ES2677944T3 - Detección de infección intraamniótica - Google Patents

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Abstract

Un método para la detección de inflamación o infección intraamnióticas en una muestra obtenida a partir de un sujeto mamífero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende: (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de alfa-fetoproteína (AFP) e interleucina-6 (IL-6) en relación con los niveles correspondientes de dichas proteínas en un flujo vaginalcervical normal o un flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamación o infección intraamnióticas; y (b) detectar inflamación o infección intraamnióticas en dicha muestra si se determina que dichos niveles de cada una de dichas proteínas en dicha muestra muestran una diferencia estadísticamente significativa en relación con los niveles correspondientes de cada una de dichas proteínas en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadísticamente significativa en relación con los niveles correspondientes de cada una de dichas proteínas en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamación o infección intraamnióticas.

Description

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DESCRIPCION
Deteccion de infeccion intraamniotica Campo
La presente divulgacion se refiere a ensayos para el diagnostico y/o evaluacion del riesgo de infeccion intraamniotica (IAI) en mujeres embarazadas. La presente divulgacion se refiere adicionalmente a ensayos, algoritmos de diagnostico, biomarcadores, materiales, metodos y dispositivos relacionados con el uso de biomarcadores para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo y proporcionar sistemas de ensayo diagnostico para tal diagnostico, as! como diversas otras realizaciones tal como se describen en el presente documento.
Antecedentes
El nacimiento prematuro es la causa principal de muerte en el primer mes de vida y un factor contribuyente en mas de un tercio de todas las muertes infantiles. La infeccion intraamniotica (IAI) es una de las causas principales del nacimiento prematuro idiopatico a las <37 semanas de gestacion. Otras afecciones asociadas con el nacimiento prematuro incluyen parto prematuro, ruptura prematura de membranas, preeclampsia, desprendimiento placentario, placenta previa, retraso del crecimiento fetal, volumen de fluido amniotico excesivo o inadecuado, anomallas fetales, hemorragia intrauterina, diabetes, abuso de farmacos y estres. El tratamiento de parto prematuro y nacimiento prematuro puede incluir el tratamiento con agentes tocollticos y corticosteroides para la maduracion pulmonar fetal, si se indica. Pueden prescribirse antibioticos de espectro reducido para la cobertura de estreptococos del Grupo B a la espera de resultados de cultivo negativos.
La IAI es una de las causas mas importantes de parto prematuro idiopatico y nacimiento prematuro. La IAI es una invasion microbiana de la cavidad amniotica y se produce en el 10 -15 % de todos los casos de parto prematuro. (Newton ER. Clin Obstet Gynecol 1993;36(4):795-808; Watts DH, et al., Obstet Gynecol 1992;79:351-7; Romero R, et al., Am J Obstet Gynecol 1993;169:805-16; Hillier SL, et al., Obstet Gynecol 1993;81:941-8). Otros terminos que se usan para describir la IAI con o sin membranas intactas incluyen: infeccion de fluido amniotico, amnionitis y corioamnionitis cllnica. Ademas del papel de la IAI como una causa de parto prematuro, la IAI tambien esta asociada con morbilidad y mortalidad neonatal aumentada, particularmente entre neonatos prematuros. En general, se ha observado un aumento de tres a cuatro veces en la mortalidad perinatal entre neonatos con nacimiento de bajo peso nacidos de madres con IAI. Tambien hay aumentos en slndrome de dificultad respiratoria, hemorragia intraventricular y sepsis neonatal. (Morales, W.J. Obstetrics and Gynecology 70:183, 1987). La IAI ha estado independientemente implicada en leucomalacia periventricular neonatal y paralisis cerebral; los riesgos de dano de materia blanca cerebral y paralisis cerebral son nueve veces superiores en el marco de IAI. (Bejar,R., et al., Am.J.Obstet.Gynecol. 159:357, 1988; Grether,J.K. and Nelson,K.B. JAMA 278:207, 1997).
La mayorla de los casos de IAI, del 80 % al 90 %, son subcllnicos (asintomaticos) distintos del parto prematuro. Actualmente, el tratamiento de parto prematuro idiopatico incluye la observacion, tratamiento con agentes tocollticos y posible confirmacion de IAI mediante amniocentesis y cultivo. El cultivo de fluido amniotico solo subestima la verdadera prevalencia de IAI debido a la presencia de microorganismos no aptos para el cultivo, dificultad en el aislamiento de microorganismos delicados y terapia antibiotica previa (Romero, R. et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 161:817, 1989). Un ensayo de IAI positivo o la presente divulgacion proporcionarla un complemento util para los diagnosticos actuales y regimen de tratamiento disponibles para el cllnico. El diagnostico preciso de IAI es importante para el tratamiento apropiado de la madre con antibioticos dirigidos, denegando la terapia tocolitica que esta contraindicada en la IAI as! como anticipando la ubicacion del parto para la madre y el nivel necesario de cuidado para el lactante que puede ser muy prematuro y enfermo como una consecuencia en exceso de la IAI.
Un ensayo de IAI negativo de la presente divulgacion proporciona la seguridad de que la etiologla del parto prematuro puede ser de orlgenes distintos a la infeccion. Un ensayo negativo, junto con la observacion 30 de otras senales y/o slntomas, permite al medico tratar el parto prematuro.
Patogenesis y factores de riesgo: La infeccion intraamniotica se produce como resultado de una infeccion ascendente por microorganismos del tracto genital inferior. La prevalencia de la IAI tiene una fuerte correlacion inversa con la edad gestacional. (Watts DH, et al., Obstet Gynecol 1992;79:351-7). Las bacterias indlgenas al tracto genital inferior se recuperan del fluido amniotico del 10-20 % de todas las mujeres en parto prematuro con membranas amnioticas intactas sin signos cllnicos de IAI (Romero R, et al., Ann N Y Acad Sci 1991;622:355-75) y en hasta un 67 % de las mujeres en parto prematuro con embarazo que terminan a las 23-24 semanas de gestacion. (Watts DH, et al., Obstet Gynecol 1992;79:351-7). Ademas, estas observaciones estan respaldadas por la corioamnionitis histologica que se ha encontrado en un 60-90 % de las gestaciones que finalizan entre las 20 y 24 semanas. Estas observaciones apoyan la hipotesis de que la IAI es una causa importante de parto prematuro idiopatico, especialmente en edades gestacionales tempranas.
Diagnostico: Un diagnostico de IAI temprano permitirla el tratamiento e intervencion a tiempo. Sin embargo, hay
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multiples problemas en la realization del correcto diagnostico. Desde el punto de vista cllnico, el diagnostico temprano resulta problematico puesto que los signos y slntomas cllnicos de la IAI aparecen tarde en el transcurso de la infection y son, en general, no especlficos. Los criterios cllnicos usados comunmente para diagnosticar la IAI incluyen parto prematuro con fiebre materna (> 37,8 °C), junto con dos o mas de los siguientes: leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna o fetal, sensibilidad uterina o fluido amniotico fetido. (Gibbs RS, et al., Am J Obstet Gynecol 1980;136(6):709-13). En un estudio por Watts, et al., de mujeres con parto prematuro, no hubo diferencia en la temperatura materna maxima media, recuento de WBC y diferencial entre mujeres con o sin cultivos de fluido amniotico positivo. La IAI subcllnica es un termino usado para describir una IAI y en la cual los signos y slntomas son mlnimos o ausentes en aproximadamente el 88 % de los casos con cultivos de fluido amniotico positivo. (Watts DH, et al., Obstet Gynecol 1992;79:351-7). El concepto de IAI subcllnica se corrobora adicionalmente por los hallazgos de Gravett, et al., utilizando un modelo de primate no humano. Estos investigadores demostraron que despues de una IAI experimental inducida con estreptococos del Grupo B, solo hay fiebre y leucocitosis en un 50 % del tiempo al inicio del parto prematuro inducido con infeccion, el cual se produce de 28 a 40 horas despues de la infeccion experimental. (Gravett MG, et al., Am J Obstet Gynecol 1994; 171(6): 1660-7).
Debido a la inconsistencia de caracterlsticas cllnicas, se han utilizado otros ensayos de laboratorio complementarios 30 para ayudar en el diagnostico de IAI. Estos incluyen: medicion de protelna C-reactiva materna, examination directa de fluido amniotico o leucocitos o bacterias sobre tincion de Gram, cultivo de fluido amniotico, medicion de concentraciones de glucosa en fluido amniotico, detection de esterasa leucocitaria en fluido amniotico, detection de acidos organicos bacterianos mediante cromatografla gas-llquido, mediciones de diversas citocinas en fluido amniotico (por ejemplo, interleucinas 2, 4, 6, factor estimulante de colonias de granulocitos y factor de necrosis tumoral-alfa), metaloproteinasa-9 de matriz, lactoferrina y evaluation de la actividad fetal (perfil bioflsico) mediante ultrasonografla. La medicion de citocinas u otros factores bioqulmicos resulta costoso, no esta cllnicamente disponible y es principalmente una herramienta de investigation. Ademas, la eficacia de evaluacion de estos ensayos no ha sido consistentemente mejor que otros ensayos tradicionales facilmente disponibles tales como tincion de Gram y cultivo de fluido amniotico, concentraciones de glucosa en fluido amniotico y deteccion de esterasa leucocitaria en fluido amniotico. La eficacia de estos ensayos se ha revisado exhaustivamente anteriormente. (Ohlsson, A. and Wang, E.: An analysis of antenatal tests to detect infection at preterm rupture of the membranes. American Journal of Obstetrics and Gynecology 162:809, 1990). Aunque todos tienen una sensibilidad, especificidad y valor predictivo razonables, ninguno es lo suficientemente sensible o especlfico para usarse independientemente de las caracterlsticas cllnicas en el diagnostico de IA.
Por consiguiente, existe una gran necesidad de nuevo enfoques que permitan el diagnostico temprano y preciso de IAI.
El documento US 2007/0161125 A1 desvela de identification de proteomas de fluidos biologicos y su uso en la determination del estado de afecciones maternas/fetales, incluyendo afecciones maternas de origen fetal, aneuploidlas cromosomicas y enfermedades fetales asociadas con el crecimiento fetal y maduracion. Se desvela el analisis proteomico de fluido amniotico (FA) y flujo vaginal cervical (FVC), junto con la correlation de cambios en el proteoma normal con diversas afecciones maternas/fetales patologicas, tales como infecciona intraamniotica, parto prematuro y/o defectos cromosomicos. Tambien se describe identificacion de biomarcadores y grupos de biomarcadores que pueden usarse para el diagnostico no invasivo de trastornos relacionados con el embarazo, junto con ensayos de diagnostico que usan tales biomarcadores.
GRAVETT MICHAEL G et al., JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 6, n.° 1, 1 de enero de 2007, paginas 89-96 desvela que la infeccion intraamniotica (IAI) esta asociada con el nacimiento prematuro y la mortalidad perinatal. Los autores realizan un estudio exhaustivo de proteoma de flujo vaginal cervical (FVC) a partir de un modelo de IAI de primate utilizando tecnologla de identificacion de protelnas multidimensional (LC/lC-MS/MS) y analisis MALDI-TOF-MS. Los autores informan que estos analisis de proteoma de FVC identifican 205 protelnas unicas y la expresion diferencial de protelnas 27 en controles y muestras de IAI. Se describe el uso de distintivos de expresion de protelnas e inmunodeteccion de biomarcadores especlficos para la deteccion no invasiva de IAI.
HITTI et al., AMERICAN JOURNAL OF OBSTETRICS & GYNECOLOGY, vol. 195, n.° 6, 1 de diciembre de 2006, pagina S5, describe un analisis del proteoma del flujo vaginal con el fin de identificar predictores no invasivos de infeccion intraamniotica (IAI) y nacimiento prematuro (PTB).
HOLST ROSE-MARIE et al., ACTA OBSTETRICIA ET GYNECOLOGICA SCANDINAVICA, vol. 84, n.° 6, junio de 2005, paginas 551-557 desvela que IL-6>1,7 ng/ml cervical estaba relacionada con la inflamacion intraamniotica y tenia una sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y un valor predictivo negativo del 58, 83, 75 y 69 %, respectivamente, en la identificacion de inflamacion intraamniotica. Se informo de datos similares para L- 8>6,7 ng/ml.
JACOBSSON BO et al., AMERICAN JOURNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY, vol. 189, n.° 4, octubre de 2003 (10-2003), paginas 1161-1167, desvela que la proteina-1 quimiotactica de monocitos en fluido amniotico y cervical era superior en mujeres con parto prematuro que en mujeres a termino. La proteina-1 quimiotactica de monocitos en mujeres con parto prematuro se asocio con la invasion microbiana de la cavidad amniotica, inflamacion
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intraamniotica, parto a los 7 dlas y a las <34 semanas. La protelna-1 quimiotactica de monocitos estaba correlacionada con la invasion microbiana de la cavidad amniotica en mujeres con ruptura prematura de membranas pretermino, inflamacion intraamniotica en parto prematuro, ruptura prematura de membranas pretermino, parto a los 7 dlas y parto a las <34 semanas en mujeres con parto prematuro.
El documento WO 2008/057160 desvela ensayos multiplex, que incluyen paneles de sondas para el desarrollo de ensayos multiplex capaces de medir simultaneamente multiples protelnas biologicamente relevantes usando muy pequenas cantidades de muestras biologicas para evaluar rapidamente el estado de salud de animales, especialmente animales de companla, as! como para formular reglmenes nutricionales para mejorar el estado de salud de animales.
El documento US 2007/0178605 A1 desvela metodos y composiciones relacionadas con perfiles de biomarcadores para cada trimestre de embarazo. Tambien se describen metodos para identificar pacientes con riesgo de desarrollar una complicacion en el embarazo, tal como preeclampsia.
El documento US6.008.056 desvela un metodo para evaluar un volumen preseleccionado de muestra sobre una tira cromatografica que incluye proporcionar un deposito receptor de muestras.
Sumario
La presente invencion se refiere a ensayos para el diagnostico y/o evaluacion del riesgo de infeccion intraamniotica (IAI) en mujeres embarazadas, segun se define mediante las reivindicaciones. La divulgacion se refiere adicionalmente a la identificacion y detection de biomarcadores y grupos o combinaciones de biomarcadores que pueden usarse para el diagnostico no invasivo de infeccion intraamniotica (IAI) y ensayos de diagnosticos usando tales biomarcadores, que incluye un ensayo no invasivo basado en el uso de una unica combination de tres biomarcadores de protelnas para diagnosticar y/o evaluar el riesgo de infeccion intraamniotica (IAI) en mujeres embarazadas. La presente divulgacion se refiere generalmente a materiales y procesos usados para crear el ensayo desarrollado en laboratorio de infeccion intraamniotica y el dispositivo de diagnostico in vitro y a biomarcadores que tienen utilidad cllnica en el diagnostico de IAI. En particular, la divulgacion se refiere a materiales y procesos usados para crear un dispositivo de diagnostico in vitro para diagnosticas o evaluar el riesgo de IAI analizando una muestra biologica, tal como flujo vaginal cervical (FVC) obtenido a partir de una mujer embarazada. En particular, la presente divulgacion se refiere a biomarcadores que, especialmente cuando se usan en combinacion con un algoritmo de diagnostico, tienen la capacidad de predecir la presencia de IAI usando un ensayo de inmunodiagnostico, a base de hisopado cervical vaginal no invasivo con un alto grado de precision. Esta combinacion unica de marcadores, cuando se usan en combinacion con un algoritmo de diagnostico, tienen la capacidad de predecir la presencia de IAI usando un ensayo de inmunodiagnostico, a base de hisopado cervical vaginal no invasivo con un alto grado de precision.
En una realization, la divulgacion proporciona paneles nuevos de biomarcadores que pueden medirse y usarse para determinar la presencia o ausencia de IAI en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo.
En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto en nivel de alfa fetoprotelna (AFP) e interleucina6 (IL-6) con respecto al nivel en flujo vaginal-cervical normal o flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y (b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadlsticamente significativas en relation con el nivel en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel de dicho flujo vaginal- cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica. En una realizacion, el sujeto es un paciente humano. En determinadas realizaciones, el metodo de la divulgacion incluye medir la abundancia de al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o de todas las protelnas.
En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto los niveles de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con los niveles correspondientes de dichas dos o mas protelnas en flujo vaginal-cervical normal o flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y (b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que cada uno de dichos niveles de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicha muestra demuestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas protelnas en flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica. En una realizacion, el sujeto es un paciente
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humano. En determinadas realizaciones, el metodo de la divulgacion incluye medir los niveles de al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o de todas las protelnas.
En una realization, los biomarcadores medidos incluyen oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a) y protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b). En otra realizacion, los biomarcadores medidos incluyen oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a) y alfa-1-glicoproteina acida (A1AG). En otra realizacion mas, los biomarcadores medidos incluyen alfa-1-glicoproteina acida (A1AG) y protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b). En estas realizaciones, biomarcadores adicionales medidos pueden incluir alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) y/o inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En realizaciones adicionales, los biomarcadores medidos pueden incluir protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1).
En determinadas realizaciones, los biomarcadores medidos incluyen inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP- 1) y oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a). En determinadas realizaciones, los biomarcadores medidos incluyen inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP1) y protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b). En determinadas realizaciones, los biomarcadores medidos incluyen inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1) y alfa-1-glicoproteina acida (A1AG). En estas realizaciones, biomarcadores adicionales medidos pueden incluir interleucina-6 (IL-6).
En determinadas realizaciones, los biomarcadores medidos pueden incluir alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL- 6) y protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b). En determinadas realizaciones, los biomarcadores medidos incluyen interleucina-6 (IL-6), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), protelnas de union de lipolisacaridos (LBP), oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a) y alfa fetoprotelna (AFP).
En una realizacion, los metodos de la divulgacion incluyen medir el nivel de protelnas de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1- glicoproteina acida (A1AG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), as! como diagnosticar dicho sujeto con infection intraamniotica, si dos o mas dichas protelnas sometidas a ensayo muestran una diferencia estadlsticamente significativa en la muestra de flujo vaginal-cervical en relation con un flujo vaginal-cervical normal.
En una realizacion, los metodos de la divulgacion incluyen medir los niveles de cada dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1- glicoproteina acida (A1AG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), as! como diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica, si el nivel de cada una de las dos o mas dichas protelnas sometidas a ensayo muestran una diferencia estadlsticamente significativa en la muestra de flujo vaginal-cervical en relacion con el nivel de protelnas correspondiente en un flujo vaginal-cervical normal.
En determinadas realizaciones, los metodos de la divulgacion incluyen diagnosticar el sujeto con infeccion intraamniotica, si los niveles de todas dichas protelnas sometidas a ensayo muestran una diferencia estadlsticamente significativa en la muestra de flujo vaginal-cervical en relacion con los niveles correspondientes de dichas protelnas en un flujo vaginal-cervical normal. En todas las realizaciones, el nivel de protelnas identificadas en el presente documento puede determinarse mediante un inmunoensayo. En determinadas realizaciones, los niveles de protelnas identificadas en el presente documento pueden determinarse usando una matriz de protelnas. En determinadas realizaciones, los niveles de protelnas identificadas en el presente documento pueden determinarse usando un dispositivo de ensayo inmunocromatografico. En determinadas realizaciones que usan un dispositivo de ensayo inmunocromatografico, los niveles de protelnas identificadas en el presente documento pueden determinarse usando un dispositivo de ensayo inmunocromatografico que comprende una o mas tiras de ensayo cromatografico. En determinadas realizaciones que usan un dispositivo de ensayo inmunocromatografico, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico es un dispositivo de flujo lateral.
En determinadas realizaciones, la invention proporciona un dispositivo de ensayo inmunocromatografico que comprende tiras de cromatografla para la detection de alfa fetoprotelna (AFP) e interleucina-6 (IL-6). En realizaciones, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico comprende tiras de ensayo que comprenden anticuerpos a dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En realizaciones, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico es un dispositivo de flujo lateral.
En determinadas realizaciones, la divulgacion proporciona un dispositivo de ensayo inmunocromatografico que comprende tres o mas tiras de cromatografla para la deteccion de tres o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union IGF-1
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(IGFBP-1), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En realizaciones, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico comprende tiras de ensayo que comprenden anticuerpos a tres o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union IGF-1 (IGFBP-1), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos- 1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En realizaciones, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico es un dispositivo de flujo lateral.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende:
(a) obtener una muestra de flujo vaginal-cervical de dicho sujeto; (b) determinar el nivel de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM- 1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con los niveles correspondientes de dichas dos o mas protelnas en flujo vaginal-cervical normal o flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dichos niveles de cada una de dichas dos o mas protelnas muestra una diferencia estadlsticamente significativas en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para determinar signos y slntomas que indican infeccion intraamniotica que comprenden
(a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM- 1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con el nivel en flujo vaginal-cervical normal o flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel de dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica. En determinadas realizaciones, los signos y slntomas incluyen, pero sin limitacion, fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna y/o fetal, sensibilidad uterina y/o fluido amniotico fetido.
En otro aspecto, la divulgacion proporciona metodos para determinar signos y slntomas que indican infeccion intraamniotica que comprenden
(a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto los niveles de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM- 1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con los niveles correspondientes de dichas dos o mas protelnas en flujo vaginal-cervical normal o en relacion con los niveles correspondientes de dichas dos o mas protelnas en flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que cada uno de dichos niveles de dichas dos o mas protelnas en dicha muestra demuestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas dos o mas protelnas en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica. En determinadas realizaciones, los signos y slntomas incluyen, pero sin limitacion, fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna y/o fetal, sensibilidad uterina y/o fluido amniotico fetido.
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En un aspecto, la divulgacion se refiere un metodo para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto mamlfero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende:
(a) someter a ensayo una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto los niveles de a- fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1); y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si cada uno de dichos niveles de AFP, IL-6 y IGFBP-1 en dicha muestra se determina que muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de AFP, Il-6 y IGFBP-1 en flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de AFP, IL-6 y IGFBP-1 en flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
En una realizacion, el paciente es un paciente humano.
En otra realizacion se implementa un ensayo usando un aparato adaptado para determinar el nivel de protelnas.
En aun otra realizacion se realiza el ensayo usando un programa de software ejecutado por un procesador adecuado.
En una realizacion adicional, el programa esta materializado en software almacenado sobre un medio tangible.
En todavla una realizacion adicional, el medio tangible se selecciona del grupo que consiste en una memoria flash, un CD-ROM, un disquete, un disco duro, un DVD y una memoria asociada con el procesador.
En una realizacion distinta, el metodo comprende ademas la etapa de preparar un informe que registra los resultados de dicho ensayo o el diagnostico, donde el informe puede registrarse o almacenarse sobre un medio tangible, tal como papel, memoria flash, un CD-ROM, un disquete, un disco duro, un DVD o una memoria asociada con el procesador.
En otra realizacion, el metodo comprende ademas la etapa de comunicar los resultados de dichos diagnosticos a una parte interesada, tal como el paciente o el medico interviniente. En diversas realizaciones, la comunicacion es por escrito, por e-mail o por telefono.
En otra realizacion mas, los niveles de protelnas se determinan mediante un inmunoensayo.
En una realizacion adicional, los niveles de protelnas se determinan mediante un ensayo inmunocromatografico, que puede emplear un dispositivo de flujo lateral.
En otras realizaciones adicionales, los niveles de protelnas se determinan mediante espectrometrla de masas o mediante el uso de una matriz de protelnas.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un kit de inmunoensayo que comprende anticuerpos y reactivos para la deteccion de a-fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1).
En otro aspecto mas, la divulgacion se refiere a un dispositivo de ensayo inmunocromatografico que comprende una o mas tiras de cromatografla para la deteccion de a-fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1).
En una realizacion, en el dispositivo de ensayo inmunocromatografico la tira de ensayo o tiras de ensayo comprende(n) anticuerpos de a-fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1).
En otra realizacion, el dispositivo de ensayo inmunocromatografico es un dispositivo de flujo lateral.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un informe que comprende los resultados de y/o diagnostico basado en un ensayo que comprende
(a) someter a ensayo una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto los niveles de a- fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1); y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadlsticamente significativas en relacion con el nivel en flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel de flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un informe que comprende los resultados de y/o diagnostico basado en un ensayo que comprende
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(a) someter a ensayo una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto los niveles de a- fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1); y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si cada uno de dichos niveles de AFP, IL-6 y IGFBP-1 se determina que muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel correspondiente de AFP, Il-6 y IGFBP-1 en flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel correspondiente de AFP, IL-6 y IGFBP-1 en flujo vaginal- cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un medio tangible que almacena los resultados de y/o diagnostico basado en un ensayo que comprende
(a) someter a ensayo una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de a- fetoprotelna, interleucina-6 (IL-6) y protelna de union de IGF-1 (IGFBP-1); y
(b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadlsticamente significativas en relacion con el nivel en flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con el nivel de flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
En determinadas realizaciones, la medicion se implementa un ensayo usando un aparato adaptado para determinar el nivel de dichas protelnas. En otra realizacion, la medicion se realiza el ensayo usando un programa de software ejecutado por un procesador adecuado. En determinadas realizaciones, el programa esta materializado en software almacenado sobre un medio tangible. En determinadas otras realizaciones, el medio tangible se selecciona del grupo que consiste en una CD- ROM, un disquete, un disco duro, un DVD y una memoria asociada con el procesador.
En determinadas realizaciones, los metodos de la divulgacion incluyen adicionalmente una etapa de preparacion de un informe que registra los resultados del ensayo o el diagnostico. En una realizacion, el informe se registra o almacena sobre un medio tangible. En una realizacion especlfica, el medio tangible es papel. En otra realizacion, el medio tangible se selecciona del grupo que consiste en una CD- ROM, un disquete, un disco duro, un DVD y una memoria asociada con el procesador.
En determinadas otras realizaciones, los metodos de la divulgacion incluyen ademas una etapa de comunicar los resultados de dichos diagnosticos a una parte interesada. En una realizacion, la parte interesada es el paciente o el medico interviniente. En otra realizacion, la comunicacion es por escrito, por e-mail o por telefono.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un kit de inmunoensayo que comprende anticuerpos y reactivos para la deteccion de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En una realizacion, el kit de inmunoensayo incluye anticuerpos y reactivos para la deteccion de todas las protelnas identificadas en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un kit de inmunoensayo que comprende anticuerpos y reactivos para la deteccion de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union IGF-1 (IGFBP-1), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). En una realizacion, el kit de inmunoensayo incluye anticuerpos y reactivos para la deteccion de todas las protelnas identificadas en el presente documento.
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un kit de inmunoensayo que comprende anticuerpos y reactivos para la deteccion de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1).
En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona un informe que comprende los resultados y/o diagnostico basado en un ensayo que comprende (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de dos o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con el nivel en flujo vaginal-cervical normal o flujo
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vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y (b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadisticamente significativas en relacion con el nivel en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadisticamente significativa en relacion con el nivel de dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un medio tangible que almacena los resultados y/o diagnostico basado en un ensayo que comprende (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de dos o mas proteinas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), proteina inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoproteina (AFP), interleucina-6 (IL-6), proteina de union de lipolisacaridos (LBP), molecula-1 de adhesion celular vascular (VCAM-1), proteina quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), en relacion con el nivel en flujo vaginal-cervical normal o flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica; y (b) diagnosticar dicho sujeto con infeccion intraamniotica si se determina que dicho nivel muestra una diferencia estadisticamente significativa en relacion con el nivel en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadisticamente significativa en relacion con el nivel de dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de infeccion intraamniotica.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de GROalfa (Ensayo 1) en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 2 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de MIP 1b en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 3 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de MCP-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 4 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de B2MG en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 5 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de TIMP-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 6 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de A1AG en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 7 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de IL-6 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 8 muestra el valor de logaritmo natural de LBP en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 9 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de AFP en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 10 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de VCAM-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
La Figura 11 ilustra el AUROC de un modelo de tres marcadores para la prediccion de IAI frente a no IAI. La sensibilidad es del 86 %, la especificidad del 85 %.
La Figura 12 ilustra el AUROC de un modelo de cinco marcadores para la prediccion de IAI frente a no IAI. La sensibilidad es del x % y la especificidad del y %.
La figura 13 ilustra los niveles de puntuacion del biomarcador Z del estado de IAI compuesto de 0 o 1.
La Figura 14 ilustra los datos que se muestran en la Figura 13 con graficos de Sensibilidad frente a 1- Especifidad, con un AUROC de 0,86. La sensibilidad fue del 82 %, la especificidad del 85 %, el PPV del 33 % y el NPV del 98 %.
La Figura 15 ilustra un grafico de Kaplan-Meier que muestra el tiempo de parto por el estado de FVC y el estado de infeccion de FA.
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La figura 16 ilustra los niveles de puntuacion del biomarcador Z del estado de IAI compuesto de 0 o 1.
La Figura 17 ilustra los datos que se muestran en la Figura 16 con graficos de Sensibilidad frente a 1- Especifidad, con un AUROC de 0,88. La sensibilidad fue del 82 %, la especificidad del 89 %, el PPV del 41 % y el NPV del 98 %.
Descripcion detallada Definiciones
Debe comprenderse que esta divulgacion no se limita a realizaciones particulares, que pueden, por supuesto, variar. Tambien se comprende que la terminologla usada en la presente memoria es unicamente con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante. Tal y como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, los terminos en singulares y las formas singulares "un", "uno", "una" y "el", "la", por ejemplo, incluyen opcionalmente referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una sonda" opcionalmente incluye una pluralidad de moleculas de sonda; de manera similar, dependiendo del contexto, el uso del termino "un acido nucleico" opcionalmente incluye, de manera practica, muchas copas de esa molecula de acido nucleico. Las designaciones de letras de genes o protelnas pueden referirse a la forma del gen y/o la forma de la protelna, dependiendo del contexto. Un experto es completamente capaz de relacionar el acido nucleico y las formas de aminoacidos de las moleculas biologicas relevantes mediante referencia a las secuencias del presente documento, secuencias conocidas y el codigo genetico.
Salvo que definan de otro modo, los terminos tecnicos y cientlficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente una persona normalmente experta en la tecnica a la cual pertenece la presente divulgacion. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994) proporciona a un experto en la tecnica con una gula general de muchos de los terminos usados en la presente solicitud.
Los terminos "que corresponde" y "corresponder" y equivalentes gramaticales se usan en el presente documento para sustancias analogas o similares; por ejemplo, cuando se hace referencia a dos mezclas de protelnas, protelna A en la primera mezcla corresponde a, y es la protelna correspondiente de, la protelna A en la segunda mezcla; la protelna B en la primera mezcla corresponde a, y es la protelna correspondiente de, la protelna B en la segunda mezcla; y as! sucesivamente.
El termino "proteoma" tal como se usa en el presente documento describe una parte significativa de protelnas en una muestra biologica en un momento dado. El concepto de proteoma es fundamentalmente distinto del de genoma. Mientras que el genoma es practicamente estatico, el proteoma cambia continuamente en respuesta a factores internos y externos.
El termino "perfil proteomico" se usa para referirse a la representacion del patron de expresion de una pluralidad de protelnas en una muestra biologica, por ejemplo, un fluido biologico en un momento dado. El perfil proteomico puede, por ejemplo, representarse como un espectro de masas, pero tambien se incluyen otras representaciones basadas en cualquier propiedad fisicoqulmica o bioqulmica de las protelnas. Por lo tanto, el perfil proteomico puede, por ejemplo, basarse en diferencias en las propiedades electroforeticas de las protelnas, tal como se determina mediante electroforesis en gel bidimensional, por ejemplo, mediante 2-D PAGE, y puede representarse, por ejemplo, como una pluralidad de manchas en un gel de electroforesis bidimensional. Los perfiles de expresion diferencial pueden tener un valor de diagnostico importante, incluso en la ausencia de protelnas especlficamente identificadas. Las manchas de protelnas unicas pueden detectarse, a continuacion, por ejemplo, mediante inmunotransferencia, multiples manchas o protelnas que usan micromatrices. El perfil proteomico representa normalmente o contiene informacion que podrla variar de unos pocos picos a un perfil complejo que representara 50 o mas picos. Por lo tanto, por ejemplo, el perfil proteomico puede contener o representar el menos 2, o al menos 5 o al menos 10 o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25, o al menos 30, o al menos 35, o al menos 40, o al menos 45, o al menos 50, o al menos 60, o al menos 65, o al menos 70, o al menos 75, o al menos 80, o al menos 85, o al menos 85, o al menos 90, o al menos 95, o al menos 100, o al menos 125, o al menos 150, o al menos 175, o al menos 200 protelnas.
El termino "afeccion patologica" se usa en su sentido mas amplio y cubre todos los cambios y fenomenos que comprometen el bienestar de un sujeto. Afecciones maternas patologicas incluyen, sin limitacion, infeccion intraamniotica, afecciones de origen materno o fetal, tales como, por ejemplo, preeclampsia y parto y alumbramiento prematuro. Afecciones fetales patologicas incluyen, sin limitacion, defectos cromosomicos (aneuploidlas), tales como slndrome de Down y todas las anomallas en edad gestacional y madurez fetal.
El termino "estado de una afeccion [materna o fetal] patologica" se usa en el presente documento en su sentido mas amplio y se refiere a la ausencia, presencia, magnitud, fase, naturaleza, progresion o regresion de la afeccion patologica.
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El termino "distintivo de expresion unica" se usa para describir un rasgo unico o motivo dentro del perfil proteomico de una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de referencia) que difiere del perfil proteomico de una muestra biologica normal correspondiente (obtenida a partir del mismo tipo de fuente, por ejemplo, fluido biologico) de un modo estadlsticamente significativo.
Los terminos "infeccion intraamniotica (IAI)", "infeccion de fluido amniotico", "amnionitis", y "corioamnionitis cllnica" se usan indistintamente y se refieren a una infeccion aguda, que incluye, pero no restringida a contenidos bacterianos, del fluido amniotico e intrauterinos durante el embarazo.
La "respuesta del paciente" puede evaluarse usando cualquier criterio de valoracion que indique un beneficio para el paciente, que incluye, sin limitacion, (1) inhibicion, al menos hasta cierto punto, de la progresion de la afeccion patologica, (2) prevencion de la afeccion patologica, (3) alivio, al menos hasta cierto punto, de uno o mas slntomas asociados con la afeccion patologica; (4) aumento en la duracion de supervivencia despues del tratamiento; y/o (5) disminucion de mortalidad en un momento dado despues del tratamiento.
El termino "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, cuyo objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) la afeccion o trastorno patologico diana. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, as! como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se quiera prevenir el trastorno.
La "malformacion congenita" es una anomalla que no es hereditaria pero que existe en el nacimiento.
La designacion de cualquier protelna particular, tal como se usan en el presente documento, incluye todos los fragmentos, precursores y variantes de origen natural, tales como variantes e isoformas alelicas y alternativamente empalmadas, as! como formas solubles de la protelna nombrada, junto con homologos de secuencia nativa (que incluye todas las variantes de origen natural) en otras especies. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se indica que la abundancia de protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (Swiss-Prot Acc. No. P13236) se somete a ensayo, la afirmacion incluye especlficamente el ensayo de cualquier fragmento, precursor o variante de origen natural de la protelna enumerada segun Swiss-Prot Acc. No. 13236, as! como sus homologos no humanos y variantes de origen natural del mismo, si es sujeto no es humano.
Descripcion detallada
La presente divulgacion se refiere a metodos y medios para un ensayo temprano, fiable y no invasivo de afecciones maternas y fetales segun el perfil proteomico de un fluido biologico de la madre o el feto. En particular, la presente divulgacion esta basada en el descubrimiento de marcadores de protelnas que estan diferencialmente presentes en muestras de pacientes con IAI y sujetos de control, y la aplicacion de este descubrimiento en metodos y kits para determinar la presencia o ausencia de IAI. Estos marcadores de protelnas se encuentras en muestras de pacientes con IAI en niveles que son distintos a los niveles en muestras de pacientes sin IAI. Por consiguiente, la cantidad de dos o mas marcadores encontrados en una muestra de ensayo en comparacion con una de control, o la presencia o ausencia de dos o mas marcadores en la muestra de ensayo proporciona informacion util con respecto al estado de la IAI del paciente.
La presente divulgacion tambien se refiere a metodos y medios para un ensayo temprano, fiable y no invasivo de afecciones maternas y fetales segun el perfil proteomico de un fluido biologico de la madre o el feto. En particular, la presente divulgacion proporciona ensayos diagnosticos y prognosticos para la deteccion temprana y fiable de IAI midiendo alfa fetoprotelna (a-fetoprotelna), interleucina-6 (IL-6) y protelna de union al factor de crecimiento de insulina-1 (IGFBP-1) en un fluido biologico, tal como flujo vaginal cervical (FVC), obtenido a partir de una mujer embarazada o feto.
La divulgacion se basa a demas en el descubrimiento de que la incorporacion de los signos y slntomas del sujeto, por ejemplo, fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna o fetal, sensibilidad uterina o fluido amniotico fetido, en el algoritmo de diagnostico resulta util en la determination de si la IAI esta presente o ausente.
La divulgacion utiliza tecnicas proteomicas bien conocidas en la tecnica, como se describe, por ejemplo, en los siguientes libros de texto: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice), M. R. Wilkins et al., eds., Springer Verlag, 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link, editor, Humana Press, 1999; Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud editor, Springer Verlag, 2000; Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice), P. James editor, Springer Verlag, 2001; Introduction to Proteomics, D. C. Liebler editor, Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier et al., eds., John Wiley & Sons, 2002.
El experto en la materia reconocera muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podran utilizarse en la practica de la presente divulgacion. De hecho, la presente
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divulgacion no esta limitada en modo alguno por los metodos y materiales descritos.
1. Identificacion de proteinas y polipeptidos expresados en fluidos biologicos
De acuerdo con la presente divulgacion, el analisis proteomico de fluidos biologicos puede llevarse a cabo usando diversos metodos conocidos en la tecnica. Estos fluidos biologicos incluyen, por ejemplo, flujo vaginal-cervical (FVC), sangre del cordon umbilical, suero neonatal, llquido cefalorraquldeo (LCR), fluido amniotico, suero, plasma, orina, llquido cefalorraquldeo, leche materna, moco, saliva y sudor.
Normalmente, los patrones protelnicos (mapas de proteomas) de muestras de distintas fuentes, tales como fluido biologico normal (muestra normal) y un fluido biologico de ensayo (muestra de ensayo), se comparan para detectar proteinas que estan reguladas en positivo o en negativo en una enfermedad. Estas proteinas pueden escindirse para su identificacion y caracterizacion completa, por ejemplo, usando inmunoensayos, identificacion genetica de masa de peptido y/o espectrometria de masas y metodos de secuenciacion, o el mapa de proteomas especifico de la enfermedad y/o normal puede usarse directamente para el diagnostico de la enfermedad de interes, o para confirmar la presencia o ausencia de la enfermedad.
En analisis comparativos, es importante tratar las muestras normales y de ensayo exactamente del mismo modo, para representar correctamente el nivel relativo o abundancia de proteinas y obtener resultados precisos. La cantidad requerida de proteinas totales dependera de la tecnica analitica usada y puede determinarse facilmente por un experto en la tecnica. Las proteinas presentes en las muestras biologicas se separan normalmente mediante electroforesis en gel bidimensional (2-DE) segun su pl y peso molecular. Las proteinas se separan en primer lugar por su carga usando isoelectroenfoque (electroforesis en gel unidimensional). Esta etapa puede, por ejemplo, llevarse a cabo usando tiras de gradiente de pH inmovilizado (IPG), que estan disponibles en el mercado. La segunda dimension es un analisis SDS_PAGE normal, en el que la tira de IPG enfocada se usa como muestra. Despues de la separation de 2-DE, las proteinas pueden visualizarse con tintes convencionales, tal como azul de Coomassie o tincion de plata, y formadas por imagenes usando tecnicas y equipamiento, tal como, por ejemplo, densitometro Bio-Rad 10 GS800 y software PDQUEST, que ambos estan disponibles en el mercado.
Manchas individuales se cortan a continuation a partir del gel, se destinen y se someten a digestion triptica. Las mezclas peptidicas pueden analizarse mediante espectrometria de masas (MS). Como alternativa, los peptidos pueden separarse, por ejemplo, mediante cromatografia de alta presion en fase liquida (HPLC) de capilares y puede analizarse mediante MS bien individualmente o en agrupaciones.
Los espectrometros de masas consisten en una fuente de iones, analizador de masas, detector de iones y unidad de adquisicion de datos. En primer lugar, los peptidos se ionizan en la fuente de iones. A continuacion, los peptidos ionizados se separan segun su relation masa a carga en el analizador de masas y los iones separados se detectan. Las espectrometria de masas se ha usado en gran medida en analisis de proteinas, especialmente desde la invention de la desorcion/ionizacion laser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDITOF) y metodos de ionization de electropulverizacion (ESI). Existen varias versiones de analizador de masas, que incluye, por ejemplo, MALDITOF y triple o cuadruple-TOF o analizador de masas de trampa de iones acoplado a ESI. Por lo tanto, por ejemplo, un espectrometro de Q-Tof-2 utiliza un analizador de tiempo en vuelo ortogonal que permite la detection simultanea de iones por todo el intervalo de espectro de masas completo. Para detalles adicionales, vease, Por ejemplo, Chemusevich et al., J. Mass Spectrom. 36:849-865 (2001). Si se desea, las secuencias de aminoacidos de los fragmentos de peptido y finalmente las proteinas de las que derivan pueden determinarse mediante tecnicas conocidas en la tecnica, tal como determinadas variaciones de la espectrometria de masas o degradation de Edman.
2. Deteccion temprana de infeccion intraamniotica y complicaciones relacionadas
La infeccion intraamniotica (IAI) es una infeccion bacteriana aguda del fluido amniotico y contenido intrauterino durante el embarazo. Estudios prospectivos indican que la IAI aparece en el 4 % al 10 % de todos los partos (Newton, E. R., Prihoda, T. J., and Gibbs, R. S.: Logistic regression analysis of risk factors for intra-amniotic infection. Obstet. Gynecol. 73:571, 1989; Soper, D. E., Mayhall, C. G., and Dalton, H. P.: Risk factors for intraamniotic infection: a prospective epidemicologic study. American Journal of Obstetrics and Gynecology 161:562, 1989; y Lopez-Zeno, J. A., Peaceman, A. M., Adashek, J. A., and Socol, M. L.: A controlled trial of a program for the active management of labor. N. Engl. J. Med. 326:450, 1992). Otros terminos usados para describir IAI incluyen infeccion de fluido amniotico, amnionitis y corioamnionitis clinica. La infeccion intraamniotica se diagnostica clinicamente por la fiebre materna, sensibilidad uterina, leucocitosis y taquicardia fetal y debe distinguirse de la corioamnionitis histologica. La infeccion intraamniotica es una causa importante de morbilidad materna y neonatal. Las infecciones intraamnioticas ascienden a un 10-40 % de los casos de morbilidad febril en el periodo de periparto y se asocian con un 20-40 % de los casos de sepsis y neumonia neonatal temprana. Chorioamnionitis and intraamniotic infection. Clin. Obstet. Gynecol. 36:795, 1993). La bacteriemia materna se produce en un 2-6 % de los pacientes con IAI y la morbilidad infecciosa postparto se ve aumentada. Tambien existe un riesgo aumentado de parto disfuncional y parto por cesarea entre los pacientes con IAI. Duff et al. informo de un 75 % de incidencia de parto disfuncional y un 34 % de incidencia de parto por cesarea entre pacientes que desarrollaron infeccion intraamniotica mientras estaban de
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parto (Duff, P., Sanders, R., and Gibbs, R. S.: The course of labor in term pregnancies with chorioamnionitis. American Journal of Obstetrics and Gynecology 147:391, 1983). La infeccion intraamniotica tambien esta asociada con morbilidad y mortalidad neonatal aumentada, particularmente entre neonatos prematuros. En general, existe un aumento de tres a cuatro veces en la mortalidad perinatal entre neonatos con nacimiento de bajo peso nacidos de madres con IAI (GIbbs, R. S., Castillo, M. A., and Rodgers, P. J.: Management of Acute Chorioamnionitis. American Journal of Obstetrics and Gynecology 136:709, 1980; Gilstrap, L. C., Coleman, Leveno, K. J., Cox, S. M., Burris, J. S., Mashburn, M., and Rosenfeld, C. R.: Intrapartum treatment of acute chorioamnionitis: impact on neonatal sepsis. Am. J. Obstet. Gynecol. 159:579, 1988). Tambien hay aumentos en slndrome de dificultad respiratoria, hemorragia intraventricular y sepsis neonatal, Morales, W. J.: The effect of chorioamnionitis on the developmental outcome of preterm infants at one year. Obstetrics and Gynecology 70:183, 1987). Recientemente, La IAI ha estado implicada en leucomalacia periventricular neonatal y paralisis cerebral; los riesgos de dano de materia blanca cerebral y paralisis cerebral son nueve veces superiores en el marco de infeccion intraamniotica, Bejar, R., Wozniak, P., Allard, M., Benirschke, K., Vaucher, Y., Coen, R., Berry, C., Schragg, P., Villegas, I., y Resnik, R.: Antenatal origin of neurologic damage in newborn infants. I. Preterm infants. Am. J. Obstet. Gynecol. 159:357, 1988; Grether, J. K. and Nelson, K. B.: Maternal infection and cerebral palsy in infants of normal birth weight. JAMA 278:207, 1997). Finalmente, la IAI subcllnica se ha encontrado en al menos un 10 % de mujeres con parto prematuro con membranas fetales intactas, sugiriendo que la IAI es una causa importante, y potencialmente prevenible, de prematuridad (Romero, R., Avila, C., Brekus, C. A., y Morotti, R.: The role of systemic and intrauterine infection in preterm parturition. Annuals of the New York Academy of Sciences 622:355, 1991). Una revision bibliografica por Newton demostro incidencias de IAI cllnica del 41 % en edades gestacionales inferiores a 27 semanas, del 15 % en edades gestacionales de 27-37 semanas y del 2 % en gestaciones de 38 semanas o superiores (Newton et al., supra). Bacterias indlgenas al tracto genital inferior tambien se han recuperado del fluido amniotico del 10-20 % de todas las mujeres con parto prematuro con membranas fetales intactas sin signos cllnicos de infeccion intraamniotica (Romero et al., supra), y en hasta un 67 % de mujeres con parto prematuro con embarazos finalizando a las 23-24 semanas (Watts, D. H., Krohn, M. A., Hillier, S. L., and Eschenbach, D. A.: The association of occult amniotic fluid infection with gestational age and neonatal outcome among women in preterm labor. Obstet Gynecol 79:351, 1992). La mayorla de estos pacientes paren rapidamente y la IAI cllnicamente aparente se desarrolla en mucho de ellos. Estas observaciones respaldan la hipotesis las infecciones intrauterinas inicialmente subcllnicas ascendentes preceden el parto prematuro y pueden ser una causa importante de partos prematuros extremos.
El parto prematuro se define como un nacimiento anterior a la 37a semana completada de gestacion. La incidencia de nacimiento prematura en los Estados Unidos es del 10-11 % de todos los nacimientos vivos y va en aumento a pesar del tratamiento agresivo del parto prematuro. En su conjunto, la prematuridad y sus consecuencias son las responsables del 80 % de las muertes perinatales no atribuibles a malformaciones congenitas y suponen aproximadamente 5 mil millones anualmente para el presupuesto nacional para la atencion de salud. Factores de riesgo de nacimiento prematuro incluyen raza no blanca, edad joven, estado socioeconomico bajo, peso maternal por debajo de 55 kg, nuliparidad, sangrado en el primer trimestre, gestaciones multiples (Meis P J, Michielutte R, Peters T J, et al. Factors associated with preterm birth in Cardiff, Wales: II. Indicated and spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol 173:597-602, 1995).
Desafortunadamente la prediccion de pacientes en riesgo de nacimiento prematuro espontanea ha sido generalmente desalentadora (Creasy R K, lams J D. Preterm labor and delivery. In Maternal-Fetal Medicine, Creasy R K, Resnik R (eds.). W.B. Saunders Company, Filadelfia, Pa. 4a edicion, 1999. Paginas 498-531). Los intentos anteriores en definir la poblacion con mayor riesgo de nacimiento prematuro y, por lo tanto, beneficiandose potencialmente de una intervencion temprana ha incluido Indices de puntuacion de riesgo, deteccion bioqulmica de fibronectina fetal cervical, medicion ultrasonica de longitud cervical y seguimiento de actividad uterina en el hogar. Estos programas han sido costosos y tambien se han visto obstaculizados por la incapacidad de predecir con precision que pacientes se beneficiarlan de una intervencion o profilaxis temprana. Todos adolecen de un valor predictivo positivo pobre de aproximadamente el 30 %, con la mayorla de pacientes identificados como parto "de riesgo" en termino. Las intervenciones, que incluyen tratamiento farmacologico para inhibir contracciones uterinas, son eficaces, pero dependen de un diagnostico temprano y fiable de parto prematuro. Los marcadores tempranos y fiables para identificar pacientes en mayor riesgo de nacimiento prematuro son, por lo tanto, necesarios para reducir los tremendos costes y mortalidad y morbilidad neonatal asociada con el nacimiento prematuro.
3. Deteccion y diagnostico temprano de infeccion intraamniotica usando biomarcadores en fluidos biologicos
A) La presente divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante analisis proteomico de fluidos biologicos, tal como, por ejemplo, flujo vaginal-cervical (FVC), fluido amniotico, suero, plasma, orina, llquido cefalorraquldeo, leche materna, moco o saliva. En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante inmunoensayo o un panel de inmunoensayos. En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante analisis proteomico de CVF.
A modo de ejemplo no limitante, la presente divulgacion proporciona metodos para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto de sexo femenino embarazada que comprende someter a ensayo en una muestra de
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flujo vaginal-cervical materno obtenido a partir de dicho sujeto el nivel o la cantidad de una o mas protelnas seleccionadas entre el grupo que consiste en oncogen regulado por crecimiento alfa (GRO-a), protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta (MIP1b), alfa-1-glicoproteina acida (A1AG), alfa fetoprotelna (AFP), interleucina-6 (IL-6), protelna de union de lipolisacaridos (LBP), molecula de adhesion a celulas vasculares -1 (VCAM-1), protelna quimiotactica de monocitos-1 (MCP-1), beta-2-microglobulina (B2MG) e inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1). El diagnostico de infeccion intraamniotica puede basarse en la diferencia estadlsticamente significativa en el nivel, cantidad o abundancia de dichas protelnas en especlmenes de pacientes que estan definidos como positivos para IAI frente a especlmenes de control que no tienen IAI. En determinadas realizaciones, el diagnostico de infeccion intraamniotica puede mejorarse mediante la incorporacion al algoritmo de diagnostico los signos y slntomas del sujeto. Por ejemplo, incorporacion de signos y slntomas que incluyen, pero sin limitacion, fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna y/o fetal, sensibilidad uterina y/o fluido amniotico fetido, se pueden incluir en el algoritmo de diagnostico.
Tabla 1. Biomarcadores de IAI
Registro
ID Protefna SEQ ID NO
P09341
GRO-a oncogen regulado por crecimiento alfa 1
P13236
MIP1b protelna inflamatoria de macrofagos 1 beta 2
P02763
A1AG alfa-1-glicoproteina acida 3
P02771
AFP alfa-fetoprotelna 4
P05231
IL-6 interleucina-6 5
P18428
LBP protelna de union de lipolisacaridos 6
P19320
VCAM-1 molecula de adhesion a celulas vasculares-1 7
P13500
MCP-1 protelna quimiotactica de monocitos-1 8
P61769
B2MG beta-2-microglobulina 9
P01033
TIMP-1 inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 10
Tal como se ha senalado anteriormente, en el contexto de la presente divulgacion el termino "perfil proteomico" se usa para referirse a la representacion del patron de expresion de una pluralidad de protelnas en una muestra biologica, por ejemplo, un fluido biologico en un momento dado. El perfil proteomico puede, por ejemplo, representarse como un panel de resultados de inmunoensayo, pero tambien se incluyen otras representaciones basadas en cualquier propiedad fisicoqulmica o bioqulmica de las protelnas. Aunque resulta posible identificar y secuenciar todas o algunas de las protelnas presentes en el proteoma de un fluido biologico, no es necesario para el uso diagnostico de loes perfiles proteomicos generados segun la presente divulgacion. El diagnostico de una enfermedad particular puede basarse en las diferencias caracterlsticas (distintivos de expresion unicos) entre un perfil proteomico normal y un perfil proteomica del mismo fluido biologico obtenido en las mismas circunstancias, cuando la enfermedad o afeccion patogenica a diagnosticar esta presente. El distintivo de expresion unica puede ser cualquier un rasgo unico o motivo dentro del perfil proteomico de un ensayo o una muestra biologica de referencia que difiere del perfil proteomico de una muestra biologica normal correspondiente obtenida a partir del mismo tipo de fuente, de un modo estadlsticamente significativo. Cuando el perfil proteomico de la muestra de ensayo obtenida a partir de un sujeto mamlfero se compara con el perfil proteomico de una muestra de referencia que comprende un distintivo de expresion unica caracterlstico de una afeccion materna o fetal patologica, el sujeto mamlfero se diagnostica con tal afeccion patologica si comparte el distintivo de expresion unica con la muestra de referencia.
Una afeccion materna/fetal patologica particular puede diagnosticarse comparando el perfil proteomica en un fluido biologico obtenido a partir del sujeto a diagnosticar con el perfil proteomico de una fluido biologico normal del mismo tipo, obtenido y tratado del mismo modo. Si el perfil proteomico de la muestra de ensayo es esencialmente la misma que el perfil proteomico de la muestra normal, es sujeto se considera que esta libre de la afeccion materna/fetal patologica del sujeto. Si el perfil proteomico de la muestra de ensayo muestra un distintivo de expresion unico en relacion con el perfil proteomico de la muestra normal, el sujeto es diagnosticado con la afeccion materna/fetal en cuestion.
Como alternativa o ademas, el perfil proteomico de la muestra de ensayo puede compararse con el perfil proteomico de una muestra de referencia, obtenida a partir de un fluido biologico de un sujeto diagnosticado independientemente con la afeccion materna/fetal en cuestion. En este caso, el sujeto es diagnosticado con la afeccion patologica si el perfil proteomico de la muestra de ensayo comparte al menos un rasgo, o una combinacion de rasgos que representan un distintivo de expresion unico, con el perfil proteomico de la muestra de referencia.
En los metodos de la presente divulgacion el perfil proteomico de una muestra de ensayo biologica juega un papel diagnostico importante. Como se analiza anteriormente, si el perfil proteomico de la muestra de ensayo es esencialmente la misma que el perfil proteomico de la muestra biologica normal, el paciente es diagnosticado como
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que esta libre de la afeccion materna/fetal patologica a ser identificada. Este diagnostico "negativo" resulta de gran significancia, puesto que elimina la necesidad de someter al paciente a tratamiento o intervencion innecesarios, lo que podrla tener posibles efectos secundarios o podrlan, de otro modo, poner al paciente, feto o neonato en riesgo. Los datos se analizan para determinar si las diferencias son estadlsticamente significativas.
Los resultados que se detallan en los Ejemplos a continuacion presentan perfile proteomicos caracterlsticos de infeccion intraamniotica (IAI) que difieren del perfil proteomico normal de flujo vaginal-cervical (FVC) de un modo estadlsticamente significativo. Ademas, los Ejemplos presentan marcadores de expresion y distintivos de expresion unica caracterlsticos de la IAI.
Un fluido biologico particularmente ventajoso para realizar metodos de diagnostico no invasivos de la presente divulgacion es el flujo vaginal-cervical (FVC). El FVC es un flujo biologico complejo que consiste en agua, electrolitos, compuestos organicos de bajo peso molecular (glucosa, aminoacidos y llpidos), celulas (leucocitos, linfocitos y celulas epiteliales) y una multitud de protelnas y enzimas proteollticas que estan predominantemente sintetizadas por el endocervix (Blandau et al., The Biology of the Cervix. University of Chicago Press: Chicago, 1973; p xi, 450p. El FVC tambien contiene secreciones de celulas vaginales, que incluye mucinas, defensinas, factores de complemento, inmunoglobulinas, lactoferrina y colectinas (Blandau et al., supra). EL FVC fluye por todo el tracto reproductivo femenino y lo lubrica, incluyendo la vagina, areas cervicales y uterinas. El FVC forma la primera llnea de defensa frente a patogenos externos, senales de fertilidad y ayuda en la inseminacion, embarazo y parto (Blandau et al., supra; Bigelow, J. L. et al., Hum Reprod 2004, 19, (4), 889-92). El FVC contiene flora tal como Lactobacilli crispatus y Lactobacilli vaginalis. Las secreciones de esta flora aportan un bajo pH al FVC, que mejora su actividad antipatogena (Blandau et al., supra). Cualquier desequilibrio en la flora vaginal o invasion de flora externa resulta en vaginosis bacteriana. En respuesta a la vaginosis bacteriana, la secrecion de varias citocinas tales como IL-1 a, IL-lf3, IL-10, IL-8 y TNF-ct en el FVC por el endoepitelio vaginal y cervical cambia (Mattsby-Baltzer, I et al., Acta Obstet Gynecol Scand 1998, 77, (7), 701-6; Eschenbach, D. A. et al., J Clin Microbiol 1989, 27, (2), 251-6). La imposibilidad de frenar la vaginosis bacteriana se ha correlacionado positivamente con cancer cervical (Mikamo, H et al., J Infect Chemother 1999, 5, (2), 82-85), enfermedad inflamatoria pelvica (Ness, R. B. et al., Am J Epidemiol 2005, 162, (6), 585-90.), endometritis (Haggerty, C. L. et al., Clin Infect Dis 2004, 39, (7), 990-5; Morris, M. et al., Bjog 2001, 108, (5), 439-50) e infertilidad tubarica (Morris et al., supra). La vaginosis bacteriana en mujeres embarazadas se ha correlacionado con un riesgo aumentado de parto prematuro y nacimiento prematuro (Graved, M. G. et al., Jama 1986, 256, (14), 1899-903).
Las citocinas y otras moleculas de defensa presentes en el FVC juegan un papel importante en la infeccion, replicacion y proliferacion de virus de inmunodeficiencia transmitidos sexualmente tales como VIH y virus del herpes simple (VHS) en la vagina (Poli, G. et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1992, 8, (2), 191-7; Zara, F. et al., Sex Transm Infect 2004, 80, (2), 108-12; John, M. et al., J Infect Dis 2005, 192, (10), 1731-40). El analisis de la fraccion polipeptldica cationica del FVC ha identificado 20 polipeptidos que contribuyen en la actividad anti-VIH (Venkataraman, N. et al., J Immunol 2005, 175, (11), 7560-7). Estudios previos tambien han identificado un papel del FVC en la captura de viriones del VIH, previniendo, de este modo, la infeccion (Maher, D. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, (32), 11504-9; Quinones-Mateu, M. E et al., Aids 2003, 17, (16), F39-48). Estudios recientes han detectado una correlacion entre varias moleculas de respuesta inmune y FVC y la incidencia de ruptura prematura de las membranas (PROM) subcllnica, que lleva a el nacimiento prematuro (Helmig, B. R. et al., J Matern Fetal Neonatal Med 2002, 12, (4), 237-46; Ogino, M. et al., J Obstet Gynaecol Res 2005, 31, (5), 421-6). Durante el embarazo, el FVC podrla contener fluido amniotico (FA) derivado del utero, bien debido a la interrupcion o secreciones paralelas de la interfaz corionica-decidual. Esta "fuga" de FV en el FVC proporciona la base para el diagnostico no invasivo actual para la presencia de fibronectina fetal, que se ha usado para predecir el nacimiento prematuro en mujeres (Swamy, G. K. et al., J Reprod Med 2005, 50, (11), 851-6).
El FVC es un sitio de diagnostico potencial importante para controlar la salud materna y fetal en mujeres embarazadas debido a su metodo de recogida mlnimamente invasivo en comparacion con FA, es decir, amniocentesis. Los biomarcadores y grupos o combinaciones de biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una herramienta de diagnostico valiosa en la deteccion fiable de infeccion intraamniotica en un sujeto embarazado.
Los metodos estadlsticos para comparar perfiles proteomicos son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los niveles de expresion de protelnas para una serie de biomarcadores pueden cuantificarse mediante inmunoensayo. La presencia o ausencia de un distintivo de expresion caracterlstico o la identidad sustancial de dos perfiles puede determinarse cotejando el perfil proteomico (patron) de una muestra de ensayo con el perfil proteomico (patron) de una muestra de referencia o normal, con un algoritmo apropiado. Se desvela un metodo estadlstico para analizar patrones proteomicos, por ejemplo, In Antibiotics III, et al., The Lancet 359:572-77 (2002).; Issaq et al., Biochem Biophys Commun 292:587-92 (2002); Ball et al., Bioinformatics 18:395-404 (2002); y Li et al., Clinical Chemistry Journal, 48:1296-1304 (2002).
(B) La presente divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante analisis proteomico de fluidos biologicos, tal como, por ejemplo, flujo vaginal- cervical (FVC), fluido amniotico, suero, plasma, orina, llquido cefalorraquldeo, leche materna, moco o saliva. En
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una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante inmunoensayo. En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo temprano y fiable, no invasivo para el diagnostico de infeccion intraamniotica mediante analisis proteomico de CVF.
A modo de ejemplo no limitante, la presente divulgacion proporciona metodos para el diagnostico de infeccion intraamniotica en un sujeto de sexo femenino embarazada que comprende someter a ensayo en una muestra de flujo vaginal-cervical materno obtenido a partir de dicho sujeto la abundancia de al menos a-fetoprotelna, IL-6 y IGFBP1. El diagnostico de infeccion intraamniotica basandose en la diferencia estadlsticamente significativa en abundancia de estas protelnas en especlmenes de pacientes que estan definidos como positivos para IAI frente a especlmenes de control que no tienen IAI.
Tal como se ha senalado anteriormente, en el contexto de la presente divulgacion el termino "perfil proteomico" se usa para referirse a la representacion del patron de expresion de una pluralidad de protelnas en una muestra biologica, por ejemplo, un fluido biologico en un momento dado. El perfil proteomico puede, por ejemplo, representarse como un espectro de masas, pero tambien se incluyen otras representaciones basadas en cualquier propiedad fisicoqulmica o bioqulmica de las protelnas. Aunque resulta posible identificar y secuenciar todas o algunas de las protelnas presentes en el proteoma de un fluido biologico, no es necesario para el uso diagnostico de loes perfiles proteomicos generados segun la presente divulgacion. El diagnostico de una enfermedad particular puede basarse en las diferencias caracterlsticas (distintivos de expresion unicos) entre un perfil proteomico normal y un perfil proteomica del mismo fluido biologico obtenido en las mismas circunstancias, cuando la enfermedad o afeccion patogenica a diagnosticar esta presente. El distintivo de expresion unica puede ser cualquier un rasgo unico o motivo dentro del perfil proteomico de un ensayo o una muestra biologica de referencia que difiere del perfil proteomico de una muestra biologica normal correspondiente obtenida a partir del mismo tipo de fuente, de un modo estadlsticamente significativo. Por ejemplo, si el perfil proteomico se presenta en la forma de un espectro de masas, el distintivo de expresion unica es normalmente un pico o una combination de picos que difieren, cualitativa o cuantitativamente, del espectro de masas de una muestra normal correspondiente. Por lo tanto, la aparicion de un nuevo pico o una combinacion de nuevos picos en el espectro de masas, o cualquier cambio estadlsticamente significativo en la amplitud o forma de un pico existente o combinacion de picos existente, o la desaparicion de un pico existente, en el espectro de masas puede considerarse un distintivo de expresion unica. Cuando el perfil proteomico de la muestra de ensayo obtenida a partir de un sujeto mamlfero se compara con el perfil proteomico de una muestra de referencia que comprende un distintivo de expresion unica caracterlstico de una afeccion materna o fetal patologica, el sujeto mamlfero se diagnostica con tal afeccion patologica si comparte el distintivo de expresion unica con la muestra de referencia.
Una afeccion materna/fetal patologica particular puede diagnosticarse comparando el perfil proteomica en un fluido biologico obtenido a partir del sujeto a diagnosticar con el perfil proteomico de una fluido biologico normal del mismo tipo, obtenido y tratado del mismo modo. Si el perfil proteomico de la muestra de ensayo es esencialmente la misma que el perfil proteomico de la muestra normal, es sujeto se considera que esta libre de la afeccion materna/fetal patologica del sujeto. Si el perfil proteomico de la muestra de ensayo muestra un distintivo de expresion unico en relation con el perfil proteomico de la muestra normal, el sujeto es diagnosticado con la afeccion materna/fetal en cuestion.
Como alternativa o ademas, el perfil proteomico de la muestra de ensayo puede compararse con el perfil proteomico de una muestra de referencia, obtenida a partir de un fluido biologico de un sujeto diagnosticado independientemente con la afeccion materna/fetal en cuestion. En este caso, el sujeto es diagnosticado con la afeccion patologica si el perfil proteomico de la muestra de ensayo comparte al menos un rasgo, o una combinacion de rasgos que representan un distintivo de expresion unico, con el perfil proteomico de la muestra de referencia.
En los metodos de la presente divulgacion el perfil proteomico de una muestra de ensayo biologica juega un papel diagnostico importante. Como se analiza anteriormente, si el perfil proteomico de la muestra de ensayo es esencialmente la misma que el perfil proteomico de la muestra biologica normal, el paciente es diagnosticado como que esta libre de la afeccion materna/fetal patologica a ser identificada. Este diagnostico "negativo" resulta de gran significancia, puesto que elimina la necesidad de someter al paciente a tratamiento o intervention innecesarios, lo que podrla tener posibles efectos secundarios o podrlan, de otro modo, poner al paciente, feto o neonato en riesgo. Los datos se analizan para determinar si las diferencias son estadlsticamente significativas.
La sensibilidad de los metodos de diagnostico de la presente divulgacion puede mejorarse retirando las protelnas encontradas en tanto el proteoma normal como el afectado en esencialmente los mismos niveles de expresion (protelnas comunes, tales como albumina e inmunoglobulinas) antes del analisis usando metodos de separation de protelnas convencionales. La retiracion de tales protelnas comunes, que no forman parte del distintivo de expresion unica, da como resultado una sensibilidad mejorada y una precision diagnostica. Como alternativa o ademas, los distintivos de expresion de las protelnas comunes pueden eliminarse (o se pueden eliminar las senales) durante el analisis informatizado de los resultados, normalmente usando algoritmos seleccionados espectrales, que estan orientados a la maquina, par hacer lamadas de diagnostico.
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Los resultados que se detallan en los Ejemplos a continuacion presentan perfile proteomicos caracterlsticos de infeccion intraamniotica (IAI) que difieren del perfil proteomico normal de flujo vaginal-cervical (FVC) de un modo estadlsticamente significativo. Ademas, los Ejemplos presentan marcadores de expresion y distintivos de expresion unica caracterlsticos de la IAI.
Un fluido biologico particularmente ventajoso para realizar metodos de diagnostico no invasivos de la presente divulgacion es el flujo vaginal-cervical (FVC). El FVC es un flujo biologico complejo que consiste en agua, electrolitos, compuestos organicos de bajo peso molecular (glucosa, aminoacidos y llpidos), celulas (leucocitos, linfocitos y celulas epiteliales) y una multitud de protelnas y enzimas proteollticas que estan predominantemente sintetizadas por el endocervix (Blandau et al., The Biology of the cervix. University of Chicago Press: Chicago, 1973; p xi, 450p. El FVC tambien contiene secreciones de celulas vaginales, que incluye mucinas, defensinas, factores de complemento, inmunoglobulinas, lactoferrina y colectinas (Blandau et al., supra). EL FVC fluye por todo el tracto reproductivo femenino y lo lubrica, incluyendo la vagina, areas cervicales y uterinas. El FVC forma la primera llnea de defensa frente a patogenos externos, senales de fertilidad y ayuda en la inseminacion, embarazo y parto (Blandau et al., supra; Bigelow, J. F. et al., Hum Reprod 2004, 19, (4), 889-92). El FVC contiene flora tal como Lactobacilli crispatus y Lactobacilli vaginalis. Las secreciones de esta flora aportan un bajo pH al FVC, que mejora su actividad antipatogena (Blandau et al., supra). Cualquier desequilibrio en la flora vaginal o invasion de flora externa resulta en vaginosis bacteriana. En respuesta a la vaginosis bacteriana, la secrecion de varias citocinas tales como IL-1 a, IL-1 p, IL-10, IL-6 y TNF-a el FVC por el endoepitelio vaginal y cervical cambia (Mattsby-Baltzer, I et al., Acta Obstet Gynecol Scand 1998, 77, (7), 701-6; Eschenbach, D. A. et al., J Clin Microbiol 1989, 27, (2), 251-6). La imposibilidad de frenar la vaginosis bacteriana se ha correlacionado positivamente con cancer cervical (Mikamo, H et al., J Infect Chemother 1999, 5, (2), 82-85), enfermedad inflamatoria pelvica (Ness, R. B. et al., Am J Epidemiol 2005, 162, (6), 585-90.), endometritis (Haggerty, C. L. et al., Clin Infect Dis 2004, 39, (7), 990-5; Morris, M. et al., Bjog 2001, 108, (5), 439-50) e infertilidad tubarica (Morris et al., supra). La vaginosis bacteriana en mujeres embarazadas se ha correlacionado con un riesgo aumentado de parto prematuro y nacimiento prematuro (Gravett, M. G. et al., Jama 1986, 256, (14), 1899-903).
Las citocinas y otras moleculas de defensa presentes en el FVC juegan un papel importante en la infeccion, replicacion y proliferacion de virus de inmunodeficiencia transmitidos sexualmente tales como VIH y virus del herpes simple (VHS) en la vagina (Poli, G. et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1992, 8, (2), 191-7; Zara, F. et al., Sex Transm Infect 2004, 80, (2), 108-12; John, M. et al., J Infect Dis 2005, 192, (10), 1731-40). El analisis de la fraccion polipeptldica cationica del FVC ha identificado 20 polipeptidos que contribuyen en la actividad anti-VIH (Venkataraman, N. et al., J Immunol 2005, 175, (11), 7560-7). Estudios previos tambien han identificado un papel del FVC en la captura de viriones del VIH, previniendo, de este modo, la infeccion (Maher, D. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, (32), 11504-9; Quinones-Mateu, M. E et al., Aids 2003, 17, (16), F39-48). Estudios recientes han detectado una correlacion entre varias moleculas de respuesta inmune y FVC y la incidencia de ruptura prematura de las membranas (PROM) subcllnica, que lleva a el nacimiento prematuro (Helmig, B. R. et al., J Matern Fetal Neonatal Med 2002, 12, (4), 237-46; Ogino, M. et al., J Obstet Gynaecol Res 2005, 31, (5), 421-6). Durante el embarazo, el FVC podrla contener fluido amniotico (FA) derivado del utero, bien debido a la interrupcion o secreciones paralelas de la interfaz corionica-decidual. Esta "fuga" de FV en el FVC proporciona la base para el diagnostico no invasivo actual para la presencia de fibronectina fetal, que se ha usado para predecir el parto prematuro en mujeres (Swamy, G. K. et al., J Reprod Med 2005, 50, (11), 851-6).
El FVC es un sitio de diagnostico potencial importante para controlar la salud materna y fetal en mujeres embarazadas debido a su metodo de recogida mlnimamente invasivo en comparacion con FA, es decir, amniocentesis. Las combinaciones de biomarcadores identificados en el presente documento proporcionan una herramienta de diagnostico valiosa en la deteccion fiable de infeccion intraamniotica en un sujeto en estado de embarazo.
Los metodos estadlsticos para comparar perfiles proteomicos son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, en el caso de un espectro de masas, el perfil proteomico se define mediante los valores de amplitud maximos en posiciones de masa/carga (M/Z) clave a lo largo del eje horizontal del espectro. Por consiguiente, un perfil proteomico caracterlstico puede, por ejemplo, caracterizarse por el patron formado por la combinacion de amplitudes espectrales en valores de M/Z dados. La presencia o ausencia de un distintivo de expresion caracterlstico o la identidad sustancial de dos perfiles puede determinarse cotejando el perfil proteomico (patron) de una muestra de ensayo con el perfil proteomico (patron) de una muestra de referencia o normal, con un algoritmo apropiado. Se desvela un metodo estadlstico para analizar patrones proteomicos, por ejemplo, In Antibiotics III, et al., The Lancet 359:572-77 (2002).; Issaq et al., Biochem Biophys Commun 292:587-92 (2002); Ball et al., Bioinformatics 18:395-404 (2002); y Li et al., Clinical Chemistry Journal, 48:1296-1304 (2002).
4. Matrices de protelnas
Tanto los ensayos de diagnostico como de identificacion descritos anteriormente pueden llevarse a cabo usando matrices de protelnas. En los ultimos anos, las matrices de protelnas han ganado un amplio reconocimiento como medio potente para detectar protelnas, controlar sus niveles de expresion e investigar las interacciones y funciones de las protelnas. Estas permiten un analisis de protelnas de alto rendimiento, cuando grandes cantidades de
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determinaciones pueden realizarse simultaneamente, usando medios automaticos. La micromatriz o formato de chip, que se ha desarrollado originalmente para matrices de ADN, tales determinaciones pueden llevarse a cabo con un uso mlnimo de materiales mientras que genera grandes cantidades de datos.
Aunque el analisis de proteomas mediante electroforesis en gel 2D y espectrometrla de masas es muy eficaz, no siempre proporciona la elevada sensibilidad necesaria y esto puede perder muchas protelnas que se expresan en baja abundancia. Las micromatrices de protelnas, ademas de su elevada eficacia, proporcionan una sensibilidad mejorada.
Las disposiciones de protelnas se forman inmovilizando protelnas sobre una superficie solida, tal como vidrio, silicio, micro-pocillos de plastico, nitrocelulosa, membranas de PVDF y microperlas, usando varios procedimientos de qulmica de union covalentes y no covalentes bien conocidos en la tecnica. El soporte solido debe ser qulmicamente estable antes y despues del procedimiento de acoplamiento, proporcionar una buena morfologla de manchas, mostrar una union no especlfica minima, no debe contribuir un antecedente en los sistemas de deteccion y debe ser compatible con distintos sistemas de deteccion.
En general, las micromatrices de protelnas usan los mismos metodos de deteccion comunmente usado para la lectura de matrices de ADN. De manera similar, la misma instrumentacion que se usa para leer micromatrices de ADN es aplicable a matrices de protelnas.
Por lo tanto, las matrices de captura (por ejemplo, matrices de anticuerpos) pueden sondarse con protelnas marcadas fluorescentemente a partir de dos fuentes distintas, tales como fluidos biologicos normales y afectados. En este caso, la lectura se basa en la carga en la senal fluorescente como un reflejo de los cambios en el nivel de expresion de una protelna diana. Lecturas alternativas incluyen, sin limitacion, transferencia de energla por resonancia de fluorescencia, resonancias plasmonica de superficie, amplification del ADN de clrculo rodante, dispersion de luz de resonancia, reacciones enzimaticas y microscopla de fuerza atomica.
Para mas detalles, vease, por ejemplo, Zhou H, et al., Trends Biotechnol. 19:S34-9 (2001); Zhu et al., Current Opin. Chem. Biol. 5:40-45-(2001); Wilson and Nock, Angew Chem Int Ed Engl 42:494-500 (2003); and Schweitzer and Kingsmore, Curr Opin Biotechnol 13:14-9 (2002). Biomolecule arrays are also disclosed in U.S. Pat. No. 6,406,921, publicada el 18 de junio de 2002.
5. Inmunoensayos
Los ensayos de diagnostico de la presente divulgation tambien pueden llevarse a cabo en la forma de diversos formatos de inmunoensayo, que son bien conocidos en la tecnica. Una realization de la divulgacion incluye metodos para diagnosticas infection intraamniotica en un individuo, que comprende las etapas de obtener un fluido corporal, por ejemplo, flujo vaginal-cervical, de un individuo; medir una cantidad de una o mas protelnas descritas en el presente documento en el fluido corporal usando sistemas de inmunoensayo descritos en el presente documento; y comparar la cantidad de una o mas protelnas descritas en el presente documento en el fluido corporal a un nivel de referencia de una o mas protelnas descritas en el presente documento en individuos sanos sin la afeccion, donde una cantidad elevada de una o mas protelnas descritas en el presente documento anteriormente el nivel de referencia indica que el individuo tiene infeccion intraamniotica.
En una realizacion, un ensayo de una etapa (incubation simultanea de muestra mas anticuerpo de deteccion) es util. En otra realizacion, un ensayo de dos etapas (incubacion secuencial de muestra y el anticuerpo de deteccion) es util. Es preferente un ensayo de dos etapas en el caso en el que otras moleculas de protelnas podrlan competir para unirse al anticuerpo de deteccion. En inmunoensayos homogeneos, tanto la reaction inmunologica entre un antlgeno y un anticuerpo como la deteccion se lleva a cabo en una reaccion homogenea. Los inmunoensayos heterogeneos incluyen al menos una etapa de separation, que permite la diferenciacion de productos de reaccion a partir de reactivos no reaccionados.
En una realizacion de un inmunoensayo referido como ensayo inmunometrico, de "dos sitios" o "sandwich", el analito esta unido a o intercalado entre dos anticuerpos que se unen a distintos epltopos sobre el analito. Ejemplos representativos de tales inmunoensayos incluyen inmunoensayos enzimaticos o ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzima (EIA o ELISA), ensayos inmunoradiometricos (IRMA), inmunoensayos de fluorescentes, ensayos de flujo lateral, inmunoensayos de difusion, ensayos de inmunoprecipitacion y ensayos de separacion magnetica (MSA). En un tal ensayo, un primer anticuerpo, que se describe como el anticuerpo "de captura", se une a un soporte solido, tal como una superficie de acoplamiento de protelnas o de union de protelnas, partlculas de metal coloidales, partlculas de oxido de hierro o perlas polimericas. Un ejemplo de una perla polimerica es una partlcula de latex. En dicha realizacion, el anticuerpo de captura esta unido a o revestido sobre un soporte solido usando procedimientos conocidos en la tecnica. Como alternativa, el anticuerpo de captura esta acoplado con un ligando que es reconocido por un anticuerpo adicional que esta unido a o revisto sobre un soporte solido. La union del anticuerpo de captura al anticuerpo adicional mediante el ligando inmoviliza, a continuation, el anticuerpo de captura sobre el soporte solido. Un ejemplo de tal ligando es la fluorescelna.
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El segundo anticuerpo, que se describe como el anticuerpo "de deteccion", se acopla o conjuga con un marcador usando procedimientos conocidos en la tecnica. Ejemplos de marcadores adecuados para este fin incluyen un agente quimioluminiscente, un agente colorimetrico, un agente de transferencia de energla, una enzima, un sustrato de una reaccion enzimatica, un agente fluorescente y un radioisotopo. En una realizacion, el marcador incluye una primera protelna tal como biotina acoplada con el segundo anticuerpo, y una segunda protelna tal como estreptavidina que esta acoplada con una enzima. La segunda protelna se une a la primera protelna. La enzima produce una senal detectable cuando se proporciona con el/los sustrato(s), de modo que la cantidad de senal medida se corresponde con la cantidad del segundo anticuerpo que esta unido al analito. Ejemplos de enzimas incluyen, sin limitation, fosfatasa alcalina, amilasa, luciferasa, catalasa, beta-galactosidasa, glucoxidasa, glucosa-6- fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, peroxidasa de rabano picante, lactamasa, ureasa y malato deshidrogenasa. Sustratos adecuados incluyen, sin limitacion, TMB ((3,3',5,5'-tetrametil-bencidina, OPD (o-fenileno diamina) y ABTS (acido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico).
En el formato "sandwich" el antlgeno que se esta sometiendo a ensayo se mantiene entre dos anticuerpos distintos. En este metodo, en primer lugar, se reviste una superficie solida con un anticuerpo de fase solida. La muestra de ensayo, que contiene el antlgeno (es decir, una protelna de diagnostico) o una composition que contiene el antlgeno, que se esta midiendo, se anade, a continuation, y el antlgeno se deja reaccionar con el anticuerpo unido. Cualquier antlgeno no unido se elimina por lavado. Una cantidad conocida de anticuerpo marcado con enzima se deja reaccionar a continuacion con el antlgeno unido. Cualquier anticuerpo unido a enzima no unido en exceso de elimina por lavado despues de la reaccion. El sustrato para la enzima usada en el ensayo se anade a continuacion y la reaccion entre el sustrato y la enzima produce un cambio de color. La cantidad de cambio de color visual es una medicion directa de anticuerpo unido conjugado con enzima especlfico y consiguientemente el antlgeno presente en la muestra sometida a ensayo.
El ELISA tambien puede usarse como ensayo de competition. En el formato de ensayo de competition, el especimen de ensayo que contiene el antlgeno a determinar se mezcla con una cantidad precisa de antlgeno marcado con enzima y ambos compiten por unirse a un anticuerpo anti-antlgeno unido a una superficie solida. El exceso de antlgeno marcado con enzima libre se lava antes de que se anada el sustrato para la enzima. La cantidad de intensidad de color resultante de la interaction enzima-sustrato es una medicion de la cantidad de antlgeno en la muestra sometida a ensayo. Los inmunoensayos homogeneos incluyen, por ejemplo, la Tecnica de Inmunoensayo de Enzimas Multiplicadas (EMIT), que normalmente incluye una muestra biologica que comprende el compuesto o compuestos a medir, moleculas marcadas con enzima del/ de los compuesto(s) a medir, anticuerpo especlfico o anticuerpos que se unen al/ a los compuesto(s) a medir y un sustrato cromogenico de enzima especlfico. En una EMIT tlpica se anade exceso de anticuerpos especlficos a una muestra biologica. Si la muestra biologica contiene las protelnas a detectar, tales protelnas se unen a anticuerpos. Una cantidad medida de las protelnas marcadas con enzima correspondientes se anade a continuacion a la mezcla. Los sitios de union de anticuerpos no ocupados por moleculas de la protelna en la muestra se ocupan con moleculas de la protelna marcada con enzima anadida. Como resultado, la actividad enzimatica se reduce puesto que solo la protelna marcada con enzima libre puede actuar sobre el sustrato. La cantidad de sustrato convertido de una forma incolora a una forma colora determina la cantidad de enzima libre sobrante en la mezcla. Una elevada concentration de la protelna a detectar en la muestra causa lecturas de absorbancia superiores. Una menor protelna en la muestra resulta en una actividad enzimatica inferior y consiguientemente lecturas de absorbancia inferiores. La inactivation del marcador de enzima cuando el complejo Ag-enzima esta Ab-unido hace que el EMIT un sistema unico, permitiendo que el ensayo se realice sin la separation de compuestos unidos y no unidos segun sea necesario con otros metodos de inmunoensayo.
Anticuerpos utiles en las diversas realizaciones de los sistemas y metodos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos disponibles en el mercado, as! como cualquier anticuerpo novedoso generado para unir un epltopo adecuado sobre la protelna diana designada. En todas las realizaciones, los anticuerpos a usar segun la presente divulgation deben unir la una o mas isoformas especlficas de los biomarcadores descritas en el presente documento que estan presentes en el flujo vaginal-cervical. Los anticuerpos usados en diversas realizaciones ilustrados en el presente documento son monoclonales o policlonales en la naturaleza. Otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, tales como anticuerpos recombinantes, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab o Fv, as! como fragmentos seleccionados identificando bibliotecas de muestra de fagos y similares tambien son utiles en las composiciones y metodos descritos en el presente documento.
Los metodos para la preparation de anticuerpos monoclonales as! como policlonales estan ahora bien establecidos (Harlow E. et al., 1988. Antibodies. New York: Cold Spring Harbour Laboratory). En una realizacion, los anticuerpos se presentan frente a LBP recombinante humano, fragmentos sinteticos de los mismos o LBP, tal como pueden ser purificados a partir de suero humano. Se plantean anticuerpos policlonales en diversas especies incluyendo, pero sin limitacion, raton, rata, conejo, cabra, oveja, burro y caballo, usando procedimientos de inmunizacion estandar y de sangrado. Los sangrados de animal con elevados tltulos se fraccionan mediante procedimientos de precipitation por sales selectivos rutinarios, tales como precipitacion con sulfato de amonio y fracciones de inmunoglobulina especlfica separandose mediante cromatografla de afinidad sucesiva sobre columnas de Protelna-A-Sefarosa y leptina-Sefarosa, segun metodos estandar. Los anticuerpos policlonales as! como monoclonales purificados se caracterizan a continuacion para su especificidad y falta de reactividad cruzada con moleculas relacionadas. Tal
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caracterizacion se lleva a cabo mediante metodos estandar usando protelnas, por LBP, marcadas con indicadores tales como radioisotopo o biotina en competicion con niveles en aumento de reactivos cruzados potenciales no marcados para la union de anticuerpos. En algunas realizaciones, se requiere la purification adicional para obtener fracciones de anticuerpos altamente especlficas o para la selection de fracciones de anticuerpos de afinidad superior a partir de un grupo policlonal. En el caso de los anticuerpos monoclonales, se lleva cuidado en la seleccion de anticuerpos con buenas caracterlsticas de union y especificidad no solo para el inmunogeno, sino tambien para las moleculas circulantes nativas, particularmente cuando se usa una molecula recombinante o antlgeno de peptido para la inmunizacion. Los estudios de reactividad cruzada se evaluan adicionalmente mediante otros metodos estandar tales como la bien establecida electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (SDS- PAGE) y metodos de transferencia de Western en afecciones decrecientes y no decrecientes. La evaluation de inmunorreactividad protelnica detectada en las muestras de suero fraccionadas mediante cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC) tambien se usa para definir aproximadamente el perfil de peso molecular de la protelna detectada (Gravett M G, et al., JAMA 2004; 292:462-469; Khosravi M J et al., Clin Biochem 1995; 28:407-414).
Se preparan anticuerpos monoclonales segun a procedimiento de laboratorio estandar bien establecidos ("Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" by P. Tijssen (In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds: R. H. Burdon and P. H. van Kinppenberg; Elsevier Publishers Biomedical Division, 1985)), que se basan en la tecnica original de Kohler y Milstein (Kohler G., Milstein C. Nature 256:495, 1975). Esta tecnica se lleva a cabo retirando celulas del bazo de animales inmunizados e inmortalizando las celulas productoras de anticuerpos mediante fusion con celulas de mieloma o mediante transformation de virusa Epstein Barr, y a continuation identificando clones que expresen el anticuerpo deseado, aunque tambien se usan otras tecnicas conocidas en la tecnica. Tambien se producen anticuerpos mediante otros planteamientos conocidos para los expertos en la tecnica, incluyendo, pero sin limitation a la inmunizacion con ADN especlfico.
Para su uso en los inmunoensayos descritos en el presente documento, los anticuerpos se purifican usando esquemas de purificacion de anticuerpos estandar. En diversas realizaciones, tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales se purifican mediante cromatografla de afinidad sobre columnas de Protelna-A. Como alternativa, los anticuerpos se purifican mediante cromatografla de afinidad sobre una columna de gel que contiene protelna de antlgeno inmovilizada usando metodos estandar.
Otra consideration para la seleccion del anticuerpo apropiado para su uso en los sistemas y metodos descritos en el presente documento es la capacidad del anticuerpo de captura y el anticuerpo de detection en unirse simultaneamente a una molecula de protelna dada. En una realization que implica un MlP1b, por ejemplo, el sitio de union de anti-MIP1b del anticuerpo de captura es distinto del epltopo al cual se une el anticuerpo de deteccion, permitiendo de este modo la union simultanea de los anticuerpos de captura y deteccion y deteccion del marcador especlfico. En el caso de superposition significativa de epltopos y una respuesta de union resultante pobre, resulta comprensible para un experto en la tecnica seleccionar un anticuerpo distinto al biomarcador como el anticuerpo de captura o de deteccion. En algunas realizaciones un sitio de union de anticuerpos no esta completamente disponible sobre la superficie de la protelna, por ejemplo, cuando la protelna esta principalmente presente en la muestra en un complejo con una o mas protelnas y es menos accesible para unirse a los anticuerpos de captura o de deteccion. En tal circunstancia, las tecnicas conocidas en la materia se usan para exponer los sitios de union de anticuerpos, tales como desnaturalizacion de protelnas parcial o modification de tampon.
Como se conoce en la tecnica, el anticuerpo de captura se acopla con o se enlaza a diversos soportes de fase solida usando metodos de union covalente o no covalente estandar, dependiendo de los requisitos de separation anallticos y/o de fase solida. El soporte solido se encuentra en la forma de tubos de ensayo, perlas, micropartlculas, papel de filtro, membranas, filtros de vidrio, partlculas magneticas, virutas de vidrio o silicio u otros materiales y enfoques conocidos por los expertos en la tecnica. El uso de micropartlculas, particularmente partlculas magnetizables, se han revestido directamente con el anticuerpo (anticuerpo de captura de partlculas magneticas) o partlculas que se han marcado con un enlazador universal (por ejemplo, avidina o anticuerpo antiespecie) son utiles para acortar significativamente el tiempo de incubation del ensayo. Esto junto con otros enfoques alternativos conocidos en la tecnica permiten una finalization del ensayo a los minutos sin limitar la sensibilidad requerida. El uso de partlculas magnetizables o enfoques similares permiten la automatization conveniente de la tecnologla en los inmunoanalizadores ampliamente disponibles.
El anticuerpo de deteccion usado para la deteccion del fragmento de protelna esta o bien directamente acoplado con una molecula indicadora o esta indirectamente detectado mediante un sistema de deteccion secundario. Este ultimo se basa en varios principios distintos conocidos en la tecnica, incluyendo reconocimiento de anticuerpos mediante un anticuerpo antiespecie marcado y otras formas de puentes de union inmunologicos o no inmunologicos y sistemas de deteccion de amplification de senal (por ejemplo, la tecnologla de biotina-estreptavidina). El enfoque de amplification de senales se usa para aumentar significativamente la sensibilidad del ensayo y el bajo nivel de reproducibilidad y rendimiento. El marcador usado para el acoplamiento de anticuerpo directo o indirecto es cualquier molecula indicadora detectable. Ejemplos de marcadores adecuados son aquellos ampliamente usados en el campo de los sistemas de deteccion inmunologicos o no inmunologicos, tales como fluoroforos, marcadores luminiscentes, complejos de metal y marcadores radioactivos, as! como restos que podrlan detectarse mediante otros reactivos adecuados tales como enzimas o diversas combinaciones de marcadores directos o indirectos tales
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como enzimas con sustratos luminogenicos.
En diversas realizaciones de los metodos de la divulgacion, cualquier volumen de muestra o anticuerpo y tiempos de incubacion se pueden alterar dentro de la experiencia del experto en la tecnica. Estos metodos y sistemas incluyen modificaciones comunes usadas en inmunoensayos convencionales y cualquier modificacion conocida por el experto en la tecnica. En diversas realizaciones, el diseno del ensayo es homogeneo o heterogeneo, dependiendo de la aplicacion particular del ensayo y la necesidad de velocidad, sensibilidad, precision y conveniencia.
Ademas de los inmunoensayos descritos anteriormente, otros inmunoensayos (por ejemplo, placas de Ouchterlony o transferencias de Western puede realizarse sobre geles de protelnas o manchas de protelnas sobre filtros) son conocidos en la tecnica y pueden encontrar uso como diagnostico.
Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a un kit de inmunoensayo. En una realizacion, el kit de inmunoensayo comprende anticuerpos y reactivos para la detection de dos o mas protelnas descritas en el presente documento. En un aspecto, la divulgacion incluye un kit de inmunoensayo sandwich que comprende un anticuerpo de captura y un anticuerpo detector. El anticuerpo de captura y el anticuerpo detector puede ser monoclonal o policlonal. En otro aspecto, la divulgacion incluye un kit de diagnostico que comprende dispositivos de flujo lateral, tales como ensayos de tira inmunocromatografica (ICS), usando inmunocromatografla de flujo. Los dispositivos de flujo lateral emplean tecnicas de ensayo de flujo lateral tal como se describe generalmente en las patentes de los Estados Unidos n.° 4.943.522; 4.861.711; 4.857.453; 4.855.240; 4.775.636; 4.703.017; 4.361.537; 4.235.601; 4.168.146; 4.094.647. En otro aspecto mas, el kit de inmunoensayo puede comprender, por ejemplo, en recipientes separados (a) anticuerpos monoclonales que tienen especificidad de union para polipeptidos usados en el diagnostico de una afeccion materna/fetal particular, tal como sepsis neonatal; (b) inmunoglobulinas de anticuerpos. El kit de inmunoensayo puede utilizarse para la practica de los diversos metodos proporcionados en el presente documento. Los anticuerpos monoclonales y las inmunoglobulinas de anticuerpos pueden proporcionarse en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 gramos, y mas preferentemente aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 gramo. La inmunoglobulina de anticuerpo puede ser una inmunoglobulina policlonal, protelna A o protelna G o fragmentos funcionales de las mismas, que puede marcarse antes de su uso mediante metodos conocidos en la tecnica. El kit de diagnostico puede incluir adicionalmente cuando sea necesario agentes para reducir la interferencia de fondo en un ensayo, agentes para aumentar la senal, software y algoritmos para combinar e interpolar valores de marcador para producir una prediction del resultado cllnico de interes, aparato para realizar un ensayo, curvas y diagramas de calibration, curvas y diagramas de estandarizacion y similares. Este kit de ensayo puede empaquetarse de cualquier modo adecuado, normalmente con todos los elementos en un unico recipiente junto con una hoja de instrucciones impresas para llevar a cabo el ensayo.
6. Metodos de diagnostico y de tratamiento
Los metodos de diagnostico de la presente divulgacion son herramientas valiosas para medicos practicantes para realizar rapidas decisiones de tratamiento, que son a menudo crlticas para la supervivencia del nino y/o la madre. Por lo tanto, por ejemplo, si una mujer embarazada muestra slntomas de parto prematuro, es importante realizar un ensayo de diagnostico para determinar se hay presente infection intraamniotica. Si el ensayo de diagnostico rapido y no invasivo del presente documento confirma la presente de infeccion intraamniotica, el medico necesita tomar medidas inmediatas para mejorar las posibilidades de supervivencia del nino prematuro y liminar los riesgos de la salud de la madre. Actualmente no hay disponible ensayos in invasivos para la infeccion intraamniotica.
Si el ensayo de infeccion intraamniotica es negativo, la cuestion de si aun se puede producir un parto prematuro permanece. Actualmente, a veces se usa un ensayo de fibronectina fetal (fFN) de marcador unico para este fin. La ausencia de fFN en el FVC de la paciente embarazada es un buen indicador de que el embarazo continuara durante al menos dos semanas mas. Sin embargo, basandose en la presencia de fFN (ensayo positivo), no es posible predecir fielmente si es posible que se produzca un nacimiento prematuro. Los ensayos de diagnostico multimarcador de la presente divulgacion proporcionan predictores fieles de la posibilidad de parto prematuro tanto en el caso de resultados de ensayo negativos y positivos.
Como alternativa, si un paciente muestra slntomas de parto prematura y se usa un ensayo diagnostico (bien un ensayo del presente documento o cualquier otro ensayo usado en la practica cllnica) para evaluar la posibilidad de parto prematuro, puede realizarse un ensayo para la infeccion intraamniotica como seguimiento, para proporcionar information respecto a la presencia o ausencia de infeccion intraamniotica y permitir al medico realizar mejores decisiones de tratamiento.
Despues de la medicion u obtencion de los niveles de expresion de las protelnas identificadas en el presente documento, los resultados de ensayo, hallazgos, diagnosticos, predicciones y/o recomendaciones de tratamiento se registran normalmente y se comunican a los tecnicos, medicos y/o pacientes, por ejemplo. En determinadas realizaciones, se usaran ordenadores para comunicar tal informacion a las partes interesadas, tal como, pacientes y/o el medico interviniente. En algunas realizaciones, los ensayos se realizaran o los resultados de ensayo se analizaran en un pals o jurisdiction que difiera del pals o jurisdiction al cual los resultados o diagnosticos van a comunicarse.
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En una realizacion preferida, un diagnostico, prediccion y/o recomendacion de tratamiento basada en el nivel de expresion en un sujeto de ensayo de uno o mas biomarcadores en el presente documento se comunica al sujeto tan pronto como sea posible despues de que se complete el ensayo y se genere el diagnostico y/o prediccion. En determinadas realizaciones, el diagnostico, prediccion y/o recomendacion de tratamiento se basa adicionalmente en signos y slntomas presentados por el sujeto. En una realizacion, los signos y slntomas que indican IAI incluyen, pero sin limitacion, fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna o fetal, sensibilidad uterina o fluido amniotico fetido. Otros signos y slntomas que indican IAI se conocen en la tecnica. El uno o mas biomarcadores identificados y cuantificados en los metodos descritos en el presente documento pueden contenerse en uno o mas paneles. El numero de biomarcadores que comprenden un panel puede incluir 1 biomarcador, 2 biomarcadores, 3 biomarcadores, 4 biomarcadores, 5 biomarcadores, 6 biomarcadores, 7 biomarcadores, 8 biomarcadores, 9 biomarcadores, 10 biomarcadores, 11 biomarcadores, 12 biomarcadores, 13 biomarcadores, 14 biomarcadores, 15 biomarcadores, 16 biomarcadores, 17 biomarcadores, 18 biomarcadores, 19 biomarcadores, 20 biomarcadores, etc.
En una realizacion preferida, la divulgacion se refiere a un ensayo de infeccion intraamniotica (ensayo de infeccion intraamniotica ProteoGenix (PG-IAI)), que es un ensayo inmunocromatografico que mide la a-fetoprotelna, interleucina-6 (IL-6) y las concentraciones de protelna de union al factor de crecimiento de insulina-1 (IGFBP-1) en flujo vaginal-cervical (FVC). El ensayo es particularmente util como una ayuda en la evaluacion del riesgo de IAI en mujeres embarazadas con parto prematuro idiopatico, membranas intactas y muestradas entre las 22 semanas 0 dlas y las 36 semanas 6 dlas y puede usarse para priorizar el tratamiento del paciente para aquellos que se sospecha que tienen IAI.
En una realizacion particular, el ensayo se aloja en un cartucho de flujo lateral, y las intensidades de senal del biomarcador PG-IAI se miden usando un lector de flujo lateral. El FVC se recoge usando un hisopo de FVC no invasivo usando un kit de recogida de hisopo.
Los datos de estudios cllnicos/anallticos actuales que usan una plataforma ELISA se usaron para el rendimiento del ensayo aproximado para el dispositivo de flujo lateral. El mejor modelo uso concentraciones de masas de dos biomarcadores de FVC, a-fetoprotelna e IL-6. El biomarcador de FVC adicional, IGFBP1, se ha identificado que sirve como un vigilante para la evaluacion de riesgo de dos biomarcadores. Mientras que el IGFBP1 puede que no sea un diagnostico de IAI por si mismo, rechaza un 29 % de resultados de paciente de falso positivo de IAI y mejora en gran medida la especificidad del ensayo de diagnostico.
Los resultados y/o informacion relaciones puede comunicarse al sujeto por el medico que trata al sujeto. Como alternativa, los resultados pueden comunicarse directamente a un sujeto de ensayo mediante cualquier medio de comunicacion, que incluye, por escrito, tal como mediante un informe por escrito, formas electronicas de comunicacion, tales como correo electronico o telefono. La comunicacion puede facilitarse mediante el uso de un ordenador, tal como en el caso de comunicaciones por correo electronico. En determinadas realizaciones, la comunicacion que contiene los resultados de un ensayo de diagnosticos y/o conclusiones extraldas y/o recomendaciones de tratamiento basadas en el ensayo, puede generarse y suministrarse automaticamente al sujeto usando una combinacion de hardware y software informatizado que resultara familiar a los expertos en las telecomunicaciones. Un ejemplo de un sistema de comunicacion orientado al cuidado de la salud se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 6.283.761; sin embargo, la presente divulgacion no se limita a metodos que utilizan este sistema particular de comunicacion. En determinadas realizaciones de los metodos de la divulgacion, todas o algunas de las etapas del metodo, incluyendo el analisis de muestras, diagnosticos de enfermedades y comunicacion de los resultados de ensayo o diagnosticos, puede llevarse a cabo en diversas (por ejemplo, extranjeras) jurisdicciones.
Para facilitar el diagnostico, los perfiles de referencia y/o de biomarcador del sujeto o nivel de expresion de uno o mas de los biomarcadores presentados en el presente documento de la presente divulgacion pueden presentarse sobre un dispositivo de visualizacion, contenidos electronicamente o en un medio lelble por maquina, tales como, pero sin limitacion, cintas analogas como las lelbles mediante un VCR, CD-ROM, DVD-ROM, un medio flash de USB, por ejemplo, memoria flash, entre otros. Tales medios lelbles por maquina tambien pueden contener resultados de ensayo adicionales, tal como, sin limitacion, mediciones de parametros cllnicos y factores de riesgo de laboratorio tradicionales. Como alternativa o ademas, el medio lelble por maquina tambien puede comprender informacion del sujeto tal como el historial medico o cualquier historial familiar relevante.
Microbiologia y tratamiento: La IAI es frecuentemente una infeccion polimicrobiana, que implica eubacterias, mycoplasma sp. y hongos. Los microorganismos mas frecuentes recuperados mediante cultivo o PCR de ADNr 16S a partir de fluido amniotico en IAI incluyen Gardnerella vaginalis, Bacteroides bivius. Fusobacterium nucleatum, Peptostroptococcus sp., Provotella bivus, otros anaerobios Gram negativos, Candida, as! como los micoplasmas genitales Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum. (DiGiulio DB, et al., PLoS ONE 3(8): e3056; Han, Yiping W. et al., J. Clin. Microbiol. 2009 47: 38-47). La terapia antibiotica dirigida debe iniciase en el perlodo intraparto, tan pronto se confirme el diagnostico.
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Ejemplos
El siguiente ejemplo tiene solamente fines ilustrativos, y no se pretende que limite el alcance de la presente divulgacion en forma alguna. Un experto en la materia reconocera varios parametros que pueden alterarse dentro del alcance de divulgacion.
Ejemplo 1
Identificacion de biomarcadores de flujo vaginal-cervical de infection intraamniotica usando inmunoensayos
Se recogieron especlmenes de paciente individuales a partir de pacientes que presentaban un parto prematuro. Se usaron especlmenes de fluido amniotico iguales para clasificar los pacientes segun presentaban infeccion intraamniotica (IAI) o sin IAI basandose en el cultivo de fluido amniotico (aerobio y anaerobio y Mycoplasma sp) y la presenta o ausencia de fluido amniotico de ADN ribosomico 16S.
Recogida de hisopo de flujo vaginal cervical. Se recogio flujo vaginal-cervical hisopando el orificio cervical con un bastoncillo de polieter (Puritan, Guilford, ME), que a continuation se coloco en un recipiente con ~ 1 ml. de tampon de recogida de especimen. Los especlmenes se congelaron a -70 °C para su transporte, a continuacion se descongelaron, centrifugaron durante 15 minutos a 270 x g y se volvieron a alicuotar para un almacenamiento a largo plazo.
GROalfa: Dilucion de especlmenes de FVC. Especlmenes de flujo vaginal-cervical (FVC) se diluyeron 1:50 en Tampon de ensayo (2,67mM de KCl, 1.47mM de KH2PO4, 137,93mM de NaCl, 8.06mM de Na2HPO4-7H2O, BSA al 0,15 %, 0,05 % v/v de Tween-20, 0,075 % v/v de ProClin 950, pH 7,3 + 0,3) antes del ensayo sobre el Kit de Inmunoensayo Quantikine Human CXCL1/GROct tal como se describe a continuacion.
Deteccion de GROalfa en especlmenes de FVC. Despues de la dilucion, los especlmenes de ejecutaron como muestras sobre el Kit de Inmunoensayo Quantikine Human CXCLI/GROct de R&D Systems (Numero de catalogo DGR00) con algunas modificaciones a las instrucciones del fabricante. En resumen, reactivos, controles y muestras se llevaron a temperatura ambiente (TA). El estandar de GROct se reconstituyo con 5ml de tampon de ensayo, generando una solution de 1000 pg/ml. Esta solution se incubo a temperatura ambiente durante 15 ng. con agitation suave. Despues de la incubation, 750 pl de la solucion de 100Opg/ml se diluyo en 750 pl de tampon de ensayo, generando una solucion de 500 pg/ml. Este proceso se repitio cuatro veces adicionales, generando soluciones de 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, y 31,25 pg/ml. Se anadieron a cada pocillo 50 pl de diluyente de ensayo RD1U. Se anadieron 200 pl de estandares a pocillos adecuados por triplicado. Se anadieron 200 pl de controles y muestras a pocillos apropiados por duplicado. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante 2h. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron 3X con 400 pl IX de tampon de lavado con un 1 min. de incubacion entre lavados usando el lavador de placas BioTek ELx50. Se retiro cualquier llquido residual dando golpes a los pocillos boca abajo sobre papel absorbente. Se anadieron a cada pocillo 200 pl de conjugado de GROct. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a 2-8 °C durante 2 h. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron como antes. Cualquier llquido residual se retiro como antes. Se anadieron a cada pocillo 200 pl de solucion de sustrato. Los pocillos se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron a TA durante 20 ng. Se anadieron a cada pocillo 50 pl de solucion de parada. Se leyo la placa a 450 nm y 540 nm usando el lector de placas BioTek Synergy 2 y el software de BioTek Gen5.
Cuantificacion de GROalfa en especlmenes de FVC. Usando el software de Gen5, se realizaron cuatro parametros de regresion no lineal para generar una curva estandar. Esta curva estandar se uso, a continuacion, para calcular las concentraciones de GROalfa en los especlmenes de FVC ejecutados sobre el kit de inmunoensayo. Para calcular las concentraciones finales de GROalfa en los especlmenes de FVC, las concentraciones calculadas se multiplicaron por 50 para justificar la dilucion de especlmenes inicial. Cualquier especimen que tuviera las lecturas de DO Delta (DO450-DO540) inferior a la lectura de DO Delta del estandar de 31,25 pg/ml se asigno a una concentration de 31,25 pg/mF, que se multiplico, a continuacion, por 50. A continuacion, los datos se analizaron usando metodos estadlsticos tal como se describe a continuacion. La Figura 1 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de GROalfa (Ensayo 1) en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
Dilucion de especlmenes de FVC. Especlmenes de flujo vaginal-cervical (FVC) se diluyeron 1:100 en diluyente de calibrador RD6F antes del ensayo sobre el Kit de Inmunoensayo Quantikine Human IL-6 tal como se describe a continuacion.
Deteccion de IL-6 en especlmenes de FVC. Despues de la dilucion, los especlmenes de ejecutaron como muestras sobre el Kit de Inmunoensayo Quantikine Human IL-6 de R&D Systems (Numero de catalogo D6050) con algunas modificaciones a las instrucciones del fabricante. En resumen, reactivos, controles y muestras se llevaron a temperatura ambiente (TA). El estandar de IL-6 se reconstituyo con 5ml de diluyente de calibrador RD6F, generando una solucion de 300 pg/ml. Esta solucion se incubo a temperatura ambiente durante 15 min. con agitacion suave. Despues de la incubacion, se diluyeron 333 pl de la solucion de 300 pg/ml en 667 pl del diluyente de calibrador
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RD6F, generando una solucion de 100 pg/ml. se diluyeron 500 pi de la solucion de 100 pg/ml en 500 pi del diluyente de calibrador RD6F, generando una solucion de 50 pg/ml. Se repitieron diluciones de dos veces cuatro veces adicionales, generando soluciones de 25 pg/ml, 12,5 pg/ml, 6,25 pg/ml, y 3,12 pg/ml. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de diluyente de ensayo RD1W. Se anadieron 100 pl de estandares a pocillos adecuados por triplicado. Se anadieron 100 pl de controles y muestras a pocillos apropiados por duplicado. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante 2h. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron 4X con 400 pl IX de tampon de lavado usando el lavador de placas BioTek ELx50. Se retiro cualquier llquido residual dando golpes a los pocillos boca abajo sobre papel absorbente. Se anadieron a cada pocillo 200 pl de conjugado de IL-6. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante 2h. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron como antes. Cualquier llquido residual se retiro como antes. Se anadieron a cada pocillo 200 pl de solucion de sustrato. Los pocillos se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron a TA durante 20 ng. Se anadieron a cada pocillo 50 pl de solucion de parada. Se leyo la placa a 450 nm y 540 nm usando el lector de placas BioTek Synergy 2 y el software de BioTek Gen5.
Cuantificacion IL-6 en especfmenes de FVC. Usando el software de Gen5, se realizaron cuatro parametros de regresion no lineal para generar una curva estandar. Esta curva estandar se uso, a continuation, para calcular las concentraciones de IL-6 en los especlmenes de FVC ejecutados sobre el kit de inmunoensayo. Para calcular las concentraciones finales de IL-6 en los especlmenes de FVC, las concentraciones calculadas se multiplicaron por 100 para justificar la dilution de especlmenes inicial. Cualquier especimen que tuviera las lecturas de DO Delta (DO450- DO540) inferiores a la lectura de DO Delta del estandar de 3,12 pg/ml se asigno a una concentration de 3,12 pg/ml, que se multiplico, a continuacion, por 100. Cualquier especimen que tuviera las lecturas de DO Delta superiores a la lectura de DO Delta del estandar de 300 pg/ml se diluyo a diluciones superiores y se ejecuto sobre el kit de nuevo. A continuacion, los datos se analizaron usando metodos estadlsticos tal como se describe a continuacion. La Figura 7 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de IL-6 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por iAi (n=95).
LBP: Dilucion de especlmenes de FVC. Especlmenes de flujo vaginal-cervical (FVC) se diluyeron 1:50 en Tampon de ensayo (2,67mM de KCl, 1.47mM de KH2P04, 137,93mM de NaCl, 8,06mM de Na2HPO4-7H20, 0,15 % de BSA, 0,05 % v/v de Tween-20, 0,075 % v/v de ProClin 950, pH 7,3 + 0,3) antes del ensayo sobre el Kit ELISA Human LBP tal como se describe a continuacion.
Deteccion de LBP en especlmenes de FVC. Despues de la dilucion, los especlmenes de ejecutaron como muestras sobre el Kit ELISA Human LBP de Cell Sciences (Numero de catalogo CKH113) con algunas modificaciones a las instrucciones del fabricante. En resumen, reactivos, controles y muestras se llevaron a temperatura ambiente (TA). El estandar de LBP humano se reconstituyo con 30 pl de agua destilada. El estandar de LBP humano reconstituido se diluyo a continuacion en 1570 pl de tampon de ensayo, generando una solucion de 50 ng/ml. se diluyeron 350 pl de la solucion de 50 ng/ml en 350 pl del tampon de ensayo, generando una solucion de 25 ng/ml. Se repitieron diluciones de dos veces cuatro veces adicionales, generando soluciones de 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml, y 1,56 ng/ml. Se anadieron 100 pl de estandares a pocillos adecuados por triplicado. Se anadieron 100 pl de controles y muestras a pocillos apropiados por duplicado. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante 1h. con agitation. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron 3X con 300 pl de tampon de lavado usando el lavador de placas BioTek ELx50. Se retiro cualquier llquido residual dando golpes a los pocillos boca abajo sobre papel absorbente. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de anticuerpo de deteccion. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante 1h. con agitacion. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron como antes. Cualquier llquido residual se retiro como antes. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de solucion de sustrato. Los pocillos se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron a TA durante 12-15 min. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de solucion de parada. Se leyo la placa a 450 nm y 620 nm usando el lector de placas BioTek Synergy 2 y el software de BioTek Gen5. La Figura 8 ilustra el valor de logaritmo natural de LBP en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
Cuantificacion de LBP en especlmenes de FVC. Usando el software de Gen5, se realizaron cuatro parametros de regresion no lineal para generar una curva estandar. Esta curva estandar se uso, a continuacion, para calcular las concentraciones de LBP en los especlmenes de FVC ejecutados sobre el kit de inmunoensayo. Para calcular las concentraciones finales de LBP en los especlmenes de FVC, las concentraciones calculadas se multiplicaron por 50 para justificar la dilucion de especlmenes inicial. Cualquier especimen que tuviera las lecturas de DO Delta (DO450- DO620) inferiores a la lectura de DO Delta del estandar de 1,56 ng/ml se asigno a una concentracion de 1,56 ng/ml, que se multiplico, a continuacion, por 50. Cualquier especimen que tuviera las lecturas de DO Delta superiores a la lectura de DO Delta del estandar de 50 ng/ml se diluyo a diluciones superiores y se ejecuto sobre el kit de nuevo. A continuacion, los datos se analizaron usando metodos estadlsticos tal como se describe a continuacion.
A1AG: Dilucion de especlmenes de FVC. Especlmenes de flujo vaginal-cervical (FVC) se diluyeron 20 1:200 en PVS con 1 % de leche antes del ensayo sobre el Kit de cuantificacion ELISA de Human Orosomucoid (alfa-1- glicoproteina acida) tal como se describe a continuacion.
Deteccion de A1AG en especlmenes de FVC. Despues de la dilucion, los especlmenes de ejecutaron como muestras sobre el Kit de cuantificacion ELISA Human de Human Orosomucoid (alfa-1-glicoprotelna acida) de
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GenWay (Numero de catalogo 40-288-22927F) con algunas modificaciones a las instrucciones del fabricante. En resumen, reactivos, controles y muestras se llevaron a temperatura ambiente (TA). El anticuerpo de recubrimiento se diluyo a 5pg/ml en tampon de recubrimiento (0,05 M Carbonato-Bicarbonato, pH 9,4). se anadieron 100 pl de esta solucion de recubrimiento de 5pg/ml a Immuno LockWells con una superficie MaxiSorp (Nunc, numero de catalogo 446469). Los pocillos se incubaron a TA durante 1h. y a continuacion se lavaron 3X con 300 pl de solucion de lavado (50mM de Tris-HCl, 0,14 M de NaCl, 0,05 % de Tween 20) usando el lavador de placas BioTek ELx50. Se retiro cualquier llquido residual dando golpes a los pocillos boca abajo sobre papel absorbente. se anadieron 200 pl de PBS con un 1 % de leche a cada pocillo y los pocillos se incubaron a tA durante Ih. Los pocillos se lavaron a continuacion como antes y cualquier llquido residual se retiro como antes. El calibrador se diluyo a 250 ng/ml en PBS con un 1 % de leche. A continuacion, se diluyeron 400 pl de la solucion de 250 ng/ml en 400 pl de PBS con un 1 % de leche, generando una solucion de 125 ng/ml. Se repitieron diluciones de dos veces cinco veces adicionales, generando soluciones de 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,625 ng/ml, 7,8125 ng/ml, y 3,90625 ng/ml. Se anadieron 100 pl de estandares a pocillos adecuados por triplicado. Se anadieron 100 pl de controles y muestras a pocillos apropiados por duplicado. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante Ih. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron 5X con 300 pl de solucion de lavado usando el lavador de placas BioTek ELx50. Cualquier llquido residual se retiro como antes. El conjugado de HRP se diluyo a 480 ng/ml en PBS con un 1 % de leche. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de conjugado de HRP diluido. Los pocillos se cubrieron con una tira adhesiva y se incubaron a TA durante Ih. La tira adhesiva se retiro y los pocillos se lavaron como antes.
Cualquier llquido residual se retiro como antes. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de 1-Step Ultra TMB ELISA (Thermo Scientific, numero de catalogo 34028. Los pocillos se cubrieron con papel de aluminio y se incubaron a TA durante 2,75 min. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de reactivo de parada para sustrato de TMB (Sigma, numero de catalogo S5814-100ml). Se leyo la placa a 450 nm usando el lector de placas BioTek Synergy 2 y el software de BioTek Gen5. La Figura 6 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de A1AG en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95).
Cuantificacion A1AG en especfmenes de FVC. Usando el software de Gen5, se realizaron cuatro parametros de regresion no lineal para generar una curva estandar. Esta curva estandar se uso, a continuacion, para calcular las concentraciones de A1AG en los especlmenes de FVC ejecutados sobre el kit de inmunoensayo. Para calcular las concentraciones finales de A1AG en los especlmenes de FVC, las concentraciones calculadas se multiplicaron por 200 para justificar la dilucion de especlmenes inicial. Cualquier especimen que tuviera lecturas de DO450 inferiores a la lectura de DO450 del estandar de 3,90625 ng/ml se asigno a una concentracion de 3,90625 ng/ml, que se multiplico, a continuacion, por 200.
Cualquier especimen que tuviera lecturas de DO450 superiores a la lectura de DO450 del estandar de 250 ng/ml se diluyo a diluciones superiores y se ejecuto sobre el kit de nuevo. A continuacion, los datos se analizaron usando metodos estadlsticos tal como se describe a continuacion.
Deteccion y cuantificacion de MIP-1beta, AFP, B2MG, MCP-1, TIMP-1 y VCAM-1 en especlmenes de FVC. Se
contrato un ensayo de laboratorio externo (Rules Based Medicine) para determinar las concentraciones de MIP- 1beta, AFP, B2MG, MCP-1, TIMP-1 y VCaM-1 en especlmenes de FVC usando una tecnologla de inmunoensayo multiplexado (Luminex xMAP). Los datos proporcionados por el laboratorio del ensayo se analizaron usando metodos estadlsticos tal como se describe a continuacion. La Figura 2 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de MIP 1b en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95). La Figura 3 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de MCP-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95). La Figura 4 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de B2MG en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95). La Figura 5 ilustra diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de TIMP-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95). Diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de AFP en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95) se ilustran en la Figura 9. Diagramas de caja que muestran el valor de logaritmo natural de VCAM-1 en pacientes infectados por IAI (n=14) frente a no infectados por IAI (n=95) se ilustran en la Figura 10.
Analisis estadlsticos de datos. Se llevaron a cabo comparaciones de biomarcadores individuales como sigue: Se agruparon sujetos con estado infectado frente a no infectado mediante definicion de referencia de compuestos. Se realizo un ANOVA en un sentido para comparar grupos que usaban datos transformados por lof para reducir la influencia de los valores extremos. A continuacion, se llevo a cabo un ensayo basado en el rango de Wilcoxin para comparar los grupos. Finalmente, se generaron curvas receptor-operador caracterlsticas (ROC) para evaluar la capacidad discriminatoria.
Se combinaron biomarcadores en modelos que usaban regresion loglstica. Los marcadores con p<0,20 sobre el ensayo de Wilcoxin se consideraron modelos multimarcador. Las curvas ROC basadas en modelo se crearon y usaron para comparar el rendimiento de marcadores individuales con respecto a modelos multimarcador. El intento fue maximizar el area bajo la curva de ROC y asegurar que las curvas cumpllan los criterios mlnimamente aceptables del 80 % de sensibilidad y especificidad. Las puntuaciones de riesgo se calcularon sobre modelos prometedores. Se escogieron umbrales en las puntuaciones de riesgo que maximizaban la sensibilidad/especificidad
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35
del modelo multimarcador.
El area debajo de las curvas caracterlsticas receptor-operador individuales para diez marcadores se muestran en la Tabla 2 (columna etiquetada "AUROC"). Estos marcadores se usaron en combinacion con otros biomarcadores para construir modelos de regresion loglstica para la discrimination de IAI frente a sin IAI, que se muestran en las Figuras 11 y 12. Los parametros para cada marcador en el modelo se muestran a continuation en la Tabla 3. Distintas combinaciones de biomarcadores tuvieron un rendimiento superior en modelos multimarcador con respecto al rendimiento de modelo individual.
Tabla 2. AUROC y valores p de biomarcadores individuales asociados con la prediction de infection intraamniotica.
AUROC valor p
AFTP
0,829 0,0001
IL6
0,813 0,0000
LBP
0,692 0,0146
MCP1
0,686 0,0270
B2MG
0,632 0,1148
A1AG
0,617 0,2162
TIMP-1
0,615 0,1588
GRO-ct
0,607 0,1959
MIP1b
0,569 0,4142
VCAM-1
0,598 0,2432
Tabla 3. Analisis de estimaciones con maxima probabilidad.
Parametro
DF Estimacion Error estandar Chi-cuadrado de Wald Pr > Chi2
Ordenada
1 7,1935 7,5066 0,9183 0,3379
AFTP
1 0,6788 0,3701 3,3641 0,0666
IL6
1 1,3192 0,5689 5,3769 0,0204
LBP
1 0,1894 0,7334 0,0667 0,7962
A1AG
1 -0,3369 0,2833 1,4139 0,2344
Groa
1 -2,3908 1,1906 4,0321 0,0446
Ejemplo 2
El conjunto de datos de desarrollo para biomarcadores de FVC se analizo para evaluar si un punto de corte para las concentraciones de biomarcadores individuales podrla usarse para clasificar pacientes como que tienen un riesgo de infeccion intraamniotica. Las concentraciones de biomarcadores de FVC individuales se expresan como unidades de masa directamente o valores normalizados de estas unidades de masa. Los valores cuantitativos se analizaron para biomarcadores individuales y para combinaciones de biomarcadores. El enfoque de punto de corte permite que el ensayo de IAI de FVC se formatee como un dispositivo de flujo lateral. En un formato de flujo lateral, los niveles de biomarcadores se puntuan cuantitativamente midiendo la intensidad de banda sobre un lector de flujo lateral.
Una combinacion de ELISA de analito unico y matrices de perlas llquidas multiplexadas basadas en la tecnologla xMAP™ se uso para identificar los biomarcadores de IAI. Un cohorte de especlmenes de flujo vaginal-cervical humano (N=1 12) que tenia una prevalencia de IAI del 15 % se recogio en el Ensayo de bancos de especlmenes de IAI ProteoGenix. El fluido amniotico de estos sujetos se analizo mediante cultivo aerobio, anaerobio y Mycoplasma as! como en ensayos internos de PCR de ADNr 16S para establecer el estado de infeccion intraamniotica. Los datos de ELISA e inmunoensayo xMAP™ del FVC se analizaron usando analisis de regresion loglstica, asi como analisis de componentes de base, para seleccionar los mejores ocho biomarcadores de FVC capaces de discriminar pacientes con IAI de pacientes sin IAI. A partir de estos ocho biomarcadores, los ultimos tres se seleccionaron segun la presente divulgacion.
Los datos a partir de los estudios ELISA se usaron para simular lecturas de flujo lateral. Los puntos de corte se escogieron para maximizar la sensibilidad puesto que el intento es usar el ensayo de IAI de FVC como una ayuda para evaluar el riesgo de IAI. Otros ensayos comunmente disponibles, tales como glucosa de fluido amniotico, cepa Gram o cultivo podria usarse para confirmar el diagnostico de IAI. El enfoque de punto de corte permite que los
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resultados del ensayo de PG-IAI se informe como un resultado binario tal como riesgo alto o bajo de infeccion.
El mejor modelo hasta la fecha utiliza concentraciones de masa de solo dos biomarcadores, a-fetoproteina e IL-6. Los especimenes de paciente que no tienen albumina detectable (6/298) o altamente hemolizada (11/292) se retiraron del conjunto de datos. Basandose en el estandar de referencia de compuestos del cultivo o ADNr 16S, hubo 23 infectados y 258 no infectados en este conjunto de datos.
Los resultados se muestran en las figuras 13 y 14. Las concentraciones de biomarcador se transformaron con log y se calculo la puntuacion de Z. Un punto de corte de suma de puntuacion Z de 1,0 se uso en este conjunto de datos de ELISA. Se determino la suma de la puntuacion de Z de los biomarcadores, se clasifico y se determino un punto de corte. La sensibilidad fue del 82 %, la especificidad del 85 %, el PPV del 33 % y el NPV del 98 %. El AUROC fue de 0,86.
Un biomarcador de FVC adicional, se identifico proteina de union al factor de crecimiento de insulina-1 (IGFBP-1), que sirve como un vigilante para el panel de factor de riesgo de dos biomarcadores. El biomarcador de IGFBP-1 no es diagnostico de IAI pero si no que excluye una cantidad de resultados de falso positivo de IAI (basandose en el estandar de referencia de compuestos) y mejora significativamente la especificidad del ensayo de factor de riesgo PG-IAI.
La IGFBP-1 se ha usado como biomarcador en flujo vaginal-cervical para detectar la ruptura de la membrana fetal (AmnioSure Test; Medix Biochemica actim™ Prom Test). La concentracion de IGFBP-1 es 1000 a 10.000 veces superior en fluido amniotico que en flujo vaginal-cervical. En el cohorte de ProteoGenix, la ausencia de ruptura prematura de la membrana (PROM) se verifico mediante Fem negativo, nitrazina, agrupacion y/o ensayos AmnioSure. Tal como se muestra en el grafico de Kaplan-Meier a continuacion, las concentraciones de IGFBP1 de FVC superiores a 3 pg/ml son acordes con el nacimiento prematuro sin IAI. Los resultados se muestran en la Figura 15.
Los especimenes de paciente que no tienen albumina detectable (6/298), altamente hemolizada (11/292) o concentraciones de IGFBP1 superiores a 3 pg/ml (15/281) se retiraron del conjunto de datos. Basandose en el estandar de referencia de compuestos del cultivo y/o ADNr 16S, hubo 23 infectados y 243 no infectados en este conjunto de datos. Las dos concentraciones de biomarcador de diagnostico se transformaron con log y se calculo la puntuacion de Z. Se uso punto de corte de suma de puntuacion Z de 1,0. Se determino la suma de la puntuacion de Z de los biomarcadores, se clasifico y se determino un punto de corte. La sensibilidad fue del 82 %, la especificidad del 89 %, el PPV del 41 % y el NPV del 98 %. El AUROC mejoro de 0,86 a 0,89. 11 de 38 (29 %) de especimenes de pacientes de falso positivo se eliminaron resultando en una mejora de la especificidad del 85 % al 89 % y PPV del 33 % al 41 %. En el cohorte de paciente N=266, un 17 % tienen una puntuacion de alto riesgo. Los resultados se muestran en las figuras 16 y 17.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Elisabeth I. Laderman Thomas H. Grove
<120> BIOMARCADORES DE INMUNODIAGNOSTICO MULTIVARIADO EN FLUJO VAGINAL CERVICAL PARA LA DETECCION DE INFECCION INTRAAMNIOTICA
<130> PTX-0014PR
<140> Aun no asignado <141> Con la presente
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
5
10
15
Met
Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro ser Asn Pro Arg Leu Leu
1
5 10 15
Arg
val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu val Ala Ala Gly Arg Arg Ala
20 25 30
Ala
Gly Ala 35 Ser Val Ala Thr Glu 40 Leu Arg cys Gin Cys 45 Leu Gin Thr
Leu
Gin Gly He His Pro Lys Asn He Gin Ser Val Asn val Lys Ser
50 55 60
Pro
Gly Pro His cys Ala Gin Thr Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asn
65
70 75 80
Gly
Arg Lys Ala cys 85 Leu Asn Pro Ala Ser 90 Pro lie val Lys Lys 95 He
He
Glu Lys Met Leu Asn ser Asp Lys Ser Asn
100 105
<210>2 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400>2

Met Lys Leu Cys val Thr val Leu Ser Leu Leu Met Leu val Ala Ala 15 10 15

Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr 20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe val

35 40 45

val Asp Tyr Tyr Glu Thr ser ser Leu Cys Ser Gin pro Ala val val 50 55 60

Phe Gin Thr Lys Arg ser Lys Gin val cys Ala Asp Pro Ser Glu ser 65 70 75 80

Trp val Gin Glu Tyr val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn 85 90
<210>3 <211 > 201 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400>3
Met
Ala Leu ser Trp val Leu Thr Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu
1
5 10 15
Glu
Ala Gin lie pro Leu Cys Ala Asn Leu val Pro val Pro lie Thr
20 25 30
Asn
Ala Thr Leu ASp Gin lie Thr Gly Lys Trp Phe Tyr lie Ala Ser
35 40 45
Ala
Phe Arg Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Ser val Gin Glu lie Gin
Ala
50 55 60
Thr
phe Phe Tyr phe Thr pro Asn Lys Thr Glu ASp Thr lie phe Leu
65
70 75 80
Arg
Glu Tyr Gin Thr 85 Arg Gin Asp Gin Cys 90 He Tyr Asn Thr Thr 95 Tyr
Leu
Asn val Gin Arg Glu Asn Gly Thr lie Ser Arg Tyr val Gly Gly
100 105 110
Gin
Glu His Phe Ala His Leu Leu lie Leu Arg ASp Thr Lys Thr Tyr
115 120 125
Met
Leu Ala Phe Asp val Asn Asp Glu Lys Asn Trp Gly Leu Ser Val
130 135 140
Tyr
Ala Asp Lys Pro Glu Thr Thr Lys Glu Gin Leu Gly Glu Phe
Tyr
145
150 155 160
Glu
Ala Leu Asp Cys Leu Arg lie pro Lys Ser Asp Val val Tyr Thr
165 170 175
Asp
Trp Lys Lys Asp Lys Cys Glu Pro Leu Glu Lys Gin His Glu Lys
180 185 190
Glu Arg Lys Gin Glu Glu Gly Glu Ser 195 200
<210>4 <211>609 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400>4

Claims (17)

  1. 5
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    15
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    40
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    55
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para la deteccion de inflamacion o infeccion intraamnioticas en una muestra obtenida a partir de un sujeto mamifero de sexo femenino en estado de embarazo que comprende:
    (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de dicho sujeto el nivel de alfa-fetoproteina (AFP) e interleucina-6 (IL-6) en relacion con los niveles correspondientes de dichas proteinas en un flujo vaginal- cervical normal o un flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamacion o infeccion intraamnioticas; y
    (b) detectar inflamacion o infeccion intraamnioticas en dicha muestra si se determina que dichos niveles de cada una de dichas proteinas en dicha muestra muestran una diferencia estadisticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas proteinas en dicho flujo vaginal-cervical normal, o se determina que no muestra una diferencia estadisticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de cada una de dichas proteinas en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamacion o infeccion intraamnioticas.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el sujeto es un paciente humano.
  3. 3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho nivel se determina mediante metodos que comprenden el uso de un inmunoensayo, una matriz de proteinas, un ensayo inmunocromatografico, espectrometria de masas o combinaciones de los mismos.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3 en el que dicho nivel se determina usando un ensayo inmunocromatografico que emplea un dispositivo de flujo lateral, en el que opcionalmente el dispositivo de flujo lateral es un ensayo de tira inmunocromatografica (ICS).
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, en el que dicho inmunoensayo emplea anticuerpos y reactivos para la deteccion de IL-6 y AFP, en el que opcionalmente los anticuerpos y reactivos comprenden un anticuerpo de captura y un anticuerpo detector.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo detector son:
    (a) anticuerpos monoclonales;
    (b) anticuerpos policlonales; o
    (c) o bien anticuerpos monoclonales o policlonales.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que los anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales que tienen una especificidad de union de IL-6 y AFP y en donde el metodo comprende ademas el uso de una inmunoglobulina de anti-anticuerpos.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que los anticuerpos monoclonales y la inmunoglobulina de anti-anticuerpos se proporcionan en una cantidad de:
    (a) de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 gramos; o
    (b) de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 gramo.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la inmunoglobulina de anti-anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina policlonal, proteina A y proteina G o fragmentos funcionales de las mismas.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que la inmunoglobulina de anti-anticuerpos esta marcada.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas el uso de:
    (a) agentes para reducir la interferencia de fondo en un ensayo o agentes para aumentar la senal; o
    (b) software y algoritmos para combinar e interpolar valores de marcador para producir una prediction del resultado clinico de interes.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 5, que comprende ademas el uso de un aparato para realizar un ensayo.
  13. 13. Un metodo para determinar si los signos y sintomas indican inflamacion o infeccion intraamnioticas, que comprende
    (a) medir en una muestra de flujo vaginal-cervical obtenido a partir de un sujeto mamifero de sexo femenino en estado de embarazo los niveles de interleucina-6 (IL-6) y alfa-fetoproteina (AFP) en relacion con los niveles correspondientes de dichas proteinas en un flujo vaginal-cervical normal o un flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamacion o infeccion intraamnioticas; y
    (b) diagnosticar a dicho sujeto inflamacion o infeccion intraamnioticas si cada uno de dichos niveles de IL-6 y
    AFP en dicha muestra se determina que muestra una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de IL-6 y AFP en dicho flujo vaginal-cervical normal o se determina que no muestran una diferencia estadlsticamente significativa en relacion con los niveles correspondientes de IL-6 y AFP en dicho flujo vaginal-cervical conocido por ser indicativo de inflamacion o infeccion intraamnioticas.
    5
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que los signos y slntomas comprenden fiebre materna (> 37,8 °C), leucocitosis materna (>15.000 /mm3), taquicardia materna y/o fetal, sensibilidad uterina y/o fluido amniotico fetido.
  15. 15. Un dispositivo de ensayo inmunocromatografico que comprende tiras de cromatografla para la deteccion de 10 interleucina-6 (IL-6) y alfa-fetoprotelna (AFP) en el que la tira o las tiras de cromatografla comprende(n) anticuerpos
    de IL-6 y AFP, en donde opcionalmente el dispositivo de ensayo inmunocromatografico es un dispositivo de flujo lateral.
    Figura 1
    cn
    Estadistica poranalito
    Q2
    7,84 7,97
    Min.
    7,35 7,35
    Max.
    8,59 10,16
    10,5 -
    10,0 -
    9,5 -
  16. 9.0 - 8,5-
  17. 8.0 -
    7, 5 -
    7,0 -______________________
    I |
    infectado no infectado
    Figura 2
    Estadistica por analito
    Q2
    6,84 6,12
    1 Mm.
    3,33 2,63
    Max.
    8,05 9,55
    10 -
    1
    )
    8 -
    l 6 -
    i
    1
    4 -
    !
    F
    imagen1
    [j
    imagen2
    I
    ■fs.
    F igura 3
    imagen3
    Figura 4
    ■fs.
    00
    —--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------— Estadistica poranalito
    Q2
    4,91 3,38
    Min.
    0,26 0,26
    Max.
    6,29 6,61
    imagen4
    Figura 5
    Estadistica poranalito
    Q2
    Min.
    Max.
    4,73
    -1,47
    5,68
    imagen5
    3,20
    -2,47
    5,71
    -2 -
    □
    □
    H
    n
    Estadi'stica por analito
    Q2
    Min.
    iMax.
    :______________
    12,5-
    o 10,0-
    7,5 -
    5,0-
    2,5 - 0 -
    Figura 6
    imagen6
    Figura 7
    Estadistica por analito
    5,74 5,73 9,94
    10 -
    9 -
    8 -
    7 -
    6 -
    5 -
    ! i
    imagen7
    Q2
    7,38
    Min.
    5,74
    Max.
    9,44
    cn
    hJ
    Figura 8
    !Estadistica por analito
    Q2
    5,20 4,36
    Min. I
    4,56 4,36
    Max. i
    5,96 8,33
    9 -
    □
    8 -
    □
    7 -
    imagen8
    Figura 9
    Estadistica por analito
    Q2
    3,78 1,87
    Min.
    1,33 0,90
    Max.
    5,93 5,55
    6 - 5 - 4 - 3 - 2 - 1 -
    imagen9
    imagen10
    0 4
    Figura 10
    Estadistica por analito
    Q2
    1,31 0,22
    ■Min.
    -3,32 -3,32
    Min.
    2,35 3,63
    4 -
    2 -
    0 -
    I
    T
    -2 -
    ---------1--------
    infectado
    Figura 11
    Curva ROC
    imagen11
    Figura 12
    Curva ROC
    imagen12
    Figura 13
    imagen13
    Estado de iai compuesto - feb 2010 - post-sec.
    imagen14
    Figura 14
    imagen15
    Figura 15
    Tiempo para el parto (dias) mediante estrato de IGFBP1 en FVC y estado de infeccion de FV
    imagen16
    ------------- Bajo IGFBP1, sin IAI -------------Alto IGFBP1, Sin IAI
    -------------Alto IGFBP1, sin IAI
    Figura 16
    imagen17
    o
    o
    imagen18
    m
    CM
    o'
    o
    o
    o'
    Figura 17
    imagen19
    ---r----------—-----------1--------■ ------—l--------------------------f-
    0,25 0,50 0,75 1,00
    1-Especificidad
ES10795488.5T 2009-11-25 2010-11-22 Detección de infección intraamniótica Active ES2677944T3 (es)

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