CN105372414B - 大熊猫乳汁中关键因子的分析方法 - Google Patents

大熊猫乳汁中关键因子的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，包括如下步骤：（1）采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，（2）通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，（3）将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，（4）通过OPLS‑DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定，（5）通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子。

Description

大熊猫乳汁中关键因子的分析方法
技术领域
本发明属于大熊猫人工养殖领域，具体涉及一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法。
背景技术
大熊猫育幼成活难曾经是圈养大熊猫“三难”问题之一。综合统计表明，在圈养条件下，从1963年-1990年的27年里，大熊猫幼仔的成活率(半岁)仅为33.9％。上世纪90年代以来，由于大熊猫幼仔出生时非常严重的免疫缺陷，科学家认识到对大熊猫幼仔及时补充母兽初乳的重要性。科学家通过开展大熊猫母兽与人工轮换哺育幼仔以及人工补充初乳的方式，大熊猫幼仔的成活率已经得到了显著提高。近5年来，幼仔成活率保持在90％以上。尽管已经意识到初乳对于大熊猫幼仔建立被动免疫的重要性，但是截止到目前为止，大熊猫乳汁尤其是初乳中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析。之前的相关研究主要集中于测定乳汁中的粗蛋白含量，大熊猫乳汁蛋白的氨基酸序列分析及其功能性研究并未开展。关于大熊猫乳汁中其它营养成分的分析，之前的研究主要集中于测定乳汁的粗脂肪、粗灰分、乳糖、矿物元素、维生素等营养物质。由于受到仪器设备及大熊猫乳汁样本数量的限制，大熊猫在不同泌乳阶段的营养成分分析未能开展研究。
发明内容
本发明目的是提供一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，解决大熊猫乳汁尤其是初乳中对于幼仔免疫力发育至关重要的蛋白成分未能进行有效分析的问题。
本发明的技术方案为：一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，包括如下步骤：
(1)采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，
(2)通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，
(3)将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，
(4)通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定，
(5)通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子。
进一步地，步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的步骤为：
1)将采集的乳汁经降解离心处理后通过LC-MS处理，得到乳汁成分的液相质谱数据；
2)将液相质谱数据与代谢组学数据库对比，筛选得到成分因子LC-HRMS因子。
进一步地，步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的具体方法为：
在室温溶解采集的乳汁样品，各取50μl乳汁样品加入体积比为1:1的methanol/acetonitrile溶液，混合溶液，超声波降解20秒，15000rpm，4℃离心10min，取上清液，将上清液样品置入Accela 600HPLC系统后，系统从HiChrom中吸取10ul各样品溶液注入ZIC-pHILIC柱中，整个LC-MS分析过程中，样品上机顺序安排为随机，将所得到的数据输出到Excel表中，消除背景噪音，信号的最大强度必须超过空白对照信号的20倍，否则便被从库中移除，之后用代谢组学数据库并基于准确分子量推测鉴定到乳汁的成分因子LC-HRMS因子。
进一步地，步骤(3)中将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类的方法为：将经过LC-MS分析后的大熊猫乳汁中的成分因子LC-HRMS因子进行PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段分为初乳阶段、后初乳阶段和常乳阶段；初乳阶段为1-6天，后初乳阶段为6-20天，常乳阶段为20天以上。
进一步地，通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定的方法为：根据分类结果将乳汁样品在7天前后的代谢产物分子浓度分别进行准确测定，并进行OPLS-DA分析，筛选出初乳及常乳中信号强及浓度较高的成分因子LC-HRMS因子，将这些成分因子通过MZMine 2.10和标准品或元素组分分析进行成分鉴定工作。
进一步地，通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子的方法为：记录大熊猫幼仔出生后每天的体重，将当天较前一天体重的增长百分比作为大熊猫体重增长率；鉴定到的乳汁的成分因子LC-HRMS因子的浓度变化作为X变量，将大熊猫幼仔体重增长率作为Y变量，经过OPLS分析，得到与大熊猫幼仔体重增长率显著相关的成分因子，即为大熊猫乳汁中的关键因子。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明首次提出对大熊猫乳汁开展了代谢组学研究。传统的大熊猫乳汁营养成分研究仅对乳汁中的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纤维、碳水化合物进行了研究，而代谢组学分析方法更精准的对乳汁中的代谢物质进行定性和定量分析，并且可以将这些代谢物质与大熊猫幼仔生长情况进行关联性分析。
附图说明
图1：55份大熊猫乳汁样品HCA(A)树状图及PCA主成份分析点状图(BCD)；圆圈：丽丽(LL)；星状：圆圆(YY)；菱形：小丫头(XYT)。样品在PCA点状图上按深浅被分成不同的组，并分别对应HCA图上用点状线分隔的几个部分。质量控制的样品(丽丽19天1、2、3号样品)在图中圈出；
图2：55份大熊猫乳汁样品OPLS-DA回归分析的S-plot图，初乳(7天以内)与常乳(7天之后)比较。初乳中最高的50种因子与常乳中最高的20种因子分别用深色及浅色标出。插入的图片是两种寡糖异构体N262与N351的变化趋势；
图3：图中A为21份圆圆样品OPLS回归分析图，LC-HRMS数据为X变量，大熊猫幼仔体重增长率为Y变量；B为大熊猫初生幼仔体重变化趋势；C，D，E和F为各关键因子在大熊猫哺乳期的变化趋势。
具体实施方式
1.材料和方法
1.1实验材料
采用了莉莉，圆圆，小丫头三只大熊猫共55份乳汁样品。样品在采集以后2小时内放入-80℃保存一直到分析之前。
三种人工乳：安婴儿奶粉(美赞臣公司)、美国猫狗奶粉(No.IL-BLD-OO4,IllinoisUSA)和Panda milk-10(日本森永公司)。
表1试验动物情况表
表2采样信息表
1.2实验仪器和试剂
实验仪器：Accela 600HPLC系统与Exactive(Orbitrap)超高分辨质谱仪(ThermoFisher Scientific,Germany)。
试剂：高效液相色谱级乙腈(Fisher Scientific)、Ammonium carbonateand(Sigma-Aldrich)、ammonium hydroxide solution(28-30％)(Sigma-Aldrich)、metabolite standards标准物。
1.3实验方法
1.3.1样品处理
室温溶解样品。各取50μl奶样加入methanol/acetonitrile 1:1(v/v)溶液，混合溶液，超声波降解20秒。15,000rpm，4℃离心10min。取上清，加入HPLC仪器特定的管中，进行LC-MS分析。
1.3.2HILIC–HRMS and HRMSn分析
样品置入Accela 600HPLC系统后，系统从HiChrom(流动相A：20mM ammoniumcarbonate pH9.2，流动相B:高效液相色谱级乙腈)中吸取10ul各样品溶液注入ZIC-pHILIC柱(150×4.6mm,5μm)中。整个LC-MS分析过程中，样品上机顺序安排为随机。
我们同时设置了质量控制(圆圆第19天的样品重复3份，分别安排在第一个、中间与最后检测)。数据输出到Excel表中，消除背景噪音。信号的最大强度必须超过空白对照信号的20倍，否则便被从库中移除。
之后数据被输出做多变量分析。在项目组自己的宏数据库里进行比对。
1.3.3多变量分析
采用SIMCA-P version 13.0(Umetrics,Sweden)软件进行了包括PCA,HCA,OPLS-DA and OPLS的多种方法多变量分析。数据比较一致。大熊猫幼仔体重增长率在OPLS中用作单一的Y变量。计算方式是当天较前一天体重的增长百分比(SM-T3)。
2实验结果
2.1PCA及HCA分析
在排除系统干扰以后，在ESI负，正离子检测模式下分别得到了2821及1945个LC-HRMS因子，其中两种模式下都收集到的因子有368个。用代谢组学数据库基于准确分子量推测鉴别了2199个因子，93个代谢产物经过与标准品(SM-T4)进行保留时间的比对被确定。以上数据输入SIMCA-P 13软件，进行了PCA分析(通过mean centring和UV scaling)。我们得到了8个主要成分，它们在这个非常复杂的数据矩阵中表现出非常理想的模型标准并具有可预测性(R2X(cum)＝61％and Q2(cum)＝41.2％)。
本研究的一个目标是找到大熊猫初乳中物质成分变化情况以及各大熊猫个体之间的差异。在PCA分析的基础上，我们开展了层次聚类分析(HCA)，其树状图见图1中A。
来自“圆圆”(19D)的3个用作质量控制的重复样品，表现出了LC-HRMS信号的高度重复性，在HCA树状图及PCA点状图(图1中A及1中B的圆圈内)中被聚到了一起，表明我们的LC-HRMS系统在整个实验过程中是稳定可靠的。在SIMCA-P中以一定维度横向交叉树状图，PCA点状图中的数据聚类情况也会发生相应变化，因此更多的主要因子得以在二维的PCA点状图中被描述出来。如在图1中A及图1中B中显示的那样，分娩后大约20天后，第一个重要因子开始将乳汁样品明显分开来，提示此时可能在乳汁的成分以及含量上均发生了明显的变化。随着更多重要因子加入到分析中，我们得到了关于分娩后乳汁变化及不同大熊猫个体间比较的更精细的数据。在图1中C中，用第二重要因子对分娩后20天内的大熊猫乳汁样品(图1中B中的深色圆圈、星状与菱形部分)进行分类时，样品被分成了两个组，以分娩后第6天为界限。图1中B中的浅色星状与菱形部分(分娩20天以后的乳汁样品)被第三重要因子进一步分成了两个群，并且每个群中的样品分别属于同一只大熊猫。需要指出的是，在这两个群之间的巨大分界线提示在不同大熊猫个体的常乳代谢产物之间可能存在非常大的差异。在图1中D中，当第4及第5重要因子被加入，图1中C中第7天-20天乳汁样品被进一步聚类成了3个小的亚群。从图上可以明显看出，该三个亚群分别属于3只大熊猫个体。我们没有采集到大熊猫“丽丽”在分娩19天后的样品。但我们推测，其此后的乳汁样品也将与其它两只大熊猫个体远远分开。这两只大熊猫个体之间的分隔是如此明显，可被观察到。剩下的其他重要因子引入分析后的结果不在列出，因为它们对该PCA模型的影响太小了。从对图1的观察中我们可以看出，大熊猫乳汁代谢产物分布表现出非常明显的时间相关性，并且个体间的差异随着分娩后时间的增长而增大。在分娩后6天以内，三只大熊猫乳汁样品差异相对较小，提示在它们的初乳中可能存在一些共同的生物标记，随着分娩后时间的增加，它们的差异越来越显著。在20天后，大熊猫个体间的明显差异界限被观察到。因此，我们的样品可以被分类为初乳(1-6天)、后初乳(6-20天)和常乳(20天以上)或者1周、2-3周和3周以上。
2.2对55份大熊猫乳汁样品进行OPLS-DA分析
为了对乳汁样品在7天前后的代谢产物分子浓度进行准确测定，我们开展了OPLS-DA分析。我们观察到得分图上明显的分界线(R2X(cum)＝89.9％and Q2(cum)＝80.6％)。同时为了可视化初乳中潜在的分子标记，我们将S-Plot图进行了处理，见图2。在初乳中选择了50个信号强及可信度高的LC-HRMS因子，在常乳中选择了20个因子，并分别在点状图中用深色与浅色表示。非质子加合物及符合离子是通过MZMine 2.10分析处理的，并对其原始LC-HRMS数据进行了人工验证。在这些LC-HRMS因子中有很大比例(40％)都是用这种方式鉴定出来，说明了在进一步鉴定工作/实验之前开展非分子离子评估的必要性。余下的因子都是通过标准品或元素组成分析(准确的质量和同位素分数)和MS/MS碎片实验推定的，通过这些手段，它们的化学分类成分可以被推演出来。
LC-HRMS因子具有在化学分子分类中具有高度的多样性，包括了氨基酸、寡糖、脂类。大熊猫乳汁不仅含有供给幼体的营养成分，也含有母体排出的代谢产物。因此本研究毫不意外观察到了一些可以反映大熊猫母体由分娩造成的代谢变化的小的代谢产物。在早期样品中出现的肌酐(creatine)与磷酸肌酸(phosphocreatine)提示大熊猫母亲分娩时对肌肉的大量应用，而此后其二者水平的大幅度下降显示了大熊猫母亲正慢慢恢复到正常的肌肉使用水平。
此前有报道表明大熊猫乳汁中的乳糖含量相比其他哺乳动物如猪和人类等要低。本研究显示，乳糖在大熊猫初乳中的含量还是相对较高的，但随着分娩后时间的推移逐渐降低，不过与本实验中同时进行检测的三种大熊猫所使用的人工乳相比，人工乳中的乳糖含量还是太高了。
要注意到两种唾液酸双糖异构体(sialylated disaccharide isomers)在整个产后期的变化趋势是完全相反的(见图2)。它们的MS/MS光谱分析显示了许多相同的片段但是在比率上却有着显著差异(SM-F1)。其片段模式与已发表数据经过比较，它们被分别确认为3’-唾液乳糖(3’-sialyllactose，N262,初乳中含量较高)和6’-唾液乳糖(6’-sialyllactose，N351，初乳中含量低)。
本研究发现的另一个重要的唾液酸双糖被推定为Gc2-3Lac，在比较它们的MS/MS片段(SM-F2)后发现，其与3’-sialyllactose在唾液酸基团上只有一个氧分子的差别。最近有研究报道，唾液乳糖与其它的唾液酸寡糖在抵抗病原体、肠道炎症、以及免疫功能和认知能力发展都可能有着重要作用。因此，本研究结果提示这些初乳中含有的唾液酸寡糖可能对大熊猫出生幼仔存活能力有着非常重要的作用。
研究发现，与大熊猫人工乳样品相比，这三种人工乳中的唾液酸寡糖的含量均非常低。然而获得的它们的HILI色层分离数据不够好，因此未能进行有效的分析比较。
在图1中D中，“圆圆”与“小丫头”分娩20天以后的样品直接有着明显的分界，提示大熊猫乳汁中代谢产物成分在此阶段开始表现出明显的个体差异性。对这些样品进行OPLS-DA分析，并做点状图(SM-F3)，以其发现造成这种差异的主要成分因子/代谢产物。我们从每个大熊猫母亲处均得到了20个强度高可靠性好的LC-HRMS因子，并列在SM-T5中。它们中大部分是小分子代谢产物而非大的营养因子(脂类及寡糖)。例如，一些酰肌肉毒碱(acylcarnitines)水平的显著差异可能表明了这两个大熊猫母亲个体脂肪酸代谢水平的不同。研究认为大熊猫母亲可能会逐步适应分娩后代谢的变化而后泌乳，然后乳腺开始生产出常乳，其营养成分的含量与丰度不会有非常大的区别。不过在常乳后期，个体化因子如年龄、基因、饮食习惯以及分娩历史等都可能造成体液包括乳汁的成分不同。
2.3发现并鉴定大熊猫乳汁中对幼体生长的关键因子
为了发现大熊猫乳汁中对大熊猫幼仔生长具有潜在作用的关键成分，我们用OPLS做回归分析，LC-HRMS数据为X变量，大熊猫幼仔体重增长率为Y变量。从上面的论述里我们知道，大熊猫母亲个体间可能出现大熊猫乳汁中成分的巨大差异，尤其是在分娩20天之后。在分析了产后乳汁采集情况之后(“丽丽”在分娩20天后未采集到样品；“小丫头”只有分娩后前10天的样品)，回归分析主要集中在一个大熊猫母亲“圆圆”上。分析结果见图3中A，其中潜在的关键成分在图中用深色标注。理论上与OPLS高度相关的X变量具有高的正相关分值，但正交分数趋近于零，其应该位于点状图水平轴上的最右方。图3中我们用了5个线性图(图3B-F)来进一步解释选择这些关键因子的策略。图3中B中可以看出，大熊猫幼仔体重在初乳早期经历了飞速上涨，7天之后其涨速逐渐降低到了一个相对比较低的水平。本项目想要找出的关键因子理论上应该与体重增长有相似的走势，但考虑到它们要持续支撑大熊猫幼仔生长，其水平应该在大熊猫哺乳中期略有上升，并在常乳中保持一定的含量。图3中C显示了一个很典型的潜在关键因子N258的走势图，其含量一开始很低，然后在泌乳早期显著增加，最后保持在一个相对稳定的水平上。与图3中B、3中C比较，3D-3F显示了3种不同的变化趋势，提示这些代谢产物可能是关键因子。因此我们设置在正向水平轴向上45度及向下10度左右寻找可能的关键因子，最终筛选到了50个最高强度的点(图3，深色标记)作为大熊猫乳汁中促进幼仔体重增长的可能关键因子。
进一步与标准品与MS/MS的保留时间进行比较之后，最终对关键因子进行了确定。最有意思的成分是N258，跟与此前关于大熊猫乳汁中寡糖的报道，其被定义为isoglobotriose，我们的MS2分析系统对此进行了确认。我们同时对其它两只大熊猫个体乳汁样品进行了N528变化趋势分析，并得到了相同的变化曲线(SM-F9)。因此isoglobotriose在大熊猫乳汁中的变化趋势是在初乳中含量很低，随后显著上升，并最终在此常乳中保持一定的含量。与大熊猫乳汁中乳糖变化趋势(SM-F7)相比，isoglobotriose明显在刺激及保持大熊猫幼仔体重增长方面具有更重要的作用。需要再一次指出的是，与乳汁样品相比，3种大熊猫人工乳中isoglobotriose的含量都非常低，甚至低过了其在初乳中的含量。这可能是因为这些奶粉都是以牛奶为基础原料制造而来的，而牛奶中isoglobotriose的含量是很低的。
Sn-glycero-3-phosphocholine与sn-glycero-3-phosphethanolamine是另两种有趣的因子，三只大熊猫均表现出了理想的趋势(SM-F4/5)。它们具有在许多磷脂中含有的亲水性头部。一方面这些乳汁中含有游离脂肪酸的头部基团结合，大熊猫幼仔可能具有构建各种磷脂的能力，这些磷脂是其生长时构建细胞膜所必须的。另一方面，这可能是大熊猫母亲乳腺持续制造脂肪或磷脂的证据。此外，这两种因子还都是磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphate)的前体，磷酸甘油脱氢酶参与了许多基本生物合成反应。由于受到现有方法分离及检测上的限制，脂肪酸和磷脂的推定只建立在准确质量(mass)的基础上(包括亚油酸:多不饱和ω-6脂肪酸，被认为是皮肤及毛发生长的关键营养因子)。下一步将在本项目组脂类组学的分析平台上对这些脂肪及脂肪酸进行准确鉴定及定量分析。
2.4大熊猫乳汁中寡糖的变化趋势
研究中发现，在我们的变量方差分析中发现的许多关键因子都是寡糖。此前人们对几种熊类(Ezo棕熊、日本黑熊以及北极熊)的乳汁样品进行分析的结果显示，其寡糖也表现出了高度一致的特性。考虑到大熊猫与熊分类上非常接近，因此在大熊猫乳汁中出现这种相似性并不令人意外。尽管采用目前的方法我们还不能准确的描述出大熊猫乳汁中各寡糖四种基本元素的连接方式与位置(葡萄糖与半乳糖具有相同的分子质量)，但仍可以通过它们的数量绘制出这些代谢物结构的大概轮廓。之前研究报道过的大熊猫乳汁中的六糖低聚糖(包括乳糖)在我们的研究中全部检测到了，并具有很高的含量。此外，熊乳汁里报道发现的15种寡糖，本研究找到了其中的11个；本研究还发现了人乳汁的寡糖库中具有的5个寡糖。如在SM-F6-37中显示的那样，随着分娩后时间的推移，3只大熊猫乳汁样品中各寡糖成分开始出现不同的变化趋势。一些寡糖只在初乳(1-7天)中出现，一些只在常乳中出现(20天以后)。此外，这种变化趋势在3只大熊猫个体中是可复制的。比如，在大熊猫“丽丽”乳样中未检测到N4511的原因很简单，是没采集到其分娩19天以后的样品。这些寡糖在3只大熊猫乳汁样品中清晰可重复的变化在很大程度上决定了样品在PCA点状图上的分布，而它们随时间而变化的趋势表明它们可能在大熊猫母体不同泌乳期中扮演着重要的角色。
本研究观察到其它一些碳水复合物如糖醇，糖酸及寡糖的派生产物变化趋势也与时间密切相关。研究没有观察到寡糖结构与其在泌乳期中变化趋势的明显相关关系。结合其他代谢产物的变化开展分析，可能对于探索大熊猫乳腺在泌乳期变化提供了一种可能性。本项目组的HILIC-HRMS方法(在HILIC模型中餐用高PH流动相的ZIC-pHILIC柱)显示了对寡糖分析的超强能力，如分开了两组同分异构体(N262/N351，N1594/N4517)，并检测到了许多低含量的碳水化合物。下一步计划在现有实验方法上改善色析法的条件(LC梯度，流动相成分等)，以期提高分离效率；进一步采用UniCarb-DB方法开展MS/MS实验以期得到更多寡糖分子结构信息。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (4)

1.一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集分娩后的大熊猫在不同阶段的乳汁，
(2)通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分因子进行推测鉴定，
(3)将成分因子经过PCA和HCA分析，将大熊猫的泌乳阶段进行分类，
(4)通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定，
(5)通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子；
步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的步骤为：
1)将采集的乳汁经降解离心处理后通过LC-MS处理，得到乳汁成分的液相质谱数据；
2)将液相质谱数据与代谢组学数据库对比，筛选得到成分因子LC-HRMS因子；
步骤(3)中将所述代谢组学得到的成分因子，用SIMCA-P软件进行PCA分析，得到乳汁中的8个主要成分，在PCA分析的基础上，开展HCA分析，分娩后20天后，第一主要成分开始将乳汁样品区分开来，提示此时在乳汁的成分以及含量上均发生了明显变化，用第二主要成分对分娩后20天内的大熊猫乳汁样品进行分类时，样品被分成了两个组，以分娩后第6天为界限，剩下的其他主要成分引入分析后的结果不再列出，在分娩后6天以内，三只大熊猫乳汁样品差异相对较小，提示在它们的初乳中存在共同的生物标记，随着分娩后时间的增加，它们的差异越来越显著，在20天后，大熊猫个体间的明显差异界限被观察到，因此，将大熊猫的泌乳阶段分为初乳阶段、后初乳阶段和常乳阶段；初乳阶段为1-6天，后初乳阶段为6-20天，常乳阶段为20天以上，所述PCA中文名称为主成分分析，所述HCA中文名称为层次聚类分析，所述OPLS中文名称为偏最小二乘分析，所述OPLS-DA中文名称为正交偏最小二乘判别分析。
2.根据权利要求1所述的一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，其特征在于：步骤(2)中通过代谢组学的分析手段对乳汁中的成分进行推测鉴定的具体方法为：
在室温溶解采集的乳汁样品，各取50μl乳汁样品加入体积比为1:1的methanol/acetonitrile溶液，混合溶液，超声波降解20秒，15000rpm，4℃离心10min，取上清液，将上清液样品置入Accela 600HPLC系统后，系统从HiChrom中吸取10ul各样品溶液注入ZIC-pHILIC柱中，整个LC-MS分析过程中，样品上机顺序安排为随机，将所得到的数据输出到Excel表中，消除背景噪音，信号的最大强度必须超过空白对照信号的20倍，否则便被从库中移除，之后用代谢组学数据库并基于准确分子量推测鉴定到乳汁的成分因子LC-HRMS因子。
3.根据权利要求1所述的一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，其特征在于：通过OPLS-DA分析方法筛选出不同泌乳阶段信号强且浓度较高的成分因子，并对这些成分因子进行成分鉴定的方法为：根据分类结果将乳汁样品在7天前后的代谢产物分子浓度分别进行准确测定，并进行OPLS-DA分析，筛选出初乳及常乳中信号强及浓度较高的成分因子LC-HRMS因子，将这些成分因子通过MZMine 2.10和标准品或元素组分分析进行成分鉴定工作。
4.根据权利要求3所述的一种大熊猫乳汁中关键因子的分析方法，其特征在于：通过OPLS分析方法将这些被鉴定的成分因子的成分浓度变化情况与大熊猫幼仔体重增长率进行关联分析，最终筛选到大熊猫乳汁中对于大熊猫幼仔生长具有关键作用的因子的方法为：记录大熊猫幼仔出生后每天的体重，将当天较前一天体重的增长百分比作为大熊猫体重增长率；鉴定到的乳汁的成分因子LC-HRMS因子的浓度变化作为X变量，将大熊猫幼仔体重增长率作为Y变量，经过OPLS分析，得到与大熊猫幼仔体重增长率显著相关的成分因子，即为大熊猫乳汁中的关键因子。
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