析する。
１６．検量線によって血清検体及び対照液におけるＹＫＬ−４０またはＭＡＳＰ２の濃度を読み出す。

結果
前記ステップによって得られた測定結果は表１に示す。

表１から分かるように、ＹＫＬ−４０の濃度と肝癌症状とが密接な関係性を有する。すなわち、肝癌患者の血清におけるＹＫＬ−４０蛋白の含有量が健康ボランティアの血清における含有量より顕著に高い。

ＲＯＣ曲線の作成
ＧＢＳＴＡＴＶ１０．０(Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD USA)システムを使用し、ＹＫＬ−４０蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してＲＯＣ曲線を作成し、且つ曲線下面積ＡＵＣを算出する。作成されたＲＯＣ曲線及び算出された曲線下面積（ＡＵＣ）は図１に示す。

図１に示すように、ＲＯＣ曲線のＡＵＣは０．９８である。ＹＫＬ−４０濃度の閾値が０．８７（ｎｇ／ｍＬ）であった時に、肝癌診断の感度が０．９２（すなわち９２％）で、１−特異性が０．８７（すなわち８７％）で、肝癌診断の成功率が０．９（すなわち９０％）である。

実施例２
ＭＡＳＰ２含有量の測定
実施例１と類似なステップを採用するが、異なるところは、メーカーの指導に基づき、オランダＨｙｃｕｌｔ生物技術公司（Ｕｄｅｎ，オランダ）のＭＡＳＰ２試薬キットを使用してＥＬＩＳＡ操作を行い、血清検体におけるＭＡＳＰ２蛋白の濃度を測定する。結果は表１に示す。

表１から分かるように、ＭＡＳＰ２の濃度と肝癌症状も密接な関係性を有する。すなわち、肝癌患者の血清におけるＭＡＳＰ２蛋白の含有量が健康ボランティアの血清における含有量より顕著に低い。

ＲＯＣ曲線の作成
ＧＢＳＴＡＴＶ１０．０システムを使用し、ＭＡＳＰ２蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してＲＯＣ曲線を作成し、且つ曲線下面積（ＡＵＣ）を算出する。図２に示す。

図２に示すように、ＭＡＳＰ２濃度の閾値が２９２．９（ｎｇ／ｍＬ）であった時に、肝癌診断の感度が０．８７で、１−特異性が０．７７で、実際の肝癌診断の成功率が０．８である。

実施例３
ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２を結合使用する。すなわち、ＧＢＳＴＡＴＶ１０．０システムを使用し、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２蛋白の含有量を変数にし、異なる閾値に基づいて癌診断の感度及び特異性に対してＲＯＣ曲線を作成し、且つ曲線下面積ＡＵＣを算出する。図３に示す。

図３に示すように、閾値が１２．５７（比の値）であった時に、診断の感度が１００％で、実際の肝癌診断の成功率が９０％である。今まで常用されているアルファ胎児性蛋白検出の成功率（ほぼ７０％）より遥かに高い。

また、図３と図１及び図２との比較から分かるように、閾値が１２．５７であった時に、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２を結合検出したときの肝癌診断の感度がいずれか１種のマーカーを単独に使用した時より高く（結合使用時の感度が１で、ＹＫＬ４０またはＭＡＳＰ２の単独使用時の感度がそれぞれ０．９２及び０．８７である）、実際の肝癌診断の成功率が９０％であった。

以上は独立なＹＫＬ４０またはＭＡＳＰ２試薬キットを使用してＥＬＩＳＡ操作を行い、肝癌診断を例として、ＹＫＬ４０及びＭＡＳＰ２を結合検出したときのＲＯＣ曲線を作成することによって、本発明の技術案に対して説明を行ったが、本発明の開示に基づき、本発明の方法は無論その他の一部の疾病の診断、予後評価、治療効果モニタリングまたは疾病経過のモニタリングに普及させることもでき、これは本発明分野の当業者にとって明らかであるため、本発明の思想に逸脱してない限り、本発明分野の当業者がこの上で行う種々の変更及び改訂は、本発明の範囲に属すべきである。

Claims

検体分類の正確性を向上する方法において、検体における蛋白ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合検出することを特徴とする検体分類の正確性を向上する方法。
前記結合検出は、
（１）検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量を検出するステップと、
（２）検出されたＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量に対して数学分析を行うステップと、
（３）数学分析の結果に基づき、測定検体に対して分類を行うステップと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の含有量がそれぞれ検出されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記数学分析はＲＯＣ曲線を作成することであり、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２蛋白含有量の比を変数にし、異なる閾値に基づいてＲＯＣ曲線を作成して曲線下の面積ＡＵＣを計算し、且つ所望の感度及び特異性に応じて測定検体に対して分類を行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
ＹＫＬ−４０とＭＡＳＰ２とのうちの少なくとも１つの含有量がＥＬＩＳＡ技術によって測定されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記検体は全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液及び涙から構成された群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
癌症の診断、予後評価、治療効果のモニタリング及び疾病経過のモニタリングに用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記癌症が肝癌であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するための試薬キットであって、
（１）ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合できる抗体と、
（２）ＹＫＬ−４０及び／またはＭＡＳＰ２が（１）により限定された抗体に結合された時に、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２に結合することができる標識抗体と、
を含む、試薬キット。
さらに、
（３）既知量のＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を含有する溶液によって構成される標準検体と、
（４）抗体と結合して抱合体を形成することができる測定用抗体標識と、
を含むことを特徴とする請求項９に記載の試薬キット。
個体の特定の組織または器官の癌症または疾病に対して診断、予後評価、治療効果のモニタリングまたは疾病経過のモニタリングを行う方法であって、
（１）個体の血液検体における癌症または疾病高発現の蛋白または遺伝子を測定するステップと、
（２）血液における、特定組織または器官の特異的な蛋白または遺伝子の低発現を測定するステップと、
（３）検出された蛋白含有量または遺伝子発現結果に対して数学分析を行うステップと、
（４）数学分析結果に基づき、測定された個体検体に対して分類を行い、癌症または疾病の診断結果を下すステップと、
を含む、方法。
肝癌の診断、予後評価、治療効果のモニタリングまたは疾病経過のモニタリング用方法であって、
（１）個体の血液検体における肝炎ウイルスの発現を測定するステップと、
（２）個体の血液検体におけるＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の発現を測定するステップと、
（３）検出された肝炎ウイルス発現レベルと、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２の発現レベルに対して数学分析を行うステップと、
（４）数学分析結果に基づき、測定された血液検体に対して分類を行い、肝癌の判断結果を下すステップと、
を含む、方法。
請求項１２に記載の方法を実施するための試薬キットであって、
（１）肝炎ウイルス、ＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２を結合できる抗体と、
（２）肝炎ウイルス及び／またはＹＫＬ−４０及び／またはＭＡＳＰ２が（１）により限定された抗体に結合された時に、肝炎ウイルス及び／またはＹＫＬ−４０及びＭＡＳＰ２に結合することができる標識抗体と、
を含む、試薬キット。