BRPI0717803A2 - Composições e ensaios multiplicadores para a medição de mediadores biológicos de saúde fisiológica - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E ENSAIOS MULTIPLICADORES PARA A MEDIÇÃO DE MEDIA- DORES BIOLÓGICOS DE SAÚDE FISIOLÓGICA".

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados Esse pedido reivindica a prioridade ao Pedido Provisório U.S. n°

de série 60/849.928 depositado em 6 de outubro de 2006, cuja revelação é incorporada aqui por esta referência.

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção refere-se em geral a ensaios simples para a

determinação do estado de saúde de animais e particularmente a ensaios multiplicadores que envolvem a medição de citocinas, hormônios, e adipoci- nas para avaliar o estado de saúde do animal e ao efeito de nutrição sobre estado de saúde.

Descrição da Técnica Relacionada

Citocinas, adipocinas, e hormônios estão entre os principais me- diadores biológicos que orquestram resposta fisiológica a estímulos e esfor- ço e são, portanto, úteis como "assinaturas" do estado de saúde e/ou indica- dores de doença. Avaliando-se mudanças, tanto estática quanto temporal, 20 nesses mediadores proveem algum entendimento da resposta do sistema biológico ou organismo aos estressores.

Análise multiplicadora é conveniente e permite o estudo de anali- tos múltiplos usando-se intrumentos tal como a plataforma de Luminex xMAP. Tal análise multiplicadora permite medição quantitativa simultânea de 25 até 100 analitos em um único ensaio. Tais ensaios são assim adequados para o acúmulo dos dados exigidos, e para a natureza das amostras envol- vidas no estudo de mediadores biológicos tais como aqueles descritos aqui.

Embora as técnicas para a medição de muitos mediadores bio- lógicos sejam conhecidas, permanece a necessidade de painéis de sondas para o desenvolvimento de ensaios multiplicadores capazes de simultanea- mente medir múltiplas proteínas biologicamente relevantes usando-se quan- tidades muito pequenas de amostras biológicas para rapidamente avaliar o T 2

estado de saúde de animais, especialmente animais companheiros, bem como para formular regimes para o melhoramento do estado de saúde de animais. Em particular, há uma necessidade para as sondas e métodos para avaliar o estado de saúde de animais e para intervenções terapêuticas ou nutricionais úteis para efetuar o melhoramento da saúde do animal.

Sumário da Invenção

É, portanto, um objetivo da presente invenção prover painéis de sondas para o desenvolvimento de ensaios multiplicadores capazes de si- multaneamente medir múltiplas proteínas biologicamente relevantes usando- se quantidades muito pequenas de amostras biológicas.

É um objetivo da invenção da presente invenção prover métodos para rapidamente avaliar o estado de saúde dos animais.

É um outro objetivo da presente invenção prover regimes nutri- cionais para o melhoramento do estado de saúde dos animais.

É um outro objetivo da invenção prover artigos de fabricação na

forma de kits que contêm combinações dos ensaios multiplicadores da pre- sente invenção e intrução de como usar os ensaio para as várias finalidades.

Um ou mais desses e outros objetivos são alcançados usando- se novas coleções de sondas moleculares detectáveis para a determinação da atividade, da presença ou da expressão de cada um conjunto predeter- minado de analitos em uma única amostra. O conjunto de analitos compre- endem pelo menos uma citocina ou gene para a mesma e, uma quimiocina ou gene para a mesma, um hormônio ou gene para o mesmo, e uma adipo- cina ou gene para a mesma, para cada analito no conjunto, a coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da atividade, da presença ou da expressão daquele analito. Em algumas concretizações, o conjunto de analitos adicionalmente compreende um ou mais fatores de crescimento neuronal ou genes para os mesmos, fa- tores de crescimento outros que não-fatores de crescimento neuronal ou genes para os mesmos, receptores solúveis ou genes para os mesmos ou suas combinações.

Outros e mais objetivos, características e vantagens da presente invenção estarão prontamente evidentes por aqueles versados na técnica. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1, apresentação diagramática de Síndrome metabólica que mostra o papel central que resiste à insulina e sustenta e risco final de 5 doença cardíaca, acidente vascular cerebral, e/ou inflamação.

Figura 2, citocinas que respondem ao estímulo de LPS: PBMCs foram cultivados com concentrações diferentes de LPS por 3, 6, ou 18 hrs C/S foram analisados para citocinas Dados para IL-6 [A], TNFaIfa [B], IL-18 [C] e IL-8 [D] são mostrados. No eixo X dose de LPS ng/ml, eixo Y é Intensi- 10 dade de Fluorescência Média [MFI] ou [MF] e eixo Z representa ponto de tempo.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

O termo "atividade" de um gene inclui qualquer medição que es- tá relacionada às regras biológicas centrais desempenhadas por um gene. Por exemplo, medição da transcrição de um gene, ou medição ou em pontos de tempo estático ou em tempo real da abundância de uma espécie de RNA transcrita a partir do mesmo. O técnico versado apreciará que uma medição de uma "atividade" do gene como usada aqui pode incluir medições em teci- dos específicos, tipos de células ou órgãos, da quantidade de mRNA produ- zido a partir de um gene particular, se em tempo real ou não. Similarmente, o versado na técnica também apreciará que analitos de proteína podem ser medidos em uma variedade de meios úteis. Medição de proteína e outros analitos podem incluir a presença ou a ausência do analito, atividade (por exemplo, atividade de enzima ou outra atividade biológica), propriedades de ligação, semivida, mudança, ou outros atributos do analito.

O termo "analito" inclui proteínas "expressas a partir de um ge- ne" na forma de proteínas nativas como elas são traduzidas na célula e nas proteínas tendo deslocamento, processamento, modificações, e similares. 30 Assim, em alguns casos analitos de proteína podem ser truncados depois da tradução, ou, por exemplo, podem ser fosforilados, ou têm outras modifica- ções tal como na cadeia princpal ou na cadeia lateral de qualquer resíduo de aminoácido. O termo analito também inclui derivados metabólicos de tais proteínas, e complexos, se ativos ou não, de uma ou mais proteínas com um ou mais substituintes encontrados em uma célula. Em concretizações prefe- ridas, os analitos são proteína ou peptídeos e as sondas são anticorpos. Ca- 5 da anticorpo na coleção de sondas especificamente reconhece apenas uma proteína no conjunto, e há pelo menos um tal anticorpo na coleção para ca- da proteína no conjunto selecionado. O técnico versado apreciará que uma vez que um conjunto de tais proteínas foi selecionado, se as seqüências a- minoácidos dessas proteínas forem conhecidas, está frequentemente dentro 10 da habilidade do versado técnico projetar um conjunto de ácido nucleico ou outras sondas que correspondem aos genes ou mRNAs a partir daquelas proteínas são expressas. Correspondentemente, tais aplicações são úteis também aqui.

O termo "animal" significa qualquer animal tendo citocinas, hor- 15 mônios, adipocinas, fatores de crescimento neuronal, fatores de crescimento outros que não fatores de crescimento neuronal, ou receptores solúveis úteis na presente invenção, incluindo, mas não limitados a, ser-humano, aviário, bovino, canino, equino, felino, caprino, murino, ovino, e suíno porcine ani- mais, de preferência seres humanos, murinos, simíos, caninos, e felinos.

O termo "coleção" em referência a um grupo de sondas molecu-

lares significa uma pluralidade. Tipicamente a pluralidade não tem limite, embora coleções de 100 ou menos sondas sejam preferidas.

O termo "sonda(s) molecular(es)" significa qualquer molécula que pode ser usada para detectar a presença ou a atividade de um gene, seu RNA correspondente, ou seu produto de expressão de proteína.

O termo "painel" é sinônimo ao termo coleção. O termo painel é algumas vezes mais descritivo do uso da coleção em amostras de triagem. Uma coleção como usada aqui é de preferência, mas não necessariamente, usada para a detecção de um conjunto correspondente de analitos em forma 30 multiplex, isto é, todos os resultados para cada uma da pluralidade de son- das são obtidos a partir de uma única reação ou recipiente de ensaio. Uma coleção de sondas tipicamente corresponde a um conjunto de analitos, em que cada uma da pluralidade de sondas corresponde a um analito particular. Em certas concretizações, os analitos são genes ou produtos de genes (pro- teínas) e as sondas permitem a medição da atividade ou expressão de cada um dos genes (ou seus produtos de expressão) no grupo (ou conjunto). Mais de preferência, os analitos são proteínas expressas a partir do gene.

O termo "embalagem única" significa que os componentes de um kit estão fisiologicamente associados em ou com um ou mais recipientes e são considerados uma unidade para a fabricação, distribuição, venda ou uso. Recipientes incluem, mas não são limitados a, sacos, caixas, garrafas, 10 embalagens, componentes grampeados ou de outra maneira unidos, ou su- as combinações. Uma única embalagem podem ser recipientes de compo- nentes de ensaio individuais fisicamente associados tais que eles são consi- derados uma unidade para a fabricação, distribuição, venda ou uso.

O termo "embalagem virtual" significa que os componentes de 15 um kit estão associados por orientação em um ou mais componentes de kit virtuais ou físicos que instruem o usuário como se obter outros componen- tes, por exemplo, em uma embalagem contendo um componente e orienta- ções que instruem o usuário para ir a um website, contatar uma mensagem gravada, ver uma mensagem visual, ou contatar um instrutor ou profissional 20 encarregado da prescrição para se obter instruções de como usar o kit.

A Invenção

Em um aspecto, a presente invenção provê uma coleção de sondas moleculares detectáveis para a determinação de uma única amostra, a atividade, presença ou expressão de cada um de conjunto predeterminado 25 de analitos. O conjunto de analitos compreende pelo menos uma citocina ou gene para a mesma, uma quimiocina ou gene para a mesma, um hormônio ou gene para o mesmo, e uma adipocina ou gene para a mesma. Para cada analito no conjunto da coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para o uso em uma detecção da atividade, 30 presença ou expressão daquele analito. Pretende-se que essas coleções de sondas para o uso em um método de detecção que é de preferência condu- zido em um formato de ensaio conveniente em um recipiente de reação úni- co. Em combinação com reconhecimento de padrão apropriado e técnica de análise de trajetória desses painéis ajudam a prever ou avaliar resultados funcionais de intervenções e estressores fisiológicos.

De preferência, as sondas moleculares compreendem proteína, ácido nucleico ou suas combinações mas podem compreender moléculas pequenas ou outros compostos e estruturas ou suas combinações. Exem- plos de sondas compreendendo proteína incluem anticorpos, fragmentos de anticorpo, receptores, proteínas de ligação, enzimas e similares. Eles podem ser usados para sondar não apenas analitos de proteína, mas uma varieda- de de outros analitos. Sondas de ácido nucleico incluem aqueles cuja espe- cificidade surge através de emparelhamento de tipo Watson-Crick comple- mentar, bem como aqueles cuja especificidade origina-se de ou inclui outras interações. Por exemplo, aptâmeros, ácidos nucleicos que podem ser proje- tados para reconhecer especificamente certos analitos, tais como proteínas ou outras moléculas, são úteis aqui. Enzimas de ácido nucleico tais como DNAzimas e ribozimas são conhecidas na técnica, têm especificidades co- nhecidas, e são úteis como sondas aqui. Sondas podem também compreen- der Iigantes para a ligação de moléculas e receptores. O uso de todas tais moléculas como sondas para analitos, tais como os produtos de expressão de genes, ou ainda os próprios genes, é conhecido na técnica, e assim o técnico versado apreciará como selecionar e adaptar tais moléculas para o uso aqui.

Sondas podem ser produzidas pelo homem ou isoladas da natu- reza. Em concretizações preferidas, as sondas moleculares são anticorpos. 25 Em uma concretização, cada anticorpo em uma coleção pode especifica- mente reconhecer e assim serve para identificar, um analito de proteína em um conjunto correspondente de proteínas. Sondas podem ser usadas em qualquer formato conveniente, tal como solução ou suspensão. Em certas concretizações, elas podem estar ligadas a um substrato, tal como um veícu- 30 Io ou uma conta, ou colocadas em um ensaio, microensaio, ou similares de modo a criar um sistema de ensaio útil, conveniente e/ou informativo.

O conjunto predeterminado de analitos em certas concretizações é um conjunto de genes, ou um conjunto ou proteínas. Em certas concreti- zações de analitos de proteína e ensaios com base em um conjunto corres- pondente de genes ou mRNAs são desenvolvidos. O conjunto de analitos é selecionado em uma base racional, com base em sua relação à informação a ser obtida a partir do painel. Em uma concretização preferida, o conjunto de analitos é selecionado com bem na relação de cada analito ao estado de saúde de um indivíduo.

Em uma concretização, o conjunto de analitos é um proteínas compreendendo pelo menos uma citocina, uma quimiocina, um hormônio, e uma adipocina. Para cada analito no conjunto, a coleção de sondas molecu- lares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da presença, da atividade ou da expressão daquele analito - isto é, há uma sonda correspondente para cada analito no conjunto cuja presença, ativida- de, ou expressão deve ser determinado. Em uma outra concretização, em que a coleção de sondas moleculares é o conjunto exposto acima de anali- tos de proteína, o conjunto de analitos adicionalmente compreende um ou mais de pelo menos um outro tipo de organismo probiótico.

Em uma outra concretização, o conjunto de analitos compreende um conjunto de genes com pelo menos um gene que codifica uma citocina, um um gene que codifica uma quimiocina, um que codifica um hormônio, e uma adipocina. Em uma concretização, o conjunto de gene analitos adicio- nalmente compreende pelo menos um gene que codifica um fator de cresci- mento neuronal, pelo menos um gene que codifica um outro fator de cresci- mento (isto é, fatores de crescimento outros que não-fatores de crescimento neuronal), ou pelo menos um gene que codifica receptores solúveis, ou qualquer sua combinação.

Enquanto não há limite real a numerosas sondas que podem estar presentes em uma única coleção de acordo com isso, é preferido que um limite superior seja de 100 sondas por coleção em certas concretizações. Coleções menores de sondas são também adequadas. Por exemplo, painéis de cerca de 90-100, 80-90, 70-80 ou 60-70 sondas são adequadas para o uso aqui. Similarmente, coleções de cerca de 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 ou 50-60 são também adequadas para o uso. Outros números específicos de sondas oriundas de 4 a 100 estão também incluídas aqui, embora não espe- cificamente enumeradas, como são todas as faixas possíveis de desde 4- 100 sondas incluídas aqui, embora não especificamente enumeradas. Fai- xas de ondas são particularmente onde alguma redundância pode ser inci- almente desejável, e mais tarde encontradas serem desnecessárias ou al- ternativamente, onde uma sonda adicional pode ser determinada ser útil pa- ra incluir com uma coleção particular como mais a cerca de sua regra in vivo é revelada ou é aprecidada. Em outras concretizações, por exemplo, onde as sondas podem estar ligadas a um ensaio ou microensaio, pode ser útil, e assim preferível, exceder 100 sondas por coleção.

Em uma concretização, a coleção de sondas moleculares com- preende sondas detectáveis para a detecção de uma proteína (isto é, um produto de gene codificado) de cada um de um conjunto de genes desse modo determinando a expressão de cada gene no conjunto. Em tais concre- tizações, de preferência cada sonda é específica para a detecção da proteí- na codificada para um gene no conjunto. Em algumas concretizações, um grau de reatividade cruzada pode ser experimentalmente aceitável. Isso é particularmente verdadeiro onde as sondas são elas próprias moléculas bio- lógicas, tais como anticorpos. A reatividade cruzada de certos anticorpos é reconhecida na técnica. O técnico versado apreciará que reatividade cruza- da de anticorpos a antígenos proximamente relacionados, tais como algu- mas proteínas podem criar problemas, especialmente se severos. Em uma concretização, a reatividade cruzada é minimizada ou eliminada através do uso de anticorpos monoespecíficos, tais como anticorpos altamente purifica- dos, ou anticorpos monoclonais para epítopos que são imunologicamente distinguíveis. Em uma outra concretização, a reatividade cruzada é distinguí- vel a partir da atividade pretendida com base nas propriedades de ligação tais constantes de ligação, ou uma medição da resistência de ligação, ou similares. Em uma outra concretização, o uso de controles adequados e cui- dadosos, ou outros meios, tal como análise de computador de resultados permiet a correção dos dados experimentais para reatividade cruzada de certos tipos.

Enquanto há muitas escolhas para o conjunto de analitos, como discutidas aqui, uma abordagem racional para a seleção de analitos é prefe- rida. A coleção de sondas moleculares de preferência será projetada ou se- lecionada com o objetivo do uso pretendido em mente. Para aquela finalida- de, o conjunto de analitos é predeterminado via uma abordagem racional que permanece nas relações conhecidas, previstas ou aqui reveladas entre a presença ou atividade de certos analitos por vários aspectos de saúde de um animal. Fatores tais como o estado de inflamação em um animal e a pre- sença relativa de certos hormônios e outros sinais bioquímicos ou conduto- res de sinal podem auxiliar a prover informação detalhada ligada ao estado de saúde de um animal.

Assim, em uma concretização, o conjunto de analitos é um con- junto de proteínas que compreende uma ou mais citocinas. De preferência, a citocina inclui uma ou mais de interferon alfa, interferon gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, inter- leucina 4, interleucina 10, transformante de fator de crescimento beta-1 , fa- tor de necrose de tumor beta, interleucina 3, interleucina 5, interleucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, inter- leucina 2, interleucina 11, interleucina 12 p70, interleucina 16, interleucina 17, Regulado na ativação, Normal T Expresso e presumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21, interleucina 9, ou receptor de fator de crescimen- to beta transformante III. Em várias concretizações, o conjunto de proteínas compreende

uma ou mais quimiocinas, por exemplo, B- quimioatraente de linfócito, peptí- deo de ativação de neutrófilo derivado de célula epitelial, eotaxina, eotaxina- 2, proteína 2 quimiotática de monócito, proteína 3 quimiotática de monócito, fator inibitório de migração de macrógafo, proteína inflamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1, proteína de estimulação de ma- crógafo, proteína quimiotática de granulócito 2, proteína 10 induzível por in- terferom gama, fator inibitório de leucemia, fator de estimulação de colônia de macrófago, proteína quimiotática de monócito 1, quimiocina derivada de macrófago, proteína inflamatória de macrófago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regu- lada pulmonar e por ativação, fator derivado de célula estromal alfa, quimio- cina regulada por timo ou por ativação, betacelulina, 6 Cquina, fator de cres- cimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimiocina de CC de hemofiltrado 1, proteína quimiotática de monócito 4, proteína inflamatória de macrófago 3 beta, fator de plaqueta 4, ativador de receptor de NF-kappa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionado a crescimento gama, alfa quimioatraente de célula T induzível por interferona gama, receptor de fator inibitório de leu- cemia alfa, "midkine", proteína 3 inflamatória de macrógrafo alfa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimiocina expressa com timo, fator de crescimento alfa transformante, citocina induzida por activina relacionado a TNF, proteína-1 de adesão vascular , CXCL9, ou CCLI. Naturalmente, o conjunto pode compreender as quimiocinas expostas acima além das citoci- nas exemplificadas aqui.

Em várias concretizações, o conjunto de proteínas compreende um ou mais hormônios. Preferidos são os hormônios prolactina, proteína 2 de ligação de fator de crescimento de tipo insulina, leptina, insulina, resistina, adiponectina, glucagon, peptídeo 1 relacionado com glucagon ou PYY. O versado na técnica apreciará que outros hormônios podem ser selecionados. De preferência, a atividade ou a presença dos hormônios é afetada por um regime nutriconal selecionado como discutido abaixo, ou há uma relação entre a atividade ou a presença do hormônio ao estado de saúde de um a- nimal. Como aqui, e para cada uma das categorias exemplificadas aqui co- mo dentro da predeterminação racional do conjunto de proteínas, a inclusão de certos hormônios não precludem e podem ser além da inclusão de outras moléculas, por exemplo citocinas, quimiocinas, adipocinas, e outras descri- tas aqui.

Em uma outra concretização, o conjunto de proteínas compre- ende uma ou mais adipocinas, incluindo mas não limitadas a proteína 1 qui- miotática de monócito, leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa, ou ini- bidor de fibrinólise ativável por trombina.

Em certas concretizações, o conjunto predeterminado de anali- tos de proteína adicionalmente compreende um ou de um fator de cresci- mento neuronal, um fator de crescimento outros que não um fator de cresci- mento neuronal, ou um receptor solúvel, ou suas combinações.

Fatores de crescimento neuronal para o uso aqui incluem mas não limitados a fator neutrófico ciliar, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neutrófico derivado de cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta.

Fatores de crescimento são de preferência selecionados de an- giogenina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibro- blasto 7, fator de crescimento de fibroblasto-9, fator de estimulação de colô- nia de macrófago de granulócito, atividade de estimulação de crescimento de melanoma, oncostatina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento beta-3 transformante, fator de crescimento de fibroblasto 6 de anfirregulina, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de célula- tronco, fator de crescimento endotelial vascular, cardiotrofina-1 , oncogene relacionado a crescimento beta, fator de crescimento de EGF-hke de ligação de heparina , fator de crescimento de hepatócito, mediador de entrada de vírus da herpes, Iipoproteinase de metal de matriz 10, Iipoproteinase de me- tal de matriz 7, metaloproteinase de matriz 9, inibidores de tecido de metalo- proteinases 1 , fator de crescimento endotelial vascular D, receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2, fator de crescimento de fibroblasto bá- sico, fator de crescimento de insulina tipo I, fator de crescimento de insulina tipo II, proteína 1 de ligação de fator de crescimento tipo insulina, proteína 3 de ligação de fator de crescimento tipo insulina, proteína 4 de ligação de fa- tor de crescimento tipo insulina, proteína 6 de ligação de fator de crescimen- to de tipo insulina, metaloproteinase de matriz 1 , metaloproteinase de matriz 2, ou inibidor de tecido de metaloproteinases 2.

Os receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonista de re- ceptor de interleucina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigante indu- tor de apoptose relacionada com TNF, receptor ativador de plaminogênio de tipo uroquinase, Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms, glicoproteína so- lúvel 130, receptor I solúvel em interleucina 1, receptor solúvel em interleuci- na 6, receptor de fator de necrose de tumor I, receptor Il de fator de necrose de tumor, caderina de epitélio vascular, CCL28, molécula 4 associada a Iin- fócito T citotóxico, receptor de morte 6, Iigante de Fas, molécula de adesão intracelular 3, receptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L-selectina, molécula 1 de adesão de célula endotelial de plaqueta, Re- ceptor de fator de célula-tronco, Receptor 4 de Iigante de indução de apop- tose relacionado a TNF, Adesão de célula de leucócito ativada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, Molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, receptor Il solúvel em in- terleucina 1, receptor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de Fator de estimulação de colônia de macrófago, receptor alfa de fator de crescimento derivado por plaqueta, ou Receptor 4 de Iigante de in- dução de apoptose relacionado a TNF, e outros, são todos úteis aqui.

Em uma outra concretização preferida, o conjunto de analitos é um conjunto de genes que compreende um ou mais genes que codificam uma ou mais citocinas. De preferência, as citocinas codificadas incluem uma ou mais das citocinas enumeradas aqui interferon alfa, interferon gama, in- terleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfoto- xina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 4, interleucina 10, fator de crescimento beta-1 trans- formante, fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, interleucina 5, inter- Ieucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 2, interleucina 11, interleucina 12 p70, interleucina 16, in- terleucina 17, Regulado na ativação, Normal T Expresso e presumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21 , interleucina 9, ou receptor de fator de crescimento beta transformante III. O conjunto de genes compreende, em certas concretizações, um

ou mais genes que codificam uma ou mais quimiocinas B-quimioatraente de linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epitelial, eota- xina, eotaxina-2, proteína 2 quimiotática de monóciío, proteína 3 quimiotática de monócito, fator inibitório de migração de macrógafo, proteína 1 inflamató- ria de macrófago alfa, fator inibitório de origem mieloide 1, proteína de esti- mulação de macrógafo, proteína 2 quimiotática de granulócito, proteína 10 induzível por interferon gama, fator inibitório de leucemia, fator de estimula- ção de colônia de macrófago, proteína 1 quimiotática de monócito, quimioci- na derivada por macrófago, proteína 1 inflamatória de macrófago beta, prote- ína 1 inflamatória de macrófago delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e de ativação, fator derivado de célula estro- mal alfa, quimiocina regulada por timo ou por ativação, betacelulina, 6 Cqui- na, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimiocina CC de hemofiltrado 1, proteína 4 quimiotática de monócito, proteína 3 inflamatória de macrófago beta, fator de plaqueta 4, ativador de receptor de NF-kappa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto-4, follistatin, oncogene relacionado a crescimento gama, alfa qui- mioatraente de célula T induzível por interferon gama, fator inibitório de leu- cemia receptor alfa, de ""midkine"", proteína inflamatória de macrófago 3 al- fa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimiocina expressa com timo, fator de crescimento alfa transformante, citocina induzida por acti- vina relacionada a TNF1 proteína-1 de adesão vascular , CXCL9, ou CCL1 naturalmente, o conjunto pode compreender um ou mais genes para as qui- miocinas expostas acima além daqueles genes para as citocinas exemplifi- cadas aqui.

Em várias concretizações, o conjunto de genes compreende um ou mais genes que codificam vários hormônios. Preferidos são genes que codificam os hormônios prolactina, proteínade ligação 2 de fator de cresci- mento tipo insulina, leptina, insulina, resistina, adiponectina, glucagon, peptí- deo 1 relacionado com glucagon, ou PYY. De preferência, há uma relação entre a atividade ou expressão do hormônio codificado ao estado de saúde de um animal. A inclusão no conjunto de analitos de um ou mais genes que codificam hormônios não impede a inclusão de um ou mais genes que codi- ficam outras moléculas, por exemplo, citocinas, quimiocinas, adipocinas, e outros descritos aqui.

Em uma outra concretização, o conjunto de genes compreende uma ou mais genes que codificam um ou mais da proteína 1 quimiotática de monócito de adipocinas, Ieptina1 resistina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa, ou genes de inibidor de fibrinólise ativável por trombina para outras adipocinas são também úteis aqui.

Em certas concretizações, o conjunto predeterminado de genes adicionalmente compreende um ou mais genes que codificam um fator de crescimento neuronal, um fator de crescimento outros que não um fator de crescimento neuronal, ou um receptor solúvel. Fatores de crescimento neu- ronal preferidos, fatores de crescimento outros que não fatores de cresci- mento neuronal, e receptores solúveis incluem mas não são limitados àque- les enumerados aqui para o conjunto de proteínas. Outras tais moléculas são também contempladas para o uso aqui. Em várias concretizações, o conjunto de analitos compreende

uma ou mais produtos metabólicos primários ou secundários. Assim, em uma concretização, o conjunto de analitos inclui uma ou mais eicosanoides, uma classe de moléculas hidrofóbicas oxigenadas que grandemente funcio- nam como mediadores autócrino e parácrino de funções biológicas. Por e- xemplo, Ieucotrienos são conhecidos como servindo como agentes na res- posta inflamatória. Alguns têm um efeito quimiotático na migração de neutró- filos, e como tais ajudam a levar células necessárias ao tecido. Leucotrienos também são poderosos vasoconstritores, particularmente de vênulas. Elas funcionam na broncoconstrição, e podem também aumentar a permeabilida- de vascular. Leucotrienos adequados para o uso aqui incluem mas não são limitados a LTA4, LTB4, LTC4, LTD4, LTE4, e LTF4. Outros eiscosanóides adequados como analitos para o uso aqui incluem tromboxanos e os deriva- dos de prostaglandina H1 prostanoides. Ainda outros compostos eiscosanói- des tais como resolvinas, isofuranos, isoprostanos, lipoxinas, ácidos epoxiei- cosatrienoico (EETs), neuroprotectina D e endocanabinoide de 20 carbonos podem ser adequados para o uso aqui como analitos. Além disso, recepto- res eicosanoides, tais como os receptores de Ieucotrieno CysLTI (Receptor de Ieucotrieno de cisteínila tipo 1), CysLT2 (Receptor de Ieucotrieno de ciste- ínila tipo 2), e BLTI (receptor de B4 de leucotrieno), os receptores prostanoi- des PGD2 DP-(PGD2), PGE2 , EPI- (PGE2), EP2-(PGE2), EP3-(PGE2), EP4-(PGE2), PGF2alfa FP-(PGF2alfa), PGI2 (prostaciclina) IP-(PGI2), e TXA2 (tromboxano) TP-(TXA2) são também úteis como analitos em qualquer um dos aspectos ou concretizações aqui.

Em uma concretização preferida, a coleção de sondas molecula- res compreende uma sonda específica para cada uma de IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN gama, IP- 10, TNF-alfa, MCP-1, GLP-1 , glucagon, insulina, adiponectina, e resistina. A coleção de sondas adicionalmente compreende sondas específicas para uma ou mais de IL-15, KC1 e Ieptina em certas concretizações.

Em uma outra concretização preferida, a coleção de sondas mo- leculares compreendem sondas usando-se moléculas específicas caninas adequadas para a produção para um ensaio canino. Painel, Citoci- na/quimiocina; Analito GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN- gama, IP-10, TNF-alfa, MCP-1 , IL-15, KC. Painel, Endócrino; Analito GLP-1 , Glucagon, Insulina, Leptina. Painel; Adipocina; Analito; Adiponectina, Re- sistina. Em uma outra, a coleção de sondas moleculares compreende son- das usando-se moléculas de felino adequadas para a produção de um en- saio de felino: Painel; Citocina/quimiocina; Analito: GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-lbeta, IL-8, IL-10, IL-18, IFNgama, Fas, TNF-alfa, MCP-1, Iigante de Flt-3. Painel; Endócrino; Analito: GLP-1 , Glucagon, Insulina, Leptina. Painel: Adi- pocina; Analito: Adiponectina, Resistina. Em uma concretização, as sondas moleculares são capazes de

detectar a presença, atividade, expressão, ou similares de cada um dos ana- litos no conjunto predeterminado de analitos. De preferência o conjunto de analitos são os conjuntos de proteínas e/ou genes indicados aqui. Mais de preferência os genes são oriundos de um ser-humano, um símio, um canino ou um felino. Em concretizações preferidas, a coleção de sondas é específi- ca para a detecção da presença ou atividade de um conjunto de proteínas caninas ou felinas. Em uma concretização, a coleção de sondas moleculares é uma pluralidade de anticorpos específicos para medir ou detectar analitos de pro- teína (isto é, os produtos de expressão oriundos um conjunto de genes) de um canino. De preferência, as sondas proveem um determinação quantitati- va da quantidade de expressão de cada proteína, tal como a quantidade de cada proteína específica presente na amostra. Em certas concretizações, os resultados são mais qualitativos provendo informação no que diz respeito a quantidades relativas, por exemplo, indicando diferenças ou mudanças de amostra para amostra, ou mudanças durante um curso de tempo em amos- tras de um indivíduo. Em outras concretizações, medições análogas são ob- tidas para o conjunto de genes que correspondem às proteínas seleciona- das.

Em várias concretizações, para a coleção de sondas molecula- res descritas, cada sonda está ligada a uma matriz ou a um suporte, em que cada tal sonda ligada permanece capaz de prover uma determinação quanti- tativa da quantidade de atividade ou presença de cada um de um conjunto de analitos em uma amostra posta em contato com a matriz. O versado na técnica apreciará que sondas do tipo descrito aqui podem estar ligadas, i- mobilizadas ou suportadas em uma variedade de modo a permitir ensaios mais fáceis de serem desenvolvidos. Em tais concretizações uma coleção total de sondas poderia estar ligada a uma única matriz e distinções podem ser feitas, por exemplo, através da separação espacial de um conjunto de proteínas (ou produtos de gene expresso), por exemplo, electroforeticamen- te ou embora a detecção de sinais discretos ou individualmente detectáveis que correspodem a cada um das sondas. Em algumas concretizações, as sondas são separadamente dispostas como um conjuto ou microconjunto. O uso de conjuntos tais como "lascas" e similares é também útil aqui. Alternati- vamente, cada sonda pode estar ligada a uma matriz separada, o uso de tais sondas é também conhecido na técnica. Exemplos de matrizes às quais sondas podem estar ligadas incluem várias membranas, polímeros, supor- tes, contas, lascas, conjuntos, cavidades de ensaio e similares. Métodos de ensaios tais como ELISA e FACS podem ser usados para detectar tais son- das que estão ligadas a uma matriz. De modo ideal, tal ligação pode auxiliar no projeto dos ensaios multiplicadores em que a pluralidade de genes no conjunto de genes predeterminados podem ser analisados em um único re- cipiente de reação. Ligação das sondas moleculares a vários tipos de contas poliméricas ou de vidro podem prover um formato simples para o desenvol- vimento de um ensaio multiplicador usando-se, por exemplo, marcação dife- rencial e FACS como um método para distinguir uma sonda de uma outra. Assim, em uma concretização, a coleção de sondas moleculares é provida em que cada sonda está ligada a uma matriz separada, e cada sonda é in- dependentemente detectável uma da outra sonda na coleção. As sondas podem também estar ligadas ou covalentemente, ou através de outros mei- os, a vários componentes moleculares tais como sinais e outras moléculas que podem, por exemplo, ou ampliar ou extinguir sinais ou facilitar desenvol- vimento de ensaio, como é útil. Alternativamente, tais extintores ou aumen- tadores de sinal, e outras moléculas podem ser usados em combinação com as sondas enquanto nem fisicamente nem quimicamente ligados aos mes- mos.

As várias citocinas, quimiocinas, hormônios, e adipocinas, bem como fatores de crescimento neuronal, fatores de crescimento, e receptores solúveis são algumas vezes mencionados aqui por suas abreviações ou ou- tra referência de nomeclatura taquigráfica. Mostrada abaixo está uma lista de tais abreviações e outros nomes de referência mostrados como "Refe- rência, Sistemática (entre parêntese quando disponível), e Nome".

Citocinas IFN-alfa, Interferon alfa: IFN-gama, Interferon gama: IL- 12 (p40), Interleucina 12 p40: IL- 18, Interleucina 18: IFN-beta, Interferon beta: IFN-ômega, Interferon omêga: Linfotoxina betaR, (TNFRSF3), Linfoto- xina beta R: Linfotactina (Lptn), (XCLI), Linfotoxina: IL-6, Interleucina 6: IL-8, (CXCL8), Interleucina 8: TNF-alfa; Fator de necrose de tumor alfa: IL-4, In- terleucina 4: IL- 10, Interleucina 10: TGF-beta I, Fatorde crescimento trans- formante beta- 1: TNF-beta, Fator de necrose de tumor beta: IL-3, Interleuci- na 3: IL-5, Interleucina 5: IL-7, Interleucina 7: IL- 13, Interleucina 13: IL-15, Interleucina 15: IL-alfa, Interleucina 1 alfa :IL-I beta, Interleucina 1 beta: IL-2, Interleucina 2: IL-11, Interleucina 11: IL-12 (p70), Interleueina 12 p70: IL-16, Interleucina 16: IL-17, Interleucina 17: RANTES, (CCL5), Regulado na ativa- ção Normal T Expresso e presumidamente Secretado IL-21, Interleucina 21: IL-9, Interleucina 9 e TGF-beta RHI, Receptor de fator de crescimento beta transformante III.

Quimiocinas BLC (BCA-1); quimioatraente de B-linfócito: ENA- 78, (CXCL5); peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epitelial: Eot1 (CCLI1); Eotaxina: Eot-2; (CCL24); Eotaxina-2: MCP-2; (CCL8); Proteí- na quimiotática de monócito 2: MCP-3; (CCL7); Proteína quimiotática de monócito 3: MIF1 Fator inibitório de migração de macrógafo MIP-IaIfa1 (C- CL3), Proteína inflamatória de macrófago 1 alfa: MPIF; Fator inibitório de origem mieloide 1: MSP, Proteína de estimulação de macrógafo: GCP-2; (CXCL6); Proteína quimiotática de granulócito 2: I-309; (CCLI); Nenhum: IP- 10; (CXCLIO); Proteína induzível por interferon gama 10: LIF; Fator inibitório de leucemia: M-CSF; Fatorde estimulação de colônia de macrófago: MCP-1; (CCL2); Proteína quimiotática de monócito 1: MDC; (CCL22); quimiocina derivada por macrógafo: MIG; (CXCL9); Nenhum: ΜΙΡ-lbeta; (CCL4); Prote- ína inflamatória de macrófago 1 beta: MIP-1 delta; (CCL15); Proteína inflama- tória de macrófago 1 delta: NAP-2; Peptídeo de ativação de neutrófilo 2: PARC; quimiocina regulada por ativação e pulmonar: SDF-lalfa; fator deriva- do por célula estromal alfa: TARC; (CCLI7); quimiocina regulada por ativação e timo: BTC; Betacelulina 6Ckine: (CCL21); 6Ckine: ácido FGF; (FGF-1); Fator de crescimento de fibroblasto ácido: Fractalcina; (CX3CL1); Fractalci- na: HCC-1; (CCL14); Hemofiltrado CC Quimiocina 1: MCP-4; (CCL13); Pro- teína quimiotática de monócito 4: MIP-3beta; (CCL19); Proteína inflamatória de macrófago 3 beta: PF4; (CXCL4); Fator de plaqueta 4: RANK; (TN- FRSF11A); Ativador de receptor de NF-kapa-B: CTACK; (CCL27); quimioci- na atraente de célula T cutânea: Eot-3; (CCL26); Eotaxina-3: FGF-4; Fator de crescimento de fibroblasto-4: Folistatina; Folistatina: GRO-gama; (CX- CL3), oncogene relacionado com crescimento gama: l-TAC; (CXCL11); Quimioatraente alfa de célula T induzível por Interferon gama: sLIF-Ralfa (gp190); Fator inibitório de leucemia receptor alfa: "midkine"; "midkine": MIP- 3alfa; (CCL20); Proteína inflamatória de macrógrafo alfa 3: Pleiotrofina (PTN); Pleiptrofina: SDF-lbeta; (CXCLI 2); fator derivado por célula estromal beta: TECK; (CCL25); quimiocina expressa por timo: TGF-alfa; Fator de crescimento transformante alfa: TRANCE (RANKL); (TNFSF11); TNF- Citocina induzida por Activina relacionada ao: sVAP-1; e Proteína de adesão vascular 1.

Hormônios. Prolactina; Prolactina: IGFBP-2; proteína 2 de liga- ção de fator de crescimento de tipo insulina: Leptina/OB; Leptina; Insulina; Insulina: Resistina; Resistina: Adiponectina; Adiponectina: Glucagon; Gluca- gon: GLP-1, peptídeo 1 de tipo glucagon: e PYY; peptídeo YY:

Adiponectinas. MCP-1; Proteína quimiotática de monócito 1: Leptina; Leptina: Resistina; Resistina: Adiponectina; Adiponectina: IL-6; IL-6: TNF-alfa; TNF-alfa: e tPAI-1; inibidor de fibrinólise ativável portrombina.

Fatores de crescimento neuronal. CNTF; fator neurotrófico ciliar: GDNF; fator neurotrófico derivado por célula glial: BDNF; fator neurotrófico derivado por cérebro: NT-3; Neurotrofina 3: NT-4; Neurotrofina 4: e beta- NGF; Fatorde crescimento de beta-nervo.

Fatores de crescimento. ANG; Angiogenina: EGF; fator de cres- cimento epidérmico: FGF-7; Fator de crescimento de fibroblasto 7: FGF-9; Fator de crescimento de fibroblasto 9: GM-CSF; fator de estimulação de co- lônia de macrófago de granulócito: GRO-alfa (MGSA); (CXCLI); atividade de estimulação de crescimento de melanoma: OSM; Oncostatina M: PIGF; fator de crescimento de placenta: TGF-beta3; Fator de crescimento transforman- te: beta-3AR; Anfirregulina: FGF-6; Fator de crescimento de fibroblasto 6: G- CSF; fator de estimulação de colônia de granulócito: SCF; fator de célula- tronco: VEGF; fator de crescimento endotelial vascular: CT-1; Cardiotrofina- 1: GRO-beta; (CXCL2); oncogene relacionado ao crescimento beta: HB- EGF; Fator de crescimento de tipo EGF de ligação a heparina: HGF; fator de crescimento de hepatócito: HVEM; (TNFRSF14); mediador de entrada de vírus da herpes: MMP-10; (total), metaloproteinase de matriz 10: MMP-7 (to- tal); metaloproteinase de matriz 7: MMP-9 (total); metaloproteinase de matriz 9: TIMP-1; inibidores de tecido de metaloproteinases 1: VEGF-D (FIGF); Fa- tor de crescimento endotelial vascular D: VEGF-R2 (Flk-1/KDR); Fator de crescimento Receptor endotelial vascular 2: FGF básico (FGF-2); Fator de crescimento de fibroblasto básico: IGF-I; Fator de crescimento de insulina tipo I: IGF-II; Fator de crescimento de insulina tipo II: IGFBP-1; proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1: IGFBP-3; proteína 3 de ligação de fator de crescimento de tipo IGFBP-4; proteína de ligação de fa- tor de crescimento de tipo insulina 4: IGFBP-6; proteína 6 de ligação de fator de crescimento de tipo insulina: MMP-1 (total); metaloproteinase de matriz 1: MMP-2 (total); metaloproteinase de matriz 2: e TIMP-2; inibidores de tecido de metaloproteinases 2.

Receptores solúveis. sCD23; nenhum: Fas; Fas (CD95): IL-Ira; antagonista de receptor de interleucina 1: IL-2 sRalfa; receptor alfa solúvel de interleucina 2: TRAIL; (TNFSFIO); Iigante indutor de apoptose relacionada com TNF: uPAR; receptor de ativador de plasminogênio de tipo uroquinase: Flt-3 L; Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms: sgpl30; glicoproteína solú- vel 130: IL-I sRI; receptor I solúvel de interleucina 1: I IL-6 sR; receptor solú- vel de interleucina 6: TNF RI; Fator de necrose de tumor receptor I: TNF-RII; Fator de necrose de tumor receptor II: sVE-caderina; caderina de epitélio vascular: CCL28; CCL28 CTLA-4; molécula 4 associada a linfócito T citotóxi- co: DR6; (TNFRSF21); Receptor 6 de morte: Iigante de Fas; (TNFSF6); Ii- gante de Faz: ICAM-3 (CD50); Molécula de adesão intracelular 3: IL-2 Rga- ma; receptor gama de interleucina 2: IL-5 Ralfa (CD125); receptor alfa de interleucina 5: L-Selectina (CD62L); L-selectina: PECAM-I (CD31); molécula- 1 de adesão de célula endotelial de plaqueta: SCFR; Receptor de fator de célula-tronco: TRAIL R4; (TNFRSFI OD); Receptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF: ALCAM (CD166); Adesão de célula de Ieu- cócito ativada: CD27; (TNFRSF7); CD27 CD30; (TNFSF8); CD30 CD40; CD40: CNTF Ra; receptor de fator neurotrófico ciliar: ICAM-1 (CD54); Molé- cula de adesão intracelular 1: IGF-IR; receptor I de fator de crescimento de tipo insulina: IL-1 sRII; receptor Il solúvel em interleucina 1: IL-2 Rbeta; re- ceptor beta de interleucina 2: IL-10 Rbeta; receptor beta de interleucina 10: M-CSFR; receptor de Fator de estimulação de colônia de macrófago: PDGF Ra; receptor alfa de fator de crescimento derivado por plaqueta: e TRAIL R4; (TNFRSFIOD); receptor 4 de Iigante de indução por apoptose relacionado com TNF.

Em um outro aspecto, a invenção provê métodos de avaliação do estado de saúde de um animal por determinação da relativa atividade ou expressão de um conjunto de analitos. em geral, os métodos compreendem as etapas de

a) obtenção de uma amostra biológica a partir do animal, onde a amostra pelo menos putativamente contém um conjunto predeterminado de

analitos de interesse. O conjunto de analitos compreende pelo menos uma citocina, quimiocina, hormônio, e adipocina

b) contato da amostra com uma coleção de sondas moleculares para a determinação da atividade ou presença de cada um do conjunto pre- determinado de analitos, em que para cada analito no conjunto, a coleção de

sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da presença ou uma atividade mensurável daquele analito. Cada sonda na coleção é capaz de produzir um sinal independentemente detectá- vel quando o analito que corresponde àquela sonda está presente na amos- tra c) detecção dos sinais independentemente detectáveis produzidos depois que a amostra é posta em contato com a coleção d) correlação dos sinais detectáveis com pelo menos a atividade ou presença relativa de cada um do conjunto predeterminado de analitos na amostra, e) correlação da atividade ou presença relativa de cada um do conjunto predeterminado de analitos na amostra com parâmetros conhecidos ou determinados de estado de saúde, e f) produção de uma determinação do estado de saúde dos animais de a- cordo com as correlações produzidas na etapa e).

Em outra concretização, o conjunto de analitos compreende e conjunto de genes e o método compreende as etapas de

a) obtenção de uma amostra biológica a partir do animal, onde a amostra pelo menos putativamente contém um conjunto predeterminado de genes de interese ou os produtos de expressão daqueles genes. O conjunto de genes compreende pelo menos um gene que cada um que codifica uma citocina, uma quimiocina, um hormônio, e uma adipocina

b) contato da amostra com uma coleção de sondas moleculares para a determinação da atividade ou expressão de cada um do conjunto predeterminado de genes, em que para cada gene no conjunto, a coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da atividade ou expressão daquele gene. Cada sonda na coleção é capaz de produzir um sinal independentemente detectável quando o gene ou produto de expansão do gene que corresponde àquela sonda está pre- sente na amostra

c) detecção dos sinais independentemente detectáveis produzi-

dos depois que a amostra é posta em contato com a coleção

d) correlação dos sinais detectáveis com pelo menos a expres- são ou atividade relativa de cada um do conjunto predeterminado de genes na amostra,

e) correlação da expressão ou atividade relativa de cada um do

conjunto predeterminado de genes na amostra com parâmetros conhecidos ou determinados de estado de saúde, e

f) produção de uma determinação do estado de saúde dos ani- mais de acordo com as correlações produzidas na etapa e).

Os métodos têm muitos usos reais e potencial. A tabela 1 mostra

uma lista parcial de alguns tais usos.

Tabela 1

condição fisiológica a ser avaliada estado atual do diagnóstico da técnica parâmetros a serem medi- dos com os métodos provi- dos resistência à insulina teste de tolerância à glico- se diminuição em adiponectina; aumento em insulina, IL-6, e TNF-alfa; alterações em Ieptina e resistina predisposição à dia- betes de tipo Il teste de tolerância à glico- se para estabelecer resis- tência à insulina diminuição em adiponectina; aumento em insulina, IL-6 e TNF-alfa (por exemplo, para documentar inflamação de baixo grau); alterações em Ieptina e resistina intervenção de dieta, por exemplo, restrição calórica Nenhuma análise de mudanças em moléculas de citoci- na/quimiocina/endócrina podem ser usadas para mo- Iecularmente explicar fisio- Iogia subjacente e, por e- xemplo, desenvolver estra- tégias aperfeiçoadas para perda de peso inflamação estabelecer perfis melhora- dos tanto de citocinas pró- quanto anti-inflamatórias (por exemplo, regulação para cima) homeostase melhorada em sistema leva a manipulação melhor dos desafios imunes ou inflamação alergias desenvolver marcador subs- tituto com base nas citoci- nas de auxiliar T 1 e auxiliar T 2 para prever o desenvol- vimento de alergias e/ou eficácia de um intervenção de dieta envelhecimento desenvolver um marcardor substituto para o evelheci- mento para regimes nutrico- nais avaliados que retardam ou previnem o envelheci- mento ou promovem longe- vidade

Em certas concretizações, o conjunto de analitos adicionalmente

compreende um ou mais de um fator de crescimento neuronal, um fator de crescimento outros que não um fator de crescimento neuronal, ou um recep- tor solúvel, além da citocina, quimiocina, hormônio, e adipocina discutido aqui. Onde os analitos são genes, o conjunto compreende os genes corres- pondentes, de acordo com as limitações expostas acima. De preferência, as sondas detectáveis são específicas para a detecção da presença ou ativida- de de cada uma das proteínas (ou produto de gene codificado de cada um do conjunto de genes), ou a atividade ou expressão de cada uma das genes.

As sondas detectáveis compreendem anticorpos, fragmentos de anticorpo, ligantes, receptores, ou proteínas de ligação, ácidos nucleicos, por exemplo, DNA ou RNA. De preferência, em que o conjunto compreende as proteínas, a coleção de sondas compreende anticorpos para cada uma das proteínas.

Em uma concretização dos métodos como discutidos aqui para as coleções de sondas, o conjunto de proteínas ou genes compreende uma ou mais genes que codificam, ou proteínas que são as citocinas interferon alfa, interferon gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 4, interleucina 10, fator de cres- cimento transformante beta-1, fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, interleucina 5, interleucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 2, interleucina 11, interleucina 12 p70, interleucina 16, interleucina 17, Regulado na ativação, Normal T Expresso e presumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21, interleucina 9, ou receptor de fator de crescimento beta transformante III.

Em várias concretizações, o conjunto predeterminado de anali- tos pode, alternativamente ou além do exposto acima, incluir uma ou mais proteínas que são ou genes que codificam a quimiocinas quimioatraente de B-linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epitelial, eotaxina, eotaxina-2, proteína quimiotática de monócito 2, proteína quimio- tática de monócito 3, fator inibitório de migração de macrógafo, proteína in- flamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1, proteína de estimulação de macrógafo, proteína quimiotática de granulócito 2, prote- ína induzível por interferon gama 10, fator inibitório de leucemia, fator de estimulação de colônia de macrófago, proteína quimiotática de monócito 1, quimiocina derivada por macrófago, proteína inflamatória de macrófago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e de ativação, fator derivado de célula estromal alfa, quimiocina regulada por timo ou por ativação, betacelu- in, 6 Cquina, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimioci- na 1 hemofiltrado CC, proteína quimiotática de monócito 4, proteína infla- matória de macrófago 3 beta, fator de piaqueta 4, ativador de receptor de NF-kapa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionado ao crescimen- to gama, quimioatraente alfa de célula T induzível por interferon gama, fator inibitório de leucemia receptor alfa, "midkine", proteínainflamatória de macró- fago 3 alfa, pleiptropin, fator derivado de célula estromal beta, quimiocina expressa com timo, fator de crescimento transformante alfa, citocina induzi- da por activina relacionada a TNF, proteína de adesão vascular 1, CXCL9, ou CCLI.

Em ainda outras concretizações, o conjunto predeterminado de genes ou proteínas inclui um ou mais genes que codificam ou proteínas que são os hormônios prolactina, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 2, leptina, insulina, resistina, adiponectina, glucagon, peptídeo relacionado com glucagon 1, ou PYY.

Em uma concretização, o conjunto predeterminado de genes ou proteínas pode também incluir um ou mais genes que codificam ou proteínas que são a proteína quimiotática de monócito de adipocinas 1, leptina, resis- tina, adiponectina, IL- 6, TNF-alfa, ou inibidor de fibrinólise ativável por trom- bina.

Em outras concretizações, o conjunto predeterminado de genes ou proteínas adicionalmente variavelmente compreende um ou mais genes que codificam um ou mais das seguintes, ou as próprias proteínas os fatores de crescimento neuronal fator neutrófico ciliar, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neutrófico derivado de cérebro, neurotrofina 3, neu- rotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta, os fatores de crescimento angiogenina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibro- blasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de estimulação de colô- nia de macrófago de granulócito, atividade de estimulação de crescimento de melanoma, oncostatina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento transformante beta-3, amfirregulin fator de crescimento 6 de fibroblasto de anfirregulina, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de célula-tronco, fator de crescimento endotelial vascular, cardiotrofina- 1, oncogene relacionado a crescimento beta, fator de crescimento de tipo EGF de ligação de heparina, fator de crescimento de hepatócito, mediador de entrada de vírus da herpes, metaloproteinase de matriz 10, metaloprotei- nase de matriz 7, metaloproteinase de matriz 9, inibidores de tecido de meta- Ioproteinases 1, fator de crescimento endotelial vascular D, receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento de tipo insulina I, fator de crescimento de tipo insulina II, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 3, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 4, proteína de ligação de fa- tor de crescimento de tipo insulina 6, metaloproteinase de matriz 1, metalo- proteinase de matriz 2, ou inibidor de tecido de metaloproteinases 2, ou os receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonista de receptor de interleu- cina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigante indutor de apoptose relacionada com TNF, receptor ativador de plaminogênio de tipo uroquinase, Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms, glicoproteína solúvel 130, recep- tor I solúvel em interleucina 1, receptor solúvel em interleucina 6, receptor de fator de necrose de tumor I, receptor Il de fator de necrose de tumor, caderi- na de epitélio vascular, CCL28, molécula 4 associada ao linfócito T citotóxi- ca, receptor 6 de morte, Iigante de Fas, molécula de adesão intracelular 3, receptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L-selectina, molécula 1 de adesão de célula endotelial de plaqueta, Receptor de fator de célula-tronco, Receptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF, Adesão de célula de leucócito ativada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, Molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, receptor Il solúvel em interleucina 1, recep- tor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de Fator de estimulação de colônia de macrófago, receptor alfa de fator de cresci- mento derivado por plaqueta, ou receptor 4 de Iigante de indusão por apopo- tose relacionado com TNF. Em uma concretização preferida do método, o conjunto prede- terminado de analitos compreende um ou mais genes que codificam cada um de IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL- 18, IFN gama, IP-10, TNF-alfa, MCP-I , GLP-1, glucagon, insulina, adiponectina, e resistina. Em uma outra concretização, o conjunto de analitos compreende as próprias proteínas ex- postas acima. Em várias concretizações, o animal deve ser-humano, murino, símio, canino, ou felino. Os conjunto de analitos predeterminados adicional- mente compreende um ou mais genes que codificam IL-15, KC, ou leptina, ou as próprias proteínas, em certas concretizações. Em uma concretização preferida do método, os analitos são ori-

undos de um canino e as sondas são anticorpos específicos para as proteí- nas ou produto de genes dos genes que os codificam. Em uma concretiza- ção, a coleção de sondas moleculares permite uma determinação quantitati- va da quantidade da proteína, ou a expressão de cada gene. O método pode ser praticado com cada sonda ligada a uma ma-

triz, em que cada tal sonda ligada permanece competente para prover uma determinação quantitativa de expressão de um gene que corresponde àque- la sonda, em uma amostra posta em contato com a matriz.

Em algumas concretizações, o método adicionalmente compre- ende uma etapa de contato da amostra e a coleção de sondas moleculares com um conjunto de anticorpos secundários compreendendo uma ou mais anticorpos que podem, por exemplo, detectar a presença de uma porção ou tipo particular de um anticorpo, detectar ligação especfica entre um produto de gene de cada gene no conjunto, e uma sonda correspondente na cole- ção. O uso de anticorpos secundários para tal detecção é entendido por a- queles de habilidade no desenvolvimento de ensaios de anticorpo, tal como certos métodos ELISA e várias técnicas assim chamadas de "sanduíche". Ou a sonda ou um segundo anticorpo pode ser adicionalmente ligado a uma geração de sinal ou sistema de ampliação, tal como uma enzima. Os métodos em certas concretizações envolve o uso de uma

coleção de sondas moleculares em que cada sonda está ligada a uma matriz separada, tal como uma conta ou um material de suporte polimérico. Os métodos envolve o uso de uma amostra biológica, que é de preferência uma amostra que é provável de conter os genes no conjunto predeterminado, ou é provável de conter os seus produtos de expressão, é fácil e relativamente indolor de se obter, é abundante ou cuja ausência pro- duzirá o animal não-nocivo, e é reproduzível.

Várias tais amostras biológicas ocorrerão por aqueles de habili- dade, exemplos inclui amostras de vários tecidos e fluidos. Exemplos inclu- em sangue, soro, plasma, urina, extratos de tecido, fluido espinhal cerebral (CFS), fluido sinovial e células de cultura de tecido de extratos celulares, extratos, fluidos de sobrenadantes, e meio de cultura gasto são também Ci- teis. Amostras preferidas são sangue, soro, e plasma. Tamanho de amostra não é crística, amostras podem ser de qualquer tamanho que é úteis, práti- cas e analiticamente significativas. Amostras de menos do que 1 ml são pre- feridas. Amostras tipicamente são menos do que 100 μΙ, por exemplo, 75 ou 50 μΙ. Amostras menores são também úteis aqui. Amostra que são suficien- temente pequenas para permitir ensaios no equipamento de laboratório pa- drão, são naturalmente preferidos, como são ensaios miniaturizados.

Em outro aspecto, a invenção provê métodos de formulação de um regime nutricional para o melhoramento da saúde de um animal. Os mé- todos compreendem

a) seleção de um conjunto predeterminado de analitos de intere- se em um animal em que a atividade dos analitos, ou sua presença pode estar correlacionado ao estado de saúde do animal, e com um regime nutri- cional do animal, o conjunto compreendendo pelo menos uma proteína ou

um gene que codifica cada uma de uma citocina, uma quimiocina, um hor- mônio, e um adipocina,

b) obtenção de uma amostra biológica a partir do animal, a dita amostra putativamente contendo o conjunto predeterminado de analitos, ou os produtos de expressão dos mesmos, a dita amostra indicativa de um re-

gime nutricional atual do animal,

c) determinação de uma medição de linha base por contato da amostra com uma coleção de sondas moleculares para a determinação da atividade ou presença de cada um do conjunto predeterminado de analitos, ou seu produto de gene, em que para cada analito no conjunto, a coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da atividade ou presença daquele analito, cada sonda capaz de produzir um sinal independentemente detectável quando o analito, ou o pro- duto de gene do analito que corresponde àquela sonda está presente na amostra,

d) detecção dos sinais independentemente detectáveis produzi- dos depois que a amostra é posta em contato com a coleção,

e) correlação dos sinais detectáveis com a presença ou ativida-

de relativa de cada um do conjunto predeterminado de analitos, ou seu pro- duto de gene, na amostra;

f) correlação da expressão ou atividade relativa de cada um do conjunto predeterminado de genes na amostra com parâmetros conhecidos

do estado de saúde;

g) produção de uma determinação do estado de saúde do ani- mal no regime nutricional corrente de acordo com o mesmo;

h) formulação de um ou mais suplementos ou regimes nutrico- nais de teste para a testagem no animal por ajuste de um ou mais da fonte

ou teor de macronutriente, a fonte ou teor de macronutriente, componentes de dieta suplementar, ou teor calórico da dieta quando comparado com re- gime nutricional corrente do animal,

i) provisão de um ou mais suplementos ou regimes nutriconais de teste, ou sua combinação, ao animal em uma quantidade e por um tempo

eficaz para mudar a atividade, presença ou expressão de um ou mais de o conjunto predeterminado de analitos,

j) para cada regime ou suplemento nutricional de teste, ou sua combinação, repetição das etapas b) até g) com uma nova amostra oriunda do animal para determinar se o regime ou suplemento nutricional de teste,

ou sua combinação melhorou o estado de saúde do animal, e

k) seleção de regime ou suplemento nutricional formulado, ou sua combinação, que melhora o estado de saúde do animal. O técnico versado apreciará que a etapa j) refere-se à repetição das etapas b) até g), no entanto, essas etapas são repetidas com uma nova amostra tirada do animal depois da etapa j), isto é, depois que o animal re- cebeu o novo regime nutricional.

Como com os outros métodos e composições providos aqui, a

seleção dos analitos predeterminados é essencialmente um processo racio- nal de seleção daqueles analitos, cuja presença, atividade, ou expressão pode ser correlacionada com tanto estado de saúde quanto um regime nutri- cional, e que proverão resultados úteis. Seleção de analitos que têm correla- ção zero com estado de saúde e correlação zero de qualquer regime nutri- cional deve ser evitado, embora tais analitos possam ser incluídos como controles ou analitos de teste, ou similares.

Os métodos descritos aqui são úteis para a formulação de qual- quer regime nutricional com qualquer animal como descrito aqui. Em várias concretizações preferidas, os métodos são totalmente úteis em situações em que o animal é obeso, tem diabetes, tem sintomas de estar predisposto a diabetes, tem um nível indesejável de inflamação, tem um nível indesejável de resistência à insulina, tem síndrome metabólica, aterosclerose prematura, metabolismo de glicose anormal, ou metabolismo de gordura anormal. Mui- tas tais condições são conhecidas na técnica e podem ser livremente ou mais estritamente associadas a regimes nutricionais, particularmente regi- mes nutricionais a longo prazo. Em uma concretização, o regime nutricional formulado, suplemento, ou sua combinação melhora a função imune, reduz inflamação, reduz resistência à insulina, ou a sua combinação no animal. Em várias concretizações, o regime nutricional formulado, su-

plemento, ou sua combinação tem um ou mais dos seguintes efeitos (1) re- duz inflamação no animal, e um ou mais de aumentos de citocinas inflamató- rias, reduz citocinas pró-inflamatórias, ou diminui mediadores de citocina de inflamação, (2) reduz resistência à insulina no animal e um ou mais de au- mentos de adiponectina, diminui resistina, ou diminui leptina, ou (3) reduz um ou mais de dispidemia, inflamação, hipertensão, reatividade vascular aumentada, ou obesidade visceral, ou melhora de fibrinólise. Em concretiza- ções específicas, o conjunto de analitos compreende cada um e qualquer um dos analitos descritos aqui para outros aspectos da invenção.

Em uma concretização preferida, o conjunto predeterminado de analitos compreende uma ou mais genes que codificam cada um de IL-2, IL- 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL- 18, IFN-gama, IP-10, TNF-alfa, MCP-1 , GLP- I, glucagon, insulina, adiponectina, e resistina, ou as proteínas corresponden- tes. Adicionalmente, um ou mais genes que codificam IL- 15, KC, ou Ieptina podem ser incluídos, ou as proteínas correspondentes.

Em certas concretizações, o animal é um ser-humano, camun- dongo, símio, canino, ou felino. Em uma concretização preferida, os analitos são proteínas oriundas de um canino e as sondas moleculares são anticor- pos que permitem uma determinação quantitativa da quantidade de tais pro- teínas. Em algumas concretizações, cada sonda está ligada a uma matriz e permanece capaz de prover uma determinação quantitativa da quantidade do analito que corresponde àquela sonda quando uma amostra contata a matriz.

Os métodos podem também compreender a outra etapa de con- tato da amostra e a coleção de sondas moleculares com um conjunto de sondas secundárias, por exemplo, anticorpos secundários compreendendo um ou mais anticorpos que aumentam especificidade ou aumentam sinal através da ampliação. Em uma concretização, cada sonda está ligada a uma matriz separada.

Como descrita aqui, a amostra pode ser qualquer amostra bioló- gica tal como tecido ou fluido do corpo. Exemplos incluem sangue, soro, plasma, urina, extratos de teci-

do, fluido espinhal cerebral (CFS)1 fluido sinovial, e extratos celulares de amostras ex vivo tais como células ou tecidos estavelmente ou transitoria- mente cultivados, ou fluido de sobrendante, meio de cultura gasto, seus e- xudatos, ou similares, são também úteis aqui. Amostras compreendendo ou consistindo em soro ou plasma são preferidas para o uso nos métodos.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê kits adequados para a determinação de em uma amostra única, a atividade, a presença, ou a expressão de cada conjunto predeterminado de analitos. Os kits compre- endem em recipientes separados em um única embalagem ou em recipien- tes separados em uma embalagem virtual, quando apropriado para o com- ponente de kit, um ensaio multiplicador compreendendo uma coleção de sondas detectáveis moleculares como definidas aqui e um ou mais de (1) instruções para como usar o ensaio multiplicador para determinar a ativida- de, presença, ou expressão de cada conjunto predeterminado de analitos, (2) instrução para como avaliar o estado de saúde de um animal usando-se o ensaio multiplicador, (3) instruções para a formulação de um regime nutri- cional para o melhoramento da saúde de um animal usando-se o ensaio multiplicador, e (4) uma ou mais ingredientes adequados para o consumo por um animal. Em certas concretizações, o kit compreende o ensaio multi- plicador e uma composição alimentícia tais como ração nutricionalmente completa para animais de estimação ou suplementos nutricionais tais como vitaminas e minerais que são úteis para a formulação de um regime nutricio- nal para o melhoramento da saúde de um animal.

Quando o kit compreende uma embalagem virtual, o kit é limita- do a instruções em um ambiente virtual em combinação com um ou mais componentes de kit físico. O kit pode conter itens adicionais tais como um dispositivo para a misturação de reagentes úteis com o ensaio multiplicador ou um dispositivo para suportar e/ou manipular o ensaio multiplicador.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um meio para a comunicação de informação junto ao ou instruções para o uso do ensaio multiplicador para uma ou mais de (1) determinação de em uma amostra única, a atividade, a presença, ou a expressão de cada conjunto predetermi- nado de analitos, (2) avaliação do estado de saúde de um animal, ou (3) formulação de um regime nutricional para o melhoramento da saúde de um animal. O meio compreende um documento, meio de armazenagem digital, meio de amarzenagem ótica, apresentação de áudio, ou exibição visual con- tendo a informação ou instruções. Em certas concretizações, o meio de co- municação é um web site exibido, quiosque de exibição visual, folheto, rótulo no produto, inserto na embalagem, publicidade, nota fornecida à imprensa, anúncio público, fita de áudio, fita de vídeo, DVD, CD-ROM, chip legível pelo computador, cartão legível pelo computador, disco legível pelo computador, memória no computador, ou sua combinação contendo tal informação ou instruções. Informação útil inclui um ou mais de (1) métodos e técnicas para a manipulação de amostras biológicas para o uso com o ensaio multiplicador (2) informação de contato para indivíduo usar se eles tiverem uma pergunta sobre o ensaio multiplicador e seu uso.

A invenção não é limitada à metodologia, a protocolos e a rea- gentes particulares descritos aqui uma vez que eles podem variar. Além dis- so, a terminologia usada aqui é para a finalidade de descrição das concreti- zações particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção. Como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singular "um," "uma," "o" e "a" incluem referência plural a não ser que o contexto cla- ramente mostre o contrário, por exemplo, referência a "uma citocina" inclui uma pluralidade de tais citocinas. Similarmente, as palavras "compreendem", "compreende", e "compreendendo" devem ser intermpretadas inclusivamen- te ao invés de exclusivamente.

A não ser que de outra maneira definido, todos os termos técni- cos e científicos e quaisquer acrossemias usados têm os mesmos significa- dos como comumente entendido por aquele versado na técnica e no campo da invenção. Embora quaisquer composições, métodos, artigos de fabrica- ção ou outros meios ou materiais similares ou equivalente àqueles descritos aqui possam ser usados na prática da presente invenção, as composições, os métodos, os artigos de fabricação, ou outros meios ou materiais preferi- dos são descritos aqui. Exemplos

A invenção pode adicionalmente ser ilustrada pelos seguintes exemplos, embora seja entendido que esses exemplos estejam incluídos meramente para a finalidade de ilustração e não se destinem a limitar o es- copo da invenção a não ser que de outra maneira especificamente indicada. Exemplo 1

Estudo com camundongo com Regime de Dieta Modificado compreendendo óleo de peixe, e Vitamina Ε. O objetivo da experiência era identificar as trajetórias moleculares influenciadas por dieta modificada e mecanismos de ação entendidos com relação a período de vida aumentado. Design Experimental: Grupo I: Camundongos alimentados de dieta Modifica- da a partir de 10 - 16 meses [n=19], Grupo II: camundongos alimentados de dieta de Controle a partir de 10 - 16 meses [n=19], Grupo III: Camundongos alimentados de dieta Modificada a partir de 17 - 23 meses [n=7], e Grupo IV: Camundongos alimentados de dieta de Controle a partir de 17 - 23 meses [n=9]. Experimento: uso de método multiplex para medir níveis de 27 proteí- nas (MIP-1 a, GM-CSF1 MCP-1, KC1 RANTES, IFN-gama, IL-1 beta, IL-lalfa, G-CSF, IP- 10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNF-alfa, IL-9, IL- 13, IL-15, IL- 17, Insulina, Leptina, tPAI-1, Resistina, e Adiponectina) usando-se medições de amostras de 75 μΙ plasma. Medições multiplicadoras tiradas com painel de sondas que correspondem as 27 proteínas selecionadas, u- sando-se dispositivo Luminex. Portas de tempo: camundongos Machos C57BI/6 foram usados. Camundongos começaram nos regimes de dieta ou a 10 ou 17 meses de idade. Camundogos foram alimentados ou por dieta modificada ("teste") ou por dieta de controle por um período de 6 meses - a partir de ou 10 a 16 meses de idade ("Y", camundongos jovens, Grupos I e II), ou a partir de 17 a 23 meses de idade ("O", camundongos velhos, Grupos Ille IV). Amostras de sangue foram obtidas a partir de camundongos subme- tidos à eutanasia e os órgãos foram congelados rapidamente para gerar um banco de tecido. As bioamostras foram analisadas quanto aos 27 analitos de proteína. Os resultados são mostrados nas Tabela 2. Tabela 2A - Citocinas

« Identificação de amostra (idade - meses) MIP-Ia pg/ml 83 GM-CSF pg/ml 37 MCP-1 pg/ml 18 KC pg/rnl 35 RANTES pg/ml 8 IFN-y pg/ml 12 IL-ip pg/ml <3 C2-12 10 147 67 40 32 13 14 3 C3-12 10 99 7 29 24 16 32 11 C4-12 10 64 35 23 31 12 6 4 C5-12 10 632 216 47 77 40 8 14 C6-12 10 110 69 9 80 38 <3 <3 C7-12 10 4 13 26 34 26 <3 13 C8-12 10 94 25 25 134 23 <3 <3 C9-12 10 88 48 19 21 30 2,187 <3 C10- 12 Cl 1-12 10 407 151 21 33 30 <3 <3 10 679 117 29 128 6 51 16 C12-12 10 105 25 13 18 34 <3 <3 C-13 10 125 31 21 8 48 <3 <3 C14-12 10 105 <5 9 95 26 <3 <3 C15-12 10 338 90 18 27 21 <3 5 C16-12 10 99 33 <6 107 13 <3 <3 C17-12 10 83 45 16 51 31 <3 <3 C18-12 10 210 110 29 419 25 <3 5 C19-12 10 176 47 13 59 17 <3 <3 C20-12 10 4,861 52 26 16 20 12 7 TI-12 10 4 23 <6 12 14 <3 <3 T2-12 10 77 101 <6 27 17 <3 <3 T3-12 10 241 77 24 45 38 13 <3 T4-12 10 99 65 162 71 43 <3 6 T5-12 10 115 52 11 40 20 <3 <3 T6-12 10 105 71 19 30 36 <3 <3 T7-12 10 120 156 32 79 52 <3 <3 T8-12 10 94 <5 11 5 34 4 <3 T9-12 10 210 187 25 67 50 <3 10 T10-12 10 147 180 89 59 42 9 83 Tl 1-12 10 414 123 24 70 25 5 8 T12-12 10 70 38 6 30 10 <3 <3 T13-12 10 41 63 15 <3 43 <3 <3 T14-12 10 70 <5 13 20 4 5 <3 T15-12 10 267 72 90 47 25 <3 14 T16-12 10 88 63 15 26 22 <3 <3 T17-12 10 41 35 <6 94 18 <3 <3 Τ19-12 10 180 34 23 59 31 <3 <3 Τ20-12 10 120 52 34 63 18 <3 5 TI-12 20 <3 <5 <6 17 <3 <3 <3 Τ3-12 20 301 55 34 20 21 4 9 T5-12 20 650 107 49 57 14 41 83 T6-12 20 160 15 18 29 9 35 <3 T7-12 20 <3 <5 15 <3 11 <3 3 T8-12 20 228 76 51 19 20 229 19 T12-12 20 192 57 30 110 20 4 5 T16-12 20 1,500 262 102 213 17 144 44 T17-12 20 312 103 1,562 74 452 51 1,175 CI-12 20 419 69 15 40 14 47 <3 C2-12 20 286 59 56 33 24 87 25 C3-12 20 147 88 304 64 124 54 423 C5-12 20 365 <5 1,426 9 645 4 444 C6-12 20 88 48 44 27 13 <3 11 C9-12 20 389 65 461 110 64 31 614 C10-12 20 143 122 41 39 18 <3 3

Tabela 2 - Continuação

Identificação de amostra (idade - meses) IL-Ia pg/ml 20 G-CSF pg/ml 36 IP-10 pg/ml 35 IL-2 pg/ml 3 IL-4 pg/ml <3 IL-5 pg/ ml 3 IL-6 pg/ml <3 C1-12 10 20 36 35 3 <3 3 <3 C2-12 10 11 26 34 <3 <3 7 7 C3-12 10 17 105 371 <3 <3 8 6 C4-12 10 33 136 64 <3 <3 8 10 C5-12 10 51 274 86 21 4 30 35 C6-12 10 24 102 71 9 <3 28 2 C7-12 10 10 36 45 42 <3 11 7 C8-12 10 81 463 80 <3 <3 17 122 C9-12 10 26 87 93 <3 <3 5 7 C10-12 C11-12 10 10 16 22 168 93 74 117 4 <3 7 <3 9 7 5 6 C12-12 10 14 65 29 <3 <3 15 5 C-13 10 37 80 44 <3 <3 26 7 C14-12 10 20 141 30 <3 <3 6 18 C15-12 10 21 83 38 4 <3 U 5 C16-12 10 23 76 56 <3 <3 5 3 C17-12 10 22 100 46 19 <3 29 8 C18-12 10 241 2,328 42 10 <3 22 317 C19-12 10 20 42 32 4 <3 8 <3 C20-12 10 9 24 26 5 <3 7 6 ΤΙ-12 10 8 57 6 4 <3 4 <3 Τ2-12 10 14 202 46 6 <3 8 <3 Τ3-12 10 34 160 73 3 <3 31 8 Τ4-12 10 31 193 712 <3 <3 53 3 Τ5-12 10 12 30 36 7 <3 13 <3 Τ6-12 10 21 92 53 5 <3 10 <3 Τ7-12 10 33 246 104 28 <3 14 <3 Τ8-12 10 18 83 57 <3 <3 1,09 2 <3 Τ9-12 10 39 224 93 39 <3 32 3 Τ10-12 10 38 259 57 10 <3 65 75 ΤΙΙ-12 10 25 218 41 13 <3 19 <3 Τ12-12 10 11 53 23 <3 <3 14 5 Τ13-12 10 19 93 60 <3 <3 13 <3 Τ14-12 10 19 105 32 <3 <3 4 <3 Τ15-12 10 19 62 47 8 <3 9 4 Τ16-12 10 35 56 35 6 <3 10 <3 Τ17-12 10 15 70 38 <3 <3 6 <3 Τ19-12 10 38 87 47 5 <3 8 <3 Τ20-12 10 68 141 44 4 <3 8 26 ΤΙ-12 20 190 171 <6 <3 <3 8 5 Τ3-12 20 186 879 42 7 <3 8 131 Τ5-12 20 42 298 29 11 <3 16 13 Τ6-12 20 35 102 16 <3 <3 8 <3 Τ7-12 20 28 85 6 <3 <3 6 <3 Τ8-12 20 99 550 26 3 <3 16 47 Τ12-12 20 63 112 9 4 <3 12 24 Τ16-12 20 63 115 38 68 <3 25 18 Τ17-12 20 79 1,818 88 <3 <3 273 1,528 CI-12 20 90 698 36 5 <3 10 365 C2-12 20 150 629 39 10 <3 10 44 C3-12 20 40 191 433 <3 <3 175 761 C5-12 20 78 396 28 <3 <3 122 35 C6-12 20 83 183 42 <3 <3 12 <3 C9-12 20 40 527 104 5 <3 83 143 C10-12 20 181 199 15 17 <3 24 13

Identificação de amostra IL-7 IL-10 IL-12 TNFa IL-9 IL-13 IL-15 IL-17 (idade - meses) pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml pg/rnl pg/ml pg/ml pg/ml C1-12 10 9 <10 <4 8 * 6 <9 9 C2-12 10 80 <10 77 15 * 9 11 27 C3-12 10 <4 <10 87 9 * <5 11 13 C4-12 10 6 <10 <4 7 * 20 18 11 C5-12 10 4 <10 232 13 21 56 17 C6-12 10 <4 <10 52 5 * 13 <9 11 C7-12 10 15 <10 71 6 * 21 <9 30 C8-12 10 <4 <10 32 16 ★ 12 220 10 C9-12 10 55 72 238 15 * 12 17 57 C10-12 10 <4 <10 146 4 20 22 15 C11-12 10 <4 <10 32 <3 * 13 13 10 C12-12 10 <4 <10 59 5 <11 9 <9 13 C-13 10 <4 <10 55 5 * <5 21 34 C14-12 10 <4 <10 228 8 <11 22 <9 7 C15-12 10 9 <10 170 6 <11 25 61 7 C16-12 10 <4 <10 69 <3 * 24 <9 6 C17-12 10 <4 <10 170 5 31 19 26 19 C18-12 10 9 <10 148 18 * 31 66 20 C19-12 10 <4 <10 54 4 <11 20 <9 5 C20-12 10 8 <10 208 8 <11 20 124 11 TI-12 10 <4 <10 47 3 * 8 <9 <3 T2-12 10 <4 <10 35 5 <11 7 <9 7 T3-12 10 <4 <10 141 7 <11 20 <9 13 T4-12 10 <4 20 564 296 <11 23 10 19 T5-12 10 <4 <10 25 5 * 5 <9 7 T6-12 10 <4 <10 70 4 * 23 16 4 T7-12 10 5 31 285 10 14 24 28 21 T8-12 10 6 <10 <4 4 * <5 13 8 T9-12 10 <4 <10 363 9 20 20 13 T10-12 10 <4 12 369 60 * 10 <9 67 T11-12 10 <4 <10 69 20 26 131 8 T12-12 10 <4 <10 107 <3 * 20 <9 5 T13-12 10 <4 <10 54 9 * 11 14 17 T14-12 10 <4 <10 38 3 * 13 <9 6 T15-12 10 <4 <10 75 27 14 18 10 9 T16-12 10 <4 <10 68 6 <11 22 <9 6 T17-12 10 <4 <10 <4 8 * 28 <9 9 T19-12 10 <4 <10 38 6 19 24 <9 8 T20-12 10 <4 <10 52 14 <11 24 29 25 T1-12 20 <4 <10 22 9 <11 <5 <9 6 T3-12 20 <4 20 105 20 φ 28 16 10 T5-12 20 <4 <10 128 7 103 39 45 14 T6-12 20 6 <10 12 5 <5 29 4 T7-12 20 <4 <10 35 4 ★ 13 <9 6 T8-12 20 7 43 190 15 * 24 <9 61 T12-12 20 <4 <10 85 11 * 13 39 8 T16-12 20 <4 <10 135 44 658 31 21 34 T17-12 20 5 261 2,543 1,233 * 35 14 1,126 C1-12 20 <4 15 153 11 169 16 51 128 C2-12 20 10 48 175 23 187 <5 20 43 C3-12 20 274 29 999 111 * <5 449 276 C5-12 20 11 92 2,628 > 10,000 <11 <5 32 841 C6-12 20 200 <10 103 8 <11 16 160 15 C9-12 20 <4 33 208 91 * 11 27 183 C10-12 20 <4 <10 141 7 ★ 12 56 11

Tabela 2B: Adipocinas

Identificação de amostra Insulina Leptina tPAI-1 Resistina C1-12 10 meses 840 6,229 1,486 3,334 C2-12 10 meses 906 9,992 836 807 C3-12 10 meses 728 11,529 732 727 C4-12 10 meses 474 12,431 398 1,360 C5-12 10 meses 618 4,611 2,753 2,127 C6-12 10 meses 1,361 9,748 1,609 955 C7-12 10 meses 939 13,068 653 978 C8-12 10 meses 462 6,728 1,794 484 C9-12 10 meses 599 14,251 2,464 999 C10-12 10 meses 971 13,112 1,452 1,107 C11-12 10 meses 515 8,270 216 582 C12-12 10 meses 660 9,170 2,075 815 C-13 10 meses 564 13,499 2,378 1,035 C14-12 10 meses 1,213 11,812 1,954 736 C15-12 10 meses 1,116 6,027 503 1,149 C16-12 10 meses 632 6,772 2,289 680 C17-12 10 meses 574 11,722 2,927 1,565 C18-12 10 meses 316 813 3,880 714 C19-12 10 meses 686 2,170 1,244 266 C20-12 10 meses 761 6,536 706 668 T1-12 10 meses 1,158. 4,674 1,047 498 T2-12 10 meses 836 5,872 743 538 T3-12 10 meses 1,226 3,919 1,170 690 T4-12 10 meses 728 6,397 2,342 349 T5-12 10 meses 840 3,402 843 830 T6-12 10 meses 733 15,217 2,002 1,057 T7-12 10 meses 1,417 12,485 1,521 1,261 T8-12 10 meses 896 8,986 2,321 683 T9-12 10 meses 843 6,250 1,758 313 T10-12 10 meses 298 5,421 1,458 763 T11-12 10 meses 916 7,344 329 330 T12-12 10 meses 449 3,687 1,702 123 T13-12 10 meses 776 6,292 2,266 1,599 Τ14-12 10 meses 430 6,428 1,894 970 Τ15-12 10 meses 574 2,455 938 405 Τ16-12 10 meses 1,085 2,852 478 351 Τ17-12 10 meses 909 6,972 1,771 259 Τ19-12 10 meses 646 3,716 1,229 430 Τ20-12 10 meses 307 2,017 <12 300 T1-12 20 meses 847 4,785 1,839 315 T3-12 20 meses 492 135 2,457 613 T5-12 20 meses 449 2,736 369 425 T6-12 20 meses 728 2,177 216 218 T7-12 20 meses 564 1,738 940 343 T8-12 20 meses 278 67 2,065 613 T12-12 20 meses 443 1,494 249 340 T16-12 20 meses 402 1,013 778 432 T17-12 20 meses 456 2,143 1,206 1,043 CI-12 20 meses 258 1,688 1,049 513 C2-12 20 meses 258 2,663 2,400 521 C3-12 20 meses 341 9,421 1,419 624 C5-12 20 meses 803 4,347 1,293 516 C6-12 20 meses 919 4,431 1,835 335 C9-12 20 meses 521 5,676 1,517 340 C10-12 20 meses 521 291 1,210 210

Tabela 2C: Adiponectina

Identificação de amostra adiponectina de camundongo C1-12 10 meses 8.6 C2-12 10 meses QNS C3-12 10 meses 13,2 C4-12 10 meses 13,0 C5-12 10 meses 11,3 C6-12 10 meses 10,4 C7-12 10 meses 13,4 C8-12 10 meses 7,4 C9-12 10 meses 10,7 C10-12 10 meses 10,0 C11-12 10 meses 9,3 C12-12 10 meses 11,9 C-13 10 meses 10,3 C14-12 10 meses 13,3 C15-12 10 meses 13,0 C16-12 10 meses 8,3 C17-12 10 meses 12,7 C18-12 10 meses 5,3 C19-12 10 meses 9,4 C20-12 10 meses 13,8 ΤΙ-12 10 meses 13,2 Τ2-12 10 meses 8,4 Τ3-12 10 meses 11,7 Τ4-12 10 meses 8,9 Τ5-12 10 meses 11,4 Τ6-12 10 meses 9,1 Τ7-12 10 meses 7,3 Τ8-12 10 meses 8,6 Τ9-12 10 meses 9,3 Τ10-12 10 meses 7,7 Tl 1-12 10 meses 10,0 Τ12-12 10 meses 14,7 Τ13-12 10 meses 10,3 Τ14-12 10 meses 14,1 Τ15-12 10 meses 9.2 Τ16-12 10 meses 12.9 Τ17-12 10 meses 12.7 Τ19-12 10 meses 11.8 Τ20-12 10 meses 7.7 ΤΙ-12 20 meses 16.2 Τ3-12 20 meses 9.1 Τ5-12 20 meses 13.9 Τ6-12 20 meses 19.1 Τ7-12 20 meses 17.7 Τ8-12 20 meses 9.6 Τ12-12 20 meses 13.1 Τ16-12 20 meses 19.3 Τ17-12 20 meses 14.3 CI-12 20 meses 8.7 C2-12 20 meses 8.0 C3-12 20 meses 10.3 C5-12 20 meses 9.6 C6-12 20 meses 19.5 C9-12 20 meses 13.3 C10-12 20 meses 10.8

Referência a Tabelas 2A, 2B, e 2C, os dados mostram que um

regime de dieta modificado reduziu inflamação [p<0,05] nos camundongos. Citocinas pró-inflamatórías IL-6 [Y] & IL-12 [O] diminuíram, mediadores in- flamatórios IL-7 [Y,0], IL-15 [O] & IL-17 [O] diminuíram, citocinas anti- inflamatórias IL-10 [O] & IL-13 [O] diminuíram. "O" refere-se a significativo em camundongos apenas velhos, Ύ' refere-se a significativo em grupo de camundongos jovens apenas e "OY" refere-se a significativo tanto em ca- mundongos jovens quanto velhos. Fenotipicamente, o camundongo mais velho no grupo de teste tinha muito poucas incidências de dermatite atópica quando comparados com os grupos de controle que indicam uma redução no processo inflamatório que são típicos do processo de envelhecimento. Citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL- 12 diminuíram nos Grupos I e III, res- pectivamente. Citocinas consideradas mediadores inflamatórios (IL-7, IL-15, & IL-17) diminuíram. IL-7 diminuíram nos Grupos I e III, enquanto IL-15 e IL- 17 diminuíram no Grupo III. As citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-13 di- minuíram no Grupo III, consistente com a observação acima na inflamação. O regime nutricional modificado de resistência à insulina reversa [p < 0,05]. Nos camundongos do Grupo III, um aumento em adiponectina foi observado em camundongos do Grupo I, resistina e Ieptina foram, cada uma, observa- das estarem diminuídas. Claramente, a dieta de teste reduziu inflamação e resistência à insulina reversa, ambas as quais estão associadas às caracte- rísticas típicas de idade. Os dados também mostram que vários biomarcado- res podem ser usados para analisar o estado de saúde dos animais Exemplo 2

Desenvolvimento e Otimização do Ensaio Multiplicador

Materials & Métodos: ensaios multiplicadoresados foram desen- volvidos em três etapas: [1] Aquisição de reagente /Caracterização: Anticor- pos específicos às moléculas caninas para o ensaio canino foram obtidos, imunoensaios de tipo sanduíche foram desenvolvidos e seu desempenho foi caracterizado e foi combinado para desenvolver painéis de ensaio multipli- cador como mostrado para o Ensaio Canino: [2] Desenvolvimento de Méto- do: Ensaios individuais foi então otimizado para eliminar reatividade cruzada, aumentar sensibilidade e faixa dinâmica; e [3] Validação Preliminar: Painéis de ensaio multiplicador foram então validados com (a) soro e plasma nor- mais oriundos de cachorros saudáveis (b) sobrenadantes de cultura [C/S] oriundos de PBMCs de cachorro estimulado com lipopolissacarídeos [LPS]. Ensaio canino - [Painel, Citocina/quimiocina, Analito GMCSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-18, IFNgama, IP-10, TNF-alfa, MCP-1, IL-15, KC. Painel, Endócrino, Analito GLP-1 , Glucagon, Insulina, Leptina; Painel, Adipocina, Analito Adiponectina, Resistina]. Os resultados são mostrados na Tabela 3 Resultados & Discussão [1] Aquisição de reagente/Caracterização 20: molé- culas caninas que cobrem diferentes áreas-chave do interesse nutriconal & terapêutico foram selecionadas como alvos. Vários pares de anticorpos es- pecíficos para essas moléculas foram triados. Esses incluem anticorpos es- pecíficos caninos e onde anticorpos específicos caninos não estavam dispo- níveis, anticorpos originados contra moléculas de murino, roedores ou ser- humano foram triadas. Pares de anticorpos que forneceram o melhor sinal com proteínas caninas foram selecionados para desenvolver imunoensaios de tipo sanduíche com base em conta [plataforma Luminex xMAP]. [2] Méto- do de desenvolvimento: os ensaios selecionados da etapa [1] foram adicio- nalmente otimizados para a reatividade cruzada, sensibilidade e faixa dinâ- mica para se obter os painéis complexados finais. Depois da otimização houve reatividade cruzada desprezível dentro dos painéis multiplex. Várias concentrações de analitos em uma "matriz de soro" foram usadas para cons- truir "Curvas-Padrão". Uma análise das curvas padrão para IL-4 & IL- 18 [painel de citocina canino] e Leptina & Insulina [painel de hormônio endócri- no] indicam que eles têm sensibilidade significantemente menor quando comparados com o resto dos analitos. Anticorpos para IL-8 visto para dar um sinal de base mais alto quando comparados com outras citocinas. No entan- to, essas características de ensaio não inferirão nas medições de níveis fi- siológicos uma vez que o nível normal da maioria desses analitos está na faixa de pg/ml. [3] Validação: uma validação preliminar desses painéis multi- plexados foi realizada usando-se soro normal/plasma. Tabela 3A sumariza os dados nas citocinas & quimiocinas [39 cachorros saudáveis, German Shepard, Labrador Retriever1 Schnauzer, Siberian Huskie1 idades de 2 a 6 anos]. Tabela 3B sumariza dados nos hormônios endócrinos caninos em duas amostras de soro contendo inibidores para prevenir degradação de GLP-1. Tabela 3C sumariza dados obtidos a partir do painel de adipocina [amostras de soro oriundas de 17 Beagle e Mongrel] Tabela 3A: Citocinas em Soro Canino & Plasma Normais (conc. em pq/ml)

Citocina Soro Plasma Média Min. Máx. Média Min Max % de- tectável TNFa 2,2 ND 885,5 79,5 1,1 ND 221,4 56,4 GMCSF 289,0 61,0 40112,0 100,0 151,0 ND 31654,0 100,0 IL-4 306,3 ND 5020,4 69,2 226,0 ND 1859,0 66,7 MCP-1 349,0 144,2 24484,2 100,0 161,7 68.4 6422,0 100,0 KC 620,3 94,0 1201,5 100,0 32,3 ND 828,1 94,9 IL-8 395,5 9,6 19832,9 100,0 556,8 9.1 2292,4 100,0 IFNy ND ND 1980,0 28,2 ND ND 1264,0 10,3 Leptina 2024,5 ND 57755,0 71,8 1764,0 ND 17905,0 76,9 IL-10 ND ND 8744,0 23,1 ND ND 5204,9 12,8 IP-10 35,0 7,0 1292,0 100,0 21,0 ND 541,0 84,6 Glucagon 91,4 5,3 1080,8 100,0 35,4 ND 1525,4 84,6 IL-02 157,0 ND 17472,0 69,2 ND ND 63072,0 48,7 IL-6 ND ND 18955,0 53,8 ND ND 12768,0 38,5 IL-7 270,0 46,0 26273,0 97,4 155,0 ND 65201,0 100,0 IL-15 166,0 27,0 79521,0 97,4 116,0 ND 22939,0 87,2 IL-18 3703,0 508,0 96292,0 100,0 3191,0 353,0 89725,0 100,0 Insulina 864,1 280,4 12469,0 100.0 591,4 49,0 5946,1 100,0

Tabela 3B: Hormônios em amostras de soro canino normais Amostra Leptina (ng/mL) Glucagon (pg/mL) GLP-1 (pM) Insulina (ng/mL) Morgan 10,12 148,37 80,94 1,30 Stoli ND 94,96 ND 1,50

Tabela 3C: Adiponectina (Acrp30) e Resistina em amostras de soro canino normais

N= 17 cAcrp30 (ng/ml) cResistina (ng/ml) Min 3,08 5,10 Max 32,37 253,05 Média 14,90 15,03

Experiências foram também conduzidas para confirmar que es-

ses painéis detectaram citocinas secretadas por PBMCs após estimulação com LPS. Dados representativos são mostrados na figura 2. Uma dose de LPS e secreção dependente de tempo de IL-6, TNF-alfa, IL-8 & IL-18 pode ser claramente observada.

Conclusões: Um painel multiplexado capaz de medir 20 diferen- tes proteínas caninas nos sobrenadantes de soro, de plasma & de cultura de tecido foi desenvolvido com sucesso. Painel inclui ensaios para várias prote- ínas para as quais ensaios não estavam anteriormente disponível. Validação preliminar de painel com amostras de plasma/soro normais demonstra que o painel é capaz de medir essas moléculas em soro/plasma. Ensaios realiza- dos nos sobrenadantes de cultura a partir dos LPS tratados com PBMCs demonstram que os ensaios no painel são capazes de detectar citocinas esperadas a serem em reposta a estímulo de LPS, a saber IL-6, TNF-alfa, IL-8 e IL-18 de uma vez bem como dependente do modo de dose. Outras experiências de validação estão atualmente a caminho com nutrição & estu- dos clínicos adequados. Em combinação com técnicas de análise de trajetó- ria e reconhecimento-padrão apropriados; esses painéis ajudarão a pre- ver/avaliar resultados funcionais de interveções e estressores fisiológicos.

Deve ser entendido que várias mudanças e modificações nas concretizações preferidas descritas aqui estarão evidentes por aqueles ver- sados na técnica. Tais mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo do presente assunto e sem diminuir suas vantagens pretendidas. Pretende-se, portanto, que mudanças e modifica- ções sejam cobertas pelas reivindicações anexas.

Todas as patentes, pedidos de patente, publicações e outras referências citados ou mencionados aqui são incorporados aqui por referên- cia na medida permitida pela lei. A discussão daquelas referências destina- se meramente a sumarizar as afirmações produzidas ali. Nenhuma admis- são é feita a quaisquer tais patentes, pedidos de patente, publicações ou referências, ou qualquer sua porção, é relevante na técnica anterior para a presente invenção e o certo para desafiar a exatidão e pertinência de tais patentes, pedidos de patente, publicações, e outras referências é especifi- camente reservada.

Claims (74)

1. Coleção de sondas detectáveis moleculares para a determi- nação em uma amostra única, da atividade, presença, ou expressão de, ca- da um, um conjunto predeterminado de analitos, u conjunto compreendendo 5 pelo menos uma citocina ou gene para a mesma, uma quimiocina ou gene para a mesma, um hormônio ou gene para o mesmo, e uma adipocina ou gene para a mesma, em que para cada analito no conjunto, a coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da atividade, presença, ou expressão daquele analito.

2. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 1 em que o conjunto de analitos adicionalmente compreende um ou mais fatores de crescimento neuronal ou genes para os mesmos, fatores de crescimento outros que não fatores de crescimento neuronal ou genes para os mesmos, receptores solúveis ou genes para os mesmos, ou sua combi- nação.

3. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 2, compreendendo sondas detectáveis para a detecção de um produto de gene codificado de cada gene no conjunto de analitos desse modo de- terminando a expressão de cada gene no conjunto.

4. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 3, em que cada sonda é específica para a detecção daquele analito no conjunto.

5. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 3, em que as sondas detectáveis compreendem anticorpos, fragmentos de anticorpo, ligantes, receptores, proteínas de ligação, ou ácidos nucleicos.

6. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 1, em que o conjunto de analitos compreende um ou mais das citocinas interferon alfa, interferon gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interfe- ron beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, in- terleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 4, interleucina 10, fator de crescimento transformante beta-1 , fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, interleucina 5, interleucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 2, interleucina 11 , inter- Ieucina 12 p70, interleucina 16, interleucina 17, regulado na Ativação, normal T expresso e presumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21 , inter- leucina 9, ou receptor beta de fator de crescimento transformante III, ou um gene que codifica qualquer uma das citocinas expostas acima.

7. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 6, em que o conjunto de analitos compreende um ou mais de quimioci- nas quimioatraentes de B-linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo deriva- do de célula epitelial, eotaxina, eotaxina-2, proteína quimiotática de monóci- to 2, proteína quimiotática de monócito 3, fator inibitório de migração de ma- crógafo, proteína inflamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1, proteína de estimulação de macrógafo, proteína quimiotática de granulócito 2, proteína induzível por interferon gama 10, fator inibitório de leucemia, fator de estimulação de colônia de macrófago, proteína quimiotáti- ca de monócito 1, quimiocina derivada por macrófago, proteína inflamatória de macrófago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e de ativação, fa- tor derivado de célula estromal alfa, quimiocina regulada por timo ou por ati- vação, betacelulina, 6 Cquina, fator de crescimento de fibroblasto ácido, frac- talcina, quimiocina CC de hemofiltrado 1, proteína quimiotática de monócito4, proteína inflamatória de macrófago 3 beta, fator de plaqueta 4, ativador de receptor de NF-kapa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxi- na-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionada ao crescimento gama, alfa quimioatraente de célula T induzível por interferon gama, receptor de fator inibitório de receptor alfa, "midkine", proteína infla- matória de macrófago 3 alfa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimiocina expressa com timo, fator de crescimento transformante alfa, citocina induzida por activina relacionada a TNF, proteína-1 de adesão vas- cular , CXCL9, ou CCLI, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

8. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 7, em que o conjunto de analitos compreende um ou dos hormônios pro- lactina, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 2, Iepti- na, insulina, resistina, adiponectina, glucagon, peptídeo 1 relacionado a glu- cagon, ou PYY, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

9. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 8, em que o conjunto de analitos compreende uma ou das proteína quimiotática de monócito de adipocinas 1, leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa, ou inibidor de fibrinólise ativável por trombina, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

10. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 9, em que o conjunto predeterminado dos analitos adicionalmente com- preende um ou mais dos fatores de crescimento neuronal, fator neutrófico ciliar, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neutrófico deri- vado de cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

11. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 9, em que o conjunto predeterminado de analitos adicionalmente com- preende um ou mais dos fatores de crescimento angiogenina, fator de cres- cimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de cresci- mento de fibroblasto 9, fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito, atividade de estimulação de crescimento de melanoma, oncosta- tina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento transformante beta-3, fator de crescimento de fibroblasto anfirregulina 6, fator de estimula- ção de colônia de granulócito, fator de célula-tronco, fator de crescimento endotelial vascular, cardiotrofina-1 , oncogene relacionado ao crescimento beta, fator de crescimento de tipo EGF de ligação de heparina, fator de cres- cimento de hepatócito, mediador de entrada de vírus da herpes, metalopro- teinase de matriz 10, metaloproteinase de matriz 7, metaloproteinase de ma- triz 9, inibidores de tecido de metaloproteinases 1, fator de crescimento en- dotelial vascular D, receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2, fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento de tipo insu- lina I, fator de crescimento de tipo insulina II, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 3, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 4, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 6, metalopro- teinase de matriz 1, metaloproteinase de matriz 2, ou inibidor de tecido de metaloproteinases 2, ou um gene que codifica qualquer um do exposto aci- ma.

12. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 9, em que o conjunto predeterminado de analitos adicionalmente com- preende um ou mais dos receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonis- ta de receptor de interleucina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigan- te indutor de apoptose relacionada com TNF1 receptor de ativador de plas- minogênio do tipo uroquinase, Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms, glicoproteína solúvel 130, receptor I solúvel em interleucina 1, receptor solú- vel em interleucina 6, receptor I de fator de necrose de tumor, receptor Il de fator de necrose de tumor, caderina de epitélio vascular, CCL28 molécula 4 associada a linfócito T citotóxico 4, receptor de morte 6, Iigante de Fas, mo- lécula de adesão intracelular 3, receptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L-selectina, molécula 1 de adesão de célula endotelial de plaqueta , Receptor de fator de célula-tronco, Receptor de Iigante de in- dução de apoptose 4 relacionado a TNF, Adesão de célula de leucócito ati- vada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, Molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, re- ceptor Il solúvel em interleucina 1, receptor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de Fator de estimulação de colônia de ma- crófago, receptor alfa de fator de crescimento derivado por plaqueta, ou Re- ceptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

13. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 9, que compreende uma sonda específica para cada uma de IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 10, IL-18, IFN gama, IP-10, TNF-alfa, MCP-1, GLP-1, glu- cagon, insulina, adiponectina, e resistina

14. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 13, que são capazes de detectar a atividade, presença, ou expressão de cada de um conjunto predeterminado de analitos a partir de um animal que é ser-humano, camundongo, símio, canino, ou felino.

15. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 14, adicionalmente compreendendo sondas específicas para a detecção da presença ou atividade de uma ou mais de IL-15, KC, e leptina, ou um ge- ne que codifica qualquer um do exposto acima.

16. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 13, em que os analitos são oriundos de um canino e as sondas são anti- corpos.

17. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 16, que provê uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou da quantidade de expressão de cada analito.

18. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 17, em que cada sonda está ligada a uma matriz, em que cada tal sonda ligada permanece capaz de provisão de uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou quantidade de expressão de cada analito em uma amostra posta em contato com a matriz.

19. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 18, em que cada sonda está ligada a uma matriz separada.

20. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 19, em que cada sonda é independentemente detectável uma da outra sonda na coleção.

21. Método de avaliação do estado de saúde de um animal por determinação da expressão ou atividade relativa de um conjunto de genes, o método compreendendo as etapas de obtenção de uma amostra biológica a partir do animal, a dita amostra putativamente contendo um conjunto prede- terminado de analitos de interese ou os produtos de expressão daqueles analitos, o conjunto compreendendo pelo menos uma citocina, uma quimio- cina, um hormônio, e uma adipocina, ou um gene que codifica cada um do exposto acima; contato da amostra com uma coleção de sondas moleculares para a determinação da atividade, presença, ou expressão de cada um do conjunto predeterminado de analitos, em que para cada analito no conjunto, a coleção de sondas moleculares compreende pelo menos uma sonda ade- quada para a detecção da atividade, presença, ou expressão daquele anali- to, cada sonda capaz de produzir um sinal independentemente detectável quando o analito ou seu produto de expressão que corresponde àquela son- da está presente na amostra, detecção dos sinais independentemente detec- táveis produzidos depois que a amostra é posta em contato com a coleção, correlação dos sinais detectáveis com a atividade relativa, presença, ou ex- pressão de cada um do conjunto predeterminado de analitos na amostra, correlação da atividade relativa, presença, ou expressão de cada um do con- junto predeterminado de analitos na amostra com parâmetros conhecidos de estado de saúde, e produção de uma determinação do estado de saúde dos animais de acordo com o mesmo.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o conjun- to de analitos adicionalmente compreende um ou mais de um fator de cres- cimento neuronal, um fator de crescimento outros que não um fator de cres- cimento neuronal, um receptor solúvel, ou uma sua combinação, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que as son- das detectáveis são específicas para a detecção da presença, atividade ou expressão de cada analito no conjunto de analitos.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que as son- das detectáveis are anticorpos, fragmentos de anticorpo, ligantes, recepto- res, ou proteínas de ligação.

25. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o conjun- to de analitos compreende um ou mais das citocinas interferon alfa, interfe- ron gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 4, interleucina 10, fator de crescimento transformante beta-1, fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, inter- leucina 5, interleucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 2, interleucina 11, interleucina 12 p70, inter- Ieucina 16, interleucina 17, Regulado na ativação, Normal T Expresso e pre- sumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21, interleucina 9, ou recep- tor de fator de crescimento beta transformante III, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais das quimiocinas quimioatra- ente de B-linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epi- telial, eotaxina, eotaxina-2, proteína quimiotática de monócito 2, proteína quimiotática de monócito 3, fator inibitório de migração de macrógafo, prote- ína inflamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1 , proteína de estimulação de macrógafo, proteína quimiotática de granulócito 2, proteína induzível por interferon gama 10, fator inibitório de leucemia, fa- tor de estimulação de colônia de macrófago, proteína quimiotática de monó- cito 1, quimiocina derivada por macrófago, proteína inflamatória de macró- fago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativa- ção de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e de ativação, fator deri- vado de célula estromal alfa, quimiocina regulada por timo e por ativação, betacelulina, 6 Ckine1 fator de crescimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimiocina CC de hemofiltrado 1, proteína quimiotática de monócito 4, prote- ína inflamatória de macrófago 3 beta, fator de plaqueta 4, ativador de recep- tor de NF-kapa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionada ao cresci- mento gama, alfa quimioatraente de célula T induzível por interferon gama, receptor de fator inibitório de leucemia alfa, "midkine", proteína inflamatória de macrófago 3 alfa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimiocina expressa com timo, fator de crescimento transformante alfa, cito- cina induzida por activina relacionada com TNF, proteína-1 de adesão vas- cular , CXCL9, ou CCL1 , ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais dos hormônios prolactina, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 2, leptina, insuli- na, resistina, adiponectina, glucagon, peptídeo relacionado a glucagon 1, ou PYY1 ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais dentre proteína quimiotática de monócito de adipocinas 1, leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa, ou inibidor de fibrinólise ativável por trombina, ou um gene que codifica qual- quer um do exposto acima.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais fator neutrófico ciliar de fatores de crescimento neuronal, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neurotrófico derivado de cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta, ou um gene que codi- fica qualquer um do exposto acima

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais dos fatores de crescimento angiogenina, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibroblasto 9, fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito, atividade de estimu- lação de crescimento de melanoma, oncostatina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento transformante beta-3, fator de crescimento de fibroblasto de anfirregulina 6, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de célula-tronco, fator de crescimento endotelial vascular, cardiotrofina1 , oncogene relacionado ao crescimento beta, fator de crescimento de EGF- hke de ligação heparina, fator de crescimento de hepatócito, mediador de entrada de vírus da herpes, metaloproteinase de matriz 10, metaloproteinase de matriz 7, metaloproteinase de matriz 9, inibidores de tecido de metalopro- teinases 1, fator de crescimento endotelial vascular D, receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2, fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento de tipo insulina I, fator de crescimento de tipo insulina II, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 3, proteína de ligação de fa- tor de crescimento de tipo insulina 4, proteína de ligação de fator de cresci- mento de tipo insulina 6, metaloproteinase de matriz 1, metaloproteinase de matriz 2, ou inibidor de tecido de metaloproteinases 2, ou um gene que codi- fica qualquer um do exposto acima.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais dos receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonista de receptor de interleu- cina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigante indutor de apoptose relacionada a TNF1 receptor ativador de plaminogênio de tipo uroquinase, Iigante de cinase 3 de tirosina tipo fms, glicoproteína solúvel 130, receptor I solúvel em interleucina 1, receptor solúvel em interleucina 6, receptor de fa- tor de necrose de tumor I, receptor de fator de necrose de tumor II, caderina de epitélio vascular, CCL28, molécula associada a linfócito T citotóxico 4, receptor de morte 6, Iigante de Fas, molécula de adesão intracelular 3, re- ceptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L-selectina, molécula de adesão de célula endotelial de plaqueta 1, Receptor de fator de célula-tronco, Receptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF, Adesão de célula de leucócito ativada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, Molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, receptor Il solúvel em interleucina 1, recep- tor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de fator de estimulação de colônia de macrófago, receptor alfa de fator de cresci- mento derivado por plaqueta, ou receptor 4 de Iigante de indução de apopto- se relacionado a TNF, ou um gene que codifica qualquer um do exposto a- cima.

32. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o conjun- to predeterminado de analitos compreende cada um de IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-8, IL- 10, IL- 18, IFN gama, IP- 10, TNF-alfa, MCP- I, GLP- I , glucagon, insulina, adiponectina, e resistina, ou pelo menos um gene cada que codifica cada um do exposto acima.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o animal é ser-humano, murino, símio, canino, ou felino.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais de IL- 15, KC1 ou leptina, ou um gene que codifica qualquer um do exposto aci- ma.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que os anali- tos são oriundos de um canino e as sondas são anticorpos.

36.Método de acordo com a reivindicação 35, em que a coleção de sondas moleculares permite uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou quantidade de expressão de cada analito.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que cada sonda está ligada a uma matriz, em que cada tal sonda ligada permanece capaz de prover uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou quantidade de expressão de um analito que corresponde àquela sonda, em uma amostra é posta em contato com a matriz.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, adicionalmente compreendendo contato da amostra e a coleção de sondas moleculares com um conjunto de anticorpos secundários compreendendo um ou mais anticor- pos para auxiliar na detecção por aumento de especificidade ou sinal de de- tecção.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que cada sonda está ligada a uma matriz separada.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que a amostra é soro ou plasma.

41. Método de formulação de um regime nutricional para o me- lhoramento da saúde de um animal compreendendo a) seleção de um conjunto predeterminado de analitos de intere- se em um animal, em que a atividade, presença, ou expressão dos analitos podem ser correlacionadas com o estado de saúde do animal, e com um regime nutricional do animal, o conjunto compreendendo pelo menos um de cada uma citocina, uma quimiocina, um hormônio, e uma adipocina, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima, b) obtenção de uma amostra biológica oriunda do animal, a dita amostra putativamente contendo o conjunto predeterminado de analitos, ou os seus produtos de expressão, a dita amostra indicativa de um regime nu- tricional atual do animal, c) determinação de uma medição de linha base por contato da amostra com uma coleção de sondas moleculares para a determinação da atividade, presença, ou expressão de cada um do conjunto predeterminado de analitos, em que para cada analito no conjunto, a coleção de sondas mo- leculares compreende pelo menos uma sonda adequada para a detecção da atividade, presença, ou expressão daquele analito, cada sonda capaz de produzir um sinal independentemente detectável quando o analito ou seu produto de expressão que corresponde àquela sonda está presente na a- mostra, d) detecção dos sinais independentemente detectáveis produzi- dos depois que a amostra é posta em contato com a coleção, e) correlação dos sinais detectáveis com a atividade relativa, presença, ou expressão de cada um do conjunto predeterminado de analitos na amostra, f) correlação da atividade relativa, presença, ou expressão de cada um do conjunto predeterminado de analitos na amostra com parâme- tros conhecidos de estado de saúde, g) produção de uma determinação do estado de saúde do ani- mal no regime nutricional corrente de acordo com o mesmo, h) formulação de um ou mais suplementos ou regimes nutrico- nais de teste para a testagem no animal por ajuste de um ou mais da fonte ou teor de micronutriente, a fonte ou teor de macronutriente, componentes de dieta suplementar, ou teor calórico da dieta quando comparado com re- gime nutricional corrente do animal, i) provisão de um ou mais suplementos ou regimes nutriconais de teste, ou sua combinação, ao animal em uma quantidade e por um tempo eficaz para mudar a atividade, presença, ou expressão de um ou mais do conjunto predeterminado de analitos, j) para cada regime ou suplemento nutricional de teste, ou sua combinação, repetição das etapas b) até g) com uma nova amostra oriunda do animal para determinar se o regime ou suplemento nutricional de teste, ou sua combinação melhorou o estado de saúde do animal, e k) seleção de regime ou suplemento nutricional formulado, ou sua combinação, que melhora o estado de saúde do animal.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o animal é obeso, tem diabetes, tem sintomas de estar predisposto a diabetes, tem um nível indesejável de inflamação, tem um nível indesejável de resistência à insulina, tem síndrome metabólica, aterosclerose prematura, metabolismo de glicose anormal, ou metabolismo de gordura anormal.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o regime nutricional formulado, suplemento, ou sua combinação reduz inflamação, reduz resistência à insulina, ou a sua combinação no animal

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o regime nutricional formulado, suplemento, ou sua combinação reduz inflamação no animal, e um ou mais de aumentos citocinas anti-inflamatórias, reduz citoci- nas pró-inflamatórias, ou diminui mediadores de citocina de inflamação.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que as citoci- nas pró-inflamatórias incluem um ou mais de interferon alfa, interferon gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfo- toxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, ou fator de necrose de tumor alfa, e em que as citocinas anti-inflamatórias incluem interleucina 4, interleucina 10, interleucina 13, fator de crescimento transformante beta-1 , ou fator de necrose de tumor beta.

46. Método de acordo com a reivindicação 44, em que as citoci- nas pró-inflamatórias são IL-6 ou IL-12, IFN, e as citocinas anti-inflamatórias são IL-IOe IL-13.

47. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o regime nutricional formulado, suplemento, ou sua combinação reduz resistência à insulina no animal e um ou mais de aumentos adiponectina, diminui resisti- na, ou diminui leptina.

48. Método de acordo com a reivindicação 42, em que o regime nutricional formulado, suplemento, ou sua combinação reduz um ou mais de dislipidemia, inflamação, hipertensão, reatividade vascular aumentada, ou obesidade viceral, ou melhora fibrinólise.

49. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o conjun- to de analitos adicionalmente compreende um ou mais de um fator de cres- cimento neuronal, um fator de crescimento outros que não um fator de cres- cimento neuronal, um receptor solúvel, ou sua combinação, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

50. Método de acordo com a reivindicação 41, em que as son- das detectáveis são específicas para a detecção de cada um do conjunto de analitos.

51. Método de acordo com a reivindicação 41, em que as son- das detectáveis são anticorpos, fragmentos de anticorpo, ligantes, recepto- res, ou proteínas de ligação.

52. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o conjun- to de analitos compreende um ou mais das citocinas interferon alfa, interfe- ron gama, interleucina 12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, interleucina 4, interleucina 10, fator de crescimento transformante beta-1 , fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, inter- Ieucina 5, interleucina 7, interleucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleucina 2, interleucina 11, interleucina 12 p70, inter- leucina 16, interleucina 17, regulado na ativação, normal T expresso e pre- sumidamente secretado (RANTES), interleucina 21, interleucina 9, ou recep- tor beta de fator de crescimento transformante III, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais das quimiocinas quimioatra- ente de B-linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epi- telial, eotaxina, eotaxina-2, proteína quimiotática de monócito 2, proteína quimiotática de monócito 3, fator inibitório de migração de macrógafo, prote- ína inflamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1 , proteína de estimulação de macrógafo, proteína quimiotática de granulócito .2, proteína induzível por interferon gama 10, fator inibitório de leucemia, fator de estimulação de colônia de macrófago, proteína quimiotática de monócito 1, quimiocina derivada por macrófago, proteína inflamatória de macrófago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e de ativação, fator derivado de célula estromal alfa, quimiocina regulada por timo e por ativação, betaceluli- na, 6 Cquina, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimioci- na CC de hemofiltrado 1, proteína quimiotática de monócito 4, proteína in- flamatória de macrófago 3 beta, fator de plaqueta 4, ativador de receptor de NF-kappa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionado ao crescimen- to gama, alfa quimioatraente de célula T induzível por interferon gama, re- ceptor de fator inibitório de leucemia alfa, "midkine", proteína inflamatória de macrófago 3 alfa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimio- cina expressa com timo, fator de crescimento transformante alfa, citocina induzida por activina relacionada a TNF, proteína-1 de adesão vascular, CXCL9, ou CCL1, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais dos hormônios prolactina, proteína de ligação de fator de crescimento 2 de tipo insulina, leptina, insuli- na, resistina, adiponectina, glucagon, peptídeo 1 relacionado a glucagon, ou PYY, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, em que o conjun- to predeterminado de analitos inclui um ou mais da proteína quimiotática de monócito de adipocinas 1, leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNF-alfa, ou inibidor de fibrinólise ativável por trombina, ou um gene que codifica qual- quer um do exposto acima.

56. Método de acordo com a reivindicação 55, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais fator neutrófico ciliar de fatores de crescimento neuronal, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neurotrófico derivado de cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta, ou um gene que codi- fica qualquer um do exposto acima.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais dos fatores de crescimento angiogenina, fator-7 de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblasto, fator-9 de crescimento de fibroblasto, fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito, atividade de estimula- ção de crescimento de melanoma, oncostatina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento transformante beta-3, fator-6 de crescimento de fibroblasto anfirregulina, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de célula-tronco, fator de crescimento endotelial vascular, cardiotrofina- 1, oncogene relacionado ao crescimento beta, fator de crescimento de tipo EGF de ligação de heparina, fator de crescimento de hepatócito, mediador de entrada de vírus da herpes, metaloproteinase de matriz 10, metaloprotei- nase de matriz 7, metaloproteinase de matriz 9, inibidores de tecido de meta- Ioproteinases 1, fator de crescimento endotelial vascular D, receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2, fator de crescimento de fibroblasto bá- sico, fator de crescimento de tipo insulina I, fator de crescimento de tipo insu- lina II, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 3, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 4, proteína de ligação de fator de cres- cimento de tipo insulina 6, metaloproteinase de matriz 1, metaloproteinase de matriz 2, ou inibidores de tecido de metaloproteinase 2, ou um gene que codifica qualquer um do exposto acima.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais dos receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonista de receptor de interleu- cina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigante indutor de apoptose relacionada a TNF, receptor ativador de plasminogênio de tipo uroquinase, Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms, glicoproteína solúvel 130, recep- tor I solúvel em interleucina 1, receptor solúvel em interleucina 6, receptor I de fator de necrose de tumor, receptor Il de fator de necrose de tumor, cade- rina de epitélio vascular, CCL28, molécula 4 associada a linfócito T citotóxi- co, receptor de morte 6, Iigante de Fas, molécula de adesão intracelular 3, receptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L-selectina, molécula 1 de adesão de célula endotelial de plaqueta, receptor de fator de célula-tronco, receptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF, adesão de célula de leucócito ativada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, receptor Il solúvel em interleucina 1, recep- tor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de fator de estimulação de colônia de macrófago, receptor alfa de fator de cresci- mento derivado por plaqueta, ou receptor 4 de Iigante de indução de apopto- se relacionado a TNF, ou um gene que codifica qualquer um do exposto a- cima.

59. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o conjun- to predeterminado de analitos compreende cada um de IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-8, IL- 10, IL- 18, IFN gama, IP- 10, TNF-alfa, MCP-1 , GLP-1 , glucagon, insulina, adiponectina, e resistina, ou pelo menos um gene cada que codifi- cada cada um do exposto acima.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, em que o animal é um ser-humano, murino, símio, canino, ou felino.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, em que o conjun- to predeterminado de analitos adicionalmente compreende um ou mais de IL-15, KC, ou leptina, ou um gene que codifica qualquer um do exposto aci- ma.

62. Método de acordo com a reivindicação 60, em que os anali- tos são oriundos de um canino e as sondas são anticorpos.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, em que a coleção de sondas moleculares permite uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou expressão de cada analito.

64. Método de acordo com a reivindicação 63, em que cada sonda está ligada a uma matriz, em que cada tal sonda ligada permanece capaz de prover uma determinação quantitativa da atividade, presença, ou quantidade de expressão de um analito que corresponde àquela sonda, em uma amostra posta em contato com a matriz.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, compreendendo a outra etapa de contato da amostra e a coleção de sondas moleculares com um conjunto de anticorpos secundários compreendendo uma ou mais anti- corpos para auxiliar na detecção por aumento da especificidade ou sinal de detecção.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que cada sonda está ligada a uma matriz separada.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a amostra é tecido ou fluido do corpo.

68. Método de acordo com a reivindicação 67, em que o fluido é soro ou plasma.

69. Coleção de sondas detectáveis moleculares para a determi- nação em uma amostra única, a presença de um conjunto predeterminado de analitos de proteína, o conjunto compreendendo uma sonda específica para cada um de IL-2, IL-4, IL-6, IL- 7, IL-8, IL-10, IL-18, IFN gama, IP-10, TNF-alfa, MCP-1, GLP-1, glucagon, insulina, adiponectina, e resistina, em que cada sonda é um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico para a detecção de uma proteína no conjunto, cada sonda sendo independente- 20 mente detectável uma da outra sonda na coleção, cada tal sonda ligada a uma matriz, em que cada sonda ligada é capaz de prover uma determinação quantitativa da proteína correspondente no conjunto, em uma amostra posta em contato com a matriz, em que as proteínas são codificadas por genes de um animal que é um ser-humano, murino, símio, canino, ou felino.

70. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 69, adicionalmente compreendendo sondas específicas para um ou mais de IL-15, KC, e leptina.

71. Coleção de sondas moleculares de acordo com a reivindica- ção 69, em que o conjunto de analitos de proteína adicionalmente compre- ende um ou mais das citocinas interferon alfa, interferon gama, interleucina12 p40, interleucina 18, interferon beta, interferon ômega, Iinfotoxina beta R, linfotoxina, interleucina 6, interleucina 8, fator de necrose de tumor alfa, inter- Ieucina 4, interleucina 10, fator de crescimento transformante beta-1 , fator de necrose de tumor beta, interleucina 3, interleucina 5, interleucina 7, inter- leucina 13, interleucina 15, interleucina 1 alfa, interleucina 1 beta, interleuci- na 2, interleucina 11 , interleucina 12 p70, interleucina 16, interleucina 17, Regulado na Ativação, Normal T Expresso e presumidamente Secretado (RANTES), interleucina 21, interleucina 9, ou receptor Ill beta de fator de crescimento transformante, e um ou mais de quimiocinas quimioatraentes de B-linfócito, peptídeo de ativação de neutrófilo derivado de célula epitelial, eotaxina, eotaxina-2, proteína 2 quimiotática de monócito, proteína quimio- tática de monócito 3, fator inibitório de migração de macrógafo, proteína in- flamatória de macrófago 1 alfa, fator inibitório de origem mieloide 1, proteína de estimulação de macrógafo, proteína quimiotática de granulócito 2, proteí- na induzível por interferon 10 gama, fator inibitório de leucemia, fator de es- timulação de colônia de macrófago, proteína quimiotática de monócito 1, quimiocina derivada por macrófago, proteína inflamatória de macrófago 1 beta, proteína inflamatória de macrófago 1 delta, peptídeo de ativação de neutrófilo 2, quimiocina regulada pulmonar e por ativação, fator derivado de célula estromal alfa, quimiocina regulada por timo ou por ativação, betacelu- lina, 6 Cquina, fator de crescimento de fibroblasto ácido, fractalcina, quimio- cina CC de hemofiltrado 1, proteína quimiotática de monócito 4, proteína in- flamatória de macrófago 3 beta, fator de plaqueta 4, ativador de receptor de NF-kappa-B, quimiocina atraente de célula T cutânea, eotaxina-3, fator de crescimento de fibroblasto 4, folistatina, oncogene relacionado ao crescimen- to gama, alfa quimioatraente de célula T induzível por interferon gama, re- ceptor de fator inibitório de leucemia alfa, "midkine", proteína inflamatória de macrófago 3 alfa, pleiptrofina, fator derivado de célula estromal beta, quimio- cina expressa com timo, fator de crescimento transformante alfa, citocina induzida por activina relacionada a TNF, proteína-1 de adesão vascular, CXCL9, ou CCL1, e um ou mais dos hormônios prolactina, proteína de Iiga- ção de fator de crescimento de tipo insulina 2, leptina, insulina, resistina, a- diponectina, glucagon, peptídeo 1 relacionado a glucagon, ou PYY, e um ou mais das adipocinas proteína 1 quimiotática de monócito, leptina, resistina, adiponectina, IL-6, TNF- alfa, ou inibidor de fibrinólise ativável por trombina, e um ou mais de fator neutrófico ciliar dos fatores de crescimento neuronal, fator neutrófico derivado de linha de célula glial, fator neurotrófico derivado de cérebro, neurotrofina 3, neurotrofina 4, ou fator de crescimento de nervo beta, ou os fatores de crescimento angiogenina, fator de crescimento epi- dérmico, fator de crescimento de fibroblasto 7, fator de crescimento de fibro- blasto 9, fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito, ativi- dade de estimulação de crescimento de melanoma, oncostatina M, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento transformante beta-3, fator de crescimento de fibroblasto de anfirregulina 6, fator de estimulação de colônia de granulócito, fator de célula-tronco, fator de crescimento endotelial vascu- lar, cardiotrofina-1, oncogene relacionado a crescimento beta, fator de cres- cimento de tipo EGF de ligação de heparina, fator de crescimento de hepa- tócito, mediador de entrada de vírus da herpes, metaloproteinase de matriz 10, Iipoproteinase de metal de matriz 7, metaloproteinase de matriz 9, inibi- dores de tecido de metaloproteinases 1, fator de crescimento endotelial vas- cular D, receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular, fator de cres- cimento de fibroblasto básico, fator de crescimento de tipo insulina I, fator de crescimento de tipo insulina II, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 1, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina3,proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 4, proteína de ligação de fator de crescimento de tipo insulina 6, metaloproteinase de ma- triz 1, metaloproteinase de matriz 2, ou inibidor de tecido de metaloproteina- ses 2, ou os receptores solúveis sCD23, Fas (CD95), antagonista de recep- tor de interleucina 1, receptor alfa solúvel em interleucina 2, Iigante indutor de apoptose relacionado a TNF, receptor ativador de plaminogênio de tipo uroquinase, Iigante de cinase-3 de tirosina de tipo fms, glicoproteína solúvel 130, receptor I solúvel em interleucina 1, receptor solúvel em interleucina 6, receptor I de fator de necrose de tumor, receptor Il de fator de necrose de tumor, caderina de epitélio vascular, CCL28, molécula 4 associada a linfócito T citotóxico, receptor de morte 6, Iigante de Fas, molécula de adesão intra- celular 3, receptor gama de interleucina 2, receptor alfa de interleucina 5, L- selectina, molécula-1 de adesão de célula endotelial de plaqueta, receptor de fator de célula-tronco, receptor 4 de Iigante de indução de apoptose rela- cionado a TNF, adesão de célula de leucócito ativada, CD27, CD30, CD40, receptor de fator neutrófico ciliar, molécula de adesão intracelular 1, receptor I de fator de crescimento de tipo insulina, receptor Il solúvel em interleucina1, receptor beta de interleucina 2, receptor beta de interleucina 10, receptor de fator de estimulação de colônia de macrófago, receptor alfa de fator de crescimento derivado por plaqueta, ou receptor 4 de Iigante de indução de apoptose relacionado a TNF.

72. Kit adequado para a determinação em uma amostra única, a atividade, presença, ou expressão de cada um de conjunto predeterminado de analitos compreendendo em recipientes separados em uma única emba- lagem ou em recipientes separados em uma embalagem virtual, quando a- propriado para o componente de kit, um ensaio multiplicador compreenden- do uma coleção de sondas detectáveis moleculares e um ou mais de (1) ins- truções para como usar o ensaio multiplicador para determinar a atividade, presença, ou expressão de cada um de conjunto predeterminado de anali- tos, (2) instrução para como avaliar o estado de saúde de um animal usan- do-se o ensaio multiplicador, (3) instruções para a formulação de um regime nutricional para o melhoramento da saúde de um animal usando-se o ensaio multiplicador, e (4) um ou mais ingredientes adequados para o consumo por um animal.

73. Meio para a comunicação de informação próximo ao ou ins- truções para o uso do ensaio multiplicador para um ou mais de (1) determi- nação em uma amostra única, a atividade, a presença, ou a expressão de cada um de conjunto predeterminado de analitos, (2) avaliação do estado de saúde de um animal, ou (3) formulação de um regime nutricional para o me- lhoramento da saúde de um animal compreendendo um documento, meio de armazenagem digital, meio de armazenagem ótica, apresentação de áudio, ou exibição visual contendo a informação ou instruções.

74. Meio de acordo com a reivindicação 73, selecionado do gru- po que consiste em um web site exibido, quiosque de exibição visual, folhe- to, rótulo de produto, inserto de embalagem, publicidade, nota fornecida à imprensa, anúnico público, fita de áudio, fita de vídeo, DVD, CD-ROM, chip legível pelo computador, cartão legível pelo computador, disco legível pelo computador, memória no computador, ou sua combinação *