CN102667486B - 羊膜内感染的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可以用于非侵入性诊断羊膜内感染的生物标记和生物标记集合或组合基团的鉴定，和使用此类生物标记的诊断测定法。

Description

羊膜内感染的检测
技术领域
本发明涉及用诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的试验。本发明进一步涉及试验、诊断算法、生物标记、材料、方法及装置，它们与用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的生物标的用途有关并且为此类诊断提供诊断性试验系统，和如本文所述的多种其他实施方案。
背景技术
早产是生命头一个月中死亡的主导原因并且在超过三分之一全部婴儿死亡案例中是助长原因。羊膜内感染(IAI)是妊娠不足37周时特发性早产的主导原因之一。与早产(pretermbirth)相关的其他病状包括未足月分娩(pretermlabor)、早产胎膜破裂、先兆子痫、陡变、前置胎盘、胎儿生长迟缓、羊膜液体积过多或不足、胎儿畸形、子宫内出血、糖尿病、药物滥用和应激。未足月分娩和早产的控制措施可以包括用抗分娩剂(tocolyticagent)治疗和视病情用促进胎儿肺成熟的皮质类固醇治疗。对于B组链球菌覆盖率待定的阴性培养结果，可以开具窄谱抗生素。
IAI是特发性未足月分娩和早产的最重要病因之一。IAI是羊膜腔的微生物性侵入并且在10-15%全部未足月分娩病例中发生。(NewtonER.ClinObstetGynecol1993;36(4):795-808；WattsDH等人，ObstetGynecol1992;79:351-7；RomeroR等人，AmJObstetGynecol1993;169:805-16；HillierSL等人，ObstetGynecol1993;81:941-8)。用来描述伴有或不伴有完整胎膜的IAI的其他术语包括：羊膜液感染、羊膜炎和临床绒毛膜羊膜炎。除IAI作为未足月分娩的一个病因之外，IAI还与增加的新生儿发病率和死亡率相关，特别在未足月的初生婴儿当中是如此。通常，已经在患有IAI的母亲产下的低出生体重初生婴儿当中观察到3至4倍围产期死亡率增加。还存在呼吸窘迫综合征、心室内出血和新生儿败血症的增加。(Morales,W.J.Obstetrics和Gynecology70:183，1987)。IAI已经独立地牵涉新生儿脑室周围白质软化病和脑瘫；大脑白质损伤和脑瘫的风险在IAI的背景下大9倍。(Bejar，R.等人，Am.J.Obstet.Gynecol.159:357，1988；Grether，J.K.和Nelson，K.B.JAMA278:207，1997)。
大部分IAI病例(80%至90%)是亚临床的(无症状的)，而不是未足月分娩。目前，特发性未足月分娩的控制措施包括观察、用抗分娩剂治疗和可能通过羊膜腔穿刺术证实IAI。单独的羊膜液培养低估IAI的真实患病率，原因是存在不可培养的微生物、难以分离苛养性微生物和既往抗生素疗法(Romero，R.等人，Am.J.Obstet.Gynecol.161:817，1989)。本发明的阳性IAI试验将为临床医生可用的当前诊断及治疗方案提供有用辅助。IAI的精确诊断对于用靶向抗生素(targetedantibiotics)恰当治疗母体、保持抗分娩疗法(其在IAI中是禁忌)以及预定母体的分娩地点和必要的婴儿护理水平是重要的，其中所述婴儿可能因IAI的过度后果而是非常未足月的并且患病。
本发明的阴性IAI试验提供这样的再保证：未足月分娩的病因学可能来自感染之外的来源。阴性试验，连同其他体征和/或症状的30种观察结果，允许医师治疗未足月分娩。
发病机理和风险因素：羊膜内感染可能因下生殖道微生物的上行感染而发生。IAI的患病率与孕龄强烈地反相关。(WattsDH等人，ObstetGynecol1992;79:351-7)。从10-20%具有完整羊膜、没有IAI临床体征的全部未足月分娩妇女的羊膜液中(RomeroR等人，AnnNYAcadSci1991;622:355-75)和在至多到67%在妊娠第23-24周终结怀孕的未足月分娩妇女中回收下生殖道天然具有的细菌。(WattsDH等人，ObstetGynecol1992;79:351-7)。另外，这些观察结果得到组织学绒毛膜羊膜炎支持，其中已经在60-90%第20和24周之间终结的妊娠中发现所述组织学绒毛膜羊膜炎。这些观察结果支持这样的假设：IAI是特发性未足月分娩的重要病因，尤其在早期孕龄时。
诊断：IAI的早期诊断可能允许及时的治疗和介入。然而，在形成正确诊断方面存在诸多难题。从临床观点看，早期诊断存在问题，因为IAI的临床体征和症状在感染期晚期出现，并且是常见和非特异性的。常用来诊断IAI的临床标准包括未足月分娩伴随母体发热(≥37.8℃)，连同以下项中两项或更多项：母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体或胎儿心动过速、子宫压痛或腐臭味羊膜液。(GibbsRS等人，AmJObstetGynecol1980;136(6):709-13)。在Watts等人对未足月分娩妇女的研究中，具有或不具有阳性羊膜液培养的妇女之间在平均最高母体温度、WBC计数和鉴别方面没有差异。亚临床IAI是用来描述下述IAI的术语，在所述IAI中体征和症状在大约88%具有阳性羊膜液培养的病例中最少或不存在。(WattsDH等人，ObstetGynecol1992;79:351-7)。亚临床IAI的概念进一步由Gravett等人使用非人灵长类模型时的研究结果确证。这些研究者证明，在用B组链球菌引起的实验性IAI后，发热和白细胞增多仅在感染引起的未足月分娩发作的50%时间存在，所述的发作在实验性感染后28至40小时出现。(GravettMG等人，AmJObstetGynecol1994;171(6):1660-7)。
因为临床特征的不一致性，已经其他辅助性实验室试验来帮助诊断IAI。这些试验包括：测量母体C反应蛋白、直接对羊膜液检查白细胞或在革兰氏染色时检查细菌、羊膜液培养、测量羊膜液的葡萄糖浓度、检测羊膜液的白细胞酯酶、通过气-液相色谱检测细菌有机酸、测量多种羊膜液的细胞因子(例如，白介素2、4、6、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子-α)、基质金属蛋白酶-9、乳铁蛋白和铜鼓超声波扫描术评估胎儿活动性(生物物理图谱)。细胞因子或其他生物化学因子的测量是昂贵的，通常在临床上不可用，并且主要作为研究工具。另外，这些试验的检验效率并不总是比更容易获得的传统试验如羊膜液革兰氏染色和培养、羊膜液的葡萄糖浓度和检测羊膜液的白细胞酯酶好。先前已经回顾了这些试验的效率。(Ohlsson，A.和Wang，E.:Ananalysisofantenatalteststodetectinfectionatpretermruptureofthemembranes.AmericanJournalofObstetricsandGynecology162:809，1990)。虽然它们均具有合理的灵敏度、特异性和预示值，但是若在诊断IAI时不依赖于临床特征而利用时，则没有一个试验是足够灵敏或特异的。
因此，迫切需要允许早期和精确诊断的IAI新方法。
发明概述
本发明涉及用诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的试验。本发明进一步涉及可以用于非侵入性诊断羊膜内感染(IAI)的生物标记和生物标记集合或组合基团的鉴定和检测，和使用此类生物标记的诊断测定法，包括基于使用三种蛋白质生物标记的独特组合诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的非侵入性试验。本发明一般地涉及用来创建实验室开发的羊膜内感染试验和体外诊断装置的材料和方法并且涉及在IAI的诊断中具有临床用途的生物标记。具体而言，本发明涉及用来创建体外诊断装置以通过分析生物学样品(如从孕妇获得的宫颈阴道液(CVF))诊断IAI或评估其风险的材料和方法。特别地，本发明涉及生物标记，其中所述生物标记具有利用一种基于宫颈阴道棉拭子的非侵入性免疫诊断试验以高的准确度预测IAI存在的能力，尤其与诊断算法组合使用时。与诊断算法联合使用时，这种独特的标记组合具有利用一种基于宫颈阴道棉拭子的非侵入性免疫诊断试验以高的准确度预测IAI存在的能力。
在一个实施方案中，本发明提供新的生物标记组，其中所述生物标记组可以被测量并且用来确定IAI在怀孕雌性哺乳动物受试者中的存在或不存在。
在一个方面，本发明提供用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，本发明的方法包括测量所述蛋白质中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部的丰度。
在一个方面，本发明提供用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述样品中的每个所述水平相对于所述蛋白质中每一者在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，本发明的方法包括测量所述蛋白质中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部的水平。
在一个实施方案中，测量的生物标记包括生长调节的癌基因α(GRO-a)和巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)。在另一个实施方案中，测量的生物标记包括生长调节的癌基因α(GRO-a)和α-1-酸性糖蛋白(A1AG)。在又一个实施方案中，测量的生物标记包括α-1-酸性糖蛋白(A1AG)和巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)。在这些实施方案中，测量的其他生物标记可以包括α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和/或金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在其他实施方案中，测量的生物标记可以包括IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)。
在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)和生长调节的癌基因α(GRO-a)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP1)和巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)和α-1-酸性糖蛋白(A1AG)。在这些实施方案中，测量的其他生物标记可以包括白介素-6(IL-6)。
在某些实施方案中，测量的生物标记包括α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括白介素-6(IL-6)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、脂多糖结合蛋白(LBP)、生长调节的癌基因α(GRO-a)和α-甲胎蛋白(AFP)。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：测量选自巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)中的两种或更多种蛋白质的蛋白质的水平，并且如果在宫颈-阴道液样品中，所检定的蛋白质的两种或更多种相对于正常宫颈-阴道液显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在一个实施方案中，本发明的方法包括：测量选自巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)的两种或更多种蛋白质中每一者的水平，并且如果在宫颈-阴道液样品中，所检定的蛋白质的两种或更多种中每一者的水平相对于正常宫颈-阴道液中相应的蛋白质水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在某些实施方案中，本发明的方法包括如果在宫颈-阴道液样品中，全部所述检定的蛋白质的水平相对于所述蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在全部实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以由免疫测定法测定。在某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用蛋白质阵列测定。在某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用免疫色谱试验装置测定。在使用免疫色谱试验装置的某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用包括一个或多个色谱测试条的免疫色谱试验装置测定。在使用免疫色谱试验装置的某些实施方案中，免疫色谱试验装置是横向流装置。
在某些实施方案中，本发明提供了一种免疫色谱试验装置，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的两个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置包含测试条，所述测试条包含针对两种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。
在某些实施方案中，本发明提供一种免疫色谱试验装置，其包含用于检测三种或更多种蛋白质的三个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置包含测试条，所述测试条包含针对三种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。
在另一个方面，本发明提供一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得宫颈-阴道液样品；(b)相对于两种或更多种蛋白质中每一者在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，确定所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和如果确定所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述样品中的相应水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在另一个方面，本发明提供一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，所述方法包括
(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和
(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，所述体征和症状包括，但不限于母体发热(≥37.8℃)、母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
在另一个方面，本发明提供一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，所述方法包括
(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平或相对于所述两种或更多种蛋白质在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和
(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，所述体征和症状包括，但不限于母体发热(≥37.8℃)、母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
在一个方面，本发明涉及一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，所述方法包括：
(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的水平；和
(b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-1在所述样品中的每个所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-1在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-1中每一者在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在一个实施方案中，受试者是人患者。
在另一个实施方案中，使用适应于确定蛋白质水平的装置，进行检定。
在又一个实施方案中，通过使用由合适处理器执行的软件程序，进行检定。
在又一个实施方案中，该程序体现于有形介质上存储的软件中。
仍在另一个实施方案中，有形介质选自闪盘、CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。
在一个不同实施方案中，所述方法还包括准备一份记录所述检定或诊断结果的报告的步骤，其中所述报告可以记录或存储在有形介质上，如纸、闪盘、CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将所述诊断的结果传达至利益方，例如患者或主治医师的步骤。在多个实施方案中，所述传达以书面、通过电子邮件或电话进行。
在又一个实施方案中，通过免疫测定法确定蛋白质水平。
在又一个实施方案中，通过免疫测定法确定蛋白质水平，所述免疫色谱试验可以使用横向流装置。
在另外其他实施方案中，通过质谱法或通过使用蛋白质阵列确定蛋白质水平。
在另一个方面，本发明涉及一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的抗体和试剂。
在又一个方面，本发明涉及一种免疫色谱试验装置，其包含用于用于检测α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的一个或多个色谱条。
在一个实施方案中，在免疫色谱试验装置中，所述测试条或多个测试条包含针对α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的抗体。
在另一个实施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。
在又一个方面，本发明涉及一份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括
(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的水平；和
(b)如果确定所述水平相对于正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在又一个方面，本发明涉及一份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括
(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的水平；和
(b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-1的每个所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-1在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-1在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在又一个方面，本发明涉及有形介质，其存储基于下述试验的结果和/或诊断，所述试验包括
(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的水平；和
(b)如果确定所述水平相对于正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在某些实施方案中，使用适应于确定所述蛋白质的水平的装置，进行测量。在又一个实施方案中，通过使用由合适处理器执行的软件程序，进行测量。在某些实施方案中，该程序体现于有形介质上存储的软件中。仍在某些其他实施方案中，有形介质选自CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。
在某些实施方案中，本发明的方法还包括准备一份记录所述检定或诊断的结果的报告的步骤。在一个实施方案中，该报告记录或存储在有形介质上。在具体实施方案中，有形介质是纸。在另一个实施方案中，有形介质选自、CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。
在某些其他实施方案中，本发明的方法还包括将所述诊断的结果传达至利益方的步骤。在一个实施方案中，利益方是患者或主治医师。在另一个实施方案中，所述传达以书面、通过电子邮件或电话进行。
在另一个方面，本发明提供一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在一个实施方案中，该免疫测定试剂盒包含用于检测本文中鉴定的全部蛋白质的抗体和试剂。
在另一个方面，本发明提供一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。在一个实施方案中，该免疫测定试剂盒包含用于检测本文中鉴定的全部蛋白质的抗体和试剂。
在又一个方面，本发明提供一种免疫测定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。
在另一个方面，本发明提供一份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
在另一个方面，本发明提供有形介质，其存储基于下述试验的结果和/或诊断，所述试验包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)；和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
附图简述
图1描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中GROα(测定法1)的自然对数值。
图2描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MIP1b的自然对数值。
图3描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MCP-1的自然对数值。
图4描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中B2MG的自然对数值。
图5描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中TIMP-1的自然对数值。
图6描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中A1AG的自然对数值。
图7描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中IL-6的自然对数值。
图8显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中LBP的自然对数值。
图9描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中AFP的自然对数值。
图10描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中VCAM-1的自然对数值。
图11描述用于预测IAI与非IAI的三标记模型的AUROC。灵敏度是86%，特异性是85%。
图12描述用于预测IAI与非IAI的五标记模型的AUROC。灵敏度是x%并且特异性是y%。
图13描述针对复合IAI状态的生物标记Z评分水平0或1。
图14描述13图中显示的数据，将所述数据以灵敏度对1-特异性作图，AUROC为0.86。灵敏度是82%，特异性是85%，PPV是33%并且NPV是98%。
图15描述Kaplan-Meier图，其显示由CVF状态和AF感染状态所致的距分娩时间。
图16描述针对复合IAI状态的生物标记Z评分水平0或1。
图17描述16图中显示的数据，将所述数据以灵敏度对1-特异性作图，AUROC为0.88。灵敏度是82%，特异性是89%，PPV是41%并且NPV是98%。
发明详述
定义
应当理解，本发明不限于具体的方法或方案，它们当然可以变动。还应当理解本文中所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不旨在限制。如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”的术语，例如，任选包括复数指称，除非上下文另外清楚地说明。因而，例如，对“一个探针”的指称任选地包括多个探针分子；类似地，根据上下文，术语“一个核酸”的用途任选地包括，实际而言，包括该核酸分子的众多副本。根据上下文，基因或蛋白质的字母命名可以指基因形式和/或蛋白质形式。通过参考本文中的序列、已知序列和遗传密码，技术人员完全能够联系相关生物学分子的核酸形式和氨基酸形式。
除非另外限定，否则本文中所用的技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(NewYork，N.Y.1994)为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指南。
术语“对应”和“相应”和语法等同物在本文中用来指类似或相似的物质；例如，当提到蛋白质的两种混合物时，第一混合物中的蛋白质A对应于第二混合物中的蛋白质A，并且是第二混合物中蛋白质A的相应蛋白质；第一混合物中的蛋白质B对应于第二混合物中的蛋白质B，并且是第二混合物中蛋白质B的相应蛋白质；如此类推。
术语“蛋白质组”在本文中用来描述在给定时间在生物学样品中的蛋白质的主要部分。蛋白质组的概念与基因组根本不同。基因组实际上是静态的，而蛋白质组应答于内部和外部事件而持续变化。
术语“蛋白质组图谱(proteomicprofile)”用来指在给定时间在生物学样品例如生物流体中多种蛋白质的表达模式的表述。蛋白质组图谱可以例如表述为质量谱，但是还包括基于蛋白质的任何物理化学特征或生物化学特征的其他表述。因而蛋白质组图谱可以例如基于蛋白质的电泳特征的差异，如二维凝胶电泳例如2-DPAGE所测定，并且可以例如表述为二维电泳凝胶中的多个点。差异性表达谱可能具有重要的诊断价值，即使在特异性鉴定的蛋白质不存在的情况下也是如此。可以随后例如通过免疫印迹法检测到单一蛋白质点，使用蛋白质微阵列检测到多个点或多种蛋白质。蛋白质组图谱一般描述或含有这样的信息，其可能是几个峰至代表50个或更多个峰的复杂图谱。因而，例如，蛋白质组图谱可以含有或代表至少2种、或至少5种或至少10种或至少15种、或至少20种、或至少25种、或至少30种、或至少35种、或至少40种、或至少45种、或至少50种、或至少60种、或至少65种、或至少70种、或至少75种、或至少80种、或至少85种、或至少85种、或至少90种、或至少95种、或至少100种、或至少125种、或至少150种、或至少175种、或至少200种蛋白质。
术语“病理学病状”以最广泛的意义使用并且涵盖损害受试者健康的全部变化和现象。母体病理病状包括，而不限于羊膜内感染、胎儿或母体源病状，如例如先兆子痫和未足月分娩和分娩。胎儿病理病状态包括，而不限于染色体缺陷(非整倍性)如Down综合征和在孕龄及胎儿成熟方面的全部异常。
术语“[母体或胎儿]病理学病状的状态”在本文中以最广泛的含义使用并且指所述病理学病状的不存在、存在、范围、阶段、本质、进展或消退。
术语“独特表达标签”用来描述生物学样品(例如参比样品)的蛋白质组图谱内部的独特的特征或基序，其以统计显著的方式与相应的正常生物学样品(从相同类型来源获得，例如，生物学流体)的蛋白质组图谱不同。
术语“羊膜内感染(IAI)”、“羊膜液感染”、“羊膜炎”、“和"临床绒毛膜羊膜炎”互换使用，并且指妊娠期间羊膜液和子宫内容物的急性感染，包括，但不限于细菌性急性感染。
“患者应答”可以使用显示该患者获益的任何终点来评估，所述终点包括而不限于，(1)抑制病理学病状进展，至少到某种程度，(2)预防该病理学病状、(3)减轻一种或多种与该病理学病状相关的症状，至少至某种程度；(4)治疗后存活时间长度的增加；和/或(5)治疗后在给定时间点下降的死亡率。
术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止措施，其中目的是防止或减缓(减轻)所指向的病理学状况或病症。需要治疗的那些患者包括已经患有该病症的那些患者以及易于患有该病症的那些患者或待预防该病症的那些患者。
“先天畸形”是非遗传但出生就存在的畸形。
如本文所用的任何具体蛋白质名称包括全部片段、前体和天然存在的变体，如可变剪接的和等位变体和同工型，以及所命名蛋白质的可溶性形式，连同其他物种中的天然序列同源物(包括全部天然存在的变体)。因而，例如，当描述了检定巨噬细胞炎性蛋白1β(Swiss-Prot登录号P13236)的丰度时，这个描述具体地包括检定以Swiss-Prot登录号13236列出的蛋白质的任何片段、前体或天然存在变体，以及该蛋白质的非人类同源物及其天然存在的变体，如果受试者是非人类受试者。
详述
本发明涉及基于母亲或胎儿的生物学流体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入地检定母体和胎儿病状的方法和手段。具体而言，本发明基于蛋白质标记的发现，所述蛋白质标记差异性地存在于IAI患者及对照受试者的样品中，和这种发现在用于确定IAI存在或不存在的方法和试剂盒中的应用。这些蛋白质标记在来自IAI患者的样品中存在的水平与来自非IAI患者的样品中存在的水平不同。因而，存在于试样中的两种或更多种标记与对照相比的量或两种或更多种标记在该试样中的存在或不存在提供了关于该患者的IAI状态方面的有用信息。
本发明还涉及基于母亲或胎儿的生物学流体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入地检定母体和胎儿病状的方法和手段。具体而言，本发明提供了通过测量从孕妇或胎儿获得的生物学流体如宫颈阴道液(CVF)中的α-甲胎蛋白(α-甲胎蛋白)、白介素-6(IL-6)和胰岛素生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)，早期和可靠检测IAI的诊断试验和预后试验。
本发明是进一步基于这样的发现：将受试者体征和症状，例如母体发热(≥37.8℃)、母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体或胎儿心动过速、子宫压痛或腐臭味羊膜液并入诊断算法可用于确定IAI是否存在或不存在。
本发明利用本领域熟知的蛋白质组技术，如在例如以下教材中所述的蛋白质组技术，所述教材的内容在此明确地通过引用方式并入：ProteomeResearch:NewFrontiersinFunctionalGenomics(PrinciplesandPractice)，M.R.Wilkins等人编著，SpringerVerlag，1007；2-DProteomeAnalysisProtocols，AndrewLLink编著，HumanaPress，1999；ProteomeResearch:Two-DimensionalGelElectrophoresisandIdentificationMethods(PrinciplesandPractice)，T.Rabilloud编著，SpringerVerlag，2000；ProteomeResearch:MassSpectrometry(PrinciplesandPractice)，P.James编著，SpringerVerlag，2001；IntroductiontoProteomics，D.C.Liebler编著，HumanaPress，2002；ProteomicsinPractice:ALaboratoryManualofProteomeAnalysis，R.Westermeier等人，编著，JohnWiley&Sons，2002。
本领域技术人员会认出与本文所述的那些方法和材料相似或等同的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实施。实际上，本发明无论如何不限于至所述的方法和材料。
1.鉴定生物学流体中所表达的蛋白质和多肽
根据本发明，可以使用本领域已知的多种方法进行生物学流体的蛋白质组分析。生物学流体包括例如宫颈-阴道液(CVF)、脐带血、新生血清、脑脊液(CSF)、羊膜液、血清、血浆、尿、脑脊液、母乳、粘液、唾液和汗。
一般，比较不同来源的样品(如正常生物学流体(正常样品)和试验生物学流体(试样))的蛋白谱(蛋白质组图)以检测在发病时上调或下调的蛋白质。随后可以将这些蛋白质切下以用于鉴定和充分表征，例如，使用免疫测定法、肽指纹法和/或质谱法和测序方法，或可以将正常和/或疾病特异性蛋白质组图直接用于诊断目的疾病，或用来证实该疾病的存在或不存在。
在对比分析中，重要的是以完全相同的方式处理正常样品和试样，目的是正确地描述蛋白质的相对水平或丰度并且获得精确的结果。需要的总蛋白量将取决于所用的分析技术和可以由本领域技术人员轻易地决定。存在于生物学样品中的蛋白质一般根据它们的pI和分子量的二维凝胶电泳(2-DE)分离。使用等电聚焦法(一种二维凝胶电泳方法)，蛋白质首先因其电荷而分离。这个步骤可以例如使用可商业获得的固定化pH梯度(IPG)胶条来实施。第二维度是正常SDS-PAGE分析，其中聚焦的IPG胶条用作样品。在2-DE分离后，蛋白质可以用常规染料如考马斯蓝或银染法显现，并且使用已知的技术和设备(例如均可商业获得的Bio-Rad10GS800光密度计和PDQUEST软件)成像。
随后将各个点从凝胶中切下、脱色并且进行胰蛋白酶消化。可以通过质谱法(MS)分析肽混合物。或者，可以将肽分离，例如通过毛细管高压液相色谱(HPLC)分离，并且可以通过MS逐一地或以汇集物形式分析。
质谱仪由离子源、质量分析仪、离子探测器和数据采集装置组成。首先，在离子源中将肽电离。随后，电离的肽根据它们的质荷比在质量分析仪中分离，并且随后检测分开的离子。质谱法已经广泛地用于蛋白质分析中，尤其自基质辅助激光解吸附电离/时间飞行(MALDI-TOF)和电喷雾电离(ESI)方法的发现起。存在几种形式的质量分析仪，包括例如MALDI-TOF和三重或四极杆-TOF，或与ESI偶联的离子阱质量分析仪。因而，例如，一种Q-Tof-2质谱仪利用了允许同时检测横跨整个质量谱范围的离子的直交式时间飞行分析仪。对于进一步细节，见，例如，Chemusevich等人，J.MassSpectrom.36:849-865(2001)。根据需要，可以通过本领域已知的技术如质谱法的某些变型或Edman降解法，测定肽片段的氨基酸序列并且最终测定衍生所述肽片段的蛋白质的氨基酸序列。
2.羊膜内感染和相关并发症的早期检测
羊膜内感染(IAI)是妊娠期间羊膜液和子宫内容物的急性细菌性感染。前瞻性研究表明，IAI在4%至10%的全部分娩案中发生(Newton，E.R.，Prihoda，T.J.和Gibbs，R.S.:Logisticregressionanalysisofriskfactorsforintra-amnioticinfection.Obstet.Gynecol.73:571，1989；Soper，D.E.，Mayhall，C.G.,和Dalton，H.P.:Riskfactorsforintraamnioticinfection:aprospectiveepidemicologicstudy.AmericanJournalofObstetricsandGynecology161:562，1989；以及Lopez-Zeno，J.A.，Peaceman，A.M.，Adashek，J.A.和Socol，M.L.:Acontrolledtrialofaprogramfortheactivemanagementoflabor.N.Engl.J.Med.326:450，1992)。用来描述IAI的其他术语包括：羊膜液感染、羊膜炎和临床绒毛膜羊膜炎。羊膜内感染在临床上通过母体发热、子宫压痛、白细胞增多、和胎儿心动过速诊断并且应当与组织学绒毛膜羊膜炎区分。羊膜内感染是母体和新生儿发病率的重要原因。羊膜内感染占围产期内10-40%的热病发病率并且与20-40%的早期新生儿败血症和肺炎病例相关(Newton，E.R.:Chorioamnionitisandintraamnioticinfection.Clin.Obstet.Gynecol.36:795，1993)。母体菌血症在2-6%的IAI患者中出现，并且产后期感染性发病率是增加。IAI患者当中还存在增加的功能障碍性分娩和剖宫产风险。Duff等人报道了分娩时发生羊膜内感染的患者当中75%的功能障碍性分娩发生率和34%剖宫产的发生率(Duff，P.，Sanders，R.和Gibbs，R.S.:Thecourseoflaborintermpregnancieswithchorioamnionitis.AmericanJournalofObstetricsandGynecology147:391，1983)。羊膜内感染还与增加的新生儿发病率和死亡率相关，特别在未足月的初生婴儿当中是如此。通常，在患有IAI的母亲产下的低出生体重初生婴儿当中存在3至4倍围产期死亡率增加(Gibbs，R.S.，Castillo，M.A.和Rodgers，P.J.:ManagementofAcuteChorioamnionitis.AmericanJournalofObstetricsandGynecology136:709，1980；Gilstrap，L.C.，III，Leveno，K.J.，Cox，S.M.，Burris，J.S.，Mashburn，M.和Rosenfeld，C.R.:Intrapartumtreatmentofacutechorioamnionitis:impactonneonatalsepsis.Am.J.Obstet.Gynecol.159:579，1988)。还存在呼吸窘迫综合征、心室内出血和新生儿败血症的增加(Morales，W.J.:Theeffectofchorioamnionitisonthedevelopmentaloutcomeofpreterminfantsatoneyear.ObstetricsandGynecology70:183，1987)。最近，IAI已经独立地牵涉新生儿脑室周围白质软化病和脑瘫；大脑白质损伤和脑瘫的风险在羊膜内感染的背景下大9倍(Bejar，R.，Wozniak，P.，Allard，M.，Benirschke，K.，Vaucher，Y.，Coen，R.，Berry，C.，Schragg，P.，Villegas，I.和Resnik，R.:Antenataloriginofneurologicdamageinnewborninfants.I.Preterminfants.Am.J.Obstet.Gynecol.159:357，1988；Grether，J.K.和Nelson，K.B.:Maternalinfectionandcerebralpalsyininfantsofnormalbirthweight.JAMA278:207，1997)。最后，已经在至少10%具有完整胎膜的发生未足月分娩的妇女中发现亚临床IAI中，这表明IAI是重要的和潜在可预防的早产病因(Romero，R.，Avila，C.，Brekus，C.A.和Morotti，R.:Theroleofsystemicandintrauterineinfectioninpretermparturition.AnnualsoftheNewYorkAcademyofSciences622:355，1991)。Newton的文献综述显示临床IAI的发生率在小于27周的孕龄时是41%，在27-37周的孕龄时是15%，并且在27-37周的孕龄时是2%(Newton等人，上文)。也已经从10-20%具有完整胎膜、没有羊膜内感染临床体征的全部未足月分娩妇女的羊膜液中(Romero等人，上文)和在至多到67%在第23-24周终结怀孕的未足月分娩妇女中回收下生殖道天然具有的细菌(Watts，D.H.，Krohn，M.A.，Hillier，S.L.和Eschenbach，D.A.:Theassociationofoccultamnioticfluidinfectionwithgestationalageandneonataloutcomeamongwomeninpretermlabor.ObstetGynecol79:351，1992)。大部分这些患者快速地分娩，并且在许多患者中临床上明显的IAI形成。这些观察结果支持这样的假设：递增的起初亚临床的子宫内感染先于未足月分娩并且可能极端未足月分娩的重要原因。
将未足月分娩定义为在完成妊娠第37周之前的出生。在美国，早产的发生率是10-11%全部活胎产，并且正在增加，即便积极治疗未足月分娩。总体上，早产及其后果导致80%不归咎于先天畸形的围产期死亡，并且增加每年大约50亿美元国民保健预算。早产的风险因素包括非白人种族、幼龄、低下社会经济地位、母体重量低于55kg、未经产、头三个月出血、多胎妊娠(MeisPJ，MichielutteR，PetersTJ，等人FactorsassociatedwithpretermbirthinCardiff，Wales:II.Indicatedandspontaneouspretermbirth.AmJObstetGynecol173:597-602，1995)。
不幸地是，对存在自发性早产风险的患者的预测总体上令人失望(CreasyRK，IamsJD.引自Maternal-FetalMedicine，CreasyRK，ResnikR(编著).W.B.SaundersCompany，Philadelphia，Pa.第4版，1999.第498-531页)。在定义存在最大早产风险的群体并且因此可能从早期介入治疗中受益时，先前的工作已经包括风险评定指标、生物化学检测宫颈胎纤连蛋白、超声测量宫颈长度和子宫活动性居家监测。这些方案既昂贵，还受阻于不能准确预测哪些患者可能从早期介入治疗或预防中获益。全部方案均受大约30%不良阳性预示值困扰，其中大部分患者被鉴定“存在足月分娩风险”。介入治疗，包括药理学治疗以抑制宫缩，是有效的，但是取决于早期和可靠的未足月分娩诊断。因此需要可鉴定存在最大早产风险的患者的早期和可靠标记以减少与早产相关的巨大费用和新生儿死亡率和发病率。
3.使用生物学流体中的生物标记早期检测和诊断羊膜内感染
A)本发明提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析生物学流体如宫颈-阴道液(CVF)、羊膜液、血清、等离子体、尿、脑脊液、母乳、粘液或唾液来诊断羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过免疫测定法或一组免疫测定法诊断羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析CVF来诊断羊膜内感染。
通过非限制性实例，本发明提供了用于诊断怀孕雌性受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括检定从所述受试者获得的母体宫颈阴道液样品中一种或多种蛋白质的水平或量，其中所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)。羊膜内感染的诊断可以基于所述蛋白质在定义为IAI阳性的患者试样及不存在IAI的对照试样中的水平、量或丰度的统计显著差异。在某些实施方案中，可以通过受试者的体征和症状并入诊断算法来增强羊膜内感染的诊断。例如，可以在诊断算法中包括掺入这样的体征和症状，它们包括，但不限于母体发热(≥37.8℃)、母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
表1：IAI的生物标记
登录号 ID 蛋白质 SEQ ID NO
P09341 GRO-a 生长调节的癌基因α 1
P13236 MIP1b 巨噬细胞炎性蛋白1β 2
P02763 A1AG α-1-酸性糖蛋白 3
P02771 AFP α-甲胎蛋白 4
P05231 IL-6 白介素-6 5
P18428 LBP 脂多糖结合蛋白 6
P19320 VCAM-1 血管细胞黏附分子-1 7
P13500 MCP-1 单核细胞趋化肽-1 8
P61769 B2MG β-2-微球蛋白 9
P01033 TIMP-1 金属蛋白酶-1组织抑制剂 10
如上文指出，在本发明的上下文中术语“蛋白质组图谱”用来指在给定时间在生物学样品例如生物流体中多种蛋白质的表达模式的表述。蛋白质组图谱可以例如表述为一组免疫测定法结果，但是还包括基于蛋白质的任何物理化学特征或生物化学特征的其他表述。虽然可以鉴定存在于生物学流体的蛋白质组中的全部或一些蛋白质并且将它们测序，但是对于根据本发明产生的蛋白质组图谱的诊断用途而言，这不是必需的。特定疾病的诊断可以基于当待诊断的疾病或病理学病状存在时，正常蛋白质组图谱和在相同环境下获得的相同生物学流体的蛋白质组图谱之间的特征性差异(独特表达标签)。独特表达标签可以是试验生物学样品或参比生物学样品的蛋白质组图谱内部独特的特征或基序，其以统计显著的方式与从相同类型来源获得的相应正常生物学样品的蛋白质组图谱不同。从哺乳动物受试者获得的试样的蛋白质组图谱与参比样品的蛋白质组图谱比较，所述参比样品包含作为母体或胎儿病理学病状之特征的独特表达标签，如果所述哺乳动物受试者与该参比样品共有独特表达标签，则诊断该哺乳动物受试者存在这种病理学病状。
可以通过比较从待诊断的受试者获得的生物学流体的蛋白质组图谱与以相同方式获得和处理的相同类型正常生物学流体的蛋白质组图谱，诊断出特定的母体/胎儿病理学病状。如果该试样的蛋白质组图谱与正常样品的蛋白质组图谱基本上相同，则认为该受试者未患有主题母体/胎儿病理学病状。如果该试样的蛋白质组图谱相对于正常样品的蛋白质组图谱显示出独特表达标签，则诊断该受试者患有所讨论的母体/胎儿病理学病状。
可选或额外地，试样的蛋白质组图谱可以与参比样品的蛋白质组图谱比较，其中，所述参比样品从被独立诊断患有所讨论的母体/胎儿病理学病状的受试者的生物学流体中获得。在此情况下，如果该试样的蛋白质组图谱与参比样品的蛋白质组图谱共有至少一个表示独特表达标签的特征或特征组合，则诊断该受试者患有所述病理学病状。
在本发明的方法中，正常生物学样品的蛋白质组图谱发挥重要的诊断作用。如上文讨论，如果该试样的蛋白质组图谱与正常生物学样品的蛋白质组图谱基本上相同，则诊断该患者未患有待鉴定的母体/胎儿病理学病状。这种“阴性”诊断具有巨大意义，因为它消除了患者经历不必要治疗或或介入治疗的需要，所述治疗可能具有潜在的副作用或可以另外带给患者、胎儿或初生婴儿风险。分析数据以确定如果差异是否为统计显著的。
在以下实施例中详述的结果提供了羊膜内感染(IAI)的蛋白质组图谱特征，其以统计显著的方式与宫颈-阴道液(CVF)的正常蛋白质组图谱不同。此外，所述实施例提供了作为IAI特征的表达标记和独特表达标签。
一种对开展本发明非侵入性诊断方法特别有利的生物学流体是宫颈-阴道液(CVF)。CVF是一种复杂的生物学流体，由水、电解质、低分子量有机化合物(葡萄糖、氨基酸和脂类)、细胞(白细胞、淋巴细胞和上皮细胞)和由子宫颈内膜优势合成的多种蛋白质和蛋白裂解酶组成(Blandau等人，TheBiologyoftheCervix.芝加哥大学出版社:芝加哥，1973；第xi页，450页)。CVF还含有来自阴道细胞的分泌物，其包含黏蛋白、防卫素、补体因子、免疫球蛋白、乳铁蛋白和胶原凝素(Blandau等人，上文)。CVF流过并润滑整个雌性生殖道，包括阴道、宫颈和子宫区域。CVF形成抵抗外部病原体的防御一线、发送能育性信号，并且辅助授精、妊娠和分娩(Blandau等人，上文；Bigelow，J.L.等人，HumReprod2004，19，(4)，889-92)。CVF还含有菌群如卷曲乳杆菌(Lactobacillicrispatus)和阴道乳杆菌(Lactobacillivaginalis)。来自这种菌群的分泌物赋予CVF低pH，这增强其抗病原体活性(Blandau等人，上文)。阴道菌群的任何不平衡或外部菌群侵入导致细菌性阴道病。应答于细菌性阴道病，由宫颈和阴道内上皮分泌至CVF中的几种细胞因子如IL-1a、IL-1β、IL-10、IL-8和TNF-α变化(Mattsby-Baltzer，I等人，ActaObstetGynecolScand1998，77，(7)，701-6；Eschenbach，D.A.等人，JClinMicrobiol1989，27，(2)，251-6)。抑制细菌性阴道病失败已经与宫颈癌(Mikamo，H等人，JInfectChemother1999，5，(2)，82-85)、盆腔炎性疾病(Ness，R.B.等人，AmJEpidemiol2005，162，(6)，585-90.)、子宫内膜炎(Haggerty，C.L.等人，ClinInfectDis2004，39，(7)，990-5；Morris，M.等人，Bjog2001，108，(5)，439-50)和输卵管性不孕(Morris等人，上文)正相关。孕妇中的细菌性阴道病已经与增加的未足月分娩和早产风险相关(Gravett，M.G.等人，Jama1986，256，(14)，1899-903)。
CVF中存在的细胞因子和其他防御分子还在性传达性免疫缺损病毒如HIV和单纯疱疹病毒(HSV)在阴道内感染、复制和增殖方面发挥重要作用(Poli，G.等人，AIDSResHumRetroviruses1992，8，(2)，191-7；Zara，F.等人，SexTransmInfect2004，80，(2)，108-12；John，M.等人，JInfectDis2005，192，(10)，1731-40)。分析CVF的阳离子性多肽级分已鉴定出有助于抗HIV活性的20种多肽(Venkataraman，N.等人，J.Immunol2005，175，(11)，7560-7)。先前研究也已经鉴定CVF在截获HIV病毒粒子，因而防止感染方面的作用(Maher，D.等人，ProcNatlAcadSciUSA2005，102，(32)，11504-9；Quinones-Mateu，M.E等人，Aids2003，17，(16)，F39-48)。最近的研究已经检测到CVF中几种免疫应答分子和导致早产的亚临床胎膜早破(PROM)的发生率之间的相关性(Helmig，B.R.等人，JMaternFetalNeonatalMed2002，12，(4)，237-46；Ogino，M.等人，JObstetGynaecolRes2005，31，(5)，421-6)。在妊娠期间，CVF可能含有源自子宫的羊膜液(AF)，这归因于绒毛膜-蜕膜界面的破坏或平行分泌。AF“泄漏”入CVF为针对胎儿纤连蛋白存在的现有非侵入式诊断法提供基础，所述诊断法已经用来在妇女中预测早产(Swamy，G.K.等人，JReprodMed2005，50，(11)，851-6)。
CVF是监督孕妇中母体和胎儿健康的重要潜在诊断部位，原因在于其与AF即羊膜腔穿刺术相比侵入性最小的采集方法。本文中鉴定的生物标记和生物标记群或组合在可靠检测怀孕受试者中的羊膜内感染方面提供有价值的诊断工具。
用于比较蛋白质组图谱的统计方法是本领域熟知的。例如，一系列生物标记的蛋白质表达水平可以由免疫测定法定量。可以通过将试样的蛋白质组图谱(谱)与参比或正常样品的蛋白质组图谱(谱)采用适宜算法匹配，确定特征性表达标签的存在或不存在或两个图谱的实质同一性。用于分析蛋白质组谱的统计方法例如在PetricoinIII等人，TheLancet359:572-77(2002).；Issaq等人，BiochemBiophysCommun292:587-92(2002)；Ball等人，Bioinformatics18:395-404(2002)；和Li等人，ClinicalChemistryJournal，48:1296-1304(2002)中公开。
(B)本发明提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析生物学流体如宫颈-阴道液(CVF)、羊膜液、血清、等离子体、尿、脑脊液、母乳、粘液或唾液来诊断羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过免疫测定法诊断羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供一种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析CVF来诊断羊膜内感染。
通过非限制性实例，本发明提供了用于诊断怀孕雌性受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括检定从所述受试者获得的母体宫颈阴道液样品中至少α-甲胎蛋白、IL-6和IGFBP1的丰度。羊膜内感染的诊断基于这些蛋白质在定义为IAI阳性的患者试样及不存在IAI的对照试样中的丰度的统计显著差异。
如上文指出，在本发明的上下文中术语“蛋白质组图谱”用来指在给定时间在生物学样品例如生物流体中多种蛋白质的表达模式的表述。蛋白质组图谱可以例如表述为质量谱，但是还包括基于蛋白质的任何物理化学特征或生物化学特征的其他表述。虽然可以鉴定存在于生物学流体的蛋白质组中的全部或一些蛋白质并且将它们测序，但是对于根据本发明产生的蛋白质组图谱的诊断用途而言，这不是必需的。特定疾病的诊断可以基于正常蛋白质组图谱和当待诊断的疾病或病理学病状存在时在相同环境下获得的相同生物学流体的蛋白质组图谱之间的特征性差异(独特表达标签)。术语“独特表达标签”可以是试验生物学样品或参比生物学样品的蛋白质组图谱内部独特的特征或基序，其以统计显著的方式与从相同类型来源获得的相应正常生物学样品的蛋白质组图谱不同。例如，如果蛋白质组图谱以质谱形式提供，则独特表达标签一般是与来自相应正常样品中的质谱定性或定量性不同的峰或峰组合。因而，可以将质谱中新峰或新峰组合的出现，或现存峰或现存峰组合的幅度或形状的任何统计显著变化，或该质谱中现存峰的消失视为独特表达标签。从哺乳动物受试者获得的试样的蛋白质组图谱与参比样品的蛋白质组图谱比较，所述参比样品包含作为母体或胎儿病理学病状之特征的独特表达标签，如果所述哺乳动物受试者与该参比样品共有独特表达标签，则诊断该哺乳动物受试者存在这种病理学病状。
可以通过比较从待诊断的受试者获得的生物学流体的蛋白质组图谱与以相同方式获得和处理的相同类型正常生物学流体的蛋白质组图谱，诊断出特定的母体/胎儿病理学病状。如果该试样的蛋白质组图谱与正常样品的蛋白质组图谱基本上相同，则认为该受试者未患有主题母体/胎儿病理学病状。如果该试样的蛋白质组图谱相对于正常样品的蛋白质组图谱显示出独特表达标签，则诊断该受试者患有所讨论的母体/胎儿病理学病状。
可选或额外地，试样的蛋白质组图谱可以与参比样品的蛋白质组图谱比较，其中，所述参比样品从被独立诊断患有所讨论的母体/胎儿病理学病状的受试者的生物学流体中获得。在此情况下，如果该试样的蛋白质组图谱与参比样品的蛋白质组图谱共有至少一个表示独特表达标签的特征或特征组合，则诊断该受试者患有所述病理学病状。
在本发明的方法中，正常生物学样品的蛋白质组图谱发挥重要的诊断作用。如上文讨论，如果该试样的蛋白质组图谱与正常生物学样品的蛋白质组图谱基本上相同，则诊断该患者未患有待鉴定的母体/胎儿病理学病状。这种“阴性”诊断具有巨大意义，因为它消除了患者经历不必要治疗或或介入治疗的需要，所述治疗可能具有潜在的副作用或可以另外带给患者、胎儿或初生婴儿风险。分析数据以确定如果差异是否为统计显著的。
本发明诊断方法的灵敏度可以通过分析之前使用常规蛋白质分离方法移除在正常和发病蛋白质组中均以基本上相同的表达水平存在的蛋白质(常见蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白)来增强。不充当独特表达标签的部分的此类常见蛋白质的移除导致改进的灵敏度和诊断准确度。可选或额外地，可以在结果的计算机化分析期间消除(或可以移除信号)常见蛋白质的表达标签，一般使用面向机器的频谱选择算法以产生诊断性服务请求(call)。
在以下实施例中详述的结果提供了羊膜内感染(IAI)的蛋白质组图谱特征，其以统计显著的方式与宫颈-阴道液(CVF)的正常蛋白质组图谱。此外，所述实施例提供了作为IAI特征的表达标记和独特表达标签。
一种对开展本发明非侵入性诊断方法特别有利的生物学流体是宫颈-阴道液(CVF)。CVF是一种复杂的生物学流体，由水、电解质、低分子量有机化合物(葡萄糖、氨基酸和脂类)、细胞(白细胞、淋巴细胞和上皮细胞)和由子宫颈内膜优势合成的多种蛋白质和蛋白裂解酶组成(Blandau等人，TheBiologyofthecervix.芝加哥大学出版社:芝加哥，1973；第xi页，450页)。CVF还含有来自阴道细胞的分泌物，其包含黏蛋白、防卫素、补体因子、免疫球蛋白、乳铁蛋白和胶原凝素(Blandau等人，上文)。CVF流过并润滑整个雌性生殖道，包括阴道、宫颈和子宫区域。CVF形成抵抗外部病原体的防御一线、发送能育性信号，并且辅助授精、妊娠和分娩(Blandau等人，上文；Bigelow，J.L.等人，HumReprod2004，19，(4)，889-92)。CVF还含有菌群如卷曲乳杆菌(Lactobacillicrispatus)和阴道乳杆菌(Lactobacillivaginalis)。来自这种菌群的分泌物赋予CVF低pH，这增强其抗病原体活性(Blandau等人，上文)。阴道菌群的任何不平衡或外部菌群侵入导致细菌性阴道病。应答于细菌性阴道病，由宫颈和阴道内上皮分泌至CVF中的几种细胞因子如IL-1a、IL-1β、IL-10、IL-6和TNF-α变化(Mattsby-Baltzer，I等人，ActaObstetGynecolScand1998，77，(7)，701-6；Eschenbach，D.A.等人，JClinMicrobiol1989，27，(2)，251-6)。抑制细菌性阴道病失败已经与宫颈癌(Mikamo，H等人，JInfectChemother1999，5，(2)，82-85)、盆腔炎性疾病(Ness，R.B.等人，AmJEpidemiol2005，162，(6)，585-90.)、子宫内膜炎(Haggerty，C.L.等人，ClinInfectDis2004，39，(7)，990-5；Morris，M.等人，Bjog2001，108，(5)，439-50)和输卵管性不孕(Morris等人，上文)正相关。孕妇中的细菌性阴道病已经与增加的未足月分娩和早产风险相关(Gravett，M.G.等人，Jama1986，256，(14)，1899-903)。
CVF中存在的细胞因子和其他防御分子还在性传达性免疫缺损病毒如HIV和单纯疱疹病毒(HSV)在阴道内感染、复制和增殖方面发挥重要作用(Poli，G.等人，AIDSResHumRetroviruses1992，8，(2)，191-7；Zara，F.等人，SexTransmInfect2004，80，(2)，108-12；John，M.等人，JInfectDis2005，192，(10)，1731-40)。分析CVF的阳离子性多肽级分已鉴定出有助于抗HIV活性的20种多肽(Venkataraman，N.等人，J.Immunol2005，175，(11)，7560-7)。先前研究也已经鉴定CVF在截获HIV病毒粒子，因而防止感染方面的作用(Maher，D.等人，ProcNatlAcadSciUSA2005，102，(32)，11504-9；Quinones-Mateu，M.E等人，Aids2003，17，(16)，F39-48)。最近的研究已经检测到CVF中几种免疫应答分子和导致早产的亚临床早产胎膜破裂(PROM)的发生率之间的相关性(Helmig，B.R.等人，JMaternFetalNeonatalMed2002，12，(4)，237-46；Ogino，M.等人，JObstetGynaecolRes2005，31，(5)，421-6)。在妊娠期间，CVF可能含有源自子宫的羊膜液(AF)，这归因于绒毛膜-蜕膜界面的破坏或平行分泌。AF“泄漏”入CVF为针对胎儿纤连蛋白存在的现有非侵入式诊断法提供基础，所述诊断法已经用来在妇女中预测早产(Swamy，G.K.等人，JReprodMed2005，50，(11)，851-6)。
CVF是监督孕妇中母体和胎儿健康的重要潜在诊断部位，原因在于其与AF即羊膜腔穿刺术相比侵入性最小的采集方法。本文中鉴定的生物标记组合在可靠检测怀孕受试者中的羊膜内感染方面提供有价值的诊断工具。
用于比较蛋白质组图谱的统计方法是本领域熟知的。例如，在质谱的情况下，蛋白质组图谱由沿质谱水平轴关键质/荷(M/Z)位置处的峰振幅值限定。因此，特征性蛋白质组图谱可以例如以给定M/Z值时频谱振幅的组合所形成的谱为特征。可以通过将试样的蛋白质组图谱(谱)与参比或正常样品的蛋白质组图谱(谱)采用适宜算法匹配，确定特征性表达标签的存在或不存在或两个图谱的实质同一性。用于分析蛋白质组谱的统计方法例如在PetricoinIII等人，TheLancet359:572-77(2002).；Issaq等人，BiochemBiophysCommun292:587-92(2002)；Ball等人，Bioinformatics18:395-404(2002)；和Li等人，ClinicalChemistryJournal，48:1296-1304(2002)中公开。
4.蛋白质阵列
上文讨论的诊断性分析法和筛选分析法均可以使用蛋白质阵列来进行。近年来，作为检测蛋白质、监测其表达水平和研究蛋白质相互作用与功能的有力手段，蛋白质阵列已经赢得广泛认可。当使用自动化手段，可以同时进行巨大数目的测定时，蛋白质阵列使得高通量蛋白质分析成为可能。以最初开发用于DNA阵列的微阵列或芯片格式，此类测定可以在材料消耗最小的情况下实施，同时产生大量的数据。
虽然借助2D凝胶电泳和质谱法的蛋白质组分析法非常有效，但它不总是提供所需要的高灵敏度，并且这种分析法可能错过许多以低丰度表达的蛋白质。除其高效率之外，蛋白质微阵列还提供改进的灵敏度。
通过使用本领域熟知的多种共价和非共价接合化学将蛋白质固定在固相表面如玻璃、硅、塑料微孔、硝酸纤维素、PVDF膜和微珠上，形成蛋白质阵列。固相支持物应当是在偶联方法之前和之后化学稳定的，允许良好点形态，显示最小非特异性结合，不应当在检测系统中提供背景，并且应当与不同的检测系统相容。
通常，蛋白质微阵列使用了常用于读取DNA阵列的相同检测方法。类似地，与用于读取DNA微阵列相同的仪器操作法适用于蛋白质阵列。
因而，捕获阵列(例如，抗体阵列)可以用荧光标记的来自两个不同来源(如正常流体和发病生物学流体)的蛋白质来探测。在此情况下，读出基于反映靶蛋白表达水平变化的荧光信号变化。替代性读出包括，而不限于、荧光共振能量转移、表面等离子体共振、滚环DNA扩增、共振光散射法、酶反应和原子力显微镜。
对于其他细节，见例如，ZhouH等人，TrendsBiotechnol.19:S34-9(2001)；Zhu等人，CurrentOpin.Chem.Biol.5:40-45-(2001)；Wilson和Nock，AngewChemIntEdEngl42:494-500(2003)；和Schweitzer和Kingsmore，CurrOpinBiotechnol13:14-9(2002)。生物分子阵列还在2002年6月18日授予的美国专利6,406,921中公开，所述文献的完整内容在此明确地通过引用方式并入。
5.免疫测定法
本发明的诊断测定法也可以以本领域熟知的多种免疫测定样式形式进行。本发明的一个实施方案包括用于诊断个体中羊膜内感染方法，包括下列步骤：从个体获得体液，例如，宫颈-阴道液；使用本文所述的免疫测定系统测量本文所述的一种或多种蛋白质在该体液中的量；和比较本文所述的一种或多种蛋白质在该体液中的量与本文所述的一种或多种蛋白质在未患有该病状的健康个体中的参比水平，其中本文所述的一种或多种蛋白质的量升高超过参比水平表明该个体患有羊膜内感染。
在一个实施方案中，单步骤测定法(同时孵育样品和检测抗体)是有用的。在另一个实施方案中，两步骤测定法(依次孵育样品和检测抗体)是有用的。在其他蛋白质分子可能竞争与检测抗体结合的情况下，两步骤测定法是优选的。在均相免疫测定法中，抗原和抗体之间的免疫反应和检测均在均相反应中实施。多相免疫测定法包括至少一个分离步骤，其允许区分反应产物与未反应的试剂。
在称作免疫定量性“双位点”或“夹心”免疫测定法的免疫测定法的一个实施方案中，分析物与结合至该分析物上不同表位的两种抗体结合或夹在这两种抗体之间。此类免疫测定法的代表性实例包括酶免疫测定法或酶联免疫吸附测定(EIA或ELISA)、免疫放射定量测定法(IRMA)、荧光免疫测定法、横向流测定法、扩散免疫测定法、免疫沉淀测定法和磁分离测定法(MSA)。在这样一个测定法中，称作“捕获”抗体的第一抗体与固相支持物如蛋白质偶联或蛋白质结合表面、胶态金属粒子、氧化铁粒子或聚合物珠结合。聚合物珠的一个实例是乳胶粒子。在这种实施方案中，使用本领域已知的方法，将捕获抗体结合至或包被于固相支持物上。可选地，捕获抗体与额外抗体识别的配体偶联，其中所述额外抗体结合至或包被于固相支持物上。捕获抗体经配体与额外抗体结合随后间接地将捕获抗体固定在固相支持物上。这种配体的一个实例是荧光素。
使用本领域已知的方法，将称作“检测”抗体的第二抗体与标记物偶联或缀合。用于此目的的合适标记物的实例包括化学发光剂、比色剂、能量转移剂、酶、酶促反应的底物、荧光剂和放射性同位素。在一个实施方案中，标记物包括与第二抗体偶联的第一蛋白如生物素，和与酶偶联的第二蛋白如链霉亲和素。第二蛋白与第一蛋白结合。当与底物提供时，所述酶产生可检测的信号，从而测量到的信号的量对应于与分析物结合的第二抗体的量。酶的实例包括，而不限于碱性磷酸酶、淀粉酶、萤光素酶、过氧化氢酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶、辣根过氧化物酶、内酰胺酶、脲酶和苹果酸脱氢酶。合适的底物包括，而不限于TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)、OPD(邻苯二胺)和ABTS(2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸))。
在“夹心”模式下，正在分析的抗原固定在两种不同抗体之间。在这种方法中，固相表面首先用固相抗体包被。随后添加含有正在被测量的抗原(即，诊断性蛋白质)的试样或含有该抗原的组合物，并且允许抗原与结合的抗体反应。洗去任何未结合的抗原。随后允许已知量的酶抗体与结合的抗原反应。反应后，洗去任何过量的未结合的酶联抗体。随后添加在本测定法中使用的酶的底物，并且在该底物和酶之间的反应产生颜色变化。可视颜色变化的量是特异性酶缀合的结合抗体的直接量度，并且因此，检定出该样品中存在的抗原。
ELISA也可以作为竞争性测定法使用。在竞争性测定法模式中，含有待确定抗原的试验标本与精确量的酶标记抗原混合并且这两种抗原均竞争与结合至固相表面的针对抗原的抗体结合。在添加酶的底物之前，洗去过量的游离的酶标记抗原。因酶-底物相互作用产生的颜色强度的量是所检验的样品中的抗原量的度量。均相免疫测定法包括例如酶放大免疫测定技术(EMIT)，其一般包含生物学样品，所述生物学样品包含待测量的化合物或多种化合物、待测量的化合物的酶标记分子、结合待测量化合物的特异性抗体或多种抗体和特异性酶生色底物。在常见的EMIT中，将过量的特异性抗体添加至生物学样品。如果该生物学样品含有待检测的蛋白质，则这种蛋白质与抗体结合。随后将测量过的量的相应酶标记蛋白质添加至所述混合物。未被样品中蛋白质分子占据的抗体结合位点以添加的酶标记蛋白质占据。因此，酶活性降低，因为仅游离的酶标记蛋白质可以作用于底物。从无色形式转变成有色形式的底物的量决定混合物中留下的游离酶的量。样品中待检测的蛋白质的高浓度引起更高吸光度读数。样品中较少的蛋白质导致较小的酶活性并且因此导致较低的吸光度读数。当Ag-酶复合物被Ab结合时，酶标记物的失活使得EMIT成为唯一系统，从而使该试验能够在结合的化合物和未结合的化合物不分开情况下进行，其中其他免疫测定法需要将结合的化合物和未结合的化合物分开。
在本文所述的系统和方法的多个实施方案中有用的抗体包括可商业获得的抗体和抗体片段，以及经产生以结合所述靶蛋白上合适表位的任何新抗体。在全部实施方案中，根据本发明待使用的抗体必须结合本文所述生物标记的一种或多种特定同工型，它们存在于宫颈-阴道液中。在本文例举的多个实施方案中使用的抗体是在本质上是单克隆或多克隆的。其他抗体和抗体片段，如重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段如Fab或Fv片段以及通过筛选噬菌体展示文库选择的片段等也用于本文所述的组合物和方法中。
用于制备单克隆抗体及多克隆抗体的方法现在充分建立(HarlowE.等人，1988.1988.Antibodies.NewYork:ColdSpringHarbourLaboratory)。在一个实施方案中，针对重组人LBP、其合成性片段或如可以从人血清纯化的LBP产生抗体。使用标准免疫方法和采血方法，在多个物种中产生多克隆抗体，所述物种包括但不限于小鼠、大鼠、兔、山羊、羊、驴和马。通过盐析方法如硫酸铵沉淀法将具有高滴度的动物血液分级，并且根据标准方法，在蛋白A-Sepharose柱和瘦蛋白-Sepharose柱上通过连续亲和层析分离特异性免疫球蛋白级分。随后用相关分子对纯化的多克隆抗体以及单克隆抗体就特异性和无交叉反应性进行表征。通过标准方法，使用以示踪剂如放射性同位素或生物素标记的蛋白质例如LBP在与增加水平的未标记的潜在交叉反应物竞争抗体结合中进行这种表征。在一些实施方案中，需要进一步纯化以获得高度特异的抗体级分或用于从多克隆汇集物中选择具有更高亲和力的抗体级分。在单克隆抗体的情况下，仔细选择对免疫原和天然循环分子均具有良好结合特征和特异性的抗体，尤其重组分子或肽抗原用于免疫时。交叉反应性研究进一步由其他标准方法如在还原性和非还原性条件下的充分建立的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹方法评估。对级分的血清样品中通过高效液相色谱(HPLC)检测到的蛋白质免疫反应性的评价也用来粗略限定检测到的蛋白质的分子量谱(GravettMG等人，JAMA2004；292:462-469；KhosraviMJ等人，ClinBiochem1995；28:407-414)。
根据充分建立的标准实验室方法制备单克隆抗体(P.Tijssen的“PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays”(引自LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology，R.H.Burdon和P.H.vanKinppenberg编著；ElsevierPublishersBiomedicalDivision，1985))，这些实验室方法基于Kohler和Milstein的最初技术(KohlerG.，MilsteinC.Nature256:495，1975)。这项技术如此进行：从免疫的动物取出脾细胞，并且通过与骨髓瘤细胞融合或通过Epstein-Barr病毒转化法，使产生抗体的细胞永生化，随后筛选表达合乎需要的抗体的克隆，不过也使用本领域已知的其他技术。还通过本领域技术人员已知的其他方法产生抗体，所述方法包括但不限于用特定的DNA免疫。
为用于本文所述的免疫测定法中，使用标准抗体纯化方案纯化抗体。在多个实施方案中，单克隆抗体和多克隆抗体均通过亲和层析在蛋白质柱上纯化。可选地，使用标准方法在含有固定化抗原蛋白的凝胶柱上通过亲和层析纯化抗体。
选择用于本文所述系统和方法中的适宜抗体的另一考虑是捕获抗体和检测抗体同时与给定蛋白质分子结合的能力。在涉及MIP1b的一个实施方案中，例如，捕获抗体的抗MIP1b结合位点与检测抗体结合的表位不同，因而允许捕获和检测抗体的同时结合和特定生物标记的检测。在表位明显重叠和因而结合反应不良的情况下，选择针对该生物标记的不同抗体作为捕获抗体或检测抗体落入本领域技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，蛋白质表面上的抗体结合位点不是全部可用的，例如该蛋白质主要以一种或多种其他蛋白质的复合物形式存在于样品中，并且对于结合至捕获抗体或检测抗体是较不可接近的。在这种情况下，使用本领域已知的技术来暴露抗体结合位点，如局部的蛋白质变性或缓冲剂修饰。
如本领域已知，根据所需要的分析性和/或固相分离要求，使用标准的非共价或共价结合方法，将捕获抗体偶联于或连接至各种固相支持物。固相支持物处于试管、珠、微粒子、滤纸、膜、玻璃滤器、磁性颗粒、玻璃或硅芯片或本领域技术人员已知的其他材料与方法的形式。已经用抗体直接包被的微粒、尤其可磁化颗粒(磁性颗粒-捕获抗体)或已经以通用结合物(例如，抗生物素蛋白或抗物种抗体)标记的粒子的应用用于显著缩短测定孵育时间。这些方法连同本领域已知的其他替代性方法允许测定法在数分钟内完成，而不限制所要求的灵敏度。可磁化颗粒或相似方法的应用允许该技术在广泛获得的免疫分析仪上便利地自动化。
用于检测蛋白质片段的检测抗体直接用报道分子偶联，或由次级检测系统间接地检测。后一种情况基于本领域已知的几种不同原理，包括标记的抗物种抗体的抗体识别和其他形式的免疫学或非免疫桥接和信号扩增检测系统(例如，生物素-链霉亲和素技术)。信号扩增方法用来显著地增加分析灵敏度和低水平重复性和性能。用于直接或间接抗体偶联的标记物是任何可检测的报道分子。合适标记物的实例是广泛用于免疫检测系统和非免疫检测系统领域的那些标记物，如荧光团、发光标记物、金属络合物和放射性标记物，以及可以通过其他的合适试剂如酶或直接或间接标记物如酶与发光底物的多种组合检测到的部分。
在本发明方法的多个实施方案中，改变任何样品和抗体体积和孵育时间处于本领域技术人员的能力范围内。这些方法和系统包括常规免疫测定法中使用的常见修改和本领域技术人员已知的任何修改。在多个实施方案中，根据测定法的具体应用和对于速度、灵敏度、准确度和便利性的需求，测定法设计是均相或多相的。
除上述的免疫测定法之外，其他免疫测定法(例如，可以对蛋白质凝胶或滤膜上的蛋白质点进行Ouchterlony平板或蛋白质印迹)是领域已知的并且可以用作诊断。
本发明的另一个方面涉及一种免疫测定试剂盒。在一个实施方案中，该免疫测定试剂盒包含用于检测本文所述的两种或更多种蛋白质的抗体和试剂。在一个方面，本发明包括一种夹心免疫测定试剂盒，其包含捕获抗体和检测抗体。该捕获抗体和检测抗体可以是单克隆或多克隆的。在另一个方面，本发明包括一种诊断试剂盒，其包括使用免疫流色谱法的横向流装置，如免疫色谱胶条(ICS)试验。该横向流装置采用总体上如美国专利4,943,522；4,861,711；4,857,453；4,855,240；4,775,636；4,703,017；4,361,537；4,235,601；4,168,146；4,094,647所述的横向流测定技术，所述每一篇专利的全部内容通过引用方式并入。在又一个方面，所述免疫测定试剂盒可以包含例如在独立容器中(a)对于诊断特定母体/胎儿病状如新生儿败血症中所用的多肽具有结合特异性的单克隆抗体；(b)和抗-抗体免疫球蛋白。这种免疫测定试剂盒可以用于实施本文中提供的多种方法。所述单克隆抗体和抗-抗体免疫球蛋白可以按约0.001mg至约100克和更优选地约0.01mg至约1克的量提供。抗-抗体免疫球蛋白可以是多克隆免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G或其功能片段，它们可以在使用之前通过本领域已知的方法被标记。在需要的情况下，该诊断试剂盒可以进一步包括用于减少试验中背景干扰的试剂、用于提高信号的试剂、用于合并和插入标记值以预测临床目的后果的软件和算法、用于实施检验的装置、校正曲线和图表、标准化曲线和图表等。检验试剂盒可以以任何适合的方式包装，一般全部要素处于单个容器中，连同一页用于实施该试验的印刷说明书。
6.诊断方法和治疗方法
本发明的诊断方法是对执业医师作出快速治疗决定有价值的工具，所述快速治疗决定对于婴儿和/或母亲的存活往往是关键性的。因而，例如，如果孕妇显示未足月分娩的症状，则重要的是进行一项诊断试验以确定羊膜内感染是否存在。如果本文中的快速和非侵入性诊断试验证实存在羊膜内感染，则医师需要立即采取步骤以改善未足月婴儿存活的几率并且限制母亲健康的风险。迄今没有用于羊膜内感染的非侵入性试验。
如果用于羊膜内感染的试验为阴性，则存在这样的问题：是否仍将预料发生未足月分娩。目前，单一标记胎儿纤连蛋白(fFN)试验有时用于这种目的。在怀孕患者的CVF中不存在fFN是妊娠将继续至少额外两周的良好指示物。然而，基于fFN的存在(阳性试验)，不可能可靠地预测未足月分娩是否可能发生。本发明的多标记诊断试验在阴性和阳性试验结果情况下均提供未足月分娩似然性的可靠预测。
可选地，如果患者显示未足月分娩的症状并且一项诊断试验(本文中的试验或用于临床实践中的任何其他试验)用来评估未足月分娩的可能性，则用于膜内感染的试验可以作为随访进行，以提供关于存在或不存在羊膜内感染的信息，并且使医师能够作出更好的决定。
在测量或获得的表达本文中鉴定的蛋白质的水平后，通常记录分析结果、研究结果、诊断、预测和/或治疗建议并且将其传达至例如技师、医师和/或患者。在某些实施方案中，计算机将用来传达这种信息至利益方，如患者和/或主治医师。在一些实施方案中，将在与结果或诊断所传达到的国家和管辖区不同的国家和管辖区进行测定或分析测定结果。
在优选的实施方案中，在测定完成并且形成诊断和/或预测后，将基于试验受试者中一种或多种本文生物标记的表达水平的诊断、预测和/或治疗建议尽可能快地传达至受试者。在某些实施方案中，所述诊断、预测和/或治疗建议进一步基于受试者提出的体征和症状。在一个实施方案中，指示IAI的体征和症状包括，但不限于母体发热(≥37.8℃)、母体白细胞增多(≥15,000/mm3)、母体或胎儿心动过速、子宫压痛或腐臭味羊膜液。指示IAI的其他体征和症状是本领域已知的。在本文所述的方法中鉴定和定量的一个或多个生物标记可以含于一个或多个组中。组成一个组的生物标记的数目可以包括1个生物标记、2个生物标记、3个生物标记、4个生物标记、5个生物标记、6个生物标记、7个生物标记、8个生物标记、9个生物标记、10个生物标记、11个生物标记、12个生物标记、13个生物标记、14个生物标记、15个生物标记、16个生物标记、17个生物标记、18个生物标记、19个生物标记、20个生物标记等。
在优选的实施方案中，本发明涉及一项羊膜内感染试验(ProteoGenix羊膜内感染试验(PG-IAI))，它是一种测量宫颈阴道液(CVF)中α-甲胎蛋白、白介素-6(IL-6)和胰岛素生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)浓度的免疫色谱试验。该试验特别作为辅助手段用于评估IAI在出现特发性未足月分娩的孕妇、完整胎膜以及22周0日和36周6日之间的样品中的风险，并且可以用来为那些疑似IAI患者优先考虑患者防治措施。
在特定的实施方案中，所述试验安置于横向流盒内，并且使用横向流读数仪测量PG-IAI生物标记信号强度。使用拭子采集试剂盒，使用非侵入性CVF拭子收集CVF。
来自使用ELISA平台的现场临床研究/分析性研究中的数据用来逼近横向流装置的检验性能。最佳模型使用两个CVF生物标记、α-甲胎蛋白和IL-6的质量浓度。已经鉴定额外的CVF生物标记IGFBP1，其充当这两个生物标记风险评估的护卫(gatekeeper)。尽管IGFBP1可能本身对于IAI没有诊断意义，但是它排除29%的IAI假阳性患者结果并且大大改善诊断试验的特异性。
所述结果和/或相关信息可以由受试者的治疗医师传达至受试者。可选地，结果可以通过任何通讯手段直接传达至试验受试者，包括书写，如通过提供书面报告，电子形式的传达，如电子邮件或电话。可以通过使用计算机促进传达，如在电子邮件传达的情况下。在某些实施方案中，可以产生含有诊断试验结果和/或从诊断试验得出的结论和/或基于该试验的治疗建议的信息并且使用远程通讯领域技术人员熟悉的计算机硬件和软件组合，将其自动递送至受试者。美国专利6,283,761中描述了面向保健的通讯系统的一个实例；然而，本发明不限于利用这种特定通讯系统的方法。在本发明方法的某些实施方案中，可以在多样的(例如，外国)管辖区内实施所述方法步骤的全部或一些，包括样品的分析、疾病的诊断和分析结果或诊断的传达。
为促进诊断，可以在电子方式所含有的显示器上或在可机读介质中显示参比和/或受试者生物标记图谱或本发明所描述的一个或多个生物标记的表达水平，所述可机读介质例如是，但不限于模拟磁带如VCR可读的那些磁带、VCR、CD-ROM、DVD-ROM、USB闪存介质、闪盘连同其他。此类可机读介质也可以含有额外的试验结果，例如而不限于，临床参数和传统实验室风险因素的测量结果。可选或额外地，所述可机读介质也可以包含受试者信息如医疗史和任何相关的家族史。
微生物学和治疗：IAI往往是一种多重微生物感染，涉及真细菌、支原体物种和真菌。通过培养或16SrDNAPCR从处于IAI的羊膜液中回收的最常见微生物包括阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、真口拟杆菌(Bacteroidesbivius)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、消化链球菌属物种(Peptostroptococcussp.)、二路普氏菌(Provotellabivus)、其他革兰氏阴性厌氧菌、假丝酵母属(Candida)以及生殖道支原体：人型支原体(Mycoplasmahominis)和解脲支原体(Ureaplasmaurealyticum)(DiGiulioDB等人，PLoSONE3(8):e3056；Han，YipingW.等人，J.Clin.Microbiol.200947:38-47)。一旦证实诊断，则应当在分娩期内开始定向抗生素疗法。
本说明书中引用的全部专利和文献参考因而通过引用方式完整地并入本文。
实施例
仅出于说明目的提供以下的实施例并且它们不旨在以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员将认出可以在本发明范围内改变的多种参数。
实施例1
使用免疫测定法鉴定羊膜内感染的宫颈阴道液生物标记
从存在未足月分娩的患者采集个体患者标本。匹配的羊膜液标本用来基于羊膜液培养(有氧、厌氧和支原体物种)和羊膜液16S核糖体DNA的存在或不存在，将患者划分为存在羊膜内感染(IAI)或无IAI。
宫颈阴道液拭子采集.通过用聚酯拭子擦拭(Puritan，Guilford，ME)子宫颈口采集宫颈阴道液，所述聚酯拭子随后置于含有约1mL标本采集缓冲液的容器中。标本在-70℃冷冻用于运输，随后融化，以270xg离心15分钟并且为长期贮存而再等分。
GROα：CVF标本的稀释.在如下文描述的Quantikine人CXCL1/GROα免疫测定试剂盒上检定之前，宫颈阴道液(CVF)标本于分析缓冲液(2.67mMKCl，1.47mMKH2PO4，137.93mMNaCl，8.06mMNa2HPO4.7H2O，0.15%BSA，0.05%v/vTween-20，0.075%v/vProClin950，pH7.3+0.3)中1:50稀释。
检测CVF标本中的GROα.在稀释后，将标本作为样品在来自R&DSystems的Quantikine人CXCL1/GROα免疫测定试剂盒(目录号编号DGR00)上运行，相对于制造商的说明书作出一些修改。简而言之，使试剂、对照和样品达到室温(RT)。GROα标准物用5mL分析缓冲液重构，产生1000pg/mL溶液。该溶液在室温孵育15分钟，伴以柔和搅拌。在孵育后，将750μL的1000pg/mL溶液稀释至750μL分析缓冲液中，产生500pg/mL的溶液。该过程重复额外4次，产生250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液。将50μL分析稀释液RD1U添加至每个孔。将200μL标准物一式三份添加至适宜的孔。将200μL对照和样品一式二份添加至适宜的孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育2小时。移去粘性条，并且使用BioTekELx50洗板机，用400μL1X洗涤缓冲液洗涤所述孔3次，洗涤之间孵育1分钟。通过在纸巾上倒转拍打各孔除去任何残余液体。将200μL的GROα缀合物添加至每个孔。所述孔用粘性条覆盖并且在2-8℃孵育2小时。移去粘性条，并且所述孔如前洗涤。如前除去任何残余液体。将200μL底物溶液添加至每个孔。所述孔用铝箔覆盖并且在室温孵育20分钟。将50μL终止液添加至每个孔。使用BioTekSynergy2平板读数仪和BioTekGen5软件，在450nm和540nm读取平板。
CVF标本中GROα的定量.使用Gen5软件，进行四参数非线性回归分析以产生标准曲线。该标准曲线随后用来计算免疫测定试剂盒上所运行的CVF标本中GROα的浓度。为计算CVF标本中GROα的终浓度，计算的浓度乘以50以算出初始的标本稀释度。将具有比31.25pg/mL标准物的ΔOD读数低的ΔOD(OD450-OD540)读数的任何标本给予浓度31.25pg/mL，此浓度随后乘以50。随后使用如下文描述的统计方法分析数据。图1描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中GROα(测定法1)的自然对数值。
CVF标本的稀释.在如下文描述的Quantikine人IL-6免疫测定试剂盒上检定之前，宫颈阴道液(CVF)标本于校准稀释液RD6F中1:100稀释。
检测CVF标本中的IL-6.在稀释后，将标本作为样品在来自R&DSystems的Quantikine人IL-6免疫测定试剂盒(目录号编号D6050)上运行，相对于制造商的说明书作出一些修改。简而言之，使试剂、对照和样品达到室温(RT)。IL-6标准物用5mL校准稀释液重构，产生300pg/mL溶液。该溶液在室温孵育15分钟，伴以柔和搅拌。在孵育后，将333μL的300pg/mL溶液稀释至667μL校准稀释液RD6F中，产生100pg/mL的溶液。将500μL的100pg/mL溶液稀释至500μL校准稀释液RD6F中，产生50pg/mL的溶液。两倍稀释重复额外4次，产生25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL和3.12pg/mL的溶液。将100μL分析稀释液RD1W添加至每个孔。将100μL标准物一式三份添加至适宜的孔。将100μL对照和样品一式二份添加至适宜的孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育2小时。移去粘性条，并且使用BioTekELx50洗板机，用400μL1X洗涤缓冲液洗涤所述孔4次，通过在纸巾上倒转拍打各孔除去任何残余液体。将200μL的IL-6缀合物添加至每个孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育2小时。移去粘性条，并且所述孔如前洗涤。如前除去任何残余液体。将200μL底物溶液添加至每个孔。所述孔用铝箔覆盖并且在室温孵育20分钟。将50μL终止液添加至每个孔。使用BioTekSynergy2平板读数仪和BioTekGen5软件，在450nm和540nm读取平板。
CVF标本中IL-6的定量。使用Gen5软件，进行四参数非线性回归分析以产生标准曲线。该标准曲线随后用来计算免疫测定试剂盒上所运行的CVF标本中IL-6的浓度。为计算CVF标本中IL-6的终浓度，计算的浓度乘以100以算出初始的标本稀释度。将具有比3.12pg/mL标准物的ΔOD读数低的ΔOD(OD450-OD540)读数的任何标本给予浓度3.12pg/mL，此浓度随后乘以100。将具有比300pg/mL标准物的ΔOD读数高的ΔOD读数的任何标本以更高的稀释度稀释并且在该试剂盒上再次运行。随后使用如下文描述的统计方法分析数据。图7描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中IL-6的自然对数值。
LBP：CVF标本的稀释.在如下文描述的人LBPELISA试剂盒上检定之前，宫颈阴道液(CVF)标本于分析缓冲液(2.67mMKCl，1.47mMKH2PO4，137.93mMNaCl，8.06mMNa2HPO4-7H2O，0.15%BSA，0.05%v/vTween-20，0.075%v/vProClin950，pH7.3+0.3)中1:50稀释。
检测CVF标本中的LBP.在稀释后，将标本作为样品在来自CellSciences的LBPELISA试剂盒(目录号编号CKH113)上运行，相对于制造商的说明书作出一些修改。简而言之，使试剂、对照和样品达到室温(RT)。将人LBP标准物用30μL蒸馏水重构。将重构的人LBP标准物随后稀释至1570μL分析缓冲液中，产生50ng/mL的溶液。将350μL的50ng/mL溶液稀释至350μL分析缓冲液中，产生25ng/mL的溶液。两倍稀释重复额外4次，产生12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL和1.56ng/mL的溶液。将100μL标准物一式三份添加至适宜的孔。将100μL对照和样品一式二份添加至适宜的孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育1小时，伴以振荡。移去粘性条，并且使用BioTekELx50洗板机，用300μL洗涤缓冲液洗涤所述孔3次。通过在纸巾上倒转拍打各孔除去任何残余液体。将100μL检测抗体添加至每个孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育1小时，伴以振荡。移去粘性条，并且所述孔如前洗涤。如前除去任何残余液体。将100μL底物溶液添加至每个孔。所述孔用铝箔覆盖并且在室温孵育12-15分钟。将100μL终止液添加至每个孔。使用BioTekSynergy2平板读数仪和BioTekGen5软件，在450nm和620nm读取平板。图8描述IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中LBP的自然对数值。
CVF标本中LBP的定量.使用Gen5软件，进行四参数非线性回归分析以产生标准曲线。该标准曲线随后用来计算免疫测定试剂盒上所运行的CVF标本中LBP的浓度。为计算CVF标本中LBP的终浓度，计算的浓度乘以50以算出初始的标本稀释度。将具有比1.56ng/mL标准物的ΔOD读数低的ΔOD(OD450-OD620)读数的任何标本给予浓度1.56ng/mL，此浓度随后乘以50。将具有比50ng/mL标准物的ΔOD读数高的ΔOD读数的任何标本以更高的稀释度稀释并且在该试剂盒上再次运行。随后使用如下文描述的统计方法分析数据。
A1AG：CVF标本的稀释.在如下文描述的人Orosomucoid(α-1-酸性糖蛋白)ELISA定量试剂盒上检定之前，宫颈阴道液(CVF)标本于含1%乳的PBS中1:200稀释。
检测CVF标本中的A1AG.在稀释后，将标本作为样品在来自GenWay的人Orosomucoid(α-1-酸性糖蛋白)ELISA定量试剂盒(目录号编号40-288-22927F)上运行，相对于制造商的说明书作出一些修改。简而言之，使试剂、对照和样品达到室温(RT)。将包被抗体在包被缓冲液(0.05M碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.4)中稀释至5μg/mL。将100μL这种5μg/mL包被液添加至带有MaxiSorp表面的ImmunoLockWells(Nunc，目录编号446469)。所述孔在室温孵育1小时并且随后使用BioTekELx50洗板机，以300μL洗涤溶液(50mMTris-HCl，0.14MNaCl，0.05%Tween20)洗涤3次。通过在纸巾上倒转拍打各孔除去任何残余液体。将200μL含1%乳的PBS添加至每个孔并且将所述孔在室温孵育1小时。随后如前洗涤所述孔，并且如前除去任何残余液体。在含1%乳的PBS中稀释校准物至250ng/mL。随后将400μL的250ng/mL溶液稀释至400μL含1%乳的PBS中，产生125ng/mL的溶液。两倍稀释重复额外5次，产生62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL和3.90625ng/mL的溶液。将100μL标准物一式三份添加至适宜的孔。将100μL对照和样品一式二份添加至适宜的孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育1小时。移去粘性条，并且使用BioTekELx50洗板机，用300μL洗涤溶液洗涤所述孔5次。如前除去任何残余液体。在含1%乳的PBS中稀释HRP缀合物至480ng/mL。随后将100μL稀释的HRP缀合物添加至每个孔。所述孔用粘性条覆盖并且在室温孵育1小时。移去粘性条，并且所述孔如前洗涤。
如前除去任何残余液体。100μL的1-StepUltraTMBELISA(ThermoScientific，目录号34028)添加至每个孔。所述孔用铝箔覆盖并且在室温孵育2.75分钟。将100μL用于TMB底物的终止试剂(Sigma，目录号S5814-100mL)添加至每个孔。使用BioTekSynergy2平板读数仪和BioTekGen5软件，在450nm读取平板。图6描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中A1AG的自然对数值。
检测CVF标本中A1AG的定量.使用Gen5软件，进行四参数非线性回归分析以产生标准曲线。该标准曲线随后用来计算免疫测定试剂盒上所运行的CVF标本中A1AG的浓度。为计算CVF标本中A1AG的终浓度，计算的浓度乘以200以算出初始的标本稀释度。将具有比3.90625ng/mL标准物的OD450读数低的OD450读数的任何标本给予浓度3.90625ng/mL，此浓度随后乘以200。
将具有比250ng/mL标准物的OD450读数高的ΔOD读数的任何标本以更高的稀释度稀释并且在该试剂盒上再次运行。随后使用如下文描述的统计方法分析数据。
CVF标本中MIP-1α、AFP、B2MG、MCP-1、TIMP-1和VCAM-1的检测和定量.与一家在外检定的实验室(基于药物规则)签约以使用多重免疫测定技术(LuminexxMAP)测定CVF标本中的MIP-1α、AFP、B2MG、MCP-1、TIMP-1和VCAM-1的浓度。随后使用如下文描述的统计方法分析由该检定实验室提供的数据。图2描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MIP1b的自然对数值。图3描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MCP-1的自然对数值。图4描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中B2MG的自然对数值。图5描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中TIMP-1的自然对数值。在图9中描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中AFP的自然对数值。在图10中描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中VCAM-1的自然对数值。
数据的统计分析.如下进行各个生物标记的比较：将具有由复合参比定义所确定的感染状态与无感染状态的受试者分组。使用自然对数变换的数据以减少离群值影响，进行各组比较的单因素方差分析(one-wayANOVA)。接下来，进行基于Wilcoxin秩的检验来比较各组。最后，产生接收者-操作特征(ROC)曲线以评估区分能力。
使用对数回归，将生物标记合并入模型中。在多标记模型中考虑Wilcoxin检验时p<0.20的标记。产生基于模型的ROC曲线并且用来与多标记模型比较各个标记的性能。目的在于最大化ROC曲线下面积并且确保曲线最低符合80%灵敏度和特异性的可接受标准。基于有前景的模型计算风险评分。选择风险评分中的阈值，其使多标记模型的灵敏度最大化。
表2中10个生物标记的各个接收者操作特征曲线下面积(标记“AUROC”的列)。这些标记与其他生物标记组合使用来建立图11和12中所示的用于区分IAI与无IAI的对数回归模型。在下表3中显示该模型中每个标记的参数。生物标记的不同组合在多标记模型中以优于各个模型性能的方式进行。
表2.与预测羊膜内感染相关的各个生物标记的AUROC和p-值
AUROC P值
AFTP 0.829 0.0001
IL6 0.813 0.0000
LBP 0.692 0.0146
MCP1 0.686 0.0270
B2MG 0.632 0.1148
A1AG 0.617 0.2162
TIMP-1 0.615 0.1588
GRO-ct 0.607 0.1959
MIP1b 0.569 0.4142
VCAM-1 0.598 0.2432
表3.对最大似然性估计值的分析
参数 DF 估计值 标准误差 Wald卡方 Pr>Chi Sq
截距 1 7.1935 7.5066 0.9183 0.3379
AFTP 1 0.6788 0.3701 3.3641 0.0666
IL6 1 1.3192 0.5689 5.3769 0.0204
LBP 1 0.1894 0.7334 0.0667 0.7962
A1AG 1 -0.3369 0.2833 1.4139 0.2344
Groa 1 -2.3908 1.1906 4.0321 0.0446
实施例2
分析CVF生物标记的发展数据集(developmentsetdata)以评估各个生物标记浓度的临界值是否可以用来将患者划分为具有羊膜内感染风险。各个CVF生物标记浓度直接表述为质量单位或这些质量单位的归一化值。分析各个生物标记和生物标记组合的定量值。临界值方法允许使CVFIAI试验格式化为一种横向流装置。在横向流模式中，通过在横向流读数仪上测量条带强度定量地评定生物标记水平。
单一分析物ELISA和基于xMAPTM技术的多重液态珠阵列的组合用来鉴定IAI的生物标记。在ProteoGenixIAI标本库试验中采集一个具有15%IAI患病率的人宫颈阴道液标本队列(N=112)。通过有氧培养、厌氧培养和支原体培养物以及用自制16SrDNAPCR试验测试来自这些受试者的羊膜液，以确立羊膜内感染状态。使用对数回归分析以及主成分分析法分析在CVF上的ELISA和xMAPTM免疫测定数据，以选择能够区分IAI患者与非IAI患者的前八个CVF生物标记。从这八个生物标记中，根据本发明选择最终三者。
来自ELISA研究的数据用来模拟横向流读数。选择临界值以使灵敏度最大化，因为目的在于使用CVFIAI试验作为辅助手段来评估IAI风险。其他常用试验，如羊膜液葡萄糖法、革兰氏染色法或培养法，可以用来证实IAI的诊断。临界值方法产生作为二元结果如高感染风险或低感染风险报道的PG-IAI试验的结果。
迄今最佳的模型仅使用两个CVF生物标记α-甲胎蛋白和IL-6的质量浓度。从所述数据集中剔除无可检出白蛋白(6/298)或严重溶血的患者标本(11/292)。基于培养或16SrDNA的复合参比标准物，该数据集中存在23例感染者和258例无感染者。
图13和14中显示结果。生物标记浓度经过对数变换和Z评分计算。在这个ELISA数据集中使用Z评分总和临界值1.0。将这两个生物标记的Z评分的总和确定、排序和确定临界值。灵敏度是82%，特异性是89%，PPV是41%并且NPV是98%。AUROC是0.86。
已经鉴定额外的CVF生物标记、胰岛素生长因子-1(IGFBP1)，其充当这两个生物标记风险因子组的护卫(gatekeeper)。IGFBP-1生物标记对于IAI没有诊断意义，而是排除众多的IAI假阳性结果(基于复合参比标准物)并且显著地改善PG-IAI风险因子试验的特异性。
IGFBP-1已经用作宫颈阴道液中的生物标记以检测胎膜破裂(AmnioSureTest；MedixBiochemicaactimTMPromTest)。IGFBP-1的浓度在羊膜液中比宫颈阴道液中高1000至10,000倍。在ProteoGenix队列中，通过阴性Fern试验、硝氮黄试验、掺混试验和/或AmnioSure试验验证不存在胎膜早破(PROM)。如以下Kaplan-Meier图中所示，大于3μg/mL的CVFIGFBP1浓度与无IAI早产一致。图15中显示结果。
从所述数据集中剔除无可检出白蛋白(6/298)或严重溶血(11/292)或IGFBP1浓度大于3μg/mL(15/281)的患者标本。基于培养和/或16SrDNA的复合参比标准物，该数据集中存在23例感染者和243例无感染者。这两个诊断性生物标记浓度经过对数变换和Z评分计算。使用Z评分总和临界值1.0。将这两个生物标记的Z评分的总和确定、排序和确定临界值。灵敏度是82%，特异性是89%，PPV是41%并且NPV是98%。AUROC从0.86改进至0.89。消除11/38(29%)的假阳性患者标本，导致特异性从85%改善至89%和PPV从33%改善至41%。在N=266患者队列中，17%具有高风险评分。图16和17中显示结果。
尽管出于阐明和理解目的，已经以某种程度详细地描述了前述发明，不过对于阅读本公开的本领域技术人员而言，显而易见可以做出形式和细节方面的各种变化而不脱离本发明的真实范围。例如，上述的全部技术和装置可以在多种组合下使用。本申请中引用的全部出版物、专利、专利申请和/或其他文献为了所有目的通过引用方式以相同程度完整并入本文，如同分别指出为了所有目的将每份单独出版物、专利、专利申请和/或其他文献通过引用方式并入。

Claims (43)

1.用于检测以下两种或更多种蛋白质的抗体在制备一种用于检测从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的样品中的羊膜内感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的样品中的羊膜内感染的方法，包括：
(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)；和
(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述样品中的所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述两种或更多种蛋白质包括α-甲胎蛋白(AFP)和白介素-6(IL-6)，所述方法还包括测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中IGF结合蛋白-1(IGFBP-1)的水平；和
(b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-1中每一者在所述样品中的所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-1中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-1中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述受试者是人患者。
4.根据权利要求1所述的用途，包括检定多个所述蛋白质的丰度，其中所述蛋白质的数目选自所述蛋白质中的至少三者和所述蛋白质中的至少四者。
5.根据权利要求1所述的用途，包括测量选自巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)和金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)中两种或更多种蛋白质的水平，和如果在宫颈-阴道液样品中，所述两种或更多种选择的蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种选择的蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
6.根据权利要求5所述的用途，包括如果在宫颈-阴道液样品中，全部所述测试蛋白质相对于所述蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述水平由包括使用免疫测定法、蛋白质阵列、免疫色谱试验、质谱法、横向流装置或其组合的方法测定。
8.用于检测以下两种或更多种蛋白质的抗体在制备一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括
(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平或相对于所述两种或更多种蛋白质在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因α(GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)、α-1-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化肽-1(MCP-1)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)；和
(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
9.权利要求8所述的用途，其中所述体征和症状包括母体发热、母体白细胞增多、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
10.根据权利要求9所述的用途，其中母体发热为≥37.8℃。
11.根据权利要求9所述的用途，其中母体白细胞增多为≥15,000/mm3。
12.根据权利要求1所述的用途，包括测量
a)巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)和α-1-酸性糖蛋白(A1AG)的水平，
b)巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1b)和生长调节的癌基因α(GRO-a)的水平，或
c)A1AG和GRO-a的水平，和
如果在宫颈-阴道液样品中，所述MIP1b和A1AG、或所述MIP1b和GRO-a、或所述A1AG和GRO-a的水平分别相对于所述MIP1b和A1AG、或所述MIP1b和GRO-a、或所述A1AG和GRO-a在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
13.用于检测α-甲胎蛋白(AFP)和白介素-6(IL-6)的抗体在制备一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括
(a)相对于α-甲胎蛋白(AFP)和白介素-6(IL-6)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的宫颈-阴道液样品中AFP和IL-6的水平；和
(b)如果确定AFP和IL-6中每一者在所述样品中的所述水平相对于AFP和IL-6在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP和IL-6在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则在所述样品中检测羊膜内感染。
14.权利要求13所述的用途，其中所述体征和症状包含母体发热、母体白细胞增多、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
15.根据权利要求14所述的用途，其中母体发热为≥37.8℃。
16.根据权利要求14所述的用途，其中母体白细胞增多为≥15,000/mm3。
17.用于检测白介素-6(IL-6)和胎儿纤连蛋白(fFN)的抗体在制备一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，包括
(a)相对于白介素-6(IL-6)和胎儿纤连蛋白(fFN)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中IL-6和fFN的水平；和
(b)如果确定IL-6和fFN中每一者在所述样品中的所述水平相对于IL-6和fFN在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于IL-6和fFN在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则所述受试者诊断为羊膜内感染。
18.用于检测白介素-6(IL-6)和α-甲胎蛋白(AFP)的抗体在制备一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，包括
(a)相对于白介素-6(IL-6)和α-甲胎蛋白(AFP)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中IL-6和AFP的水平；和
(b)如果确定IL-6和AFP中每一者在所述样品中的所述水平相对于IL-6和AFP在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于IL-6和AFP在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则所述受试者诊断为羊膜内感染。
19.权利要求17或18的用途，其中所述受试者是人患者。
20.权利要求17、18、36或37的用途，其中所述蛋白质水平由包括使用免疫测定法、蛋白质阵列、免疫色谱试验、质谱法或其组合的方法测定。
21.权利要求20的用途，其中使用免疫色谱试验测定所述水平，所述试验采用横向流装置。
22.权利要求21的用途，其中所述横向流装置是免疫色谱条(ICS)试验。
23.权利要求20的用途，其中所述免疫测定法采用用于检测IL-6、fFN和AFP的抗体和试剂。
24.权利要求23的用途，其中所述抗体和试剂包含捕获抗体和检测抗体。
25.权利要求24的用途，其中所述捕获抗体和检测抗体是单克隆抗体。
26.权利要求24的用途，其中所述捕获抗体和检测抗体是多克隆抗体。
27.权利要求24的用途，其中所述捕获抗体和检测抗体是单克隆或多克隆抗体。
28.权利要求25的用途，其中所述抗体包含具有对IL-6、fFN和AFP的结合特异性的单克隆抗体，且其中所述方法还包括使用抗-抗体免疫球蛋白。
29.权利要求28的用途，其中所述单克隆抗体和所述抗-抗体免疫球蛋白以约0.001mg至约100克的量提供。
30.权利要求28的用途，其中所述单克隆抗体和所述抗-抗体免疫球蛋白以约0.01mg至约1克的量提供。
31.权利要求28的用途，其中所述抗-抗体免疫球蛋白选自下组：多克隆免疫球蛋白、蛋白A和蛋白G、或其功能片段。
32.权利要求31的用途，其中所述抗-抗体免疫球蛋白是经标记的。
33.权利要求23的用途，其进一步包括使用用于减少试验中背景干扰的试剂或用于提高信号的试剂。
34.权利要求23的用途，其进一步包括使用用于合并和插入标记值以预测临床目的后果的软件和算法。
35.权利要求23的用途，其进一步包括使用用于实施检验的装置。
36.用于检测白介素-6(IL-6)和胎儿纤连蛋白(fFN)的抗体在制备一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括
(a)相对于白介素-6(IL-6)和胎儿纤连蛋白(fFN)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的宫颈-阴道液样品中IL-6和fFN的水平；和
(b)如果确定IL-6和fFN中每一者在所述样品中的所述水平相对于IL-6和fFN在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于IL-6和fFN在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则所述受试者诊断为羊膜内感染。
37.用于检测白介素-6(IL-6)和α-甲胎蛋白(AFP)的抗体在制备一种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括
(a)相对于白介素-6(IL-6)和α-甲胎蛋白(AFP)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从怀孕雌性哺乳动物受试者获得的宫颈-阴道液样品中IL-6和AFP的水平；和
(b)如果确定IL-6和AFP中每一者在所述样品中的所述水平相对于IL-6和AFP在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于IL-6和AFP在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则所述受试者诊断为羊膜内感染。
38.权利要求36或37的用途，其中所述体征和症状包含母体发热、母体白细胞增多、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
39.根据权利要求38所述的用途，其中母体发热为≥37.8℃。
40.根据权利要求38所述的用途，其中母体白细胞增多为≥15,000/mm3。
41.一种免疫色谱试验装置，包含用于检测白介素-6(IL-6)和胎儿纤连蛋白(fFN)的两个或更多个色谱条。
42.权利要求41的免疫色谱试验装置，其中所述色谱条包含针对白介素-6(IL-6)、胎儿纤连蛋白(fFN)和α-甲胎蛋白(AFP)的抗体。
43.权利要求41或42的免疫色谱试验装置，其为横向流装置。
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