ES2955883T3 - Pares de biomarcadores para la predicción del parto prematuro - Google Patents

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Abstract

La divulgación proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1 y APOC3/LYAM1, en donde el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre hembras preñadas en riesgo de Controles de nacimientos prematuros y de término. También se proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, comprendiendo el método medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SFIBG, IBP4 /PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG , PEDF/LYAMl, CD14/LYAM1 y APOC3/LYAM1 para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Pares de biomarcadores para la predicción del parto prematuro
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 62/290,796, presentada el 3 de febrero de 2016, la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No.62/387,420, presentada el 24 de diciembre de 2015, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No.62/182,349, presentada el 19 de junio de 2015.
La enseñanza se refiere en general al campo de la medicina de precisión y, más específicamente, a composiciones y métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada.
Antecedentes
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, se estima que 15 millones de bebés nacen prematuros (antes de las 37 semanas completas de gestación) cada año. En casi todos los países con datos confiables, las tasas de partos prematuros están aumentando. Véase, World Health Organization; March of Dimes; The Partnership for Maternal, Newborn & Child Health; Save the Children, Born too soon the global action report on preterm birth, ISBN 9789241503433(2012). Se estima que 1 millón de bebés mueren anualmente por complicaciones del parto prematuro. A nivel mundial, el parto prematuro es la principal causa de muerte de recién nacidos (bebés en las primeras cuatro semanas de vida) y la segunda causa de muerte después de la neumonía en niños menores de cinco años. Muchos sobrevivientes enfrentan una discapacidad de por vida, que incluye discapacidades de aprendizaje y problemas visuales y auditivos.
En 184 países con datos confiables, la tasa de partos prematuros varía desde el 5 % hasta el 18 % de los bebés nacidos. Blencowe et al., “National, regional and worldwide estimates of preterm birth.” The Lancet, 9; 379(9832):2162-72 (2012). Si bien más del 60 % de los partos prematuros ocurren en África y el sur de Asia, el parto prematuro es, sin embargo, un problema mundial. Los países con los números más altos incluyen Brasil, India, Nigeria y los Estados Unidos de América. De los 11 países con tasas de partos prematuros superiores al 15 %, todos menos dos se encuentran en el África subsahariana. En los países más pobres, en promedio, el 12 % de los bebés nacen demasiado pronto, en comparación con el 9 % en los países de mayores ingresos. Dentro de los países, las familias más pobres están en mayor riesgo. Más de las tres cuartas partes de los bebés prematuros se pueden salvar con atención factible y rentable, por ejemplo, inyecciones antenatales de esteroides administradas a mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro para fortalecer los pulmones de los bebés.
Los recién nacidos prematuros corren un mayor riesgo de mortalidad y una variedad de problemas de salud y desarrollo que los recién nacidos a término. Las complicaciones incluyen problemas agudos respiratorios, gastrointestinales, inmunológicos, del sistema nervioso central, auditivos y visuales, así como problemas motores, cognitivos, visuales, auditivos, conductuales, socioemocionales, de salud y de crecimiento a largo plazo. El nacimiento de un lactante prematuro también puede generar costes emocionales y económicos considerables para las familias y tener implicaciones para los servicios del sector público, tales como el seguro de salud, educación y otros sistemas de apoyo social. El mayor riesgo de mortalidad y morbilidad es para aquellos lactantes que nacen en las edades gestacionales más tempranas. Sin embargo, los lactantes nacidos más cerca del término representan la mayor cantidad de lactantes prematuros y también experimentan más complicaciones que los lactantes nacidos a término. Para prevenir el parto prematuro en mujeres que tienen menos de 24 semanas de embarazo con una ecografía que muestra la apertura del cuello uterino, se puede emplear un procedimiento quirúrgico conocido como cerclaje de cuello uterino en el que se cierra el cuello uterino con suturas fuertes. Para las mujeres con menos de 34 semanas de embarazo y en trabajo de parto prematuro activo, puede ser necesaria la hospitalización, así como la administración de medicamentos para detener temporalmente el trabajo de parto prematuro y/o promover el desarrollo pulmonar fetal. Si se determina que una mujer embarazada corre el riesgo de tener un parto prematuro, los proveedores de atención médica pueden implementar varias estrategias clínicas que pueden incluir medicamentos preventivos, por ejemplo, inyecciones de caproato de 17-α hidroxiprogesterona (Makena) y/o gel de progesterona vaginal, pesarios cervicales, restricciones en actividad sexual y/u otras actividades físicas, y alteraciones de los tratamientos para afecciones crónicas, tales como diabetes y presión arterial alta, que aumentan el riesgo de parto prematuro.
Existe una gran necesidad de identificar y proporcionar atención antenatal adecuada a las mujeres en riesgo de parto prematuro. Las mujeres identificadas como de alto riesgo pueden ser programadas para una vigilancia antenatal más intensiva e intervenciones profilácticas. Las estrategias actuales para la evaluación del riesgo se basan en la historia médica y obstétrica y el examen clínico, pero estas estrategias solo pueden identificar un pequeño porcentaje de mujeres que están en riesgo de nacimiento prematuro. La historia previa de PTB espontáneo (sPTB) es actualmente el único predictor más fuerte de PTB subsiguiente. Después de un sPTB anterior, la probabilidad de un segundo PTB es del 30 al 50 %. Otros factores de riesgo maternos incluyen: raza negra, índice de masa corporal materno bajo y longitud cervical corta. Los estudios de líquido amniótico, líquido cervicovaginal y biomarcadores en suero para predecir el sPTB sugieren que múltiples rutas moleculares son anómalas en las mujeres que finalmente dan a luz de manera prematura. La identificación temprana confiable del riesgo de parto prematuro permitiría planificar una monitorización y manejo clínico adecuados para prevenir el nacimiento prematuro. Dicha monitorización y manejo podría incluir: visitas de atención prenatal más frecuentes, mediciones seriadas de la longitud del cuello uterino, mayor educación sobre los signos y síntomas del trabajo de parto prematuro temprano, intervenciones en el estilo de vida para comportamientos de riesgo modificables, tales como dejar de fumar, pesarios cervicales y tratamiento con progesterona. Finalmente, la identificación antenatal confiable del riesgo de parto prematuro también es crucial para la asignación rentable de recursos de monitorización.
A pesar de la intensa investigación para identificar a las mujeres en riesgo, los algoritmos de predicción de PTB basados únicamente en factores clínicos y demográficos o utilizando biomarcadores medidos en suero o vaginal no han resultado en pruebas clínicamente útiles. Se necesitan métodos más precisos para identificar a las mujeres en riesgo durante su primer embarazo y lo suficientemente temprano en la gestación para permitir la intervención clínica. La presente enseñanza aborda esta necesidad al proporcionar composiciones y métodos para determinar si una mujer embarazada está en riesgo de parto prematuro. También se proporcionan ventajas relacionadas.
Resumen
La presente enseñanza proporciona composiciones y métodos para predecir la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada.
La enseñanza proporciona biomarcadores aislados seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza pueden predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los biomarcadores aislados se seleccionan del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF. CD14. y APOC3.
La enseñanza proporciona péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. En algunas realizaciones, los péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados se seleccionan del grupo de péptidos sustitutos establecidos en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza y sus péptidos sustitutos se pueden utilizar en métodos para predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los péptidos sustitutos corresponden a biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14 y APOC3.
La enseñanza proporciona péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) que corresponden a los péptidos sustitutos seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza, sus péptidos sustitutos y los péptidos SIS se pueden utilizar en métodos para predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los péptidos SIS corresponden a péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14 y APOC3.
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la divulgación de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención. En particular, el término “realización” no se debe interpretar como una referencia necesaria a una realización de la invención, a menos que la “realización” en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones.
La enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en los biomarcadores aislados enumerados en la Tabla 26, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de la relación entre las mujeres embarazadas con riesgo de parto prematuro y los controles a término.
La enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4 y HPX/PTGDS, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en valor de la relación entre mujeres embarazadas con riesgo de parto prematuro y controles a término.
La enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de relación entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
En una realización, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
En una realización, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
En una realización, la enseñanza proporciona una composición que comprende un par de péptidos sustitutos que corresponden a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización, la enseñanza proporciona una composición que comprende un par de péptidos sustitutos que corresponden a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización particular, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados IBP4/SHBG, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término. En una realización adicional, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados IBP4/SHBG, en los que el par de biomarcadores exhibe una mayor relación en mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término.
En una realización, la enseñanza proporciona una composición que comprende un par de péptidos sustitutos que corresponden a un par de biomarcadores IBP4/SHBG, en los que el par de biomarcadores exhibe una mayor relación en mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, el panel comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para los péptidos sustitutos derivados de cada uno de dichos biomarcadores.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, el panel comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para los péptidos sustitutos derivados de cada uno de dichos biomarcadores.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, el panel comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, el panel comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en el que al menos uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en el que al menos uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que una puntuación calculada, derivada del panel de al menos dos pares de biomarcadores exhibe un cambio en el valor entre mujeres embarazadas y control a términos. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, n los que una puntuación calculada, derivada del panel de al menos dos pares de biomarcadores exhibe un cambio en el valor entre mujeres embarazadas y control a términos. En una realización, la composición comprende péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada una relación para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada una relación para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1 para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2 . En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En algunas realizaciones, determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca una etapa inicial que incluye la formación de un índice de probabilidad/riesgo al medir la relación de biomarcadores aislados seleccionados del grupo en una cohorte de embarazos prematuros y embarazos a término con edad gestacional conocida al nacer. En realizaciones adicionales, el índice de riesgo prematuro se forma al medir la relación de IBP4/SHBG en una cohorte de embarazos prematuros y a término donde se registra la edad gestacional al nacer. En algunas realizaciones, determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada comprende medir la relación de IBP4/SHBG y comparar el valor con el índice para derivar el riesgo prematuro utilizando las mismas tecnologías de medición y aislamiento para derivar IBP4/SHBG como en el grupo índice.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1 para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, IHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1 para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en las intensidades relativas de los biomarcadores individuales entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En realizaciones adicionales, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para un par de biomarcadores que consiste en IBP4 y SHBG para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para un par de biomarcadores que consiste en una relación de IBP4 sobre SHBG (IBP4/SHBG) para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada, en la que una mayor relación en la mujer embarazada en comparación con los controles a término indica un mayor riesgo de parto prematuro. En realizaciones adicionales, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para un par de biomarcadores IBP4 y SHBG para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 y menor de o igual a 37 kg/m2. En algunas realizaciones, el método comprende una etapa inicial de obtener una muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende detectar, medir o cuantificar un péptido sustituto SIS de cada uno de los biomarcadores.
La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1 en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un primer agente de captura que se une específicamente a un primer miembro de dicho par y un segundo agente de captura que se une específicamente a un segundo miembro de dicho par; y detectar la unión entre el primer biomarcador de dicho par y el primer agente de captura y entre el segundo miembro de dicho par y el segundo agente de captura.
En una realización la enseñanza proporciona un método para detectar IBP4 y SHBG en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si IBP4 y SHBG están presentes en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente de captura que se une específicamente a IBP4 y un agente de captura que se une específicamente a SHBG; y c. detectar la unión entre IBP4 y el agente de captura y entre SHBG y el agente de captura. En una realización, el método comprende medir un valor de reversión para el par de biomarcadores. En una realización adicional, la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En una realización, la muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de edad gestacional. En una realización adicional, el agente de captura se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo, fragmento de anticuerpo, reactivo de unión a proteínas a base de ácidos nucleicos, molécula pequeña o variante de los mismos. En una realización adicional, el método se realiza mediante un ensayo seleccionado del grupo que consiste en inmunoensayo enzimático (EIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayo (RIA). La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1 en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; y b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica que comprende someter la muestra a un flujo de trabajo de proteómica compuesto de cuantificación por espectrometría de masas.
En una realización la enseñanza proporciona un método para detectar IBP4 y SHBG en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; y b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica que comprende someter la muestra a un flujo de trabajo de proteómica compuesto de cuantificación por espectrometría de masas.
En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en las intensidades relativas de los biomarcadores individuales entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En realizaciones adicionales, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada. En una realización un índice de riesgo prematuro se forma al medir la relación de IBP4/SHBG en una cohorte de embarazos prematuros y a término donde se registra la edad gestacional al nacer. Luego, en la práctica clínica la relación medida de IBP4/SHBG en un embarazo individual se compara con el índice para derivar el riesgo prematuro utilizando las mismas tecnologías de medición y aislamiento para derivar IBP4/SHBG como en el grupo índice.
Otras características y ventajas de la enseñanza serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Ventanas de extracción de sangre. El rendimiento de reversión individual se muestra en las ventanas de extracción de sangre. Reversiones mostradas: IBP4/SHBG; VTNC/VTDB; IBP4/SHBG; VTNC/SHBG; IBP4/SHBG; CATD/SHBG; PSG2/ITIH4; CHL1/ITIH4; PSG2/C1QB; PSG2/FBLN3; HEMO/IBPG; HEMO/PTGDS.
Figura 2. Caso de descubrimiento, caso de verificación y caso de validación para GABD.
Figura 3. Expresión de proteínas durante el embarazo. Se pueden analizar varias proteínas en base al comportamiento conocido de las proteínas y en el conocimiento de las proteínas/rutas que no se ven afectadas por el parto prematuro. La Figura 3 muestra la expresión de proteínas relacionadas con el embarazo durante la gestación. Estas proteínas y sus redes no se ven afectadas por la patología del prematuro en la edad gestacional mostrada.
Figura 4. Expresión de proteínas durante el embarazo. La Figura 4 muestra una versión ampliada de la gráfica mostrada en la Figura 3 en relación con la hormona del crecimiento específica de la placenta.
Figura 5. Patología de proteínas durante el embarazo. La proteína de fijación 4 al factor de crecimiento similar a la insulina (IBP4) se sobreexpresó en al menos un 10 % en la ventana de extracción de sangre de 19-21 semanas. La globulina fijadora a hormonas sexuales (SHBG) se subexpresó en al menos un 10 % en la ventana de extracción de sangre de 19-21 semanas.
Figura 6. Criterios de selección de verificación. La Figura 6 describe los criterios para realizar una prueba de alto rendimiento de prematuros sólida desde el punto de vista clínico y analítico.
Figura 7. Validación Cruzada de Monte Carlo (MCVV). MCCV es un método conservador que estima qué tan bien funcionará un clasificador en un conjunto independiente de muestras extraídas de la misma población (por ejemplo, PAPR).
Figura 8. Análisis de [IBP4]/[SHBG CHL1 CLUS]. CHL1 y CLUS aumentaron el rendimiento en 0.03 en relación solo con IBP4/SHBG.
Figura 9. Análisis de potencia y tamaño de muestra. El análisis de potencia y tamaño de muestra predice la probabilidad de que un estudio tenga la potencia suficiente para rechazar la hipótesis nula (AUC= 0.5) en los umbrales del número de muestra y las estimaciones de rendimiento.
Figura 10. Reloj de embarazo y tiempo hasta el parto. Se pueden utilizar múltiples analitos que aumentan en el embarazo pero que no son diferentes en los casos de PTB y los controles para fechar el embarazo bioquímicamente. La datación bioquímica podría ser útil para confirmar la datación por la fecha del último período menstrual o la datación por ultrasonido, o antes de las determinaciones posteriores del riesgo de sPTB, TTB o predicción de GAB.
Figura 11. Desarrollo del clasificador. La Figura 11 muestra los criterios para desarrollar clasificadores.
Figura 12. Cobertura de la ruta en el ensayo de descubrimiento. La Figura 12 muestra la distribución de proteínas por ruta.
Figura 13. El PCA de los datos de descubrimiento detecta cambios a través de las ventanas de extracción de sangre y, por lo tanto, indica que el ensayo altamente multiplexado es sensible a la edad gestacional.
Figura 14. Agrupamiento jerárquico de proteínas medidas en muestras de descubrimiento.
Figura 15. Rama de proteína específica de placenta dentro de un grupo más grande. El panel de la derecha enumera un módulo de genes que se expresa durante el embarazo identificado por Thompson y el panel de la izquierda demuestra que el ensayo de descubrimiento de proteómica en suero reproduce la expresión correlacionada de este módulo. (Thompson et al., Genome Res.12(10):1517-1522 (2002).
Figura 16. Muestras de proteínas desreguladas PreTRM™.
Figura 17. Biología de la globulina fijadora de Hormonas Sexuales (SHGB) resaltada. SHBG se expresa en células placentarias (derecha). La SHBG puede ser responsable de controlar los niveles de testosterona libre y los niveles de estrógeno en el compartimento fetal placentario (izquierda).
Figura 18. Interacciones de IBP4, IGF2, PAPP-A y PRG2. IBP4 es un regulador negativo de IGF2. IBP4 se libera de IGF2 por proteólisis mediada por PAPPA. Los niveles bajos de PAPPA se han implicado en IUGR y PE. Los niveles elevados de IBP4 son indicativos de actividad suprimida de IGF2. Los casos de PTB tienen niveles suprimidos de PAPPA, PRG2 y niveles elevados de IBP4.
Figura 19. Proteína de fijación 4 al factor de crecimiento similar a la insulina (IBP4). IBP4 se regula al alza en los casos de PTB. IGF2 estimula la proliferación, diferenciación e invasión de EVT en el embarazo temprano. La actividad de IGF es esencial para la placentación normal y el crecimiento fetal. IBP4 media el control autocrino y paracrino de la actividad de IGF2 en la interfaz materno-fetal. La actividad de IGF2 expresada por los citotrofoblastos se equilibra con la IBP producida por las células deciduales. La IBP4 elevada y IGF2 reducida en el 1er trimestre se correlacionaron con disfunción placentaria (por ejemplo, IUGR/SGA).
Figura 20. Correlación MS vs. ELISA para IBP4, SHBG y CHL1. La espectrometría de masas y ELISA están en buen acuerdo para los analitos clave. El acuerdo en dos plataformas ortogonales afirma la confiabilidad de la medición del analito.
Figura 21. Clasificación de PTB por IBP4/SHBG en muestras de descubrimiento de GABD de 19-21 semanas. Las muestras de descubrimiento para las semanas 19-21 de gestación se dividieron por IMC alto y bajo. Los valores de reversión de IBP4/SHBG son más altos en la categoría de IMC alto debido a los valores más bajos de SHBG. La separación de casos y controles es IMC mayor a menor.
Figura 22. Niveles de SHBG suprimidos en casos de PTB con un IMC bajo. Ajustes lineales de los niveles en suero de SHBG en sujetos PAPR a través de GABD. Los niveles de SHBG se suprimen por un IMC alto. Los niveles de SHBG aumentan a través de la gestación. Los casos de PTB con un IMC bajo tienen niveles reducidos de SHBG que aumentan a través de la gestación a un ritmo acelerado.
La Figura 23 resume la distribución de los sujetos de estudio en PAPR.
La Figura 24 muestra la curva ROC y el valor AUC correspondiente utilizando el predictor IBP4/SHBG para clasificar el conjunto de muestras de validación estratificadas de IMC.
La Figura 25 muestra el valor predictivo positivo (VPP) ajustado por prevalencia, una medida de riesgo clínico, como una función de la puntuación del predictor. La asociación calculada de la puntuación del predictor y el VPP permite la determinación de la probabilidad de riesgo de sPTB para cualquier sujeto desconocido. La línea superior (púrpura) debajo de la gráfica de la curva de riesgo corresponde a GAB < 350/7 semanas; la segunda línea (roja) desde arriba corresponde a GAB entre 350/7 y 370/7/ semanas; tercera línea (verde) corresponde a GAB entre 370/7 y 390/7/ semanas; la cuarta línea (azul) desde arriba corresponde a GAB 390/7 semanas ≤ GAB.
La Figura 26 muestra la tasa de partos para los grupos de alto y bajo riesgo como eventos en un análisis de Kaplan Meier. El riesgo alto y bajo se definió como por encima o por debajo de un riesgo relativo de 2x el riesgo promedio de la población de sPTB (= 14.6 %) a partir de los datos de la Figura 25.
La Figura 27 muestra una curva ROC correspondiente al desempeño del predictor utilizando una combinación de sujetos de los análisis de verificación y validación a ciegas dentro del intervalo óptimo de IMC y GA. La curva ROC para la muestra combinada corresponde a un AUROC de 0.72 (p = 0.013)
La Figura 28 muestra que 44 proteínas se regularon al alza o a la baja en intervalos de GA de 3 semanas superpuestos y pasaron los filtros analíticos.
La Figura 29 muestra la reversión de mayor rendimiento en general, IBP4/SHBG, tuvo un AUROC=0.74 en el intervalo de 190/7 a 216/7.
La Figura 30 muestra el AUROC medio de 0.76 obtenido a partir de 2,000 iteraciones de análisis de remuestreo. El rendimiento de AUROC de IBP4/SHBG a ciegas en las muestras de verificación fue de 0.77 y 0.79 para todos los sujetos y sujetos estratificados con IMC, respectivamente, en buena concordancia con el rendimiento obtenido en el descubrimiento. Después de la verificación a ciegas, las muestras de descubrimiento y verificación se combinaron para la determinación del rendimiento del análisis de remuestreo.
La Figura 31 muestra la Separación de Casos vs. Controles de sPTB Derivada de los Valores de Puntuación de MS y ELISA
La Figura 32 muestra el Inmunoensayo frente a los Análisis MS ROC sin restricción de IMC.
La Figura 33 muestra los análisis de Inmunoensayo frente a MS ROC para un IMC superior a 22 y menor o igual a 37. La Figura 34 muestra la correlación entre los valores de puntuación IBP4/SHBG derivados de MS y ELISA dentro de GABD 133-146, para sujetos estratificados con IMC (panel izquierdo) y todos los sujetos (panel derecho).
La Figura 35 muestra la Separación de Controles y Casos por ELISA y MS (IMC estratificado)
La Figura 36 muestra la Separación de Controles y Casos por ELISA y MS (todo el IMC)
La Figura 37 muestra la comparación de las mediciones de SHBG por Abbott Architect CMIA, los instrumentos de inmunoensayo semiautomáticos y el método de análisis proteómico de Sera Prognostics que implica el inmunoagotamiento de muestras, digestión enzimática y análisis en un Espectrómetro de Masas Agilent 6490. La Figura 38 muestra la comparación de las mediciones de SHBG con el analizador Roche cobas e602, los instrumentos de inmunoensayo semiautomáticos y el método de análisis proteómico de Sera Prognostics que implica el inmunoagotamiento de muestras, digestión enzimática y análisis en un Espectrómetro de Masas Agilent 6490. La Figura 39 muestra la comparación de las mediciones de SHBG realizadas por Abbott Architect CMIA y el analizador Roche cobas e602, ambos instrumentos de inmunoensayo semiautomáticos.
La Figura 40 muestra el dominio y las características estructurales de la isoforma más larga de la proteína IBP4 (Uniprot: P22692). El péptido QCHPALDGQR de IBP4 (aa, 214-223) se ubica dentro del dominio de la Tiroglobulina tipo 1. IBP4 tiene un solo sitio de glicosilación ligado a N en el residuo 125.
La Figura 41 destaca la posición del péptido QCHPALDGQR en las dos isoformas de IBP4.
La Figura 42 muestra el dominio y las características estructurales de la isoforma más larga de la proteína SHBG (Uniprot: P04278). El péptido IALGGLLFPASNLR de SHBG (aa, 170-183) se ubica en el primer dominio similar a Lamin G. SHBG tiene tres sitios de glicosilación; dos sitios ligados a N en los residuos 380 y 396; un sitio ligado a O en el residuo 36.
La Figura 43 destaca la posición del péptido IALGGLLFPASNLR en el exón 4 dentro de las siete isoformas de SHBG. La Figura 44 muestra la relación de respuesta promedio para los niveles de IBP4 por separado para los casos de sPTB y los controles a término a lo largo de la edad gestacional en el momento de extracción de sangre (GABD). Los datos de descubrimiento transversales se analizaron al suavizar utilizando una ventana deslizante de 10 días. La señal de caso vs. control corresponde a una diferencia máxima aproximada del 10 %.
La Figura 45 muestra la relación de respuesta promedio para los niveles de SHBG por separado para los casos de sPTB y los controles a término a lo largo de la edad gestacional en el momento de extracción de sangre (GABD). Los datos de descubrimiento transversales se analizaron al suavizar utilizando una ventana deslizante de 10 días. La señal de caso vs. control corresponde a una diferencia máxima aproximada del 10 %.
La Figura 46 muestra la puntuación del predictor IBP4/SHBG por separado para los casos de sPTB y los controles a término a lo largo de la edad gestacional en el momento de extracción de sangre (GABD). Los datos de descubrimiento transversales se analizaron al suavizar utilizando una ventana deslizante de 10 días. La diferencia máxima entre las dos curvas corresponde aproximadamente a una diferencia del 20 %, en comparación con la diferencia aproximada del 10 % en la señal de los analitos individuales (Figuras 45 y 46). Estos datos demuestran la amplificación de la señal de diagnóstico obtenida al emplear la estrategia de reversión IBP4/SHBG.
La Figura 47 muestra la amplificación de la señal de diagnóstico como resultado de la formación de muchas reversiones diferentes. Para investigar si la formación de reversiones en general amplifica la señal de diagnóstico, examinamos el rendimiento diagnóstico de las reversiones formadas por muchas proteínas diferentes mediante análisis ROC. En el panel superior se muestra el rango de valores de AUC (caso de sPTB vs. control a término) utilizando conjuntos de datos de muestras recolectadas entre las semanas 19/0 y 21/6 de gestación. Los gráficos de caja adyacentes muestran el rango en el rendimiento de ROC para las proteínas individuales reguladas al alza y a la baja utilizadas para formar las reversiones asociadas. De manera similar, el panel inferior muestra que los valores p derivados de una prueba de Wilcoxon (caso de sPTB frente a controles a término) para las reversiones son más significativos que aquellos de las proteínas individuales correspondientes.
La Figura 48 muestra el coeficiente analítico de variación (CV) para la medida de las relaciones de respuesta de IBP4 y SHBG individuales y para la puntuación de reversión correspondiente calculada. Se analizaron muestras de suero de control agrupadas de donantes embarazadas (pHGS) libres de variabilidad biológica en múltiples lotes y a lo largo de varios días. La variabilidad de reversión es menor que la variabilidad asociada con las proteínas individuales. Estos datos indican que la formación de los controles de reversión para la variabilidad analítica se produce durante el procesamiento de muestras en el laboratorio. La variabilidad analítica no es un fenómeno biológico.
La Figura 49 muestra los CV analíticos para muchas reversiones y sus proteínas individuales reguladas al alza y a la baja. Para investigar si la formación de reversiones en general amplifica la señal de diagnóstico, examinamos el rendimiento de ROC (AUC) de reversiones de alto rendimiento (AUC> 0.6) formadas por la relación de muchas proteínas. En el panel superior se muestra el rango de valores de AUC (caso de sPTB vs. control a término) utilizando conjuntos de datos de muestras recolectadas entre las semanas 19/0 y 21/6 de gestación. Los diagramas de caja adyacentes muestran el rango en el rendimiento de ROC para las proteínas individuales reguladas al alza y a la baja utilizadas para formar las reversiones asociadas. De manera similar, los valores p derivados de una prueba de Wilcoxon (caso de sPTB frente a controles a término) para las reversiones son más significativos que aquellos de las proteínas individuales correspondientes.
La Figura 50 muestra la comparación de puntajes de PreTRM™ para sujetos anotados como médicamente indicados para preeclampsia vs. otras indicaciones.
La Figura 51 muestra una tabla de métricas del desempeño del predictor IBP4/SHBG en el conjunto de muestras de validación (IMC > 22 <= 37). Utilizando diferentes delimitaciones para definir los casos (por debajo del punto de corte) a partir de los controles (por encima del punto de corte) se determinaron la sensibilidad, especificidad, área bajo la curva ROC (AUC) y razón de probabilidades del predictor.
La Figura 52 muestra un mapa de calor de intensidad de reversión con anotación de diabetes. Las flechas rojas muestran los casos de diabetes. Las muestras se enumeran en la parte inferior con los casos de PTB a la derecha y los partos a término en el lado izquierdo de la pantalla. Los pacientes con diabetes están agrupados a la derecha, lo que muestra que es posible construir una prueba de diagnóstico a partir de los biomarcadores para predecir la diabetes gestacional.
La Figura 53 muestra el agrupamiento jerárquico de las relaciones de respuesta del analito.
La Figura 54 muestra proteínas expresadas diferencialmente que funcionan en las interacciones de la matriz extracelular.
La Figura 55 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la ruta de IGF-2 que muestran una separación máxima a las 18 semanas.
La Figura 56A muestra un esquema de interacciones entre las proteínas IGF-2, IBP4, PAPP1 y PRG2 que afectan la biodisponibilidad de estas proteínas en sPTB; 56B muestra un esquema de señales intracelulares preferentemente activadas por la unión de insulina a IR-B y por la unión de insulina e IGF a IR-A o IGF1R.
La Figura 57 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en el equilibrio hormonal metabólico.
La Figura 58 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la angiogénesis. La Figura 59 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la inmunidad innata.
La Figura 60 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la coagulación. La Figura 61 muestra gráficos cinéticos de proteínas en suero/secretadas expresadas diferencialmente.
La Figura 62 muestra gráficos cinéticos de PSG/IBP expresados diferencialmente.
La Figura 63 muestra gráficos cinéticos de proteínas ECM/de superficie celular expresadas diferencialmente.
La Figura 64 muestra gráficos cinéticos de proteínas-1 del complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 65 muestra gráficos cinéticos de proteínas-2 de complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 66 muestra gráficos cinéticos de proteínas-3 de complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 67 muestra gráficos cinéticos de proteínas-4 de complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 68 muestra los gráficos cinéticos para los analitos especificados en los paneles A a I con datos de la edad gestacional en el momento de extracción de sangre (GABD) de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 69 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 70 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 71 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 72 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 73 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 74 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 75 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 76 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 77 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 78 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 79 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 80 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 81 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 82 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 83 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 84 muestra los gráficos cinéticos para analitos especificados en los paneles A a I con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 85 muestra los gráficos cinéticos para transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a G con datos desde GABD de 17 semanas 0 días, a 28 semanas, 6 días.
La Figura 86 muestra los gráficos cinéticos para transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas.
La Figura 87 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 88 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 89 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 90 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 91 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 92 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 93 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 94 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 95 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a C utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas. La Figura 96 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 97 muestra los gráficos cinéticos para transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas.
La Figura 98 muestra los gráficos cinéticos para transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas.
La Figura 99 muestra los gráficos cinéticos para transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas.
La Figura 100 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 101 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 102 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 103 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas.
La Figura 104 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a I utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 105 muestra los gráficos cinéticos para las transiciones de péptidos especificadas en los paneles A a C utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. La Figura 106 muestra los niveles de IBP4 y SHBG y los valores de reversión de IBP4/SHBG en casos y controles de sPTB por separado.
La Figura 107 muestra la correlación de los resultados de MSD con kits comerciales de ELISA y MS-MRM.
La Figura 108 proporciona gráficos de caja que muestran ejemplos de reversiones con buen desempeño en las semanas 19-20 en trabajo de parto prematuro en ausencia de PPROM (PTL).
La Figura 109 proporciona gráficos de caja que muestran ejemplos de reversiones con buen desempeño en las semanas 19-20 en la ruptura prematura de membrana pretérmino (PPROM).
La Figura 110 es una curva de riesgo que muestra las relaciones entre la Puntuación del Predictor (ln IBP4/SHBG) y el riesgo relativo ajustado por prevalencia de sPTB (Valor Predictivo Positivo), utilizando un punto de corte de < 370/7 semanas frente a >= 370/7 semanas de gestación. La línea superior (púrpura) debajo de la gráfica de la curva de riesgo corresponde a sPTB (GAB < 35 semanas); la segunda línea (roja) desde arriba corresponde a sPTB (35 ≤ GAB < 37 semanas); tercera línea (verde) corresponde al TERM (37 ≤ GAB < 39 semanas); la cuarta línea (azul) desde arriba corresponde al TERM (39 semanas ≤ GAB).
La Figura 111 es una curva de riesgo que muestra las relaciones entre la Puntuación del Predictor (ln IBP4/SHBG) y el riesgo relativo ajustado por prevalencia de sPTB (Valor Predictivo Positivo), utilizando un punto de corte de < 350/7 semanas frente a >= 350/7 semanas de gestación. La línea superior (púrpura) debajo de la gráfica de la curva de riesgo corresponde a sPTB (GAB < 35 semanas); la segunda línea (roja) desde arriba corresponde a sPTB (35 ≤ GAB < 37 semanas); la tercera línea (verde) corresponde al TERM (37 ≤ GAE3 < 39 semanas); la cuarta línea (azul) desde arriba corresponde al TERM (39 semanas ≤ GAB).
Descripción detallada
La presente divulgación se basa, en general, en el descubrimiento de que ciertas proteínas y péptidos en muestras biológicas obtenidas de una mujer embarazada se expresan de manera diferencial en mujeres embarazadas que tienen un mayor riesgo de parto prematuro en relación con los controles. La presente divulgación se basa además específicamente, en parte, en el descubrimiento inesperado de que los valores de reversión de pares de biomarcadores divulgados en el presente documento se pueden utilizar en métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada con alta sensibilidad y especificidad. Las proteínas y péptidos divulgados en el presente documento como componentes de relaciones y/o pares de reversión sirven como biomarcadores para clasificar muestras de prueba, predecir la probabilidad de parto prematuro, predecir la probabilidad de parto a término, predecir la edad gestacional al nacer (GAB), predecir el tiempo hasta el parto (TTB) y/o monitorización del progreso de la terapia preventiva en una mujer embarazada con riesgo de PTB, ya sea individualmente, en relaciones, pares de reversión o en paneles de biomarcadores/pares de reversión. Un valor de reversión es la relación del área máxima relativa de un biomarcador regulado al alza sobre el área máxima relativa de un biomarcador regulado a la baja y sirve tanto para normalizar la variabilidad como para amplificar la señal de diagnóstico. La enseñanza radica, en parte, en la selección de biomarcadores particulares que, cuando se emparejan, pueden predecir la probabilidad de parto prematuro en base a los valores de reversión. De acuerdo con lo anterior, es el ingenio humano en la selección de los biomarcadores específicos que son informativos al ser emparejados en reversiones novedosas lo que subyace en la presente enseñanza.
El término “valor de reversión” se refiere a la relación del área máxima relativa de un analito regulado al alza sobre el área máxima relativa de un analito regulado a la baja y sirve tanto para normalizar la variabilidad como para amplificar la señal de diagnóstico. De todas las reversiones posibles dentro de una ventana estrecha, se puede seleccionar un subconjunto basado en el desempeño univariado individual. Como se divulga en el presente documento, la relación del área máxima relativa de un biomarcador regulado al alza sobre el área máxima relativa de un biomarcador regulado a la baja, denominada en el presente documento valor de reversión, se puede utilizar para identificar clasificadores sólidos y precisos y predecir la probabilidad de parto prematuro. predecir la probabilidad de parto a término, predecir la edad gestacional al nacer (GAB), predecir el tiempo hasta el parto y/o monitorización del progreso de la terapia preventiva en una mujer embarazada. Por lo tanto, la presente enseñanza se basa, en parte, en la identificación de pares de biomarcadores en los que se revierte la expresión relativa de un par de biomarcadores que exhiben un cambio en el valor de reversión entre PTB y no PTB. El uso de una relación de biomarcadores en los métodos divulgados en el presente documento corrige la variabilidad que es el resultado de la manipulación humana después de la extracción de la muestra biológica de la mujer embarazada. Dicha variabilidad se puede introducir, por ejemplo, durante la recolección de muestras, procesamiento, agotamiento, digestión o cualquier otra etapa de los métodos utilizados para medir los biomarcadores presentes en una muestra y es independiente de cómo se comportan los biomarcadores de recolección en la naturaleza. De acuerdo con lo anterior, la enseñanza, en general, abarca el uso de un par de reversión en un método de diagnóstico o pronóstico para reducir la variabilidad y/o amplificar, normalizar o aclarar la señal de diagnóstico.
Si bien el término valor de reversión se refiere a la relación del área máxima relativa de un analito regulado al alza sobre el área máxima relativa de un analito regulado a la baja y sirve tanto para normalizar la variabilidad como para amplificar la señal de diagnóstico, también se contempla que un par de biomarcadores de la enseñanza se podría medir por cualquier otro medio, por ejemplo, por sustracción, suma o multiplicación de áreas máximas relativas. Los métodos divulgados en el presente documento abarcan la medición de pares de biomarcadores por dichos otros medios.
Este método es ventajoso porque proporciona el clasificador más simple posible que es independiente de la normalización de datos, ayuda a evitar el sobreajuste y da como resultado una prueba experimental muy simple que es fácil de implementar en la clínica. El uso de pares de marcadores basados en cambios en los valores de reversión que son independientes de la normalización de datos permitió el desarrollo de los biomarcadores clínicamente relevantes divulgados en el presente documento. Debido a que la cuantificación de cualquier proteína individual está sujeta a incertidumbres causadas por la variabilidad de la medición, fluctuaciones normales y variación relacionada con el individuo en la expresión inicial, la identificación de pares de marcadores que pueden estar bajo una regulación sistemática y coordinada permite métodos sólidos para el diagnóstico y el pronóstico individualizados.
La divulgación proporciona pares de reversión de biomarcadores y paneles asociados de pares de reversión, métodos y kits para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada. Una de las principales ventajas de la presente divulgación es que el riesgo de desarrollar un parto prematuro se puede evaluar al principio del embarazo, de tal manera que se pueda iniciar de manera oportuna la monitorización y manejo clínico apropiados para prevenir el nacimiento prematuro. La presente enseñanza es de particular beneficio para las mujeres que carecen de cualesquier factores de riesgo de parto prematuro y que de otro modo no desearían ser identificadas y tratadas.
A modo de ejemplo, la presente divulgación incluye métodos para generar un resultado útil para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada mediante la obtención de un conjunto de datos asociado con una muestra, donde el conjunto de datos incluye al menos datos cuantitativos acerca de la expresión relativa de pares de biomarcadores que se han identificado como que exhiben cambios en el valor de reversión predictivo de parto prematuro, y que ingresan el conjunto de datos en un proceso analítico que utiliza el conjunto de datos para generar un resultado útil para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada. Como se describe más adelante, los datos cuantitativos pueden incluir aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, nucleósidos, azúcares, ácidos grasos, esteroides, metabolitos, carbohidratos, lípidos, hormonas, anticuerpos, regiones de interés que sirven como sustitutos de macromoléculas biológicas y combinaciones de las mismas.
Además de los biomarcadores específicos identificados en esta divulgación, por ejemplo, por número de acceso en una base de datos pública, secuencia o referencia, la enseñanza también contempla el uso de variantes de biomarcadores que son al menos 90 % o al menos 95 % o al menos 97 % idénticas a las secuencias ejemplificadas y que son ahora conocidas o descubiertas posteriormente y que tienen utilidad para los métodos de la enseñanza. Estas variantes pueden representar polimorfismos, variantes de corte y empalme, mutaciones y similares. En este sentido, la presente especificación divulga múltiples proteínas conocidas en la técnica en el contexto de la enseñanza y proporciona números de registro de ejemplo asociados con una o más bases de datos públicas, así como referencias de ejemplo a artículos de revistas publicados que se relacionan con estas proteínas conocidas en la técnica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica aprecian que se pueden identificar fácilmente números de acceso adicionales y artículos de revistas que pueden proporcionar características adicionales de los biomarcadores divulgados y que las referencias ejemplificadas no son de ninguna manera limitantes con respecto a los biomarcadores divulgados. Como se describe en el presente documento, varias técnicas y reactivos encuentran uso en los métodos de la presente enseñanza. Las muestras adecuadas en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, sangre, plasma, suero, líquido amniótico, secreciones vaginales, saliva y orina. En algunas realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, plasma y suero. En una realización particular, la muestra biológica es suero. Como se describe en el presente documento, los biomarcadores se pueden detectar a través de una variedad de ensayos y técnicas conocidas en la técnica. Como se describe adicionalmente en el presente documento, dichos ensayos incluyen, sin limitación, ensayos basados en espectrometría de masas (MS), ensayos basados en anticuerpos, así como ensayos que combinan aspectos de los dos.
Los biomarcadores de proteínas que son componentes de los pares inversos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, la Proteína de Fijación 4 al Factor de Crecimiento Similar a la Insulina (IBP4), Globulina Fijadora a Hormonas Sexuales (SHBG), Vitronectina (VTNC), Componente Específico del Grupo (Proteína de Fijación a Vitamina D) (VTDB), catepsina D (proteasa de aspartil lisosomal) (CATD), beta-1-glicoproteína 2 específica del embarazo (PSG2), Miembro 4 de la Familia de Cadenas Pesadas Inhibidoras de la Inter-Alfa-Tripsina (ITM4), molécula de adhesión celular similar a L1 (CHL1), Componente 1 del Complemento, Subcomponente Q, Cadena B (C1QB), Fibulina 3 (FBLN3), Hemopexina (HEMO o HPX), Proteína se Fijación al Factor de Crecimiento Similar a la Insulina 6 (IBP6), prostaglandina D2 sintasa 21 kDa (PTGDS).
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que comprende aquellos pares enumerados en las figuras y tablas acompañantes, que incluyen la Figura 1.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada.
La enseñanza proporciona biomarcadores aislados seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza pueden predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los biomarcadores aislados se seleccionan del grupo que consiste en IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, y PTGDS. En algunas realizaciones, los biomarcadores aislados se seleccionan del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, y APOC3.
La enseñanza proporciona péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. En algunas realizaciones, los péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados se seleccionan del grupo de péptidos sustitutos establecido en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza y sus péptidos sustitutos se pueden utilizar en métodos para predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los péptidos sustitutos corresponden a biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, y PTGDS. En algunas realizaciones, los péptidos sustitutos corresponden a biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, y APOC3.
La enseñanza proporciona péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) que corresponden a los péptidos sustitutos seleccionados del grupo establecido en la Tabla 26. Los biomarcadores de la enseñanza, sus péptidos sustitutos y los péptidos SIS se pueden utilizar en métodos para predecir el riesgo de parto prematuro en una mujer embarazada. En algunas realizaciones, los péptidos SIS corresponden a péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, VTNC, VTDB, CATD, PSG2, ITIH4, CHL1, C1QB, FBLN3, HPX, y PTGDS. En algunas realizaciones, los péptidos SIS corresponden a péptidos sustitutos de los biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4, SHBG, PSG3, LYAM1, IGF2, CLUS, IBP3, INHBC, PSG2, PEDF, CD14, y APOC3.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados IBP4/SHBG, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término. En una realización adicional, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados IBP4/SHBG, en los que el par de biomarcadores exhibe una mayor relación en mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, y CATD/SHBG para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de GABD. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre 19 y 22 semanas de GABD.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para IBP4/SHBG para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de GABD. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre 19 y 22 semanas de GABD.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada, en la que la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término determina la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de GABD. En realizaciones adicionales la muestra se obtiene entre 19 y 22 semanas de GABD
Se incluyen dentro de las realizaciones de la enseñanza, métodos iterativos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS y cualquier otro par de biomarcadores seleccionados de las proteínas descritas y/o ejemplificadas en el presente documento para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada, en la que la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término determina la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. El rendimiento iterativo de los métodos descritos en el presente documento incluye mediciones posteriores obtenidas a partir de una sola muestra, así como la obtención de muestras posteriores para la medición. Por ejemplo, si se determina que la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, que se puede expresar como una puntuación de riesgo, está por encima de un valor específico, el método se puede repetir utilizando un par de reversión distinto de la misma muestra o el mismo o un par de reversión distinto de una muestra posterior para estratificar aún más el riesgo de sPTB.
Además de los biomarcadores específicos, la divulgación incluye además variantes de biomarcadores que son de alrededor de 90 %, alrededor de 95 % o alrededor de 97 % idénticas a las secuencias ejemplificadas. Las variantes, como se utilizan en el presente documento, incluyen polimorfismos, variantes de corte y empalme, mutaciones y similares. Aunque se describe con referencia a biomarcadores de proteínas, los cambios en el valor de reversión se pueden identificar en los niveles de expresión de proteínas o genes para pares de biomarcadores.
Se pueden seleccionar marcadores adicionales de uno o más indicios de riesgo, que incluyen, pero no se limitan a, características maternas, antecedentes médicos, antecedentes de embarazos anteriores y antecedentes obstétricos. Dichos marcadores adicionales pueden incluir, por ejemplo, bajo peso al nacer previo o nacimiento prematuro, múltiples abortos espontáneos en el segundo trimestre, aborto inducido previo en el primer trimestre, factores familiares e intergeneracionales, antecedentes de infertilidad, nuliparidad, anomalías placentarias, anomalías cervicales y uterinas, mediciones de longitud cuello uterino cortas, sangrado gestacional, restricción del crecimiento intrauterino, exposición intrauterina a dietilestilbestrol, gestaciones múltiples, sexo infantil, baja estatura, bajo peso antes del embarazo, índice de masa corporal bajo o alto, diabetes, hipertensión, infecciones urogenitales (es decir, infección del tracto urinario), asma, ansiedad y depresión, asma, hipertensión, hipotiroidismo. Los indicios de riesgo demográfico para el parto prematuro pueden incluir, por ejemplo, edad materna, raza/etnicidad, estado civil soltero, nivel socioeconómico bajo, edad materna, actividad física relacionada con el empleo, exposiciones ocupacionales y exposiciones ambientales y estrés. Indicios de riesgo adicionales pueden incluir atención prenatal inadecuada, tabaquismo, uso de marihuana y otras drogas ilícitas, uso de cocaína, consumo de alcohol, ingesta de cafeína, aumento de peso materno, ingesta dietética, actividad sexual durante la última etapa del embarazo y actividades físicas en el tiempo libre. (Preterm Birth Causes, Consequences, and Prevention, Institute of Medicine (US) Committee on Understanding Premature Birth and Assuring Healthy Outcomes; Behrman RE, Butler AS, editors. Washington (DC): National Academies Press (US); 2007). Se pueden identificar indicios de riesgo adicionales útiles como marcadores utilizando algoritmos de aprendizaje conocidos en la técnica, tales como análisis discriminante lineal, clasificación automatizada de vectores de soporte, eliminación de características recursivas, análisis de predicción de microarreglo, regresión logística, CART, FlexTree, LART, bosque aleatorio, MART, y/o análisis de regresión de supervivencia, que son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen con más detalle en el presente documento.
Se debe tener en cuenta que, como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un biomarcador” incluye una mezcla de dos o más biomarcadores y similares.
El término “alrededor de”, particularmente en referencia a una cantidad dada, pretende abarcar desviaciones de más o menos cinco por ciento.
Como se utiliza en esta solicitud, que incluye las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referencias en plural, a menos que el contenido dicte claramente lo contrario, y se utilizan indistintamente con “al menos uno” y “uno o más”.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “contiene”, “que contiene” y cualesquier variaciones de los mismos, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, de tal manera que una proceso, método, producto por proceso o composición de materia que comprende, incluye o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solo esos elementos pero puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho proceso, método, producto por proceso, o composición de la materia.
Como se utiliza en el presente documento, el término “panel” se refiere a una composición, tal como una matriz o una colección, que comprende uno o más biomarcadores. El término también puede referirse a un perfil o índice de patrones de expresión de uno o más biomarcadores descritos en el presente documento. El número de biomarcadores útiles para un panel de biomarcadores se basa en el valor de sensibilidad y especificidad para la combinación particular de valores de biomarcadores.
Como se utiliza en el presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, los términos “aislado y” purificado generalmente describen una composición de materia que se ha extraído de su entorno nativo (por ejemplo, el ambiente natural si ocurre naturalmente), y por lo tanto es alterado por la mano del hombre desde su estado natural para poseer características marcadamente diferentes con respecto al menos a una de estructura, función y propiedades. Una proteína o ácido nucleico aislado es diferente de la forma en que existe en la naturaleza e incluye péptidos y proteínas sintéticas.
El término “biomarcador” se refiere a una molécula biológica, o un fragmento de una molécula biológica, cuyo cambio y/o detección se puede correlacionar con una condición o estado físico particular. Los términos “marcador” y “biomarcador” se utilizan indistintamente a lo largo de la divulgación. Por ejemplo, los biomarcadores de la presente enseñanza se correlacionaron con una mayor probabilidad de parto prematuro. Dichos biomarcadores incluyen cualquier analito adecuado, pero no se limitan a, moléculas biológicas que comprenden nucleótidos, ácidos nucleicos, nucleósidos, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, esteroides, metabolitos, péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, hormonas, anticuerpos, regiones de interés que sirven como sustitutos de macromoléculas biológicas y combinaciones de las mismas (por ejemplo, glicoproteínas, ribonucleoproteínas, lipoproteínas). El término también abarca porciones o fragmentos de una molécula biológica, por ejemplo, fragmento de péptido de una proteína o polipéptido que comprende al menos 5 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 6 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 7 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 8 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 9 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 10 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 11 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 12 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 13 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 14 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 15 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 5 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 16 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 17 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 18 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 19 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 20 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 21 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 22 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 23 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 24 residuos de aminoácidos consecutivos, al menos 25 residuos de aminoácidos consecutivos, o más residuos de aminoácidos consecutivos.
Como se utiliza en el presente documento, el término “péptido sustituto” se refiere a un péptido que se selecciona para servir como sustituto para la cuantificación de un biomarcador de interés en una configuración de ensayo MRM. La cuantificación de péptidos sustitutos se logra mejor utilizando péptidos sustitutos estándar marcados con isótopos estables (“péptidos sustitutos SIS” o “péptidos SIS”) en conjunto con la técnica de detección MRM. Un péptido sustituto puede ser sintético. Un péptido sustituto SIS se puede sintetizar con marcado pesado, por ejemplo, con Arginina o Lisina, o cualquier otro aminoácido en el terminal C del péptido para que sirva como estándar interno en el ensayo MRM. Un péptido sustituto SIS no es un péptido de origen natural y tiene una estructura y propiedades marcadamente diferentes en comparación con su contraparte de origen natural.
En algunas realizaciones, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada una relación para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en dicha mujer embarazada, en la que la existencia de un cambio en la relación entre la mujer embarazada y un control a término determina la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la relación puede incluir una proteína regulada al alza en el numerador, una proteína regulada a la baja en el denominador o ambas. Por ejemplo, como se ejemplifica en el presente documento, IBP4/SHBG es una relación de una proteína regulada al alza en el numerador y una proteína regulada a la baja en el denominador, que se define en el presente documento como una “reversión”. En los casos en que la relación incluye una proteína regulada al alza en el numerador, o una proteína regulada a la baja en el denominador, la proteína no regulada serviría para normalizar (por ejemplo, disminuir la variabilidad preanalítica o analítica). En el caso particular de una relación que es una “reversión”, tanto la amplificación como la normalización son posibles. Se entiende que los métodos de la enseñanza no se limitan al subconjunto de reversiones, sino que también abarcan relaciones de biomarcadores.
Como se utiliza en el presente documento, el término “reversión” se refiere a la relación del valor medido de un analito regulado al alza sobre el de un analito regulado a la baja. En algunas realizaciones, el valor del analito es en sí mismo una relación del área máxima del analito endógeno sobre el área máxima del analito estándar isotópico estable correspondiente, denominado en el presente documento: relación de respuesta o relación relativa.
Como se utiliza en el presente documento, el término “par de reversión” se refiere a biomarcadores en pares que exhiben un cambio en el valor entre las clases que se comparan. La detección de reversiones en las concentraciones de proteínas o los niveles de expresión génica elimina la necesidad de la normalización de datos o el establecimiento de umbrales para toda la población. En algunas realizaciones, el par de reversión es un par de biomarcadores aislados IBP4/SHBG, en el que el par de reversión exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término. En una realización adicional, el par de reversión IBP4/SHBG exhibe una mayor relación en mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro en comparación con los controles a término. Abarcado dentro de la definición de cualquier par de reversión se encuentra el par de reversión correspondiente en el que los biomarcadores individuales se intercambian entre el numerador y el denominador. Un experto en la técnica apreciará que dicho par de reversión correspondiente es igualmente informativo con respecto a su poder predictivo.
El término “valor de reversión” se refiere a la relación del área máxima relativa de un analito regulado al alza sobre el área máxima relativa de un analito regulado a la baja y sirve tanto para normalizar la variabilidad como para amplificar la señal de diagnóstico. De todas las reversiones posibles dentro de una ventana estrecha, se puede seleccionar un subconjunto basado en el desempeño univariado individual. Como se divulga en el presente documento, la relación del área máxima relativa de un biomarcador regulado al alza sobre el área máxima relativa de un biomarcador regulado a la baja, denominada en el presente documento valor de reversión, se puede utilizar para identificar clasificadores sólidos y precisos y predecir la probabilidad de parto prematuro, predecir la probabilidad de parto a término, predecir la edad gestacional al nacer (GAB), predecir el tiempo hasta el parto y/o monitorizar el progreso de la terapia preventiva en una mujer embarazada.
Este método de reversión es ventajoso porque proporciona el clasificador más simple posible que es independiente de la normalización de datos, ayuda a evitar el sobreajuste y da como resultado una prueba experimental muy simple que es fácil de implementar en la clínica. El uso de pares de biomarcadores basados en reversiones que son independientes de la normalización de datos, tal como se describe en el presente documento, tiene un enorme poder como método para la identificación de biomarcadores de PTB clínicamente relevantes. Debido a que la cuantificación de cualquier proteína única está sujeta a incertidumbres causadas por la variabilidad de la medición, fluctuaciones normales y variación relacionada con el individuo en la expresión inicial, la identificación de pares de marcadores que pueden estar bajo una regulación sistemática y coordinada debería resultar más sólida para el diagnóstico y el pronóstico individualizados.
La enseñanza proporciona una composición que comprende un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización, las composiciones comprenden los péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para los péptidos sustitutos derivados de cada uno de dichos biomarcadores.
En realizaciones particulares, la enseñanza proporciona un par de biomarcadores aislados que consiste en IBP4 y SHBG, en el que el par exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
IBP4 es miembro de una familia de proteínas de fijación al factor de crecimiento similar a la insulina (IBP) que regulan negativamente los factores de crecimiento similares a la insulina IGF1 e IGF2. (Forbes et al. Insulin-like growth factor I and II regulate the life cycle of trophoblast in the developing human placenta. Am J Physiol, Cell Physiol.
2008;294(6):C 1313-22). IBP4 se expresa por los sincitiotrofoblastos (Crosley et al., IGFBP-4 and -5 are expressed in first-trimester villi and differentially regulate the migration of HTR-8/SVneo cells. Reprod Biol Endocrinol, 2014; 12(1):123) y es el IBP dominante expresado por los trofoblastos extravellosos (Qiu et al. Significance of IGFBP-4 in the development of fetal growth restriction. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(8):E1429-39). En comparación con los embarazos a término, los niveles maternos de IBP4 al principio del embarazo son más altos en los embarazos complicados por restricción del crecimiento fetal y preeclampsia. (Qiu et al., supra, 2012)
SHBG regula la disponibilidad de hormonas esteroides libres biológicamente activas. Hammond GL. Diverse roles for sex hormone-binding globulin in reproduction. Biol Reprod. 2011;85(3):431-41. Los niveles plasmáticos de SHBG aumentan de 5 a 10 veces durante el embarazo (Anderson DC. Sex-hormone-binding globulin. Clin Endocrinol (Oxf).
1974;3(1):69-96) y existe evidencia de expresión extrahepática, que incluye células trofoblásticas de placenta la placenta. (Larrea et al. Evidence that human placenta is a site of sex hormone-binding globulin gene expression. J Steroid Biochem Mol Biol.1993;46(4):497-505) Fisiológicamente, los niveles de SHBG se correlacionan negativamente con los triglicéridos, niveles de insulina e IMC. (Simó et al. Novel insights in SHBG regulation and clinical implications. Trends Endocrinol Metab.2015;26(7):376-83) El efecto del IMC en los niveles de SHBG puede explicar, en parte, el rendimiento predictivo mejorado con la estratificación del IMC.
La inflamación y la infección intraamniótica se han asociado con PTB, al igual que niveles elevados de citocinas proinflamatorias, que incluyen TNF-α e IL 1-β. (Mendelson CR. Minireview: fetal-maternal hormonal signaling in pregnancy and labor. Mol Endocrinol.2009;23(7):947-54; Gomez-Lopez et al. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol.2014; 11(6):571-81). La transcripción de SHBG en el hígado se suprime por la señalización de TNF-α mediada por IL1-β y NF-kB (Simó et al. Novel insights in SHBG Regulation and Clinical Implications. Trends Endocrinol Metab.2015;26(7):376-83), una ruta implicada en el inicio del trabajo de parto normal y anormal (Lindström TM, Bennett PR. The role of nuclear factor kappa B in human labour. Reproduction.2005;130(5):569-81). Los niveles más bajos de SHBG en mujeres destinadas a sPTB pueden ser el resultado de una infección y/o inflamación. Por lo tanto, la SHBG puede ser fundamental para el control de la acción de andrógenos y estrógenos en la unidad placentaria-fetal en respuesta a señales inflamatorias en dirección ascendente.
En una realización, la enseñanza proporciona una composición que comprende un par de péptidos sustitutos que corresponden a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que el par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término. En una realización adicional, la enseñanza proporciona un panel de al menos dos pares de péptidos sustitutos, cada par de los péptidos sustitutos corresponde a un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS, en los que cada uno de los pares exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada
En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada.
En una realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los biomarcadores enumerados en cualquiera de las Tablas 1 a 77 y Figuras 1 a 111 En una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en las pares de biomarcadores especificados en la Tablas 27 a 59, 61 a 72, 76 y 77 en una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada.
En una realización adicional, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un valor de reversión para al menos un par de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los biomarcadores enumerados en la Tabla 26 en una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada.
En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en las pares de biomarcadores especificados en cualquiera de las Tablas 1 a 77 y Figures 1 a 111 En una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada.
En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en las pares de biomarcadores especificados en la Tablas 27 a 59, 61 a 72, 76 y 77 en una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada.
En otra realización, la enseñanza proporciona un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, el método comprende medir en una muestra biológica obtenida de la mujer embarazada un cambio en el valor de reversión para un panel de al menos dos pares de biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en los biomarcadores especificados en la Tabla 26 en una mujer embarazada para determinar la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el valor de reversión revela la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término e indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En algunas realizaciones, la etapa de medir comprende medir péptidos sustitutos de los biomarcadores en la muestra biológica obtenida de la mujer embarazada.
Para los métodos dirigidos a predecir el tiempo hasta el parto, se entiende que “parto” significa parto después del inicio espontáneo del trabajo de parto, con o sin ruptura de membranas.
Aunque se describe y ejemplifica con referencia a los métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, la presente divulgación es igualmente aplicable a los métodos para predecir la edad gestacional al nacer (GAB), métodos para predecir el parto a término, métodos para determinar la probabilidad del parto a término en una mujer embarazada, así como métodos para predecir el tiempo hasta el parto (TTB) en una mujer embarazada. Será evidente para un experto en la técnica que cada uno de los métodos antes mencionados tiene utilidades y beneficios específicos y sustanciales con respecto a las consideraciones de salud materno-fetal.
Adicionalmente, aunque se describe y ejemplifica con referencia a métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, la presente divulgación es igualmente aplicable a métodos para predecir una prueba de glucola anormal, diabetes gestacional, hipertensión, preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino, muerte fetal, restricción del crecimiento fetal, síndrome HELLP, oligohiramnios, corioamnionitis, corioamnionitis, placenta previa, placenta acreta, desprendimiento, desprendimiento de placenta, hemorragia placentaria, ruptura prematura de membrana pretérmino, trabajo de parto prematuro, cuello uterino desfavorable, embarazo postérmino, colelitiasis, sobredistensión uterina, estrés. Como se describe con más detalle a continuación, el clasificador descrito en el presente documento es sensible a un componente de PTB médicamente indicado basado en afecciones tales como, por ejemplo, preeclampsia o diabetes gestacional.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona biomarcadores, pares de biomarcadores y/o reversiones, ejemplificados en el presente documento al utilizar ITIH4/CSH, que son fuertes predictores del tiempo hasta el parto (TTB) (Figura 10). TTB se define como la diferencia entre la GABD y la edad gestacional al nacer (GAB). Este descubrimiento permite la predicción, ya sea individualmente o en combinación matemática, de dichos analitos de TTB o GAB. Los analitos que carecen de una diferencia entre casos y controles, pero muestran cambios en la intensidad del analito a lo largo del embarazo, son útiles en un reloj de embarazo de acuerdo con los métodos de la enseñanza. La calibración de múltiples analitos que pueden no ser diagnósticos de nacimiento prematuro de otros trastornos se podría utilizar para fechar el embarazo. Dicho reloj de embarazo es valioso para confirmar la datación mediante otra medida (por ejemplo, fecha del último período menstrual y/o datación por ultrasonido), o útil solo para predecir posteriormente y con mayor precisión sPTB, GAB o TTB, por ejemplo. Estos analitos, también denominados en el presente documento “proteínas de reloj”, se pueden utilizar para fechar un embarazo en ausencia de otros métodos de datación o junto con ellos. La Tabla 60 proporciona una lista de proteínas de reloj útiles en un reloj de embarazo de la enseñanza para predecir TTB y GAB.
En realizaciones adicionales, los métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarcan además la detección de una característica medible para uno o más indicios de riesgo asociados con el parto prematuro. En realizaciones adicionales, los indicios de riesgo se seleccionan del grupo que consiste en bajo peso al nacer previo o nacimiento prematuro, múltiples abortos espontáneos en el segundo trimestre, aborto inducido previo en el primer trimestre, factores familiares e intergeneracionales, antecedentes de infertilidad, nuliparidad, gravidez, primigrávida, multigrávida, anormalidades placentarias, anomalías cervicales y uterinas, sangrado gestacional, restricción del crecimiento intrauterino, exposición intrauterina a dietilestilbestrol, gestaciones múltiples, sexo infantil, baja estatura, bajo peso antes del embarazo, índice de masa corporal bajo o alto, diabetes, hipertensión, e infecciones urogenitales.
Una “característica medible” es cualquier propiedad, característica o aspecto que se puede determinar y correlacionar con la probabilidad de parto prematuro en un sujeto. El término abarca además cualquier propiedad, característica o aspecto que se pueda determinar y correlacionar en relación con una predicción de GAB, una predicción de nacimiento a término o una predicción de tiempo hasta el parto en una mujer embarazada. Para un biomarcador, dicha característica medible puede incluir, por ejemplo, la presencia, ausencia o concentración del biomarcador, o un fragmento del mismo, en la muestra biológica, una estructura alterada, tal como, por ejemplo, la presencia o cantidad de una modificación postraduccional, tal como la oxidación en una o más posiciones en la secuencia de aminoácidos del biomarcador o, por ejemplo, la presencia de una conformación alterada en comparación con la conformación del biomarcador en sujetos de control a término, y/o la presencia, cantidad o estructura alterada del biomarcador como parte de un perfil de más de un biomarcador.
Además de los biomarcadores, las características medibles pueden incluir indicios de riesgo que incluyen, por ejemplo, características maternas, edad, raza, etnia, antecedentes médicos, antecedentes de embarazos anteriores, antecedentes obstétricos. Para un indicio de riesgo, una característica medible puede incluir, por ejemplo, bajo peso al nacer previo o nacimiento prematuro, múltiples abortos espontáneos en el segundo trimestre, aborto inducido previo en el primer trimestre, factores familiares e intergeneracionales, antecedentes de infertilidad, nuliparidad, anomalías placentarias, anomalías cervicales y uterinas, mediciones de longitud del cielo uterino cortas, sangrado gestacional, restricción del crecimiento intrauterino, exposición intrauterina a dietilestilbestrol, gestaciones múltiples, sexo infantil, baja estatura, bajo peso antes del embarazo/bajo índice de masa corporal, diabetes, hipertensión, infecciones urogenitales, hipotiroidismo, asma, bajo nivel educativo, tabaquismo, consumo de drogas y de alcohol.
En algunas realizaciones, los métodos de la enseñanza comprenden el cálculo del índice de masa corporal (IMC).
En algunas realizaciones, los métodos divulgados para determinar la probabilidad de parto prematuro abarcan detectar y/o cuantificar uno o más biomarcadores utilizando espectrometría de masas, un agente de captura o una combinación de los mismos.
En realizaciones adicionales, los métodos divulgados para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarcan una etapa inicial de proporcionar una muestra biológica de la mujer embarazada.
En algunas realizaciones, los métodos divulgados para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarcan comunicar la probabilidad a un proveedor de atención médica. Los métodos divulgados para predecir GAB, para predecir el parto a término, los métodos para determinar la probabilidad de parto a término en una mujer embarazada y los métodos para predecir el tiempo hasta el parto en una mujer embarazada abarcan de manera similar comunicar la probabilidad a un proveedor de atención médica. Como se indicó anteriormente, aunque se describió y ejemplificó con referencia a determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, todas las realizaciones descritas a lo largo de esta divulgación son igualmente aplicables a los métodos para predecir GAB, los métodos para predecir el parto a término, métodos para determinar la probabilidad de nacimiento a término en una mujer embarazada, así como métodos para predecir el tiempo hasta el parto en una mujer embarazada. Específicamente, los biomarcadores y paneles enumerados a lo largo de esta solicitud que se expresan con referencia a métodos para parto prematuro también se pueden utilizar en métodos para predecir GAB, los métodos para predecir parto a término, métodos para determinar la probabilidad de parto a término en una mujer embarazada, así como métodos para predecir el tiempo hasta el parto en una mujer embarazada. Será evidente para un experto en la técnica que cada uno de los métodos mencionados anteriormente tiene utilidades y beneficios específicos y sustanciales con respecto a las consideraciones de salud materno-fetal.
En realizaciones adicionales, la comunicación informa una decisión de tratamiento posterior para la mujer embarazada. En algunas realizaciones, el método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca la característica adicional de expresar la probabilidad como una puntuación de riesgo.
En los métodos divulgados en el presente, determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca una etapa inicial que incluye la formación de un índice de probabilidad/riesgo al medir la relación de biomarcadores aislados seleccionados del grupo en una cohorte de embarazos prematuros y embarazos a término con edad gestacional conocida al nacer. Para un embarazo individual, determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca medir la relación del biomarcador aislado utilizando el mismo método de medición que se utilizó en la etapa inicial para crear el índice de probabilidad/riesgo y comparar la relación medida con el índice de riesgo para derivar el riesgo personalizado para el embarazo individual. En una realización, se forma un índice de riesgo de prematuro al medir la relación de IBP4/SHBG en una cohorte de embarazos prematuros y de término donde se registra la edad gestacional al nacer. Luego, en la práctica clínica, la relación medida de IBP4/SHBG en un embarazo individual se compara con el índice para derivar el riesgo prematuro utilizando las mismas tecnologías de medición y aislamiento para derivar IBP4/SHBG que en el grupo índice.
Como se utiliza en el presente documento, el término “puntuación de riesgo” se refiere a una puntuación que se puede asignar en base a la comparación de la cantidad de uno o más biomarcadores o valores de reversión en una muestra biológica obtenida de una mujer embarazada con una puntuación estándar o de referencia que representa una cantidad promedio de uno o más biomarcadores calculada a partir de muestras biológicas obtenidas de un grupo aleatorio de mujeres embarazadas. En algunas realizaciones, la puntuación de riesgo se expresa como el logaritmo del valor de reversión, es decir, la relación de las intensidades relativas de los biomarcadores individuales. Un experto en la técnica apreciará que una puntuación de riesgo se puede expresar en base a varias transformaciones de datos, así como expresarse como la propia relación. Adicionalmente, con respecto particular a los pares de reversión, un experto en la técnica apreciará que cualquier relación es igualmente informativa si los biomarcadores en el numerador y el denominador se intercambian o si se aplican transformaciones de datos relacionadas (por ejemplo, resta). Debido a que el nivel de un biomarcador puede no ser estático a lo largo del embarazo, se debe haber obtenido una puntuación estándar o de referencia para el punto de tiempo de la gestación que corresponde al de la mujer embarazada en el momento en que se tomó la muestra. La puntuación estándar o de referencia se puede predeterminar e integrar en un modelo predictor de tal manera que la comparación sea indirecta en lugar de realizarse realmente cada vez que se determina la probabilidad para un sujeto. Una puntuación de riesgo puede ser un estándar (por ejemplo, un número) o un umbral (por ejemplo, una línea en una gráfica). El valor de la puntuación de riesgo se correlaciona con la desviación, hacia arriba o hacia abajo, de la cantidad promedio de uno o más biomarcadores calculados a partir de muestras biológicas obtenidas de un grupo aleatorio de mujeres embarazadas. En ciertas realizaciones, si una puntuación de riesgo es mayor que una puntuación de riesgo estándar o de referencia, la mujer embarazada puede tener una mayor probabilidad de parto prematuro. En algunas realizaciones, la magnitud de la puntuación de riesgo de una mujer embarazada, o la cantidad por la que excede una puntuación de riesgo de referencia, puede ser indicativa o correlacionada con el nivel de riesgo de esa mujer embarazada.
Como se ejemplifica en el presente documento, el Clasificador PreTRM™ se define como el logaritmo natural de las intensidades normalizadas SIS de la transición del péptido IBP4 (QCHPALDGQR_394.5_475.2) y la transición del péptido SHBG (IALGGLLFPASNLR_481.3_657.4). Puntuación = ln(P1 n/P2 n), en donde P1 n y P2 n indican los valores de área máxima normalizados SIS para las transiciones IBP4 y SHBG, respectivamente. La normalización SIS se define como la relación relativa del área máxima endógena dividida por el área máxima SIS correspondiente: por ejemplo, P1 n = P1 e/P1 SIS, en donde P1 n = el área máxima para la transición endógena de IBP4 y P1 SIS = el área máxima para la transición SIS de IBP4. A partir de la asociación identificada entre la distribución de las puntuaciones PreTRM™ y el correspondiente valor predictivo positivo ajustado por prevalencia, se puede asignar una probabilidad de sPTB a un sujeto desconocido en base a la determinación de su puntuación”. Esta relación o asociación se muestra en la Figura 25 y conecta una medida de laboratorio con una predicción clínica.
Si bien el Clasificador PreTRM™ se define como el logaritmo natural de las intensidades normalizadas SIS de la transición del péptido IBP4 (QCHPALDGQR 394:5475.2) y la transición del péptido SHBG (IALGLLFPASNLR_481.3-657.4), la enseñanza también comprende clasificadores que incluyen múltiples reversiones. Se puede lograr un rendimiento mejorado al construir predictores formados a partir de más de una reversión. En realizaciones adicionales, los métodos de la enseñanza por lo tanto comprenden múltiples reversiones que tienen un fuerte rendimiento predictivo, por ejemplo, para ventanas de GABD separadas, ruptura prematura de membrana pretérmino (PPROM) frente al trabajo de parto prematuro en ausencia de PPROM (PTL), género fetal, primigrávida frente a multigrávida. Esta realización se ejemplifica en el Ejemplo 10 y la Tabla 61, ya sea para reversiones que produjeron un fuerte rendimiento predictivo temprano (por ejemplo, semanas 17-19) o más tarde (por ejemplo, semanas 19-21) en el rango de edad gestacional. Como se ejemplifica, se evaluó el rendimiento de los predictores formados a partir de combinaciones (SumLog) de múltiples reversiones para todo el rango de extracción de sangre y se derivó una puntuación de predictor a partir de la suma de los valores Log de la reversión individual (SumLog). Un experto en la técnica puede seleccionar otros modelos (por ejemplo, regresión logística) para construir un predictor formado por más de una reversión.
Los métodos de la enseñanza incluyen además clasificadores que contienen una variable indicadora que selecciona uno o un subconjunto de reversiones en base a factores clínicos conocidos, por ejemplo, período de extracción de sangre, género fetal, gravidez, así como cualquier otra característica conocida del paciente y/ o factores de riesgo descritos a lo largo de esta solicitud. Esta realización se ejemplifica en el Ejemplo 10, Tablas 61 a 64, que ejemplifican el rendimiento de reversión (semanas 17-21) independientemente para dos fenotipos diferentes de sPTB, PPROM y PTL. Esta realización se ejemplifica de manera similar en el Ejemplo 10, Tablas 76 y 77 y Figuras 108 y 109, que ejemplifican el rendimiento de reversión (semanas 19-21) de forma independiente para dos fenotipos diferentes de sPTB, ruptura prematura de membrana pretérmino (PPROM) y trabajo de parto prematuro. En ausencia de PPROM (PTL). Los métodos de la enseñanza incluyen la selección de reversiones para construir predictores independientes de PPROM y PTL, o para maximizar el rendimiento general con la combinación de más de una reversión en un solo predictor como se describió anteriormente. Esta realización se ejemplifica adicionalmente en el Ejemplo 10, Tablas 65-68, que ejemplifican el rendimiento de reversión (semanas 17-21) independientemente para dos tipos diferentes de sPTB, primigrávida y multigrávida. Esta realización se ejemplifica adicionalmente en el Ejemplo 10, Tablas 69-72 y Figura 106, que ejemplifican el rendimiento de reversión (semanas 17-21) de forma independiente para dos tipos diferentes de sPTB en base al género fetal. Si bien se ejemplifica con respecto a PPROM y PTL, la gravidez y el género fetal, los métodos de la enseñanza incluyen clasificadores que contienen una variable indicadora que selecciona uno o un subconjunto de reversiones en base a GABD o cualquier factor clínico conocido/factores de riesgo descritos en el presente documento u otros. conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como alternativa a tener un clasificador que incluya una variable indicadora, el HW&M proporciona además clasificadores separados que se adaptan a subconjuntos de mujeres embarazadas en base a GABD o cualquier factor clínico/factor de riesgo conocido descrito en el presente documento u otro conocido por aquellos expertos en la técnica Por ejemplo, esta realización abarca clasificadores separados para ventanas de tiempo consecutivas y/o superpuestas para GABD que se basan en las reversiones de mejor rendimiento para cada ventana de tiempo.
Como se ejemplifica en el presente documento, el rendimiento predictivo de los métodos reivindicados se puede mejorar con una estratificación del IMC mayor de 22 e igual o menor de 37 kg/m2. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, los métodos de la enseñanza se pueden practicar con muestras obtenidas de mujeres embarazadas con un IMC específico. Brevemente, el IMC es el peso de un individuo en kilogramos dividido por el cuadrado de su altura en metros. El IMC no mide la grasa corporal directamente, pero las investigaciones han mostrado que el IMC se correlaciona con medidas más directas de la grasa corporal obtenidas a partir de mediciones del grosor de los pliegues cutáneos, impedancia bioeléctrica, densitometría (pesaje bajo el agua), absorciometría de rayos X de energía dual (DXA) y otros métodos. Adicionalmente, el IMC parece estar tan fuertemente correlacionado con varios resultados metabólicos y de enfermedades como lo están estas medidas más directas de la grasa corporal. En general, un individuo con un IMC por debajo de 18.5 se considera de bajo peso, un individuo con un IMC igual o mayor de 18.5 a 24.9 de peso normal, mientras que un individuo con un IMC igual o mayor de 25.0 a 29.9 se considera con sobrepeso y un individuo con un IMC igual o mayor de 30.0 se considera obeso. En algunas realizaciones, el rendimiento predictivo de los métodos reivindicados se puede mejorar con una estratificación de IMC igual o mayor de 18, igual o mayor de 19, igual o mayor de 20, igual o mayor de 21, igual o mayor de 22, igual o mayor de 23, igual o mayor de 24, igual o mayor de 25, igual o mayor de 26, igual o mayor de 27, igual o mayor de 28, igual o mayor de 29 o igual o mayor de 30. En otras realizaciones, el rendimiento predictivo de los métodos reivindicados se puede mejorar con una estratificación de IMC igual o menor de 18, igual o menor de 19, igual o menor de 20, igual o menor de 21, igual o menor de 22, igual o menor de 23, igual o menor de 24, igual o menor de 25, igual o menor de 26, igual o menor de 27, igual o menor de 28, igual o menor de 29 o igual o menor de 30.
En el contexto de la presente enseñanza, el término “muestra biológica” abarca cualquier muestra que se toma de una mujer embarazada y contiene uno o más de los biomarcadores divulgados en el presente documento. Las muestras adecuadas en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, sangre, plasma, suero, líquido amniótico, secreciones vaginales, saliva y orina. En algunas realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, plasma y suero. En una realización particular, la muestra biológica es suero. Como apreciarán aquellos expertos en la técnica, una muestra biológica puede incluir cualquier fracción o componente de sangre, sin limitación, células T, monocitos, neutrófilos, eritrocitos, plaquetas y microvesículas tales como exosomas y vesículas similares a exosomas. En una realización particular, la muestra biológica es suero.
Como se utiliza en el presente documento, el término “parto prematuro” se refiere al nacimiento o parto a una edad gestacional menor de 37 semanas completas. Se han establecido otras subcategorías de parto prematuro comúnmente utilizadas y se delinean moderadamente prematuro (parto a las 33 a 36 semanas de gestación), muy prematuro (parto a < 33 semanas de gestación) y extremadamente prematuro (parto a ≤ 28 semanas de gestación). Con respecto a los métodos divulgados en el presente documento, aquellos expertos en la técnica entienden que los puntos de corte que delimitan el parto prematuro y el parto a término, así como los puntos de corte que delimitan las subcategorías de parto prematuro, se pueden ajustar al practicar los métodos divulgados en el presente, para, por ejemplo, para maximizar un beneficio particular para la salud. En varias realizaciones de la enseñanza, los puntos de corte que delimitan el nacimiento prematuro incluyen, por ejemplo, parto a ≤ 37 semanas de gestación, ≤ 36 semanas de gestación, ≤ 35 semanas de gestación, ≤ 34 semanas de gestación, ≤ 33 semanas de gestación, ≤ 32 semanas de gestación, ≤ 30 semanas de gestación, ≤ 29 semanas de gestación, ≤ 28 semanas de gestación, ≤ 27 semanas de gestación, ≤ 26 semanas de gestación, ≤ 25 semanas de gestación, ≤ 24 semanas de gestación, ≤ 23 semanas de gestación o ≤ 22 semanas de gestación. En algunas realizaciones, el punto de corte que delimita el parto prematuro es de ≤ 35 semanas de gestación. Se entiende además que dichos ajustes se encuentran dentro del conjunto de experticias de las personas consideradas expertas en la técnica y están abarcados dentro del alcance de la enseñanza divulgada en el presente documento. La edad gestacional es un indicador del grado de desarrollo fetal y la preparación del feto para el parto. La edad gestacional normalmente se ha definido como la duración del tiempo transcurrido desde la fecha de la última menstruación normal hasta la fecha del parto. Sin embargo, las medidas obstétricas y las estimaciones de ultrasonido también pueden ayudar a estimar la edad gestacional. Los partos prematuros generalmente se han clasificado en dos subgrupos separados. Uno, los partos prematuros espontáneos son aquellos que ocurren después del inicio espontáneo del trabajo de parto prematuro o la ruptura prematura de membrana pretérmino, independientemente de la estimulación posterior del trabajo de parto o del nacimiento por cesárea. Dos, los partos prematuros médicamente indicados son aquellos que ocurren después de la inducción o cesárea por una o más condiciones que el cuidador de la mujer determina que amenazan la salud o la vida de la madre y/o el feto. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se dirigen a determinar la probabilidad de parto prematuro espontáneo o parto prematuro por indicación médica. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento se dirigen a determinar la probabilidad de parto prematuro espontáneo. En realizaciones adicionales, los métodos divulgados en el presente documento se dirigen al parto prematuro médicamente indicado. En realizaciones adicionales, los métodos divulgados en el presente documento se dirigen a predecir la edad gestacional al nacer.
Como se utiliza en el presente documento, el término “edad gestacional estimada” o “GA estimada” se refiere a la GA determinada en base a la fecha de la última menstruación normal y medidas obstétricas adicionales, estimaciones de ultrasonido u otros parámetros clínicos, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en el párrafo anterior. En contraste, el término “edad gestacional pronosticada al parto” o “GAB predicha” se refiere a la GAB determinada con base en los métodos de la enseñanza como se divulga en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, “parto a término” se refiere al parto a un edad igual o mayor a 37 semanas completas.
En algunas realizaciones, la mujer embarazada tiene entre 17 y 28 semanas de gestación en el momento en que se recolecta la muestra biológica, también denominada como (Edad Gestacional en el Momento de Extracción de Sangre). En otras realizaciones, la mujer embarazada tiene entre 16 y 29 semanas, entre 17 y 28 semanas, entre 18 y 27 semanas, entre 19 y 26 semanas, entre 20 y 25 semanas, entre 21 y 24 semanas, o entre 22 y 23 semanas de gestación en el momento en que se recolecta la muestra biológica. En realizaciones adicionales, la mujer embarazada tiene entre alrededor de 17 y 22 semanas, entre alrededor de 16 y 22 semanas entre alrededor de 22 y 25 semanas, entre alrededor de 13 y 25 semanas, entre alrededor de 26 y 28, o entre alrededor de 26 y 29 semanas de gestación en el momento en que se recolecta la muestra biológica. De acuerdo con lo anterior, la edad gestacional de una mujer embarazada en el momento en que se recolecta la muestra biológica puede ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 semanas. En realizaciones particulares, la muestra biológica se recolecta entre las 19 y 21 semanas de edad gestacional. En realizaciones particulares, la muestra biológica se recolecta entre las 19 y 22 semanas de edad gestacional. En realizaciones particulares, la muestra biológica se recolecta entre las 19 y 21 semanas de edad gestacional. En realizaciones particulares, la muestra biológica se recolecta entre las 19 y 22 semanas de edad gestacional. En realizaciones particulares, la muestra biológica se recolecta a las 18 semanas de edad gestacional. En realizaciones adicionales, las reversiones de mayor rendimiento para ventanas de tiempo consecutivas o superpuestas se pueden combinar en un único clasificador para predecir la probabilidad de sPTB en una ventana más amplia de edad gestacional en el momento de extracción de sangre.
El término “cantidad” o “nivel” como se utiliza en el presente documento se refiere a una cantidad de un biomarcador que es detectable o medible en una muestra biológica y/o control. La cantidad de un biomarcador puede ser, por ejemplo, una cantidad de polipéptido, la cantidad de ácido nucleico o la cantidad de un fragmento o sustituto. El término puede incluir alternativamente combinaciones de los mismos. El término “cantidad” o “nivel” de un biomarcador es una característica medible de ese biomarcador.
La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en las pares de biomarcadores especificados en cualquiera de las Tablas 1 a 77 y Figuras 1 a 111 en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un primer agente de captura que se une específicamente a un primer miembro de dicho par y un segundo agente de captura que se une específicamente a un segundo miembro de dicho par; y detectar la unión entre el primer biomarcador de dicho par y el primer agente de captura y entre el segundo miembro de dicho par y el segundo agente de captura.
La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en las pares de biomarcadores especificados en la Tablas 27 a 59, 61 a 72, 76 y 77 en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un primer agente de captura que se une específicamente a un primer miembro de dicho par y un segundo agente de captura que se une específicamente a un segundo miembro de dicho par; y detectar la unión entre el primer biomarcador de dicho par y el primer agente de captura y entre el segundo miembro de dicho par y el segundo agente de captura.
La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un primer agente de captura que se une específicamente a un primer miembro de dicho par y un segundo agente de captura que se une específicamente a un segundo miembro de dicho par; y detectar la unión entre el primer biomarcador de dicho par y el primer agente de captura y entre el segundo miembro de dicho par y el segundo agente de captura. En una realización, la enseñanza proporciona un método para detectar BP4 y SHBG en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de
a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; b. detectar si IBP4 y SHBG están presentes en la muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente de captura que se une específicamente a IBP4 y un agente de captura que se une específicamente a SHBG; y c. detectar la unión entre IBP4 y el agente de captura y entre SHBG y el agente de captura. En una realización, el método comprende medir un valor de reversión para el par de biomarcadores. En una realización adicional, la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada. En una realización, la muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de edad gestacional. En una realización adicional, el agente de captura se selecciona del grupo que consiste en el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, reactivo de unión a proteínas a base de ácidos nucleicos, molécula pequeña o variante de los mismos. En una realización adicional, el método se realiza mediante un ensayo seleccionado del grupo que consiste en inmunoensayo enzimático (EIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), y radioinmunoensayo (RIA).
La enseñanza también proporciona un método para detectar un par de biomarcadores aislados seleccionados del grupo que consiste en IBP4/SHBG, VTNC/VTDB, VTNC/SHBG, CATD/SHBG, PSG2/ITIH4, CHL1/ITIH4, PSG2/C1QB, PSG2/FBLN3, HPX/IBP4, y HPX/PTGDS en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; y b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica que comprende someter la muestra a un flujo de trabajo de proteómica compuesto de cuantificación por espectrometría de masas.
En una realización la enseñanza proporciona un método para detectar IBP4 y SHBG en una mujer embarazada, dicho método comprende las etapas de a. obtener una muestra biológica de la mujer embarazada; y b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en la muestra biológica que comprende someter la muestra a un flujo de trabajo de proteómica compuesto de cuantificación por espectrometría de masas.
Un “flujo de trabajo de proteómica” generalmente abarca una o más de las siguientes etapas: Las muestras de suero se descongelan y se agotan de las 14 proteínas de mayor abundancia mediante cromatografía de inmunoafinidad. El suero agotado se digiere con una proteasa, por ejemplo, tripsina, para producir péptidos. El producto de la digestión se fortifica posteriormente con una mezcla de péptidos SIS y luego se desaliniza y se somete a LC-MS/MS con un instrumento de triple cuadripolo operado en modo MRM. Las relaciones de respuesta se forman a partir de las relaciones de área de los picos de péptidos endógenos y los correspondientes picos de contrapartes del péptido SIS. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que en los métodos de la enseñanza se pueden utilizar otros tipos de MS tales como, por ejemplo, MALDI-TOF, o ESI-TOF. Además, un experto en la técnica puede modificar un flujo de trabajo de proteómica, por ejemplo, al seleccionar reactivos particulares (tales como proteasas) u omitir o cambiar el orden de ciertas etapas, por ejemplo, puede que no sea necesario inmunoagotar, el péptido SIS se podría agregar antes o después y las proteínas marcadas con isótopos estables se podrían utilizar como estándares en lugar de péptidos.
Cualquier método de separación, detección y cuantificación existente, disponible o convencional se puede utilizar en el presente documento para medir la presencia o ausencia (por ejemplo, la lectura está presente vs. la ausencia; o la cantidad detectable vs. la cantidad indetectable) y/o la cantidad (por ejemplo, la lectura es una cantidad absoluta o relativa, tal como, por ejemplo, concentración absoluta o relativa) de biomarcadores, péptidos, polipéptidos, proteínas y/o fragmentos de los mismos y opcionalmente de uno o más biomarcadores o fragmentos de los mismos en muestras. En algunas realizaciones, la detección y/o cuantificación de uno o más biomarcadores comprende un ensayo que utiliza un agente de captura. En realizaciones adicionales, el agente de captura es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, reactivo de unión a proteínas basado en ácido nucleico, molécula pequeña o una variante de los mismos. En realizaciones adicionales, el ensayo es un inmunoensayo enzimático (EIA), un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y un radioinmunoensayo (RIA). En algunas realizaciones, la detección y/o cuantificación de uno o más biomarcadores comprende además espectrometría de masas (MS). En aún otras realizaciones, la espectrometría de masas es espectrometría de masas de coinmunoprecipitación (co-PI MS), en donde la coinmunoprecipitación, una técnica adecuada para el aislamiento de complejos de proteínas completas, es seguida por análisis espectrométrico de masas.
Como se utiliza en el presente documento, el término “espectrómetro de masas” se refiere a un dispositivo capaz de volatilizar/ionizar analitos para formar iones en fase gaseosa y determinar sus masas moleculares absolutas o relativas. Los métodos adecuados de volatilización/ionización son la ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), electropulverización, láser/luz, térmica, eléctrica, atomización/pulverización y similares, o combinaciones de los mismos. Las formas adecuadas de espectrometría de masas incluyen, pero no se limitan a, instrumentos de trampa de iones, instrumentos de cuadrupolo, instrumentos de sector electrostático y magnético, instrumentos de tiempo de vuelo, espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo (TOF MS/MS), espectrómetros de masas con transformada de Fourier, Orbitraps e instrumentos híbridos compuestos por varias combinaciones de estos tipos de analizadores de masas. Estos instrumentos, a su vez, se pueden interconectar con una variedad de otros instrumentos que fraccionan las muestras (por ejemplo, cromatografía líquida o técnicas de adsorción en fase sólida basadas en propiedades químicas o biológicas) y que ionizan las muestras para introducción en el espectrómetro de masas, que incluye la desorción láser asistida por matriz (MALDI), electropulverización o ionización por nanopulverización (ESI) o combinaciones de los mismos.
En general, cualquier técnica de espectrometría de masas (MS) que pueda proporcionar información precisa sobre la masa de péptidos, y preferiblemente también sobre la fragmentación y/o la secuencia de aminoácidos (parcial) de péptidos seleccionados (por ejemplo, espectrometría de masas en tándem, MS/MS; o en el decaimiento posterior a la fuente de ionización, TOF MS), se puede utilizar en los métodos divulgados en el presente documento. Las técnicas y sistemas de MS y MS/MS de péptidos adecuados son bien conocidos per se (véase, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, vol.146: “Mass Spectrometry of Proteins and Peptides”, por Chapman, ed., Humana Press 2000; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79; o Methods in Enzymology, vol.402: “Biological Mass Spectrometry”, by Burlingame, ed., Academic Press 2005) y se puede utilizar para practicar los métodos divulgados en el presente documento. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, los métodos divulgados comprenden realizar MS cuantitativa para medir uno o más biomarcadores. Dichos métodos cuantitativos se pueden realizar en un formato automatizado (Villanueva, et al., Nature Protocols (2006) 1(2): 880-891) o semiautomático. En realizaciones particulares, la MS se puede vincular operativamente a un dispositivo de cromatografía de líquidos (LC-MS/MS o LC-MS) o un dispositivo de cromatografía de gases (GC-MS o GC-MS/MS). Otros métodos útiles en este contexto incluyen la etiqueta de afinidad codificada por isótopos (ICAT), las etiquetas de masa en tándem (TMT) o el marcado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular (SILAC), seguido de cromatografía y MS/MS.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “monitorización de reacciones múltiples (MRM)” o “monitorización de reacciones seleccionadas (SRM)” se refieren a un método de cuantificación basado en MS que es particularmente útil para cuantificar analitos que se encuentran en baja abundancia. En un experimento SRM, los dos filtros de masa de un instrumento de triple cuadrupolo seleccionan un ion precursor predefinido y uno o más de sus fragmentos y los monitorizan a lo largo del tiempo para lograr una cuantificación precisa. Se pueden medir varios pares de iones precursores y fragmentos de SRM dentro del mismo experimento en la escala de tiempo cromatográfica al alternar rápidamente entre los diferentes pares de precursores/fragmentos para realizar un experimento de MRM. Una serie de transiciones (pares de iones precursor/fragmento) en combinación con el tiempo de retención del analito dirigido (por ejemplo, péptido o molécula pequeña tal como entidad química, esteroide, hormona) puede constituir un ensayo definitivo. Se puede cuantificar una gran cantidad de analitos durante un solo experimento de LC-MS. El término “programado” o “dinámico” en referencia a MRM o SRM, se refiere a una variación del ensayo en el que las transiciones para un analito en particular solo se adquieren en una ventana de tiempo alrededor del tiempo de retención esperado, lo que aumenta significativamente la cantidad de analitos que se pueden detectar y cuantificar en un solo experimento de LC-MS y que contribuyen a la selectividad de la prueba, ya que el tiempo de retención es una propiedad que depende de la naturaleza física del analito. Un solo analito también se puede monitorizar con más de una transición. Finalmente, se pueden incluir en el ensayo estándares que corresponden a los analitos de interés (por ejemplo, la misma secuencia de aminoácidos), pero que se diferencien por la inclusión de isótopos estables. Los estándares isotópicos estables (SIS) se pueden incorporar al ensayo a niveles precisos y utilizar para cuantificar el analito desconocido correspondiente. Un nivel adicional de especificidad es aportado por la coelución del analito desconocido y su SIS correspondiente y las propiedades de sus transiciones (por ejemplo, la similitud en la relación del nivel de dos transiciones del analito desconocido y la relación de las dos transiciones de su correspondiente SIS).
Los ensayos, instrumentos y sistemas de espectrometría de masas adecuados para el análisis de péptidos biomarcadores pueden incluir, sin limitación, MS de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF); decaimiento posterior a la fuente de ionización (PSD) de MALDI-TOF; MALDI-TOF/TOF; MS de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por superficie (SELDI-TOF); espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n (n es un número entero mayor que cero); MS de trampa de iones ESI 3D o lineal (2D); MS de triple cuadrupolo ESI; TOF ortogonal de cuadrupolo ESI (Q-TOF); sistemas de MS de transformada de Fourier ESI; desorción/ionización sobre silicio (DIOS); espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS); espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI-(MS)n; espectrometría de movilidad de iones (IMS); espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), espectrometría de masas de fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS); APPI-MS/MS; y APPI-(MS)n. La fragmentación de iones peptídicos en disposiciones de MS en tándem (MS/MS) se puede lograr utilizando formas establecidas en la técnica, como, por ejemplo, disociación inducida por colisión (CID). Como se describe en el presente documento, la detección y cuantificación de biomarcadores por espectrometría de masas puede implicar la monitorización de reacciones múltiples (MRM), tal como se describe, entre otros, por Kuhn et al. Proteomics 4: 1175-86 (2004). La adquisición en modo de monitorización de reacciones múltiples programadas (MRM programada) durante el análisis LC-MS/MS potencia la sensibilidad y la precisión de la cuantificación de péptidos. Anderson and Hunter, Molecular and Cellular Proteomics 5(4):573 (2006). Como se describe en el presente documento, los ensayos basados en espectrometría de masas se pueden combinar ventajosamente con métodos de separación o fraccionamiento de péptidos o proteínas y dirección ascendente, tales como por ejemplo con los métodos cromatográficos y otros descritos en el presente documento a continuación. Como se describe con más detalle en el presente documento, la proteómica cuantitativa de escopeta se puede combinar con ensayos basados en SRM/MRM para la identificación y verificación de alto rendimiento de biomarcadores pronósticos de parto prematuro.
Un experto en la técnica apreciará que se pueden utilizar varios métodos para determinar la cantidad de un biomarcador, que incluye enfoques de espectrometría de masas, tales como MS/MS, LC-MS/MS, monitorización de reacciones múltiples (MRM) o SRM y monitorización de producción (PIM) y también incluye métodos basados en anticuerpos como inmunoensayos tales como transferencia de Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo, transferencia de puntos y FACS. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, determinar el nivel de al menos un biomarcador comprende utilizar un inmunoensayo y/o métodos de espectrometría de masas. En realizaciones adicionales, los métodos de espectrometría de masas se seleccionan de MS, MS/MS, LC-MS/MS, SRM, PIM y otros de dichos métodos conocidos en la técnica. En otras realizaciones, LC-MS/MS comprende además 1D LC-MS/MS, 2D LC-MS/MS o 3D LC-MS/MS. Las técnicas y protocolos de inmunoensayo son generalmente conocidos por aquellos expertos en la técnica (Price and Newman, Principles and Practice oflmmunoassay, 2nd Edition, Grave’ s Dictionaries, 1997; and Gosling, Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press, 2000.) Se puede utilizar una variedad de técnicas de inmunoensayo, que incluyen inmunoensayos competitivos y no competitivos (Self et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996).
En realizaciones adicionales, el inmunoensayo se selecciona de transferencia de Western, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, radioinmunoensayo (RIA), transferencia de puntos y FACS. En ciertas realizaciones, el inmunoensayo es un ELISA. En aún una realización adicional, el ELISA es ELISA directo (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), ELISA indirecto, ELISA tipo intercalado, ELISA competitivo, ELISA multiplex, tecnologías ELISPOT y otras técnicas similares conocidas en la técnica. Los principios de estos métodos de inmunoensayo se conocen en la técnica, por ejemplo, John R. Crowther, The ELISA Guidebook, lst ed, Humana Press 2000, ISBN 0896037282. Normalmente, los ELISA se realizan con anticuerpos, pero se pueden realizar con cualesquier agentes de captura que se unen específicamente a uno o más biomarcadores de la enseñanza y que se pueden detectar. El ELISA multiplex permite la detección simultánea de dos o más analitos dentro de un solo compartimento (por ejemplo, pocillo de microplaca) usualmente en una pluralidad de direcciones de matriz (Nielsen and Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20 (2004) and Ling et al.2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98 (2007)).
En algunas realizaciones, el Radioinmunoensayo (RIA) se puede utilizar para detectar uno o más biomarcadores en los métodos de la enseñanza. El RIA es un ensayo basado en la competencia que es bien conocido en la técnica e implica mezclar cantidades conocidas de radioactivamente-analito diana marcado (por ejemplo, marcado con 125I o 131I) con un anticuerpo específico para el analito, luego agregar el analito no marcado de una muestra y medir la cantidad de analito marcado que se desplaza (véase, por ejemplo, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, por Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 como guía).
Se puede utilizar un marcado detectable en los ensayos descritos en el presente documento para la detección directa o indirecta de los biomarcadores en los métodos de la enseñanza. Se puede utilizar una amplia variedad de etiquetas detectables, y la elección de la etiqueta depende de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el anticuerpo, requisitos de estabilidad y las disposiciones de instrumentación y eliminación disponibles. Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con la selección de un marcado detectable adecuado basado en la detección de biomarcadores en los métodos de la enseñanza. Los marcados detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon Green™, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarhodimina (TRITC), Cy3, Cy5, etc.), marcadores fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), ficoeritrina, etc.), enzimas (por ejemplo, luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, etc.), nanopartículas, biotina, digoxigenina, metales y similares.
Para análisis basados en espectrometría de masas, el etiquetado diferencial con reactivos isotópicos, por ejemplo, etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT) o la variación más reciente que utiliza reactivos de etiquetado isobárico, iTRAQ (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), o las etiquetas de masa en tándem, TMT, (Thermo Scientific, Rockford, IL), seguidas de cromatografía líquida multidimensional (LC) y análisis de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) pueden proporcionar una metodología adicional para practicar los métodos de la enseñanza.
Se puede utilizar un ensayo de quimioluminiscencia que utiliza un anticuerpo quimioluminiscente para la detección sensible y no radiactiva de los niveles de proteína. También puede ser adecuado un anticuerpo marcado con fluorocromo. Los ejemplos de fluorocromos incluyen, sin limitación, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo de Texas y lisamina. Los marcados indirectos incluyen varias enzimas bien conocidas en la técnica, tales como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), betagalactosidasa, ureasa y similares. Los sistemas de detección que utilizan sustratos adecuados para la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina y la beta-galactosidasa son bien conocidos en la técnica.
Se puede analizar una señal del marcado directo o indirecto, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro para detectar el color de un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación tal como un contador gamma para detección de 125I; un fluorómetro para detectar la fluorescencia en presencia de luz de una determinada longitud de onda. Para la detección de anticuerpos ligados a enzimas, se puede realizar un análisis cuantitativo utilizando un espectrofotómetro tal como un Lector de Microplacas EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, Calif.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos utilizados para practicar la enseñanza se pueden automatizar o realizar de forma robótica, y la señal de varias muestras se puede detectar simultáneamente.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento, abarcan la cuantificación de los biomarcadores utilizando espectrometría de masas (MS). En realizaciones adicionales, la espectrometría de masas puede ser cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), monitorización de reacciones múltiples (MRM) o monitorización de reacciones seleccionadas (SRM). En realizaciones adicionales, la MRM o la SRM pueden abarcar además la MRM programada o el SRM programada.
Como se describió anteriormente, la cromatografía también se puede utilizar para practicar los métodos de la enseñanza. La cromatografía abarca métodos para separar sustancias químicas y generalmente implica un proceso en el que una mezcla de analitos es transportada por una corriente de líquido o gas en movimiento (“fase móvil”) y se separa en componentes como resultado de la distribución diferencial de los analitos a medida que fluyen alrededor o sobre una fase líquida o sólida estacionaria (“fase estacionaria”), entre la fase móvil y dicha fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser usualmente un sólido finamente dividido, una hoja de material filtrante o una película delgada de un líquido sobre la superficie de un sólido, o similar. La cromatografía es bien entendida por aquellos expertos en la técnica como una técnica aplicable para la separación de compuestos químicos de origen biológico, tales como, por ejemplo, aminoácidos, proteínas, fragmentos de proteínas o péptidos, etc.
La cromatografía puede ser en columna (es decir, en la que la fase estacionaria se deposita o empaca en una columna), preferiblemente cromatografía líquida y, aún más preferiblemente, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida de ultra alto rendimiento/presión (UHPLC). Los detalles de la cromatografía son bien conocidos en la técnica (Bidlingmeyer, Practical HPLC Methodology and Applications, John Wiley & Sons Inc., 1993). Los tipos de ejemplo de cromatografía incluyen, sin limitación, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), UHPLC, HPLC de fase normal (NP-HPLC), HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), tales como cromatografía catiónica o aniónica, cromatografía de intercambio, cromatografía de interacción hidrófila (HILIC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que incluye la cromatografía de filtración en gel o la cromatografía de permeación en gel, cromatoenfoque, cromatografía de afinidad tal como inmunoafinidad, cromatografía de afinidad con metal inmovilizado y similares. La cromatografía, que incluye la cromatografía unidimensional, bidimensional o multidimensional, se puede utilizar como un método de fraccionamiento de péptidos junto con un método de análisis de péptidos adicional, como, por ejemplo, con un análisis de espectrometría de masas en dirección descendente como se describe en otra parte de esta especificación.
Se pueden utilizar métodos adicionales de separación, identificación o cuantificación de péptidos o polipéptidos, opcionalmente junto con cualquiera de los métodos de análisis descritos anteriormente, para medir biomarcadores en la presente divulgación. Dichos métodos incluyen, sin limitación, partición de extracción química, enfoque isoeléctrico (IEF) que incluye enfoque isoeléctrico capilar (CIEF), isotacoforesis capilar (CITP), electrocromatografía capilar (CEC) y similares, electroforesis en gel de poliacrilamida unidimensional (PAGE), electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D-PAGE), electroforesis en gel capilar (CGE), electroforesis en zona capilar (CZE), cromatografía electrocinética micelar (MEKC), electroforesis de flujo libre (FFE), etc.
En el contexto de la enseñanza, el término “agente de captura” se refiere a un compuesto que se puede unir específicamente a una diana, en particular un biomarcador. El término incluye anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, reactivos de unión a proteínas basados en ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros, Aptámeros Modificados de Tasa de Desaceleración Lenta (SOMAmer™)), agentes de captura de proteínas, ligandos naturales (es decir, una hormona para su receptor o viceversa), moléculas pequeñas o variantes de los mismos.
Los agentes de captura se pueden configurar para unirse específicamente a una diana, en particular, un biomarcador. Los agentes de captura pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas orgánicas, tales como polipéptidos, polinucleótidos y otras moléculas no poliméricas que son identificables por un experto. En las realizaciones divulgadas en el presente documento, los agentes de captura incluyen cualquier agente que se pueda utilizar para detectar, purificar, aislar o enriquecer una diana, en particular un biomarcador. Cualesquier tecnologías de captura por afinidad conocida en la técnica se pueden utilizar para aislar y enriquecer/concentrar selectivamente los biomarcadores que son componentes de mezclas complejas de medios biológicos para utilizar en los métodos divulgados.
Los agentes de captura de anticuerpos que se unen específicamente a un biomarcador se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.1986) Los agentes de captura de anticuerpos pueden ser cualquier inmunoglobulina o derivado de la misma, ya sea natural o producido total o parcialmente sintéticamente. Todos los derivados de los mismos que mantienen la capacidad de unión específica también se incluyen en el término. Los agentes de captura de anticuerpos tienen un dominio de unión que es homólogo o en gran parte homólogo a un dominio de unión de inmunoglobulina y pueden derivar de fuentes naturales, o producirse parcial o totalmente de forma sintética. Los agentes de captura de anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. En algunas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos se pueden proporcionar en cualquiera de una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, humanizado, parcialmente humanizado, quimérico, quimérico humanizado, etc. Los agentes de captura de anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, Fv, diacuerpo dsFv y Fd. Un agente de captura de anticuerpos se puede producir por cualquier medio. Por ejemplo, un agente de captura de anticuerpos se puede producir enzimática o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto y/o se puede producir de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. Un agente de captura de anticuerpos puede comprender un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Alternativa o adicionalmente, el agente de captura de anticuerpos puede comprender múltiples cadenas que están ligadas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro; y cualquier fragmento funcional obtenido a partir de dichas moléculas, en el que dichos fragmentos conservan las propiedades de unión específica de la molécula de anticuerpo original. Debido a su tamaño más pequeño como componentes funcionales de la molécula completa, los fragmentos de anticuerpos pueden ofrecer ventajas sobre los anticuerpos intactos para uso en ciertas técnicas inmunoquímicas y aplicaciones experimentales.
Los agentes de captura adecuados útiles para practicar la enseñanza también incluyen aptámeros. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos que se pueden unir a sus dianas específicamente a través de estructuras tridimensionales (3-D) únicas. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos y diferentes aptámeros pueden tener el mismo número de nucleótidos o uno diferente. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN o ácidos nucleicos modificados químicamente y pueden ser de cadena sencilla, o de cadena doble o contener regiones de cadena doble, y pueden incluir estructuras de orden superior. Un aptámero también puede ser un fotoaptámero, donde se incluye un grupo funcional fotorreactivo o químicamente reactivo en el aptámero para permitir que se ligue covalentemente a su diana correspondiente. El uso de un agente de captura de aptámeros puede incluir el uso de dos o más aptámeros que se unen específicamente al mismo biomarcador. Un aptámero puede incluir una etiqueta. Un aptámero se puede identificar utilizando cualquier método conocido, que incluye el proceso SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). Una vez identificado, un aptámero se puede preparar o sintetizar de acuerdo con cualquier método conocido, que incluyen los métodos de síntesis química y los métodos de síntesis enzimática, y se puede utilizar en una variedad de aplicaciones para la detección de biomarcadores. Liu et al., Curr Med Chem.18(27):4117-25 (2011). Los agentes de captura útiles en la práctica de los métodos de la enseñanza también incluyen SOMAmers (Aptámeros Modificados de Tasa de Desaceleración Lenta) conocidos en la técnica por tener características de tasa de desaceleración mejoradas. Brody et al., J Mol Biol. 422(5):595-606 (2012). Los SOMAmers se pueden generar utilizando cualquier método conocido, que incluye el método SELEX.
Aquellos expertos en la técnica entienden que los biomarcadores se pueden modificar antes del análisis para mejorar su resolución o determinar su identidad. Por ejemplo, los biomarcadores se pueden someter a digestión proteolítica antes del análisis. Se puede utilizar cualquier proteasa. Las proteasas, tales como la tripsina, que es probable que escindan los biomarcadores en un número discreto de fragmentos, son particularmente útiles. Los fragmentos que resultan de la digestión funcionan como una señal distintiva para los biomarcadores, lo que permite su detección de manera indirecta. Esto es particularmente útil cuando hay biomarcadores con masas moleculares similares que podrían confundirse con el biomarcador en cuestión. También, la fragmentación proteolítica es útil para biomarcadores de alto peso molecular porque los biomarcadores más pequeños se resuelven más fácilmente mediante espectrometría de masas. En otro ejemplo, los biomarcadores se pueden modificar para mejorar la resolución de detección. Por ejemplo, la neuraminidasa se puede utilizar para retirar los residuos de ácido siálico terminal de las glicoproteínas para mejorar la unión a un adsorbente aniónico y mejorar la resolución de detección. En otro ejemplo, los biomarcadores se pueden modificar mediante la adhesión de una etiqueta de peso molecular particular que se une específicamente a los biomarcadores moleculares, distinguiéndolos aún más. Opcionalmente, después de detectar dichos biomarcadores modificados, la identidad de los biomarcadores se puede determinar aún más al hacer coincidir las características físicas y químicas de los biomarcadores modificados en una base de datos de proteínas (por ejemplo, SwissProt).
Se aprecia además en la técnica que los biomarcadores en una muestra se pueden capturar sobre un sustrato para la detección. Los sustratos tradicionales incluyen placas de 96 pocillos recubiertas de anticuerpos o membranas de nitrocelulosa que posteriormente se prueban para detectar la presencia de las proteínas. Alternativamente, las moléculas de unión a proteínas adheridas a microesferas, micropartículas, microesferas, perlas u otras partículas se pueden utilizar para la captura y detección de biomarcadores. Las moléculas de unión a proteínas pueden ser anticuerpos, péptidos, peptoides, aptámeros, ligandos de moléculas pequeñas u otros agentes de captura de unión a proteínas adheridos a la superficie de las partículas. Cada molécula de unión a proteínas puede incluir un marcado detectable único que está codificado de tal manera que se pueda distinguir de otros marcados detectables adheridos a otras moléculas de unión a proteínas para permitir la detección de biomarcadores en ensayos multiplex. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, microesferas codificadas por colores con intensidades de luz fluorescente conocidas (véase, por ejemplo, microesferas con tecnología xMAP producidas por Luminex (Austin, Tex.); microesferas que contienen nanocristales de puntos cuánticos, por ejemplo, que tienen diferentes relaciones y combinaciones de colores de puntos cuánticos (por ejemplo, nanocristales Qdot producidos por Life Technologies (Carlsbad, Calif.); nanopartículas metálicas recubiertas de vidrio (véase, por ejemplo, nanoetiquetas SERS producidas por Nanoplex Technologies, Inc. (Mountain View, Calif.); materiales de código de barras (véase por ejemplo, varillas metálicas rayadas de tamaño submicrónico, tales como los Nanocódigos de barras producidos por Nanoplex Technologies, Inc.), micropartículas codificadas con códigos de barras de colores (véase, por ejemplo, CellCard producido por Vitra Bioscience, vitrabio.com), micropartículas de vidrio con imágenes de códigos holográficos digitales (véase, por ejemplo, microperlas CyVera producidas por Illumina (San Diego, Calif.), tintes quimioluminiscentes, combinaciones de compuestos de tinte y perlas de diferentes tamaños detectables.
En otro aspecto, los biochips se pueden utilizar para la captura y detección de los biomarcadores de la enseñanza. Muchos biochip de proteína se conocen en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, biochips de proteínas producidos por Packard BioScience Company (Meriden Conn.), Zyomyx (Hayward, California) y Phylos (Lexington, Mass.). En general, los biochips de proteínas comprenden un sustrato que tiene una superficie. Un reactivo de captura o adsorbente se adhiere a la superficie del sustrato. Con frecuencia, la superficie comprende una pluralidad de ubicaciones direccionables, cada una de cuyas ubicaciones tiene el agente de captura unido a ella. El agente de captura puede ser una molécula biológica, tal como un polipéptido o un ácido nucleico, que captura otros biomarcadores de manera específica. Alternativamente, el agente de captura puede ser un material cromatográfico, tal como un material de intercambio aniónico o un material hidrofílico. Los ejemplos de biochips de proteínas son bien conocidos en la técnica.
La presente divulgación también proporciona métodos para predecir la probabilidad de parto prematuro que comprende medir un cambio en el valor de reversión de un par de biomarcadores. Por ejemplo, una muestra biológica se puede poner en contacto con un panel que comprende uno o más agentes de unión a polinucleótidos. La expresión de uno o más de los biomarcadores detectados luego se puede evaluar de acuerdo con los métodos divulgados a continuación, por ejemplo, con o sin el uso de métodos de amplificación de ácidos nucleicos. Los profesionales expertos apreciarán que, en los métodos descritos en el presente documento, se puede automatizar una medición de la expresión génica. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema que puede llevar a cabo una medición multiplexada de la expresión génica, por ejemplo, proporcionar lecturas digitales de la abundancia relativa de cientos de especies de ARNm simultáneamente.
En algunas realizaciones, se pueden utilizar métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar un biomarcador de polinucleótidos. Por ejemplo, los cebadores de oligonucleótidos y las sondas de la presente enseñanza se pueden utilizar en métodos de amplificación y detección que utilizan sustratos de ácido nucleico aislados por cualquiera de una variedad de metodologías bien conocidas y establecidas (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Manual, pp.7.37-7.57 (2nd ed., 1989); Lin et al., in Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications, pp.605-16 (Persing et al., eds. (1993); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2001 y actualizaciones posteriores)). Los métodos para amplificar ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la transcripción inversa PCR (RT-PCR) (véase Patentes de los Estados Unidos Nos.4,683,195; 4,683,202; 4,800, 159; 4,965,188), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Weiss, Science 254: 1292-93 (1991)), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (véase, por ejemplo, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992); Patentes de Estados Unidos Nos.5,270,184 y 5,455,166), SDA termofílica (tSDA) (véase, por ejemplo, Patente Europea No.0684315) y los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos No.5,130,238; Lizardi et al., BioTechnol.6: 1197-1202 (1988); Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-77 (1989); Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-78 (1990); Patentes de su Nos.
5,480,784; 5,399,491; Publicación US No.2006/46265.
En algunas realizaciones, la medición del ARNm en una muestra biológica se puede utilizar como un sustituto para la detección del nivel del biomarcador de proteína que correspondiente a una muestra biológica. Por lo tanto, también se pueden detectar cualesquiera de los biomarcadores, los pares de biomarcadores o los paneles de reversión de biomarcadores descritos en el presente documento al detecta el ARN apropiado. Los niveles de ARNm se pueden medir mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-PCR seguida de qPCR). La RT-PCR se utiliza para crear un ADNc a partir del ARNm. El ADNc se puede utilizar en un ensayo qPCR para producir fluorescencia a medida que avanza el proceso de amplificación del ADN. En comparación con una curva estándar, la qPCR puede producir una medición absoluta, tal como el número de copias de ARNm por célula. Las transferencias Northern, microarreglos, ensayos Invader y RT-PCR combinados con electroforesis capilar se han utilizado para medir los niveles de expresión de ARNm en una muestra. Véase Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.
Algunas realizaciones divulgadas en el presente documento se refieren a métodos de diagnóstico y pronóstico para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada. La detección del nivel de expresión de uno o más biomarcadores y/o la determinación de una relación de biomarcadores se puede utilizar para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada. Dichos métodos de detección se pueden utilizar, por ejemplo, para el diagnóstico temprano de la afección, para determinar si un sujeto está predispuesto al parto prematuro, para monitorizar el progreso del parto prematuro o el progreso de los protocolos de tratamiento, para evaluar la gravedad del parto prematuro, para pronosticar el resultado del parto prematuro y/o las perspectivas de recuperación o parto a término, o para ayudar en la determinación de un tratamiento adecuado para el parto prematuro.
La cuantificación de biomarcadores en una muestra biológica se puede determinar, sin limitación, mediante los métodos descritos anteriormente, así como cualquier otro método conocido en la técnica. Los datos cuantitativos obtenidos de esta manera se someten luego a un proceso de clasificación analítica. En dicho proceso, los datos sin procesar se manipulan de acuerdo con un algoritmo, donde el algoritmo ha sido predefinido por un conjunto de datos de entrenamiento, por ejemplo, como se describe en los ejemplos proporcionados en el presente documento. Un algoritmo puede utilizar el conjunto de datos de entrenamiento proporcionado en el presente documento, o puede utilizar las pautas proporcionadas en el presente documento para generar un algoritmo con un conjunto de datos diferente.
En algunas realizaciones, analizar una característica medible para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca el uso de un modelo predictivo. En realizaciones adicionales, analizar una característica medible para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca comparar dicha característica medible con una característica de referencia. Como podrán apreciar aquellos expertos en la técnica, dicha comparación puede ser una comparación directa con la característica de referencia o una comparación indirecta en la que la característica de referencia se ha incorporado al modelo predictivo. En realizaciones adicionales, analizar una característica medible para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada abarca uno o más de un modelo de análisis discriminante lineal, un algoritmo de clasificación automatizada de vectores de soporte, un modelo de eliminación de características recursivas, un análisis de predicción del modelo de microarreglo, un modelo de regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo de árbol flexible, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, un algoritmo de aprendizaje automático, un método de regresión penalizado o una combinación de los mismos. En realizaciones particulares, el análisis comprende regresión logística.
Un proceso de clasificación analítica puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos analíticos estadísticos para manipular los datos cuantitativos y proporcionar la clasificación de la muestra. Los ejemplos de métodos útiles incluyen el análisis discriminante lineal, la eliminación de características recursivas, un análisis de predicción de microarreglos, una regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo FlexTree, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, algoritmos de aprendizaje automático; etc.
Para la creación de un bosque aleatorio para la predicción de GAB, un experto en la técnica puede considerar un conjunto de k sujetos (mujeres embarazadas) para quienes se conoce la edad gestacional al nacer (GAB), y para quienes N analitos (transiciones) se han medido en un espécimen de sangre tomada varias semanas antes del parto. Un árbol de regresión comienza con un nodo raíz que contiene todos los sujetos. La GAB promedio para todos los sujetos se puede calcular en el nodo raíz. La variación de la GAB dentro del nodo raíz será alta, porque hay una mezcla de mujeres con diferentes GAB. Luego, el nodo raíz se divide (particiona) en dos ramas, de tal manera que cada rama contenga mujeres con una GAB similar. Se calcula nuevamente la GAB promedio para los sujetos en cada rama. La varianza de la GAB dentro de cada rama será menor que en el nodo raíz, porque el subconjunto de mujeres dentro de cada rama tiene GAB relativamente más similar que las del nodo raíz. Las dos ramas se crean al seleccionar un analito y un valor de umbral para el analito que crea ramas con GAB similar. El analito y el valor umbral se eligen entre el conjunto de todos los analitos y valores umbral, normalmente con un subconjunto aleatorio de analitos en cada nodo. El procedimiento continúa produciendo ramas recursivamente para crear hojas (nodos terminales) en las que los sujetos tienen GAB’s muy similares. La GAB predicha en cada nodo terminal es la GAB promedio para sujetos en ese nodo terminal. Este procedimiento crea un único árbol de regresión. Un bosque aleatorio puede consistir en varios cientos o miles de árboles de este tipo.
La clasificación se puede realizar de acuerdo con métodos de modelado predictivo que establecen un umbral para determinar la probabilidad de que una muestra pertenezca a una clase determinada. La probabilidad es preferiblemente de al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 % o mayor. Las clasificaciones también se pueden realizar al determinar si una comparación entre un conjunto de datos obtenido y un conjunto de datos de referencia produce una diferencia estadísticamente significativa. Si es así, la muestra de la que se obtuvo el conjunto de datos se clasifica como no perteneciente a la clase de conjunto de datos de referencia. Por el contrario, si dicha comparación no es significativamente diferente desde el punto de vista estadístico del conjunto de datos de referencia, entonces la muestra de la que se obtuvo el conjunto de datos se clasifica como perteneciente a la clase de conjunto de datos de referencia.
La capacidad predictiva de un modelo se puede evaluar de acuerdo con su capacidad para proporcionar una métrica de calidad, por ejemplo, AUROC (área bajo la curva ROC) o precisión, de un valor particular, o rango de valores. Las medidas del área bajo la curva son útiles para comparar la precisión de un clasificador a través de todo el rango de datos. Los clasificadores con mayor AUC tienen mayor capacidad para clasificar correctamente las incógnitas entre dos grupos de interés. En algunas realizaciones, un umbral de calidad deseado es un modelo predictivo que clasificará una muestra con una precisión de al menos alrededor de 0.5, al menos alrededor de 0.55, al menos alrededor de 0.6, al menos alrededor de 0.7, al menos alrededor de 0.75, al menos alrededor de 0.8, al menos alrededor de 0.85, al menos alrededor de 0.9, al menos alrededor de 0.95, o mayor. Como medida alternativa, un umbral de calidad deseado se puede referir a un modelo predictivo que clasificará una muestra con un AUC de al menos alrededor de 0.7, al menos alrededor de 0.75, al menos alrededor de 0.8, al menos alrededor de 0.85, al menos alrededor de 0.9, o mayor.
Como se conoce en la técnica, la sensibilidad y la especificidad relativas de un modelo predictivo se pueden ajustar para favorecer la métrica de selectividad o la métrica de sensibilidad, donde las dos métricas tienen una relación inversa. Los límites en un modelo como se describió anteriormente se pueden ajustar para proporcionar un nivel de sensibilidad o especificidad seleccionado, dependiendo de los requisitos particulares de la prueba que se está realizando. Uno o ambos de sensibilidad y especificidad pueden ser de al menos alrededor de 0.7, al menos alrededor de 0.75, al menos alrededor de 0.8, al menos alrededor de 0.85, al menos alrededor de 0.9 o mayor.
Los datos sin procesar se pueden analizar inicialmente al medir los valores de cada biomarcador, usualmente por triplicado o en múltiples triplicados. Los datos se pueden manipular, por ejemplo, los datos sin procesar se pueden transformar utilizando curvas estándar y el promedio de mediciones por triplicado se utiliza para calcular el promedio y la desviación estándar para cada paciente. Estos valores se pueden transformar antes de ser utilizados en los modelos, por ejemplo, transformada logarítmicamente, transformada por Box-Cox (Box and Cox, Royal Stat. Soc., Series B, 26:211-246(1964). Luego, los datos se ingresan en un modelo predictivo, que clasificará la muestra de acuerdo con el estado. La información resultante se puede comunicar a un paciente o proveedor de atención médica.
Para generar un modelo predictivo para el parto prematuro, se utiliza un conjunto de datos sólido, que comprende muestras de control conocidas y muestras correspondientes a la clasificación de parto prematuro de interés en un conjunto de entrenamiento. Se puede seleccionar un tamaño de muestra utilizando criterios generalmente aceptados. Como se discutió anteriormente, se pueden utilizar diferentes métodos estadísticos para obtener un modelo predictivo de alta precisión. En el Ejemplo 2 se proporcionan ejemplos de dicho análisis.
En una realización, el agrupamiento jerárquico se realiza en la derivación de un modelo predictivo, donde la correlación de Pearson se emplea como la métrica de agrupación. Un enfoque es considerar un conjunto de datos de partos prematuros como una “muestra de aprendizaje” en un problema de “aprendizaje supervisado”. CART es un estándar en aplicaciones a la medicina (Singer, Recursive Partitioning, in the Health Sciences, Springer (1999)) y se puede modificar al transformar cualesquier características cualitativas en características cuantitativas; clasificarlos por niveles de significancia alcanzados, evaluados por métodos de reutilización de muestras para el estadístico T2 de Hotelling; y aplicación adecuada del método Lasso. Los problemas de predicción se convierten en problemas de regresión sin perder de vista la predicción, de hecho, al hacer un uso adecuado del criterio de clasificación de Gini para evaluar la calidad de las regresiones.
Este enfoque condujo a lo que se denomina FlexTree (Huang, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A 101: 10529-10534(2004)). FlexTree funciona muy bien en simulaciones y cuando se aplica a múltiples formas de datos y es útil para practicar los métodos reivindicados. Se ha desarrollado el software que automatiza FlexTree. Alternativamente, se puede utilizar LARTree o LART (Tumbull (2005) Classification Trees with Sub set Analysis Selection by the Lasso, Stanford University). El nombre refleja árboles binarios, como en CART y FlexTree; el Lasso, como se ha dicho; y la implementación del Lasso a través de lo que se denomina LARS por Efron et al. (2004) Annals of Statistics 32:407-451 (2004). Véase, también, Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101(29): 10529-34 (2004). Otros métodos de análisis que se pueden utilizar incluyen la regresión lógica. Un método de regresión lógica Ruczinski, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512 (2003). La regresión lógica se parece a CART en que su clasificador se puede mostrar como un árbol binario. Es diferente en que cada nodo tiene declaraciones booleanas sobre características que son más generales que las simples declaraciones “y” producidas por CART.
Otro enfoque es el de los centroides contraídos más cercanos (Tibshirani, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 99:6567-72(2002)). La tecnología es similar a k-means, pero tiene la ventaja de que, al reducir los centros de los grupos, uno selecciona automáticamente las características, como es el caso el Lasso, para enfocar la atención en un pequeño número de aquellas que son informativas. El enfoque está disponible como software PAM y se utiliza ampliamente. Dos conjuntos adicionales de algoritmos que se pueden utilizar son los bosques aleatorios Preiman, Machine Learning 45:5-32 (2001)) y MART (Hastie, The Elements of Statistical Learningq, Springer (2001)). Estos dos métodos se conocen en la técnica como “métodos de comité”, que implican predictores que “votan” sobre el resultado.
Para proporcionar un orden de importancia, se puede determinar la tasa de descubrimiento falsa (FDR). Primero, se genera un conjunto de distribuciones nulas de valores de disimilitud. En una realización, los valores de los perfiles observados se permutan para crear una secuencia de distribuciones de coeficientes de correlación obtenidos al azar, creando de esta manera un conjunto apropiado de distribuciones nulas de coeficientes de correlación (Tusher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.98, 5116-21 (2001)). El conjunto de distribución nula se obtiene al: permutar los valores de cada perfil para todos los perfiles disponibles; calcular los coeficientes de correlación por pares para todo el perfil; calcular la función de densidad de probabilidad de los coeficientes de correlación para esta permutación; y repetir el procedimiento N veces, donde N es un número grande, usualmente 300. Utilizando las distribuciones N, se calcula una medida apropiada (media, mediana, etc.) del recuento de los valores del coeficiente de correlación que exceden el valor (de similitud) que se obtiene a partir de la distribución de valores de similitud observados experimentalmente en un nivel de significancia dado.
La FDR es la relación entre el número de correlaciones falsamente significativas esperadas (estimadas a partir de las correlaciones mayores que esta correlación de Pearson seleccionada en el conjunto de datos aleatorios) y el número de correlaciones mayores que esta correlación de Pearson seleccionada en los datos empíricos (correlaciones significativas). Este valor de correlación de punto de corte se puede aplicar a las correlaciones entre perfiles experimentales. Utilizando la distribución anteriormente mencionada, se elige un nivel de confianza para la significancia. Este se utiliza para determinar el valor más bajo del coeficiente de correlación que excede el resultado que se hubiera obtenido por casualidad. Utilizando este método, se obtienen umbrales para correlación positiva, correlación negativa o ambos. Utilizando este(s) umbral(es), el usuario puede filtrar los valores observados de los coeficientes de correlación por pares y eliminar aquellos que no excedan el(los) umbral(es). Adicionalmente, se puede obtener una estimación de la tasa de falsos positivos para un umbral determinado. Para cada una de las distribuciones individuales de “correlación aleatoria”, se puede encontrar cuántas observaciones caen fuera del rango de umbral. Este procedimiento proporciona una secuencia de recuentos. La media y la desviación estándar de la secuencia proporcionan el número promedio de posibles falsos positivos y su desviación estándar.
En un enfoque analítico alternativo, las variables elegidas en el análisis en sección transversal se emplean por separado como predictores en un análisis de tiempo hasta el evento (análisis de supervivencia), donde el evento es la ocurrencia de un parto prematuro y los sujetos sin evento son considerada censurados en el momento del parto. Dado el resultado específico del embarazo (evento de parto prematuro o sin evento), los períodos aleatorios de tiempo en que se observará a cada paciente y la selección de características proteómicas y de otro tipo, un enfoque paramétrico para analizar la supervivencia puede ser mejor que el Cox semiparamétrico ampliamente aplicado. modelo. Un ajuste paramétrico de supervivencia de Weibull permite que la tasa de riesgo sea monótonamente creciente, decreciente o constante, y también tiene una representación de riesgo proporcional (al igual que el modelo de Cox) y una representación acelerada del tiempo de falla. Todas las herramientas estándar disponibles para obtener estimadores de máxima verosimilitud aproximados de los coeficientes de regresión y las funciones correspondientes están disponibles con este modelo.
Además, se pueden utilizar los modelos de Cox, especialmente porque las reducciones del número de covariantes a un tamaño manejable con el Lasso simplificarán significativamente el análisis, lo que permitirá la posibilidad de un enfoque no paramétrico o semiparamétrico para la predicción del tiempo hasta el parto prematuro. Estas herramientas estadísticas son conocidas en la técnica y aplicables a todo tipo de datos proteómicos. Se proporciona un conjunto de biomarcadores, datos clínicos y genéticos que se pueden determinar fácilmente y que son altamente informativos con respecto a la probabilidad de parto prematuro y el tiempo previsto para un evento de parto prematuro en dicha mujer embarazada. Además, los algoritmos brindan información con respecto a la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada.
De acuerdo con lo anterior, un experto en la técnica entiende que la probabilidad de parto prematuro de acuerdo con la enseñanza se puede determinar utilizando una variable categórica o cuantitativa. Por ejemplo, al practicar los métodos de la enseñanza, la característica medible de cada uno de los N biomarcadores se puede someter a un análisis de datos categóricos para determinar la probabilidad de parto prematuro como un resultado categórico binario. Alternativamente, los métodos de la enseñanza pueden analizar la característica medible de cada uno de los N biomarcadores al calcular inicialmente variables cuantitativas, en particular, la edad gestacional predicha al nacer. La edad gestacional predicha al nacer se puede utilizar posteriormente como base para predecir el riesgo de parto prematuro. Al utilizar inicialmente una variable cuantitativa y luego convertir la variable cuantitativa en una variable categórica, los métodos de la enseñanza toman en cuenta el continuo de mediciones detectadas para las características medibles. Por ejemplo, al predecir la edad gestacional al nacer en lugar de hacer una predicción binaria de parto prematuro frente a parto a término, es posible adaptar el tratamiento para la mujer embarazada. Por ejemplo, una edad gestacional predicha más temprana al nacer dará como resultado una intervención prenatal más intensiva, es decir, seguimiento y tratamiento, que una edad gestacional predicha que se acerca al término completo.
Entre las mujeres con una GAB predicha de j días más o menos k días, p(PTB) se puede estimar como la proporción de mujeres en el ensayo clínico PAPR (véase el Ejemplo 1) con una GAB predicha de j días más o menos k días que en realidad dan a luz antes de las 37 semanas de edad gestacional. En términos más generales, para las mujeres con una GAB predicha de j días más o menos k días, la probabilidad de que la edad gestacional real al nacer sea menor que una edad gestacional especificada, p(GAB real < GAB especificada), se estimó como la proporción de mujeres en el ensayo clínico PAPR con una GAB predicha de j días más o menos k días que en realidad dieron a luz antes de la edad gestacional especificada.
En el desarrollo de un modelo predictivo, puede ser deseable seleccionar un subconjunto de marcadores, es decir, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, hasta el conjunto completo de marcadores. Usualmente, se elegirá un subconjunto de marcadores que satisfaga las necesidades del análisis cuantitativo de la muestra, por ejemplo, disponibilidad de reactivos, conveniencia de cuantificación, etc., mientras que se mantiene un modelo predictivo de alta precisión. La selección de una serie de marcadores informativos para construir modelos de clasificación requiere la definición de una métrica de rendimiento y un umbral definido por el usuario para producir un modelo con capacidad predictiva útil basada en esta métrica. Por ejemplo, la métrica de rendimiento puede ser el AUC, la sensibilidad y/o la especificidad de la predicción, así como la precisión general del modelo de predicción.
Como entenderán aquellos expertos en la técnica, un proceso de clasificación analítica puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos analíticos estadísticos para manipular los datos cuantitativos y proporcionar la clasificación de la muestra. Los ejemplos de métodos útiles incluyen, sin limitación, análisis discriminante lineal, eliminación de características recursivas, un análisis de predicción de microarreglo, una regresión logística, un algoritmo CART, un algoritmo FlexTree, un algoritmo LART, un algoritmo de bosque aleatorio, un algoritmo MART, y algoritmos de aprendizaje automático. Varios métodos se utilizan en un modelo de entrenamiento. La selección de un subconjunto de marcadores puede ser para una selección anterior o posterior de un subconjunto de marcadores. Se puede seleccionar el número de marcadores que optimizarán el rendimiento de un modelo sin el uso de todos los marcadores. Una forma de definir el número óptimo de términos es elegir el número de términos que producen un modelo con la capacidad predictiva deseada (por ejemplo, un AUC >0.75, o medidas equivalentes de sensibilidad/especificidad) que no se encuentra más de un error estándar del valor máximo obtenido para esta métrica utilizando cualquier combinación y número de términos utilizados para el algoritmo dado.
En aún otro aspecto, la enseñanza proporciona kits para determinar la probabilidad de parto prematuro. El kit puede incluir uno o más agentes para la detección de biomarcadores, un recipiente para contener una muestra biológica aislada de una mujer embarazada; e instrucciones impresas para hacer reaccionar agentes con la muestra biológica o una porción de la muestra biológica para detectar la presencia o cantidad de biomarcadores aislados en la muestra biológica. Los agentes se pueden empacar en recipientes separados. El kit puede comprender además una o más muestras de referencia de control y reactivos para realizar un inmunoensayo.
El kit puede comprender uno o más recipientes para las composiciones contenidas en el kit. Las composiciones pueden estar en forma líquida o pueden estar liofilizadas. Los recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, que incluyen vidrio o plástico. El kit también puede comprender un prospecto que contiene instrucciones escritas para los métodos para determinar la probabilidad de parto prematuro.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, no de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1. Desarrollo de un conjunto de muestras para el descubrimiento y validación de biomarcadores para parto prematuro
Se desarrolló un protocolo estándar que rige la realización del estudio clínico Evaluación Proteómica del Riesgo Prematuro (PAPR). Se obtuvieron especímenes de mujeres en 11 sitios aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en los Estados Unidos. Después de dar el consentimiento informado, se obtuvieron muestras de suero y plasma, así como información pertinente con respecto a las características demográficas de la paciente, antecedentes médicos y de embarazo, antecedentes de embarazo actual y medicamentos concurrentes. Después del parto, se recolectaron datos relacionados con las condiciones y complicaciones maternas e infantiles. Las muestras de suero y plasma se procesaron de acuerdo con un protocolo que requiere centrifugación refrigerada estandarizada, se formaron alícuotas de las muestras en crioviales 2-D con código de barras y posteriormente se congelaron -80 °C. Después del parto, los casos de parto prematuro se revisaron individualmente para determinar su estado como parto prematuro espontáneo o parto prematuro por indicación médica. Para este análisis sólo se utilizaron casos de parto prematuro espontáneo. Para el descubrimiento de biomarcadores de parto prematuro, se analizaron muestras de suero de 86 casos de prematuros y 172 controles que cubrían edades gestacionales en el momento de extracción de sangre (GABD) de 17 semanas y 0 días (17.0) a 28 semanas y 6 días (28.6). También se analizó un conjunto de muestras separado con fines de verificación y estaba compuesto por suero de 50 casos de prematuros y 100 controles, en el mismo rango de edad gestacional. Los dos controles para cada caso fueron emparejados por GABD y seleccionados de varios paneles de controles generados aleatoriamente que coincidían con la distribución de partos informados en el Informe Nacional de Estadísticas Vitales de 2012. Se instituyó un protocolo para garantizar que el personal del laboratorio desconociera la edad gestacional al nacer y el estado de casos vs. los controles de los sujetos utilizados para ambos conjuntos de muestras. El personal de informática también desconocía el conjunto de muestras de verificación hasta que se completó el análisis analítico de las muestras.
Las muestras de suero se agotaron de proteínas de gran abundancia utilizando el Sistema de Eliminación de Múltiples Afinidades Humanas 14 (MARS 14), que elimina 14 de las proteínas más abundantes que se tratan como no informativas con respecto a la identificación de cambios relevantes para la enfermedad en el proteoma en suero. Con este fin, se diluyeron volúmenes iguales (50 µl) de cada muestra clínica de suero humano agrupado (HGS) o de suero humano de mujer embarazada (pHGS) agrupado con 150 µl de tampón de columna A de Agilent y se filtraron sobre una placa de filtro Captiva. para eliminar los precipitados. Las muestras filtradas se agotaron utilizando una columna MARS-14 (4.6 x 100 mm, Cat. #5188-6558, Agilent Technologies), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se enfriaron a 4 °C en el muestreador automático, la columna de agotamiento se hizo funcionar a temperatura ambiente y las fracciones recolectadas se mantuvieron a 4 °C hasta su posterior análisis. Las fracciones no unidas se recolectaron para su posterior análisis.
Las muestras de suero agotado se redujeron con ditiotreitol, se alquilaron con yodoacetamida y luego se digirieron con 5.0 μg de Trypsin Gold - Mass Spec Grade (Promega) a 37 °C durante 17 horas (± 1 hora). Después de la digestión con tripsina, se agregó una mezcla de 187 péptidos Estándar de Isótopos Estables (SIS) a las muestras y la mitad de cada muestra se desalinizó sobre una Placa de Extracción en Fase Sólida de 96 pocillos Empore C18 (3M Bioanalytical Technologies). La placa se acondicionó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los péptidos se lavaron con 300 µl de ácido trifluoroacético al 1.5 %, acetonitrilo al 2 %, se eluyeron con 250 µl de ácido trifluoroacético al 1.5 %, acetonitrilo al 95 %, se congelaron a -80 ºC durante 30 minutos y luego se liofilizaron hasta secado. Los péptidos liofilizados se reconstituyeron con acetontilo al 2 %/ácido fórmico al 0.1% que contenía tres péptidos estándar internos no humanos (IS). Los péptidos se separaron con un gradiente de acetonitrilo de 30 min a 400 μl/min sobre una columna Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2.1 x 100 mm, 2.7 μm) a 40 ºC y se inyectaron en un espectrómetro de masas Agilent 6490 Triple Quadrapole.
Las muestras agotadas y digeridas con tripsina se analizaron mediante un método de Monitorización de Reacciones Múltiples Programada (sMRM). El ensayo sMRM monitorizó 898 transiciones que midieron 259 péptidos biológicos y 190 péptidos IS (187 SIS 3 IS), que representan 148 proteínas. Los picos cromatográficos se integraron utilizando el software de Análisis cuantitativo Mass Hunter (Agilent Technologies).
Análisis de datos
El análisis de los datos de muestra de descubrimiento y verificación se realizó en dos fases. En la primera fase, se identificaron biomarcadores sólidos mediante selección utilizando las muestras de descubrimiento y confirmación utilizando el conjunto de muestras de verificación independiente. En la segunda fase, los datos de descubrimiento y verificación se combinaron y utilizaron para identificar los mejores analitos y paneles de analitos para el desarrollo de clasificadores.
Fase I: Análisis ciego
El desarrollo del clasificador inicial se centró en las edades gestacionales de 17.0 a 25.6. Utilizando muestras de descubrimiento, se seleccionó un conjunto de péptidos que corresponde a 62 proteínas en base a criterios preanalíticos y analíticos. El rendimiento del diagnóstico del analito se evaluó en una serie de ventanas GABD estrechas que abarcan tres semanas con dos semanas de superposición entre ventanas adyacentes. En base a la coherencia en el rendimiento del diagnóstico (regulación al alza y a la baja en casos frente a controles en GABD), se seleccionó un subconjunto de 43 analitos para un análisis más detallado.
Para cada ventana estrecha de GABD, se formó un conjunto de reversiones utilizando todas las combinaciones de analitos regulados al alza y a la baja dentro de la ventana estrecha. Un valor de reversión es la relación entre el área máxima relativa de un analito regulado al alza sobre el área máxima relativa de un analito regulado a la baja y sirve tanto para normalizar la variabilidad como para amplificar la señal de diagnóstico. De todas las reversiones posibles dentro de una ventana estrecha, se seleccionó un subconjunto en base a su rendimiento univariado individual (AUC >= 0.6).
Para cada ventana se formaron paneles de reversión de diferentes tamaños (tamaños de 2, 3, 4, 6, 8). Para cada tamaño de panel dentro de una ventana, se realizó una Validación Cruzada de Monte Carlo (MCCV) al entrenar y probar un clasificador logístico iterativamente 1,000 veces en el 70 % y el 30 % de las muestras, respectivamente. Posteriormente, se utilizó un tamaño de panel de 4, determinado como óptimo por la media de AUC MCCV, para identificar las reversiones candidatas que funcionan bien en los paneles. Las reversiones candidatas se identificaron por la frecuencia de ocurrencia en clasificadores logísticos de rendimiento superior de paneles de tamaño 4 en el análisis MCCV. Para cada ventana, se crearon tres conjuntos de tablas de frecuencia de reversión utilizando medidas de rendimiento de ya sea AUC o AUC parcial (pAUC) para una sensibilidad que variaba entre 0.7 y 1, o la correlación de la puntuación de salida del clasificador con el valor de tiempo hasta el parto (TTB) (diferencia en días entre GABD y la edad gestacional al nacer). A partir de cada una de estas listas de reversiones, se seleccionaron las 15 reversiones principales para un análisis más detallado.
Para cada ventana de GABD estrecha, se formaron paneles de reversión de tamaño 2, 3,4 a partir de cada una de las tres listas (AUC, pAUC y TTB) y, en base al desempeño de un análisis MCCV, se seleccionaron los 15 paneles principales para cada tamaño de panel en cada ventana. Junto con las 15 reversiones principales de cada una de las tres listas (AUC, pAUC y TTB) para cada ventana, estos 15 paneles principales de tamaño 2, 3,4 se utilizaron para entrenar clasificadores logísticos sobre las muestras de descubrimiento y las puntuaciones de clasificación se generaron para la verificación de muestras de forma ciega.
Un estadístico externo evaluó el rendimiento de todos los paneles de reversión y clasificador y se informaron las curvas AUC, pAUC para ROC y la correlación TTB de las puntuaciones del clasificador.
Fase II: Análisis no ciego
Después de la eliminación del cegamiento, los conjuntos de datos de descubrimiento y verificación se combinaron y volvieron a analizar. Debido a que la expresión de las proteínas de diagnóstico puede cambiar durante el embarazo, examinamos los niveles de proteínas en función de GABD. Se aplicó una ventana de suavizado mediana de /- 10 días para generar los gráficos cinéticos. Los niveles relativos de proteínas se expresaron como la relación del área máxima del péptido endógeno sobre su estándar SIS correspondiente (relación relativa). Se muestran ejemplos de proteínas con niveles que aumentan durante el embarazo pero que no son diferentes en casos y controles de PTB en las Figuras 3, 4 y 10. La medición de los niveles de dichas proteínas podría ser útil para determinar la datación exacta del embarazo (por ejemplo, un “reloj” de embarazo). El reloj de embarazo predice la edad gestacional a partir de la abundancia relativa de una o más proteínas (transiciones). Alternativamente, en este mismo análisis identificamos proteínas cuyos niveles cambian a través de GABD, pero muestran diferencias entre los casos de PTB y los controles Figura 5. Estas proteínas son candidatas de diagnóstico obvias para el desarrollo del clasificador de PTB. También se ejemplificó el impacto de formar una reversión utilizando la relación de una proteína sobreexpresada sobre la de una proteína subexpresada (Figuras 8 y 21). Es claro que esto resulta en un aumento en la separación de casos y controles de PTB. Los análisis previos sugirieron que los niveles de algunos analitos pueden estar influenciados por el índice de peso corporal (IMC) previo al embarazo. CLIN. CHEM. 37/5, 667-672 (1991); European Journal of Endocrinology (2004) 150161-171. Por esta razón, se exploró el impacto del IMC en la separación al expresar el valor de reversión a lo largo de la gestación solo en aquellas pacientes cuyo IMC es menor de 35 (Figura 21). Esto da como resultado una mejora adicional en la separación.
La selección de reversión y el desarrollo del clasificador en el conjunto de datos combinados de descubrimiento y verificación reflejaron estudios anteriores. Nos enfocamos en la tercera ventana GABD superpuesta (Días 133-153) para ejemplificar el análisis. Se realizó un análisis MCCV para identificar reversiones candidatas. Para evaluar el rendimiento de los paneles, los valores de reversión se combinaron en un clasificador LogSum simple. El clasificador LogSum asigna una puntuación a cada muestra en base a la suma de los logaritmos del valor de la relación relativa de cada reversión para esa muestra. La ausencia de coeficientes en un clasificador de este tipo ayuda a evitar problemas de sobreajuste. Cualquier experto en la técnica puede derivar un clasificador logístico equivalente utilizando los mismos analitos con técnicas bien establecidas. El rendimiento multivariado de un panel de tres reversiones principales formado por cuatro proteínas se muestra como un histograma de valores de AUC obtenidos mediante validación cruzada y en curvas ROC en la Figura 8. Análisis previos sugirieron que los niveles de algunos analitos pueden estar influenciados por el índice de peso corporal (IMC) antes del embarazo.
Determinamos proteínas y/o reversiones, ejemplificadas en el presente documento al utilizar ITIH4/CSH, que son fuertes predictores del tiempo hasta el parto (TTB) (Figura 10). El TTB se define como la diferencia entre la GABD y la edad gestacional al nacer (GAB). Esto tiene potencial para permitir la predicción, ya sea individualmente o en una combinación matemática de dichos analitos para estimar clínicamente TTB (o GAB).
Ejemplo 2. Validación del Predictor sPTB de IBP4/SHBG
Este ejemplo demuestra la validación del predictor sPTB de IBP4/SHBG identificado en un gran esfuerzo de proteómica del suero materno en mujeres asintomáticas al principio del embarazo.
Sujetos
El estudio de Evaluación Proteómica del Riesgo Prematuro (PAPR) se llevó a cabo de conformidad con un protocolo estandarizado en once sitios aprobados por la Junta de revisión institucional (IRB) en los Estados Unidos (identificador Clinicaltrials.gov: NCTO 1371019). Los sujetos se inscribieron entre las 170/7 y 286/7 semanas de GA. La datación se estableció utilizando un protocolo predefinido de datación menstrual confirmado por biometría de ultrasonido temprana, o solo por ultrasonido, para proporcionar la mejor edad gestacional estimada clínicamente. El índice de masa corporal (IMC) se derivó de la altura y el peso autoinformado antes del embarazo. Se excluyeron los embarazos con gestaciones múltiples y con anomalías fetales importantes conocidas o sospechadas. La información pertinente con respecto a las características demográficas del sujeto, antecedentes médicos y de embarazo anteriores, historial de embarazo actual y medicamentos concurrentes se recolectó y se ingresó en un formulario de informe de caso electrónico. Después del parto, se recolectaron datos sobre los resultados y las complicaciones maternas e infantiles. Todos los partos se adjudicaron como partos a término (≥ 370/7 semanas de GA), prematuros espontáneos (que incluye la ruptura prematura de membrana pretérmino) o partos prematuros por indicación médica. Como se indicó, las discrepancias se aclararon con el Investigador Principal en el sitio de estudio. La adjudicación se completó y los datos se bloquearon antes de los estudios de validación.
Recolección de muestras
La sangre materna se recolectó y procesó de la siguiente manera: un período de coagulación a temperatura ambiente de 10 minutos, seguido de centrifugación refrigerada inmediata o colocación en un baño de agua con hielo a 4-8 °C hasta centrifugación. La sangre se centrifugó dentro de las 2.5 horas posteriores a la recolección y se almacenaron alícuotas de suero de 0.5 ml a -80 °C hasta que se analizó.
Principios de desarrollo de predictor
El desarrollo del predictor IBP4/SHBG incluyó etapas independientes y secuenciales de descubrimiento, verificación y validación consistentes con las pautas del Instituto de Medicina (IOM) para las mejores prácticas en investigación “ómica”. IOM (Institute of Medicine). Evolution of Translation Omics: Lessons Learned and the Path Forward. (Micheel CM, Nass SJ, Omenn GS, eds.). Washington, DC The National Academies Press.; 2012:1-355. La validación analítica precedió al análisis de la muestra de validación clínica e incluyó la evaluación de la precisión entre lotes y dentro de lotes, el arrastre y el límite de detección.
El análisis de caso/control anidado de validación se realizó en casos preespecificados de sPTB y especímenes de control independientemente del descubrimiento y la verificación. Los casos de sPTB incluyeron muestras de nueve sitios en total, con dos sitios únicos para la validación. Los casos de validación y los controles se realizan al 100 % en la verificación del documento de origen in situ con la historia clínica de cada sujeto antes del análisis de suero por espectrometría de masas (MS). Este proceso aseguró que todos los sujetos cumplieran los criterios de inclusión y exclusión, así como las complicaciones médicas/del embarazo confirmadas y las asignaciones de GA al nacer para todos los sujetos en el momento de la recolección y suministro de la muestra. Se preestablecieron protocolos de análisis detallados, que incluyen el diseño del estudio de validación, el plan de análisis y un protocolo de cegamiento. El personal desconocía las asignaciones de datos de casos, controles y GA al nacer de los sujetos, con la excepción del Director de Operaciones Clínicas (DCO) y el Administrador de Datos Clínicos. El plan de análisis de datos incluía afirmaciones de validación preespecificadas y un protocolo para análisis externos independientes dobles. Las puntuaciones de los predictores, calculadas como se describe a continuación, se determinaron para todas las muestras de sujetos por un estadístico cegado. Los datos de casos, controles y GA, ligados a las puntuaciones del predictor por el DCO, se sometieron a un análisis estadístico externo independiente. El área bajo la curva característica operativa del receptor (AUROC) y los resultados de las pruebas de significancia se transfirieron de nuevo al DCO. La transferencia de datos incorporó el uso de la función SUMPRODUCT (Microsoft. Microsoft Excel.2013) para garantizar el mantenimiento de la integridad de los datos. Para proporcionar una pista de auditoría de los datos de cada sujeto hasta los resultados de la validación, se aplicó un sello de tiempo digital en tiempo real a los datos analíticos, planes e informes.
Diseño del estudio de validación
En el análisis primario, los casos de sPTB se definieron como sujetos con partos debido a ruptura prematura de membrana pretérmino (PPROM) o inicio espontáneo del trabajo de parto < 370/7 semanas de GA. Los controles fueron sujetos que dieron a luz a las ≥ 370/7 semanas de GA. Los análisis previos de descubrimiento y verificación investigaron 44 biomarcadores candidatos utilizando muestras de suero recolectadas a lo largo de la edad gestacional amplia (170/7 a 256/7 semanas de GA) (Material Complementario). El descubrimiento y la verificación identificaron una GA estrecha óptima en el intervalo de extracción de sangre (190/7 a 216/7 semanas) y dos proteínas, IBP4 y SHBG, utilizadas en una relación (IBP4/SHBG) como el mejor predictor por AUROC para sPTB (Material Complementario). En el descubrimiento y verificación, los sujetos sin valores extremos de IMC habían mejorado el rendimiento de clasificación por IBP4/SHBG (Resultados Complementarios). Tras los análisis de descubrimiento y verificación, se procedió a la validación analítica y clínica.
Los casos de sPTB de validación totalizaron 18 sujetos recolectados entre las 190/7 a 216/7 semanas de GA en el momento de extracción de sangre (GABD), de un total disponible de 81 sujetos entre 170/7 a 286/7 semanas de GA. Los conjuntos de controles, que comprenden dos controles por caso de sPTB emparejados por GABD, se seleccionaron aleatoriamente utilizando el programa Estadístico R (R 3.0.2) (Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014. 2015; Matei A, Tillé Y. The R “sampling” package. European Conference on Quality in Survey Statistics. 2006) y en comparación con la distribución de nacimiento a término como se describe en el Informe Nacional de Estadísticas Vitales de 2012 (Martin JA, Hamilton BE, Osterman MJ, Curtin SC, Mathews TJ. Births: Final Data for 2012. National Vital Statistics Reports.2014;63(09): 1-86) utilizando la prueba Chi-Cuadrado. Se examinaron conjuntos de control creados aleatoriamente (en grupos de 10) para conjuntos que produjeran un valor p cercano a 1.0.
El objetivo principal fue validar el rendimiento de la relación IBP4/SHBG como predictor de sPTB utilizando AUROC (Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014.2015; Sing T, Sander O, Beerenwinkel N, Lengauer T. ROCR: visualizing classifier performance in R. Bioinformatics. 2005;21(20):7881). Para controlar la tasa general de errores de pruebas múltiples (α = 0.05), el enfoque de secuencia fija (Dmitrienko A, Tamhane AC, Bretz F, eds. Multiple Testing Problems in Pharmaceutical Statistics. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2009: 1-320; Dmitrienko A, D’Agostino RB, Ruque MF. Key multiplicity issues in clinical drug development. Stat Med.
2012;32(7): 1079-111. doi: 10.1002/sim.5642.) se aplicó a incrementos de GABD dentro del intervalo óptimo (190/7 a 216/7 semanas de GA) identificado en el descubrimiento y verificación con y sin la aplicación de una estratificación de IMC (véase Material Complementario). La significancia se evaluó mediante la estadística de Wilcoxon-Mann-Whitney que prueba la equivalencia con AUROC = 0.5 (oportunidad aleatoria). (Bamber D. The area above the ordinal dominance graph and the area below the receiver operating characteristic graph. Journal of mathematical psychology.
1975; 12(4):387-415. doi: 10.1016/0022-2496(75)90001-2; Mason SJ, Graham NE. Areas beneath the relative operating characteristics (ROC) and relative operating levels (ROL) curves: Statistical significance and interpretation. QJR Meteorol Soc. 2002;128(584):2145-2166. doi:l0.1256/003590002320603584.) Para las determinaciones del rendimiento de la clasificación en las delimitaciones de GA diferentes de < 370/7 frente a ≥ 370/7 semanas de GA (por ejemplo, < 360/7 frente a ≥ 360/7, < 350/7 frente a ≥ 350/7), los casos y los controles se redefinieron como todos los sujetos a continuación e igual a/por encima de la delimitación específica, respectivamente.
Métodos de laboratorio
Se empleó un enfoque de biología de sistemas para generar un ensayo de MS de monitorización de reacción múltiple (MRM) altamente multiplexada (Métodos y Resultados Complementarios). El ensayo de validación cuantificó los péptidos proteotípicos específicos de las proteínas predictoras IBP4 y SHBG y otros controles. Las muestras se procesaron en lotes de 32, que estaban compuestos por sujetos clínicos (24), estándares de suero agrupados de donantes sanas no embarazadas (HGS)(3), estándares de suero agrupados de donantes embarazadas sanas (pHGS)(3) y solución salina que sirvió como controles de proceso (2). Para todos los análisis, las muestras de suero se agotaron primero de proteínas de gran abundancia y no diagnósticas utilizando columnas de inmunoagotamiento MARS-14 (Agilent Technologies), se redujeron con ditiotreitol, se alquilaron con yodoacetamida y se digirieron con tripsina. A continuación, se agregaron péptidos estándar de isótopos estables (SIS) fuertemente marcados a las muestras, que posteriormente se desalinizaron y analizaron mediante cromatografía líquida de fase inversa (LC)/MRM-MS. Los péptidos SIS se utilizaron para la normalización al generar relaciones de respuesta (RR), en donde el área máxima de un ion de fragmento peptídico (es decir, la transición) medida en suero se dividió por aquel de la transición SIS correspondiente añadida a la misma muestra de suero.
El predictor IBP4/SHBG
La puntuación del predictor se definió como el logaritmo natural de la relación de las relaciones de respuesta de transición del péptido IBP4 y SHBG:
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donde RR son las relaciones de respuesta medidas de los péptidos respectivos
Resultados
La Figura 23 resume la distribución de los sujetos de estudio en PAPR. Entre marzo de 2011 y agosto de 2013 se inscribieron 5,501 sujetos. Según lo predefinido en el protocolo, 410 (6.7 %) sujetos se excluyeron del análisis debido a que recibieron terapia con progestágenos después del primer trimestre del embarazo. Se excluyeron 120 (2.2 %) sujetos adicionales debido a la interrupción temprana y 146 (2.7 %) se perdieron durante el seguimiento. Un total de 4,825 sujetos estaban disponibles para el análisis. Hubo 533 PTB; 248 (4.7 %) espontáneos y 285 (5.9 %) por indicación médica. En comparación con aquellas que dieron a luz a término, los sujetos con sPTB tenían más probabilidades de haber tenido uno o más PTB anteriores y de haber experimentado sangrado después de las 12 semanas de gestación en el embarazo del estudio (Tabla 1). Las características de los casos de sPTB y los controles a término seleccionados para la validación no fueron significativamente diferentes entre sí, con la excepción de que hubo significativamente más controles hispanos (47.5 % frente a 33.3 % p= 0.035). De manera similar, los sujetos seleccionados para la validación fueron en gran medida representativos de la cohorte del estudio en su conjunto (Tabla 1), con la excepción de la etnicidad de los controles a término.
Análisis de validación
En los análisis de descubrimiento y verificación, la relación de IBP4/SHBG y el intervalo entre las 190/7 a 216/7 semanas de GA se identificó como el predictor de sPTB con mejor desempeño por AUROC y el intervalo de GA, respectivamente (Resultados Complementarios, a continuación). Para la validación, un enfoque de secuencia fija predefinida validó el predictor IBP4/SHBG con y sin estratificación de IMC, con un rendimiento óptimo identificado para el intervalo de GA de 191/7 a 206/7 semanas. Sin tener en cuenta el IMC, el rendimiento validado fue AUROC = 0.67 (p = 0.02) (Resultados Complementarios). Sin embargo, como era de esperar, el rendimiento mejoró con una estratificación de IMC de > 22 y ≤ 37 kg/m2 que correspondía a un AUROC de 0.75 (p = 0.016, CI del 95 % 0.56-0.91) (Figura 24). Se puede encontrar una caracterización más detallada de la estratificación del IMC en Resultados Complementarios. Las medidas de rendimiento de sensibilidad, especificidad, AUROC y razones de probabilidades (OR) se determinaron en varias delimitaciones de casos frente a controles (Tabla 2). Para sPTB frente a parto a término (< 370/7 frente a ≥ 370/7 semanas), la sensibilidad y la especificidad fueron 0.75 y 0.74, respectivamente, con una razón de probabilidades (OR) de 5.04 (CI del 95 %: 1.4-18). Los resultados en otras delimitaciones se resumen en la Tabla 2. La precisión de la prueba mejoró en las delimitaciones inferiores de GA.
El valor predictivo positivo (PPV) ajustado por prevalencia, una medida del riesgo clínico, se muestra como una función de la puntuación del predictor en la Figura 25. La estratificación de los sujetos con una puntuación creciente del predictor se produce a medida que el PPV aumenta desde un valor de fondo (tasa de sPTB de la población de 7.3 % para partos únicos en los Estados Unidos) (Martin et al., Births: final data for 2013. Natl Vital Stat Rep.2015;64(1): 1-65 Martin JA, Hamilton BE, Osterman MJ, Curtin SC, Matthews TJ. Births: final data for 2013. Natl Vital Stat Rep.
2015;64(1): 1-65) a riesgos relativos de 2X (14.6 %) y 3X (21.9 %) (líneas discontinuas) y mayores (Figura 25). La distribución de los valores de puntuación del predictor IBP4/SHBG para sujetos codificados por colores según la categoría de GA al nacer se muestran en gráficos de caja en la Figura 25. Los primeros casos de sPTB (< 350/7 semanas de GA) tienen puntuaciones de predictor más altas que los controles a término tardíos (≥ 390/7 semanas de GA) mientras que las puntuaciones para los casos de sPTB tardíos (≥350/7 a < 370/7 semanas de GA) se superponen con los controles tempranos a término (≥ 370/7 a < 390/7 semanas de GA) (Figura 25). Los sujetos de validación se identificaron como de alto o bajo riesgo de acuerdo con un punto de corte de puntuación del predictor que corresponde a un riesgo relativo 2X (VPP de 14.6 %). La tasa de partos para los grupos de alto y bajo riesgo se mostró luego como eventos en un análisis de Kaplan Meier (Figura 26). A partir de este análisis, los clasificados como de alto riesgo generalmente dieron a luz antes que los clasificados como de bajo riesgo (p = 0.0004).
Análisis posteriores a la validación
El rendimiento del predictor se midió utilizando una combinación de sujetos de la verificación cegada (datos Complementarios, a continuación) y análisis de validación dentro del intervalo óptimo de IMC y GA. Se muestra la curva ROC para el conjunto de muestras combinado y corresponde a un AUROC de 0.72 (p = 0.013) (Figura 27). Utilizando un enfoque ómico, desarrollamos un predictor en suero materno compuesto por la relación de niveles de IBP4/SHBG a las 19-20 semanas con un intervalo de IMC de > 22 y ≤ 37 kg/m2 que identificó el 75 % de las mujeres destinadas a sPTB. Los antecedentes previos de sPTB (Goldenberg et al., Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 2008;371(9606):75-84. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60074-4, Petrini et al. Estimated effect of 17 alphahydroxyprogesterone caproate on preterm birth in the United States. Obstet Gynecol. 2005; 105(2):267-272) y las mediciones de longitud del cuello uterino (Iams et al. The ength of the cervix and the risk of spontaneous premature delivery. National Institute of Child Health and Human Development Maternal Fetal Medicine Unit Network. N Engl J Med. 1996;334(9):567-72; Hassan et al. Vaginal progesterone reduces the rate of preterm birth in women with a sonographic short cervix: a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled tri al. Ultrasound Obstet Gynecol.
2011;38(1):18-31) se consideran las mejores medidas de riesgo clínico hasta la fecha; sin embargo, ya sea individualmente o en combinación, no logran predecir la mayoría de los sPTB.
Una herramienta de predicción de sPTB ideal sería mínimamente invasiva, se realizaría temprano en la gestación que coincide con el momento de las visitas obstétricas de rutina e identificaría con precisión a las personas con mayor riesgo. Los estudios ómicos actuales sugieren que las perturbaciones en el estado fisiológico del embarazo se pueden detectar en los analitos del suero materno medidos en sujetos con sPTB. Los estudios de descubrimiento ómico en PTB han incluido enfoques proteómicos (Gravett et al. Proteomic analysis of cervical-vaginal fluid: identification of novel biomarkers for detection of intra-amniotic infection. J Proteome Res. 2007;6(1):89-96; Goldenberg et al. The preterm prediction study: the value of new vs standard risk factors in predicting early and all spontaneous preterm births. NICHD MFMU Network. Am J Public Health. l 998;88(2):233-8; Gravett et al. Diagnosis of intra-amniotic infection by proteomic profiling and identification of novel biomarkers. JAMA. 2004;292(4):462-469; Pereira et al. Insights into the multifactorial nature of preterm birth: proteomic profiling of the maternal serum glycoproteome and maternal serum peptidome among women in preterm labor. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(6):555.e1-10; 32. Pereira et al. Identification of novel protein biomarkers of preterm birth in human cervical-vaginal fluid. J Proteome Res.2007;6(4): 1269-76; Dasari et al. Comprehensive proteomic analysis of human cervical- vaginal fluid. J Proteome Res.2007;6(4): 1258-1268; Esplin et al. Proteomic identification of serum peptides predicting subsequent spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol. 2010;204(5):391.e1-8.), transcriptómicos (Weiner et al. Human effector/initiator gene sets that regulate myometrial contractility during term and preterm labor. Am J Obstet Gynecol.2010;202(5):474.e1-20; Chim et al. Systematic identification of spontaneous preterm birth-associated RNA transcripts in maternal plasma. PLoS ONE.
2012;7(4):e34328. Enquobahrie et al. Early pregnancy peripheral blood gene expression and risk of preterm delivery: a nested case control study. BMC Pregnancy Childbirth. 2009;9(1):56), genómicos (Bezold et al. The genomics of preterm birth from animal models to human studies. Genome Med. 2013;5(4):34; Romero et al. Identification of fetal and maternal single nucleotide polymorphisms in candidate genes that predispose to spontaneous preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(5):431.e1-34; Swaggart et al. Genomics of preterm birth. Cold Spring Harb Perspect Med.2015;5(2):a023127; Haataja et al. Mapping a new spontaneous preterm birth susceptibility gene, IGF IR, using linkage, haplotype sharing, and association analysis. PLoS Genet.2011;7(2):e1001293; McElroy et al. Maternal coding variants in complement receptor 1 and spontaneous idiopathic preterm birth. Hum Genet.
2013;132(8):935-42.), and metabolómicos (Menon et al. Amniotic fluid metabolomic analysis in spontaneous preterm birth. Reprod Sci.2014;21(6):791-803) Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de estos enfoques ha producido métodos de prueba validados para predecir de manera confiable el riesgo de sPTB en mujeres asintomáticas.
La enseñanza actual es el resultado de un gran estudio clínico prospectivo y contemporáneo que permitió análisis independientes de descubrimiento, verificación y validación, al tiempo que se adhirió a las pautas del IOM con respecto al desarrollo de pruebas ómicas. Involucró la construcción de un ensayo proteómico multiplexado grande y estandarizado para probar las rutas biológicas de relevancia en el embarazo. El tamaño del estudio y la ventana de recolección de sangre relativamente amplia (170/7 a 286/7 semanas de GA) también permitieron la identificación de un intervalo de GA en donde hubo alteraciones marcadas en las concentraciones de proteína entre los casos de sPTB y los controles a término. El uso de un modelo de predicción de baja complejidad (es decir, la relación de dos proteínas) limitó los obstáculos del sobreajuste.
La aplicación del ensayo proteómico y la construcción del modelo llevaron a la identificación de un par de proteínas críticas (IBP4 y SHBG) con un desempeño predictivo consistentemente bueno para sPTB. A pesar de los desafíos de construir un clasificador para una afección atribuida a múltiples etiologías, el predictor demostró un buen desempeño en un punto de corte de < 370/7 frente a ≥ 370/7 semanas de GA con un AUROC de 0.75. Es importante destacar que la precisión del predictor mejora para los sPTB más tempranos (por ejemplo, < 350/7 semanas de GA), lo que permite la detección de aquellos sPTB con el mayor potencial de morbilidad. Los sujetos determinados como de alto riesgo de sPTB utilizando el predictor IBP4/SHBG dieron a luz significativamente antes que los sujetos identificados como de bajo riesgo. Nuestros hallazgos sugieren que IBP4 y SHBG pueden realizar funciones importantes relacionadas con las etiologías de sPTB y/o actuar como puntos de convergencia en rutas biológicas relevantes.
La medición de la longitud del cuello uterino (LC) por ultrasonido transvaginal universal (TVU) no se realizó de forma rutinaria en la mayoría de nuestros centros de estudio y estuvo disponible para menos de 1/3 de los sujetos del estudio. Será de interés evaluar si las mediciones de CL mejoran el predictor proteómico en estudios futuros o, alternativamente, si la estratificación del riesgo mediante el clasificador IBP4/SHBG identifica a las mujeres que se benefician más de las mediciones de CL en serie. Finalmente, será intrigante investigar el desempeño del predictor molecular junto con una variable de IMC, o quizás en combinación con otros antecedentes médicos/de embarazo y características sociodemográficas.
En conclusión, una prueba predictiva predefinida para sPTB se basa en mediciones en suero de IBP4 y SHBG en mujeres paridas y nulíparas asintomáticas se validó en un conjunto de sujetos completamente independiente. Estudios funcionales adicionales sobre estas proteínas, su regulación génica y rutas relacionadas pueden ayudar a dilucidar los fundamentos moleculares y fisiológicos de la sPTB. La aplicación de este predictor debería permitir la detección temprana y sensible de mujeres en riesgo de sPTB. Esto puede mejorar los resultados del embarazo a través de una mayor vigilancia clínica, así como acelerar el desarrollo de intervenciones clínicas para la prevención de PTB.
Materiales y métodos complementarios
Sujetos de descubrimiento y verificación
Los sujetos de descubrimiento y verificación se derivaron del estudio PAPR descrito anteriormente en este Ejemplo. Principios de descubrimiento y verificación
Los casos de sPTB se definieron como se describió anteriormente en este Ejemplo. El descubrimiento y la verificación del predictor se realizaron de acuerdo con las pautas de las mejores prácticas en la investigación “ómica”. (IOM (Institute of Medicine). Evolution of Translation Omics: Lessons Leamed and the Path Forward. (Mícheel CM, Nass SJ, Omenn GS, eds.). Washington, DC: The National Academies Press.; 2012:1-355). Los análisis de casos y controles anidados utilizaron conjuntos de muestras completamente independientes entre sí. Los casos y controles seleccionados para descubrimiento y verificación se sometieron a revisión centralizada de discrepancias de datos dentro del sujeto; no se realizó verificación de documento fuente (SDV) con la historia clínica. Todos los casos y controles de sPTB para descubrimiento y verificación se adjudicaron individualmente por el director médico y las discrepancias se aclararon con el PI en el centro clínico. Se preestablecieron protocolos de análisis detallados, que incluyen los diseños de estudio, los planes de análisis y un protocolo de cegado de verificación. El personal de laboratorio y de análisis de datos desconocía las asignaciones de datos de caso, control y GA del sujeto de verificación. Las puntuaciones de los predictores, calculadas como se describe a continuación, se asignaron a todos los sujetos por un estadístico cegado interno. Los datos de casos, controles y GA, ligados a las puntuaciones de los predictores por el DCO, se proporcionaron a un estadístico externo independiente para análisis. Luego, los resultados de AUROC se transfirieron nuevamente al DCO. La transferencia de datos utilizó una función SUMPRODUCT (Microsoft. Microsoft Excel.2013) en Excel para garantizar el mantenimiento de la integridad de los datos. Para proporcionar una pista de auditoría de los datos desde los sujetos hasta los resultados de la verificación, se aplicó el sellado de tiempo digital a los datos analíticos, planes e informes.
Diseño de estudio de descubrimiento y verificación
Los casos de sPTB de descubrimiento y verificación totalizaron 86 y 50 sujetos, respectivamente, recolectados entre las 170/7 y 286/7 semanas de GA en el momento de extracción de sangre (GABD). Los sujetos utilizados en el descubrimiento y la verificación fueron completamente independientes entre sí e independientes de aquellos utilizados en la validación. Se identificaron controles emparejados para casos de sPTB en descubrimiento y verificación como se describió anteriormente en este Ejemplo.
Análisis de prevalencia
Después de los análisis de descubrimiento, verificación y validación, se seleccionaron controles a términos adicionales, no utilizados en estudios anteriores, de la base de datos PAPR y se procesaron en el laboratorio utilizando el ensayo MRM-MS aplicado en la validación y descrito anteriormente en este ejemplo. Utilizando el paquete de Muestreo en el software Estadístico R (versión 3.0.3) (Team RC. R: a Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria; 2014.2015; Matei A, Tillé Y. The R “sampling” package. European Conference on Quality in Survey Statistics.
2006), se seleccionaron aleatoriamente conjuntos de 187 sujetos del intervalo de GA al momento de la extracción de sangre validado y se compararon mediante análisis estadísticos univariados (Prueba de Chi-Cuadrado) contra los datos de la edad gestacional al nacer (GAB) del Informe Nacional de Estadísticas Vitales 2012 (NVSR). Martin et al.: Final Data for 2012. National Vital Statistics Reports. 2014;63(09): 1-86. Luego se seleccionaron los conjuntos de controles que más se aproximaban a la distribución de nacimientos en el NVSR de 2012 con base en el mejor valor p (que se aproximaba a 1.0 con un valor mínimo aceptable de 0.950) para comparación contra la distribución del IMC en el estudio PAPR en su conjunto. Utilizando el uso de análisis estadísticos univariados (Prueba de Chi-Cuadrado) contra los datos del IMC de la base de datos del estudio PAPR, se seleccionaron los conjuntos de controles que más se aproximan a la distribución del IMC (que se aproxima a 1.0 con un valor mínimo aceptable de 0.950) y la distribución del momento de nacimiento en los NVSR y se compararon con los GABD de las muestras de extracción de sangre validadas. El conjunto que más se aproximaba a las tres distribuciones se seleccionó como el conjunto sujeto para el Estudio de Prevalencia. Los valores de puntuación de predictor para la verificación, validación y prevalencia dentro del intervalo de GABD de validación y la restricción del IMC totalizaron 150 sujetos. Este conjunto de datos compuestos se utilizó para obtener las mejores estimaciones de los intervalos de confianza sobre la curva de PPV en la Figura 25. Los intervalos de confianza sobre el PPV se calcularon con la aproximación normal del error para proporciones binomiales. Brown et al. Interval estimation for a binomial proportion. Statistical science. 2001; 16(2): 101-133.
Métodos de laboratorio
Se empleó un enfoque de biología de sistemas para generar un ensayo de espectrometría de masas (MS) de monitorización de reacciones múltiples (MRM) altamente multiplexado mediante la aplicación iterativa de: selección de literatura, descubrimiento proteómico dirigido y no dirigido y análisis MRM-MS a pequeña escala de muestras de sujetos. El ensayo MRM-MS maduro, que mide 147 proteínas, se aplicó en estudios de descubrimiento y verificación.
Para todos los análisis, las muestras de suero se procesaron en el laboratorio como se describió anteriormente en este Ejemplo. Se utilizaron alícuotas de controles de suero agrupados (pHGS) para calcular el coeficiente de variación analítico (CV) entre lotes para IBP4 y SHBG.
Estrategia de desarrollo de predictor general
Se desarrolló una estrategia para evitar el sobreajuste y superar la dilución del rendimiento de los biomarcadores que se espera a través de amplios rangos de edad gestacional debido a la naturaleza dinámica de la expresión de proteínas durante el embarazo. En el desarrollo de predictores se emplearon relaciones de intensidades de analito reguladas al alza sobre las reguladas a la baja. Dichas “reversiones” son similares a las estrategias del clasificador del par de puntuación más alta y de 2 genes. (Geman et al. Classifying gene expression profiles from pair wise mRNA comparisons. Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3(1):Article19; Price et al. Highly accurate two-gene classifier for differentiating gastrointestinal stromal tumors and leiomyosarcomas. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(9) 3414-9). Este enfoque permitió la amplificación de la señal de diagnóstico y la autonomalización como ambas proteínas en una “reversión” sometida a las mismas etapas de procesamiento analítico y preanalítico. Como una estrategia para normalizar las medidas de intensidad de péptidos en flujos de trabajo proteómicos complejos, las reversiones también son similares a un enfoque introducido recientemente denominado “normalización de proteínas endógenas (EPN)”. (Li et al. An integrated quantification method to increase the precision, robustness, and resolution of protein measurement in human plasma samples. Clin Proteomics.2015;12(1):3; Li et al. A blood-based proteomic classifier for the molecular characterization of pulmonary nodules. Sci Transl Med. 2013;5(207):207ra142) El número de analitos candidatos utilizados para la construcción de modelos se redujo por los criterios analíticos. Los filtros analíticos incluyeron: puntos de corte para precisión analítica, intensidad, evidencia de interferencia, dependencia del orden de procesamiento de muestras y estabilidad preanalítica. El número total de analitos en cualquier predictor se limitó a una sola reversión, evitando de esta manera modelos matemáticos complejos. Las puntuaciones de los predictores se definieron como el logaritmo natural de un único valor de reversión, en donde la propia reversión era una relación de respuesta (definida anteriormente en este Ejemplo). Por último, se investigó el rendimiento predictivo en estrechos intervalos de gestación superpuestos de 3 semanas.
Curvas características operativas del receptor
Los valores AUROC y los valores p asociados se calcularon para las reversiones como se describió anteriormente en este Ejemplo. La distribución y el valor medio del predictor AUROC en el conjunto combinado de descubrimiento y verificación se calcularon utilizando un muestreo de análisis de remuestreo realizado iterativamente al seleccionar conjuntos aleatorios de muestras con reemplazo. Efron B, Tibshirani RJ. An Introduction to the Bootstrap. Boca Raton, Florida: Chapman and Hall/CRC Press; 1994 El número total de muestras seleccionadas en cada iteración correspondió al total disponible en el grupo inicial.
Resultados complementarios
Las características de los sujetos de descubrimiento, verificación y validación se resumen en la Tabla 3. El porcentaje de sujetos con uno o más sPTB previos en los casos de descubrimiento de sPTB fue más alto que en la verificación o validación, y otras características fueron en gran medida consistentes en todos los estudios.
Análisis de descubrimiento y verificación
Cuarenta y cuatro proteínas se regularon al alza o a la baja en intervalos de GA de 3 semanas superpuestos y pasaron los filtros analíticos (Figura 28). Las reversiones se formaron a partir de la relación de proteínas reguladas al alza y a la baja y el rendimiento predictivo probado en muestras en cada uno de los intervalos de GA de 3 semanas superpuestos. El rendimiento para un subconjunto de reversiones que visualizan patrones representativos se muestra en la Figura 29. Las olas de rendimiento fueron evidentes: las reversiones IBP4/SHBG y APOWSHBG poseían mejores valores de AUROC en las primeras ventanas, mientras que ITIH4BGH3 y PSG2BGH3 alcanzaron su punto máximo más tarde en la gestación (Figura 24). Algunas reversiones tuvieron un desempeño consistente pero moderado a través de todo el rango de edad gestacional (PSG2/PRG2) (Figura 29). La reversión de mayor rendimiento en general, IBP4/SHBG, tuvo un AUROC=0.74 en el intervalo de 190/7 a 21 6/7 (Figura 29). El rendimiento de AUROC del predictor IBP4/SHBG aumentó a 0.79 cuando los sujetos se estratificaron por IMC antes del embarazo < 35 (kg/m2) (Tabla 4). Debido a su desempeño consistentemente fuerte al principio de la gestación (es decir, 170/7 a 226/7 semanas de GA) (Figura 29) y a la utilidad clínica potencialmente deseable, se seleccionó el predictor IBP4/SHBG para el análisis de verificación.
El rendimiento cegado de AUROC de IBP4/SHBG en las muestras de verificación fue de 0.77 y 0.79 para todos los sujetos y sujetos estratificados con IMC, respectivamente, en buena concordancia con el rendimiento obtenido en el descubrimiento (Tabla 5). Después de la verificación cegada, las muestras de descubrimiento y verificación se combinaron para una determinación de rendimiento de análisis de remuestreo. Se obtuvo un AUROC medio de 0.76 a partir de 2,000 iteraciones de análisis de remuestreo Figura 30).
Análisis de validación de IMC
El desempeño del predictor IBP4/SHBG se evaluó en varios puntos de corte de IMC en las muestras de validación (Tabla 5). El rendimiento medido por AUROC mejoró modestamente al eliminar el IMC muy alto (por ejemplo, > 37 kg/m2) o bajo (por ejemplo, ≤22 kg/m2). La estratificación por una combinación de esos dos puntos de corte dio un AUROC de 0.75 (Tabla 5).
Ejemplo 3. Correlación de espectrometría de masas y datos de inmunoensayo
Este ejemplo demuestra los resultados de un cribado de Myriad RBM que identifica IBP4 y otros biomarcadores individuales para sPTB en las ventanas de recolección de edad gestacional temprana, media y tardía, (2) correlación de MS y resultados de inmunoensayo para SHBG/IBP4, y (3) datos clínicos que se relacionan con SHBG como biomarcador para sPTB.
Datos RBM
Brevemente, RBM ensayó 40 casos y 40 controles de PAPR (20/20 de Ventana Temprana), 10/10 de Ventana Intermedia, 10/10 de Ventana Tardía). RBM utilizó el Human Discovery MAP 250+ v2.0 (Myriad RBM, Austin, TX). El objetivo de estos análisis es desarrollar modelos multivariados para predecir PTB utilizando múltiples analitos. Utilizamos cuatro métodos de modelado: bosque aleatorio (rf), aumento, Lasso y logístico (logit). Realizamos una primera ronda de selección de variables en la que cada método selecciona de forma independiente las 15 mejores variables para ese método. De los 15, los mejores analitos se seleccionaron de forma independiente mediante cada uno de los cuatro métodos de modelado utilizando selección por etapas hacia atrás y estimación del área bajo la curva ROC (AUC) utilizando muestras de análisis de remuestreo fuera de la bolsa. La Tabla 6 muestra los principales resultados de varios modelos multivariables. La Tabla 7 muestra la Clasificación de Analitos de la Ventana Temprana (GABD de 17-22 semanas) por Diferentes Modelos Multivariados. La Tabla 8 muestra la Clasificación de Analitos de la Ventana Intermedia (GABD de 23-25 semanas) por Diferentes Modelos Multivariados. La Tabla 9 muestra la Clasificación de Analitos de Ventana Tardía (GABD de 26-28 semanas) por Diferentes Modelos Multivariados. Identificar kits ELISA comerciales que se correlacionan con datos de espectrometría de masas
Brevemente, las comparaciones de ELISA vs. MS incluyeron múltiples estudios que utilizaron muestras de PAPR y variaron en tamaño de 30-40 sujetos. Cada ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, se comparó la concentración predicha de cada analito por ELISA con las relaciones relativas derivadas de MS de muestras idénticas. Luego se generó el valor de correlación r de Pearson para comparar. Las comparaciones de ELISA vs. MS incluyeron múltiples estudios que utilizaron muestras de PAPR y variaron en tamaño entre 30-40 sujetos. Cada ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, se comparó la concentración predicha de cada analito por ELISA con las relaciones relativas derivadas de MS de muestras idénticas. Luego se generó el valor de correlación r de Pearson para comparación. La Tabla 10 proporciona información sobre el epítopo y clonalidad de los kits probados para los analitos IBP4_HUMAN y SHBG_HUMAN. La Tabla 11 muestra que no todos los kits ELISA se correlacionan con la MS, incluso para las proteínas en las que existe correlación. Véase, por ejemplo: IBP4, CHL1, ANGT, PAPP1
Se seleccionaron ciento veinte muestras de suero previamente congeladas con resultados conocidos del estudio PAPR para comparación entre los ensayos ELISA y MS. Estas muestras tienen una Edad Gestacional en el Momento de Extracción de Sangre (GABD) entre 119 y 180 días. Las muestras no se excluyeron debido al IMC materno. Los ELISA se realizaron en kits comercialmente disponibles para IBP4 (AL-126, ANSCH Labs Webster, Texas) y SHBG (DSHBG0B, R&D Systems Minneapolis, Minnesota). Los ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Se utilizaron estándares internos para la normalización de placa a placa. La puntuación se calculó a partir de los valores de concentración de ELISA de acuerdo con LN([IBP4]/[SHBG]), y por MS de acuerdo con LN(IBP4RR/SHBGRR), en donde RR se refiere a la relación relativa de péptido endógeno a las áreas máximas del péptido SIS. Las puntuaciones derivadas de los dos enfoques se compararon en la separación de casos frente a controles (valores p derivados de pruebas t no pareadas que suponían desviaciones estándar iguales) (Figura 31). Se seleccionaron cincuenta y siete muestras de suero previamente congeladas (19 casos de sPTB, 38 controles a término) con resultados conocidos del estudio PAPR para comparación entre los ensayos ELISA y MS. Estas muestras tienen una Edad Gestacional en el Momento de Extracción de Sangre (GABD) entre 133 y 148 días. Los ELISA se realizaron en kits comercialmente disponibles para IBP4 (AL-126, ANSCH Labs Webster, Texas) y SHBG (DSHBG0B, R&D Systems Minneapolis, Minnesota). Los ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Las muestras ejecutadas sobre diferentes placas se normalizaron utilizando estándares internos. La puntuación se calculó a partir de los valores de concentración de ELISA de acuerdo con LN([IBP4]/[SHBG]), y por MS de acuerdo con LN(IBP4RR/SHBGRR), en donde RR se refiere a la relación relativa de péptido endógeno a las áreas máximas del péptido SIS. A continuación, se determinó el rendimiento del inmunoensayo por área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) y se comparó con el AUC derivado de MS en los mismos conjuntos de muestras (Figura 32). Los valores de AUC también se determinaron después de aplicar una estratificación de IMC a las muestras (IMC > 22 ≤ 37) lo que resultó en 34 muestras totales (13 casos de sPTB, 21 controles a término) (Figura 33).
Sesenta muestras de suero previamente congeladas con resultados conocidos del estudio PAPR se analizaron mediante ensayos ELISA y MS. Estas muestras tienen una Edad Gestacional predicha en el Momento de la Extracción de Sangre (GABD) entre 133 y 146 días. Se realizaron análisis de correlación para muestras con en todos los IMC (Figura 34, panel derecho) o para el subconjunto de muestras con un IMC > 22 o ≤ 37 (Figura 34, panel izquierdo). Los ELISA se realizaron en kits comercialmente disponibles para IBP4 (AL-126, ANSCH Labs Webster, Texas) y SHBG (DSHBGOB, R&D Systems Minneapolis, Minnesota). Los ensayos se realizaron de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. Se utilizaron estándares internos para la normalización placa a placa. La puntuación se calculó a partir de los valores de concentración de ELISA de acuerdo con LN([IBP4]/[SHBG]), y por MS de acuerdo con LN(IBP4RR/SHBGRR), en donde RR se refiere a la relación relativa de péptido endógeno a las áreas máximas del péptido SIS. Las puntuaciones derivadas de los dos enfoques se compararon mediante correlación y separación de casos frente a controles (valores p derivados de pruebas t no pareadas que suponían desviaciones estándar iguales). La Tabla 12 muestra los kits ELISA de IBP4 y SHBG que Demuestran la Separación de sPTB frente al Control (univariado).
Comparación de mediciones de SHBG por espectrometría de masas y analizadores clínicos
Treinta y cinco muestras de sujetos individuales y grupos de suero de mujeres embarazadas y no embarazadas se analizaron simultáneamente en Sera Prognostics y dos laboratorios de referencia independientes, ARUP Laboratories e Intermountain Laboratory Services. Se transportaron alícuotas refrigeradas a cada laboratorio y se coordinó el envío para que las pruebas comenzaran en la misma fecha para los tres laboratorios. ARUP utiliza un analizador Roche cobas e602 e Intermountain utiliza Abbott Architect CMIA, ambos instrumentos de inmunoensayo semiautomatizados. Sera Prognostics emplea un método de análisis proteómico exclusivo que implica el inmunoagotamiento de las muestras, la digestión enzimática y el análisis en un espectrómetro de masas Agilent 6490. Los resultados tanto de ARUP como de IHC se informaron en nmol/l, mientras que Sera utiliza la Relación Relativa (RR) de sustitutos de péptidos pesados y ligeros. Los datos de ARUP e Intermountain se compararon entre sí para determinar la precisión (Figura 39). La linealidad y precisión coincidieron bien en todo el amplio rango de resultados con una pendiente de linealidad de 1.032 y un valor de r2 de 0.990. Luego, los datos de cada laboratorio de referencia se compararon con el RR de Sera y un gráfico de regresión lineal (Figuras 37 y 38). Los datos se compararon bien con los resultados de Sera con ARUP con un valor r2 de 0.937 e Intermountain que tiene un valor r2 de 0.934.
Ejemplo 4. SNP, inserciones y supresiones y variantes estructurales dentro de los péptidos PreTRM IBP4 y SHBG Este ejemplo muestra los SNP, inserciones y supresiones (indels) conocidos y variantes estructurales dentro de los péptidos PreTRM IBP4 y SHBG.
La Tabla 13 y la Tabla 14 detallan los SNP, inserciones y supresiones (indels) conocidos y las variantes estructurales dentro de los péptidos PreTRM IBP4 y SHBG. La información se deriva de la Construcción 146 de base de datos de Polimorfismo de Nucleótido Único (dbSNP). Una única variación no sinónima (G > C) en SHBG, A179P (dbSNP id: rs115336700) tiene la frecuencia alélica general más alta de 0.0048. Si bien esta frecuencia alélica es baja, varias subpoblaciones estudiadas en el proyecto 1000 genomas tenían frecuencias significativamente más altas. Estas poblaciones (frecuencias de alelos) son; estadounidenses de ascendencia africana en el suroeste de Estados Unidos (0.0492); caribeños africanos en Barbados (0.0313); Yourba en Ibadán, Nigeria (0.0278); Luhya en Webuye, Kenia (0.0101); Esan en Nigeria (0.0101); colombianos de Medellín, Colombia (0.0053); Gambia en Divisiones Occidentales en Gambia (0.0044). Todas las demás subpoblaciones estudiadas no tuvieron variación en esta posición de nucleótidos. El encabezado de la tabla incluye la identificación del grupo: (número rs de dbSNP), Heterocigosidad: heterocigosidad promedio, Validación: método de validación (o en blanco sin validación), MAF: Frecuencia de alelo menor, Función: característica funcional del polimorfismo, alelo dbSNP: identidad de nucleótido alélico, residuo de proteína: residuo que resulta del alelo, codón pos: posición en el codón, NP_001031.2 aminoácido pos: posición del aminoácido en la secuencia de referencia NP_001031.2 y NM_001040.2 ARNm pos: posición del nucleótido en una secuencia de referencia NM_001040.2.
Ejemplo 5. La reversión de IBP4/SHBG amplifica la señal de diagnóstico para sPTB y reduce la variabilidad analítica Este ejemplo demuestra la amplificación de la señal de diagnóstico y la reducción de la variabilidad obtenida empleando la estrategia de reversión IBP4/SHBG.
Se muestran los niveles de IBP4 y SHBG determinados por MS a través del rango de edad de gestación indicado para casos de sPTB y controles a término por separado (Figura 44 y Figura 45). Las curvas se generaron mediante un suavizado medio de las relaciones relativas de los péptidos (área máxima del péptido endógeno sobre el área máxima del SIS correspondiente). La señal de caso frente al control corresponde a una diferencia máxima aproximada del 10 % para IBP4 y SHBG. Cuando se grafica la puntuación calculada como ln(IBP4RR/SHBGRR), es evidente una amplificación de la señal (diferencia máxima de aproximadamente el 20 %) (Figura 46). Estos datos demuestran la amplificación de la señal de diagnóstico obtenida empleando la estrategia de reversión IBP4/SHBG.
Formar la relación de los niveles de dos proteínas puede reducir la variabilidad porque cada proteína experimenta las mismas etapas de procesamiento analítico y preanalítico. Para examinar el impacto en la variabilidad, se determinaron los CV para las proteínas individuales (RR de IBP4 y SHBG) y para la relación IBP4 RR /SHBG RR en muestras de suero de control agrupadas de donantes embarazadas (pHGS). Las muestras de control agrupadas, libres de variabilidad biológica, se analizaron en múltiples lotes y a lo largo de varios días. La variabilidad de reversión es menor que la variabilidad asociada con las proteínas individuales. (Figura 48)
Para investigar si la formación de reversiones en general amplifica la señal de diagnóstico, examinamos el rendimiento de ROC (AUC) de reversiones de alto rendimiento (AUC > 0.6) formadas por la relación de muchas proteínas. En el panel superior de la Figura 47 se muestra el rango de valores de AUC (caso de sPTB frente a control a término) utilizando conjuntos de datos de muestras recolectadas entre las 19/0 semanas y 21/6 semanas de gestación. Los gráficos de caja adyacentes muestran el rango en el rendimiento de ROC para las proteínas individuales reguladas al alza y a la baja utilizadas para formar las reversiones asociadas. De forma similar, los valores p derivados de una prueba de Wilcoxon (caso de sPTB frente a controles a término) para las reversiones son más significativos que los de las proteínas individuales correspondientes (Figura 47, en la parte inferior).
Para investigar si la formación de reversiones reduce la variabilidad de manera más general, examinamos la variabilidad analítica para 72 valores de reversión diferentes (es decir, la relación de áreas máximas relativas frente a la variabilidad analítica de las proteínas individuales que comprenden las reversiones en muestras de suero de control agrupadas de donantes embarazadas (pHGS). Las muestras de control agrupadas, libres de variabilidad biológica, se analizaron en lotes múltiples y durante varios días. La variabilidad de reversión es menor que la variabilidad asociada con las proteínas individuales (Figura 49).
Generalización de la estrategia de reversión para reducir la variabilidad analítica.
La Figura 48 informa los CV calculados para especímenes de pHGS (muestras de embarazadas agrupadas) analizadas en el laboratorio en varios lotes, días e instrumentos. Debido a que los CV se calcularon utilizando especímenes de pHGS que carecen de variabilidad biológica, corresponden a la medida de variabilidad analítica introducida en el procesamiento de muestras en el laboratorio. La variabilidad analítica de asociada con el valor proporcional para 72 reversiones es menor que la variabilidad analítica de las áreas máximas relativas de proteínas individuales reguladas al alza y reguladas a la baja utilizadas para formar las reversiones Figura 49.
Ejemplo 6. Análisis de PTB médicamente indicado
Este ejemplo confirma que el clasificador es sensible a un componente de PTB médicamente indicado basado en afecciones tales como la preeclampsia o la diabetes gestacional.
PreTRM™ se desarrolló y validó como predictor de PTB espontáneo. Alrededor del 75 % de todos los PTB en los Estados Unidos son espontáneos, el resto está médicamente indicado debido a alguna complicación materna o fetal (por ejemplo, preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino, infección). Se analizaron en el laboratorio 41 muestras de PTB médicamente indicadas del biobanco PAPR y se calcularon las puntuaciones PreTRM. Se compararon las puntuaciones de PreTRM™ para aquellos sujetos anotados como médicamente indicados para la preeclampsia vs. otras indicaciones. Los sujetos médicamente indicados para un parto prematuro debido a la preeclampsia tuvieron puntuaciones significativamente más altas que los demás (Figura 50).
La Figura 52 muestra un mapa de calor de intensidad de reversión con anotación de diabetes. Las flechas rojas muestran sujetos con diabetes. Las muestras se enumeran en la parte inferior con los casos de PTB a la derecha y los partos a término en el lado izquierdo de la pantalla. Los pacientes con diabetes están agrupados a la derecha, lo que muestra que se pueden identificar reversiones que estratifican la diabetes gestacional y, por lo tanto, es posible construir una prueba de diagnóstico a partir de los biomarcadores para predecir la diabetes gestacional.
Ejemplo 7. Otras transiciones y péptidos
La Tabla 16 muestra datos comparativos del péptido IBP4 y MS de transición. Cuatro péptidos marcados pesados diferentes (R* 10 daltons) ejemplifican varias transiciones y sus intensidades relativas que se podrían monitorizar para cuantificar IBP4. Aquellos expertos en la técnica podrían seleccionar potencialmente cualquiera de estos péptidos o transiciones u otros no ejemplificados para cuantificar IBP4.
La Tabla 17 muestra datos comparativos del péptido IBP4 y MS de transición. Los péptidos trípticos de IBP4 derivados de la proteína recombinante se analizaron mediante MRM-MS para identificar el péptido sustituto candidato y sus transiciones. Aquellos expertos en la técnica podrían seleccionar potencialmente cualquiera de estos péptidos o transiciones u otros no ejemplificados para cuantificar IBP4. IBP4 se identificó en RBM (arriba), luego se ordenó el péptido sintético para construir el ensayo.
La Tabla 18 muestra los datos comparativos del péptido SHBG y MS de transición. Los péptidos trípticos de SHBG derivados de proteína recombinante o suero de embarazada agrupado se analizaron mediante MRM-MS para identificar el péptido sustituto candidato y sus transiciones. Aquellos expertos en la técnica podrían seleccionar potencialmente cualquiera de estos péptidos o transiciones u otros no ejemplificados para cuantificar SHBG. También se muestran péptidos específicos de isoforma identificados en suero.
La Tabla 19 muestra proteínas con niveles en suero alterados a lo largo de 17 a 25 semanas de GA en muestras de PTB. * Proteínas adicionales limitadas a las 19-21 semanas de GA en PTB. El ensayo de LC-MS (MRM) de 148 proteínas de múltiples rutas y muestras de suero analizadas de la edad gestacional (GA) semanas 17-25 de 312 mujeres (104 casos de sPTB, 208 controles a término). Los datos del área máxima de MRM se analizaron mediante agrupamiento jerárquica, pruebas t y relación con GA. Después del filtrado analítico, 25 proteínas exhibieron diferencias significativas (p< 0.05) en sujetos sPTB frente a término (Tabla 1). Los niveles de 14 proteínas fueron más altos y 3 fueron más bajos en las muestras de sPTB en todo el rango de GA. Se encontró que otras proteínas estaban reguladas dinámicamente en subintervalos del período de GA. Por ejemplo, en las semanas 19-21 de GA, se elevaron 7 proteínas adicionales y 1 fue menor en sPTB.
La Tabla 20 enumera 44 proteínas que cumplen con los filtros analíticos que se regularon al alza o a la baja en sPTB vs. los controles a término.
Ejemplo 8. Perspectivas mecanicistas de biomarcadores proteómicos en suero que predicen el parto prematuro espontáneo
Este ejemplo demuestra que, dado que la expresión de proteínas específicas cambia dinámicamente a lo largo del embarazo, el rendimiento de los biomarcadores varía considerablemente a través de GA. Las proteínas expresadas diferencialmente tienen funciones en el metabolismo de los esteroides, el desarrollo de la placenta, la inmunotolerancia, la angiogénesis y el mantenimiento del embarazo. Figuras 55, 57-59. Estas diferencias en el perfil de proteínas observadas en sPTB reflejan transiciones de desarrollo deterioradas dentro del compartimiento fetal/placentario durante el segundo trimestre.
Brevemente, el objetivo del estudio descrito en este ejemplo fue obtener una perspectiva en la base fisiológica de la asociación de biomarcadores con la predicción del parto prematuro espontáneo (sPTB).
Diseño del estudio
Se han implicado rutas como la inflamación, la infección y el sangrado en la etiología del parto prematuro. Sin embargo, se sabe menos acerca de qué proteínas se pueden medir en la sangre y cuándo se alteran durante la gestación. Para responder a estas preguntas, creamos un ensayo LC-MS (MRM) de 148 proteínas de múltiples rutas y analizamos muestras de suero de la edad gestacional (GA) semanas 17-25 de 312 mujeres (104 casos de sPTB, 208 controles a término).
Brevemente, las muestras de suero se agotaron de proteínas de gran abundancia, se digirieron con tripsina y se fortificaron con péptidos estándar de isótopos estables (SIS) fuertemente marcados para casi todas las proteínas. Los péptidos SIS se utilizaron para la normalización al generar relaciones de respuesta, en donde el área máxima de un ion de fragmento de péptido (es decir, la transición) medido en suero se dividió por aquel de la transición SIS correspondiente. Las relaciones de respuesta de los datos del área máxima de MRM se analizaron mediante agrupamiento jerárquico, pruebas t y relación con GA.
Como se muestra en la Figura 53, varios péptidos de la misma proteína están bien correlacionados. Las ramas discretas (agrupadas por color) corresponden a categorías funcionales identificables tales como: proteínas de fase aguda, apolipoproteínas y proteínas conocidas específicas del embarazo. Son evidentes los complejos de proteínas importantes en biología reproductiva tales como: PAPP1:PRG2, INHBE:INHBC e IGF2:IBP3:ALS. Estas evaluaciones de calidad y relaciones destacadas validan el ensayo MRM-MS altamente multiplexado descrito en esta solicitud para su uso en la investigación de la biología del embarazo y el descubrimiento de analitos predictivos de sPTB.
La Figura 54 muestra proteínas expresadas diferencialmente que funcionan en las interacciones de la matriz extracelular. TENX activa el TGF-b latente y se localiza en el estroma fetal y materno en los puntos de transición de la diferenciación del citotrofoblasto. Alcaraz, L., et al.2014 J. Cell Biol.205(3) 409-428; Damsky, C., et al.1992 J. Clin. Invest.89(1) 210-222. Los niveles reducidos de TENX en suero en sPTB indican defectos en los vasos sanguíneos o actividad reducida de TGF-b en la placenta. NCAM1(CD56) se expresa en gran medida sobre células neurales y células destructoras naturales. NCAM1 también se expresa en trofoblastos endovasculares, pero está reducido o ausente en placentas PE. Red-Horse, K., et al. 2004 J. Clin. Invest. 114:744-754. Los niveles de NCAM1 en suero invertidos en casos de sPTB pueden reflejar una remodelación pobre de la arteria espiral y/o una inmunorregulación defectuosa. CHL1 es homólogo a NCAM1 y dirige la migración celular mediada por integrinas. BGH3 (TGFBI), una molécula de adhesión celular expresada en células endoteliales vasculares, e inhibe la angiogénesis a través de interacciones específicas con la integrina αv/β3. Son, H-N, et al.2013 Biochimica et Biophysica Acta 1833(10) 2378-2388. El TGFBI elevado en casos de sPTB puede indicar angiogénesis placentaria reducida.
La Figura 55 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la ruta de IGF-2 que muestran una separación máxima a las 18 semanas. IGF2 estimula la proliferación, diferenciación e invasión endometrial por trofoblastos extravellosos en el embarazo temprano. La IBP4 se une y modula la biodisponibilidad de IGF2 en la interfaz materno-fetal. La IBP4 elevada y la IGF2 reducida durante el 1er trimestre se correlacionan con IUGR y SGA, respectivamente. Qiu, Q., et al.2012 J. Clin. Endocrino.1 Metab.97(8):E1429-39; Demetriou, C., et al.
2014 PLOS 9(1): e85454. PAPP1 es una proteasa específica de la placenta que escinde IBP4 y libera IGF2 activa. Los niveles en suero bajos de PAPP1 al principio del embarazo se asocian con IUGR, PE y PTB. Huynh, L., et al.2014 Canadian Family Physician 60(10) 899-903. PRG2 (proMBP) se expresa en la placenta y se une covalentemente e inactiva PAPP1. El complejo inactivo PRG2:PAPP1 circula en el suero materno. Huynh, L., et al.2014 Canadian Family Physician 60(10) 899-903. La regulación de la ruta perturbada es consistente con la actividad de IGF2 comprometida en los casos de sPTB que pueden provocar una placentación anormal. La Figura 56A muestra un esquema de la regulación dinámica y la biodisponibilidad de las proteínas anteriormente mencionadas durante el sPTB.
La Figura 56 B muestra un esquema de señales intracelulares preferencialmente activadas por la unión de insulina a IR-B y por la unión de insulina e IGF a IR-A o IGF IR. Belfiore and Malaguarnera, endocrine-Related Cancer (2011) 18 R125-R147. La activación de IR-A e IGF1R por insulina e IGF conduce al predominio de señales de crecimiento y proliferación a través de la fosforilación de las proteínas IRS1/2 y Shc. La activación de Shc conduce al reclutamiento del complejo Grb2/Sos con la activación posterior de Ras/Raf/MEK1 y Erkl/2. Esta última quinasa se transloca al núcleo e induce la transcripción de varios genes implicados en la proliferación y supervivencia celular. La fosforilación de IRS1/2 induce la activación de la ruta PI3K/PDK1/AKT. Además de su función en los efectos metabólicos, AKT conduce a la activación de efectores implicados en el control de la apoptosis y la supervivencia (BAD, Mdm2, FKHR, NFkB y JNK) y la síntesis de proteínas y el crecimiento celular (mTOR).
La Figura 57 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en el equilibrio hormonal metabólico. La globulina fijadora de hormonas sexuales (SHBG), una proteína placentaria, aumenta durante el embarazo y determina la biodisponibilidad y el metabolismo de las hormonas esteroides sexuales. Los niveles reducidos de SHBG dan como resultado niveles más altos de andrógenos libres y estrógenos. Los andrógenos libres se pueden convertir en estrógenos por la actividad de la aromatasa placentaria. La actividad opuesta a la progesterona de los estrógenos acelera la gestación/trabajo de parto. La globulina fijadora de tiroxina (THBG) es inducida por el estrógeno y aumenta ~2.5 veces a mediados del embarazo. Los niveles de THBG en suero elevados en los casos de sPTB pueden dar como resultado una reducción de la hormona tiroidea libre. El hipotiroidismo en el embarazo se asocia con un mayor riesgo de aborto espontáneo y parto prematuro. Stagnaro-Green A. and Pearce E. 2012 Nat. Rev. Endocrinol.8(11):650-8. El angiotensinógeno aumenta ~3 veces por el estrógeno a mediados del embarazo para estimular el aumento del ~40 % en el volumen plasmático. La regulación al alza de la ANGT podría provocar hipertensión gestacional, una afección asociada con un mayor riesgo de sPTB.
La Figura 58 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la angiogénesis. TIE1, un correceptor inhibitorio del receptor de angiopoyetina TIE2, bloquea la capacidad de Ang-2 para estimular la angiogénesis. Seegar, T., et al.2010 Mol. Cell.37(5): 643-655. El factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), un factor antiangiogénico expresado en la placenta, estimula la escisión y la inactivación de VEGFR-1 por la gammasecretasa. La catepsina D 10 (CATD) escinde la prolactina para generar vasoinhibinas que inhiben la angiogénesis. La CATD en suero elevada y las vasoinhibinas se asocian con preeclampsia. Nakajima, R., et al.2015 Hypertension Research 38, 899-901. La alfa-2-glicoproteína rica en leucina (LRG1/A2GL) promueve la señalización de TGF-β a través de la unión del correceptor, endoglina. TGF-β activa la mitogénesis y la angiogénesis de las células endoteliales mediante la ruta de señalización Smad1/5/8. Wang, X, et al. 2013 Nature 499(7458). PSG3 induce citoquinas antiinflamatorias de monocitos y macrófagos, y estimula la angiogénesis a través de la unión de TGF-β. Los niveles bajos de PSG se asocian con IUGR. T., and Dveksler, G.2014 Int. J. Dev. Biol.58: 273-280. ENPP2 (autotaxina), una ectoenzima con actividad lisofosfolipasa D, produce ácido lisofosfatídico (LPA). El LPA actúa sobre los receptores placentarios para estimular la angiogénesis y quimiotaxis de las células NK y los monocitos. Los niveles de Autotaxin se reducen en casos de PIH y PE de inicio temprano. Chen, S-U., et al.2010 Endocrinology 151 (1):369-379.
La Figura 59 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la inmunidad innata. LBP presenta el LPS bacteriano al receptor tipo Toll-4 a través de su correceptor CD14 para inducir la respuesta inflamatoria de la ruta de inmunidad innata. La Fetuin-A (alfa-2-HS-glicoproteína) es una proteína transportadora de ácidos grasos en la sangre y el complejo FetA-FA se puede unir y activar el receptor TLR4. Pal, D., et al.2012 Nature Med.18(8): 1279-85.
La Figura 60 muestra gráficos cinéticos de proteínas expresadas diferencialmente con funciones en la coagulación. La Figura 61 muestra gráficos cinéticos de proteínas secretadas en suero expresadas diferencialmente.
La Figura 62 muestra gráficos cinéticos de PSG/IBP expresados diferencialmente.
La Figura 63 muestra gráficos cinéticos de proteínas de superficie de ECM/células expresadas diferencialmente. La Figura 64 muestra gráficos cinéticos de proteínas 1 del complemento/fase aguda expresadas diferencialmente.
La Figura 65 muestra gráficos cinéticos de proteínas-2 del complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 66 muestra gráficos cinéticos de proteínas-3 del complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. La Figura 67 muestra gráficos cinéticos de proteínas-4 del complemento/fase aguda expresadas diferencialmente. Ejemplo 9. Análisis cinético de SDT4/SV4
Este ejemplo proporciona un análisis cinético para todos los analitos ejemplificados inicialmente en el Ejemplo 1, supra, con datos desde 17 semanas 0 días, hasta 28 semanas, 6 días.
Para las Figuras 68 a 85, las relaciones relativas promedio para cada transición de péptidos se grafican utilizando el paquete R ggplot2 contra GABD utilizando una función de suavizado promedio media (ventana = /- 10 días). Las gráficas presentan gráficos separados para casos y controles utilizando dos puntos de corte de edad gestacional diferentes al momento del parto (< 370/7 frente a >= 370/7 semanas y < 350/7 frente a >= 350/7 semanas). Los títulos de los gráficos muestran un nombre corto de proteína, un guion bajo y la secuencia de péptidos. Las secuencias de analitos pueden haber sido recortadas para que los títulos se ajusten en los gráficos.
Los análisis cinéticos ejemplificados en el presente documento sirven para varios propósitos. Estos análisis demuestran si los niveles de analito están cambiando durante el embarazo y en qué dirección, si cambian de manera diferente para casos y controles, e ilustran las diferencias de diagnóstico como una función de la edad gestacional. En algunos casos, la señal diagnóstica se ubica en un estrecho rango de edad gestacional y aumenta o disminuye a lo largo del tiempo. La forma de los gráficos cinéticos también proporciona una guía visual para la selección de proteínas que se emparejan bien en las reversiones.
Se descubrió que los analitos mostraban una separación significativa entre casos frente a controles en una ventana temprana, por ejemplo, recolección de muestras entre 18 y 20 semanas de edad gestacional, incluyen, por ejemplo, AFAM, B2M, CATD, CAH1, ClQB, C1S, F13A, GELS, FETUA, HEMO, LBP, PEDF, PEPD, PLMN, PRG2, SHBG, TENX, THRB y VCAM1. Se descubrió que los analitos mostraban una separación significativa de casos frente a controles en una ventana tardía, por ejemplo, recolección de muestras entre 26 y 28 semanas de edad gestacional, incluyen, por ejemplo, ITIH4, HEP2, IBP3, IGF2, KNG1, PSG11, PZP, VASN y VTDB. La separación de casos vs. controles mejoró utilizando un punto de corte de menos de 350/7 frente a mayor o igual a 350/7 semanas frente a menos de 370/7 frente a mayor o igual a 370/7 semanas, como se vio para analitos que incluyen, por ejemplo, AFAM, APOH, CAH1, CATD, CD14, CLUS, CRIS3, F13B, IBP6, ITIH4, LYAM1, PGRP2, PRDX, PSG2, PTGDS, SHBG y SPRL1. Se descubrió que muchas moléculas inflamatorias e inmunomoduladoras muestran una separación mejorada utilizando el punto de corte gestacional al nacer menor. Un experto en la técnica apreciará que cualesquiera de los analitos que muestran una separación significativa entre los casos y controles mostrados en las Figuras acompañantes para una ventana de tiempo dada son candidatos para uso en un par de reversión de la presente enseñanza, como un biomarcador único o como parte de un panel de biomarcador de analitos.
Por último, los gráficos cinéticos para analitos que carecen de una diferencia de caso vs. control, pero que demuestran cambios en la intensidad del analito a lo largo del embarazo, son útiles en un reloj de embarazo de acuerdo con los métodos de la enseñanza. Estos analitos, también denominados en el presente documento “proteínas de reloj”, se pueden utilizar para fechar un embarazo en ausencia o junto con otros métodos de datación (por ejemplo, fecha del último período menstrual, datación por ultrasonido). La Tabla 60 proporciona una lista completa de proteínas de reloj útiles en un reloj de embarazo de la enseñanza.
Ejemplo 10. Análisis de descubrimiento 2 de casos de sPTB
Este ejemplo describe el análisis de todos los casos de sPTB analizados previamente como se describe en los ejemplos precedentes, sus controles coincidentes (2 por cada caso) y 2 controles nuevos. Este análisis descrito en este ejemplo amplió la ventana comercial de extracción de sangre más allá de las semanas 19 y 20, generó datos adicionales con respecto a la predicción de sPTB < 35 semanas en base a una mayor cantidad de muestras de todos los ejemplos anteriores, condujo al descubrimiento de nuevos analitos y reversiones, definió las proteínas del reloj molecular, aclaró los umbrales de riesgo y formuló afirmaciones de validación precisas para futuros estudios clínicos. Métodos de procesamiento de muestras
Se desarrolló un protocolo estándar que rige la realización del estudio clínico de Evaluación Proteómica del Riesgo Prematuro (PAPR). Este protocolo también especificaba que las muestras y la información clínica se podrían utilizar para estudiar otras complicaciones del embarazo. Se obtuvieron especímenes de mujeres en 11 sitios aprobados por la Junta de Revisión Interna (IRB) en los Estados Unidos. Después de dar el consentimiento informado, se obtuvieron muestras de suero y plasma, así como información pertinente con respecto a las características demográficas de la paciente, antecedentes médicos y de embarazo, antecedentes de embarazo actual y medicamentos concurrentes. Después del nacimiento, se recolectaron datos relacionados con las afecciones y complicaciones maternas e infantiles.
Las muestras de suero y plasma se procesaron de acuerdo con un protocolo que requiere centrifugación refrigerada estandarizada, se formaron alícuotas de las muestras en crioviales con código de barras 2-D de 0.5 ml y se congelaron posteriormente a -80 ºC.
Después del nacimiento, los casos de parto prematuro se revisaron individualmente para determinar su estado como parto prematuro espontáneo o parto prematuro por indicación médica. Para este análisis sólo se utilizaron casos de parto prematuro espontáneo. Para el descubrimiento de biomarcadores de parto prematuro, se generaron datos de LC-MS para 413 muestras (82 casos de sPTB, 331 controles a término) que abarcaban edades gestacionales de 17 0/7 a 216/7 semanas, con cada muestra de prematuro emparejada con 4 controles a término por edad gestacional en el momento de la extracción de sangre. Cada día de edad gestacional entre 170/7 y 216/7 semanas incluyó al menos un caso de sPTB (y controles a término coincidentes), excepto por un día. Se seleccionaron 4 controles a término con extracciones de sangre de ese día. Un control a término en el estudio que falló en el análisis de laboratorio no se volvió a analizar.
Las muestras de suero se agotaron posteriormente de proteínas de gran abundancia utilizando el Sistema de Eliminación de Múltiples Afinidades Humanas 14 (MARS-14), que elimina 14 de las proteínas más abundantes. Volúmenes iguales de cada muestra clínica o réplicas de dos mezclas de suero de control de calidad se diluyeron con tampón de columna y se filtraron para eliminar los precipitados. Las muestras filtradas se agotaron utilizando una columna MARS-14 (4,6 x 100 mm, Agilent Technologies). Las muestras se enfriaron a 4 °C en el muestreador automático, la columna de agotamiento se ejecutó a temperatura ambiente y las fracciones recolectadas se mantuvieron a 4 °C hasta su posterior análisis. Las fracciones no unidas se recolectaron para posterior análisis.
Las muestras de suero agotado se redujeron con ditiotreitol, se alquilaron con yodoacetamida y luego se digirieron con tripsina. Después de la digestión con tripsina, las muestras se fortificaron con un grupo de estándares de isótopos estables en concentraciones que se aproximaban a la concentración del analito de péptido sustituto. Las muestras fortificadas con SIS se mezclaron y dividieron en dos volúmenes iguales. Cada división se colocó en almacenamiento a -80 °C hasta que estuviera lista para continuar con el proceso de trabajo. Una división congelada de cada muestra se recuperó del almacenamiento a -80 °C, se dejó descongelar y luego se desalinizó sobre una placa de extracción en fase sólida C18 (Empore, 3M). Los péptidos eluidos se liofilizaron hasta secado. Las muestras liofilizadas se volvieron a solubilizar en una solución de reconstitución que contenía estándares internos que monitorizan la calidad de solo la etapa de LC-MS (IS Recon).
Las muestras completamente procesadas se analizaron utilizando un método dinámico de Monitorización de Reacciones Múltiples (dMRM). Los péptidos se separaron en una columna Poroshell EC-C18 de 2.1 x 100 mm, con un tamaño de partícula de 2.7 µ a un índice de fluidez de 0.4 ml/min utilizando un UPLC Agilent 1290 y se eluyeron utilizando un gradiente de acetonitrilo en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6490 con una fuente de electropulverización, que opera en modo de iones positivos. El ensayo dMRM midió 442 transiciones que corresponden a 119 péptidos y 77 proteínas que cumplen funciones tanto de diagnóstico como de calidad. Los picos cromatográficos se integraron utilizando el software de Análisis Cuantitativo MassHunter (Agilent Technologies). Se informaron las relaciones del área máxima cromatográfica del analito de péptido sustituto al área máxima cromatográfica de SIS correspondiente.
En la Tabla 21 se muestra un resumen de las proteínas, péptidos y transiciones para analitos en suero, transiciones SIS y estándares IS Recon medidos en el método dMRM. Las proteínas de agotamiento MARS-14 identifican los análisis dirigidos por la columna de inmunoagotamiento MARS-14 y se miden con fines de control de calidad. Las transiciones cuantitativas se utilizan para relaciones de respuesta relativas y las transiciones cualitativas sirven para fines de control de calidad. El asterisco (*) denota cambios de nombre. CSH indica que el péptido corresponde tanto a CSH1 como a CSH2. HLAG ahora se denomina HLACI ya que el péptido se conserva en varios isotipos de HLA de clase I. LYAM3 ahora se denomina LYAM1 porque, si bien la secuencia de péptidos está presente en cada uno, solo se deriva de la escisión con tripsina de LYAM1. SOM2 ahora se denomina como SOM2.CSH ya que los péptidos son específicos tanto para SOM2 como para CSH.
Proteína significante y selección de reversión
Para cada analito, en cada una de las ventanas superpuestas de dos y tres semanas, con y sin restricción de IMC, y con dos definiciones de SPTB (37/37 y 35/35), se calculó el valor de cambio de plegado que indica si la media de muestras de casos de SPTB fue mayor o menor que la media de las muestras de control a TERM. Las Tablas 22 y 23 muestran el AUROC de proteína/transición para ventanas de edad gestacional de dos semanas que se superponen en una semana (por ejemplo, 119-132 se refiere a los días 119-132 de embarazo, lo que equivale a las semanas 17 y 18 de gestación). El rendimiento en cada ventana de dos semanas se informa para dos puntos de corte diferentes de casos vs. controles (< 370/7 frente a >= 370/7, < 350/7 frente a >= 350/7) y con (rBMI) y sin (aBMI) una estratificación de IMC. Las Tablas 24 y 25 muestran el AUROC de proteína/transición para ventanas gestacionales de tres semanas que se superponen en dos semanas (mostradas en los días, por ejemplo, “119-139” se refiere a los días 119-139 del embarazo, lo que equivale a las semanas gestacionales 17, 18 y 19). El rendimiento en cada ventana de tres semanas se informa para dos puntos de corte diferentes de casos frente a controles (< 370/7 frente a >= 370/7, < 350/7 frente a >= 350/7) y con (rBMI) y sin (aBMI) una estratificación de IMC.
Las Figuras 86 a 95 muestran gráficos cinéticos de varias transiciones de péptidos para caso vs. control utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 370/7 vs. >= 370/7 semanas. Las Figuras 96 a 105 muestran gráficos cinéticos de varias transiciones de péptidos para caso frente a control utilizando el punto de corte de la edad gestacional al momento del parto de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas. Brevemente, las relaciones relativas promedio para cada transición de péptidos se grafican utilizando el paquete R ggplot2 contra GABD utilizando una función de suavizado promedio media (ventana = /- 10 días). Las gráficas presentan gráficos separados para casos frente a controles utilizando dos puntos de corte diferentes de edad gestacional al momento del parto (< 370/7 frente a >= 370/7 semanas y < 350/7 frente a >= 350/7 semanas). Los títulos de los gráficos muestran un nombre corto de proteína, un guion bajo y la secuencia de péptidos. Las secuencias de analitos pueden haber sido recortadas para que los títulos encajen en los gráficos.
En base al valor de cambio de plegado, que indica si la media de las muestras de casos de SPTB era mayor o menor que la media de las muestras de control a TERM, cada analito se marcó como regulado al alza o a la baja para cada una de las combinaciones (es decir, superposición de 2 o ventana de 3 semanas, restricción de IMC y definición de SPTB) y si un analito tenía la mayoría de las combinaciones marcadas como reguladas al alza, se denominaba analito regulado al alza en general y viceversa. Esto se muestra en la Tabla 26.
En base a estas asignaciones de regulación al alza y a la baja (55 reguladas al alza y 30 reguladas a la baja), se crearon reversiones al dividir el valor de la relación relativa de cada analito regulado al alza por el de un analito regulado a la baja y tomando el logaritmo natural del resultado. Esto da como resultado 1650 reversiones (55 x 30 = 1650). Para cada reversión, se calculó un área bajo la curva ROC (AUCROC) que indica la separación de SPTB y a TERM y un valor p que indica si el valor de AUCROC es significativamente diferente de AUCROC= 0.5 (es decir, no hay una separación significativa de SPTB y TERM). El rendimiento de cada reversión se tabuló para diferentes condiciones (por ejemplo, ventanas gestacionales, con y sin restricción de IMC y los dos puntos de corte de sPTB), para aquellas reversiones con un AUCROC > 0.6 y un valor p < 0.05. Las tablas 27 a 42 muestran el rendimiento de la clasificación de reversión para las semanas 17 y 18 de gestación. Las Tablas 47 a 58 muestran el rendimiento de la clasificación de reversión para las semanas 17, 18 y 19 de gestación. Las Tablas 43 a 46 muestran el rendimiento de la clasificación de reversión para las semanas 17 a 21 de gestación. Las reversiones adicionales de significancia potencial se muestran en la Tabla 59.
También se demostró un rendimiento mejorado de los predictores formados a partir de más de una reversión (semanas 17 a 21). Brevemente, se combinaron las reversiones que dieron un fuerte desempeño predictivo ya sea temprano (por ejemplo, semanas 17-19) o más tarde (por ejemplo, semanas 19-21) en este rango de edad gestacional y se evaluó el desempeño de predictores formados a partir de combinaciones (SumLog) de múltiples reversiones para el rango completo de extracción de sangre. Esto se muestra en la Tabla 61. La puntuación del predictor se derivó de la suma de los valores Log de la reve-rsión individual (SumLog), pero un experto en la técnica podría seleccionar otros modelos (por ejemplo, regresión logística). También se contempla aplicar este enfoque de reversión múltiple a combinaciones de reversiones específicas de ruptura prematura de membrana pretérmino (PPROM) frente a trabajo de parto prematuro en ausencia de PPROM (PTL), género fetal y gravidez. Se contempla además que el predictor podría contener una variable indicadora que selecciona un subconjunto de reversiones para utilizar dado el conocimiento del período de extracción de sangre, el género fetal o la gravidez.
La Figura 110 muestra las relaciones entre la Puntuación del Predictor (ln IBP4/SHBG) y el riesgo relativo ajustado por prevalencia de sPTB (Valor Predictivo Positivo), utilizando un punto de corte de < 370/7 semanas frente a >= 37 0/7 semanas de gestación. Las muestras se extrajeron entre las semanas 191/7 y 206/7 con IMC > 22 <= 37. El riesgo relativo aumenta a medida que la puntuación del predictor aumenta desde la tasa de fondo del 7.3 % (riesgo promedio de la población de sPTB en embarazos únicos) a aproximadamente el 50 %. La curva de tasa de cribado positivo para todos los umbrales de puntuación está superpuesta. Los intervalos de confianza (sombra gris) se calcularon asumiendo las observaciones distribuidas binomialmente y aproximando la distribución de error con una distribución normal. La distribución de la muestra por puntuación del clasificador se muestra mediante una gráfica de barras de acuerdo con el esquema de colores en la leyenda de la Figura.
La Figura 111 muestra las relaciones entre la Puntuación del Predictor (ln IBP4/SHBG) y el riesgo relativo ajustado por prevalencia de sPTB (Valor Predictivo Positivo), utilizando un punto de corte de < 350/7 semanas frente a >= 35 0/7 semanas de gestación. Las muestras se extrajeron entre las semanas 191/7 y 206/7. El riesgo relativo aumenta a medida que la puntuación del predictor aumenta desde la tasa de fondo del 4.4 % (riesgo promedio de la población de sPTB (< 35) en embarazos únicos) a aproximadamente el 50 %. La curva de tasa de cribado positivo para todos los umbrales de puntuación está superpuesta. Los intervalos de confianza (sombra gris) se calcularon asumiendo las observaciones distribuidas binomialmente y aproximando la distribución de error con una distribución normal. La distribución de la muestra por puntuación del clasificador se muestra mediante una gráfica de barras de acuerdo con el esquema de colores en la leyenda de la Figura.
Observaciones clínicas: sPTB, PPROM y PTL
El rendimiento de reversión (GABD semanas 17-21) se evaluó de forma independiente para dos fenotipos diferentes de sPTB, PPROM y PTL. La PPROM ocurre más a menudo temprano y se asocia con infección o inflamación. PTL puede ocurrir más tarde y generalmente se considera un fenotipo menos severo. Hubo reversiones más significativas y con mayor rendimiento para PPROM y esas reversiones están pobladas con proteínas que se sabe que están involucradas en la inflamación y la infección. Se contempla la selección de reversiones para construir métodos de prueba independientes de PPROM y PTL, o para maximizar el rendimiento general con la combinación de más de una reversión en un solo predictor. En el análisis mostrado en las Tablas 61 a 64, se requirió un AUC > 0.65 y p < 0.05 para PPROM o PTL.
La Tabla 61 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso vs. control de < 370/7 vs. > 370/7 semanas, sin estratificación de IMC, por separado para PPROM y PTL. La Tabla 62 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas, con estratificación de IMC (>22 <=37), por separado para PPROM y PTL. La Tabla 63 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto corte de caso vs. control de < 350/7 vs. >= 350/7 semanas, sin estratificación de IMC, por separado para PPROM y PTL. La Tabla 64 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso vs. control de < 350/7 vs. >= 350/7 semanas, con estratificación de IMC (> 22 <= 37), por separado para PPROM y PTL.
También se determinaron los analitos de mejor desempeño para PTL y los analitos de mejor desempeño para PPROM para las semanas 19-20 de GABD y se construyeron varias reversiones a partir de los de mejor desempeño. IBP4 está presente como un buen desempeñador tanto en PTL como en PPROM, lo que permite su utilidad en general para sPTB. La Tabla 76 enumera la AUROC de transición para las semanas gestacionales 191/7 a 206/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas, sin estratificación de IMC, para PTL. La Tabla 77 enumera la AUROC de transición para las semanas gestacionales 191/7 a 206/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas, sin estratificación de IMC, para PPROM. La Figura 108 ejemplifica reversiones con buen desempeño en las semanas 19-20 en PTL. La Figura 109 ejemplifica reversiones con buen desempeño en las semanas 19-20 en PPROM.
Observaciones clínicas: primigrávida y multigrávida
El rendimiento de la reversión (semanas 17 a 21) se evaluó más de forma independiente para dos fenotipos diferentes de sPTB, primigrávida y multigrávida. En las Tablas 65-68, se muestran las reversiones de mayor rendimiento (semanas 17-21) para las primigrávidas (madres primerizas) y las multigrávidas por separado. Las madres primerizas son las que más necesitan una prueba para predecir la probabilidad de PTB porque no tienen antecedentes de embarazo para que los médicos determinen/estimen el riesgo. Estos resultados permiten una prueba independiente para estos dos grupos, o combinar reversiones de alto rendimiento en un solo clasificador para predecir el riesgo para ambos. En el análisis mostrado en las Tablas 65-68, se requirió un AUC > 0.65 y p < 0.05 para primigrávida o multigrávida.
La tabla 65 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas, sin estratificación del IMC, por separado para primigrávida y multigrávida. La Tabla 66 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 21 6/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 370/7 frente a >= 370/7 semanas, con estratificación del IMC (> 22 <= 37), por separado para primigrávida y multigrávida. La Tabla 67 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas, sin estratificación de IMC, por separado para primigrávida y multigrávida. La Tabla 68 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 35 0/7 frente a >= 35 0/7 semanas, con estratificación del IMC (> 22 <= 37), por separado para primigrávida y multigrávida.
Observaciones clínicas: género fetal
El rendimiento de reversión (semanas 17 a 21) adicionalmente se evaluó independiente para sujetos embarazadas con un feto masculino frente a uno femenino. Se descubrió que algunas reversiones tienen un rendimiento predictivo específico del género fetal. La Figura 106 demuestra las diferencias de analito y puntuación de IBP4 y SHBG (IBP4/SHBG) específicas del género fetal. IBP4 es significativamente mayor en sujetos con fetos masculinos. El rendimiento de la reversión sigue siendo comparable para las semanas de edad gestacional 19-21 sin estratificación del IMC (Figura 106). Adicionalmente, en el ensayo clínico PAPR se descubrió que los fetos masculinos tenían un mayor riesgo de sPTB con un valor p de 0.0002 y una razón de probabilidad de 1.6. Por último, el género fetal se puede incorporar en un predictor (por ejemplo, un valor de reversión más el género fetal). En el análisis mostrado en las Tablas 69-72, se requirió un AUC > 0.65 y p < 0.05 para fetos masculinos o femeninos.
La Tabla 69 muestra el AUROC de reversión para las semanas gestacionales 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso vs. control de < 370/7 vs. >= 370/7 semanas, sin estratificación de IMC, por separado en el género fetal. La Tabla 70 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 216/7 utilizando un punto corte de caso vs. control de < 370/7 vs. >= 370/7 semanas, con estratificación de IMC (> 22 <= 37), por separado en el género fetal. La Tabla 71 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 216/7 utilizando un punto de corte de caso frente a control de < 350/7 frente a >= 350/7 semanas, sin estratificación del IMC, por separado en el género fetal. La Tabla 72 muestra el AUROC de reversión para las semanas de gestación 170/7 a 21 6/7 utilizando un punto corte de caso vs. control de < 35 0/7 vs. >= 35 0/7 semanas, con estratificación de IMC (> 22 <= 37), por separado en el género fetal.
Ejemplo 11. Correlación de espectrometría de masas y datos de inmunoensayo
Este ejemplo demuestra la implementación de un inmunoensayo utilizando una plataforma MSD (por ejemplo, datos de MSD que se correlacionan con datos de ELISA comerciales y datos de MS para IBP4 y SHBG).
Materiales
Se utilizaron los siguientes anticuerpos: globulina fijadora de hormonas sexuales (Catálogo Biospacific #s 6002-100051 y 6001-100050; Catálogo R&D Systems #s MAB2656 y AF2656), IGFBP-4 (Catálogo Ansh #s AB-308-AI039 y AB-308-AI042). Se probaron proteínas SHBG de Origene (Catálogo # TP328307), Biospacific (Catálogo #J65200), NIBSC (código: 95/560), y R&D Systems (solo disponible como parte del kit de SHBG de ELISA) como calibradores. Se utilizó IGFBP-4 Humana Recombinante (Ansh, Catálogo# AG-308-AI050) como calibrador.
Creación de soluciones de anticuerpos acoplados a U-PLEX individuales
Cada anticuerpo biotinilado se diluyó a 10 μg/ml en Diluyente 100 para un volumen final de ≥ 200 μl. A continuación, se agregó el anticuerpo biotinilado a 300 µl del Ligador U-PLEX asignado. (Se utilizó un ligador diferente para cada anticuerpo biotinilado). Las muestras se agitaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se agregó solución de parada (200 µl) a cada tubo. Los tubos se agitaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Preparación de solución de recubrimiento multiplex
Cada solución de anticuerpo acoplado a U-PLEX (600 μl) se combinó en un solo tubo y se agitó para mezclar. Al combinar menos de 10 anticuerpos, el volumen de la solución se llevó hasta 6 ml con solución de parada para dar como resultado una concentración final de 1X. Tenga en cuenta que, en estos experimentos, solo había un único anticuerpo por pocillo.
Recubrimiento de la placa U-PLEX.
Se agregó solución de recubrimiento multiplex (50 μl) a cada pocillo. Las placas se sellaron con un sello adhesivo para placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora o a 2-8 °C durante la noche, con agitación a alrededor de 700 rpm. Después de lavar 3 veces con al menos 150 µl de tampón de lavado 1X MSD, las placas estaban listas para utilizar.
Análisis de muestra
Se agregaron alícuotas, 50 µl, de muestra o calibrador a cada pocillo. La placa se selló y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación a alrededor de 700 rpm. A continuación, la placa se lavó 3 veces con al menos 150 µl de tampón de lavado 1X MSD*. Se agregó solución de anticuerpo de detección, 50 µl, a cada pocillo. Después del sellado, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación a alrededor de 700 rpm. La placa se lavó 3 veces con al menos 150 µl de tampón de lavado 1X MSD. Después de la adición de 150 µl de tampón de lectura 2X a cada pocillo, se leyó la placa inmediatamente sobre un instrumento MSD.
Cribado de anticuerpos y calibradores de SHBG
Todos los anticuerpos se probaron en ambas orientaciones de captura-detector, todas las combinaciones de pares. Los anticuerpos de captura se prepararon a 10 μg/ml, se acoplaron a ligadores U-PLEX y se recubrieron sobre la placa U-PLEX. El calibrador SHBG de R&D Systems se diluyó en Diluyente 43 para crear una curva estándar de 7 puntos con diluyente de ensayo en blanco. Las muestras se diluyeron de la siguiente manera en Diluyente 43 y se analizaron en los ensayos: muestras “altas y bajas” de SHBG de Sera: diluciones de 100 y 500 veces, y el grupo de embarazo de Sera: diluciones de 100, 200, 400 y 800 veces. Los anticuerpos de detección se probaron a 1 μg/ml en Diluyente 3. Se evaluaron las curvas estándar y la unión al analito nativo en suero. Luego, los pares de analitos principales se probaron con los calibradores NIBSC y Biospacific, con diluciones hechas como se indicó anteriormente.
Anticuerpo IGFBP-4 y cribado de calibrador
Los dos anticuerpos se probaron en ambas orientaciones de captura-detector. Los anticuerpos de captura se prepararon a 10 μg/ml, se acoplaron a ligadores U-PLEX y se recubrieron sobre la placa UPLEX. El calibrador IGFBP-4 se diluyó en Diluyente 12 para crear una curva estándar de 7 puntos con el diluyente de ensayo en blanco. Las muestras se diluyeron de la siguiente manera en Diluyente 12 y se analizaron en los ensayos: muestras “altas” y “bajas” de IGFBP-4 de Sera: 5 veces, grupo de embarazadas de Sera: diluciones dobles de 2 a 64 veces, y 2 diluciones individuales de muestras de suero humano (muestras MSD): 2, 4, 8 y 16 veces. Los anticuerpos de detección se probaron a 1 μg/ml en Diluyente 12. Se evaluaron las curvas estándar y la unión al analito nativo en suero.
Pruebas de SHBG e IGFBP-4 con 60 muestras de Sera.
Se seleccionó el par de anticuerpos 12 para medir SHBG en 60 muestras de plasma por duplicado de Sera. Para IGFBP-4, se seleccionó el par 2. Las muestras de plasma se diluyeron 1:1000 y 1:20 para SHBG e IGFBP-4, respectivamente. Los resultados del ELISA de MSD se compararon con los kits comerciales de ELISA y con los datos de MS-MRM.
Resultados:
Cribado de anticuerpos SHBG
Solo el par de anticuerpos 1 (captura mono R&D, detección poli), dio una señal fuerte con el calibrador Origene, lo que sugiere que este calibrador puede representar una subpoblación del analito SHBG endógeno. Por lo tanto, se probaron calibradores adicionales en estudios posteriores para identificar un calibrador que funcione con todos los pares. No obstante, todos los pares de anticuerpos reconocieron el analito nativo en las muestras de grupo altos, bajas y de embarazadas de Sera. R&D poly AF2656 y Biospacific mono 6001-100050 dieron un rendimiento similar. Los pares 2, 3 y 12 mostraron una titulación aproximadamente lineal con la dilución de la muestra (Tabla 73). A continuación, se evaluó el rendimiento de los cuatro pares principales de anticuerpos con tres calibradores adicionales. Se lograron buenas curvas de calibrador para los 4 pares superiores a través de los 3 calibradores (Tabla 74). Las diferencias en la señal pueden deberse en parte a las diferencias en la concentración asignada.
El panel inferior muestra que las señales de NIBSC o Biospacific relativas al calibrador R&D variaron dependiendo del par de anticuerpos. Los pares 3 y 10 (los mismos anticuerpos con la orientación de captura-detección invertida) tenían un perfil similar. El par 2 dio señales más bajas para NIBSC y Biospacific (en comparación con el par 3, misma captura). El par 12 dio señales más altas para Biospacific y señales de más de 3 veces más altas para el estándar NIBSC. Cribado de anticuerpos IGFBP-4
La curva estándar del par de anticuerpos 2 proporcionó señales de calibrador específicas y de fondo 4-6 veces más altas en comparación con el Par 1 (Tabla 75). Las señales de muestra de suero cayeron en el rango lineal para la mayoría de las diluciones probadas; el grupo de embarazadas se acercó al fondo en las diluciones de 32 y 64 veces. El par 2 dio señales ~12 veces más altas para las muestras, lo que resultó en una diferencia de 2 a 4 veces en la cuantificación. Los CV de señal fueron generalmente < 5 % para ambos pares.
Medición de SHBG e IGFBP-4 en 60 muestras de suero
Para SHBG, con la dilución de 1000 veces, las muestras cayeron entre los estándares de calibrador 1-3. La mediana de la concentración medida fue de 58.4 μg/ml. Los CV de las mediciones duplicadas fueron bajos, con una mediana de CV del 2.4 %. La mediana de la concentración medida para IGFBP-4 fue de 234 ng/ml y la mediana del CV entre muestras duplicadas fue del 2.2 %. Como se muestra en la Figura 107, se observó una buena correlación con ambas proteínas en el ensayo MSD en comparación con los kits ELISA comerciales y el ensayo MS-MRM.
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Tabla 19: Proteínas con niveles en suero alterados a lo largo de 17-25 semanas de GA en muestras de PTB
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* Proteínas adicionales limitadas a las semanas 19-21 de GA en PTB.
Tabla 20: 44 proteínas que cumplen con filtros analíticos que se regularon al alza y a la baja en sPTD vs. controles de término
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* El péptido sustituto de HLA-G no era exclusivo de esta proteína.
Tabla 21:
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* Denota cambios de nombre. CSH denota que el péptido corresponde tanto a CSH1 como CSH2. HLAG ahora se denomina como HLACI, dado que el péptido se conserva en varios isotipos HLA de clase I. LYAM3, ahora se denomina como LYAM1 porque, mientras que la secuencia de péptidos está presente en cada uno, solo se deriva por la escisión de tripsina de LYAM1. SOM2 ahora se denomina como SOM 2.CSH, ya que los péptidos son específicos tanto a SOM2 como CSH.
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Tabla 74: Pares de Anticuerpos SHBG de Mejor Rendimiento con Calibradores Adicionales
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Tabla 75: Cribado de Anticuerpo IGFBP-4
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* El sombreado gris indica señales dentro del fondo del ensayo 2x
Tabla 76: Desempeño en la Clasificación de Transición, semanas 19-20.
Transición de AUROC para las semanas gestacionales 191/7 a 206/7 utilizando un punto de corte de caso vs. control de <370/7 vs. >= 370/7 semanas, sin estratificación del IMC, para PTL.
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Tabla 77: Desempeño en la Clasificación de Transición, semanas 19-20.
Transición de AUROC para las semanas gestacionales 191/7 a 206/7 utilizando un punto de corte de caso vs. control de <370/7 vs. >= 370/7 semanas, sin estratificación del IMC, para PPROM.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un par de biomarcadores aislados IBP4 y SHBG o un par de péptidos sustitutos de un par de biomarcadores IBP4 y SHBG, en la que dicho par de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término, y en la que dichos péptidos sustitutos consisten en porciones o fragmentos de dichos biomarcadores.
2. La composición de la reivindicación 1, que comprende además uno o más pares de biomarcadores o uno o más pares de péptidos sustitutos, cada uno que corresponde a un par de biomarcadores, en los que los biomarcadores se seleccionan de IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1, en el que cada uno de dichos pares de biomarcadores exhibe un cambio en el valor de reversión entre mujeres embarazadas en riesgo de parto prematuro y controles a término.
3. La composición de la reivindicación 1 o 2, que comprende además péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) que corresponden a cada uno de los péptidos sustitutos.
4. Un método para determinar la probabilidad de parto prematuro en una mujer embarazada, en el que el método comprende medir en una muestra biológica de dicha mujer embarazada un valor de reversión para un par de biomarcadores IBP4 y SHBG, en el que el valor de reversión se basa en una relación de dicho IBP4 sobre dicho SHBG (IBP4/SHBG), y en el que una mayor relación en la mujer embarazada en comparación con los controles a término indica un mayor riesgo de parto prematuro.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el método comprende además medir un cambio en el valor de reversión para el par de biomarcadores IBP4 y SHBG y uno o más pares de biomarcadores seleccionados de IBP4/PSG3, IBP4/LYAM1, IBP4/IGF2, CLUS/IBP3, CLUS/IGF2, CLUS/LYAM1, INHBC/PSG3, INHBC/IGF2, PSG2/LYAM1, PSG2/IGF2, PSG2/LYAM1, PEDF/PSG3, PEDF/SHBG, PEDF/LYAM1, CD14/LYAM1, y APOC3/LYAM1.
6. El método de la reivindicación 4 o 5, en el que dicha medición comprende medir péptidos sustitutos de dichos biomarcadores en la muestra biológica de dicha mujer embarazada, en el que dichos péptidos sustitutos consisten en porciones o fragmentos de dichos biomarcadores; opcionalmente en los que dicha medición comprende además medir péptidos estándar marcados con isótopos estables (péptidos SIS) para cada uno de los péptidos sustitutos;
en el que dicha medición comprende espectrometría de masas (MS) o un ensayo que utiliza un agente de captura; o en el que el método comprende además la predicción de la edad gestacional al nacimiento (GAB) antes de dicha determinación de la probabilidad de parto prematuro.
7. Un método para detectar un par de biomarcadores aislados IBP4 y SHBG en una mujer embarazada, dicho método comprende:
a. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en una muestra biológica de la mujer embarazada al poner en contacto la muestra biológica con un primer agente de captura que se une específicamente a un primer miembro de dicho par y un segundo agente de captura que se une específicamente a un segundo miembro de dicho par; y detectar la unión entre el primer biomarcador de dicho par y el primer agente de captura y entre el segundo miembro de dicho par y el segundo agente de captura,
o
b. detectar si el par de biomarcadores aislados está presente en una muestra biológica de la mujer embarazada que comprende someter la muestra a un flujo de trabajo de proteómica compuesto de cuantificación por espectrometría de masas.
8. El método de la reivindicación 6 o 7(a), en el que dicho agente de captura se selecciona de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, reactivo de unión a proteínas a base de ácidos nucleicos, molécula pequeña o variante de los mismos; o en el que dicho ensayo se selecciona del grupo que consiste en inmunoensayo enzimático (EIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), y radioinmunoensayo (RIA).
9. El método de la reivindicación 7(b), en el que dicho flujo de trabajo de proteómica comprende la cuantificación de un péptido SIS.
10. El método de la reivindicación 7, que comprende además medir un valor de reversión para dicho par de biomarcadores, en el que el valor de reversión se basa en una relación de dicho IBP4 sobre dicho SHBG (IBP4/SHBG).
11. El método de la reivindicación 10, en el que la existencia de un cambio en el valor de reversión entre la mujer embarazada y un control a término indica la probabilidad de parto prematuro en la mujer embarazada.
12. El método de la reivindicación 10, en el que una mayor relación en mujeres embarazadas en comparación con los controles a término indica un mayor riesgo de parto prematuro.
13. El método de la reivindicación 4, 11, o 12, en el que dicha probabilidad se expresa como una puntuación de riesgo.
14. El método de la reivindicación 4 o 7, en el que la muestra biológica se selecciona de sangre completa, plasma, y suero;
en el que dicha muestra se obtiene entre las 19 y 21 semanas de edad gestacional.
15. El método de la reivindicación 4 o 7, en el que el método comprende además detectar una característica medible para uno o más indicios de riesgo.
16. El método de la reivindicación 15, en el que dicho indicio de riesgo se selecciona del Índice de Masa Corporal (IMC), gravidez y género fetal, opcionalmente en el que la mujer embarazada tiene un índice de masa corporal (IMC) mayor de 22 kg/m2 y menor de o igual a 37 kg/m2.
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