CN108896769B - 基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒 - Google Patents
基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于金纳米团簇的人β2‑微球蛋白检测方法及其试剂盒。本发明以人β2‑微球蛋白为检测对象，将高量子产率金纳米团簇电致化学发光技术和免疫分析技术有机结合，采用还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰纳米材料作为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，为一种基于金纳米团簇探针的高性能电致化学发光人β2‑微球蛋白检测方法。对人β2‑微球蛋白检测线性范围为0.044µg/L~1.4µg/L，检测限为0.03µg/L。具有快速、准确、灵敏度高、选择性和稳定性好、样品用量少等特点，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
β2微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）是一种内源性低分子量血清蛋白质，由淋巴细胞和其他大多数的有核细胞分泌，在免疫应答中起重要作用。临床上多用于诊断淋巴增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤。其水平与肿瘤细胞数量、生长速率、预后及疾病活动性有关。根据β2-MG水平还可用于骨髓瘤患者分期。此外，病人血或尿中的β2-MG浓度与肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒等密切相关，可以为临床诊断提供较早、可靠和灵敏的指标。目前临床上用于检测血清中人β2-微球蛋白含量的免疫分析方法已发展出很多种，如酶联免疫分析法、放射免疫分析法、免疫透射比浊法、免疫散射比浊法和时间分辨荧光免疫分析法等。这些方法存在如灵敏度和准确度低、操作过程繁琐、费用较高、检测时间长等不足，极大地限制其在临床诊断中的应用。而电致化学发光或电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）是指通过电极驱动电子转移而激活光电子发射的过程，目前已经广泛使用在相对简单和低成本的检测平台，特别是在免疫测定和传感领域。电致化学发光免疫分析具有灵敏度高、可控性强、分析速度快、易于联用等多方面的优势，在生命分析领域具有广阔的应用前景，极大促进了临床医学诊断的发展，在建立简单、快速、高灵敏的疾病标志物含量检测新方法上具有重要意义。
一种具有优良性质的ECL发光体需要能够产生强而稳定的ECL信号和具有适合的与生物分子（即抗体和核酸）或固体表面（即磁珠或电极）结合的生物偶联或官能化位点，同时保持其原始的光物理和电化学活性。因而寻找新型发光体，发展性能优良的电致化学发光体是电致化学发光分析的重要研究方向。由于纳米发光体比表面积大、催化活性高、亲和力强等特性，在发光材料的研发、生物传感器的构建等方面引起了越来越多的关注。在众多的纳米材料中，金纳米团簇（AuNCs）作为一种新型无毒的ECL发光体近几年得到了人们的广泛关注。其具有丰富的氧化还原性质、水溶性好、可调的荧光发射、良好的光稳定性、较高的荧光量子产率、低毒性、高导电性、易于制备等优良特性。尽管有关AuNCs的荧光性能得到广泛研究与应用，但是由于受其ECL强度小、量子产率低、发光机制不清楚等问题的限制，AuNCs在ECL领域的研究还非常少。针对上述问题，本课题组通过纳米尺度调控制得了高量子产率的金纳米团簇探针新方法，并将其应用于细胞释放多巴胺的检测及小分子生物硫醇等生物分子的高灵敏、快速检测。针对临床肿瘤诊断和治疗的迫切需求，设计和制备基于新型功能化金纳米团簇的高量子产率电致化学发光免疫传感器并将其用于肿瘤标志物的检测具有较重要的学术创新性和临床应用价值。
本发明提供了一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测方法，及基于该方法制备的检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测方法。
本发明的另一个目的在于提供一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体，加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测。
所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L 、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4 V~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5 min~30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述电极表面修饰二氧化锰纳米材料采用下述的电化学沉积法或滴涂法制备：
（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在1:1 V/V 的KMnO4-H2SO4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V~-0.5 V，沉积时间为100 s~600 s，清洗，氮气吹干；
（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500 μL 10 mmol/L 的KMnO4溶液加入到1.25 mL 0.1 mol/L pH 6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5 mL后超声30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液；取5 μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。
所述在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50~100 μL，于4 ℃反应1~5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5 mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育8~12 h，漂洗；加入50~100 μL、1 wt%~5 wt % 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5~2 h，洗涤，拍干。
所述加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人β2-微球蛋白抗体酶标板的样品反应孔中加入样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min~60 min，洗涤，拍干；加入0.1~10 μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37 ℃温育30 min~60 min，洗涤，拍干。
所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50 μL的0.1~1 U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37 ℃温育30 min~60 min。
所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，所用电解质为KCl或KNO3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，施加一定的扫描电压，工作电极表面产生电致化学发光辐射，光电倍增管高压设置为600~800 V，检测电致化学发光辐射信号。
所述根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测为：电极表面所采集的电致化学发光信号的电致化学发光强度值与人β2-微球蛋白浓度的对数值在0.044 µg/L~1.4 µg/L的范围内呈线性关系，检测限为0.03 µg/L。
本发明所述的基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法的检测试剂盒，其特征在于，包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、人β2-微球蛋白抗体固定酶标板、人β2-微球蛋白标准品、生物素标记的人β2-微球蛋白抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。
所述的人β2-微球蛋白抗体固定酶标板为：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50~100 μL，于4 ℃反应1~5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5 mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育8~12 h，漂洗；加入50~100 μL 1%~5% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5~2 h，洗涤，拍干；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液；所述的电致化学发光测试电解质溶液为含有过硫酸钾的缓冲溶液。
具体地说，为了实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：首先制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，以二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，进而利用酶联免疫反应，在夹心免疫反应的基础上，基于链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液和2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐反应产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化学原反应恢复电致化学发光信号，由此发展一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光免疫分析方法，用于肿瘤标志物人β2-微球蛋白的高效检测。本发明包括以下步骤：
（一）高量子产率金纳米团簇探针制备
高量子产率金纳米团簇探针制备方法如下：
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4 V~-2 V范围内），进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针。
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5~30 min（优选0.1 mol/L硼氢化钠溶液反应5 min），得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：N-乙酰化-L-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。
（二）电致化学发光信号采集方法
将电极抛光，再依次放入HNO3溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，N2吹干。采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为600 V ~ 800 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
所述电极为玻碳电极、丝网印刷电极或ITO电极等。上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1 mol/L，优选0.1 mol/L。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为KCl或KNO3，浓度为0.01~1 mol/L，优选0. 1 mol/L。
（三）二氧化锰纳米材料修饰方法
（1）电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用I-t法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1 V~-0.5 V，沉积时间为100 s~600 s，优选-0.2 V，300 s，之后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。
（2）滴涂法：首先制备二氧化锰纳米片，取500 μL 10 mmol/L 的KMnO4溶液加入到1.25 mL 0.1 mol/L pH 6.0的缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5 mL后超声30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液。取5 μL滴涂于金纳米团簇修饰电极表面，自然晾干。
（四）夹心免疫反应体系构建
夹心免疫反应体系构建具体步骤如下：（1）将空白酶标板设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入50 μL 1~5 mg/mL的多巴胺溶液（pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解），于4 ℃反应1~5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加0.01~0.5 mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4℃孵育8~12 h，漂洗。加入50~200 μL 1%~5% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5~2 h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入人β2-微球蛋白标准溶液50 μL，在样品反应孔中加入50 μL样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30~60 min，洗涤，拍干，再加入0.1~10μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37 ℃温育30~60 min，洗涤，拍干。每孔加入0.1~1 U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30~60 min，用10mM pH=7.3 Tris-HCl 缓冲液洗涤，拍干。
（五）人β2-微球蛋白的测定
人β2-微球蛋白检测步骤如下：往上述构建的所述的夹心免疫反应体系的酶标板中加入5~10 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL，再加入10 mM pH=8.0 Tris-HCl缓冲溶液50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光反应25~ 30 min。将上述二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中浸泡4~10 min，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。采集工作电极表面产生的电致化学发光信号，以电致化学发光信号对人β2-微球蛋白浓度作图绘制标准曲线。
（六）试剂盒
一种基于高量子产率金纳米团簇探针的电致化学发光人β2-微球蛋白检测试剂盒，其中包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、人β2-微球蛋白抗体固定酶标板、人β2-微球蛋白标准品、生物素标记的人β2-微球蛋白抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，以纳米二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，利用酶联免疫反应产生抗坏血酸恢复其电致化学发光信号实现人β2-微球蛋白的检测。本发明对人β2-微球蛋白的检测灵敏度高、操作简单，可有效避免检测过程中实际样品复杂成份的干扰，因而特异性好、准确度高。并且，本发明成本低、制作简单、稳定性好、灵敏度好，线性范围宽（0.044 µg/L~1.4 µg/L），检测限低（0.03 µg/L），具有很好的市场价值。
附图说明
图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图2为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图3为本发明检测人β2-微球蛋白的电致化学发光-时间曲线图（人β2-微球蛋白浓度为1.4 µg/L）。
图4为电致化学发光强度变化与人β2-微球蛋白浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
本发明所用的人β2-微球蛋白抗体（武汉默沙克生物科技有限公司），人β2-微球蛋白（武汉默沙克生物科技有限公司），生物素标记的人β2-微球蛋白抗体（武汉默沙克生物科技有限公司），链霉亲和素-碱性磷酸酶（武汉博士德生物工程有限公司），2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐（Sigma-Aldrich公司）为现有技术产品。
实施例1
取0.6 mL 0.5 moL/L的NaOH与0.4 mL 20 mg/mL氯金酸溶液加入到4 mL 0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀后置于37 ℃恒温水槽中孵育3小时。待反应结束后，用分子量为3000的透析袋对反应液透析纯化24 h，得到纯化后的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，于4 ℃冰箱避光保存。
实施例2
将直径3 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al2O3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N2吹干。取5 μL实施例1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。
实施例3
将直径3 mm的玻碳电极用1.0 μm、0.3 μm，0.05 μm的Al2O3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入HNO3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，N2吹干。取5 μL实施例1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，采用计时电流法，在KMnO4-H2SO4（1:1 V/V）溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2 V，沉积时间为300 s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，N2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。
实施例4
取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入50 μL 5 mg/mL的多巴胺溶液（pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解），于4 ℃反应2 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加200 μg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育12 h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入1% 的牛血清白蛋白溶液50 μL，于4 ℃反应1 h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干），得到人β2-微球蛋白抗体固定酶标板。
实施例5
在实施例4制备的人β2-微球蛋白抗体固定酶标板的标准品孔中加入1.4 µg/L的人β2-微球蛋白标准溶液50 μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干，再加入0.5 μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干。每孔加入0.2 U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50 μL（37 ℃预热30 min），轻轻振荡混匀，37 ℃温育45 min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8 mmol/L的2-酸磷-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL（37 ℃预热30 min），再加入pH=8.0 Tri-Hcl 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光反应25 min。将各个孔中的液体取出，加入2 mL的EP管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度EP管中浸泡10 min，取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电化学发光信号比未加人β2-微球蛋白的溶液明显增大（图3）。
实施例6
取空白酶标板，将空白酶标板设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在空白酶标板各孔中加入50 μL 5 mg/mL的多巴胺溶液（pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解），于4 ℃反应2 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加200 μg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育12 h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入1% 的牛血清白蛋白溶液50 μL，于4 ℃反应1 h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入不同浓度的人β2-微球蛋白标准溶液50 μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min，洗涤，拍干，再加入0.5 μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37℃温育30 min，洗涤，拍干。每孔加入0.2 U/mL 链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50 μL（37℃预热30 min），轻轻振荡混匀，37 ℃温育45 min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8 mmol/L的2-酸磷-L-抗坏血酸三钠盐溶液50 μL（37 ℃预热30 min），再加入pH=8.0 Tri-Hcl 50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光反应25 min。将各个孔中的液体取出，加入2 mL 的EP管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度EP管中浸泡10 min。取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750 V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在人β2-微球蛋白浓度为0.044 µg/L~1.4 µg/L的范围内人β2-微球蛋白浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为0.03 µg/L（见图4）。
实施例7
取500 μL 10 mmol/L 的KMnO4溶液加入到1.25 mL 0.1 mol/L pH 6.0的2 -（N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲溶液中，加入去离子水使溶液最后的体积成5 mL后超声30 min，结束后12000 r.p.m离心10 min，用水洗3次，重新分散于2.5 mL去离子水中，得到二氧化锰纳米片溶液。
实施例8
试剂盒使用方法：（1）取5 μL实施例1制备的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥。并进一步将该电极浸泡在0.1 mol/L硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。取6 μL实施例7制备的MnO2纳米片溶液滴加在上述金纳米团簇探针修饰玻碳电极表面，室温干燥，得到二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极。（2）取实施例4制备的人β2-微球蛋白抗体固定酶标板，将其设为空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步骤操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在空白酶标板各孔中加入50 μL 5 mg/mL的多巴胺溶液（pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解），于4 ℃反应2 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干。再滴加200 μg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育12 h。孵育结束后用水轻轻漂洗，以便除去电极表面非特异性吸附的抗体。接着加入50 μL 1% 的BSA溶液，于4 ℃反应1 h，反应完成后洗涤（小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干）。然后在标准品孔中加入不同浓度的人β2-微球蛋白标准溶液50 μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干，再加入0.5μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37 ℃温育30 min，洗涤，拍干。每孔加入0.2U/mL的链霉亲和素-碱性磷酸酶溶液50 μL（37 ℃预热30 min），轻轻振荡混匀，37 ℃温育45 min，洗涤，拍干。再往上述酶标板中加入8 mmol/L的2-酸磷-L-抗坏血酸三钠盐溶液50μL（37 ℃预热30 min），再加入pH=8.0 Tri-Hcl 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光反应25min。（3）将各个孔中的液体取出，加入2 mL的EP管当中，将处理好的电极放入各个对应浓度EP管中浸泡10 min。取出后用双蒸水冲洗干净，N2吹干。将上述电极插入含有0.1 mol/L过硫酸钾和0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0 V，脉冲时间为10 s，终止电位为-2 V，脉冲时间为1 s。光电倍增管高压设置为750V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，在人β2-微球蛋白浓度为0.044 µg/L~1.4µg/L的范围内人β2-微球蛋白浓度的对数值与电致化学发光强度变化值呈良好的线性关系，检测限为0.03 µg/L。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征在于：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光信号猝灭剂；在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体，加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物；加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，通过碱性磷酸酶选择性水解2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸；取出反应液，将电极浸入反应液中，电极表面的二氧化锰与反应液中的抗坏血酸发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测；所述高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，将上述电极插入0.1 mol/L 、pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4 V~-2 V范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5 min~1 h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1 mol/L硼氢化钠溶液反应5min~30 min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述在空白酶标板固定人β2-微球蛋白抗体的方法为自组装法：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50~100 μL，于4 ℃反应1~5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5 mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育8~12 h，漂洗；加入50~100 μL、1 wt%~5 wt % 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5~2 h，洗涤，拍干。
3.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述加入人β2-微球蛋白，再加入生物素标记的人β2-微球蛋白抗体，形成夹心免疫复合物的方法为：在固定有人β2-微球蛋白抗体酶标板的样品反应孔中加入样本，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min~60 min，洗涤，拍干；加入0.1~10 μg/mL生物素标记的人β2-微球蛋白抗体50 μL，37 ℃温育30 min~60 min，洗涤，拍干。
4.根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述加入链霉亲和素-碱性磷酸酶，再加入2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐的方法为：在形成夹心免疫复合物的酶标板孔中每孔分别加入50 μL的0.1~1 U/mL链霉亲和素-碱性磷酸酶和5~10 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐溶液，轻轻振荡混匀，避光反应，37 ℃温育30 min~60 min。
5.根据权利要求1~4任一所述的一种基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法，其特征是所述根据电致化学发光信号的改变实现人β2-微球蛋白的检测为：电极表面所采集的电致化学发光信号的电致化学发光强度值与人β2-微球蛋白浓度的对数值在0.044 µg/L~1.4 µg/L的范围内呈线性关系，检测限为0.03 µg/L。
6.一种权利要求1-4任一所述的基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法的检测试剂盒，其特征在于，包括金纳米团簇溶液、二氧化锰纳米材料、人β2-微球蛋白抗体固定酶标板、人β2-微球蛋白标准品、生物素标记的人β2-微球蛋白抗体、链霉亲和素-碱性磷酸酶、2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐、洗涤液、电致化学发光测试电解质溶液。
7.根据权利要求6所述的基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法的检测试剂盒，其特征为所述的人β2-微球蛋白抗体固定酶标板为：取空白酶标板，在空白酶标板样品孔中加入1~5 mg/mL pH 8.5的多巴胺溶液50~100 μL，于4 ℃反应1~5 h，反应结束后用水轻轻漂洗，拍干；再滴加0.1~0.5 mg/mL人β2-微球蛋白抗体溶液，4 ℃孵育8~12 h，漂洗；加入50~100 μL 1%~5% 的牛血清白蛋白溶液，于4 ℃反应0.5~2 h，洗涤，拍干；所述洗涤液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲溶液；所述的电致化学发光测试电解质溶液为含有过硫酸钾的缓冲溶液。
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