ES2322593T3

ES2322593T3 - Analisis proteomico de fluidos biologicos.

Info

Publication number: ES2322593T3
Application number: ES04758253T
Authority: ES
Inventors: Ron Rosenfeld; Sri Nagalla; Mike Gravett
Original assignee: Proteogenix Inc
Current assignee: Proteogenix Inc
Priority date: 2003-03-25
Filing date: 2004-03-23
Publication date: 2009-06-23
Anticipated expiration: 2024-03-23
Also published as: AU2010200352A1; EP2088433A1; CN1795387A; MXPA05010325A; JP2010122238A; JP5011410B2; US20040197930A1; WO2004088324A2; US7191068B2; DE602004019511D1; CA2560972A1; DK1618388T3; AU2004225527B2; EP1618388B1; US20090055099A1; AU2004225527A1; JP2006524331A; EP1618388A2; WO2004088324A3; US20080299594A1

Abstract

Método para el diagnóstico de una infeccción intramaniótica en una sujeto hembra preñada, que comprende (a) producir un perfil proteómico de una muestra de prueba de un fluido biológico obtenido de dicho sujeto; y (b) diagnosticar una infección intraamniótica en dicho sujeto si dicho perfil proteómico comprende un patrón de expresión único en relación con el perfil proteómico de una muestra normal, donde el patrón de expresión único contiene información de por lo menos IGFBP-1 o un fragmento, precursor o variante natural de la misma, y calgranulina o un fragmento, precursor o variante natural de la misma.

Description

Análisis proteómico de fluidos biológicos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a la identificación de proteomas de fluidos biológicos y su uso en la determinación del estado de afecciones de la madreles/fetales, incluyendo las afecciones de la madreles de origen fetal, y enfermedades fetales asociadas con el crecimiento y la maduración fetal. En particular, la presente invención se refiere a la identificación del proteoma del líquido amniótico (proteínas múltiples que representan la composición del fluido aminiótico) y la correlación de los cambios característicos en el proteoma normal con infección intra-aminiótica.

Descripción de la técnica relacionada Proteómica

El análisis a gran escala de los patrones de expresión de proteínas está emergiendo como un complemento importante y necesario a las actuales estrategias de clonación de ADN y determinación del perfil genético (Pandey y Mann, Nature 405:837-46 (2000)). La información de la secuencia de ADN es útil en la deducción de algunas modificaciones estructurales y de proteínas potenciales basado en métodos de homología, pero no proporciona ninguna información sobre la regulación de la función de la proteína a través de modificaciones post-traduccionales, proteólisis o compartimentalización.

Los métodos tradicionales basados en geles, tales como la electroforesis en gel unidimensional y bidimensional, son útiles para la detección de proteínas a pequeña escala (< 1.000 proteínas), pero éstos requieren grandes cantidades de muestra (Lilley KS, Razzaq A, Dupree P: Two-dimensional gel electrophoresis: recent advances in sample preparation, detection and quantitation. Curr Opin Chem Biol. 6(1):46-50, 2002). Las estrategias para superar esta limitación incluyen espectrómetros de masa de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser (MALDI o SELDI) asistida por matriz o potenciada en la superficie que generan de manera precisa perfiles que muestran las masas de las proteínas en una muestra. Estos patrones o perfiles se pueden utilizar para identificar o monitorizar varias enfermedades. El segundo nivel de identificación proviene del acoplamiento del mapeo de péptidos con la espectrometría de masas en tándem para generar información de la secuencia de aminoácidos a partir de fragmentos peptídicos. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante el acoplamiento del MALD/SELDI o EDI a MS de cuarupolo-tiempo de vuelo (MS Qq-TOF). El último método también se puede utilizar para la cuantificación de péptidos específicos (tecnología
ICAT).

Diagnóstico de afecciones patológicas de la madreles/fetales

Existen numerosas afecciones patológicas de la madres y fetales, tales como la infección intra-amniótico (IAI), la preclampsia, contracciones y parto prematuro y aneuploidías cromósomicas, que se pueden desarrollar durante el embarazo y afectar al bienestar o, en algunos casos, ser mortal para la madre y/o el feto o recién nacido. El diagnóstico precoz de dichas afecciones es crítico para permitir un tratamiento e intervención a tiempo. Desafortunadamente, el diagnóstico precoz para la mayoría de estas afecciones es difícil porque los signos y síntomas clínicos aparecen tarde, y frecuentemente no son específicos ni consistentes. Por ejemplo, los síntomas clínicos de IAI incluyen habitualmente fiebre y leucocitosis de la madre, pero estos síntomas aparecen tarde y no son ni sensibles ni específicos. De este modo, Gravett et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 171:1660-7 (1994), utilizando un modelo de primate no humano, desmostraron que tras la infección intra-aminiótica experimental con estreptococos del Grupo B, la fiebre y la leucocitosis están presentes sólo el 50% del tiempo al inicio del parto prematuro inducido por la infección, que aparece 28 a 40 horas después de la infección experimental. Por lo tanto, para evitar un retraso en el diagnóstico, se justifica un índice elevado de sospecha y el uso apropiado de tests de laboratorio adyuvantes. El criterio clínico utilizado habitualmente para diagnosticar IAI incluye fiebre de la madrel (\geq 37,8ºC), junto con dos o más de los siguientes: leucocitosis de la madrel (\geq 15.000/mm^{3}), taquicardia de la madrel o fetal, turgencia uterina o líquido amniótico con olor
nauseabundo.

Debido a la inconsistencia de características clínicas, se han utilizado otros tests de laboratorio adyuvantes para ayudar en el diagnóstico de IAI. Éstos incluyen: medición de la proteína C reactiva o defensinas de neutrófilos de la madreles (US 597 2594), examen directo de los leucocitos o bacterias en tinción de Gram del líquido amniótico, cultivo del líquido amniótico, medición de las concentraciones de glucosa del líquido amniótico, detección de leucocito esterasa del líquido amniótico, detección de ácidos orgánicos bacterianos mediante cromatografía gas-líquida, mediciones de varias citoquinas (por ejemplo, interleuquinas 2, 4, 6, factor estimulante de colonias de granulocitos, y factor \alpha de necrosis tumoral) del líquido amniótico o vaginales, metaloproteinasa-9 de matriz, lactoferrina, y valoración de la actividad fetal (perfil biofísico) mediante ultrasonografía. La medición de las citoquinas u otros factores bioquímicos es cara, generalmente no está disponible clínicamente, y es principalmente una herramienta de investigación. Además, la eficacia de verificación de estos tests no ha sido sistemáticamente mejor que tests tradicionales más fácilmente disponibles, tales como tinción de Gram y cultivo de líquido amniótico, concentraciones de glucosa en el líquido amniótico y detección de la leucocito esterasa del líquido amniótico. La eficacia de estos tests se han revisado anteriormente de manera amplia. (Ohlsson, A. y Wang, E.: An analysis of antenatal tests to detect infection at preterm rupture of the membranes. American Journal of Obstetrics and Gynecology 162:809, 1990). Aunque todos tienen una sensibilidad, especificidad y valor predictivo razonables, ninguno es suficientemente sensible o especifico para ser utilizado independientemente de las características clínicas en el diagnóstico de IAI.

Por consiguiente, existe una gran necesidad para nuevas estrategias que permitan un diagnóstico precoz y preciso de IAI y otras afecciones patológicas de la madreles/fetales.

Es particularmente deseable el desarrollo de nuevos métodos no invasivos que sean eficaces y fiables para el diagnóstico de aneuploidía cromosómica. En la actualidad, el diagnóstico definitivo de aneuploidía cromosómica después del cribado ("screening") del suero de la madre y ultrasonidos requiere una amniocentesis genética a mitad del trimestre. Esto es un proceso invasivo asociado con un riesgo del 0,5% de la pérdida del feto. Además, el análisis cromosómico de las células del líquido amnióticos un procedimiento laborioso y largo, que tarda hasta 2 semanas. Por lo tanto, son necesarios tests fiables para mejorar la detección de aneuploidía cromosómica del suero de la madre, u otros fluidos biológicos, reducir la tasa inaceptablemente elevada de falsos positivos del "screening de la madre" y aumentar la velocidad y la eficacia del diagnóstico del líquido amniótico después de la amniocentesis. Otras afecciones patológicas aneuploídicas, tales como el síndrome de Klinefelter y el síndrome de Turner, se pueden pasar completamente por alto mediante el "screening" con ultrasonografía o "screening" convencional de suero de la
madre.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona métodos no invasivos y sensibles para el diagnóstico precoz, pronóstico, y monitorización de las afecciones patológicas fetales/de la madres, mediante en análisis proteómico de fluidos bio-
lógicos.

En la presente invención se describen perfiles proteómicos de fluidos biológicos, tales como el líquido amniótico y el suero de la madre, que permite el diagnóstico, pronóstico y monitorización de varias afecciones patológicas fetales/de la madres, incluyendo, sin limitación, infección intra-amniótica (IAI), aneuploidía cromosómica y enfermedades fetales asociadas con el crecimiento y la maduración fetal, en particular perfiles proteómicos normales y patológicos para IAI. La determinación del perfil proteómico normal es de gran importancia, ya que permite la eliminación de la afección fetal/de la madre en cuestión (diagnóstico negativo), que elimina la necesidad de someter el paciente a un tratamiento o intervención innecesaria y potencialmente peligrosa.

La presente invención proporciona además biomarcadores específicos para la presencia y estado de IAI,, los cuales se expresan de manera diferencial en fluidos biológicos, tales como el líquido amniótico o el suero de la madrel, cuando dichas afecciones patológicas están presentes. Dichos biomarcadores y anticuerpos que se unen a dichos biomarcadores, que se pueden presentar, por ejemplo, en grupos de proteínas o anticuerpos, son útiles en ensayos de diagnóstico sencillos no invasivos.

En la presente invención se describe un método para determinar el estado de una afección de la madre o fetal, que comprende comparar el perfil proteómico de una muestra de prueba de un fluido biológico obtenido de un sujeto mamífero con el perfil proteómico de una muestra normal, o un perfil proteómico de referencia que comprende por lo menos un patrón de expresión único característico de dicha condición.

En una realización de este método, el sujeto mamífero es una hembra preñada, preferiblemente primate o humana.

Se puede utilizar cualquier fluido biológico en la realización del método de la presente invención, incluyendo, sin limitación, líquido amniótico, suero, plasma, orina, fluido cerebroespinal, leche de mama, moco, y saliva, preferiblemente líquido amniótico o suero de la madre.

En una realización adicional, el perfil proteómico de la muestra de prueba comprende información de por lo menos 2 proteínas, 40 o por lo menos 5 proteínas, o por lo menos 10 proteínas, o por lo menso 20 proteínas, o por lo menos 50 proteínas.

En una realización específica, el perfil proteómico es un espectro de masas.

En otra realización, el espectro de masas comprende por lo menos un patrón de expresión único en el intervalo de 3 a 5 kDa del espectro de masas.

En aún otra realización, el espectro de masas comprende por lo menos un patrón de expresión único en el intervalo de 12 kDa del espectro de masas.

En una realización adicional, la afección de la madre es la infección intra-amniótica, y el patrón de expresión único en un máximo extra en el intervalo de peso molecular de 10 a 11 kDa en la muestra de prueba, que es indicativo de la infección intra-amniótico.

En una realización diferente, el perfil proteómico se produce mediante análisis de transferencia Western.

En otra realización, el fluido biológico es el de un humano, y el perfil proteómico incluye información de la expresión de una o más de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos, lipocalina asociada con neutrófilo gelatinasa, mieloperoxidasa; L-plastina; azurocidina; proteína antibacteriana FALL-39; proteína variante Gp340; homólogo de la proteína de la glándula salivar de Ebner (GenBank No., de Acceso. 355392); inhibidor de la leucocito elastasa; calgranulina A; calgranulina B; cofilina; moesina; profilina I; proteína p57 de tipo cronina; annexina II; fibronectina; nexina derivada glial; antitrombina-III; antígeno 1 del carcinoma de células escamosas; antígeno 2 del carcinoma de células escamosas; serpina 12; cistatina A; cistatina B; cistatina C; IGFBP-1; proteína de unión a vitamina D; apolipoproteína A-I; proteína sigma 14-3-3; proteína zeta/delta 14-3-3; gelsolina; lactotransferrina; fosfoglicerato quinasa 1; fosfoglicerato mutasa 1; y transquetolasa; o un fragmento, precursor o variante natural de las mismas.

En una realización adicional, el perfil proteómico incluye información de la expresión de una o más de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos, lipocalina asociada con neutrófilo gelatinasa, mieloperoxidasa; L-plastina; azurocidina; proteína antibacteriana FALL-39; inhibidor de la leucocito elastasa; calgranulina A; calgranulina B; profilina I; nexina derivada glial; serpina 12; cistatina A e IGFBP-1; o un fragmento, precursor o variante natural de las mismas.

El método anterior es adecuado para el diagnóstico de varias afecciones fetales y de la madres, incluyendo, sin limitación, la infección intra-aminiótica.

Si el perfil proteómico de la muestra de prueba es esencialmente el mismo que el perfil proteómico de la muestra normal, se determina que el sujeto está libre de la afección de la madre o fetal.

Si el perfil proteómico contiene esencialmente el mismo patrón de expresión único que una muestra con la enfermedad, se diagnostica al paciente con la correspondiente afección de la madre o fetal.

En la presente invención se describe un método para el diagnóstico de la afección intra-aminótica, que comprende (a) comparar el perfil proteómico de una muestra de prueba de un fluido biológico obtenido de un mamífero hembra preñada con el perfil proteómico de una muestra normal, o un perfil proteómico de referencia, en el que los perfiles proteómicos proporcionan información de la masa de las proteínas presentes en las muestras, o los fragmentos proteóliticos de las mismas; y (b) diagnosticar al mamífero con la infección intra-aminótica si el perfil proteómico de la muestra de prueba muestra un patrón de expresión único en el intervalo de pesos moleculares de 3-5 y/o
10-12 KDa.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de la infección intra-aminiótica en un sujeto hembra preñada, que comprende:

(a) producir un perfil proteómico de una muestra de prueba de un fluido biológico obtenido de dicho sujeto; y

(b) diagnosticar una infección intra-amniótica en dicho sujeto, si dicho perfil proteómico comprende un patrón de expresión único en relación con el perfil proteómico de una muestra normal, en el que el patrón de expresión único contiene información de por los menos IGFBP-1 o un fragmento, precursor o una variante natural de la misma, y calgranulina, o un fragmento, precursor o variante natural de la misma.

En otra realización, la L-plastina se subexpresa en la muestra de prueba en relación a la muestra normal.

En aún otra realización, la presencia de IGFBP-1 se detecta mediante la identificación del fragmento proteolítico mostrado en la figura 12, o un fragmento del mismo.

En la presente invención se describe un perfil proteómico de un fluido biológico que comprende la información de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos; lipocalina asociada con neutrófilo gelatinasa; mieloperoxidasa; L-plastina; azurocidina; proteína antibacteriana FALL-39; inhibidor de la leucocito elastasa; calgranulina A; calgranulina B; profilina I; nexina derivada glial; serpina 12; cistatina A e IGFBP-1; o un fragmento, precursor o variante natural de las mismas.

En la presente invención se describe un perfil proteómico de un fluido biológico característico de la infección intra-amniótica, que comprende información que confirma la presencia de una proteína seleccionada del grupo que consiste en IGFB-1, profilina, ceruloplasmina, L-plastina, y calgraulina.

En la presente invención se describe un perfil proteómico de infección intra-amniótica representada en una forma que proporciona información del peso molecular de proteínas presentes en el fluido biológico, o los fragmentos proteolíticos de las mismas, que comprende un patrón de expresión único en el rango de pesoso moleculares de 3-5 KDa y/o 10-12 KDa.

En la presente invención se describe el perfil proteómico esencialmente tal como se muestra en cualquiera de las figuras 1A-1C, o esencialmente tal como se muestra en cualquiera de las figuras 2A-C, o esencialmente tal como se muestra en cualquiera de las figuras 3A-C, o esencialmente tal como se muestra en las figuras 4A ó 4B, o esencialmente tal como se muestra en cualquiera de las figuras 6-10.

En una realización particular, el perfil proteómico se analiza en formato de microarray.

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Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-C. Expresión diferencial de proteínas inducida por la infección en el líquido amniótico de primate. El análisis por SELDI-TOF de extractos de líquido amniótico unidos a arrays de chips de Fase Normal definidos químicamente. A) Espectro completo de recogida a una intensidad de láser de 235 nm que muestra las diferencias en las intensidades máximas. B) Espectro detallado que muestra las diferencias aproximadamente en la región de 10 a 12 KDa entre control e infectada. C) Espectro detallado que muestra las diferencias aproximadamente en la región de 3 a 5 KDa entre control e infectada. Las líneas continuas se utilizaron para mostrar las diferencias significativas en la expresión (patrones de expresión únicos) que se podrían utilizar para desarrollar tests de
diagnóstico.

Figuras 2A-C. Análisis con el tiempo del líquido amniótico de primate en respuesta a la infección (GBS). El líquido amniótico se recogió antes de la inoculación de las bacterias y en serie después de la inyección y se sometió a análisis SELDI-TOF tal como se ha descrito anteriormente. Figura 2 A: antes de la infección; 2B: 12 horas después de la infección; 2C: 36 horas después de la infección.

Figuras 3A-C. Expresión diferencial de proteínas inducida por la infección en el líquido amniótico humano. Análisis SELDI-TOF de extractos de líquido amniótico unidos a arrays de chips de Fase Normal definidos químicamente. A) Espectro completo de recogida a una intensidad de láser de 235 nm que muestra las diferencias en las intensidades máximas. B) Espectro detallado que muestra las diferencias aproximadamente en la región de 10 a 12 KDa entre control e infectada. C) Espectro detallado que muestra las diferencias aproximadamente en la región de 3 a 5 KDa entre control e infectada.

Figuras 4A y 4B. Espectro de masas obtenido en un espectrómetro de masas MALDI-TOF genérico, utilizando líquido amniótico de control A) humano, sin infección intrauterina y B) muestra, sin infección intrauterina.

Figura 5. Gel de SDS-PAGE teñido con Azul de Coomassie. A) 4 muestras AF de control humano agrupadas; B) muestra AF de control individual; C) 4 muestras AF infectadas humanas agrupadas; D) muestra AF infectada individual.

Figura 6. Detección de la expresión diferencial de proteínas en el líquido amniótico humano. A) Muestra AF de control (agrupada); B) Muestra AF infectada (agrupada).

Figura 7. Detección de la expresión diferencial de proteínas en el líquido amniótico humano. A) Muestra AF de control (agrupada); B) Muestra AF infectada (agrupada).

Figura 8 muestra la detección de la expresión diferencial de proteínas en el líquido amniótico humano y suero de la madrel. A) Muestra de control (agrupada); B) muestra infectada (agrupada).

Figura 9 muestra la detección de proteínas expresadas de manera diferencial en suero de la madre utilizando arrays de proteínas. 1) Imagen medio en color del array de proteínas que muestra la unión de las proteínas correspondientes con sus anticuerpos; 2) área ampliada del array; 3) transferencia Western de calgranulina IP.

Figura 10 muestra patrones de expresión diferencial de proteínas en el suero de la madre con perfiles únicos para diferencias trisomías.

Figura 11. Representación esquemática de la identificación de secuencias de proteínas de novo de proteínas del líquido amniótico. Profilina I PRO1_HUMAN (P07737) (SEC ID NOs: 5-11).

Figura 12. Identificación de proteínas de novo IGFBP-1 y secuencia de fragmento proteolítico (SEC ID NO: 1). Las secuencias peptídicas halladas en las muestras 0426se_H1_12 y 0425se_H1_13 con Ms/MS se muestran en minúscula (SEC ID NOs: 2 y 3). Éstas provienen de líquido amniótico infectado cuando se desarrollan en bandas de gel 1-D que se digirieron con tripsina y se sometieron a análisis MS/MS. El fragmento proteolítico de IGF-BP-1 detectado en geles 1-D (rango de peso molecular bajo, Figura 5), transferencias Western (Figura 6) y análisis MS/MS (Figura 13) de la banda de \sim10,5 a 12 KDa digerida con tripsina del líquido amniótico infectado se representa en la región de la secuencia subrayada (SEC ID NO: 4).

Figura 13. Perfil LCQ-MS de digestión por tripsina de banda de gel ID 10,5-11 kD de líquido amniótico infectado. LCQ-MS muestran iones parentales que representan potenciales proteínas presentes en la muestra.

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Figura 14. Espectro de masas para el pico de tiempo de retención 17,55-18,21 mostrado en la Figura 13.

Figura 15. Espectro MS/MS para el ion parental del pico 434,9 mostrado en la Figura 14.

Figura 16. Inmunodetección de biomarcadores para IAI. 16a) AF de primate de control (-) e infectado (+). 16b) AF humano de control (-) e infectado (+). 16c) AF de control humano (-) e infectado (+). Marcador de control no regulado de la proteína de unión a Vitamina D (VDBP). Las bandas de IGFBP-1 representan la proteína intacta (\sim30 kDa) y el fragmento proteolítico (\sim11 kDa). 16d) Detección de IGFBP1 en suero de la madre agrupado a partir de immunoprecitados. Suero de control (-) e infectado (+). 16e) Detección de calgranulina B en suero de la madre agrupado a partir de immunoprecitados. Suero de control (-) e infectado (+).

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Descripción detallada de la realización preferida A. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un técnico en la materia a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994) proporciona a un experto en la material una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

El término "proteoma" se utilice en la presente invención para describir una parte significativa de proteínas en una muestra biológica en un tiempo determinado. El concepto de proteoma es fundamentalmente diferente del de genoma. Mientras que el genoma es prácticamente estático, el proteoma cambia continuamente en respuesta a sucesos internos y externos.

El término "perfil proteómico" se utiliza para referirse a una representación del patrón de expresión de una pluralidad de proteínas en una muestra biológica, por ejemplo, un fluido biológico en un momento determinado. El perfil proteómico se puede representar, por ejemplo, como un espectro de masas, pero también se incluyen otras representaciones basadas en cualquier propiedad fisicoquímica o bioquímica de las proteínas. Por lo tanto, el perfil proteómico se puede basar, por ejemplo, en las diferencias en las propiedades electroforéticas de proteínas, determinadas mediante electroforesis en gel bidimensional, por ejemplo mediante PAGE 2-D, y se puede representar, por ejemplo, como una pluralidad de manchas en una electroforesis en gel bidimensional. Los perfiles de expresión diferencial pueden tener un valor de diagnóstico importante, incluso en ausencia de proteínas específicamente identificadas. A continuación, se pueden detectar manchas de proteína únicas, por ejemplo, mediante inmunotransferencia, manchas o proteínas múltiples utilizando microarrays de proteínas. El perfil proteómico representa o contiene habitualmente información que podría variar desde unos cuantos picos hasta un perfil complejo que representa 50 o más picos. Por lo tanto, por ejemplo, el perfil proteómico puede contener o representar por lo menos 2, o por lo menos 5 o por lo menos 10 o por lo menos 15, o por lo menos 20, o por lo menos 25, o por lo menos 30, o por lo menos 35, o por lo menos 40, o por lo menos 45, o por lo menos 50 proteínas.

El término "afección patológica" se utiliza en el sentido más amplio y cubre todos los cambios y fenómenos que comprometen el bienestar de un sujeto. Entre las afecciones patológicas de la madres se incluyen, sin limitación, infección intra-amniótica, afecciones de origen fetal o de la madrel, tales como, por ejemplo, preeclampsia, contracciones y parto prematuro. Las afecciones patológicas fetales incluyen, sin limitación, defectos cromosómicos (aneuploidía), tales como síndrome de Down, y todas las anormalidades en edad de gestación y madurez fetal.

El término "estado de una afección patológica [de la madre o fetal]" se utiliza en la presente invención en el sentido más amplio y se refiere a la ausencia, presencia, extensión, estadio, naturaleza, progresión o regresión de la afección patológica.

El término "patrón de expresión único" se utiliza para describir una única característica o motivo en el perfil proteómico de una muestra biológica (por ejemplo, una muestra de referencia) que difiere del perfil proteómico de una muestra biológica normal correspondiente (obtenida del mismo tipo de origen, por ejemplo, fluido biológico) de una manera estadísticamente diferente.

Los términos "infección intra-amniótica (IAI)", "infección del líquido amniótico", "amnionitis", y "corioamnionitis clínica" se utilizan indistintamente, y se refieren a una infección aguda, incluyendo, pero sin limitación, de tipo bacteriano, del líquido amniótico y contenidos intrauterinos durante el embarazo.

La "respuesta del paciente" se puede valorar utilizando cualquier punto final que indica un beneficio al paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, por lo menos en cierto grado, de la progresión de una afección patológica, (2) prevención de la afección patológica, (3) alivio, por lo menos en cierto grado, de uno o más síntomas asociados con la afección patológica; (4) aumento del tiempo de supervivencia tras el tratamiento; y/o (5) descenso de la mortalidad en un punto determinado de tiempo tras el tratamiento.

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El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico diana. Entre aquellos que necesitan el tratamiento se incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a padecer el trastorno o aquellos en los que debe prevenirse el trastorno.

"Malformación congénita" es una anormalidad que no es hereditaria pero que existe en el nacimiento.

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B. Descripción detallada

La presente invención se refiere a métodos y medios para un test precoz, fiable y no invasivo de afecciones de la madres y fetales en base al perfil proteómico de un fluido biológico de la madre o el feto. La presente invención utiliza técnicas proteómicas conocidas en la técnica, tal como se ha descrito, por ejemplo, en los siguientes libres de texto: Proteome Research: New Frontiers en Functional Genomics (Principles and Practice), M.R Wilkins et al., eds., Springer Verlag, 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link, editor, Humana Press, 1999; Proteome Research: Two-Dimensional Gel 35 Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud editor, Springer Verlag, 2000; Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice) P. James editor, Springer Verlag, 2001; Introduction to Proteomics, D. C. Liebler editor, Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier et al., eds., John Wiley & Sons, 2002.

Un experto en la material reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente invención, que se podrían utilizar en la práctica de la presente invención.

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1. Identificación de proteínas y polipéptidos expresados en fluidos biológicos

Según la presente invención, el análisis proteómico de fluidos biológicos se puede realizar utilizando una variedad de métodos conocidos en la materia.

Habitualmente, los patrones de proteínas (mapas del proteoma) de muestras de diferentes orígenes, tales como fluido biológico normal (muestra normal), se comparan para detectar proteínas que están sobrerreguladas o subreguladas en una enfermedad. Estas proteínas se pueden extraer a continuación para la identificación y caracterización completa, por ejemplo, utilizando la técnica de "fingerprint" de la masa de péptidos y/o espectrometría de masas y métodos de secuenciación, o se pueden utilizar el mapa del proteoma normal y/o específico de la enfermedad directamente para el diagnóstico de la enfermedad de interés o para confirmar la presencia o ausencia de la enfermedad.

En análisis comparativos, es importante tratar las muestras normales y de prueba exactamente de la misma manera, con el fin de representar correctamente la abundancia relativa de proteínas, y obtener resultados precisos. La cantidad requerida de proteínas totales dependerá de la técnica analítica utilizada y se puede determinar fácilmente por un experto en la materia. Las proteínas presentes en las muestras biológicas se separan habitualmente mediante electroforesis en gel bidimensional (2-DE) según su pI y el peso molecular. Las proteínas se separan en primer lugar por su carga utilizando enfoque isoeléctrico (electroforesis en gel unidimensional). Esta etapa se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando tiras de un gradiente inmovilizado de pH (IPG), que están disponibles comercialmente. La segunda dimensión es un análisis SDS-PAGE normal cuando la tira de IPG enfocada se utiliza como muestra. Después de una separación 2-DE, las proteínas se pueden visualizar con colorantes convencionales, como Azul de Coomassie o tinción con plata, y se transformaron en imágenes utilizando técnicas y equipamiento conocidos, tales como, por ejemplo, densitómetro Bio-Rad GS800 y software PDQUEST, ambos disponibles comercialmente. A continuación, las manchas individuales se recortan del gel, se destiñen y se someten a digestión tríptica. Las mezclas de péptidos se pueden analizar mediante espectrometría de masas (MS). Alternativamente, los péptidos se pueden separar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida capilar de alta presión (HPLC) y se pueden analizar mediante MS individualmente o bien por grupos.

Los espectrómetros de masas consisten en una fuente de iones, un analizar de la masa, un detector de iones y unidad de recogida de datos. En primer lugar, los péptidos se ionizan en la fuente de iones. A continuación, los péptidos ionizados se separan según su relación masa/carga en el analizador de masas y se detectan los iones separados. La espectrometría de masas se ha utilizado ampliamente en el análisis de proteínas, especialmente desde la invención de los métodos de ionización-desorción por láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDI-TOF) y métodos de ionización por electrospray (ESI). Existen diversos tipos del analizador de masas, incluyendo, por ejemplo, MALDI-TOF y triple o cuadrupolo-TOF, o analizador de masas atrapador de iones acoplado a ESI. Por tanto, por ejemplo, un espectrómetro de masas Q-Tof-2 utiliza un analizador de tiempo de vuelo ortogonal que permite la detección simultánea de iones a lo largo del rango completo del espectro de masas. Para más detalles, véase, por ejemplo, Chemusevich et al., J. Mass Spectrom. 36:849-865 (2001).

Si se desea, las secuencias de aminoácidos de los fragmentos peptídicos y finalmente las proteínas de las que derivan se pueden determinar mediante técnicas conocidas en el sector, tales como ciertas variaciones de la espectrometría de masas, o degradación de Edman.

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2. Afecciones Fetales-De la madres que se benefician del diagnóstico precoz y no invasivo a. Infección intra-amniótica

La infección intra-amniótica (IAI) es una infección bacteriana aguda del líquido amniótico y el contenido intrauterino durante el embarazo. Estudios prospectivos indican que la IAI tiene lugar en el 4% al 10% de todos los nacimientos (Newton, E.R., Prihoda, T.J., y Gibbs, R.S.: Logistic regression analysis of risk factors for intra-amniotic infection. Obstet. Gynecol. 73:571, 1989; Soper, D.E., Mayhall, C.G., y Dalton, H.P.: Risk factors for intraamniotic infection: a prospective epidemicologic study. America Journal of Obstetrics and Gynecology 161:562, 1989; y Lopez-Zeno, J.A., Peaceman, A.M., Adashek, J.A., y Socol, M.L.: A controlled trial of a program for the active management of labor. N. Engl. J. Med. 326:450, 1992). Otros términos utilizados para describir la IAI incluyen la infección del líquido amniótico, amnionitis, y corioamnionitis clínica. La infección intra-aminótica se diagnostica clínicamente mediante fiebre de la madre, hinchazón uterina, leucocitosis, y taquicardia fetal y debe diferenciarse de la corioamnionitis histológica. La infección intra-amniótica es una causa importante de la morbilidad de la madre y neonatal. La infección intra-amniótica representa el 10-40% de los casos de morbilidad febril en el periodo del periparto y está asociada con el 20-40% de los casos sepsis neonatal temprana y pneumonia (Newton, E.R.: Chorioamnionitis and intraamniotic infection. Clin. Obstet. Gynecol. 36:795, 1993). La bacteremia de la madre aparece en el 2-6% de pacientes con IAI y aumenta la morbilidad infecciosa postparto. Existe también un riesgo elevado de parto disfuncional y nacimiento por cesárea entre los pacientes con IAI. Duff et al. observaron un 75% de incidencia de parto disfuncional y un 34% de incidencia de parto disfuncional y un 34% de incidencia de nacimiento por cesárea entre los pacientes que desarrollaron la infección intra-amniótica en el parto (Duff, P., Sanders, R., y Gibbs, R.S.: The course of labor in term pregnancies with chorioamnionitis. American Journal of Obstetrics and Gynecology 147:391, 1983). La infección intra-amniótica también está asociada con el aumento de la morbilidad y mortalidad neonatal, particularmente entre los neonatos prematuros. En general, existe un aumento de tres a cuatro veces en la mortalidad perinatal ente neonatos con un peso bajo al nacer de madres con IAI (Gibbs, R.S., Castillo, M.A., y Rodgers, P.J.: Management of acute chorioamnionitis. American Journal of Obstetrics and Gynecology 136:709, 1980; Gilstrap, L.C., III, Leveno, K.J., Cox, S.M., Burris, J.S., Mashburn, M., and Rosenfeld, C.R.: Intrapartum treatment of acute chorioamnionitis: impact on neonatal sepsis. Am. J. Obstet. Gynecol. 159:579, 1988). También existen aumentos en el syndrome de dificultad respiratoria, hemorragia intraventricular, y sepsis neonatal (Morales, W.J.: The effect of chorioamnionitis on the developmental outcome of preterm infants at one year. Obstetrics and Gynecology 70:183, 1987). Recientemente, se ha observado la implicación de la IAI en la leucomalacia periventricular neonatal y paralysis cerebral; los riesgos de daño en la sustancia blanca cerebral y parálisis cerebral son nueve veces superiores en el establecimiento de la infección intra-amniótica Bejar, R., Wozniak, P., Allard, M., Benirschke, K., Vaucher, Y., Coen, R., Berry, C., Schragg, P., Villegas, I., y Resnik, R.: Antenatal origin of neurologic damage in newborn infants. I. Preterm infants. Am. J. Obstet. Gynecol. 159:357, 1988; Grether, J. K. and Nelson, K. B.: De la madrel infection and cerebral palsy in infants of normal birth weight. JAMA 278:207, 1997). Finalmente, se ha observado que la IAI subclínica en por lo menos el 10% de mujeres en parto prematuro con membranes fetales intactas, lo que sugiere que la IAI es una causa importante, y potencialmente evitable, de premadurez (Romero, R., Avila, C., Brekus, C.A., y Morotti, R.: The role of systemic and intrauterine infection in preterm parturition. Annuals of the New York Academy of Sciences 622:355, 1991). Un revision por Newton de la literatura demostró incidencias de IAI clínica del 41% en edades gestacionales inferiores a 27 semanas, 15% en edades gestacionales de 27-37 semanas, y 2% en edades gestacionales de 38 semanas o superior (Newton et al., supra). También se recuperaron del líquido amniótico bacterias naturales en el tracto genital inferior en el 10-20% de todas las mujeres con parto prematuro con membranas fetales intactas sin signos clínicos de infección intraamniótica (Romero et al., supra), y en hasta un 67% de mujeres con parto prematuro con gestaciones que acabaron a las 23-24 semanas (Watts, D. H., Krohn, M. A., Hillier, S. L., y Eschenbach, D. A.: The association of occult amniotic fluid infection with gestational age and neonatal outcome among women in preterm labor. Obstet Gynecol 79: 351, 1992). La mayoría de estas pacientes dan a luz rápidamente y en muchas se desarrolla una IAI clínicamente evidente. Estas observaciones refuerzan la hipótesis de que el aumento de infecciones intrauterinas inicialmente subclínicas preceden a un parto prematuro y pueden ser una causa importante de nacimientos prematuros extremos.

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b. Preeclampsia

La preeclampsia, definida como hipertensión de la madrel acompañada por proteinuria, edema, o ambos, aparece en el 7% de los embarazos que no terminan en el primer trimestre. Aunque la causa es desconocida, es más habitual en los extremos de edad en el nacimiento, diabetes de la madre, embarazos con gestaciones múltiples, y enfermedad renal de la madre prexistente y/o hipertensión. La preeclampsia se asocial con aumentos en la mortalidad perinatal, y también puede conducir a la eclampsia, caracterizada por convulsiones de la madre y aumento de la mortalidad de la madre. Actualmente, la base de la terapia para la preeclampsia es el nacimiento y la profilaxis anticonvulsivante con sulfato de magnesio. Antes de la llegada de la terapia con sulfato de magnesio, la mortalidad de la madre observada era del 20-30%. Sin embargo, con un diagnóstico precoz, que permite la terapia anticonvulsivante con sulfato de magnesio, anti-hipertensivos, y el nacimiento la mortalidad de la madre se ha reducido a casi cero.

Desafortunadamente, el diagnóstico de la preeclampsia en base a síntomas y señales habitualmente reconocidas es frecuentemente difícil, y aparece de manera tardía en el transcurso de la enfermedad. Frecuentemente, el compromiso fetal en el crecimiento o el bienestar es la primera manifestación reconocida de la preeclampsia. Los marcadores de laboratorio para la preeclampsia incluyen la cuantificación de la proteinuria, y las concentraciones elevadas en suero de ácido úrico o creatinina. Actualmente no existen marcadores del suero disponibles para la preeclampsia de aparición temprana o marcadores que identifiquen mujeres que desarrollarán preeclampsia. Recientemente, en un estudio se han asociado marcadores del suero prospectivos, que incluyen leptina y ácido úrico, con la preeclampsia posterior (Gursoy T, et al. Preeclampsia disrupts the normal physiology of leptin.: Am J Perinatol. 19(6):303-10, 2002), pero se necesita mucho trabajo para confirmar estos descubrimientos. El desarrollo de marcadores precoces y fiables para la preeclampsia es un imperativo para permitir la terapia e intervención con el fin de optimizar las consecuencias para el recién nacido y la madre.

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c. Parto y nacimiento prematuro

El nacimiento prematuro se define como el nacimiento antes de completar la 37ª semana de gestación. La incidencia de nacimiento prematuro en los Estados Unidos es del 10-11% de todos los nacimientos vivos, y está en aumento debido al tratamiento agresivo del parto prematuro. En general, la premadurez y sus consecuencias son responsables del 80% muertes perinatales no atribuibles a malformaciones congénitas y añaden aproximadamente 5 mil millones de dólares anuales al presupuesto de sanidad nacional. Entre los factores de riesgo para el nacimiento prematuro se incluyen raza no blanca, edad joven, baja posición socio-económica, peso de la madre por debajo de 55 kg, primeriza, sangrado durante el primer trimeste, múltiples gestaciones (Meis PJ, Michielutte R, Peters TJ, et al. Factors associated with preterm birth in Cardiff, Wales: II. Indicated and spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol 173:597-602, 1995).

Desafortunadamente, la predicción de pacientes con el riesgo de nacimiento prematuro espontáneo ha sido en general decepcionante (Creasy RK, Iams JD. Preterm labor and delivery. In De la madrel-Fetal Medicine, Creasy RK, Resnik R (eds.). W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA 4th edition, 1999. Pages 498-531). Los intentos previos por definir la población con mayor riesgo para un nacimiento prematuro y, por tanto, que se benefician potencialmente de la intervención precoz, incluían índices de valoración del riesgo, detección bioquímica de fibronectina fetal cervical, medición por ultrasonidos de la longitud cervical, y seguimiento de la actividad uterina en el hogar. Estos programas han sido costosos y se veían dificultados por la incapacidad de predecir con precisión qué pacientes se podrían beneficiar de una intervención precoz o profilaxis. Todos padecen de un escaso valor predictivo positivo de aproximadamente el 30%, con la mayoría de pacientes identificados como "con riesgo" de nacimiento en el plazo. Las intervenciones, incluyendo el tratamiento farmacológico para inhibir las contracciones uterinas, son eficaces, pero dependen del diagnóstico precoz y fiable del parto prematuro. Por tanto, son necesario marcadores precoces y fiables para identificar pacientes con mayor riesgo de un nacimiento prematuro con el fin de reducir los tremendos costes y la mortalidad y morbilidad neonatal asociadas con el nacimiento prematuro.

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d. Aneuploidía cromosómica

Las anormalidades cromosómicas son una causa frecuente de la morbilidad y mortalidad perinatal. Las anormalidades cromosómicas aparecen con una incidencia de 1 en 200 de nacimientos vivos. La causa principal de estas anormalidades es la aneuploidía cromosómica, un número anormal de cromosomas heredados de los padres. Uno de las aneuploidías cromosómicas más frecuentes es la trisomía-21 (syndrome de Down), que tiene una incidencia de 1 en 800 nacimientos vivos (Hook EB, Hamerton JL: The frequency of chromosome abnormalities detected in consecutive newborn studies: Differences between studies: Results by sex and by severity of phenotypic involvement. In Hook EB, Porter IH (eds): Population Cytogenetics, pp 63-79. New York, Academic Press, 1978). El factor de riesgo principal para la trisomía-21 es una edad de la madre superior a 35, pero el 80% de los niños con trisomía-21 nacen de mujeres menores de 35 años de edad. Otras afecciones aneuplóidicas comunes incluyen trisomías 13 y 18, síndrome de Turner y síndrome de Klinefelter.

Debido a que el 80% de niños con trisomía-21 nacen de madres menores de 35 años de edad, los programas de cribado de diagnóstico prenatal en base sólo a la edad de la madre no son eficaces. Los programas de cribado prenatal se han complementado por tanto con el cribado de suero de la madre por analitos asociados con aneuploidia cromosómica fetal, ultrasonidos o una combinación de ambas. Entre los marcadores de suero candidatos que se han utilizado ampliamente se incluyen alfa-fetoproteína (AFP), estriol no conjugado, hormona coriogonadotrófica humana (hHCG) e inhibina A. Sin embargo, con una tasa positiva de cribado del 2-5%, la tasa de detección para la trisomía 21 y otras aneuploidias ha sido decepcionante, con tasas de detección de solamente 70-86% (Cuckle H. Biochemical screening for Down syndrome. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 92(1):97-101, 2000). Además, la tasa de tests positivos verdaderos, es decir, trisomía 21 entre aquellos con un test positivo de cribado es solamente del 1-2%, dando lugar a una tasa positiva falsa global por encima del 98%.

El diagnóstico definitivo de aneuploidías cromosómicas tras el cribado del suero de la madre y ultrasonidos requiere de una amniocentesis genética a mitad del trimestre. Esto es un proceso invasivo asociado con un riesgo del 0,5% de la pérdida del embarazo. Además, el análisis cromosómico de las células del líquido amniótico es un procedimiento muy elaborado y largo, tardando hasta 2 semanas. Por lo tanto, son necesarios tests fiables para mejorar la detección de aneuploidías cromosómicas del suero de la madre, reducir la tasa de positivos falsos inaceptablemente elevados del cribado de la madre, y aumentar la velocidad y la eficacia del diagnóstico del líquido amniótico después de la amniocentesis.

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3. Diagnóstico de las afecciones de la madre/fetales utilizando el perfil proteómico de fluidos biológicos

La presente invención proporciona un método no invasivo, precoz y fiable para el diagnóstico de afecciones de la madre/fetal mediante el análisis proteómico de fluidos biológicos, tales como, por ejemplo, líquido amniótico, suero, plasma, orina, fluido cerebrospinal, leche de mama, moco o saliva.

Tal como se ha indicado anteriormente, en el contexto de la presente invención, el término "perfil proteómico" se utiliza para referirse a una representación del patrón de expresión de una pluralidad de proteínas en una muestra biológica, por ejemplo, un fluido biológico en un momento determinado. El perfil proteómico se puede representar, por ejemplo, como un espectro de masas, pero se pueden incluir otras representaciones basadas en cualquier propiedad fisicoquímica o bioquímica de las proteínas. Aunque es posible identificar y secuenciar todas o parte de las proteínas presentes en el protoma de un fluido biológico, esto no es necesario para el uso diagnóstico del perfil proteómico generado según la presente invención. El diagnóstico de una enfermedad particular se puede basar en las diferencias características (patrones de expresión únicos) entre un perfil proteómico normal y perfil proteómico del mismo fluido biológico obtenido bajo las mismas circunstancias, cuando está presente la enfermedad o afección patológica a diagnosticar. El patrón de expresión único puede ser cualquier característica o motivo único en el perfil proteómico de una muestra biológica de prueba o referencia que difiere del perfil proteómico de una muestra biológica normal correspondiente obtenida del mismo tipo de origen, de una manera estadísticamente diferente. Por ejemplo, si el perfil proteómico se presenta en forma de un espectro de masas, el patrón de expresión único es habitualmente un pico o una combinación de picos que difieren, cualitativa o cuantitativamente, del espectro de masas de una muestra normal correspondiente. Por lo tanto, la aparición de un nuevo pico o una combinación de nuevos picos en el espectro de masas, o cualquier cambio estadísticamente significativo en la amplitud o forma de un pico existente o combinación de picos existentes en el espectro de masas, se puede considerar un patrón de expresión única. Cuando el perfil proteómico de la muestra de prueba obtenida de un sujeto mamífero se compara con el perfil proteómico de una muestra de referencia que comprende un patrón de expresión único característico de una afección patológica de la madre/fetal, el sujeto mamífero es diagnosticado con dicha afección patológica si compara el patrón de expresión único con la muestra de referencia.

Una afección patológica de la madre/fetal particular se puede diagnosticar comparando el perfil proteómico de un fluido biológico obtenido del sujeto a diagnosticar con el perfil proteómico de un fluido biológico normal del mismo tipo, obtenido y tratado de la misma manera. Si el perfil proteómico de la muestra de prueba es esencialmente el mismo que el perfil proteómico de la muestra normal, se considera que el sujeto está libre de la afección patológica de la madre/fetal en cuestión. Si el perfil proteómico de la muestra de prueba muestra un patrón de expresión único en relación con el perfil proteómico de la muestra normal, se diagnostica al sujeto con la afección de la madre/fetal en cuestión.

Alternativamente o adicionalmente, el perfil proteómico de la muestra de prueba se puede compara con el perfil proteómico de una muestra de referencia, obtenida de un fluido biológico de un sujeto diagnosticado independientemente con la afección patológica de la madre/fetal en cuestión. En este caso, se diagnostica al sujeto con la afección patológica si el perfil proteómico de la muestra de prueba comparte por lo menos una característica, o una combinación de características que representan un patrón de expresión único, con el perfil proteómico de la muestra de referencia.

En los métodos de la presente invención, el perfil proteómico de una muestra biológica normal juega un importante papel de diagnóstico. Tal como se ha descrito anteriormente, si el perfil proteómico de la muestra de prueba es esencialmente el mismo que el perfil proteómico de la muestra biológica normal, se diagnostica al paciente que está libre de la afección patológica de la madrel/fetal a identificar. Este diagnóstico "negativo" es de gran importancia, ya que elimina la necesidad de someter un paciente a un tratamiento o intervención innecesarios, que podría tener potenciales efectos secundarios, o puede en cualquier caso poner a la paciente, feto, o recién nacido en riesgo. Los datos se analizan para determinar si las diferencias son estadísticamente significativas.

La sensibilidad de los métodos de diagnóstico de la presente invención se puede aumentar mediante la extracción de las proteínas halladas tanto en proteoma normal como enfermo en esencialmente los mismos niveles de expresión (proteínas comunes, tales como albúmina e inmunoglobulinas) antes del análisis utilizando métodos de convencionales de separación de proteínas. La extracción de dichas proteínas comunes, que no son parte del patrón de expresión único, da lugar a una mejor sensibilidad y precisión del diagnóstico. Alternativamente o adicionalmente, los patrones de expresión de las proteínas comunes se pueden eliminar (o se pueden eliminar señales) durante el análisis computerizado de los resultados, utilizando habitualmente algoritmos de selección espectral, que están dirigidos a máquinas, para realizar diagnósticos. Los resultados detallados en los siguientes ejemplos presentan perfiles proteómicos característicos de infección intraamniótica (IAI) que difieren del perfil proteómico normal del líquido amniótico de una manera estadísticamente significativa. Además, los Ejemplos presentan marcadores de expresión y patrones de expresión únicos característicos de IAI y el síndrome de Down, respectivamente.

Los métodos estadísticos para comparar perfiles proteómicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el caso de un espectro de masas, el perfil proteómico es definido por los valores de amplitud del pico en las posiciones clave masa/carga (M/Z) a lo largo del eje horizontal del espectro. Por consiguiente, un perfil proteómico característico se puede caracterizar, por ejemplo, por un patrón formado por la combinación de amplitudes espectrales a valores M/Z determinados. La presencia o ausencia de un patrón de expresión característico, o la identidad sustancial de dos perfiles se pueden determinar mediante el emparejamiento del perfil proteómico (patrón) de una muestra de prueba con el perfil proteómico (patrón) de una muestra de referencia o normal, con un algoritmo apropiado. Se describe un método estadístico para analizar patrones proteómicos, por ejemplo, en Petricoin III, et al., The Lancet 359:572-77 (2002); Issaq et al., Biochem Biophys Commun 292:587-92 (2002); Ball et al., Bioinformatics 18: 395-404 (2002); and Li et al., Clinical Chemistry Journal, 48:1296-1304 (2002).

En una realización particular, se aplica una muestra obtenida del paciente a un chip de proteínas, se genera un patrón proteómico mediante espectrometría de masas. El patrón de los picos en el espectro se puede analizar mediante software bioinformático adecuado, tal como se ha descrito anteriormente.

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4. Ensayos de cribado ("screening")

El perfil proteómico descrito en la presente invención son además útiles en ensayos de cribado para identificar candidatos de fármacos para el tratamiento de una afección de la madrel/fetal particular. Dichos ensayos de cribado se basan en la capacidad de una molécula de prueba para convertir un perfil proteómico que contiene un patrón de expresión característico de la afección de la madrel/fetal a tratar en un perfil proteómico desprovisto del patrón de expresión. En una realización particular, se ensaya la capacidad del compuesto de prueba para convertir un perfil de expresión patológico en un perfil de expresión normal. En otra realización, el ensayo de cribado analiza la capacidad de un compuesto de prueba para convertir un patrón de expresión único característico de una afección patológica en un patrón de expresión normal correspondiente. Dichos ensayos de cribado se pueden realizar in vitro mediante el tratamiento de una muestra biológica enfermedad y la comparación de los perfiles de expresión proteómicos antes y después del tratamiento. Alternativamente o adicionalmente, el cribado de fármacos se puede realizar mediante el tratamiento de un animal de laboratorio que muestra la afección patológico diana de la madre/fetal con un compuesto de prueba, tomando muestras de un fluido biológico del animal antes y después del tratamiento, y comparación del perfil proteómico de las dos muestras. En este ensayo, también se pueden tomar muestras de fluido biológico en varios puntos de tiempo después del tratamiento, y seguir la evolución con el tiempo del tratamiento. Estas metodologías se pueden aplicar también para caracterizar la toxicología de agentes farmacéuticos, así como identificar candidatos óptimos para terapias específicas.

Los compuestos de prueba pueden ser, por ejemplo, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas que no son péptidos, proteínas, polipéptidos, anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos), moléculas antisentido, oligonucleótidos señuelo, y cualquier otro tipo de molécula que haya sido utilizada previamente como fármaco o candidato a fármaco.

El fluido biológico puede ser, por ejemplo, líquido amniótico, suero (por ejemplo, suero de la madre), plasma, orina, fluido cerebroespinal, leche de mama, moco o saliva.

Los compuestos terapéuticamente activos identificados se pueden formular en formulaciones farmacéuticas convencionales. En Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA se encuentra un compendio de formulaciones conocidas en la técnica. La referencia a este manual es habitual en la técnica.

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5. Arrays de proteínas y anticuerpos

Tanto los ensayos de diagnóstico como de cribado descritos anteriormente se pueden realizar utilizando arrays de proteínas. En los últimos años, los arrays de proteínas han ganado un amplio reconocimiento como un medio potente para detectar proteínas, hacer el seguimiento de sus niveles de expresión e investigar las interacciones y funciones de las proteínas. Permiten un análisis de proteínas con alto rendimiento cuando se realizan muchas determinaciones de manera simultánea, utilizando medios automáticos. En el formato de microarray o chip, que se desarrolló originalmente para arrays de ADN, dichas determinaciones se llevan a cabo con un uso mínimo de materiales generando grandes cantidades de datos.

Aunque el análisis del proteoma mediante electroforesis en gel 2D y espectrometría de masas, tal como se ha descrito anteriormente, es muy eficaz, no siempre proporciona la sensibilidad elevada necesaria y esto podría implicar la pérdida de muchas proteínas que se expresan con una abundancia baja. Los microarrays de proteínas, además de su elevada eficacia, proporcionan una mejor sensibilidad. Los arrays de proteínas se forman mediante la inmovilización de proteínas sobre una superficie sólida, tal como vidrio, micropocillos, nitrocelulosa, membranas de PVDF, y microgránulos, utilizando una serie de químicas de unión covalentes y no covalentes bien conocidas en la técnica. El soporte sólido debería ser químicamente estable antes y después del procedimiento de acoplamiento, permitir una buena morfología del "spot", mostrar una unión no específica mínima, no debería contribuir a ruido de fondo en los sistemas de detección, y debería ser compatible con los diferentes sistemas de detección.

En general, los microarrays de proteínas utilizan los mismos métodos de detección utilizados habitualmente para la lectura de arrays de ADN. De manera similar, se utiliza la misma instrumentación para la lectura de microarrays de ADN es aplicable a los arrays de proteínas.

Por tanto, los arrays de captura (por ejemplo, arrays de anticuerpos) se pueden sondar con proteínas marcadas de manera fluorescente a partir de dos fuentes, tales como fluidos biológicos normales y enfermos. En este caso, la lectura se basa en el cambio en la señal fluorescente como reflejo de los cambios en el nivel de expresión de una proteína diana. Entre las lecturas alternativas se incluyen, sin limitación, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, resonancia de plasmón de superficie, amplificación de ADN enrollado en círculo, espectrometría de masas, dispersión de luz por resonancia, y microscopía de fuerza atómica.

Para más detalles, véase, por ejemplo, Zhou H, et al., Trends Biotechnol. 19:S34-9 (2001); Zhu et al., Current Opin. Chem. Biol. 5:40-45-(2001); Wilson and Nock, Angew Chem Int Ed Engl 42:494-500 (2003); and Schweitzer and Kingsmore, Curr Opin Biotechnol 13:14-9 (2002). Arrays de biomoléculas también se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6,406,921, concedida el 18 de junio de 2002.

Detalles adicionales de la presente invención serán evidentes a partir de los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo 1

Protocolos generales Modelo de infección intraamniótico en primate

Este protocolo fue aprobado por el Institutional Animal Care Utilization Committee del Oregon National Primate Research Center, y se siguieron las directrices para el tratamiento humano. Diecinueve monas rhesus preñadas (Macaca mulatta) con gestaciones controladas en el tiempo se caterizaron de forma crónica y se mantuvieron postoperativamente tal como se ha descrito previamente (Haluska GJ, et al., Temporal changes in uterine activity and prostaglandin response to RU 486 in rhesus macaques in late gestation., Am J Obstet Gynecol 157: 1487-95 (1987); and Gravett MG, et al., An experimental model for intraamniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys. Am J Obstet Gynecol 171: 1660-7 (1994)).

Brevemente, aproximadamente en el día 110 de gestación (el parto es a los 167 días) los animales preñados se acondicionaron a un sistema de carcasa y unión. (Ducssay CA, et al., Simplified vest and tether system for maintenance of chronically catheterized pregnant rhesus monkeys. Lab. Anim Sci 38:343-4 (1988)). Después del acondicionamiento, se realizó una cirugía intrauterina entre los días 119 y 126 de gestación bajo anestesia general. Se implantaron de forma quirúrgica catéteres arteriales y venosos para la madre, catéteres arteriales y venosos para el feto, dos catéteres intramanióticos de extremos abiertos, electrodos electromiográficos miometriales, y electrodos electromiográficos fetales. Todos los animales recibieron sulfato de terbutalina (1 mg de forma intravenosa durante 3 a 5 horas dos veces de manera diaria) durante 1 a 5 días después de la operación quirúrgica para controlar la irritabilidad uterina. Los animales también recibieron cefazolina (250 mg de manera intravenosa cada 12 horas), que se interrumpió por lo menos 48 horas antes de la inculación de bacterias.

Después de la estabilización postoperativa durante 8 a 13 días (día 126 a 138 de la gestación), se estableció una infección intraamniótica (IA) experimental mediante inoculación intraamniótica de a) 106 unidades formadoras de colonias (cfu) de estreptococos del Grupo B, tipo III, suspendidos en solución salina (n=7), b) 107 cfu de Ureaplasma parvum (antiguamente Ureaplasma urealyticum, serovar 1) suspendida en medio 10B (n=6), o c) 106-107 cfu de Mycoplasma hominis (n=6), suspendida en solución salina tamponada con fosfato con sacarosa al 10% y suero de ternera fetal sin endotoxinas. El aislado de estreptococos del Grupo B se recuperó originalmente de un recién nacido con meningitis. El Ureaplasma parvum era de un aislado clínico con un pasaje bajo de placenta y membranas de un paciente con corioamnionitis y sepsis neonatal. El Mycoplasma hominis era un aislado endometrial de un paciente con endomemiometritis postpartum.

Las muestras de líquido amniótico se recogieron en serie de todos los animales durante el periodo de estudio (diariamente antes de la inoculación y cada 4 a 12 horas después de la inoculación) para cultivos bacterianos cuantitativos, análisis de glóbulos blancos mediante hemocitómetro, y concentraciones de citoquinas y prostaglandina (previamente descrito - Gravett MG, et al., An experimental model for intraamniotic infection and preterm labor in rhesus monkeys. Am J Obstet Gynecol 171: 1660-7 (1994)), y para análisis proteómico.

Se registraron de manera continua la actividad electrocardiográfica fetal y uterina (presión electromiográfica e intramniótica) desde la intervención quirúrgica hasta el nacimiento. Se registró la contractilidad uterina como e área bajo la curva de contracción por hora y se expresó como el área de contracción por hora (HCA) en milímetros de mercurio por segundos/hora.

El cuello del útero de la madre se palpó vaginalmente antes de la infección y regularmente después de la misma. Se registraron en cada examen la consistencia, el borramiento y la dilatación. Después del nacimiento, mediante sección por cesárea en todos excepto un animal y vaginalmente en un animal, se obtuvieron cultivos de bacterias fetales, deciduales, de la placenta y de intermembrana para confirmar la infección y se realizaron estudios patológicos para documentar la corioamnionitis.

La infección se estableció rápidamente tras una inoculación intramaniótica realizada tal como se ha descrito anteriormente. La contracitilidad uterina que aumentó los niveles basales de 100 a más de 10.000 mm Hg x s/h apareció en un promedio de 33 \pm 9 horas después de la inoculación con estreptococos del Grupo B, en 43 \pm 14 horas después de la inoculación con Ureaplasma parvum; y en 62 \pm 14 horas después de la inoculación con Mycoplasma hominis. Las contracciones uterinas condujeron a una dilatación cervical progresiva y borramiento en todos los casos. Los incrementos en la contractilidad uterina estaban precedidos de aumentos significativos en las citoquinas proinflamatorias TNF-alfa, IL-1\beta, IL-6, e IL-8, y prostaglandinas E_{2} y F_{2\alpha}, tal como se ha descrito previamente (Gravett et al., Am J. Obstet Gynecol 171:1660-7 (1994)). Ninguno de los animales demostró señales clínicas de IAI antes del inicio del parto. Se confirmó corioamnionitis en todos los casos.

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Estudio humano (IAI Subclínica en mujeres)

La población de estudio se extrajo de 309 mujeres admitidas en una parto prematuro de 22 a 34 semanas de gestación con membranas fetales intactas se trasladó a la University of Washington Medical Center u hospitales asociados en Seattle entre el 25 de junio de 1991 y el 30 de junio de 1997, tal como se ha descrito previamente (Hitti J, et al., Amniotic fluid tumor necrosis factor-a and the risk of respiratory distress syndrome among preterm infants. Am J Obstet Gynecol 177:50-6 (1997)). Todas las mujeres dieron su consentimiento y se aprobó el protocolo del estudio por el Institutional Review Boards para todos los hospitales participantes. Todas las participantes presentaban membranas fetales intactas en el ingreso. El parto prematuro se definió como contracciones uterinas regulares en una frecuencia \leq 10 minutos con un cambio cervical registrado o una dilatación cervical > 1 centímetro o borramiento de
> 50%.

La IAI subclínica se definió por un cultivo microbiano de AF positivo y/o una concentración de interleuquinas 6 (IL-6) de AF > 2 ng/ml, evidencia histológica de chorioamnionitis (definida por la presencia de \geq 10 leucocitos polimorfonucleares por campo a 400X en 10 campos nanoadyacentes y la ausencia de turgencia uterina o fiebre. Se ha descrito previamente que una concentración de IL-6 de AF > 2 ng/ml se encontraba en el 75º percentil o superior para la población completa del estudio y se asoció con la detección de bacterias mediante reacción en cadena de la polimerasa (Hitti et al., Clin Infect Dis 24:1228-32 (1997)). Se excluyeron las mujeres con una dilatación cervical > 4 centímetros o membranas rotas en la admisión. Las mujeres con una gestación múltiple, cerclaje cervical, placenta previa, abruptio placentae, diabetes, hipertensión, y preclampsia se consideraron como aceptables si cumplían los criterios del estudio.

Se realizó una amniocentesis transabdominal bajo una guía de ultrasonidos a todas las participantes del estudio y también se recogió sangre venosa de la madre mediante una punción en vena en el momento del ingreso. A partir de esta población de estudio, se identificó de manera retrospectiva un subgrupo (Tablas 1A y B) para el análisis proteómico tal como se indica aquí. Este subgrupo incluía tres grupos de 11 pacientes cada uno: Grupo I - paciente con evidencia de IAI subclínica tal como se ha definido anteriormente; Grupo I - a un subgrupo elegida al azar de pacientes sin infección intrauterina registrada, pero con nacimiento prematuro \leq 34 semanas de gestación, y Grupo III - pacientes sin infección y con parto prematuro sensible a terapia tocolítica que nació posteriormente próximo al momento del parto (a > 35 semanas de gestación). No hubo diferencias en la edad, raza o paridad de la madre entre estos tres grupos (Tablas 1A y B). Sin embargo, se observó que pacientes con infección intrauterina a una edad gestacional algo más temprana en el inicio (p = 0,10) y que dieron a luz a una edad de gestación significativamente más temprana que aquellas pacientes con nacimiento prematuro sin infección o aquellas con nacimiento en su momento (27,3 \pm 0,9 semanas versus 29,8 \pm 1,0 y 37,0 \pm 0,9 semanas, respectivamente, p < 0,0001). Además, aquellas con infección intrauterina presentaron un ingreso significativamente más corto hasta el intervalo del nacimiento (2,1 \pm 5,6 días, en comparación con 8,4 \pm 6,3 días y 46,9 \pm 5,6 días para los otros dos grupos, p < 0,0001). El noventa y uno por cierto de aquellas con infección intrauterina dieron a luz antes de siete días desde el ingreso. Las muestras se guardaron a -20ºC hasta el análisis y no se descongelaron más de dos veces.

Entre los once pacientes con infección, se recuperaron microorganismos de cuatro (2 con Escherichia coli, 1 con Candida albicans; y 1 con anarobios mixtos); todos estos pacientes dieron a luz en menos de siete días. Otros siete pacientes se identificaron en base a las concentraciones de IL-6 en el líquido amniótico de más de 2.000 pg/ml. La concentración de interleuqina-6 promedio de líquido amniótico fue de 27,7 \pm 7,8 ng/ml entre estos pacientes, en comparación con 0,68 \pm 0,20 ng/ml entre aquellas con un nacimiento prematuro sin infección y 0,25 \pm 0,13 ng/ml entre aquellas con un parto prematuro y nacimiento prematuro (p < 0,01). Tabla 1A. Características de la Población de Estudio.

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Datos expresados como la desviación estándar de la media. Análisis mediante ANOVA para datos continuos y Chi-cuadrado para datos categóricos. Abreviaturas: PMD, nacimiento prematuro < 35 semanas; IUI, infección intrauterina; PML, parto prematuro sin nacimiento.

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TABLA 1B Resultados de screening

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En las tablas anteriores, los datos se expresan como la desviación estándar de la media. Análisis mediante ANOVA para datos continuos y Chi-cuadrado para datos categóricos. Abreviaturas: PMD, nacimiento prematuro < 35 semanas; IUI, infección intrauterina; PML, parto prematuro sin nacimiento.

TABLA 1C Valores de significancia del Test de Fisher para cribar los resultados del test

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De cuatro de las once pacientes con IAI oculta se habían recuperado microorganismos (2 con Escherichia coli, 1 con Candida albicans y 1 con anaerobios mixtos). Los otros siete pacientes con infección se identificaron en base a las concentraciones de IL-6 en AF notablemente elevadas > 2 ng/ml. La concentración de IL-6 en AF promedio era de 27,7 \pm 7,8 ng/ml entre estas pacientes, en comparación con 0,68 \pm 0,20 ng/ml entre aquellas con un nacimiento prematuro sin infección y 0,25 \pm 0,13 ng/ml entre aquellas en el Grupo II con contracciones prematuras, pero con un nacimiento en el plazo (p < 0,01).

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Análisis proteómico de líquido amniótico Identificación de proteínas mediante análisis LC-MS/MS

Se redujeron 100 \mug de líquido amniótico de muestras de control e infectadas con yodoacetamida y se identificó en un gel SDS-PAGE al 15%. La electroforesis se produjo a 80 V para separar las proteínas en la muestra. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con azul de Comassie R-250 y se recogieron las imágenes utilizando el densitómetro Bio-Rad GS800 y software PDQUEST. Las bandas diferenciadas de cada carril se cortaron del gel, se destiñeron y se digirieron en gel con tripsina durante 24-48 horas a 37ºC utilizando el método de Courchesne y Patterson (Methods Mol Biol 112:487-511 (1999)). Los péptidos se extrajeron con TFA al 0,1% y se secaron en un speedvac. El extracto se disolvió en TFA al 0,1% y se purificó utilizando puntas de pipeta Zip Tip_{C18} de Millipore. (Marvin L., et al. Identification of proteins from one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis using electrospray quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 14(14):1287-92, 2000), utilizando un espectrómetro de masas Q-Tof-2 (Micromass, Reino Unido) acoplado a CapLC (Waters, Inc) y/o en un atrapador de iones (LCQ, ThermoFinnigan, San Jose, CA) acoplado a un sistema 110 Capillary LC System (Agilent Technologies, Foster City, CA).

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Eletroforesis en gel bidimensional (2-D)

Se disolvió en tampón IEF líquido amniótico (400 - 2000 \mug) con o sin eliminación de albúmina y se rehidrató sobre una tira de IPG de 24 cm (pH 3-10) durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la rehidratación, la tira de IPG se sometió a una electroforesis unidimensional a 70 \sim90 kVhrs. A continuación, la tira de IPG se equilibró con tampón de equilibrado DTT I y tampón de equilibrado IAA II durante 15 minutos de manera secuencia, antes de un análisis SDS-PAGE bidimensional. A continuación, la tira de IPG se cargó sobre un gel de SDS-PAGE al 4-20% y se realizó la electroforesis a 120 V durante 12 horas para identificar las proteínas en la segunda dimensión. El gel se tiñó con Azul de Coomassie R-250 y se recogieron imágenes utilizando el densitómetro Bio-Rad GS800 y software PDQUEST. Se cortaron del gel las manchas individuales, se destiñeron y se digirieron en gel con tripsina durante 24-48 horas a 37ºC. Los péptidos se extrajeron con TFA al 0,1% y se purificaron utilizando puntas de pipeta Zip Tip_{C18} de Millipore (2-D Proteome analysis protocols: Methods in Molecular Biology: 112, 1999).

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Fraccionamiento de HPLC

Las muestras de líquido amniótico humano después de la eliminación de albúmina e IgG (1-15 mg de proteína) se disolvieron en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Se realizó una cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna de DEAE-5PW con gel TSK en una HPLC Waters 1525 equipada con un automuestrador y un detector de la absorbancia por UV. Se utilizó un gradiente lineal de elución de sales para fraccionar las proteínas. Las fracciones se recogieron en intervalos de un minuto. Las fracciones se agruparon, digirieron con tripsina y se analizaron las mezclas de péptidos utilizando el espectrómetro de masas (Q-Tof 2).

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Análisis por espectrometría de masas (1) Q-Tof-2

Las muestras después de la digestión en gel se analizaron sobre un espectrómetro de masas Micromass Q-Tof 2 conectado a un Micromass CapLC. El Q-Tof 2 estaba equipado con una fuente regular Z-spray o nanospray y conectado a una columna capilar de sílice fundida Integrafrit C18 75um ID x 15cm. El instrumento estaba controlado por una terminal Compaq con software Windows NT and MassLynx 3.5 software y los datos se obtenían de la misma. El Q-Tof-2 se calibró utilizando Glu1Fibrinopeptido B mediante perfusión o inyección directa en el CapLC. Se utilizó un método de estudio MS/MSMS para obtener los espectros MS/MSMS. Se rastrearon las masas 400 a 1500 para el estudio por MS y las masas 50 a 1900 para MSMS. El análisis primario de los datos se realizó en un PC con Windows 2000 y SEQUEST (version 1.3) y/O LUTEFISK. Se generaron listas de picos utilizando las funciones automáticas de generación para la recogida de picos y la aplicación del ajuste centroide para cada pico.

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(2) LCQ-MS

Las manchas de proteínas de los geles secos teñidos con azul de Coomassie se cortaron y rehidrataron/lavaron durante 30 minutos en 0,5 ml de bicarbonato de amonio 20 mM, solución de acetonitrilo al 50%. A continuación, las regiones del gel se secaron mediante centrifugación al vacío y se digirieron in situ mediante la rehidratación en tripsina modificada en grado se secuenciación 20 mm (ProMega, Madison, WI, USA) utilizando el método de Courchesne y Patterson, Identification of proteins by matrix-assisted laser desorption/ionization masses, Methods Mol. Biol. 112:487-511 (1999). Los digestos trípticos se concentraron a continuación mediante centrifugación al vacío, se separaron mediante cromatografía de fase inversa, y se analizaron los péptidos mediante un modelo de espectrómetro de masas atrapador de iones LCQ (ThermoFinnigan, San Jose, CA). Las muestras se separaron con una columna microbore Zorbax C-18 0,5 mm x 150 mm utilizando una velocidad de flujo de 10 \muL min^{-1} y un gradiente de 0 al 40% B (acetonitrilo al 75% en agua) durante una hora con un sistema 1100 Capillary LC System (Agilent Technologies, Foster City, CA). Los péptidos se introdujeron directamente en la fuente de electrospray estándar ThermoFinnigan. Se obtuvieron los espectros MS/MS de una manera automatizada utilizando el software estándar LCQ y, a continuación, se analizaron adicionalmente utilizando SEQUEST (ThermoFinnigan). Para más detalles véase Courchesne, P.L. and Patterson, S.D., supra.

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Análisis de datos (1) Sequest y DTASelect

El análisis automatizado del espectro de masa en tándem (MS/MS) se realizó utilizando software SEQUEST (ThermoFinnigan) tal como se ha descrito por Yates et al., Methods Mol. Biol. 112:553-69 (1999). SEQUEST empareja espectros de masa en tándem ininterrumpidos a las secuencias de péptidos de la base de datos. Las búsquedas se desarrollaron con los parámetros por defecto utilizando una base de datos no redundante indexada combinada de secuencias de proteínas obtenidas de la Protein Information Resource (datos de salisa) y Swiss-Prot (datos de salida). Las bases de datos se construyeron utilizando la Xcalibur Database Manager (ThermoFinnigan). La cisteína S-carboxiamidada era la única modificación considerada.

Los resultados se Sequest se analizaron posteriormente utilizando DTASelect (The Scripps Research Institute, Tabb, 2002). DTASelect organiza y filtra las identificaciones de SEQUEST. Los parámetros por defecto se utilizaron a excepción de lo siguiente: 1) cualquier emparejamiento de la base de datos que incluía el término "queratina" en la descripción y 2) los espectros del espectrómetro de masas LCQ se filtraron con una valoración de correlación cruzada de 2,4 para los iones doblemente cargados. Cada espectro y pareja de secuencias propuesta seleccionada mediante DTASelect se inspeccionaron visualmente y los resultados finales se introdujeron en una hoja de cálculo (Microsoft Excel) or una base de datos (Microsoft Access) para su manipulación.

Para más detalles, véase también: Tabb DL, et al., DTASelect and Contrast: Tools for Assembling and Comparing Protein Identifications from Shotgun Proteomics. J. Proteome Res. 1: 21-26 (2002).

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(2) Lutefisk

La secuenciación automatizada de novo de todos los espectros se realizó utilizando el programa informático, Lutefisk 1900 v1.2.5 (Taylor JA; Johnson RS. Implementation and uses of automated de novo peptide sequencing by tandem mass spectrometry. Anal Chem 73(11):2594-604 (2001)). Lutefisk genera secuencias de péptidos para espectros de los cuales algunos son suficientemente detallados para búsquedas de secuencias basadas en homología. Se consideraron modificaciones, acrilamida, carbamidometilación, y fosforilación.

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Protocolo y parámetros de detección por MALDI

La espectrometría de masas MALDI se realizó en un espectrómetro de masas con un reflector de tiempo de vuelo construido de manera habitual (Jensen ON, et al., Direct observation of UV-crosslinked protein-nucleic acid complexes by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 7(6):496-501 (1993)) equipado con una fuente de extracción retrasada en dos etapas. Aproximadamente, se mezcló 1 \muL de solución de muestra con 1 \muL de SA (ácido sinapínico en agua/acetonitrilo 60:40 en una ceoncentración final de 0,1% en TFA). Se depositó una gota de 1,0 \muL de esta solución de analito/matriz sobre una sonda de muestra precristalizada sobre una matriz y se dejó secar al aire. Se produjeron los espectros de masas mediante la radiación de la muestra con un láser Nd:YAG (355nm) (Spectra Physics) y trabajando la fuente de iones a 23 kV con un retraso de 700 ns/1,0 kV. Cada espectro de masas se registró como la suma de 20 espectros consecutivos, cada uno producido mediante un pulso único de fotones. Los iones de un patrón añadido se utilizaron para la calibración de la masa.

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Análisis SELDI del líquido amniótico

Se dispersó un total de 0,5 - 3,0 \mug de proteína de muestras de líquido amniótico sobre una Fase Normal NP20 (superficie de SiO_{2}), Fase Inversa H4 (superficie hidrofóbica: C-16 (hidrocarburo alifático de cadena larga), o array ProteinChip® SELDI de níquel inmovilizado (IMAC) (Ciphergen Biosystems, Inc. Fremont, CA). Después de la incubación a temperatura ambiente durane 1 hora, los chips NP1 y H4 se sometieron a un lavado con 5 \muL de agua para eliminar las proteínas no unidas y sustancias interferentes (es decir, tampones, sales, detergentes). Después del secado al aire durante 2-3 minutos, se añadieron dos aplicaciones de 0,5 \muL de una solución saturada de ácido sinapínico en acetonitrilo al 50% (v/v), ácido trifluoroacético al 0,5% (v/v) y se realizó el análisis de masas mediante espectrometría de masas con tiempo de vuelo en un sistema Ciphergen Protein Biology System II (PBS II), Issaq, J.H, et al.: The SELDI-TOF MS Approach to proteomics: Protein Profiling and Biomarker Identification. Biochem Biophys Res Commun. 5;292(3):587-92,2000.

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Anticuerpos policlonales e inmunotransferencia Western

Los péptidos inmunogénicos de las proteínas correspondientes se utilizaron para generar anticuerpos policlonales de conejo (DSL Laboratories, Webster, TX). A continuación, los anticuerpos purificados por afinidad se utilizaron para transferencias Western. Se identificaron cien \mug de proteína de AF en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. A partir del suero de la madre, se utilizaron 300 \mug de proteína para la inmunoprecipitación utilizando anticuerpo monoclonal IGFBP 1 (DSLLaboratories) y los productos se sometieron a transferencia western. Para la detección de calgranulina B en el suero de madre, se utilizaron 150 \mug de suero de la madre sin albúmina para la transferencia western. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% en PBST durante 45 minutos a temperatura ambiente y se incubaron con 1 \mug/ml de anticuerpo primario (IGFBP-1, azurocidina, proteína de unión a vitamina D y calgranulina B de DSL Inc., Santa Cruz, CA) durante toda la noche a 4ºC. Después de tres lavados con TBST, la membrana se incubó con anticuerpo secundario IgG-HRP (Sigma) y se visualizó con quimioluminiscencia aumentada.

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Ejemplo 2

Identificación de proteínas y polipéptidos expresados en el líquido amniótico

Utilizando los materiales y métodos descritos en el Ejemplo 1, se identificaron las proteínas y polipéptidos expresados en líquido amniótico normal e infectado. Las muestras de líquido amniótico humanas y de primate (agrupadas e individuales) se sometieron a técnicas de separación de proteínas (1-D, 2-D y fraccionamiento por HPLC) tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las proteínas separadas (bandas de gel, manchas y fracciones) se digirieron con tripsina para generar grupos de péptidos. Éstos se analizaron utilizando MS en tándem para deducir su secuencia y composición de aminoácidos.

Se seleccionaron cinco mil espectros MS utilizando programas de verificación espectral. Estos archivos espectrales se analizaron utilizando programas de secuenciación de novo (Lutefisk, Peaks) para generar la secuencia de aminoácidos correspondiente a cada péptido. Las secuencias de novo generadas a partir del grupo de péptidos se utilizaron para buscar bases de datos de proteínas y ADN tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Utilizando mapas de homología y la verificación de secuencias, se descubrió la expresión de una variedad de proteínas en el líquido amniótico. Las proteínas detectadas se analizaron para determinar la potencial función basada en similitudes estructurales conocidas (mapas de homología de secuencias). Se descubrieron proteínas que pertenecen a clases funcionales importantes implicadas en un amplio rango de enfermedades. Las proteínas y polipéptidos descubiertos por primera vez en el líquido amniótico se indican en la siguiente Tabla 2 bajo las potenciales categorías funcionales.

Se observó también que las proteínas se expresaban de manera diferencial mediante inmunoensayos y las proteínas representadas de manera más abundante o única en el líquido amniótico infectado se indican por separado. En este contexto, la abundancia relativa se define como la cantidad de péptidos que representan un cierto polipéptido o proteína en una muestra de prueba en relación a una muestra de referencia. Por consiguiente, una proteína se representa de manera más abundante en líquido amniótico infectado si más péptidos derivados de la misma proteína están presentes en el líquido amniótico infectado que en la muestra de referencia no infectada de líquido amniótico.

La Tabla 3 indica proteína y polipéptidos conocidos previamente por estar presentes en el líquido amniótico, la presencia de los cuales fue reafirmada por los presentes ensayos. Las proteínas que son marcadores conocidos para sucesos relacionados con la infección están indicadas por separado.

TABLA 2 Proteínas y polipéptidos descubiertos por primera vez en el líquido amniótico humano

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TABLA 3 Proteínas y polipéptidos, conocidos previamente por estar presentes en el líquido amniótico, identificados utilizando la secuenciación de novo

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En la siguiente Tabla 4 se proporcionan proteínas adicionales descubiertas por primera vez en líquido amniótico.

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TABLA 4

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IPI = Índice de Proteínas Internacional

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Marcadores de diagnóstico para afecciones intrauterinas

Las proteínas indicadas en las tablas anteriores son candidatas prometedoras para detectar y monitorizar las afecciones intrauterinas. A continuación, se describen con más detalle varios ejemplos de dichas afecciones y los correspondientes marcadores de proteínas.

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Proteínas moduladoras de actina y relacionadas como marcadores para defectos del desarrollo

Se sabe que la moesina (proteína "spike" de extensión de la organización en membrana), indicada entre las proteínas estructurales de la Tabla 2, es responsable de la unión de las proteínas transmembrana al citoesqueleto de actina y está implicada en varios mecanismos de señalización celular (Speck O, et al.: Moesin functions antagonistically to the Rho pathway to maintain epithelial integrity. Nature 2; 421(6918):83-7, 2003). Se observó que las GTPasas de la familia Rho y sus efectores modulan las actividades de moléculas que modifican la actina, tales como la COfilina y Profilina (también indicadas como una proteína estructural en la Tabla 2), dando lugar a cambios citoesqueléticos asociados con la extensión o retracción del cono de crecimiento (Tang BL. Inhibitors of neuronal regeneration: mediators and signaling mechanisms. Neurochem Int, 42(3):189-203, 2003). La proteína p57 de tipo coronina (aún otra proteína estructural indicada en la Tabla 2) también está implicada en la protección y reticulación de actina (Weitzdoerfer R et al.: Reduction of actin-related protein complex 2/3 in fetal Down syndrome. Biochem Biophys res Commun. 293:836, 2002) y se desregula en defectos del desarrollo conocidos, La gelsolina (véase, el precursor de la Gelsolina indicado como una proteína de transporte/unión en la Tabla 2), otra proteína moduladora de actina, también se conoce que se regula en el desarrollo y es importante en los sistemas orgánicos (Arai M, Kwiatkowski DJ. Differential developmentally regulated expression of gelsolin family members in the mouse. Dev Dyn, 215, 297, 1999). Las proteínas 14-3-3 también son marcadores epiteliales conocidos que participan en mecanismos de transducción y diferenciación de señales y son esenciales para el desarrollo normal del cerebro y otros órganos vitales (Wu C, Muslin AJ. Role of 14-3-3 proteins in early Xenopus development. Mech Dev, 119, 45, 2002).

Por consiguiente, las proteínas moduladoras de actina y otras moléculas relacionadas con importantes funciones durante el desarrollo, que se identificaron pro primera vez en el líquido amniótico humano, se podría utilizar para detectar defectos en el desarrollo de varios sistemas orgánicos, tales como el sistema nervioso central, el sistema cardiovascular y otras deformidades musculoesqueléticos, que pueden resultar de, por ejemplo, aneuploides cromosómicas. Esto es particularmente cierto para Profilina I, que se ha observado que se expresa de manera diferencial en líquido amniótico infectado, y la expresión diferencial de la cual ha sido confirmada mediante inmunoensayo.

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Marcadores de trastornos relacionados con la infección y la respuesta inmune

La presente detección de proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos, leucocito elastasa, lipocalina asociada a gelatenasa de neutrófilo, mileoperoxidasa, L-plastina (proteína citosólica de linfocito) y calgranulinas (véase la lista de genes relacionados con la respuesta inmune en la Tabla 2) en líquido amniótico infectado es la primera demostración de la presencia y regulación de estas proteínas en la infección intramaniótica. Varias de estas proteínas son respondedoras conocidas de las células inmunes en respuesta la infección, inflamación y estrés. La proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos (MCP) es una proteína sensible a Ca(2+) que modula los filamentos de actina y está implicada en el proceso inflamatorio (Dabiri GA, Molecular cloning of human macrophage capping protein cDNA. A unique member of the gelsolin/villin family expressed primarily in macrophages J Biol Chem 15; 267(23):16545-52, 1992). De manera similar, las calgranulinas son proteínas de unión a calcio que se sabe que juegan un papel en la curación de lesiones y heridas (Thorey IS. et al. The Ca2+-binding proteins S100A8 and S100A9 are encoded by novel injury-regulated genes. J Biol Chem 21; 276 (38):35818-25, 2001). La leucocito elastasa y la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilo (NGAL) están implicadas en los mecanismos bacteriostáticos y la baceterolisis (Goetz DH. et al. The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition.: Mol Cell 10(5):1033-43, 2002).

Además de los inmunomoduladores anteriores, también se descubrieron, por primera vez, dos proteínas antibacterianas Fall-39 y azurocidina en el líquido amniótico infectado. La proteína antibacteriana Fall-39 (LL-37) se une a lipopolisacáridos (lps) bacterianos y se expresa en la médula ósea, testículos y neutrófilos. Fall-39 estimula la desgranulación de mastocitos y es un potente factor quimiotáctico para los mastocitos. Además de sus actividades antibacterianas, Fall-39 puede tener el potencial para recrutar mastocitos a los focos de inflamación. En presencia del medio basal E, FALL-39 sintética era altamente activa contra D21 de Escherichia coli y Bm11 de Bacillus megaterium. Se ha propuesto un papel protector para Fall 39 cuando está dañada la integridad de la barrera de la piel, participando en la primera línea de defensa, y evitando la infección local y la invasión sistémica de microbios (Agerberth B, et al.: FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis. Proc Natl Acad Sci U S A, 3;92(1):195-9, 1995).

Azurocidina (CAP37) es una proteína antimicrobiana catiónica aislada de neutrófilos humanos y tiene importantes implicaciones en la defensa del huésped y la inflamación. Se libera durante la inflamación y regula las funciones de monocitos/macrófagos, tales como quimiotaxis, aumento de la supervivencia y diferenciación (Pereira HA. CAP37, a neutrophil-derived multifunctional inflammatory mediator. J Leukoc Biol;57(6):805-12, 1995).

Las proteasas e inhibidores de proteasas juegan un papel clave en la regulación de proteínas y, por tanto, controlan varios mecanismos fisiológicos claves. Se ha identificado por primera vez la expresión de la familia de proteasas de Serpina (Serpina, antígeno 1 y 2 del carcinoma de células escamosas, nexina derivada glial) en líquido amniótico humano, incluyendo la infección intraamniótica. La superfamilia de inhibidores de serina proteinasas de serpina tiene un papel central en el control de proteinasas en muchos mecanismos biológicos y está implicada en enfermedades conformacionales, tales como las amiloidosis, las encefalopatías por priones y la enfermedad de Huntington y Alzheimer (Lomas DA, Carrell RW, Serpinopathies and the conformational dementias. Nat Rev Genet; 3:759, 2002).

Adicionalmente, en la infección intraamniótica se identificó la expresión de Cistatinas, inhibidores de proteinasas bien implicadas en la inmunomodulación (Vray B, Hartmann S, Hoebeke J. Immunomodulatory properties of cystatins. Cell Mol Life Sci; 59(9):1503-12,2002).

Las proteínas indicadas en la lista son marcadores prometedores de trastornos relacionados con la infección y/o la respuesta inmune.

Cabe mencionar que los péptidos que representan proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos, lipocalina asociada a elatinasa de neutrófilo, precursor de meiloperoxidasa, L-plastina, azurocidina, proteína antibacteriana Fall.39, calgranulina A, Profilina I, nexina derivados gliales, serpina 12, y cistatina A se detectaron de manera más abundante o única en líquido amniótico infectado en relación a líquido amniótico normal y/o mostraban expresión diferencial en inmunoensayos.

Por consiguiente, estas proteínas son particularmente importantes como marcadores de la infección intramaniótica y/o trastornos relacionados con la respuesta inmune.

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Otras proteínas específicas de enfermedades (infecciones) detectadas en líquido amniótico humano

La proteína variante de Gp-340 indicada en la Tabla 2, que ha sido detectada en líquido amniótico infectado humano infectado, es un receptor secuestrador identificado previamente en el pulmón. Esta proteína es conocida por unirse a bacterias (estreptococos y variantes). La detección de esta proteína en líquido amniótico infectado complementa la estrategia proteómica sensible de la presente invención para identificar biomarcadores para IAI. Por lo tanto, la proteína variante de Gp-340

\hbox{identificada en el
líquido amniótico infectado se presta  para la detección de la
sepsis neonatal.}

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IGFBP-1 (fragmento proteolítico)

Tal como se muestra en la Tabla 2, se ha observado que IGFBP-1 se expresa diferencialmente en líquido amniótico infectado. Los sistemas del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) están implicados de manera crítica en el crecimiento fetal y de la placenta y modulan las acciones de hormonas esteroides en el endometrio a través de mecanismos autocrino/paracrino. Las IGF-I e IGF-II estilaban la proliferación y diferenciación y mantiene las funciones de células diferenciadas en varios tipos de células in vitro. Las células estromales endometriales producen IGF-I e IGF-II, así como proteínas de unión a IGF con afinidad elevada (IGFBPs). El ARNm de seis IGFBPs de afinidad elevada, que pueden modular las acciones de IGF, se expresan en endometrio humano. La IGFBP más abundante en el endometrio humano es IGFBP-1, la cual es secretada por células estromales endometriales predecidualizadas/decidualizadas en la fase secretora tardía y durante el embarazo. Esto tiene implicaciones para la obstetricia clínica y ginecología cuando existe la evidencia de un papel patofisiológico para IGFBP-1 en pre-eclampsia, restricción del crecimiento intrauterino, síndrome ovárico poliquístico, y trofoblastos y neoplasmas endometriales.

La presencia y regulación de un fragmento proteolítico de IGFBP-1 en líquido amniótico humano y del suero de la madre abren una nueva vía para monitorizar las afecciones intrauterinas y de la madre asociadas con el embarazo.

Para más detalles véase también el Ejemplo 12 siguiente.

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Ejemplo 3

Perfiles de expresión de proteínas del líquido amniótico de humano y primate tras infección intrauterina

Los análisis MS SELDI-TOF de espectro completo recogidos a una intensidad de láser de 235 de extractos de AF unidos a arrays de chips en fase normal definidos químicamente revelaron varias diferencias de intensidad en los picos en las regiones de 3-5 kDa y 11-12 kDa entre AF de primate y humano infectado y no infectado.

En las Figuras 1A-C se muestran los perfiles de expresión de proteínas de líquido amniótico de primate tras infección intrauterina, en comparación con los perfiles de expresión normales correspondientes. Tal y como se ilustra en las Figuras 1A-C, los perfiles de expresión de proteínas globales de líquido amniótico de control e infectado son distintos. Un espectro detallado de perfiles de líquido amniótico en un intervalo de masas más pequeño, (Figuras 1B y 1C), muestra diferencias claras y características entre los perfiles de expresión de proteínas de muestras de control e infectadas aproximadamente en el intervalo de 3-5 KDa y 10-12 KDa. Esto ilustra la regulación global de la expresión de proteínas en respuesta a infección intrauterina y la capacidad de detectar un patrón de expresión único diagnóstico una infección intrauterina.

La Figura 2 muestra el análisis con el transcurso del tiempo del líquido amniótico de primate en respuesta a la infección (GBS). Se recogió el líquido amniótico antes de la inoculación de bacterias y a intervalos después de la infección y se sometió a un análisis SELDI-TOF tal y como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 2A muestra el perfil de expresión de proteínas antes de la infección, la Figura 2B 12 horas después de la inyección, y la Figura 2C 36 horas después de la infección.

Tal y como se muestra en la Figura 2C, uno de los picos de diagnóstico (10-11 KDa) de infecciones intrauterinas alcanza claramente altos niveles de expresión en las 36 horas de infección aguda. Esto demuestra que los perfiles de proteínas de diagnóstico pueden utilizarse para monitorizar el estado de la enfermedad y la respuesta al tratamiento.

La Figura 3 muestra los resultados del análisis SELDI-TOF de extractos de líquido amniótico humano unidos a arrays de chips de fase normal definidos químicamente. La Figura 3A muestra el espectro completo a una intensidad de láser de 235. La Figura 3B es un espectro detallado que muestra las diferencias entre muestras infectadas y de control en la región de 10-12 kDa. La Figura 3 es un espectro detallado que muestra las diferencias características entre muestras infectadas y de control en la región de 3-5 kDa.

Tal y como se muestra en las Figuras 3A-C, los perfiles de expresión de proteínas globales de líquido amniótico de control e infectado son distintos. Un espectro detallado de los perfiles del líquido amniótico en un intervalo de masas más pequeño (Figuras 3B y C) muestra diferencias en las proteínas expresadas (intervalo 3-5 KDa y 10-12 KDa) entre muestras de control e infectadas. El análisis de las intensidades relativas de los picos de las proteínas sugiere la presencia de dos clusters de diagnóstico distintos (intervalos de 10-12 kDa y 3-5 kDa). Esto ilustra la regulación global de la expresión de proteínas en respuesta a la infección intrauterina y la capacidad de detectar un patrón de expresión único diagnóstico de infección intrauterina tanto en modelos humanos como en primates.

Es digno de mención que el patrón de diagnóstico de líquido amniótico humano está en concordancia con el patrón de diagnóstico de líquido amniótico de primate (Ejemplos 3 y 4).

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Ejemplo 4

Generación de perfiles de diagnóstico utilizando diferentes espectrómetros de masas

El perfil de la expresión de proteínas de diagnóstico puede detectarse utilizando diferentes tipos de espectrómetros de masas. Se ha examinado si espectrómetros de masas diferentes producen perfiles de diagnóstico similares. Si los perfiles de diagnóstico son sustancialmente independientes del tipo de espectrómetro de masas, la expresión diferencial de proteínas detectada en el líquido amniótico puede proporcionar un patrón de diagnóstico para infección
intrauterina.

La Figura 4 muestra el espectro de masas obtenido en una espectrómetro de masas MALDI-TOF genérico (Jensen ON, et al., Direct observation of UV-crosllinked protein-nucleic acid complexes by matrix-assisted laser desorption inoization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 7(6):496-501 (1993)) utilizando líquido amniótico del control humano (A), sin infección intrauterina, y una muestra (B) con infección intrauterina.

Tal y como se muestra en las Figuras 4A y B, el perfil de diagnóstico de infección intrauterina en el intervalo 10-12 Kda detectado utilizando el espectrómetro de masas alterno es similar al perfil detectado utilizando la máquina SELDI-TOF. Esto indica que los perfiles de expresión diferencial de proteínas son robustos y pueden detectarse utilizando un amplio rango de espectrómetro de masas actuales.

En resumen, se ha descubierto que las proteínas y los polipéptidos del líquido amniótico muestran patrones de expresión diferencial diagnósticos del estado de la enfermedad. Los resultados presentados aquí demuestran que los patrones de diagnóstico específicos de enfermedades pueden detectarse utilizando estrategias de espectrometrías de masas múltiples. Los patrones o perfiles de expresión de proteínas son comparables entre humanos y primates. Pueden utilizarse los perfiles para monitorizar un efecto con el tiempo (infección o tratamiento).

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Ejemplo 5

Cuantificación de la expresión de proteínas y polipéptidos en líquido amniótico para la monitorización diagnóstica y de pronóstico SDS-PAGE

Se precipitaron con acetona proteínas de líquido amniótico (AF) que contenía un alto contenido en sal. Se colocaron 100 \mug de proteínas de líquido amniótico en un SDS-PAGE al 15%. Se tiñó el gel con Azul de Coomasie R-250. Se escaneó la imagen del gel mediante Scanner de gel Bio-Rad.

La Figura 5 muestra el gel teñido de Azul de Coomasie-SDS de A) 4 muestras de AF de control humanas agrupadas; B) muestra de AF de control individual; C) 4 muestras de AF infectadas humanas agrupadas; y D) muestra de AF infectada individual.

La Figura 5 muestra diferencias significativas entre los niveles de expresión de proteína del control e infectada en el intervalo 10-15KDa. Se ha concluido que algunas de las proteínas y fragmentos proteolíticos en esta masa detectada utilizando los espectrómetros de masas son responsables de los perfiles de diagnóstico reflejo de los niveles de expresión de proteínas, y tienes utilidad diagnóstica y de pronóstico.

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Ejemplo 6

Análisis de transferencia Western del líquido amniótico de infección intrauterina

Se colocaron 100 \mug de proteínas de AF en SDS-PAGE al 4-20% a 200 V durante 60 minutos y se transfirieron a una membrana PVDF a 90 mM durante 75 minutos. Se bloqueó la membrana con PBST en leche al 5% durante 45 min a RT y se incubó con 1 \mug/ml de anticuerpo primario (Santa Cruz y Dako) durante toda la noche a 4ºC. Tras lavar con TBST 3 veces, se incubó la membrana con anticuerpo secundario IgG-HRP (Sigma) durante 90 min a RT y se visualizó con ECL (Pierce).

En la Figura 6 se muestran los resultados: A) Muestra de AF de control (agrupada); B) Muestra de AF infectada (agrupada). La Figura 6 muestra que IGFBP1 (11 KDa), profilina y ceruloplasmina (130 KDa) se expresan en un nivel más alto en AF infectado en comparación con AF no infectado. Los niveles de L-plastina fueron más bajos en la muestra infectada en comparación con la muestra de AF de control. También se identificaron estas proteínas de muestras infectadas humanas utilizando estrategias con MS (secuenciación de novo) y se indicaron en el Ejemplo 2 anterior.

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Ejemplo 7

Análisis de inmunoprecipitación de líquido amniótico de infección intrauterina

Se mezclaron dos microgramos de anticuerpo primario con 600 \mug de proteína de AF y se incubaron a 4ºC durante toda la noche. Se añadieron 15 \mul de partículas de proteína G Sefarosa y se incubó en un agitador durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las partículas con tampón IP durante 6 veces.

Los resultados se muestran en la Figura 7, en la que (A) muestra la muestra de líquido amniótico de control (agrupada), y (B) muestra la muestra de líquido amniótico infectada. La Figura 7 muestra que se expresan ceruloplasmina (\sim130 KDa) y calgranulina (\sim16KDa) a un nivel más alto en el líquido amniótico infectado que en el líquido amniótico de control.

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Ejemplo 8

Detección de la expresión diferencial de proteínas en el líquido amniótico humano y de suero materno

Se ha examinado si las proteínas expresadas diferencialmente en el líquido amniótico pueden utilizarse como un candidato para medir proteínas similares en el suero materno. Esto posibilitará el desarrollo de tests rápidos y no invasivos para el diagnóstico y la monitorización. Los resultados se muestran en la Figura 8, en la que (A) es la muestra de control (agrupada), y (B) es la muestra infectada (agrupada). La Figura 8 muestra que un fragmento proteolítico más pequeño IGFBP-1 se expresa sistemáticamente diferencialmente tanto en AF como en suero materno en respuesta a infección intrauterina.

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Ejemplo 9

Análisis por microarray de proteínas de líquido amniótico de infección intrauterina

Anticuerpos: IGFBP-1 (DSL); complemento C3, Desmina, elastasa de neutrófilo, anticuerpo de NSE (DAKO); calgranulina, ceruloplasmina, TIMP-1, plastina y profilina (Santa Cruz).

Deposición de anticuerpos: se disolvieron anticuerpos en glicerol al 40%, PBS al 60%, pH 7,5 a una concentración de 100 \mug/ml y se depositaron en portaobjetos con aldehído utilizando un Arrayer (Cartesian).

Después de una incubación de 3 horas en una cámara húmeda a temperatura ambiente, los portaobjetos se incubaron durante una hora en una solución de PBS, pH 7,5 que contenía BSA al 1% (p/v a temperatura ambiente con agitación suave).

Biotinilación de proteínas: se disolvió Biotina-NHS en agua DD a 50 mg/l. Se añadieron 10 \mul de esta solución en solución de proteína de suero de la madre (5 mg/ml en 10 mM de PB, pH 8,5) y se incubó durante 3 horas sobre un agitador. Se añadieron 5 \mul de etanolamina para parar la reacción. Se diluyeron las proteínas biotiniladas en 200 \mul de tampón TNB y se añadieron a arrays de anticuerpo y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Después de tres lavados en tampón TNT, se añadió estreptavidina-HRP y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó la interacción antígeno-anticuerpo utilizando fluorescencia de Cy5-tiramida. Se escanearon los portaobjetos en un escáner fluorescente de PE para la cuantificación. Se superpusieron las imágenes de los portaobjetos de control e infectados utilizando un programa de análisis de imágenes para generar una representación en pseudocolor para la abundancia relativa. En la Figura 9 se muestran los resultados, los cuales es una imagen en pseudocolor del array de proteínas que muestra la unión de las proteínas correspondientes con sus anticuerpos. El color verde representa la muestra infectada, el color rojo representa la muestra de control. Parte II es un área ampliada del array que muestra que la expresión de calgranulina (verde) es mayor en la muestra de suero infectada. Parte III es una transferencia Western de calgranulina IP que muestra una expresión incrementada similar en la muestra de líquido amniótico
infectada.

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Ejemplo 10

Análisis adicional de proteínas representadas en el patrón de diagnóstico único de líquido amniótico infectado

Se ha demostrado que los perfiles de SELDI-TOF del líquido amniótico de control e infectado muestran un patrón único en el intervalo de masas de 10-12 KDa (Figuras 1, 2 y 3), representativo de la muestra infectada de manera positiva. El líquido amniótico de control e infectado desarrollado en un gel 1-D (Figura 5) también muestra bandas en el intervalo de masa de 10-12 KDa que son más abundantes en las muestras de líquido amniótico infectadas agrupadas o independientes. El aislamiento de estas bandas de gel 1-D y el análisis adicional utilizando LCQ-MS tal y como se muestra en la Figura 13, identificaron péptidos representativos de IGF-BP-1 y proteínas de unión a calcio S-100. El análisis por transferencia Western de líquido amniótico de control e infectado utilizando un anticuerpo anti-IGF-BP1 tal y como se muestra en la Figura 8, también demuestra la expresión diferencial de un fragmento proteolítico (\sim1 KDa) en la infección.

La secuenciación de los polipéptidos del líquido amniótico también identificó la presencia de IGF-BP1 y calgranulinas en el líquido amniótico infectado (Tabla 3).

En la Figura 12 se muestra la secuencia del fragmento proteolítico nuevo identificado de IGFBP-1 (SEC ID Nº:1). En la Figura se muestran en minúscula las secuencias de péptido encontradas en muestras "0426seq__HI__12" y "0425seq__HI-_113" después de la electroforesis en gel 1-D, digestión con tripsina y análisis MS/MS de líquido amniótico infectado (SEC ID Nºs: 2 y 3). El fragmento proteolítico de IGF-BP-1 detectado en geles 1-D (intervalo de pesos moleculares bajo, Figura 5), transferencias Western (Figura 6), y análisis MS/MS (Figura 13) de la banda de \sim10.5-12 KDa digerida con tripsina del líquido amniótico infectado, se representa en la región de la secuencia subrayada (SEC ID Nº: 4).

De hecho, el análisis MS/MS y los resultados de la búsqueda de secuencia demostró que el ión parental 434,89 en el espectro de masas mostrado en la Figura 13 representa una secuencia de IGF-BP-1 (RSPGSPEIR), que también se muestra en el mapa de la secuencia de la Figura 12 del fragmento proteolítico de IGF-BP-1. El ión parental 1082,97 representa proteínas de unión a calcio S-100 (es decir, Calgranulinas A y B), también se identificó independientemente mediante secuenciación de novo de AF (Tablas 2 y 3).

La Figura 14 muestra el espectro de masas para el pico del tiempo de retención del minuto 17,55-18,21 mostrado en la Figura 13. Es claro que el pico dominante aparece en la masa 434,9. La Figura 15 muestra el espectro MS/MS para el ión parental del pico 434,9 mostrado en la Figura 14. En base a la búsqueda en la base de datos, el ión parental corresponde a una secuencia parcial de IGFBF-1.

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Ejemplo 11

Inmunodetección de biomarcadores para IAI

Para validar la expresión diferencial de proteínas identificadas en IAI, se seleccionaron dos marcadores a partir del perfil de 11 kDa de MS SELDI-TOF (calgranulina B e IGFBP-1), una molécula inmunoreguladora (azurocidina), y una proteína no regulada (proteína de unión a Vitamina D) identificada en el análisis global de la expresión de proteína. Tal y como se muestra en la Figura 16, el análisis por transferencia Western confirmó los tres biomarcadores que muestran una expresión diferencial que concuerda con los experimentos de identificación de proteínas realizados en líquido amniótico con IAI.

Se investigó si las proteínas expresadas diferencialmente en líquido amniótico podrían identificarse en suero de la madre agrupado de un número limitado de pacientes (n=5) donde los sueros estuvieran disponibles utilizando anticuerpos específicos desarrollados contra IGFBP-1 y calgranulina B. En este análisis limitado, el fragmento proteolítico de 11 kDa de IGFBP-1 y calgranulina B, correspondiente al pico de 11 kDa que estaba presente diferencialmente en líquido amniótico infectado versus control, también se detectó en el suero de la madre en respuesta a IAI (Figuras 16d y e). No se detectó azurocidina en el suero de la madre.

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Ejemplo comparativo 12

Perfiles de diagnóstico característicos de Aneuploidías Cromosómicas

Se examinó la utilidad de la determinación del perfil proteómico para identificar la trisomía-21 con más precisión utilizando el cribado del de suero de la madre. Este estudio se realizó con un grupo de control (n=6), trisomía-21 (n=6) y trisomía-18 (n=4), muestras de suero de madre bien caracterizadas (las muestras de líquido amniótico emparejadas para los mismos casos se ensayaron mediante el procedimiento de mapeo cromosómico estándar y se confirmó positivamente la presencia de trisomías) y se analizó utilizando metodología SELDI-TOF tal y como se ha descrito anteriormente para el modelo de infección intrauterina.

La Figura 10 muestra patrones de expresión diferencial de proteínas en el suero de la madre con perfiles únicos para distinguir las trisomías. Se utilizó un microgramo de suero de la madre (tras la eliminación de albúmina e inmunoglobulinas utilizando columnas de separación de proteína, BioRad technologies) para realizar análisis SELDI-TOF de extractos de suero de la madre unidos a arrays de chips de Fase Normal definidos químicamente tal y como se ha descrito anteriormente. El espectro completo recogido a intensidad de láser 235 que muestra las diferencias en las intensidades de los picos. A) Suero de control; B) suero de trisomía 21 (de Down); C) suero de trisomía 18. El espectro detallado que muestra las diferencias en la única región de 4-15 kDa única para cada caso. Las flechas indican los picos de diagnóstico que pueden utilizarse en una combinación para formular un algoritmo para desarrollar las pruebas de cribado de diagnóstico. Esto ilustra adicionalmente que la detección de los patrones de expresión de proteínas en varios fluidos biológicos (tal como el suero de la madre) podría identificar afecciones fetales y de la madre con más precisión y en una estrategia no invasiva.

La detección de un pico de 11 kDa sobreexpresado de manera significativa en MS SELDI-TOF en el establecimiento de la IAI en el modelo experimental de primate que utilizó microorganismos clínicamente relevantes y en mujeres infectadas con microorganismos diferentes confirma la especificidad de este patrón para IAI causada por un rango amplio de patógenos. Este cluster sobreexpresado puede representar una respuesta inmune intrauterina básica a la infección, ya que un grupo de proteínas identificadas en este cluster único, es decir, las calgranulinas, son miembros de la familia de proteínas de unión a calcio S-100, expresadas por macrófagos y por células epiteliales en tejidos inflamados de manera aguda. El segundo candidato de este cluster, un fragmento proteolítico específico de IGFBP-1, indica un potencial mecanismo relacionado con la proteasa en respuesta a la infección. El IGFBP-1 intacta es la IGFBP principal encontrada en AF, y es sintetizada por membranas fetales y decidua de la madre. Aunque la división proteolítica de las IGFBP es un fenómeno bien caracterizado (Maile et al. IGF binding protein hydrolysis in various clinical states. En: The IGF System, En: Rosenfeld CR, Roberts C, Jr., eds. Totowa, NJ: Humana Press, 1999), el fragmento particular descrito en el estudio actual no ha sido descrito previamente.

En la segunda estrategia, la caracterización de proteínas expresadas en AF en control y IAI utilizando LC-MS/MS identificó por primera vez un número significativo de moléculas relacionadas con la respuesta inmune y la infección en IAI. La proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos (MCP) es una proteína sensible a Ca^{+2} que modula los filamentos de actina y está implicada en procesos inflamatorios (Dabri et al.. J Biol Chem 267:16545-52 (1992)). La leucocito elastasa y la lipocalcina asociada a gelatinasa de neutrófilo (NGAL) están implicadas en mecanismos bacteriostáticos y de baceterolisis (Goetz et al., Mol Cell 1):1033-43 (2002)).

Además de los inmunomoduladores anteriores, la detección de proteínas antibacterianas Fall-39 y azurocidina en AF en respuesta a la infección proporciona una nueva visión de las respuestas inmunes intrauterinas. La proteína antibacteriana Fall-39 (LL-37) que se une a los lipopolisacáridos bacterianos, es un potente factor quimiotáctico para mastocitos, y sirve como una primera línea de defensa para evitar la infección local y la invasión sistémica de microbios (Agerberth et al., Proc Natl Acad Sci usa 92:195-9 (1995)). La azurocidina (CAP37) es una proteína antimicrobiana catiónica aislada de neutrófilos humanos con implicaciones importantes en la defensa de huésped y la inflamación (PEREIRA, L. Leukoc Biol 57:805-12 (1995)). La proteína variante de Gp-340 es un receptor secuestrador identificado previamente en pulmón que se une a las bacterias (Prakobhol et al., J Biol Chem 275:39860-6 (2000)). La identificación de estas proteínas complementa las estrategias proteómicas sensibles utilizadas para identificar biomarcadores para IAI.

Las pruebas de laboratorio disponibles actualmente utilizadas para confirmar el diagnóstico de IAI, incluyen las mediciones de la proteína C-reactiva de la madre, el examen directo de AF para leucocitos o bacterias en tinción Gram, el cultivo microbiano de AF o PCR, medición de glucosa de AF y concentraciones de IL-6, y detección de esterasa de leucocito de AF. Sólo los cultivos microbianos y la reacción en cadena de la polimerasa de ADNr bacteriano de amplio espectro de líquido amniótico parecen ser sensibles y específicos para IAI. No obstante, los cultivos microbianos para micoplasmas genitales o las pruebas basadas en PCR no están generalmente disponibles y se requiere amniocentesis para obtener líquido amniótico. Una ventaja de una estrategia basada en la proteómica es que los biomarcadores de péptido candidatos se prestan al desarrollo de inmunoensayos de diagnóstico rentables y de puesta en marcha rápida. Por analogía con otras pruebas de cribado de AF y suero (por ejemplo, alfa-fetoproteína para defectos del tubo neural), los péptidos identificados en el líquido amniótico infectado también podrían detectarse en el suero de la madre y ser útil en pruebas de diagnóstico no invasivas. Los datos presentados en los ejemplos anteriores, especialmente aquellos que utilizan sueros de la madre agrupados, demuestran la viabilidad de esta estrategia en que el fragmento restrictivo de IGFBP-1 y calgranulina B son dos biomarcadores que aparecen tanto en AF como en sangre de la madre durante IAI pero no en ausencia de la infección.

En resumen, se ha empleado un análisis basado en proteómica de AF para identificar biomarcadores para IAI tanto en un modelo de primate no humano experimental como en una cohorte de mujeres con parto preamturo e IAI oculta. Se identificaron los perfiles de expresión de proteínas para el diagnóstico mediante la determinación del perfil por MS SELDI-TOF que eran sensibles y específicos en la detección de IAI. El análisis de alto rendimiento de proteínas expresadas en AF identificó por primera vez la expresión de diversas moléculas inmunoreguladoras. La inmunodetección de proteínas detectadas en el pico de 11 kDa de diagnóstico (IGFBP-1 y calgranulina B) confirmó la presencia y la expresión diferencial de estos biomarcadores en líquido amniótico y en sangre de la madre durante IAI. Los datos presentados en la presente invención sirven como la base para ensayos rápidos y no invasivos para detectar IAI oculta durante el embarazo. Este es un avance importante, ya que permite a los profesionales clínicos y a los investigadores dirigirse a un subgrupo concreto de mujeres con alto riesgo para un nacimiento prematuro, para intervenciones específicas y en pruebas terapéuticas. Finalmente, estos estudios demuestran la utilidad de estrategias basadas en proteómica para identificar biomarcadores y perfiles de diagnóstico específicos para procesos infecciosos e inflamatorios y en afecciones patofisiológicas de embarazo en general. Por consiguiente, los datos presentados en la presente invención demuestran que la expresión diferencial de proteínas en el líquido amniótico, así como otros fluidos biológicos, tales como el suero, representa una estrategia válida para un diagnóstico, pronóstico, y monitorización rápidas, no invasivas y precisas de varias afecciones de la madre/fetales y aneuploidías cromosómicas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

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<110> PROTEOGENIX, INC.

\hskip1cm

ROSENFELD, Ron

\hskip1cm

NAGALLA, Sri

\hskip1cm

GRAVETT, Mike

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<120> ANÁLISIS PROTEÓMICO DE FLUIDOS BIOLÓGICOS

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<130> 39767-0002 PCT

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<140> No asignado

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<141> Con la presente

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<150> US 10/400,005

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<151> 2003-03-25

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<160> 11

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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<210> 1

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<211> 259

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip0,8cm

20

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<210> 2

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip0,8cm

21

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip0,8cm

22

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<210> 4

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\hskip0,8cm

23

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<210> 5

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<211> 139

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 5

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\hskip0,8cm

24

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<210> 6

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\hskip0,8cm

25

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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\hskip0,8cm

26

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<210> 8

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip0,8cm

27

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<210> 9

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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\hskip0,8cm

28

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<210> 10

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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29

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<210> 11

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapeins

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<400> 11

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\hskip0,8cm

30

Claims

1. Método para el diagnóstico de una infeccción intramaniótica en una sujeto hembra preñada, que comprende

(b) diagnosticar una infección intraamniótica en dicho sujeto si dicho perfil proteómico comprende un patrón de expresión único en relación con el perfil proteómico de una muestra normal, donde el patrón de expresión único contiene información de por lo menos IGFBP-1 o un fragmento, precursor o variante natural de la misma, y calgranulina o un fragmento, precursor o variante natural de la misma.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho sujeto es humano.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en líquido amniótico, suero, plasma, orina, fluido cerebroespinal, leche de mama, moco y saliva.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho fluido biológico es líquido amniótico, suero o plasma.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho fluido biológico es líquido amniótico.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dichas IGFBP-1 y calgranulina se representan de manera más abundante en dicha muestra de prueba en relación con dicha muestra normal.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dichas IGFBP-1 y calgranulina se expresan de manera diferencial en dicha muestra de prueba en relación con dicha muestra normal.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicho perfil proteómico se produce mediante espectrometría de masas, análisis por microarray de proteínas o un inmunoensayo.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho perfil proteómico se produce mediante un inmunoensayo.

10. Método según la reivindicación 9 en el que dicho inmunoensayo es transferencia Western.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en el que el patrón de expresión único contiene adicionalmente información de por los menos azurocidina.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el patrón de expresión único contiene adicionalmente información de la expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: proteína de recubrimiento ("capping") de macrófagos; lipocalina asociada con neutrófilo gelatinasa; mieloperoxidasa; L-plastina; proteína antibacteriana FALL-39; proteína variante Gp340; homólogo de la proteína de la glándula salivar de Ebner (GenBank No., de Acceso. 355392); inhibidor de la leucocito elastasa; cofilina; moesina; profilina I; proteína p57 de tipo cronina; annexina II; fibronectina; nexina derivada glial; antitrombina-III; antígeno 1 del carcinoma de células escamosas; antígeno 2 del carcinoma de células escamosas; serpina 12; cistatina A; cistatina B; cistatina C; proteína de unión a vitamina D; apolipoproteína A-I; proteína sigma 14-3-3; proteína zeta/delta 14-3-3; gelsolina; lactotransferrina; fosfoglicerato quinasa 1; fosfoglicerato mutasa 1; y transquetolasa; o un fragmento, precursor o variante natural de las
mismas.

13. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en el que el perfil proteómico contiene información de la expresión de una o más proteínas adicionales indicadas en las Tablas 2-4.

14. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en el que por lo menos una de dichas IGFBP-1 y calgranulina, o un fragmento, precursor o variante natural de las mismas, se sobreexpresa en dicha muestra de prueba en relación con dicha muestra normal.

15. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en el que la presencia de IGFBP-1 se detecta mediante la identificación del fragmento proteolítico según SEC.ID.NO:1, SEC.ID.NO:2, SEC.ID.NO:3 o SEC.ID.NO:4 o un fragmento de las mismas.

16. Método según cualquiera una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha calgranulina se selecciona entre calgranulina A o calgranulina B.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicha calgranulina es calgranulina B.

18. Array de proteínas que comprende IGFBP-1 y calgranulina inmovilizada sobre un soporte sólido.

19. Array de proteínas que comprende IGFBP-1, calgranulina y azurocidina inmovilizada sobre un soporte sólido.

20. Utilización de una combinación de anticuerpos que comprende por lo menos anticuerpos anti-IGFBP-1 y anti-calgranulina en un método para el diagnóstico de una infección intraamniótica.

21. Array de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen específicamente a IGFBP-1 y calgranulina, inmovilizados sobre un soporte sólido.

22. Array de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen específicamente a IGFBP-1, calgranulina y azurocidina inmovilizados sobre un soporte sólido.