JP2019532261A - 予定日前の早期破水対特発性自然陣痛に起因する早産を予測するためのバイオマーカー - Google Patents

Abstract

本発明は、妊娠女性の早産確率を予測するための組成物および方法を提供する。本発明は、図１および２、ならびに表１〜（３）、（６）〜（３８）、および（４４）〜（６８）に示されているバイオマーカーからなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産の、任意選択で予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産の、または特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜（３）、（６）〜（３８）、および（４４）〜（６８）に示されているバイオマーカーの１つまたは複数から選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。

Description

本願は、２０１７年１月２４日に出願された米国仮出願第６２／４４９，８６２号および２０１６年８月５日に出願された米国仮出願第６２／３７１，６６６号の利益を主張し、これらそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、精密医療の分野に関し、より具体的には、妊娠女性の早産確率を決定するための組成物および方法に関する。

背景
世界保健機関によると、推定１５００万人の乳児が毎年（妊娠満３７週前）早産で生まれる。信頼性の高いデータを伴うほぼ全ての国において早産率が増加している。世界保健機関；Ｍａｒｃｈ ｏｆ Ｄｉｍｅｓ；Ｔｈｅ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ ｆｏｒ Ｍａｔｅｒｎａｌ， Ｎｅｗｂｏｒｎ ＆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ； Ｓａｖｅ ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ， Ｂｏｒｎ ｔｏｏ ｓｏｏｎ： ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ａｃｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ、ＩＳＢＮ９７８９２４１５０３４３３（２０１２年）を参照のこと。推定１００万人の乳児が早産の合併症により毎年死亡している。世界的には、早産が、新生児の第１の死亡原因（生後４週間内の乳児）および５歳未満の小児における肺炎に続く第２の死亡原因である。多くの生存者は、学習障害ならびに視覚および聴覚の問題を含む、障害の人生に直面する。

信頼性の高いデータを伴う１８４カ国にわたり、早産率は、生まれた乳児の５％〜１８％の範囲である。Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、「Ｎａｔｉｏｎａｌ， ｒｅｇｉｏｎａｌ ａｎｄ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｐｒｅｔｅｒｍ ｂｉｒｔｈ．」、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、９；３７９巻（９８３２号）：２１６２〜７２頁（２０１２年）。早産の６０％超がアフリカおよび南アジアで発生しており、早産は、それにもかかわらず、世界的な問題である。最多数を伴う国は、ブラジル、インド、ナイジェリア、および米国を含む。１５％を上回る早産率を伴う１１カ国の内、２カ国を除く全てが、サハラ以南アフリカである。最貧国においては、高所得国における９％と比較して、平均で、乳児の１２％が、あまりにも早く生まれている。国内では、貧困家庭でリスクが高い。未熟児の４分の３超が、実施可能な、費用対効果の高いケア、例えば、乳児の肺を強化するための、早期陣痛のリスクのある妊娠女性に与えられる出生前ステロイド注射で助けることができる。

早産で生まれた幼児には、死亡ならびに種々の健康および発達の問題について、満期で生まれた幼児よりも大きなリスクがある。合併症は、急性呼吸器、消化器、免疫、中枢神経系、聴覚、および視覚の問題、ならびに長期的な運動、認知、視覚、聴覚、行動、社会的情緒、健康、および成長の問題を含む。早産児の誕生はまた、家族にかなりの感情的および経済的コストをもたらし、公的サービス、例えば健康保険、教育、および他の社会的支援のシステムなどについての意味を有しうる。死亡および罹患の最大のリスクは、最も初期の妊娠期間に生まれた幼児についてのものである。しかし、満期により近くで生まれた幼児が、早産で生まれた幼児の最多数を代表しており、満期で生まれた幼児よりも多くの合併症を経験する。

超音波で子宮頚管開口部を示す妊娠２４週未満の女性において早産を防止するために、子宮頚部を強力な縫合糸で縫合閉鎖する頚管縫縮術として公知である外科的手技を用いることができる。妊娠３４週未満および能動的な早期陣痛中の女性については、入院、ならびに早期陣痛を一時的に停止するおよび／または胎児の肺発達を促進するための医薬の投与が必要となりうる。妊娠女性で早産のリスクがあると判断された場合、医療提供者は、予防内服、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（Ｍａｋｅｎａ）注射および／または膣プロゲステロンジェル、子宮頚ペッサリーなど、性的活動および／または他の身体活動に対する制限、ならびに早期陣痛のリスクを増加させる慢性状態、例えば糖尿病および高血圧などのための処置の変更を含みうる、種々の臨床戦略を実施することができる。

早産のリスクがある女性を特定し、適した産前ケアを提供する必要性は高い。ハイリスクとして特定された女性では、より集中的な出生前サーベイランスおよび予防的介入について計画を立てることができる。リスク評価のための現在の戦略は、産科歴ならびに病歴および臨床検査に基づいているが、これらの戦略では、早期出産のリスクがある女性のわずかなパーセンテージを特定することしかできない。現在は、自然早産（ｓＰＴＢ）の前歴が、それ以降の早産（ＰＴＢ）に関する最も強力な単一の予測因子である。ｓＰＴＢを以前に一度経験している場合、第２のＰＴＢの可能性は３０〜５０％である。他の母体リスク要因としては、黒色人種であること、母体のボディ・マス・インデックスが低いこと、および子宮頚部長が短いことが挙げられる。ｓＰＴＢを予測するための羊水、頚腟液、および血清バイオマーカーの研究によると、最終的に早期分娩する女性には、複数の分子経路に異常があることが示唆されている。早産についてのリスクの信頼できる早期特定は、早期出産を防止するための適当なモニタリングおよび臨床管理の計画を可能にするであろう。そのようなモニタリングおよび管理は、より頻繁な胎教来診、連続的な子宮頚管長の測定、早期早産の徴候および症状に関する教育の強化、変更可能なリスク行動のためのライフスタイル介入、禁煙、子宮頚部ペッサリーおよびプロゲステロン処置を含みうる。最後に、早産についてのリスクの信頼できる出生前特定も、モニタリングリソースの費用対効果の配分に決定的である。

有リスク女性を特定しようとする研究が精力的に行われているにもかかわらず、臨床的および人口統計学的要因にのみ基づくか、または測定された血清または膣バイオマーカーを使用するＰＴＢ予測アルゴリズムは、臨床的に有用な検査に至っていない。臨床介入を可能にするためには、初回妊娠中および妊娠初期に有リスク女性を特定するためのより正確な方法が必要である。本発明では、妊娠女性に早産のリスクがあるか否かを決定するための組成物および方法を提供することにより、この必要性に対処する。関連する利点も提供する。

本発明は、妊娠女性の早産確率を予測するための組成物および方法を提供する。

本発明は、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーからなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む組成物を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１、ならびに表１〜３、６〜２１、４２、４３、および４５〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の特発性自然陣痛（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｌａｂｏｒ）（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図２、ならびに表１〜３、６、２２〜３６、４２、および４４〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１、ならびに表６〜２１、４２、４３、および４５〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図２、ならびに表６、２２〜３６、４２、および４４〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

本発明の他の特徴および利点は、発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明白になるだろう。

図１は、ＰＰＲＯＭ対満期対照で富化されているタンパク質（太字）を示す。多数のこうしたタンパク質は、免疫および炎症（太字、網掛け）に関与しており、炎症促進性サイトカインと関連付けられている。

図２は、ＰＴＬ対満期で発現が異なるタンパク質（太字、網掛け）が、胎児成長／発達およびインスリンシグナル伝達と関連付けられることを示す。注目すべきことに、ＰＳＧ３は免疫寛容に役割を有する場合があるものの、免疫応答および炎症のマーカーは存在しない。

本開示は、概して、妊娠女性から得られた生物学的試料中のあるタンパク質およびペプチドが、対照と比べて早産のリスク増加を有する妊娠女性では発現が異なるという発見に基づく。本開示は、さらに具体的には、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬ女性は、両者とも早産するのだが、異なるプロテオミクスプロファイルを有しており、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬに感受性のバイオマーカーを組み合わせた多重分析物予測因子（multi-analyte predictor）の生成が可能であるという予期しない発見に部分的に基づく。

本明細書で開示されているタンパク質およびペプチトは、個々に、比で、反転対（reversal pair）で、またはバイオマーカー／反転対のパネルでのいずれかで、試験試料を分類するための、早産確率を予測するための、満期出産の確率を予測するための、出生時妊娠期間（gestational age at birth）（ＧＡＢ）を予測するための、出産までの時間（ＴＴＢ）を予測するための、および／またはＰＴＢリスクのある妊娠女性の予防療法の進行をモニタリングするためのバイオマーカーとしての役割を果たす。本発明は、部分的には、早産確率を予測することができる特定のバイオマーカーの選択にある。本発明は、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に開示されているバイオマーカーの１つまたは複数の組成物と同様に、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に開示されているバイオマーカーから選択される１つまたは複数のバイオマーカー対の組成物を企図する。したがって、本発明の根底にあるものは、有益な情報をもたらす特定のバイオマーカーの選択におけるヒトの独創性である。

女性の自然早期出産リスクをＰＰＲＯＭのリスクパーセントおよびＰＴＬのリスクパーセントに分類する能力を使用して、ＰＴＬまたはＰＰＲＯＭのいずれかを遅延させること、およびＰＴＬまたはＰＰＲＯＭのいずれかに関連する合併症に備えることに焦点を置いた臨床判断を容易にすることができる。ＰＴＬまたはＰＰＲＯＭのいずれかに対する適切な介入は、必ずしも排他的である必要はないが、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬの患者の個々のリスクに適合させることができる。焦点を合わせた処置アプローチを使用して、一般的自然早産リスクのある患者を処置するために使用される従来の介入方法と比較して、妊娠継続期間を延長させることができ、および／または新生児転帰を向上させることができる。例としては、これらに限定されないが、ＰＰＲＯＭリスクのある女性に対して抗生物質をより初期に予防的に使用すること、およびＰＴＬに関連する徴候または症状がより初期でおそらくはより軽度であるうちに早産防止薬を提供することが挙げられる。

本発明は、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーからなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む組成物を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜２１、４２、４３、および４５〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６、２２〜３６、４２、および４４〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１、ならびに表６〜２１、４２、４３、および４５〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、上記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図２、ならびに表６、２２〜３６、４２、および４４〜６７に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、上記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む方法を提供する。

用語「反転値」は、２つの分析物の存在量に対応する相対的ピーク面積の比を指し、変動性の正規化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。一部の実施形態では、反転値は、上方制御された分析物（互換的に「存在量が過大な」を指し、本明細書で使用される場合、上方制御は、単に相対的存在量の観察を指す）の相対的ピーク面積の、下方制御された分析物（互換的に「存在量が過少な」を指し、本明細書で使用される場合、下方制御は、単に相対的存在量の観察を指す）の相対的ピーク面積に対する比を指す。一部の実施形態では、反転値は、ある上方制御された分析物の相対的ピーク面積の、上方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する比を指し、その場合、一方の分析物は、他方の分析物と比べて上方制御の度合いが異なる。一部の実施形態では、反転値は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積の、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する比を指し、その場合、一方の分析物は、他方の分析物と比べて下方制御の度合いが異なる。反転の１つの有利な態様は、２つの分析物には補完的な情報が存在し、そのためその２つを組み合わせることにより、いずれか１つのみの場合よりも目的の状態が良好に診断されることである。好ましくは、２つの分析物の組み合わせは、目的ではない生物医学的状態、分析前変動性、および／または分析変動性を補償することによりシグナルノイズ比を増加させる。サブセットは、狭いウィンドウ内のあらゆる考え得る反転の中から、個々の単変量性能に基づいて選択することができる。加えて、サブセットは、トレーニングセットでの二変量または多変量性能に基づいて選択し、ヘルドアウトデータ（held-out data）またはブートストラップ反復で試験することができる。例えば、ロジスティックまたは線形回帰モデルを、任意選択で、Ｌ１もしくはＬ２または他のペナルティによるパラメータ縮小推定（parameter shrinkage）で訓練し、１個抜き（leave-one-out）、１対抜き（leave-pair-out）、もしくは倍数個抜き（leave-fold-out）相互検証で、または置換によるブートストラップサンプリングで、またはヘルドアウトデータセットで試験することができる。一部の実施形態では、分析物値それ自体は、内因性分析物のピーク面積の、対応する安定同位体標準分析物のピーク面積のそれに対する比であり、本明細書では応答比または相対比と呼ばれる。本明細書に開示されているように、２つの分析物の存在量に対応する相対的ピーク面積の比、例えば、本明細書では反転値と呼ばれる、上方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積の、下方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積に対する比を使用して、ロバストで正確な分類子（classifier）を特定し、早産確率を予測し、満期出産の確率を予測し、出生時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測し、出産までの時間を予測し、および／または妊娠女性の予防療法の進行をモニタリングすることができる。したがって、本発明は、部分的には、バイオマーカー対の相対的発現が反転し、ＰＴＢと非ＰＴＢとの間で反転値の変化を示すバイオマーカー対を特定することに基づく。本明細書で開示されている方法にてバイオマーカーの比を使用することにより、妊娠女性から生物学的試料を取り出した後の人為的操作の結果である変動性が補正される。そのような変動性は、例えば、試料に存在するバイオマーカーの測定に使用される方法の試料収集中に、処理中に、枯渇中に、消化中に、または任意の他のステップ中に導入される可能性があり、バイオマーカーが自然界においてどのように挙動するかとは無関係である。したがって、本発明は、概して、変動性を低減するための、および／または診断シグナルを増幅、正規化、もしくは明瞭化するための、診断または予後の方法における反転対の使用を包含する。

用語「反転値」は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する上方制御された分析物の相対的ピーク面積の比を指し、変動性の正規化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たすが、本発明のバイオマーカーの対は、任意の他の手段、例えば相対的ピーク面積の減算、加算、または乗算により測定することができることも企図される。本明細書で開示されている方法は、そのような他の手段によるバイオマーカー対の測定を包含する。

本方法は、データ正規化に依存せず、過剰フィッティング（overfitting）の回避を支援し、診療所で簡単に実施される非常に単純な実験検査をもたらす、考え得る最も単純な分類子を提供するため有利である。データ正規化に依存しない反転値の変化に基づくマーカー対の使用は、本明細書で開示されている臨床関連バイオマーカーの開発を可能にした。任意の単一のタンパク質の定量化は、測定変動性、通常のゆらぎ（normal fluctuation）、およびベースライン発現の個体に関連する変動、ならびに目的ではない状態に関連する突発的変動または系統的変動により引き起こされる不確実性の影響下にあるため、協調的かつ系統的な調節下にありえるマーカーの対を特定することにより、個別化された診断および予後のロバストな方法が可能になる。

本開示は、妊娠女性の早産確率を決定するためのバイオマーカー反転対および反転対の関連パネル、方法、およびキットを提供する。本開示の１つの主な利点は、早期出産を予防するための適切なモニタリングおよび臨床管理を適時に開始することができるように、早産を発症するリスクを妊娠初期に評価することができることである。本発明は、早産のリスク要因を一切欠き、他の方法で特定および処置されないであろう女性にとって特に有益である。加えて、本発明は、未知の追加のリスクがある可能性があり、本発明の方法により提供される分析から利益を得ることができる、プロゲステロン（progersterone）療法を受けている女性に有益である。

例として、本開示は、早産を予測する反転値の変化を示すことが特定されたバイオマーカー対の相対的発現に関する定量データを少なくとも含む、試料に関連するデータセットを得ること、およびこのデータセットを、データセットを使用して妊娠女性の早産確率を決定するのに有用な結果を生成する分析プロセスに入力することにより、妊娠女性の早産確率を決定するのに有用な結果を生成するための方法を含む。以下にさらに記載する通り、定量的データは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝物、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のための代用物としての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組み合わせを含むことができる。

例えば、公共のデータベース、配列、または参考文献における受託番号により、本開示において特定された特定のバイオマーカーに加えて、本発明では、また、現在公知である、または後に発見される、本発明の方法のための有用性を有する例示の配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるバイオマーカー変異体の使用が検討される。これらの変異体は、多型、スプライス変異体、突然変異などを示しうる。この点において、本明細書は、本発明の文脈において、複数の当技術分野において公知のタンパク質を開示し、１つまたは複数の公的データベースならびにこれらの当技術分野において公知のタンパク質に関連する公開された雑誌論文への例示的な参考文献に関連付けられた例示的な受託番号を提供する。しかし、当業者は、開示されたバイオマーカーの追加の特徴を提供できる、追加の受託番号および雑誌記事を簡単に特定でき、例示の参照は、開示されたバイオマーカーに関して決して限定的ではないことを理解する。本明細書に記載される通り、種々の技術および試薬では、本発明の方法における使用が見出される。本発明の文脈における適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群より選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。本明細書において記載する通り、バイオマーカーは、当技術分野において公知の種々のアッセイおよび技術を介して検出することができる。本明細書においてさらに記載される通り、そのようなアッセイは、非限定的に、質量分析（ＭＳ）ベースのアッセイ、抗体ベースのアッセイならびに両者の側面を組み合わせたアッセイを含む。

一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に列挙されている対を含む群から選択される少なくとも１対のバイオマーカーの反転値を測定することを含む方法を提供する。

本発明は、本明細書で開示されているバイオマーカーの代用ペプチドに対応する安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を提供する。本発明のバイオマーカー、それらの代用ペプチド、およびＳＩＳペプチドは、妊娠女性の早産リスクを予測するための方法に使用することができる。

一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、本明細書で開示されているバイオマーカーまたはバイオマーカーの対の個々の発現レベルまたは反転値を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。追加の実施形態では、試料は、１９〜２１週のＧＡＢＤで得られる。さらなる実施形態では、試料は、１９〜２２週のＧＡＢＤで得られる。

特定のバイオマーカーに加えて、本開示は、さらに、例示の配列と約９０％、約９５％、または約９７％同一であるバイオマーカー変異体を含む。変異体は、本明細書において使用される通り、多型、スプライス変異体、突然変異などを含む。反転値の変化は、タンパク質バイオマーカーを参照して説明されているが、バイオマーカーの対の、タンパク質発現レベルで特定してもよく、または遺伝子発現レベルで特定してもよい。

追加のマーカーは、これらに限定されないが、母体の特徴、病歴、過去の妊娠歴、および産科歴を含む、１つまたは複数のリスク兆候から選択することができる。そのような追加のマーカーとしては、以下のものを挙げることができる：例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頚部および子宮の異常、短い頚部長測定値、妊娠出血、子宮内胎児発育制限（intrauterine growth restriction）、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症（つまり、尿路感染症）、喘息、不安およびうつ病、喘息、高血圧、甲状腺機能低下症。早産の人口統計学的なリスク兆候としては、以下のものを挙げることができる：例えば、母体年齢、人種／民族、独身婚姻状態、低い社会経済的状況、母側の教育（maternal education）、母体年齢、雇用関連の身体活動、職業被曝および環境被爆、ならびにストレス。さらなるリスク兆候としては、以下のものを挙げることができる：不適切な出生前ケア、喫煙、マリファナおよび他の違法薬物の使用、コカイン使用、アルコール消費、カフェイン摂取、母体の体重増加、食事摂取、妊娠後期中の性的活動、ならびに余暇の身体活動（Preterm Birth: Causes, Consequences, and Prevention、Institute of Medicine (US) Committee on Understanding Premature Birth and Assuring Healthy Outcomes；Behrman RE、Butler AS編、Washington (DC)：National Academies Press (US)；２００７年）。マーカーとして有用な追加のリスク兆候は、線形判別分析、サポートベクターマシン分類、再帰的特徴排除（recursive feature elimination）、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴ、ＦｌｅｘＴｒｅｅ、ＬＡＲＴ、ランダムフォレスト、ＭＡＲＴ、および／または生存分析回帰などの、当技術分野で公知の学習アルゴリズムを使用して特定することができる。これらは、当業者に公知であり、本明細書でさらに説明されている。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。このように、例えば、「バイオマーカー」への参照は、２個またはそれ超のバイオマーカーの混合物などを含む。

用語「約」は、特に所与の量を参照して、プラスまたはマイナス５パーセントの逸脱を包含することを意味する。

添付の特許請求の範囲を含めた本願において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含み、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」と互換的に使用される。

本明細書において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」およびそれらの任意の変化形は、非排他的な包含を対象とすることを意図しており、エレメントまたはエレメントのリストを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物は、それらのエレメントのみを含むわけではなく、そのようなプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物に明らかに列挙されていない、またはそれらに固有ではない他のエレメントを含みうる。

本明細書において使用する場合、用語「パネル」は、１個または複数のバイオマーカーを含む組成物、例えばアレイまたはコレクションなどを指す。この用語は、また、本明細書において記載する１個または複数のバイオマーカーの発現パターンのプロファイルまたは指標を指しうる。バイオマーカーパネルのために有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組み合わせについての感度および特異度の値に基づく。

本明細書で使用される場合、別様の指示がない限り、用語「単離された」および「精製された」は、一般的に、その天然環境（例えば、それが自然に存在する場合は、自然環境）から取り出されており、したがって、構造、機能、および特性の少なくとも１つに関して著しく異なる特徴を有するように、その天然状態から人為的に変更されている組成物を記述する。単離されたタンパク質または核酸は、それが自然界に存在する様式とは異なっており、合成ペプチドおよびタンパク質を含む。

用語「バイオマーカー」は、生物学的分子、または生物学的分子の断片を指し、その変化および／または検出は、特定の身体条件または状態と相関しうる。用語「マーカー」および「バイオマーカー」は、本開示を通して互換的に使用される。例えば、本発明のバイオマーカーは、早産の増加した可能性と相関する。そのようなバイオマーカーは、任意の適切な分析物を含み、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のための代用物としての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組み合わせ（例えば、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質）を含む生物学的分子を含むが、これらに限定されない。この用語は、また、生物学的分子の部分または断片、例えば、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも６個の連続アミノ酸残基、少なくとも７個の連続アミノ酸残基、少なくとも８個の連続アミノ酸残基、少なくとも９個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１１個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２個の連続アミノ酸残基、少なくとも１３個の連続アミノ酸残基、少なくとも１４個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１６個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７個の連続アミノ酸残基、少なくとも１８個の連続アミノ酸残基、少なくとも１９個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２１個の連続アミノ酸残基、少なくとも２２個の連続アミノ酸残基、少なくとも２３個の連続アミノ酸残基、少なくとも２４個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、またはそれ超の連続アミノ酸残基を含むタンパク質またはポリペプチドのペプチド断片を包含する。

本明細書で使用される場合、用語「代用ペプチド」は、ＭＲＭアッセイ構成で目的のバイオマーカーを定量化するための代用物としての役割を果たすように選択されているペプチドを指す。代用ペプチドの定量化は、ＭＲＭ検出技法と共に、安定同位体標識標準代用ペプチド（「ＳＩＳ代用ペプチド」または「ＳＩＳペプチド」）を使用すると、最も良好に達成される。代用ペプチドは合成であってもよい。例えば、アルギニンまたはリジンが、またはＭＲＭアッセイの内部標準としての役割を果たすペプチドのＣ末端の任意の他のアミノ酸が重標識されたＳＩＳ代用ペプチドを合成することができる。ＳＩＳ代用ペプチドは、天然に存在するペプチドではなく、その天然に存在する相当物と比較して著しく異なる構造および特性を有する。

一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に開示されているバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１対のバイオマーカーの比を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含み、妊娠女性と満期対照との間に比の変化が存在することが、妊娠女性の早産確率を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、比は、上方制御されたタンパク質を分子に含み、下方制御されたタンパク質を分母またはその両方に含んでいてもよい。例えば、バイオマーカー比は、上方制御されたタンパク質を分子に含み、下方制御されたタンパク質を分母に含んでいてもよく、これは、本明細書では「反転」と定義される。比が、上方制御されたタンパク質を分子に含むか、または下方制御されたタンパク質を分母に含む場合、いずれのタンパク質も、正規化の役割を果たす（例えば、分析前変動性または分析変動性を低減する）ことができる。比が「反転」である特定の場合では、増幅および正規化の両方が可能である。本発明の方法は、反転のサブセットに制限されず、バイオマーカーの比も包含することが理解される。バイオマーカーの比は、例えば、上方制御されたタンパク質を分子に含み、制御されないタンパク質を分母に含んでいてもよく、同様に制御されないタンパク質を分子に含み、下方制御されたタンパク質を分母に含んでいてもよい。これらの例では、制御されないタンパク質は、正規化群としての役割を果たすだろう。

本明細書で使用される場合、用語「反転対」は、比較されているクラス間の値の変化を示す、対になったバイオマーカーを指す。反転対は、いずれか一方のバイオマーカーのみの場合よりも良好にデータを分類する２つのバイオマーカーからなる。タンパク質濃度または遺伝子発現レベルの反転を検出することにより、データ正規化または集団全体にわたる閾値確立の必要性が排除される。任意の反転対の定義内には、個々のバイオマーカーが分子と分母との間で交換されている対応する反転対が包含される。当業者であれば、そのような対応する反転対は、その予測力に関して、等しく有益な情報をもたらすことを認識するだろう。さらに、当業者であれば、これらに限定されないが、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーを含む、本明細書に記載の反転対において特徴付けられるバイオマーカーも、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、バイオマーカー値が、反転以外の算出方法で利用される、例えば、バイオマーカーの２つもしくはそれよりも多くが互いから減算される、および／または他の数学的演算が適用されるか、もしくはロジスティック方程式において使用される、方法にとって有益な情報をもたらすことができることを理解する。

本明細書で開示されているように、反転法は、データ正規化に依存せず、過剰フィッティングの回避を支援し、診療所で簡単に実施される非常に単純な実験検査をもたらす、考え得る最も単純な分類子を提供するため有利である。本明細書に記載されているような、データ正規化に依存しない反転に基づくバイオマーカー対の使用は、臨床的に関連するＰＴＢバイオマーカーを特定するための方法として、非常に高い能力を有する。任意の単一タンパク質の定量化は、測定変動性、通常のゆらぎ、およびベースライン発現の個体に関連する変動により引き起こされる不確実性の影響下にあるため、協調的かつ系統的な調節下にありえるマーカーの対を特定することは、個別化された診断および予後についてよりロバストであることを証明するはずである。

一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に列挙されているバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１対のバイオマーカーの反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。

出産までの時間を断定（predicate）することに向けられる方法については、「出産、出生」は、破水を伴うまたは伴わない、陣痛の自然発症に続く出産を意味すると理解される。

妊娠女性において早産についての確率を決定する方法を参照して記載および例示したが、本開示は、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）を予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間（ＴＴＢ）を予測する方法に、同様に適用可能である。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。

さらに、本開示は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法を参照して記載および例示されているが、同様に、異常グルコース検査、妊娠糖尿病、高血圧、子癇前症、子宮内胎児発育制限、死産、子宮内胎児発育制限、ＨＥＬＬＰ症候群、羊水過少（oligohyramnios）、絨毛羊膜炎、絨毛羊膜炎、前置胎盤、癒着胎盤（placental acreta）、剥離、早期剥離胎盤、胎盤出血、予定日前の早期破水、早期陣痛、不利な子宮頚部、過期妊娠、胆石症、子宮過膨張（uterine over distention）、ストレスを予測するための方法に応用可能である。下記でより詳細に記載されているように、本明細書に記載の分類子は、例えば、子癇前症または妊娠糖尿病等の状態に基づいて医学的に適用されたＰＴＢの成分に感受性である。

一部の実施形態では、本開示は、出産までの時間（ＴＴＢ）の強力な予測因子であるバイオマーカー、バイオマーカー対、および／または反転を提供する。ＴＴＢは、ＧＡＢＤと出生時妊娠期間（ＧＡＢ）との間の差として定義される。この発見は、個々にまたはそのような分析物の数学的組み合わせのいずれかで、ＴＴＢまたはＧＡＢの予測を可能にする。症例対対照差を欠如するが、妊娠全体にわたって分析物強度の変化を示す分析物は、本発明の方法による妊娠時計（pregnancy clock）に有用である。他の障害の早産の診断をすることができない複数の分析物の較正を使用して、妊娠日数を決定することができる可能性がある。そのような妊娠時計は、別の尺度による日数決定（例えば、最終月経周期の日付および／または超音波による日数決定）を確認するために、または例えばｓＰＴＢ、ＧＡＢ、もしくはＴＴＢを単独で事後におよびより正確に予測するために有用である。本明細書では「時計タンパク質」と呼ばれるこうした分析物を、他の日数決定法を用いずにまたは共に使用して、妊娠日数を決定することができる。

追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、さらに、早産に関連する１つまたは複数のリスク兆候についての測定可能な特徴を検出することを包含する。追加の実施形態において、リスク兆候は、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、妊婦、初妊婦、経産婦、胎盤異常、子宮頚部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内胎児発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、および泌尿生殖器感染症からなる群より選択される。

「測定可能な特徴」は、対象において早産についての確率で決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様である。この用語は、さらに、妊娠女性におけるＧＡＢの予測、満期出産の予測、または出産までの時間の予測との関連において決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様を包含する。バイオマーカーについては、そのような測定可能な特徴は、例えば、生物学的試料におけるバイオマーカーまたはその断片の存在、非存在、もしくは濃度、変化した構造、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは量、例えばバイオマーカーのアミノ酸配列上の１つまたは複数の位置での酸化など、または、例えば、出産予定日制御（term control）対象におけるバイオマーカーの立体構造と比較して変化した立体構造の存在、および／または、１個を上回るバイオマーカーのプロファイルの一部としてのバイオマーカーの存在、量、もしくは変化した構造などを含みうる。

バイオマーカーに加えて、測定可能な特徴としては、例えば、母体の特徴、教育、年齢、人種、民族、病歴、過去の妊娠歴、産科歴を含むリスク兆候がさらに挙げられる。リスク兆候の場合、測定可能な特徴としては、以下のものを挙げることができる：例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頚部および子宮の異常、短い頚部長測定値、妊娠出血、子宮内胎児発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症、甲状腺機能低下症、喘息、低学業成績、喫煙、薬物使用、およびアルコール消費。

一部の実施形態では、本発明の方法は、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）を算出することを含む。

一部の実施形態において、早産の確率を決定するための開示方法は、質量分析、捕捉剤、またはそれらの組み合わせを使用して１個または複数のバイオマーカーを検出および／または定量化することを包含する。

追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、妊娠女性からの生物学的試料を用意する最初のステップを包含する。

一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、医療提供者に確率を連絡することを包含する。ＧＡＢを予測する開示方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法は、同様に、医療提供者に確率を連絡することを包含する。上記の通り、妊娠女性において早産についての確率を決定することを参照して記載および例示したが、本開示を通して記載した全ての実施形態は、ＧＡＢを予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法に、同様に適用可能である。具体的には、早産についての方法を明らかに参照した、本願を通して挙げられるバイオマーカーおよびパネルは、ＧＡＢを予測するための方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法において使用することもできる。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。

追加の実施形態において、連絡によって、妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する。一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、リスクスコアとして確率を表現する追加の特徴を包含する。

本明細書で開示されている方法では、妊娠女性の早産確率を決定することは、出生時妊娠期間が既知である早産妊娠および満期妊娠のコホート中の群から選択される単離されたバイオマーカーの比を測定することにより確率／リスク指標を形成することを含む初期ステップを包含する。個々の妊娠の場合、妊娠女性の早産確率を決定することは、確率／リスク指標を生成する初期ステップで使用されるものと同じ測定方法を使用して、単離されたバイオマーカーの比を測定すること、および測定した比をリスク指標と比較して、個々の妊娠の個別化されたリスクを導出することを包含する。

本明細書で使用される場合、用語「リスクスコア」は、妊娠女性から得られた生物学的試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの量または反転値を、妊娠女性のランダムプール（random pool）から得られた生物学的試料から算出された１つまたは複数のバイオマーカーの平均量を表す標準または参照スコアと比較することに基づいて割り当てることができるスコアを指す。一部の実施形態では、リスクスコアは、反転値、つまり個々のバイオマーカーの相対強度の比の対数として表される。当業者であれば、リスクスコアは、種々のデータ変換に基づいて表すことができ、ならびに比自体として表すこともできることを理解するだろう。さらに、特に反転対に関して、任意の比は、分子および分母のバイオマーカーを交換しても、関連するデータ変換（例えば減算）を適用しても、同様に有益な情報をもたらすことを、当業者であれば理解するだろう。バイオマーカーのレベルは、妊娠の全体にわたって静的ではない場合があるため、標準または参照スコアは、試料が採取された時点の妊娠女性の妊娠時点に対応する妊娠時点で得られなければならない。対象について確率が決定される毎に実際に比較が実施されるのではなく、比較が間接的であるように、標準または参照スコアを事前に決定して、予測因子モデルに組み込むことができる。リスクスコアは、標準（例えば、数値）であってもよく、または閾値（例えば、グラフの線）であってもよい。リスクスコアの値は、妊娠女性のランダムプールまたは選択されたプール（selected pool）のいずれかから得られた生物学的試料から算出される、１つまたは複数のバイオマーカーの平均量からの上方または下方の偏差に相関する。ある特定の実施形態では、リスクスコアが標準または参照リスクスコアよりも大きい場合、妊娠女性は、早産の可能性増加を有する場合がある。一部の実施形態では、妊娠女性のリスクスコアの大きさ、またはリスクスコアが参照リスクスコアを超過する量は、その妊娠女性のリスクレベルを示すことができるか、または相関している場合がある。

本発明は、１つまたは複数の個々のバイオマーカーならびに単一および複数の反転を含む分類子を含む。性能向上は、１つよりも多くの反転から形成される予測因子を構築することにより達成することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の分析物は、多変量パネル中の複数の他の分析物に対する正規化群として作用する場合がある。したがって、追加の実施形態では、本発明の方法は、例えば、別々のＧＡＢＤウィンドウ、予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）対ＰＰＲＯＭを伴わない早期陣痛（ＰＴＬ）、胎児性別、初妊婦対経産婦について、強力な予測性能を有する複数の反転を含む。複数の反転の組み合わせ（ＳｕｍＬｏｇ）から形成される予測因子の性能を、血液採取範囲全体にわたって評価することができ、個々の反転の対数値の合計（ＳｕｍＬｏｇ）から予測因子スコアを導出した。当業者であれば、他のモデル（例えば、ロジスティック回帰）を選択して、１つよりも多くの反転から形成される予測因子を構築することができる。

特許請求されている方法の予測性能は、例えば、２２よりも大きく３７ｋｇ／ｍ^２と等しいかまたはそれ未満のＢＭＩ階層化により向上させることができる。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、指定されているＢＭＩを有する妊娠女性から得られた試料で実施してもよい。手短に言えば、ＢＭＩは、個体のキログラム重量を、メートルで表される高さの２乗で除算したものである。ＢＭＩは、体脂肪を直接的に測定するものではないが、皮下脂肪厚測定、生体電気インピーダンス法、デンシトメトリー（水面下体重測定）法、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）、および他の方法から得られる体脂肪のより直接的な測定値と、ＢＭＩが相関することを示す研究がある。さらに、ＢＭＩは、身体肥満のより直接的な尺度であるため、種々の代謝および疾患転帰と強く相関すると考えられる。一般的に、１８．５未満のＢＭＩを有する個体は、体重不足であるとみなされ、１８．５またはそれ超から２４．９までのＢＭＩを有する個体は、標準体重であるとみなされ、２５．０またはそれ超から２９．９までのＢＭＩを有する個体は、太り過ぎであるとみなされ、３０．０またはそれ超のＢＭＩを有する個体は、肥満であるとみなされる。一部の実施形態では、特許請求されている方法の予測性能は、１８もしくはそれ超の、１９もしくはそれ超の、２０もしくはそれ超の、２１もしくはそれ超の、２２もしくはそれ超の、２３もしくはそれ超の、２４もしくはそれ超の、２５もしくはそれ超の、２６もしくはそれ超の、２７もしくはそれ超の、２８もしくはそれ超の、２９もしくはそれ超の、または３０もしくはそれ超のＢＭＩ階層化により向上させることができる。他の実施形態では、特許請求されている方法の予測性能は、１８もしくはそれ未満の、１９もしくはそれ未満の、２０もしくはそれ未満の、２１もしくはそれ未満の、２２もしくはそれ未満の、２３もしくはそれ未満の、２４もしくはそれ未満の、２５もしくはそれ未満の、２６もしくはそれ未満の、２７もしくはそれ未満の、２８もしくはそれ未満の、２９もしくはそれ未満の、または３０もしくはそれ未満のＢＭＩ階層化により向上させることができる。

本発明の文脈において、用語「生物学的試料」は、妊娠女性から採取された任意の試料を包含し、本明細書中に開示されるバイオマーカーの１個または複数を含む。本発明の文脈において適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群より選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。当業者により理解される通り、生物学的試料は、血液の任意の画分または成分、非限定的に、Ｔ細胞、単球、好中球、赤血球、血小板、および微小胞、例えばエキソソームおよびエキソソーム様小胞などを含みうる。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。

本明細書で使用される場合、用語「早産」は、満３７週未満の妊娠期間での分娩（delivery）または出産を指す。他の一般的に用いられる早産のサブカテゴリが確立されており、わすかに早期（妊娠３３〜３６週での出産）、非常に早期（妊娠＜３３週での出産）、および極めて早期（妊娠≦２８週での出産）と規定されている。本明細書で開示されている方法に関して、当業者は、早産と満期出産とを規定するカットオフならびに早産のサブカテゴリを規定するカットオフを、本明細書で開示されている方法の実施時に調整して、例えば、特定の健康利益を最大化にすることができることを理解する。本発明の種々の実施形態では、早産を規定するカットオフとしては、例えば、妊娠≦３７週での出産、妊娠≦３６週での出産、妊娠≦３５週での出産、妊娠≦３４週での出産、妊娠≦３３週での出産、妊娠≦３２週での出産、妊娠≦３０週での出産、妊娠≦２９週での出産、妊娠≦２８週での出産、妊娠≦２７週での出産、妊娠≦２６週での出産、妊娠≦２５週での出産、妊娠≦２４週での出産、妊娠≦２３週での出産、または妊娠≦２２週での出産が挙げられる。一部の実施形態では、早産を規定するカットオフは、妊娠≦３５週である。そのような調整は、当業者とみなされる個人の技術セット内に十分に入るものであり、本明細書で開示されている本発明の範囲内に包含されることがさらに理解される。妊娠期間は、胎児発達および胎児出生準備の程度の代理指標である。妊娠期間は、典型的には、最後の正常月経の日付から出産日までの期間として定義されている。しかしながら、産科学的な尺度および超音波による推定でも、妊娠期間の推定を支援することができる。早産は、一般的に、２つの別個のサブグループに分類されている。１つ目は自然早産であり、その後の陣痛増大または帝王切開に関わらず、早期陣痛または予定日前の早期破水の自然開始後に生じるものである。２つ目は医学的に適用される早産であり、女性の介護者が母親および／または胎児の健康または生命を脅かすと決定する１つまたは複数の状態のために誘発または帝王切開を行った後でおよび自然陣痛開始の非存在下で生じるものである。また、命に関わる理由以外の随意の早産も、医学的に適用されたものと称されることになる場合がある。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、自然早産または医学的に適用される早産の確率を決定することに向けられる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、自然早産確率を決定することに向けられる。追加の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、医学的に適用される早産に向けられる。追加の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、出生時妊娠期間を予測することに向けられる。

本明細書において使用する場合、用語「推定された妊娠期間」または「推定されたＧＡ」は、最後の正常な月経の日付および追加の産科対策、超音波推定値、または非限定的に、前項において記載されるものを含む他の臨床パラメータに基づいて決定されるＧＡを指す。対照的に、用語「予測される出生時の妊娠期間」または「予測されたＧＡＢ」は、本明細書において開示する本発明の方法に基づいて決定されたＧＡＢを指す。本明細書において使用する場合、「満期出産」は妊娠期間満３７週に等しいまたはそれを過ぎた出生を指す。

一部の実施形態では、妊娠女性は、ＧＡＢＤ（血液採取時妊娠期間）とも呼ばれる、生物学的試料が収集される時点で、妊娠１７〜２８週である。他の実施形態では、妊娠女性は、生物学的試料が収集される時点で、妊娠１６〜２９週、１７〜２８週、１８〜２７週、１９〜２６週、２０〜２５週、２１〜２４週、または２２〜２３週である。さらなる実施形態では、妊娠女性は、生物学的試料が収集される時点で、妊娠約１７〜２２週、約１６〜２２週、約２２〜２５週、約１３〜２５週、約２６〜２８、または約２６〜２９週である。したがって、生物学的試料が収集される時点での妊娠女性の妊娠期間は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０週であってもよい。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２１週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２２週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２１週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２２週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１８週の妊娠期間に収集される。さらなる実施形態では、連続または重複した時間ウィンドウで最も性能のよい反転を、単一の分類子と組み合わせて、血液採取時妊娠期間のより広いウィンドウにわたってｓＰＴＢの確率を予測することができる。

用語「量」または「レベル」は、本明細書において使用される場合、生物学的試料および／または対照中での検出可能または測定可能であるバイオマーカーの量を指す。バイオマーカーの量は、例えば、ポリペプチドの量、核酸の量、または断片もしくは代用物の量でありうる。この用語は、代わりに、それらの組み合わせを含みうる。バイオマーカーの用語「量」または「レベル」は、そのバイオマーカーの測定可能な特徴である。

また、本発明は、妊娠女性の図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に指定されているバイオマーカー対からなる群より選択される１つもしくは複数のバイオマーカーまたは単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法を提供する。１つまたは複数の個々のバイオマーカーを検出する場合、上記方法は、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、上記１つまたは複数のバイオマーカーの各々と特異的に結合する捕捉剤と接触させ、１つまたは複数のバイオマーカーの各々と対応する１つまたは複数の捕捉剤との結合を検出することにより、１つまたは複数のバイオマーカーが生物学的試料に存在するか否かを検出するステップを含む。バイオマーカー対を検出する場合、上記方法は、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、上記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および上記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させ、上記対の第１のバイオマーカーと第１の捕捉剤との結合および上記対の第２のメンバーと第２の捕捉剤との結合を検出することにより、単離されたバイオマーカーの対が生物学的試料に存在するか否かを検出するステップを含む。

一実施形態では、試料は、１９〜２１週の妊娠期間に得られる。さらなる実施形態では、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体からなる群より選択される。追加の実施形態では、本方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群より選択されるアッセイにより実施される。

一実施形態では、本発明は、生物学的試料中に存在する１つまたは複数の単離されたバイオマーカーまたは単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、試料を、質量分析定量化で構成されるプロテオミクスワークフローにかけることを含む方法を提供する。

「プロテオミクスワークフロー」は、一般的に、下記ステップの１つまたは複数を包含する：血清試料を解凍し、１４個の最も存在量が多いタンパク質を免疫親和性クロマトグラフィーで枯渇させる。枯渇させた血清を、プロテアーゼ、例えばトリプシンで消化して、ペプチドを産出する。その後、消化物をＳＩＳペプチドの混合物で強化してから脱塩し、ＭＲＭモードで操作される三連四重極機器を備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかける。内因性ペプチドピークおよび対応するＳＩＳペプチド相当物ピークの面積比から、応答比を形成する。当業者であれば、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはＥＳＩ−ＴＯＦ等の他のタイプのＭＳを本発明の方法に使用することができることを認識する。例えば、加えて、当業者であれば、特定の試薬（プロテアーゼ等）を選択することにより、またはあるステップを省くかもしくは順序を変更することにより、プロテオミクスワークフローを改変することができる。例えば、免疫枯渇は必要ではない場合があり、ＳＩＳペプチドを以前にまたは後で添加してもよく、安定同位体標識タンパク質を、ペプチドの代わりに標準として使用してもよい。

任意の既存の、入手可能な、または従来の分離、検出、および定量化の方法を本明細書において使用して、試料中のバイオマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはそれら断片の、ならびに、任意選択で、１個または複数の他のバイオマーカーまたはそれらの断片の存在もしくは非存在（例えば、読み出しが存在対非存在；または検出可能な量対検出不可能な量）および／または量（例えば、読み出しが絶対量または相対量、例えば、絶対濃度または相対濃度など）を測定することができる。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、捕捉剤を利用するアッセイを含む。さらなる実施形態において、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体である。追加の実施形態において、アッセイは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、質量分析（ＭＳ）をさらに含む。またさらなる実施形態において、質量分析は共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ ＭＳ）であり、全タンパク質複合体の単離のために適切な技術である共免疫沈降に質量分光分析が続く。

本明細書で使用する場合、用語「質量分析計」は、分析物を揮発／イオン化し、気相イオンを形成し、それらの絶対または相対分子量を決定することができるデバイスを指す。揮発／イオン化の適切な方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、レーザー／光、熱、電気、霧化／噴霧など、またはそれらの組み合わせである。質量分析法の適切な形態は、イオントラップ機器、四重極機器、静電磁場セクター機器、飛行時間機器、飛行時間タンデム質量分析計（ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ）、フーリエ変換質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、およびこれらの型の質量分析器の種々の組み合わせで構成されるハイブリッド機器を含むが、これらに限定されない。これらの機器は、次に、試料を分画する（例えば、液体クロマトグラフィーまたは化学的もしくは生物学的特徴に基づく固相吸着技術）、および質量分析計に導入するための試料をイオン化する（マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、もしくはナノスプレーイオン化（ＥＳＩ）、またはそれらの組み合わせを含む）他の種々の機器と適合させることができる。

一般的に、ペプチドの質量に関する、好ましくは、また、選択されたペプチドの断片化および／または（部分的）アミノ酸配列に関する正確な情報を提供することができる任意の質量分析（ＭＳ）技術（例えば、タンデム質量分析、ＭＳ／ＭＳ；または、ポストソース分解、ＴＯＦ ＭＳ）は、本明細書において開示する方法において使用することができる。適切なペプチドのＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術ならびにシステムは、それ自体が周知であり（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４６巻：「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２０００年；Ｂｉｅｍａｎｎ １９９０年 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９３巻：４５５〜７９頁；またはＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４０２巻：「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００５年を参照のこと）、本明細書において開示する方法を実行する際に使用することができる。したがって、一部の実施形態において、開示する方法は、１個または複数のバイオマーカーを測定するために定量的ＭＳを実施することを含む。そのような定量的方法は、自動（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６年）１巻（２号）：８８０〜８９１頁）または半自動化フォーマットにおいて実施することができる。特定の実施形態において、ＭＳは、液体クロマトグラフィーデバイス（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ）、またはガスクロマトグラフィーデバイス（ＧＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）に動作可能に連結することができる。この文脈において有用な他の方法は、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）、または細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を含み、クロマトグラフィーおよびＭＳ／ＭＳが続く。

本明細書で使用する場合、用語「多重反応モニタリング（ＭＲＭ）」または「選択反応モニタリング（ＳＲＭ）」は、少量である分析物を定量化するために特に有用であるＭＳベースの定量方法を指す。ＳＲＭ実験において、事前に定義された前駆体イオンおよびその断片の１つまたは複数は、三連四重極機器の２つの質量フィルタにより選択され、正確な定量化のために経時的にモニターされる。複数のＳＲＭ前駆体および断片イオン対は、ＭＲＭ実験を実施するために異なる前駆体／断片対の間で迅速にトグルさせることにより、クロマトグラフタイムスケールで同じ実験内で測定することができる。標的分析物（例えば、ペプチドまたは小分子、例えば化学物質、ステロイド、ホルモンなど）の保持時間と組み合わせた一連のトランジション（前駆体／断片イオン対）は、最終的なアッセイを構成することができる。多数の分析物は、単一のＬＣ−ＭＳ実験の間に定量化することができる。ＭＲＭまたはＳＲＭへの参照における用語「スケジュール」または「ダイナミック」は、アッセイのバリエーションを指し、特定の分析物についてのトランジションが、予想保持時間の周囲の時間ウィンドウにおいてだけ取得され、単一のＬＣ−ＭＳ実験において検出および定量化することができる分析物の数を有意に増加させ、テストの選択性に寄与する。なぜなら、保持時間は、分析物の物理的性質に依存した特徴であるからである。単一の分析物を、また、１を上回るトランジションを用いてモニターすることができる。最後に、目的の分析物（例えば、同じアミノ酸配列）に対応するが、安定同位体の包含により異なる標準がアッセイに含まれうる。安定同位体標準（ＳＩＳ）は、正確なレベルでのアッセイ中に組み入れられ、対応する未知の分析物を定量化するために使用することができる。追加レベルの特異性が、未知の分析物およびその対応するＳＩＳの共溶出ならびにそれらのトランジションの特徴（例えば、未知の２つのトランジションのレベルの比率およびその対応するＳＩＳの２つのトランジションの比率における類似性）により寄与される。

バイオマーカーペプチド分析のために適切な質量分析アッセイ、機器、およびシステムは、非限定的に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソース分解（ＰＳＤ）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）_ｎ（ｎはゼロよりも大きい整数である）；ＥＳＩ ３Ｄまたは線形（２Ｄ）イオントラップＭＳ；ＥＳＩ三連四重極ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳシステム；シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）；二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）；大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−（ＭＳ）_ｎ；イオン移動度分光分析（ＩＭＳ）；誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）；大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）_ｎを含みうる。タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）配置におけるペプチドイオンの断片化は、当技術分野において確立された様式、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）などを使用して達成することができる。本明細書に記載する通り、質量分析によるバイオマーカーの検出および定量化は、例えば、とりわけ、Ｋｕｈｎら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ４巻：１１７５〜８６頁（２００４年）により記載される多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含みうる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間のスケジュールされた多重反応モニタリング（スケジュールされたＭＲＭ）モード取得によって、ペプチド定量化の感度および精度が増強される。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５巻（４号）：５７３頁（２００６年）。本明細書に記載する通り、質量分析ベースのアッセイは、有利には、上流ペプチドまたはタンパク質の分離または分画方法、例えば、クロマトグラフィーおよび本明細書において以下に記載する他の方法などと組み合わせることができる。本明細書においてさらに記載する通り、ショットガン定量的プロテオミクスを、ハイスループット同定および早産の予後バイオマーカーの検証のためのＳＲＭ／ＭＲＭベースのアッセイと組み合わせることができる。

当業者は、いくつかの方法を、バイオマーカーの量を決定するために使用することができることを理解するであろう（質量分析アプローチ、例えばＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、またはＳＲＭ、および産物イオンモニタリング（ＰＩＭ）などを含む、ならびに、また、抗体ベースの方法、例えばイムノアッセイなど、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳなどを含む）。したがって、一部の実施形態において、少なくとも１個のバイオマーカーのレベルを決定することは、イムノアッセイおよび／または質量分析法を使用することを含む。追加の実施形態において、質量分析法は、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＳＲＭ、ＰＩＭ、および当技術分野において公知の他のそのような方法から選択される。他の実施形態において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、さらに、１Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、２Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、または３Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む。イムノアッセイ技術およびプロトコールは、一般的に、当業者に公知である（ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２版、Ｇｒｏｖｅ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ、１９９７年およびＧｏｓｌｉｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００年）。競合的および非競合的イムノアッセイを含む種々のイムノアッセイ技術を使用することができる（Ｓｅｌｆら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７巻：６０〜６５頁（１９９６年））。

さらなる実施形態において、イムノアッセイは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳから選択される。ある特定の実施形態において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡである。またさらなる実施形態において、ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、多重ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ技術、および当技術分野において公知の他の同様の技術である。これらのイムノアッセイ法の原理は、当技術分野において公知である（例えば、Ｊｏｈｎ Ｒ． Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ、第１版、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２０００年、ＩＳＢＮ ０８９６０３７２８２）。典型的には、ＥＬＩＳＡは抗体を用いて実施されるが、それらは、本発明の１個または複数のバイオマーカーに特異的に結合し、検出することができる任意の捕捉剤を用いて実施することができる。多重ＥＬＩＳＡによって、通常は複数のアレイアドレスで、単一の区画（例えば、マイクロプレートウェル）内での２つまたはそれ超の分析物の同時検出が可能になる（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＧｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ ２００４年、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０巻：１０７〜２０頁（２００４年）およびＬｉｎｇら、２００７年、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ ７巻：８７〜９８頁（２００７年））。

一部の実施形態において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、本発明の方法において１個または複数のバイオマーカーを検出することができる。ＲＩＡは、当技術分野において周知である競合ベースのアッセイであり、放射活性標識（例えば、^１２５Ｉまたは^１３１Ｉ標識）標的分析物の既知量と分析物に特異的な抗体を混合すること、次に試料からの非標識分析物を添加すること、および置換された標識分析物の量を測定することを含む（例えば、ガイダンスについては、Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈａｒｄ Ｔ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５年、ＩＳＢＮ ０４４４８２１１９８を参照のこと）。

検出可能な標識は、本発明の方法におけるバイオマーカーの直接的または間接的な検出のために、本明細書において記載するアッセイにおいて使用することができる。多様な検出可能な標識を使用することができ、標識の選択は、要求される感度、抗体とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な機器および廃棄規定に依存する。当業者は、本発明の方法におけるバイオマーカーのアッセイ検出に基づいて、適切な検出可能な標識の選択に精通している。適切な検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリンなど）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属などを含むが、これらに限定されない。

質量分析ベースの分析のために、同位体試薬を用いた異なるタグ付け（例えば、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）または同重体タグ付け試薬、ｉＴＲＡＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を使用したより最近のバリエーション、またはタンデム質量タグ、ＴＭＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析が続く）は、本発明の方法を実行する際にさらなる方法論を提供することができる。

化学発光抗体を使用した化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出のために使用することができる。蛍光色素で標識された抗体も、適切でありうる。蛍光色素の例は、非限定的に、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンを含む。間接標識は、当技術分野において周知の種々の酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどを含む。西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼのための適切な基質を使用した検出システムが、当技術分野において周知である。

直接または間接標識からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出するために分光光度計；放射線を検出するための放射線カウンター、例えば^１２５Ｉの検出用のガンマカウンターなど；または、ある特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して分析することができる。酵素結合抗体の検出のために、定量的な分析は、分光光度計、例えばＥＭＡＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）などを製造業者の指示に従って使用して行うことができる。所望の場合、本発明を実行するために使用されるアッセイは、自動化する、またはロボットで実施することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。

一部の実施形態において、本明細書において記載する方法は、質量分析（ＭＳ）を使用したバイオマーカーの定量化を包含する。さらなる実施形態において、質量分析は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）でありうる。追加の実施形態において、ＭＲＭまたはＳＲＭは、さらに、スケジュールされたＭＲＭまたはスケジュールされたＳＲＭを包含しうる。

上記の通り、クロマトグラフィーは、また、本発明の方法を実行する際に使用することができる。クロマトグラフィーは、化学物質を分離するための方法を包含し、一般的に、分析物の混合物が、液体または気体の移動流（「移動相」）により運ばれ、それらが固定液体または固体相（「固定相」）の周囲またはその上を流れる際、移動相と前記固定相の間で、分析物の異なる分布の結果として成分に分離される、プロセスを含む。固定相は、通常、細かく分割された固体、フィルタ材料のシート、または固体の表面上の液体の薄膜などでありうる。クロマトグラフィーは、生物学的由来の化学的化合物、例えば、アミノ酸、タンパク質、タンパク質の断片、またはペプチドなどの分離のために適用可能な技術として当業者に十分に理解されている。

クロマトグラフィーは、柱状（即ち、固定相がカラム中に沈着または充填されている）、好ましくは液体クロマトグラフィー、さらにより好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または超高速／高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）でありうる。クロマトグラフィーの細部は、当技術分野において周知である（Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、１９９３年）。クロマトグラフィーの例示的な型は、非限定的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＵＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）（例えば陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーなど）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ゲル濾過クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む）、クロマトフォーカシング、親和性クロマトグラフィー（例えば免疫親和性、固定化金属親和性クロマトグラフィーなど）などを含む。単一、二、またはそれ超の次元のクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを、さらなるペプチド分析方法、例えば、本明細書の他の箇所に記載する下流の質量分析と併せたペプチド分画方法として使用することができる。

さらなるペプチドまたはポリペプチド分離、同定、または定量方法を、任意選択で、上に記載する分析方法のいずれかと併せて、本開示におけるバイオマーカーを測定するために使用してもよい。そのような方法は、非限定的に、化学的抽出分割、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などを含む）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）などを含む。

本発明の文脈では、用語「捕捉剤」は、標的、特にバイオマーカーと特異的に結合することができる化合物を指す。この用語は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬（例えば、アプタマー、Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ（ＳＯＭＡｍｅｒ（商標））、タンパク質捕捉剤、天然リガンド（つまり、その受容体のホルモンまたはその逆も同様）、小分子、大環状Ｎ−メチル−ペプチド阻害剤（ＰｅｐｔｉＤｒｅａｍ Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）のような天然産物、およびコノトキシンライブラリーなど、またはそれらの変異体を含む。

捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーに特異的に結合するように構成することができる。捕捉剤は、有機分子、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、および当業者に同定可能である他の非ポリマー分子などを含みうるが、これらに限定されない。本明細書において開示する実施形態において、捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーを検出、精製、単離、または富化するために使用することができる任意の薬剤を含む。任意の当技術分野で公知の親和性捕捉技術を使用して、開示方法における使用のための生物学的培地の複雑な混合物の成分であるバイオマーカーを選択的に単離および富化／濃縮することができる。

バイオマーカーに特異的に結合する抗体捕捉剤は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して調製することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）を参照のこと。抗体捕捉剤は、天然の、または全体的もしくは部分的に合成的に産生されたかを問わず、任意の免疫グロブリンまたはその誘導体でありうる。特異的結合能力を維持する全てのその誘導体もこの用語に含まれる。抗体捕捉剤は、免疫グロブリン結合ドメインに相同である、または大部分が相同である結合ドメインを有し、天然供給源から誘導することができる、または部分的もしくは全体的に合成的に産生することができる。抗体捕捉剤は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。一部の実施形態において、抗体は一本鎖抗体である。当業者は、抗体が、例えば、ヒト化、部分的ヒト化、キメラ、キメラヒト化などを含む種々の形態のいずれかで提供することができることを理解するであろう。抗体捕捉剤は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、およびＦｄ断片を含むが、これらに限定されない抗体断片でありうる。抗体捕捉剤は、任意の手段により産生することができる。例えば、抗体捕捉剤は、インタクトな抗体の断片化により酵素的または化学的に産生することができ、および／または、それは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生することができる。抗体捕捉剤は、一本鎖抗体断片を含むことができる。あるいは、または加えて、抗体捕捉剤は、例えば、ジスルフィド結合により一緒に連結された複数の鎖；および、そのような分子から得られる任意の機能的断片（それにおいて、そのような断片は、親抗体分子の特異的結合特徴を保持する）を含むことができる。分子全体の機能性成分としてのそれらのより小さなサイズのため、抗体断片は、ある特定の免疫化学的技術および実験的適用における使用のためのインタクトな抗体を上回る利点を提供することができる。

本発明の実行のために有用な適切な捕捉剤は、アプタマーも含む。アプタマーは、固有の三次元（３−Ｄ）構造を介して特異的にその標的に結合することができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができ、異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学的に修飾された核酸でありえ、一本鎖、二本鎖でありうる、または二本鎖領域を含み、より高次元な構造を含みうる。アプタマーは、また、光反応性または化学的に反応性の官能基が、それが共有結合的にその対応する標的に結合することができるように、アプタマーに含まれる、フォトアプタマーでありうる。アプタマー捕捉剤の使用は、同じバイオマーカーに特異的に結合する２つまたはそれ超のアプタマーの使用を含みうる。アプタマーは、タグを含みうる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）プロセスを含む任意の公知の方法を使用して同定することができる。一度、同定された場合、アプタマーを、化学的合成法および酵素的合成法を含む、任意の公知の方法に従って調製または合成し、バイオマーカー検出のための種々の適用において使用することができる。Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１８巻（２７号）：４１１７〜２５頁（２０１１年）。本発明の方法を実行する際に有用な捕捉剤は、また、当技術分野において公知のＳＯＭＡｍｅｒ（Ｓｌｏｗ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ａｐｔａｍｅｒ）を含み、改善されたオフレート特徴を有する。Ｂｒｏｄｙら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２２巻（５号）：５９５〜６０６頁（２０１２年）。ＳＯＭＡｍｅｒは、ＳＥＬＥＸ法を含む任意の公知の方法を使用して生成することができる。

バイオマーカーを分析前に修飾して、それらの解像度を改善する、またはそれらの同一性を決定することができることが当業者により理解される。例えば、バイオマーカーは、分析前に、タンパク質分解消化に供することができる。任意のプロテアーゼを使用することができる。バイオマーカーを別個の数の断片に切断する可能性のあるプロテアーゼ、例えばトリプシンなどは特に有用である。消化に起因する断片は、バイオマーカーのためのフィンガープリントとして機能し、それにより、それらの検出を間接的に可能にする。これは、問題のバイオマーカーについて混同されうる、同様の分子量を伴うバイオマーカーがある場合に特に有用である。また、タンパク質分解断片化は、高分子量のバイオマーカーのために有用である。なぜなら、より小さなバイオマーカーは、質量分析により、より簡単に分解されるためである。別の例において、バイオマーカーを修飾して、検出分解能を改善することができる。例えば、ノイラミニダーゼを使用して糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去し、アニオン性吸着剤への結合を改善し、検出分解能を改善させることができる。別の例において、バイオマーカーは、分子バイオマーカーに特異的に結合する、特定の分子量のタグの付着により修飾することができ、それらをさらに区別する。任意選択で、そのような修飾されたバイオマーカーを検出した後、バイオマーカーの同一性は、さらに、タンパク質データベース（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）において修飾バイオマーカーの物理的および化学的特徴をマッチングさせることにより決定することができる。

試料中のバイオマーカーを、検出用に基材上で捕捉することができることが、当技術分野においてさらに理解されている。伝統的な基材は、タンパク質の存在についてその後にプローブされる抗体コーティング９６ウェルプレートまたはニトロセルロース膜を含む。あるいは、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロビーズ、ビーズ、または他の粒子に付着されたタンパク質結合分子をバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。タンパク質結合分子は、抗体、ペプチド、ペプトイド、アプタマー、小分子リガンド、または粒子の表面に付着した他のタンパク質結合捕捉剤でありうる。各々のタンパク質結合分子は、コードされる固有の検出可能な標識を含むことができ、他のタンパク質結合分子に付着した他の検出可能な標識と区別し、多重アッセイにおいてバイオマーカーの検出を可能にすることができる。例は、公知の蛍光強度を伴うカラーコードマイクロスフェア（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）により産生されたｘＭＡＰ技術を用いたマイクロスフェアを参照のこと）；量子ドットナノ結晶を含む、例えば、量子ドットカラーの異なる比率および組み合わせを有するマイクロスフェア（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＱｄｏｔナノ結晶）；ガラスコート金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＳＥＲＳナノタグを参照のこと）；バーコード材料（例えば、サブミクロンサイズのストライプ金属ロッド、例えばＮａｎｏｐｌｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により産生されたＮａｎｏｂａｒｃｏｄｅなどを参照のこと）、カラーバーコードを伴うコード微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍにより産生されたＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、デジタルホログラフィックコードイメージを伴うガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）；化学発光色素、色素化合物の組み合わせ；および検出可能な異なるサイズのビーズを含むが、これらに限定されない。

別の態様において、バイオチップを、本発明のバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。多くのタンパク質バイオチップが、当技術分野において公知である。これらは、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ Ｃｏｎｎ．）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）により産生されるタンパク質バイオチップを含む。一般的に、タンパク質バイオチップは、表面を有する基質を含む。捕捉試薬または吸着剤は、基質の表面に付着される。頻繁には、表面は、複数のアドレス可能な位置を含み、その各々の位置が、そこに結合した捕捉剤を有する。捕捉剤は、生物学的分子、例えばポリペプチドまたは核酸などでありうるが、それらは、他のバイオマーカーを特異的に捕捉する。あるいは、捕捉剤は、クロマトグラフィー材料、例えば陰イオン交換物質または親水性物質などでありうる。タンパク質バイオチップの例は、当技術分野において周知である。

一実施形態では、本発明は、バイオマーカーのレベルを測定するための試薬のセットであって、バイオマーカーが、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３６、および４２〜６７に示されているバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーの１つまたは複数である試薬のセットを提供する。そのような試薬としては、これらに限定されないが、本発明のバイオマーカーを検出するための、上記に記載されているものなどの本明細書に記載されている試薬が挙げられる。そのような試薬を使用して、例えば、本発明の１つまたは複数のバイオマーカーの量またはレベルを測定することができる。

また、本開示は、バイオマーカー対の反転値の変化を測定することを含む、早産確率を予測するための方法を提供する。例えば、生物学的試料を、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合剤を含むパネルと接触させてもよい。その後、検出されたバイオマーカーの１つまたは複数の発現を、下記に開示されている方法により、例えば、核酸増幅法を使用してまたは使用せずに評価してもよい。当業者であれば、本明細書に記載の方法では、遺伝子発現の測定を自動化することができることを認識する。例えば、遺伝子発現の多重測定を実施することができる、例えば数百のｍＲＮＡ種の相対存在量の同時デジタル測定を提供するシステムを使用することができる。

一部の実施形態では、核酸増幅法を使用して、ポリヌクレオチドバイオマーカーを検出することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、様々な周知で確立されている方法（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A laboratory Manual、７．３７〜７．５７頁（第２版、１９８９年）；Linら、Diagnostic Molecular Microbiology, Principles and Applications、６０５〜１６頁（Persingら編（１９９３年）；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology（２００１年およびその後の最新版））のいずれかにより単離される核酸基質を使用する増幅および検出方法に使用することができる。核酸を増幅する方法としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号を参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Weiss、Science、２５４巻：１２９２〜９３頁（１９９１年））、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（例えば、Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年）；米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号を参照）、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）（例えば、欧州特許第０ ６８４ ３１５号）、および米国特許第５，１３０，２３８号；Lizardiら、BioTechnol.、６巻：１１９７〜１２０２頁（１９８８年）；Kwohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：１１７３〜７７頁（１９８９年）；Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻：１８７４〜７８頁（１９９０年）；米国特許第５，４８０，７８４号；第５，３９９，４９１号；米国特許出願公開第２００６／４６２６５号に記載されている方法。

一部の実施形態において、生物学的試料中のｍＲＮＡの測定は、生物学的試料中の対応するタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するための代用として使用することができる。このように、本明細書に記載するバイオマーカー、バイオマーカー対またはバイオマーカー反転パネルのいずれかを、適当なＲＮＡを検出することにより検出することもできる。ｍＲＮＡレベルを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲが続く）により測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイにおいて使用して、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、絶対測定値、例えば細胞１個当たりのｍＲＮＡコピー数などを産生することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲの全てを使用して、試料中のｍＲＮＡの発現レベルが測定されてきた。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ． Ｓｈｉｍｋｅｔｓ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと。

本明細書で開示される一部の実施形態は、妊娠女性において早産についての確率を決定する診断方法および予後診断方法に関する。１個または複数のバイオマーカーの発現レベルの検出および／またはバイオマーカーの比率の決定を使用して、妊娠女性における早産についての確率を決定することができる。そのような検出方法は、例えば、状態の早期診断のために使用することができ、対象に早産の素因があるか否かを判断する、早産の進行または処置プロトコールの進行をモニターする、早産の重症度を評価する、早産の転帰および／または回復もしくは満期出産の見通しを予測する、または早産のための適切な処置の決定を助ける。

生物学的試料中でのバイオマーカーの定量化は、非限定的に、上に記載する方法ならびに当技術分野において公知の任意の他の方法により決定することができる。このようにして得られた定量的データは、次に分析的な分類プロセスに供する。そのようなプロセスにおいて、例えば、本明細書において提供する実施例において記載する通り、生データを、データのトレーニングセットにより事前に定義されているアルゴリズムに従って操作される。アルゴリズムでは、本明細書において提供するデータのトレーニングセットを利用することができる、または、本明細書において提供するガイドラインを利用して、データの異なるセットを用いてアルゴリズムを生成することができる。

一部の実施形態では、測定可能な特徴を分析して妊娠女性の早産確率を決定することは、予測モデルの使用を包含する。さらなる実施形態では、測定可能な特徴を分析して妊娠女性の早産確率を決定することは、上記測定可能な特徴を参照特徴と比較することを包含する。当業者であれば理解することができるように、そのような比較は、参照特徴との直接比較であってもよく、または参照特徴が予測モデルに組み込まれている間接比較であってもよい。さらなる実施形態では、測定可能な特徴を分析して妊娠女性の早産確率を決定することは、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、線形、ロジスティック、Ｃｏｘ比例ハザードまたは加速故障寿命（Accelerated Time to Failure）回帰モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法（penalized regression method）、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数を包含する。特定の実施形態では、分析はロジスティック回帰を含む。

分析的な分類プロセスでは、種々の統計的分析方法のいずれか１つを使用して、定量的データを操作し、試料の分類を提供することができる。有用な方法の例は、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズムなどを含む。

ＧＡＢの予測のためのランダムフォレストを作成するために、当業者は、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）が公知であり、Ｎ個の分析物（トランジション）が、出産の数週間前に採取された血液検体中で測定されているｋ名の対象（妊娠女性）の組を考慮することができる。回帰ツリーは、全ての対象を含むルートノードから開始する。全ての対象についての平均ＧＡＢは、ルートノードにおいて算出することができる。ルートノード内のＧＡＢの分散は高くなる。なぜなら、異なるＧＡＢを伴う女性の混合があるからである。ルートノードを、次に、２つのブランチに分割し（パーティション）、各ブランチが、類似のＧＡＢを伴う女性を含むようにする。各ブランチにおける対象についての平均ＧＡＢを再び算出する。各ブランチ内のＧＡＢの分散は、ルートノードより低くなる。なぜなら、各ブランチ内の女性のサブセットは、ルートノード中のものより、比較的類似したＧＡＢを有するからである。２つのブランチを、分析物、および類似のＧＡＢを伴うブランチを作成する分析物についての閾値を選択することにより作成する。分析物および閾値は、全ての分析物および閾値の組の間から選ばれ、通常、各ノードで分析物のランダムなサブセットを伴う。手順は、ブランチを再帰的に産生し続け、対象が非常に類似したＧＡＢを有するリーフ（末端ノード）を作成する。各末端ノードにおける予測されたＧＡＢは、その末端ノードにおける対象についての平均ＧＡＢである。この手順によって、単一の回帰ツリーが作成される。ランダムフォレストは、数百または数千のそのようなツリーからなりうる。

分類は、試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデル方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％またはそれより高い。分類は、また、得られたデータセットと参照データセットの間での比較によって、統計的な有意差がもたらされるか否かを決定することにより行うことができる。もしそうである場合、次にデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属さないとして分類される。逆に、そのような比較が、参照データセットと統計的に有意に異ならない場合、そのデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属するとして分類される。

モデルの予測能力は、品質メトリックを提供するその能力に従って評価することができる（例えば、特定の値、または値の範囲のＡＵＲＯＣ（ＲＯＣ曲線下面積）または精度）。曲線下面積の測定値は、完全なデータ範囲にわたり分類子の精度を比較するために有用である。より大きなＡＵＣ（曲線下面積）を伴う分類子は、目的の２群間で未知数を正確に分類するより大きな能力を有する。一部の実施形態において、所望の品質閾値は、少なくとも約０．５、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、またはそれより高い精度を伴い試料を分類する予測モデルである。代替測定値として、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高いＡＵＣを伴う試料を分類する予測モデルを指しうる。

当技術分野において公知の通り、予測モデルの相対的な感度および特異性は、選択メトリックまたは感度メトリックのいずれかを優先するように調整することができ、ここで、２つのメトリックは反比例関係を有する。上に記載するモデルにおける制限は、実施されているテストの特定の要件に依存して、選択された感度または特異性のレベルを提供するように調整することができる。感度および特異性の１つまたは両方が、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高くなりうる。

生データは、各バイオマーカーの値を、通常は三連でまたは複数の三連で測定することにより初期分析することができる。しかしながら、分析物が、使用されるアッセイにより適切に測定することができる限り、反復した測定値は必要ではないことが理解される。データは、操作することができる。例えば、生データは、標準曲線を使用して変換することができ、三連測定値の平均を使用して、各患者の平均および標準偏差を算出することができる。こうした値は、モデルで使用する前に変換、例えば、対数変換、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換してもよい（BoxおよびCox、Royal Stat. Soc., Series B、２６巻：２１１〜２４６頁（１９６４年）。その後、データを予測モデルに入力し、それにより試料が、状態に応じて分類されることになる。得られた情報は、患者または医療従事者に伝えることができる。

早産についての予測モデルを生成するために、公知の対照試料および目的の早産分類に対応する試料を含む、頑強なデータセットが、トレーニングセットにおいて使用される。試料サイズは、一般的に受け入れられている基準を使用して選択することができる。上で考察する通り、異なる統計的方法を使用して、高度に正確な予測モデルを得ることができる。そのような分析の例を、実施例２に提供する。

一実施形態において、階層的クラスタリングが、予測モデルの誘導において実施され、そこでは、ピアソン相関がクラスタリングメトリックとして用いられる。１つのアプローチは、「教師あり学習」の問題において「学習試料」として早産データセットを検討することである。ＣＡＲＴは、医療への適用における標準であり（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９年））、任意の定性的特徴を定量的特徴に変換すること；ホテリングＴ^２統計について試料再利用方法により評価された、達成された有意水準によりそれらを選別すること；および投げ縄方法の適切な適用により改変することができる。予測における問題は、回帰の品質を評価する際の分類のためのジニ基準の適切な使用を実際に行うことにより、予測の視力喪失を伴わず、回帰における問題になる。

このアプローチは、ＦｌｅｘＴｒｅｅと呼ばれるものに導いた（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ １０１巻：１０５２９〜１０５３４頁（２００４年））。ＦｌｅｘＴｒｅｅは、シミュレーションにおいて、および複数の形態のデータに適用された場合、非常に上手く実施され、請求する方法を実行するのに有用である。ＦｌｅｘＴｒｅｅを自動化するソフトウェアが開発されている。あるいは、ＬＡＲＴｒｅｅまたはＬＡＲＴを使用することができる（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５年）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｒｅｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｕｂｓｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｌａｓｓｏ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。この名称は、ＣＡＲＴおよびＦｌｅｘＴｒｅｅと同様に、バイナリツリー；記載されている投げ縄；および、Ｅｆｒｏｎら（２００４年）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ３２巻：４０７〜４５１頁（２００４年）によりＬＡＲＳと呼ばれるものを通じた投げ縄の実施を反映する。また、Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．１０１巻（２９号）：１０５２９〜３４頁（２００４年）を参照のこと。使用することができる他の分析方法は、論理回帰を含む。論理回帰の１つの方法：Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １２巻：４７５〜５１２頁（２００３年）。論理回帰は、その分類子をバイナリツリーとして表示することができる点でＣＡＲＴと似ている。それは、各ノードが、ＣＡＲＴにより産生される単純な「ａｎｄ」記述よりも一般的である、特徴に関するブール記述を有する点で異なる。

別のアプローチは、最も近い収縮重心のアプローチである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９９巻：６５６７〜７２頁（２００２年））。この技術は、ｋ−ｍｅａｎｓ様であるが、クラスター中心を収縮させることにより、投げ縄の場合と同様に、自動的に特徴を選択し、情報価値のある少数のものに注意を集中するという利点を有する。このアプローチは、ＰＡＭソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。使用することができるアルゴリズムの２つのさらなる組は、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５巻：５〜３２頁（２００１年））およびＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１年））である。これらの２つの方法は、転帰に「投票」する予測因子を含む「コミッティ方法」として当技術分野において公知である。

有意な順序を提供するために、偽発見率（ＦＤＲ）を決定することができる。最初に、相違値のヌル分布のセットが生成される。一実施形態において、観察されたプロファイルの値は、順序を変え、偶然に得られる一連の相関係数の分布を作成し、それにより相関係数のヌル分布の適切なセットを作成する（Ｔｕｓｈｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ ９８巻、５１１６〜２１頁（２００１年））。ヌル分布のセットは、全ての利用可能なプロファイルの各プロファイルの値の順序を変え；全てのプロファイルについてペアワイズ相関係数を算出し；この並べ替えについて相関係数の確率密度関数を算出し；この手順をＮ回（ここで、Ｎは大きな数、通常は３００である）にわたり繰り返すことにより得られる。Ｎ分布を使用して、それらの値が、所与の有意水準での実験的に観察された相似値の分布から得られる（相似の）値を超える、相関係数値のカウントの適当な測定値（平均値、中央値など）を算出する。

ＦＤＲは、予想される偽有意相関の数（ランダム化データセットにおける、この選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）と、経験的データにおける、この選択されたピアソン相関（有意な相関）よりも大きい相関の数の比率である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間の相関に適用することができる。上記の分布を使用して、信頼性の水準を有意性について選ぶ。これを使用して、偶然により得られたであろう結果を超える相関係数の最小値を決定する。この方法を使用して、正相関、負相関、またはその両方の閾値を得る。この閾値を使用して、使用者は、ペアワイズ相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値を超えないものを排除することができる。さらに、偽陽性率の推定値を、所与の閾値について得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、どれだけ多くの観察が閾値範囲外にあるのか見出すことができる。この手順は、一連のカウントを提供する。シーケンスの平均値および標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数およびその標準偏差を提供する。

代替の分析アプローチにおいて、断面分析において選ばれた変数は、時間事象分析（生存分析）における予測因子として別々に用いられ、そこでは、事象は早産の発生であり、事象を伴わない対象は、出産時に打ち切られたと見なされる。特定の妊娠転帰（早産事象または無事象）を仮定し、各患者が観察されるランダムな時間長、ならびにプロテオミクスおよび他の特徴の選択、生存を分析するパラメトリックアプローチが、広く適用されるセミパラメトリックＣｏｘモデルよりも良好でありうる。生存のワイブルパラメトリック適合は、ハザード比が、単調に増加する、減少する、または一定であることを可能にし、また、比例ハザード表現（Ｃｏｘモデルの場合と同様）および加速故障時間表現を有する。回帰係数のおおよその最尤推定量および対応する関数を得る際に利用可能な全ての標準的なツールは、このモデルにおいて利用可能である。

加えて、Ｃｏｘモデルを使用することができる。特に、なぜなら、投げ縄で管理可能なサイズまでの共変量数の低下によって、分析が有意に簡素化され、早産までの時間の予測に対するノンパラメトリックまたはセミパラメトリックなアプローチの可能性を与える。これらの統計ツールは、当技術分野において公知であり、プロテオミクスデータの全ての様式に適用可能である。簡単に決定することができ、前記妊娠女性における早産についての確率および早産事象までの予測時間に関して高度に情報価値があるバイオマーカー、臨床データ、および遺伝子データの組が提供される。また、アルゴリズムは、妊娠女性における早産についての確率に関する情報を提供する。

したがって、当業者は、本発明に従った早産についての確率を、量的またはカテゴリ変数のいずれかを使用して決定することができることを理解する。例えば、本発明の方法を実行する際、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を、カテゴリデータ分析に供し、バイナリカテゴリ転帰として早産についての確率を決定することができる。あるいは、本発明の方法は、量的変数、特に予測される出生時の妊娠期間を最初に算出することにより、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を分析しうる。予測される出生時の妊娠期間を、その後に、早産のリスクを予測するための基礎として使用することができる。最初に、量的変数を使用し、その後に量的変数をカテゴリ変数に変換することにより、本発明の方法では、測定可能な特徴について検出された測定値の連続を考慮に入れる。例えば、早産対満期出産のバイナリ予測を行うよりもむしろ、出生時の妊娠期間を予測することにより、処置を妊娠女性に合わせて個別化することが可能である。例えば、より早期の予測される出生時の妊娠期間は、満期に近づく予測された妊娠期間よりも、集中的な出生前介入、即ち、モニタリングおよび処置をもたらすであろう。

ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性の間で、ｐ（ＰＴＢ）を、実際に３７週の妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定することができる（実施例１を参照のこと）。より一般的には、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性については、出生時の実際の妊娠期間が指定された妊娠期間未満である確率ｐ（実際のＧＡＢ＜指定されたＧＡＢ）を、実際に指定された妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定した。

予測モデルの開発においては、マーカーの完全なセットまで、マーカーのサブセット、即ち、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６を選択することが望ましいことがある。通常、精度の高い予測モデルを維持しながら、定量的な試料分析に必要なもの、例えば、試薬の可用性、定量の便宜などを提供するマーカーのサブセットを選ぶ。分類モデルを構築するためのいくつかの情報価値のあるマーカーの選択では、性能メトリックの定義および、このメトリックに基づく有用な予測能力を伴うモデルを産生するための、使用者が定義する閾値が要求される。例えば、性能メトリックは、ＡＵＣ、予測の感度および／または特異性、ならびに予測モデルの全体的な精度でありうる。

当業者により理解される通り、分析的な分類プロセスでは、定量的データを操作し、試料の分類を提供するための、種々の統計分析方法のいずれか１つを使用することができる。有用な方法の例は、非限定的に、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、および機械学習アルゴリズムを含む。種々の方法が訓練モデルにおいて使用される。マーカーのサブセットの選択は、マーカーサブセットの前進選択または後方選択についてでありうる。全てのマーカーを使用することなくモデルの性能を最適化するマーカーの数を選択することができる。最適数の項目を定義するための１つの方法は、所与のアルゴリズムについて使用される項目の任意の組み合わせおよび数を使用して、このメトリックについて得られた最大値からの１以下の標準誤差がある、所望の予測能力（例えば、ＡＵＣ＞０．７５、または感度／特異性の等価の測定値）を伴うモデルを産生する項目数を選ぶことである。

さらに別の態様では、本発明は、早産確率を決定するためのキットを提供する。キットは、バイオマーカーの検出のための１つまたは複数の薬剤、妊娠女性から単離された生物学的試料を保持するための容器；および、生物学的試料中の単離されたバイオマーカーの存在または量を検出するために、生物学的試料または生物学的試料の一部と薬剤を反応させるための印刷された指示を含むことができる。薬剤は、別々の容器に包装することができる。キットは、さらに、イムノアッセイを実施するための１つまたは複数の対照参照試料および試薬を含むことができる。

キットは、キットに含まれる組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。組成物は、液体形態でありうる、または凍結乾燥することができる。組成物のための適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む、種々の材料から形成することができる。キットは、また、早産の確率を決定する方法についての指示書を含む添付文書を含みうる。

以上の記載から、変形形態および改変形態を、種々の使用法および条件に採用するために、本明細書に記載する本発明に対して作製することができることは明らかであろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。

本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一エレメントまたは列挙されたエレメントの組み合わせ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分との組み合わせで、その実施形態を含む。

本明細書において言及する全ての特許および刊行物が、各々の独立した特許および刊行物が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。

以下の実施例を、非限定的に、例示のために提供する。

（実施例１ ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬ表現型は、根底にある生化学的経路の差により特徴付けられる。）

目的：

予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）対特発性自然陣痛（ＰＴＬ）により、早産（ＰＴＢ）との母体バイオマーカー関連の根底にある生物学的経路を調査すること

研究設計：

早産リスク研究のプロテオミクス評価の二次ネステッド症例−対照分析。本発明者らは、１９５対象（３９例のｓＰＴＢ＜３７週：１７例のＰＰＲＯＭおよび２２例のＰＴＬ；１５６例の満期対照）から１９１／７〜２０６／７週にて前向きに収集された試料に由来する臨床特徴および血清を分析した。臨床変数を、カイ二乗検定、フィッシャー直接確率検定、または二標本ウィルコクソン検定を必要に応じて使用して分析した。複数のｓＰＴＢ経路を表す６３個のタンパク質の母体血清レベルを、多重反応モニタリング質量分析法を使用して測定した。受信者動作曲線下面積を、各タンパク質について生成した。ＰＰＲＯＭまたはＰＴＬ対満期で発現が異なるか（ＡＵＣ≧０．６４およびｐ値≦０．０５）またはＰＰＲＯＭ対ＰＴＬで発現が異なるタンパク質を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）経路分析を使用して分類した。

方法

早産リスク研究のプロテオミクス評価の二次分析（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１３７１０１９）

妊娠１９１／７〜２０６／７週で血清を前向きに収集した：３９例のＳＰＴＢ＜３７週：１７例のＰＰＲＯＭ、および２２例のＰＴＬ、１５６例の一致した満期対照。

臨床変数分析：カイ二乗またはフィッシャー直接確率検定

質量分析解析：（１）６３個のタンパク質を多重反応モニタリングにより測定した；（２）各タンパク質の受信者動作曲線下面積およびｐ値を算出した；（３）ＰＰＲＯＭまたはＰＴＬ対満期で発現が異なるタンパク質を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）経路分析を使用して分析した（ＡＵＣ≧０．６４およびｐ値≦０．０５）。

ＰＰＲＯＭ症例またはＰＴＬ症例と満期対照との間で、年齢、人種／民族、および経産に有意差はない。ＰＰＲＯＭコホートのＢＭＩ中央値（３３．１）は、ＰＴＬ症例（２４．９）および満期対照（２５．７）よりも高かった。統計的に有意ではないが（ｐ＝０．１３）、ＰＰＲＯＭコホートの女性は、ＰＴＬコホート（２５４日）よりも早く（２４４日）出産した。下記の表１に示されているように、ＰＴＬ対満期よりもＰＰＲＯＭ対満期で、発現が異なるタンパク質がより多く、より幅広いセットの経路が包含されていた。

ＰＰＲＯＭ対満期対照で発現が異なるタンパク質は、下記の表２に示されている。

ＰＴＬ対満期対照で発現が異なるタンパク質は、下記の表３に示されている。

症例と対照との間で、人種または民族に有意差はなかった。予想通り、出生時妊娠期間および以前の満期出産数は、症例と対照との間で有意に異なっていた（表４）。加えて、ＢＭＩは、ＰＰＲＯＭ対満期でより高かった（表４）。測定した６３個のタンパク質のうち２３個は、ＰＰＲＯＭ対満期間で有意に異なっていた。経路マップ（図１）には、サブセット（太字：ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＥＮＰＰ２、ＣＯ８Ａ、ＣＯ８Ｂ、ＶＴＮＣ、ＨＡＢＰ２、ＣＯ５、ＨＥＭＯ、ＫＮＧ１、ＣＦＡＢ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＨ、ＬＢＰ、ＣＤ１４、ＦＥＴＵＡ）が示されており、１３個が、炎症および免疫応答経路にマッピングされている（太字、網掛け：ＣＯ８Ａ、ＣＯ８Ｂ、ＶＴＮＣ、ＨＡＢＰ２、ＣＯ５、ＨＥＭＯ、ＫＮＧ１、ＣＦＡＢ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＨ、ＬＢＰ、ＣＤ１４、ＦＥＴＵＡ）。４つのタンパク質は、ＰＴＬ対満期で発現が異なり、全てが、成長制御に関与する経路にマッピングされた（図２）（太字、網掛け：ＩＢＰ４、ＩＧＦ２、ＩＢＰ３、ＰＳＧ３）。ＰＰＲＯＭをＰＴＬと比較すると、ＰＰＲＯＭで富化されているタンパク質は、血管新生、急性期応答、および先天免疫の調節に役割を有していた。

結論：

早期出産した女性の妊娠第２期母体血清タンパク質プロファイルは、ＰＰＲＯＭ対ＰＴＬでは異なっていた。ＰＰＲＯＭ対満期女性で特定されたバイオマーカーセットが多様であることは、ＰＰＲＯＭそれ自体が複数の生物学的基盤を有することを示唆している。ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬバイオマーカーを包含する多重分析物予測因子は、ＳＰＴＢのリスクのある女性をより良好に特定し、処置選択肢の指針を示すことができる。

（実施例２ ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬ表現型に関するさらなる研究）

実施例１の研究を、より多数の分析物を用いて、妊娠期間に基づく異なるデータサブセットで繰り返した。単変量分析に加えて、この実施例は、ＰＰＲＯＭ対満期、ＰＴＬ対満期、およびＰＰＲＯＭ対ＰＴＬの２分析物反転（上方制御されたタンパク質／下方制御されたタンパク質）の評価を含む。最後に、高性能ＰＰＲＯＭ対満期反転を高性能ＰＴＬ対満期反転と組み合わせることにより全体的な早産を予測するために、および各表現型に対して高度に選択的な反転の組み合わせを使用してＰＰＲＯＭ対ＰＴＬを区別するために、反転の対を評価した。

研究設計：

早産リスク研究のプロテオミクス評価の二次ネステッド症例−対照分析。本発明者らは、妊娠１１９〜１５３日で前向きに収集した試料に由来する臨床特徴および母体血清を分析した。データ分析は、重複する３週間のウィンドウ（１１９〜１３９日、１２６〜１４６日、および１３３〜１５３日）に分割した試料中で、およびＰｒｅＴＲＭアッセイで指定されている商業的ウィンドウ（１３４〜１４６日）で、コホート全体（１１９〜１５３日）を使用して実施した。臨床変数を、カイ二乗検定、フィッシャー直接確率検定、または二標本ウィルコクソン検定を必要に応じて使用して分析した。複数のｓＰＴＢ経路を表す１０９個のタンパク質＋品質管理のために使用した追加の１４個のタンパク質の母体血清レベルを、多重反応モニタリング質量分析法を使用して測定した。１０９個のタンパク質を、１つのタンパク質当たり１〜４個のペプチドを用いて、合計１８１個のペプチドにより定量化した。各ペプチドの受信者動作曲線下面積を生成して、ＰＰＲＯＭまたはＰＴＬ対満期およびＰＰＲＯＭ対ＰＴＬで発現が異なるタンパク質を特定した。任意のウィンドウでＡＵＣ＞０．６４を示すタンパク質を、機能カテゴリに分類した。

方法

早産リスク研究のプロテオミクス評価の二次分析（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１３７１０１９）

分析は、表示されているサンプル数（Ｎ）の、以下の妊娠期間ウィンドウに分割された。

臨床変数分析：ｔ検定、カイ二乗検定、またはフィッシャー直接確率検定を使用して、ＰＰＲＯＭ、ＰＴＬ、および満期対象を比較した（表３７〜４１）。

試料を、本質的に実施例１と同様に分析した。手短に言えば、血清試料は、Ｈｕｍａｎ １４ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＳ１４）を使用して、存在量の高いタンパク質を枯渇させた。これにより、血清プロテオームの疾患関連変化の特定に関して有益な情報をもたらさないとして扱われる最も存在量の高いタンパク質のうち１４個が除去される。この目的のため、等容積（５０μｌ）の各臨床のプールしたヒト血清試料（ＨＧＳ）、またはヒトのプールした妊婦血清試料（ｐＨＧＳ）を、１５０μｌのＡｇｉｌｅｎｔカラム緩衝液Ａで希釈し、Ｃａｐｔｉｖａフィルタープレートで濾過して、沈殿物を除去した。濾過した試料を、製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＲＳ−１４カラム（４．６×１００ｍｍ、カタログ番号５１８８−６５５８、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して枯渇させた。試料をオートサンプラーで４℃に冷却し、枯渇カラムを室温で流し、収集した画分を、さらなる分析まで４℃で維持した。未結合画分を、さらなる分析のために収集した。

枯渇させた血清試料をジチオスレイトールで還元し、ヨードアセトアミドを使用してアルキル化した。その後、５．０μｇのＴｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ−Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて１７時間（±１時間）３７℃で消化した。トリプシン消化後、安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチドの混合物を試料に添加し、各試料の半分を、Ｅｍｐｏｒｅ Ｃ１８ ９６ウェル固相抽出プレート（３Ｍ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）で脱塩した。プレートを、製造業者のプロトコールに従って前処理した。ペプチドを３００μｌの１．５％トリフルオロ酢酸、２％アセトニトリルで洗浄し、２５０μｌの１．５％トリフルオロ酢酸、９５％アセトニトリルで溶出し、３０分間−８０℃で凍結し、その後凍結乾燥で乾燥した。凍結乾燥したペプチドを、３つの非ヒト内部標準（ＩＳ）ペプチドを含有する２％アセトニトリル（acetontile）／０．１％ギ酸で再構成した。ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ＥＣ−Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ）で４００μｌ／分の３０分間アセトニトリル勾配を用いて４０℃にて分離し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６４９０三連四重極質量分析計に注入した。

質量分析解析：（１）１０９個のタンパク質を表す１８１個のペプチド、およびそれらの対応する安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチドを、多重反応モニタリングにより測定し、クロマトグラフィーピークを、Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して積分した。１８１個のペプチドにより表される１０９個のタンパク質のデータを、２つの異なる質量分析アッセイを用いて、同じ再構成されたペプチド消化物の逐次解析により生成した。第１のＬＣ−ＭＳ法により、実施例１のそうしたタンパク質を定量化し、第２のアッセイにより、追加の５０個の固有な（unque）タンパク質および２つの方法間で重複していた幾つかのタンパク質を定量化した。

（２）内因性ペプチドのピーク面積を、スパイクした合成ＳＩＳペプチドのピーク面積で除算することにより、各ペプチドの応答比を算出した。（３）各ペプチド応答比の受信者動作曲線下面積およびｐ値を算出した（表７〜３６および４２〜６７）。（４）各ＧＡＢＤウィンドウ毎に、上方制御された分析物および下方制御された分析物の組み合わせ全てを使用して、反転のセットを形成した。反転値は、上方制御された分析物の応答比の、下方制御された分析物の応答比に対する比であり、変動性の正規化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。ＡＵＣ値は、各ウィンドウでの考え得る全ての反転について、各比較毎に生成した（ＰＰＲＯＭ対満期、ＰＴＬ対満期、ＰＰＲＯＭ対ＰＴＬ）。有意なＡＵＣ値のサブセットが本明細書に報告されている（表７〜３６および４２〜６７）。単純化のために、１つのタンパク質当たり最も高いスコアの反転対のみを報告した（つまり、追加のペプチドが同様のＡＵＣ値を有する可能性があるが、反転の１つのタンパク質当たり１つのペプチドのみのＡＵＣを報告した）。各分析では、本発明者らは、反転に表されていた上方制御されたタンパク質または下方制御されたタンパク質（所与のカットオフ内の）の頻度も記録した。

次に、ＰＰＲＯＭ対満期分析の上位反転（ＡＵＣ＞＝０．７）（およびＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）を、ＰＴＬ対満期分析の上位反転（ＡＵＣ＞＝０．６５）（およびＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）と対にし、全体的な早期出産（ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬ共に）対満期出産を予測する能力を、各単一反転のみと比較して試験した。最後に、上位４００パネルの２つの反転分類子＋ＩＢＰ４／ＳＨＢＧを含有する全ての分類子の性能を、モンテカルロ相互検証（ＭＣＣＶ）分析を使用して試験した。ＭＣＣＶでは、モデルを、データの６７％で訓練し、５００回の反復を使用してデータの３３％で試験した。トレーニングセットのＡＵＣ値および信頼区間を算出した。

結果：

予想通り、全てのウィンドウで、出生時妊娠期間（ＧＡＢ）および結果的に出生時体重は、満期コホートよりもＰＰＲＯＭおよびＰＴＬコホートにおいて有意により早かった／より低かった（表３７〜４１）。ＰＰＲＯＭ症例もしくはＰＴＬ症例と満期対照との間、またはＰＰＲＯＭ症例とＰＴＬ症例との間では、いずれの分析ウィンドウでも、年齢、人種／民族、および経産に有意差は見られなかった。全てのウィンドウで、より高いＢＭＩがＰＰＲＯＭコホートで見られ、他のコホートと統計的に異なることが多かった（表３７〜４１）。完全なコホートでは以前のＰＴＢがＰＴＢの最大リスクをもたらすことを示唆するという証拠と一致して、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬコホートでは、以前のＰＴＢを有する女性のパーセンテージは、満期よりも高かった（表４１）。しかしながら、以前のｓＰＴＢを有する対象の割合の差は有意ではなく、より小さな妊娠期間ウィンドウでも一貫していなかった（表３７〜４１）。また、本発明者らは、出生時妊娠期間が、ＰＴＬよりもＰＰＲＯＭでより早い傾向があり、国家統計と一致しているが、このコホートでは、統計的有意差に到達しないことに留意する（表３７〜４１）。

下記の表６に示されているように、全てのウィンドウで、ＰＴＬ対満期よりもＰＰＲＯＭ対満期で、発現が異なるタンパク質がより多く、より幅広いセットの経路が包含されていた。

これは、ＰＴＬおよびＰＰＲＯＭがいずれも非常に異なる病因を有するか、ＰＴＬがこうした妊娠期間では予測がより困難である可能性があることを示唆する。本発明者らのデータは、免疫および炎症が、ＰＴＬよりもＰＰＲＯＭにおいてより顕著であるか、これらの応答が、ＰＴＬでは妊娠１１９〜１５３日ではまだ発生していないことを示唆する。

最後に、ＰＰＲＯＭとＰＴＬとを区別することができる反転を例示するために、本発明者らは、以下の分析を行った。満期との各比較では（ＰＰＲＯＭ対満期、ＰＴＬ対満期、ＰＴＢ対満期）、本発明者らは、ＡＵＣ＞０．５は、症例のスコアが満期よりも高いことを示し、ＡＵＣ＜０．５は、満期のスコアが症例よりも高いことを示すような比較方向を必要とした。これは、本発明者らが、満期に対するＰＰＲＯＭおよびＰＴＬの方向が反対であるスコアを有する反転を特定することを可能にした。ＰＴＬ対満期のＡＵＣに対するＰＰＲＯＭ対満期のＡＵＣの差分絶対値は、方向の差が最も大きな反転で最も大きくなるだろう。また、ＰＰＲＯＭ対ＰＴＬのＡＵＣ値を、反転のランク付けのために算出した。この場合、一貫した方向性は必要ではなかった。最終反転選択基準には、ＰＰＲＯＭ対ＰＴＬのＡＵＣが＞＝０．６５であること、およびＡＵＣ差（ＰＴＬ対満期に対するＰＰＲＯＭ対満期）が０．２であることが含まれていた。この場合、本発明者らは、分析を、１３４〜１４６日のＧＡＢＤに限定した。本発明者らは、１つのタンパク質当たり複数のペプチドが、この分析で考慮されることを可能にした。表６６には、まずＰＴＬ対満期から選択された反転から開始して、その後上記に列挙されている分析を適用した結果が要約されている。表６７には、まずＰＰＲＯＭ対満期から選択された反転から開始して、その後上記に列挙されている分析を適用した結果が要約されている。

下記の表７〜３６および４２〜６７では、分析物は、タンパク質名＿ペプチド配列として列挙されている。

本発明の他の特徴および利点は、発明を実施するための形態および特許請求の範囲から明白になるだろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
図１および２、ならびに表１〜３、６〜３８、および４４〜６８に示されているバイオマーカーからなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む組成物。
（項目２）
妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３８、および４４〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性の早産確率を決定することを含む、方法。
（項目３）
妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１、ならびに表６〜２２、４４、４５、および４７〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む、方法。
（項目４）
妊娠女性の特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図２、ならびに表６、２３〜３８、４４、および４６〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む、方法。

下記の表７〜３６および４２〜６７では、分析物は、タンパク質名＿ペプチド配列とし
て列挙されている。

Claims (4)

1. 図１および２、ならびに表１〜３、６〜３８、および４４〜６８に示されているバイオマーカーからなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む組成物。
2. 妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１および２、ならびに表１〜３、６〜３８、および４４〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性の早産確率を決定することを含む、方法。
3. 妊娠女性の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１、ならびに表６〜２２、４４、４５、および４７〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性のＰＰＲＯＭと関連する早産確率を決定することを含む、方法。
4. 妊娠女性の特発性自然陣痛（ＰＴＬ）と関連する早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図２、ならびに表６、２３〜３８、４４、および４６〜６８に示されているバイオマーカーの１つまたは複数からなる群より選択される１つまたは複数のバイオマーカーを測定して、前記妊娠女性のＰＴＬと関連する早産確率を決定することを含む、方法。