CN110191963A - 用于预测由于早产胎膜早破相对于特发性自然分娩所造成的早产的生物标志物 - Google Patents
用于预测由于早产胎膜早破相对于特发性自然分娩所造成的早产的生物标志物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于预测怀孕的雌性动物中早产概率的组合物和方法。本发明提供了包含选自图1和2以及表1至(3)、(6)至(38)和(44)至(68)中所述的生物标志物的一种或多种生物标志物的组合物。在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产(任选地与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产或者与特发性自然分娩(PTL)有关的早产)概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至(3)、(6)至(38)和(44)至(68)中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率。
Description
本发明申请主张2017年1月24日提交的美国临时专利申请No.62/449,862和2016年8月5日提交的美国临时专利申请No.62/371,666的权益，以上每篇专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
本发明一般地涉及精确医学领域，并且更具体地，涉及用于确定怀孕的雌性动物中早产概率的组合物和方法。
发明背景
根据世界卫生组织，每年估计1500万婴儿早产(妊娠第37完整周之前)。根据可靠数据，在几乎所有国家，早产率日益提高。参见，World Health Organization；March ofDimes；The Partnership for Maternal，Newborn&Child Health；Save the Children，Born too soon：the global action report on preterm birth，ISBN 9789241503433(2012)。每年估计有100万婴儿死于早产并发症。就全世界而言，早产是新生儿死亡的主要原因(出生前4周的婴儿)，而第二主要死亡原因是5岁以下儿童中的肺炎。多数存活者面临一生残疾，包括无学习能力以及视觉和听觉问题。
根据可靠数据，在184个国家，早产率在出生婴儿的5％至18％的范围内。Blencowe等人，“National，regional and worldwide estimates of preterm birth.”The Lancet，9；379(9832)：2162-72(2012)。尽管超过60％的早产发生在非洲和南亚，但早产仍是全球性问题。早产数最高的国家包括巴西、印度、尼日利亚和美国。在早产率超过15％的11个国家中，除两个国家外，全部处于下撒哈拉非洲。在最穷的国家中，平均地，12％的婴儿出生过早，相比之下，较高收入国家为9％。在国家内，较穷困家庭具有更高的风险。可以通过可行的、成本有效的护理挽救超过3/4的早产婴儿，例如，对具有早产风险的孕妇给予出生前类固醇注射以加强婴儿的肺。
对于死亡和多种健康和发育问题，早产婴儿比足月产婴儿具有更高的风险。并发症包含急性呼吸问题、胃肠问题、免疫学问题、中枢神经系统问题、听觉问题和视觉问题，以及长期运动问题、认知问题、视觉问题、听觉问题、行为问题、社会-情绪问题、健康问题和生长问题。早产婴儿的出生还可以给家庭带来大量情绪和经济成本，并且牵涉公共部门服务，如健康保险、教育及其它社会支持系统。最大的死亡和发病风险是对于那些在最早妊娠期出生的婴儿。然而，较接近足月出生的那些婴儿代表了最多数早产婴儿，并且仍经受了比足月产婴儿更多的并发症。
为了防止小于妊娠24周且超声显示宫颈打开的妇女中的早产，可以使用被称为宫颈环扎的手术程序，其中用稳固的缝合线将宫颈缝合闭合。对于小于妊娠34周并且处于主动早产分娩的妇女，住院治疗可能是必需的并且施用药物暂时停止早产分娩和/或促进胎儿肺发育。如果确定孕妇处于早产风险，则保健供应商可以实施多种临床策略，其可以包括预防性药物治疗，例如，17-α己酸羟孕酮(Makena)注射和/或阴道黄体酮凝胶、宫颈阴道栓剂、限制性生活和/或其它身体活动和改变提高早产风险的慢性病况(如糖尿病和高血压)的治疗。
急需鉴别具有早产风险的妇女，并为其提供适当的产前护理。可以对鉴别为高风险的妇女安排更密切的产前监督和预防性干预。当前用于风险评估的策略基于产科史和病史以及临床检查，但是这些策略仅能够鉴别较低比例的处于早产分娩风险的妇女。目前，先前的自发早产(sPTB)史是后续早产(PTB)的单一最强预测物。一次在先的sPTB之后，第二次PTB的概率为30-50％。其它母体风险因素包括：黑色人种、低母体体质指数和短宫颈长度。预测sPTB的羊膜水、宫颈阴道液和血清生物标志物研究表明在最终早产的妇女中多个分子途径异常。可靠的早期早产风险鉴别法将能够安排适当的监控和临床管理以预防早产分娩。这种监控和管理可以包含：更频繁的产前护理拜访、连续的宫颈长度量测、加强有关早期早产体征和症状的教育、对可改变的风险行为的生活方式干预(如戒烟)、宫颈阴道栓剂和黄体酮治疗。最后，早产风险的可靠产前鉴别法还对监控资源的成本-有效的分配是至关重要的。
尽管对鉴别风险妇女进行了大量研究，但是PTB预测算法仅基于临床和人口因素或使用测量的血清或者阴道生物标志物未导致临床有用的测试。需要在她们首次妊娠期间并且在妊娠足够早的时候鉴别处于风险的妇女的更准确的方法以使得能够进行临床干预。本发明通过提供用于确定孕妇是否处于早产风险的组合物和方法解决了该需求。还提供了相关优势。
发明概述
本发明提供了用于预测怀孕的雌性动物中早产概率的组合物和方法。
本发明提供了包含选自图1和2以及表1至3、6至36和42至67中所述的生物标志物的一种或多种生物标志物的组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至3、6至36和42至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1以及表1至3、6至21、42、43和45至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PPROM有关的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与特发性自然分娩(PTL)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图2以及表1至3、6、22至36、42和44至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PTL有关的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1以及表6至21、42、43和45至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PPROM有关的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与特发性自然分娩(PTL)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图2以及表6、22至36、42和44至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PTL有关的早产的概率。
根据详细说明和权利要求，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1显示了PPROM相对于足月产对照(加粗)中富集的蛋白质。大量这些蛋白质涉及免疫和炎症(加粗、阴影)并且与促炎细胞因子相联系。
图2显示在PTL相对于足月产(加粗、阴影)中差异表达的蛋白质与胎儿生长/发育以及胰岛素信号转导相联系。值得注意地，缺少免疫应答和炎症标志物，尽管PSG3可能在免疫耐受性中具有作用。
发明详述
本发明公开一般地基于以下发现：相对于对照，得自怀孕的雌性动物的生物样品中某些蛋白质和肽在具有高早产风险的怀孕的雌性动物中差异表达。本发明公开还具体地部分基于以下意外发现：尽管两者均早产，但是PPROM和PTL妇女具有不同的蛋白质组学谱，从而使得能够产生将对PPROM和PTL敏感的生物标志物组合的多分析物预测因子。
本文所公开的蛋白质和肽在具有PTB风险的怀孕的雌性动物中以比值、逆转对单独或以生物标志物/逆转对的组的形式用作用于对测试样品分类、预测早产概率、预测足月产概率、预测出生时胎龄(GAB)、预测分娩时间(TTB)和/或监控预防疗法发展的生物标志物。本发明部分在于可以预测早产概率的特定生物标志物的选择。本发明考虑了图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所公开的一种或多种生物标志物的组合物以及选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所公开的生物标志物的一种或多种生物标志物对的组合物。因此，选择本发明潜在的具有信息性的特异性生物标志物是人为的创造性。
将妇女的自发早产分娩风险分类为PPROM风险百分比和PTL风险百分比的能力可以用于辅助集中在延缓PTL或PPROM和准备与PTL或PPROM有关的并发症的临床决定。可以对于患者个体的PPROM和PTL风险调整适合于PTL或PPROM的干预(但不必需互相排斥)。与用于治疗处于一般自发早产风险的患者的常规干预方法相比，所集中的处理方法可以用于延长妊娠期和/或改善初生儿结局。实例包括(但不限于)在PPROM风险妇女中早期、预防性使用抗生素，和对于与PTL有关的早期，可能较轻的病征或症状提供安胎药。
本发明提供了包含选自图1和2以及表1至3、6至36和42至67中所述的生物标志物的一种或多种生物标志物的组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至3、6至36和42至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至3、6至21、42、43和45至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PPROM有关的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与特发性自然分娩(PTL)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至3、6、22至36、42和44至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PTL有关的早产概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1以及表6至21、42、43和45至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PPROM有关的早产的概率。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中与特发性自然分娩(PTL)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图2以及表6、22至36、42和44至67中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PTL有关的早产的概率。
术语“逆转值”是指对应于两个分析物的丰度的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。在一些实施方式中，逆转值是指上调(可互换地称为“过高丰度”，如本文所使用的上调简单地表示对相对丰度的观察)分析物的相对峰面积相对于下调分析物(可互换地称为“过低丰度”，如本文所使用的下调简单地表示对相对丰度的观察)的相对峰面积的比值。在一些实施方式中，逆转值是指上调分析物的相对峰面积相对于上调分析物的相对峰面积的比值，其中相对于另一分析物，一种分析物的上调程度不同。在一些实施方式中，逆转值是指下调分析物的相对峰面积相对于下调分析物的相对峰面积的比值，其中相对于另一分析物，一种分析物的下调程度不同。逆转的一个有利方面在于两种分析物中补充信息的存在，从而所述两种分析物的组合比任一种分析物单独对所关心的病况的诊断能力更强。优选地，所述两种分析物的组合通过补偿不关心的生物医学病况、分析前差异度和/或分析差异度提高了信噪比。在狭窄窗内所有可能的逆转中，可以基于各个单变量的表现来选择亚组。另外，通过对留存数据或对自举迭代进行测试，可以基于训练组中二变量或多变量的表现来选择亚组。例如，可以任选地通过L1或L2或其它惩罚，使用参数收缩来训练逻辑或线性回归模型，并且在留一法、留对法或留倍法(leave-fold-out)交叉验证或者在放回自举抽样或者在留存数据组中进行测试。在一些实施方式中，分析物的值本身就是内源分析物的峰值面积与相应稳定同位素标准分析物的峰值面积的比值，这在本文中称为：响应比或相对比。如本文所公开的，在本文中被称为逆转值的对应于两种分析物丰度的相对峰面积的比值，例如，上调生物标志物的相对峰面积与下调生物标志物的相对峰面积的比值可以在怀孕的雌性动物中用于鉴别稳健且准确的分类因子并预测早产概率、预测足月产概率、预测出生时胎龄(GAB)、预测分娩时间和/或监控预防疗法的进展。因此，本发明部分基于生物标志物对的鉴别，其中生物标志物对的相对表达逆转，其在PTB和非PTB之间的逆转值显示出变化。在本文所公开的方法中，生物标志物比值的使用修正了从怀孕的雌性动物中除去生物样品后作为人为调节的结果的差异度。这种差异度可以在(例如)用于测量样品中存在的生物标志物的方法的样品采集、处理、消耗、消化或任何其它步骤期间引入，并且所述差异度与生物标志物在本质上的表现无关。因此，本发明一般地包括了在诊断或预后方法中逆转对的使用以减少差异度和/或扩大、归一化诊断信号或使其清晰。
尽管术语逆转值是指上调分析物的相对峰面积相对于下调分析物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号，但是还考虑了可以通过任何其它方式，例如，通过相对峰面积的减法、加法或乘法来测量本发明的生物标志物对。本文所公开的方法涵盖了通过这些其它方式的生物标志物对的测量。
该方法是有利的，这是因为它提供了最简单的可能的分类因子，该分类因子独立于数据归一化，有助于避免过度拟合并且导致产生了易于在诊所中实施的非常简单的实验测试。基于独立于数据归一化的逆转值变化的标志物对的使用使得能够开发本文所公开的临床相关的生物标志物。由于任何单一蛋白的定量受到由测量差异度、正常波动和基线表达中个体相关变化以及特发性差异或与不关心的状况有关的系统变化所引起的不确定性的影响，因此可以处于协调、系统控制下的标志物对的鉴别使得能够获得用于个体诊断和预后的稳健方法。
本发明公开提供了用于确定怀孕的雌性动物中早产概率的生物标志物逆转对和相关的逆转对的组、方法和试剂盒。本发明公开的一个主要优势在于可以在妊娠早期评价发展早产的风险，从而可以以及时的方式起始适当的监控和临床管理以预防早产分娩。本发明对于缺少任何早产风险因素和将不会被鉴别和治疗的雌性动物是特别有用的。另外，本发明有益于处于孕酮疗法的妇女，她们可能处于未知的其它风险并且可以受益于由本发明所述的方法所提供的分析。
举例来说，本发明公开包括通过获得与样品有关的数据集来产生在确定怀孕的雌性动物中早产概率中有用的结果的方法，其中所述数据集至少包括有关已鉴别为显示出指示早产的逆转值变化的生物标志物对的相对表达的定量数据，和将所述数据集输入至使用所述数据集产生在确定怀孕的雌性动物中早产概率中有用的结果的分析方法。如以下进一步描述的，定量数据可以包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸、核苷、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合。
除了通过(例如)公众数据库中的登录号、序列或参考在本发明公开中鉴别的具体的生物标志物外，本发明还考虑了与所举例说明的序列具有至少90％或至少95％或至少97％的同一性并且是现在已知或随后将发现的并且对本发明所述的方法有用的生物标志物变体的使用。这些变体可以代表多态性、剪接变体、突变等。在这点上，本说明书在本发明的背景下公开了多种本领域已知的蛋白质并且提供了与一个或多个公共数据库有关的示例性登录号以及与这些本领域已知的蛋白质有关的发表的期刊论文的示例性参考文献。然而，本领域技术人员认识到可以容易地鉴别其它登录号和期刊论文，它们可以提供所公开的生物标志物的其它特征并且举例说明的参考文献绝不是对所公开的生物标志物的限制。如本文所述，多种技术和试剂在本发明所述的方法中是有用的。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水、阴道分泌物、唾液和尿。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。如本文所述，可以通过本领域中已知的多种测定和技术检测生物标志物。如本文进一步所述的，这些测定非限制地包括基于质谱(MS)的测定、基于抗体的测定以及将两种方法的方面结合的测定。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所列的那些对。
本发明提供了对应于本文所公开的生物标志物的替代肽的稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。本发明所述的生物标志物、它们的替代肽和SIS肽可以在预测怀孕的雌性动物中早产风险的方法中使用。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中本文所公开的生物标志物或生物标志物对的单个表达水平或逆转值以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，在GABD的19至21周之间获得样品。在其它实施方式中，在GABD的19至22周之间获得样品。
除特异性生物标志物之外，本发明公开还包括与举例说明的序列具有约90％、约95％或约97％的同一性的生物标志物变体。如本文所使用的，变体包括多态性、剪接变体、突变等。尽管参考蛋白生物标志物进行描述，但是可以在蛋白或基因表达水平鉴别生物标志物对的逆转值变化。
其它标志物可以选自一种或多种风险指征，其包括(但不限于)母体特性、病史、过往妊娠史和婚育史。这些其它标志物可以包括(例如)先前的低出生体重或早产分娩、多次在孕中期中自发性流产、先前在孕早期中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未孕、胎盘异常、宫颈和子宫异常、宫颈长度量测短、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infant sex)、身材矮小、低妊娠前体重、体重指数低或高、糖尿病、高血压、泌尿生殖器感染(即尿路感染)、哮喘、焦虑症和抑郁症、哮喘、高血压、甲状腺机能减退。早产的人口统计学风险指征可以包括(例如)母体年龄、种族/族群(race/ethnicity)、单身婚姻状况、社会经济地位低、母体教育、母体年龄、职业相关身体活动、职业性曝露以及环境暴露和压力。其它风险指征可以包括产前护理不足、吸烟、使用大麻及其它非法毒品、可卡因使用、饮酒、咖啡因摄入、母体体重增加、饮食摄入、妊娠晚期的性活动以及业余时间的身体活动。(Preterm Birth：Causes，Consequences，and Prevention，Institute of Medicine(US)Committee on Understanding Premature Birth andAssuring Healthy Outcomes；Behrman RE，Butler AS，主编.Washington(DC)：NationalAcademies Press(US)；2007)。可以使用本领域中已知的学习算法鉴别对作为标志物有用的其它风险指征，所述学习算法如线性差别分析、支持向量机分类、回归特征消去、微阵列的预测分析、逻辑回归、CART、FlexTree、LART、随机森林、MART和/或存活分析回归，它们是本领域技术人员已知的并且在本文中进一步得到说明。
应注意除非内容中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”和“所述”包括复数对象。因此，例如，对“生物标志物”的提及包括两种或更多种生物标志物等的混合物。
具体地，与给定量有关的术语“约”表示包括正或负5％的偏差。
除非内容中明确规定，否则如包括所附权利要求的本发明申请中所使用的，单数形式的“一个”和“所述”包括复数参考并且与“至少一个”和“一个或多个”是可互换使用的。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化旨在涵盖非排他的包括，如包含、包括或含有元素或元素列表的过程、方法、过程产物或物质组合物不仅包括这些成分，但是可以包括这些过程、方法、过程产物或物质组合物中未明确列出或固有的其它成分。
如本文所使用的，术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语还可以表示本文所述的一种或多种生物标志物的表达类型的谱图或指数。用于生物标志物组的生物标志物的数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。
如本文所使用的并且除非另作说明，否则术语“分离的”和“纯化的”通常描述已从其天然环境(例如，如果它是天然存在的，自然环境)中除去并因此通过人手从其自然状态改变，从而在结构、功能和性质中的至少一个中具有显著不同特征的物质组合物。分离的蛋白或核酸不同于它在自然界中存在的方式并且包括合成的肽和蛋白。
术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。在整个发明公开中，术语“标志物”和“生物标志物”是可互换使用的。例如，本发明的生物标志物与早产可能性提高有关。这些生物标志物包括任何适合的分析物，但不局限于生物分子，包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还包括生物分子的部分或片段，例如，包含至少5个连续的氨基酸残基、至少6个连续的氨基酸残基、至少7个连续的氨基酸残基、至少8个连续的氨基酸残基、至少9个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少11个连续的氨基酸残基、至少12个连续的氨基酸残基、至少13个连续的氨基酸残基、至少14个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少16个连续的氨基酸残基、至少17个连续的氨基酸残基、至少18个连续的氨基酸残基、至少19个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少21个连续的氨基酸残基、至少22个连续的氨基酸残基、至少23个连续的氨基酸残基、至少24个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基或更多个连续的氨基酸残基的蛋白质或多肽的肽片段。
如本文所使用的，术语“替代肽”是指在MRM测定配置中选择用作所关心的生物标志物定量的替代物的肽。替代肽的定量最好地使用稳定同位素标记的标准替代肽(“SIS替代肽”或“SIS肽”)结合MRM检测技术实现。替代肽可以是合成的。可以合成在肽的C-末端具有重标记，例如，具有精氨酸或赖氨酸或任何其它氨基酸的SIS替代肽以用作MRM测定中的内标。SIS替代肽不是天然存在的肽并且与其天然存在的对应物相比具有显著不同的结构和性质。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一个生物标志物对的比值，所述生物标志物对选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所公开的生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，其中所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间所述比值的变化的存在确定了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述比值可以包括分子中上调的蛋白质、分母中下调的蛋白质或两者。例如，生物标志物比值可以包括分子中上调的蛋白质和分母中下调的蛋白质，其在本文中被定义为“逆转”。在其中所述比值包括分子中上调的蛋白质或分母中下调的蛋白质的情况下，任一种蛋白质可以用于归一化(例如，减少分析前或分析差异度)。在比值为“逆转”的具体情况下，放大和归一化两者均可能。应理解本发明所述的方法不局限于逆转亚组，而且还涵盖生物标志物的比值。生物标志物的比值可以包括(例如)分子中上调的蛋白质和分母中未调控的蛋白质以及分子中未调控的蛋白质和分母中下调的蛋白质。在这些情况下，所述未调控的蛋白质将用作归一化因子(normalizer)。
如本文所使用的，术语“逆转对”是指在相比较的类别之间显示出值的变化的成对的生物标志物。逆转对由比任一个生物标志物单独分类数据更好的两个生物标志物组成。蛋白质浓度或基因表达水平中逆转的检测消除了对数据归一化或者群体宽的阈值的建立的需要。在任何逆转对的定义内涵盖了其中单个生物标志物在分子和分母之间切换的相应的逆转对。本领域技术人员将理解对于其预测能力，这种相应的逆转对具有同样的信息性。本领域技术人员还理解出现在本文所述的逆转对中的生物标志物，包括(但不限于)图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所述的生物标志物，还可以有益于确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，其中在计算方法中使用所述生物标志物的值，而不是使用逆转，例如，其中将所述生物标志物中的两种或更多种彼此相减和/或在逻辑方程中应用或使用其它数学运算。
如本文所公开的，这种逆转方法是有利的，这是因为它提供了最简单的可能的分类因子，该分类因子独立于数据归一化，有助于避免过度拟合并且导致产生了易于在诊所中实施的非常简单的实验测试。如本文所述的独立于数据归一化的基于逆转的生物标志物对作为鉴别临床相关PTB生物标志物的方法的使用具有巨大能力。由于任何单一蛋白的定量受到由测量差异度、正常波动和基线表达中单个相关变化所引起的不确定性的影响，因此可以处于协调、系统控制下的标志物对的鉴别应证明对于个体诊断和预后是更稳健的。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量怀孕的雌性动物中的至少一个生物标志物对的逆转值以确定怀孕的雌性动物中的早产概率，所述生物标志物选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所列的生物标志物。
对于针对预测生产时间的方法，应理解“生产”是指有或没有羊膜破裂的情况下，自发分娩发作后的生产。
尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法进行描述和举例说明，但是本发明公开类似地适用于预测出生时胎龄(GAB)的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间(TTB)的方法。对于本领域技术人员显而易见的是出于对母体-胎儿健康的考虑，上述方法中的每一个具有具体和大量的应用和益处。
此外，尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法进行描述和举例说明，但是本发明公开类似地适用于预测异常葡萄糖测试、妊娠期糖尿病、高血压、子痫前期、宫内生长受限、死产、胎儿生长受限、HELLP综合征、羊水过少、绒毛膜羊膜炎、绒毛膜羊膜炎、前置胎盘、胎盘增生、破裂、胎盘早期剥离、胎盘出血、早产胎膜早破、早产、宫颈不良、过期妊娠、胆石病、子宫过度膨胀、紧张。如以下更详细说明的，基于病况，如(例如)子痫前期或妊娠期糖尿病，本文所述的分类因子对医学上指明的PTB的组分敏感。
在一些实施方式中，本发明公开提供了生物标志物、生物标志物对和/或逆转，它们是分娩时间(TTB)的强预测因子。TTB定义为GABD和出生时胎龄(GAB)之间的差异。该发现使得能够单独或以TTB或GAB的这些分析物的数学组合进行预测。根据本发明所述的方法，缺少病例相对于对照的差异，但是表明妊娠期间分析物强度变化的分析物在妊娠时钟中是有用的。可能不是早产或其它病症的诊断的多个分析物的标定可以用于确定妊娠时间。这种妊娠时钟对通过另一种测量(例如，末次经期的日期和/或超声日期)的日期确认是有价值的，或者单独对随后且更准确预测(例如)sPTB、GAB或TTB是有用的。这些分析物在本文中还称为“时钟蛋白质”，其可以在没有其它确定日期的方法的情况下或者与其它确定日期的方法结合用于确定妊娠日期。
在其它实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法还包括检测与早产有关的一种或多种风险指征的可测量特征。在其它实施方式中，所述风险征候选自先前的低出生体重或早产分娩、多次在孕中期中自发性流产、先前在孕早期中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未产妇、受孕、初孕妇、经产孕妇、胎盘异常、宫颈和子宫异常、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infant sex)、身材矮小、低妊娠前体重、体重指数低或高、糖尿病、高血压和泌尿生殖器感染。
“可测量特征”是可以确定并且与受试者中早产概率相关的任何性质、特性或方面。术语还包括可以确定并且与GAB的预测、足月产的预测或怀孕的雌性动物中生产时间的预测有关的任何性质、特性或方面。对于生物标志物，这种可测量特征可以包括(例如)生物样品中生物标志物或其片段的存在、不存在或浓度、改变的结构，如(例如)翻译后修饰的存在或量，如生物标志物氨基酸序列上一个或多个位置处的氧化，或(例如)与足月产对照受试者中生物标志物的构象相比，改变的构象的存在，和/或作为不止一个生物标志物的谱的一部分的生物标志物的存在、量或改变的结构。
除生物标志物之外，可测量特征还可以包括风险指征，其包括(例如)母体特性、教育、年龄、人种、种族、病史、过往妊娠史、婚育史。对于风险指征，可测量特征可以包括(例如)先前的低出生体重或早产分娩、多次在孕中期中自发性流产、先前在孕早期中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未孕、胎盘异常、宫颈和子宫异常、宫颈长度测量短、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infantsex)、身材矮小、低妊娠前体重/低体重指数、糖尿病、高血压、泌尿生殖器感染、甲状腺机能减退、哮喘、低学历、吸烟、使用毒品和饮酒。
在一些实施方式中，本发明所述的方法包括体重指数(BMI)的计算。
在一些实施方式中，用于确定早产概率的所公开的方法涵盖了使用质谱、捕获试剂或其组合检测和/或定量一种或多种生物标志物。
在其它实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的所公开的方法涵盖了从怀孕的雌性动物提供生物样品的初始步骤。
在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的所公开的方法包括向保健供应商传达所述概率。所公开的预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法类似地涵盖了向保健供应商传达所述概率。如上所述，尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率进行描述和举例说明，但是在整个发明公开中描述的所有实施方式类似地适用于预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法。具体地，在本发明申请中，明确参考用于早产的方法所列举的生物标志物和组还可以用于预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法。对于本领域技术人员显而易见的是出于对母体-胎儿健康的考虑，上述方法中的每一个具有具体和大量的应用和益处。
在其它实施方式中，交流告知了对怀孕的雌性动物的后续治疗决策。在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法包括将所述概率表示为风险得分的其它特征。
在本文所公开的方法中，确定怀孕的雌性动物中的早产概率涵盖了包括通过测量选自早产妊娠群组和在出生时具有已知胎龄的足月产妊娠群组中的分离的生物标志物的比值形成概率/风险指数的初始步骤。对于个体妊娠，确定怀孕的雌性动物中的早产概率包括使用与产生概率/风险指数的初始步骤中所使用的相同的测量方法测量分离的生物标志物的比值，并将所述测量的比值与所述风险指数相比较以得出所述个体妊娠的个性化风险。
如本文所使用的，术语“风险得分”是指可以基于得自怀孕的雌性动物的生物样品中一种或多种生物标志物的量或逆转值与代表从得自怀孕的雌性动物的随机混合的生物样品计算的一种或多种生物标志物的平均量的标准或参考得分相比较来分配的得分。在一些实施方式中，所述风险得分可以表示为逆转值的对数，即各个生物标志物的相对强度的比值。本领域技术人员将理解可以基于多种数据转换表示风险得分，并且所述风险得分表示为比值本身。此外，通过特别关注逆转对，本领域技术人员将理解如果分子和分母中生物标志物转换或者应用了相关数据转化(例如，减法)，则任何比值同样是有信息型的。由于在整个妊娠期间，生物标志物的水平可能不是固定的，因此必需对应于采集样品时怀孕的雌性动物的妊娠时间点来获得标准或参考得分。可以预先确定标准或参考得分并建立预测模型，从而比较是间接的，而不是每次对受试者确定概率时实际进行的。风险得分可以是标准(例如，数值)或者阈值(例如，图上的线)。风险得分值相关于根据得自怀孕的雌性动物的随机混合或选择混合的生物样品计算的一种或多种生物标志物的平均量的上下偏差。在某些实施方式中，如果风险得分大于标准或参考风险得分，则怀孕的雌性动物可以具有提高的早产可能。在一些实施方式中，怀孕的雌性动物风险得分的大小或其超过参考风险得分的量可以作为怀孕的雌性动物的风险水平的指示或与之相关。
本发明包括分类因子，所述分类因子包括一个或多个单个生物标志物以及单个和多个逆转。可以通过构建由不止一个逆转所形成的预测因子来实现改善的表现。在一些实施方式中，一个或多个分析物可以起到多变量组中多个其它分析物的归一化因子的作用。在其它实施方式中，本发明方法因此包括多个逆转，其对于(例如)单独的GABD窗、早产胎膜早破(PPROM)相对于非PPROM的早产(PTL)、胎儿性别、初孕妇相对于经产孕妇具有强大的预测表现。对于整个抽血范围评价了由多个逆转的组合(SumLog)所形成的预测因子的表现，并且预测因子得分来源于各个逆转的Log值的总和(SumLog)。本领域技术人员可以选择其它模型(例如，逻辑回归)以构建由不止一个逆转所形成的预测因子。
可以通过(例如)大于22并且等于或小于37kg/m2的BMI划分来改善所主张方法的预测表现。因此，在一些实施方式中，可以通过得自具有指定BMI的怀孕的雌性动物的样品实践本发明所述的方法。简要地，BMI是个体体重(千克)除以身高(米)的平方。BMI不直接测量体脂肪，但是研究已显示BMI与得自皮褶厚度测量、生物电阻抗、密度测定(水下称重)、双能X线吸收测定(DXA)及其它方法的体脂肪的更直接的测量有关。此外，BMI似乎与这些更直接的体脂测量一样与多种代谢和疾病结局强烈相关。通常，BMI低于18.5的个体被认为是低于正常体重，BMI等于或大于18.5至24.9的个体被认为是正常体重，而BMI等于或大于25.0至29.9的个体被认为是过重，而BMI等于或大于30.0的个体被认为是肥胖。在一些实施方式中，可以通过等于或大于18、等于或大于19、等于或大于20、等于或大于21、等于或大于22、等于或大于23、等于或大于24、等于或大于25、等于或大于26、等于或大于27、等于或大于28、等于或大于29或等于或大于30的BMI划分来改善所主张的方法的预测表现。在其它实施方式中，可以通过等于或小于18、通过等于或小于19、通过等于或小于20、通过等于或小于21、通过等于或小于22、通过等于或小于23、通过等于或小于24、通过等于或小于25、通过等于或小于26、通过等于或小于27、通过等于或小于28、通过等于或小于29或通过等于或小于30的BMI划分来改善所主张的方法的预测表现。
在本发明的背景中，术语“生物样品”涵盖了得自怀孕的雌性动物并且含有本文所公开的一种或多种生物标志物的任何样品。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水、阴道分泌物、唾液和尿。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。如本领域技术人员将理解的，生物样品可以包括血液的任何部分或组分，非限制地，T细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、红细胞、血小板和微囊，如外来体和外来体样微囊。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。
如本文所使用的，术语“早产”是指在小于37个完整周的胎龄分娩或生产。已经建立了其它常用的早产子类，并将其表示为适度早产(在妊娠的第33至36周生产)、过度早产(在＜妊娠的第33周生产)和严重早产(在≤妊娠的第28周生产)。对于本文所公开的方法，本领域技术人员将理解可以在实践本文所公开的方法中调整表示早产和足月产的截止时间以及表示早产子类的截止时间，例如，以使特定健康益处最大化。在本发明的多个实施方式中，描述早产的截止时间包括(例如)在≤37周妊娠时分娩、≤36周妊娠时分娩、≤35周妊娠时分娩、≤34周妊娠时分娩、≤33周妊娠时分娩、≤32周妊娠时分娩、≤30周妊娠时分娩、≤29周妊娠时分娩、≤28周妊娠时分娩、≤27周妊娠时分娩、≤26周妊娠时分娩、≤25周妊娠时分娩、≤24周妊娠时分娩、≤23周妊娠时分娩或≤22周妊娠时分娩。在一些实施方式中，描述早产的截止时间为≤35周妊娠。应进一步理解这些调整在本领域技术人员的技术组合范围内，并涵盖在本文所公开的本发明的范围内。胎龄是胎儿发育程度和胎儿生产准备程度的代表。胎龄通常定义为最后一次正常月经至生产日期之间的时间长度。然而，产科测量和超声估计也可以辅助估计胎龄。早产通常被分为两个不同的亚组。一个是自发早产，它是在早产分娩或早产过早羊膜破裂的自发发生后发生的那些，不考虑后续催产或剖腹产。第二个是医学上的人工早产(indicated preterm births)，它是对于妇女的护理人员确定威胁母体和/或胎儿的健康或生命并且在不存在自然分娩的情况下的一种或多种条件，在引产或剖腹产后发生的那些早产。另外，可能的是仍将如医学上所指明的来表示出于非危急生命的理由的自愿早产。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及确定自发早产或医学上的人工早产的概率。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及确定自发早产的概率。在其它实施方式中，本文所公开的方法涉及医学上的人工早产。在其它实施方式中，本文所公开的方法涉及预测出生时的胎龄。
如本文所使用的，术语“估计的胎龄”或“估计的GA”是指基于最后一次正常月经的日期和其它产科测量、超声估计或其它临床参数(其非限制地包括前段中所述的那些)确定的GA。相反，术语“预测的生产时的胎龄”或“预测的GAB”是指基于如本文所公开的本发明所述的方法确定的GAB。如本文所使用的，“足月产”是指在等于或大于37完整周的胎龄的生产。
在一些实施方式中，怀孕的雌性动物在采集生物样品时处于妊娠17至28周之间，这也称为GABD(抽血时的胎龄)。在其它实施方式中，在采集生物样品时，怀孕的雌性动物在妊娠的第16至29周之间，第17至28周之间，第18至27周之间，第19至26周之间，第20至25周之间，第21至24周之间或第22至23周之间。在其它实施方式中，在采集生物样品时，怀孕的雌性动物在妊娠的约第17至22周之间，约第16至22周之间，约第22至25周之间，约第13至25周之间，约第26至28周之间或约第26至29周之间。因此，采集所述生物样品时怀孕的雌性动物的胎龄可以为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周。在具体的实施方式中，在19至21周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至22周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至21周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至22周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在18周胎龄收集生物样品。在其它实施方式中，可以在单一分类因子中组合连续或重叠时间窗的最高实施逆转以预测较宽的抽血时的胎龄窗的sPTB概率。
如本文所使用的，术语“量”或“水平”是指在生物样品和/或对照中可检测或可测量的生物标志物的量。生物标志物的量可以是(例如)多肽的量、核酸的量或者片段或替代物的量。作为另外一种选择，术语可以包括它们的组合。术语生物标志物的“量”或“水平”是生物标志物的可测量特征。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中的一个或多个生物标志物或者分离的生物标志物对的方法，其选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所指明的生物标志物对。对于检测一个或多个单个生物标志物，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异性结合至所述一个或多个生物标志物中的每一个上的捕获剂接触，检测所述一个或多个生物标志物是否存在于所述生物样品中；和检测所述一个或多个生物标志物中的每一个与相应一个或多个捕获剂之间的结合。对于检测生物标志物对，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异性结合所述对的第一成员的第一捕获剂和特异性结合所述对的第二成员的第二捕获剂接触，检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中；和检测所述对的第一生物标志物和所述第一捕获剂之间以及所述对的第二成员和所述第二捕获剂之间的结合。
在一个实施方式中，在19至21周胎龄之间获得样品。在其它实施方式中，所述捕获试剂选自抗体、抗体片段、核酸-基蛋白结合试剂、小分子或其变体。在其它实施方式中，通过测定实施所述方法，所述测定选自酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
在一个实施方式中，本发明提供了检测一个或多个分离的生物标志物或分离的生物标志物对存在于所述生物样品中的方法，其包括对所述样品进行包括质谱定量在内的蛋白质组学工作流程。
“蛋白质组学工作流程”通常涵盖了以下步骤中的一种或多种：将血清样品融化并通过免疫-亲和色谱消耗掉14种丰度最高的蛋白质。将所消耗的血清通过蛋白酶，例如，胰蛋白酶水解以获得肽。随后，向水解物中添加SIS肽的混合物，然后脱盐并使用以MRM模式运行的三重四极杆设备进行LC-MS/MS。根据内源肽峰值和相应SIS肽对应物峰值的面积比形成响应比。本领域那些技术人员应理解可以在本发明所述的方法中使用其它类型的MS，如(例如)MALDI-TOF或ESI-TOF。另外，本领域技术人员可以(例如)通过选择特定试剂(如蛋白酶)或者省去或改变某些步骤的顺序来改变蛋白质组学工作流程，例如，它可以不必需进行免疫去除，可以稍早或稍晚加入SIS肽并且可以将稳定同位素标记的蛋白质代替肽用作标准品。
可以在本文中使用任何现有的，可用的或常规的分离、检测和定量方法来测量样品中生物标志物、肽、多肽、蛋白质和/或其片段和任选地一种或多种其它生物标志物或其片段的存在或不存在(例如，读数为存在相对于不存在；或者可检测的量相对于不可检测的量)和/或量(例如，读数是绝对或相对量，如(例如)绝对或相对浓度)。在一些实施方式中，一种或多种生物标志物的检测和/或定量包括使用捕获试剂的测定。在其它实施方式中，所述捕获试剂是抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂、小分子或其变体。在其它实施方式中，所述测定选自酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。在一些实施方式中，一种或多种生物标志物的检测和/或定量还包括质谱分析法(MS)。在其它实施方式中，所述质谱分析法是免疫共沉淀-质谱分析法(co-IP MS)，其中免疫共沉淀是适合于完整蛋白质络合物分离的技术，在它之后进行质谱分析。
如本文所使用的，术语“质谱”是指能够使分析物挥发/离子化以形成气相离子并确定它们的绝对或相对分子量的装置。适合的挥发/电离方法是基质辅助激光解吸电离(MALDI)、电喷雾、激光/光、热、电、雾化/喷雾等，或它们的组合。适合的质谱形式包括(但不限于)离子阱仪器、四极仪器、静电和磁性扇形场仪器、飞行时间仪器、飞行时间串联质谱仪(TOF MS/MS)、傅里叶变换质谱仪、Orbitraps以及由这些类型的质谱分析仪的不同组合组成的混合仪器。反过来，这些仪器可以与多种其它仪器连接，所述其它仪器分离样品(例如，液相色谱或基于化学或生物性质的固相吸附技术)并且使样品电离以引入到质谱仪中，其包括基质辅助激光解吸(MALDI)、电喷雾或纳喷雾电离(ESI)或它们的组合。
通常，可以在本文所公开的方法中使用任何质谱(MS)技术，所述技术可以提供肽质量的精确信息，并且优选地还提供所选肽的片段和/或(部分)氨基酸序列的精确信息(例如，在串联质谱，MS/MS；或在源后衰变，TOF MS中)。适合的肽MS和MS/MS技术和系统本身是熟知的(参见，例如，Methods in Molecular Biology，146卷：“Mass Spectrometry ofProteins and Peptides”，Chapman主编，Humana Press 2000；Biemann 1990.MethodsEnzymol 193：455-79；或者Methods in Enzymology，402卷：“Biological MassSpectrometry”，Burlingame主编，Academic Press 2005)并且可以在实践本文所公开的方法中使用。因此，在一些实施方式中，所公开的方法包括实施定量MS以测量一种或多种生物标志物。这些定量方法可以以自动(Villanueva等人，Nature Protocols(2006)1(2)：880-891)或半自动形式进行。在具体的实施方式中，MS可以可操作地连接至液相色谱装置(LC-MS/MS或LC-MS)或者气相色谱装置(GC-MS或GC-MS/MS)。在上下文中有用的其它方法包含同位素亲合标签(isotope-coded affinity tag)(ICAT)、串联质谱标签(TMT)或通过细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)，然后进行色谱和MS/MS。
如本文所使用的，术语“多次反应监控(MRM)”或“选择反应监控(SRM)”是指对于低丰度分析物定量特别有用的MS基定量方法。在SRM实验中，通过三重四极仪的两个质量过滤器选择预先确定的前体离子以及一个或多个其片段并随时间监控精确定量。可以通过在不同前体/碎片对之间快速转换以实施MRM实验，在相同实验内在色谱时间尺度上测量多个SRM前体和碎片离子对。一系列跃迁(前体/碎片离子对)与靶标分析物(例如，肽或小分子，如化学个体、类固醇、激素)的保留时间的组合可以构成确定的测定。可以在单次LC-MS实验期间定量大量分析物。与MRM或SRM有关的术语“安排的”或“动态的”是指测定的变化，其中在预期保留时间周围的时窗中仅获得特定分析物的跃迁，从而显著提高了可以在单次LC-MS实验中检测和定量的分析物的数目并有助于测试的选择性，这是因为保留时间是依赖于分析物物理性质的性质。还可以以不止一个跃迁来监控单个分析物。最后，在测定中可以包括对应于所关心的分析物的标准品(例如，相同的氨基酸序列)，但差别在于包含了稳定同位素。可以将稳定同位素标准品(SIS)以精确水平引入所述测定并用于定量相应的未知分析物。通过未知分析物与其相应SIS的共洗脱以及它们的跃迁性质(例如，未知物两种跃迁水平的比值和其相应SIS的两种跃迁的比值的相似性)，促进了额外的特异性水平。
适合于生物标志物肽分析的质谱测定、仪器和系统可以非限制地包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS；MALDI-TOF源后衰变(PSD)；MALDI TOF/TOF；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)MS；电喷雾电离质谱(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n(n是大于零的整数)；ESI 3D或线性(2D)离子阱MS；ESI三重四级MS；ESI四极正交TOF(Q-TOF)；ESI傅里叶变换MS系统；硅上解吸/电离(DIOS)；次级离子质谱法(SIMS)；大气压化学电离质谱法(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)n；离子迁移光谱(IMS)；电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、大气压光化电离质谱仪(APPI-MS)；APPI-MS/MS；和APPI-(MS)n。可以使用在本领域中建立的方式实现串联MS(MS/MS)布置中的肽离子碎片化，如(例如)碰撞诱导解离(CID)。如本文所述，通过质谱的生物标志物的检测与定量可以包括多次反应监控(MRM)，如Kuhn等人，Proteomics 4：1175-86(2004)。在LC-MS/MS分析期间，经调度的多次反应监控(经调度的MRM)模式采集提高了肽定量的灵敏度与准确度。Anderson andHunter，Molecular and Cellular Proteomics 5(4)：573(2006)。如本文所述，基于质谱的测定可以有利地与上游肽或蛋白质分离或分馏方法组合，如(例如)与色谱和本文以下所述的其它方法组合。如本文进一步所述的，鸟枪法定量蛋白质组学可以与基于SRM/MRM的测定组合以用于早产预后生物标志物的高通量鉴别和验证。
本领域技术人员将理解一些方法可以用于确定生物标志物的量，其包括质谱法，如MS/MS、LC-MS/MS、多反应监控(MRM)或SRM以及产物离子监控(PIM)并且还包括基于抗体的方法，如免疫测定，如免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹和FACS。因此，在一些实施方式中，确定至少一种生物标志物的水平包括使用免疫测定和/或质谱法。在其它实施方式中，质谱法选自MS、MS/MS、LC-MS/MS、SRM、PIM以及本领域中已知的其它这类方法。在其它实施方式中，LC-MS/MS还包括1DLC-MS/MS、2D LC-MS/MS或3D LC-MS/MS。免疫测定技术和规程通常是本领域技术人员所知的(Price and Newman，Principles and Practice of Immunoassay，第2版，Grove′sDictionaries，1997；和Gosling，Immunoassays：A Practical Approach，OxfordUniversity Press，2000)。可以使用多种免疫测定技术，包含竞争和非竞争免疫测定(Self等人，Curr.Opin.Biotechnol.，7：60-65(1996)。
在其它实施方式中，免疫测定选自免疫印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定(RIA)、斑点印迹和FACS。在某些实施方式中，所述免疫测定为ELISA。在其它实施方式中，所述ELISA是直接ELISA(酶联免疫吸附测定)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、多通道ELISA、ELISPOT技术及其它本领域中已知的类似技术。这些免疫测定方法的原理在本领域中是已知，例如John R.Crowther，The ELISA Guidebook，第1版.，Humana Press 2000，ISBN 0896037282。通常，使用抗体进行ELISA，但是它们可以使用与本发明的一种或多种生物标志物特异性结合的并且可以检测的任何捕获试剂进行。多通道ELISA使得能够在单个隔室(例如，微孔板的孔)内同时检测两种或更多种分析物，这通常是在多个阵列位置完成的(Nielsen and Geierstanger 2004.J Immunol Methods 290：107-20(2004)和Ling等人2007.Expert Rev Mol Diagn 7：87-98(2007))。
在一些实施方式中，放射免疫测定(RIA)可以在本发明所述的方法中用于检测一种或多种生物标志物。RIA是本领域熟知的基于竞争的测定，并且包括将已知量的放射性标记的(例如，125I或131I标记的)靶标分析物与所述分析物的特异性抗体混合，然后加入来自样品的未标记的分析物并测量替换的标记的分析物的量(参见，例如，An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques，Chard T主编，Elsevier Science 1995，ISBN 0444821198作为指导)。
在本发明所述的方法中，可以在本文所述的测定中使用可检测的标记物以用于生物标志物的直接或间接检测。可以使用多种可检测的标记物，并基于所需的灵敏度、与抗体缀合的容易性、稳定性要求和可用的仪器以及处理规定选择标记物。本领域技术人员熟悉基于本发明所述的方法中生物标志物的测定检测的适合的可检测标记物的选择。适合的可检测标记物包括(但不限于)荧光染料(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OregonGreenTM、罗丹明、得克萨斯红、四若丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate，TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、酶(例如，荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、金属等。
对于质谱基分析，使用同位素试剂的差异标记，例如，同位素编码的亲合标签(ICAT)或使用同量异序标记试剂的更近期的变化、iTRAQ(Applied Biosystems，FosterCity，Calif.)或串联质谱标签，TMT(Thermo Scientific，Rockford，IL)，然后进行多维液相色谱(LC)和串联质谱(MS/MS)分析可以在本发明方法的实践中提供其它方法。
使用化学发光抗体的化学发光测定可以用于蛋白水平的灵敏、非放射性检测。用荧色物标记的抗体也可以是适合的。荧色物的实例非限制地包括DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、得克萨斯红和lissamine。间接标记物包括在本领域中熟知的多种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿酶等。使用适合于辣根-过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶的底物的检测系统在本领域中是熟知的。
例如，可以使用分光光度计检测来自发色底物的颜色；使用辐射计数器来检测辐射，如γ粒子计数器检测125I；或者在存在特定波长的光的情况下使用荧光计检测荧光，从而分析来自直接或间接标记物的信号。对于酶连抗体的检测，可以根据生产商的说明，使用分光光度计，如EMAX酶标仪(Molecular Devices；Menlo Park，Calif.)进行定量分析。如果需要，用于实践本发明的测定可以自动或机械化进行，并且可以同时检测来自多个样品的信号。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括使用质谱(MS)定量生物标志物。在其它实施方式中，质谱可以是液相色谱-质谱(LC-MS)、多次反应监控(MRM)或选择反应监控(SRM)。在其它实施方式中，MRM或SRM还可以包括经调度MRM或经调度SRM。
如上所述，还可以在本发明所述方法的实践中使用色谱法。色谱法包括用于分离化学物质的方法，并且通常涉及以下过程：通过移动液体或气体流(“流动相”)携带分析物的混合物并当它们流过或在固定液或固相(“固定相”)上流动时由于分析物在流动相和所述固定相之间的差异分配而分成不同组分。所述固定相通常可以是细碎的固体、过滤材料片层或位于固体表面上的液体薄膜等。本领域技术人员很好地认识到色谱法是适合于生物来源的化合物(如，例如，氨基酸、蛋白质、蛋白质或肽片段等)分离的技术。
色谱可以柱色谱(即其中固定相沉积或装填成柱)，优选地，液相色谱，并且更优选地，高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UHPLC)。色谱法的详细资料在本领域中是熟知的(Bidlingmeyer，Practical HPLC Methodology and Applications，John Wiley&SonsInc.，1993)。色谱的示例性类型非限制地包括高效液相色谱(HPLC)、UHPLC、正相HPLC(NP-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、离子交换色谱(IEC)，如阳离子或阴离子交换色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水性相互作用色谱(HIC)、尺寸排阻层析(SEC)，包括凝胶过滤色谱或凝胶渗透色谱、色谱焦聚、亲和色谱，如免疫亲和、固定化金属亲和色谱等。可以将色谱(包括一维、二维或多维色谱)与其它肽分析方法(如，例如，如本说明书其它处描述的下游质谱分析)一起用作肽分离方法。
可以任选地与任何上述分析方法一起使用其它肽或多肽分离、鉴别或定量方法以用于在本发明公开中测量生物标志物。这些方法非限制地包括化学提取分配、等电点聚焦(IEF)，包括毛细管等电点聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管电色谱(CEC)等、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)、自由流动电泳(FFE)等。
在本发明的背景中，术语“捕获试剂”是指可以特异性结合至靶标，具体地生物标志物的化合物。该术语包括抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂(例如，适体、慢解离速率修饰的适体(SOMAmerTM))、蛋白捕获剂、天然配体(即用于其受体的激素或反之)、小分子、天然产物，如大环N-甲基-肽抑制剂(PeptiDream Inc.，Tokyo，Japan)、芋螺毒素文库等或其变体。
可以配置捕获试剂以特异性结合至靶标，具体地生物标志物。捕获试剂可以包括(但不限于)有机分子，如多肽、多核苷酸以及技术人员可鉴别的其它非聚合物分子。在本文所公开的实施方式中，捕获试剂包括可以用于检测、纯化、分离或富集靶标，具体地生物标志物的任何试剂。任何本领域已知的亲合捕获技术可以用于选择性分离和富集/浓缩作为在所公开的方法中使用的生物培养基的复杂混合物的成分的生物标志物。
可以使用本领域中已知的任何适合的方法制备特异性结合至生物标志物的抗体捕获试剂。参见，例如，Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(1988)；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版1986)。抗体捕获试剂可以是任何免疫球蛋白或其衍生物，无论是天然的或者完全或部分合成产生的。维持特异结合能力的它的所有的衍生物也包含在该术语中。抗体捕获试剂具有与免疫球蛋白结合域同源或基本同源的并且可以来源于天然来源或者部分或完全合成产生的结合域。抗体捕获试剂可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单链抗体。本领域那些技术人员将理解抗体可以以任何多种形式提供，其包括(例如)人源化、部分人源化、嵌合、嵌合人源化等。抗体捕获试剂可以是抗体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双链抗体和Fd片段。可以通过任何方式产生抗体捕获试剂。例如，抗体捕获试剂可以通过完整抗体的碎片化来酶促或化学产生和/或它可以从编码所述部分抗体序列的基因重组产生。抗体捕获剂可以包括单链抗体片段。作为另外一种选择或另外，抗体捕获试剂可以包含(例如)通过二硫键连接在一起的多条链。；和，得自这些分子的任何功能性片段，其中这些片段保留了亲本抗体分子的特异性结合性质。由于它们作为完整分子的功能性组分的较小尺寸，对于在某些免疫化学技术和实验应用中的使用，抗体片段可以提供优于完整抗体的优势。
对实践本发明有用的适合的捕获试剂还包括适体。适体是可以通过唯一的立体(3-D)结构特异性地结合至它们的靶标的寡核苷酸序列。适体可以包括任何适合数目的核苷酸，并且不同的适体可以具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA或化学修饰的核酸，并且可以是单链、双链或含有双链区的，并且可以包括更高的有序结构。适体还可以是光适体，其中在适体中包含光反应性或化学反应性官能团以使其与其相应靶标共价连接。适体捕获试剂的使用可以包括特异性结合相同生物标志物的两种或更多种适体的使用。适体可以包括标签。可以使用任何已知的方法鉴别适体，包括SELEX(指数富集配体系统进化)法。一旦鉴别，则可以根据任何已知的方法制备或合成适体，包括化学合成法和酶促合成法，并且可以在用于生物标志物检测的多种应用中使用。Liu等人，Curr Med Chem.18(27)：4117-25(2011)。在本发明所述方法的实践中有用的捕获试剂还包括本领域中已知具有改善的解离速率特征的SOMAmers(慢解离速率修饰的适体)。Brody等人，J Mol Biol.422(5)：595-606(2012)。可以使用任何已知的方法，包括SELEX法产生SOMAmer。
本领域技术人员应理解可以在分析前修饰生物标志物以改善它们的分辨率或确定它们的身份。例如，可以在分析前对生物标志物进行蛋白消化。可以使用任何蛋白酶。可能将生物标志物切割成不连续个数的片段的蛋白酶(如胰蛋白酶)是特别有用的。由消化产生的片段用作生物标志物的指纹，借此使得能够间接检测它们。这在生物标志物具有可能与所讨论的生物标志物混淆的类似的分子量的情况下是特别有用的。另外，蛋白水解碎片化对高分子量生物标志物是有用的，这是因为较小的生物标志物更易于通过质谱分辨。在另一个实例中，可以修饰生物标志物以改善检测分辨率。例如，神经氨糖酸苷酶可以用于从糖蛋白除去末端唾液酸残基以改善与阴离子吸附剂的结合和改善检测分辨率。在另一个实例中，可以通过连接具有特定分子量的特异性结合至分子生物标志物的标签来修饰生物标志物，从而进一步区分它们。任选地，在检测这些修饰的生物标志物后，可以通过在蛋白质数据库(例如，SwissProt)中将修饰的生物标志物的物理和化学特性进行匹配来进一步确定生物标志物的身份。
在本领域中还将认识到可以将样品中的生物标志物捕获在用于检测的基底上。常规基底包括随后用于探索蛋白质存在的抗体涂覆的96-孔板或硝化纤维素膜。作为另外一种选择，可以将连接至微球、微粒、微珠、珠或其它颗粒的蛋白结合分子用于生物标志物的捕获和检测。蛋白结合分子可以是连接到颗粒表面的抗体、肽、类肽、适体、小分子配体或其它蛋白结合捕获试剂。每个蛋白结合分子可以包括唯一的可检测标记物，编码所述标记物从而使它可以不同于连接至其它蛋白结合分子的可检测标记物，从而使得能够在多通道测定中检测生物标志物。实例包括(但不限于)具有已知荧光强度的颜色编码的微球(参见，例如，由Luminex(Austin，Tex.)通过xMAP技术生产的微球)；含有量子点纳米晶体的微球，例如，其具有不同的量子点颜色的比值和组合(例如，由Life Technologies(Carlsbad，Calif.)生产的Qdot纳米晶体)；玻璃涂覆的金属纳米颗粒(参见，例如，由NanoplexTechnologies，Inc.(Mountain View，Calif.)生产的SERS nanotags)；条型码材料(参见，例如，亚微米尺寸的条纹金属棒，如由Nanoplex Technologies，Inc.生产的Nanobarcodes)，具有彩色条码的编码微粒(参见，例如，由Vitra Bioscience，vitrabio.com生产的cellcard)，具有数字全息编码图像的玻璃微粒(参见，例如，由Illumina(San Diego，Calif.)生产的CyVera微珠)；化学发光染料、染料化合物的组合；和具有可检测的不同尺寸的珠。
在另一个方面，可以将生物芯片用于本发明的生物标志物的捕获和检测。在本领域中，多种蛋白质生物芯片是已知的。这些包括(例如)通过Packard BioScience Company(Meriden Conn.)，Zyomyx(Hayward，Calif.)和Phylos(Lexington，Mass.)生产的蛋白质生物芯片。一般地，蛋白质生物芯片包含具有表面的基底。将捕获试剂或吸附剂连接至基底表面。通常，所述表面包括多个可寻址地址，每个地址具有在此结合的捕获试剂。所述捕获试剂可以是生物分子，如多肽或核酸，其以特异性方式捕获其它生物标志物。作为另外一种选择，捕获试剂可以是色谱材料，如阴离子交换材料或亲水材料。蛋白质生物芯片的实例在本领域中是熟知的。
在一个实施方式中，本发明提供了一组试剂来测量所述生物标志物的水平，其中所述生物标志物是选自图1和2以及表1至3，6至36和42至67中所述的生物标志物的一种或多种生物标志物。这些试剂包括(但不限于)用于检测本发明所述的生物标志物的本文所述的试剂，如以上所述的那些。这些试剂可以用于(例如)测量本发明所述的一种或多种生物标志物的量或水平。
本发明公开还提供了预测早产概率的方法，其包括测量生物标志物对逆转值的变化。例如，可以将生物样品与包含一种或多种多核苷酸结合试剂的组接触。然后，可以根据以下所公开的方法，例如，使用或不使用核酸扩增方法，评价所检测的生物标志物中一种或多种的表达。熟练的开业医生理解在本文所述的方法中，基因表达的测量可以是自动的。例如，可以使用可以进行基因表达的多路测量的系统，例如，同时提供数百种mRNA的相对丰度的数字读数。
在一些实施方式中，核酸扩增方法可以用于检测多核苷酸生物标志物。例如，可以在使用通过任何多种熟知和确立的方法分离的核酸底物的扩增和检测方法中使用本发明所述的寡核苷酸引物和探针(例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory Manual，7.37-7.57页(第2版，1989)；Lin等人，Diagnostic Molecular Microbiology， Principles and Applications，605-16页(Persing等人主编，(1993)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(2001及后续更新))。用于扩增核酸的方法包括(但不限于)，例如，聚合酶链反应(PCR)和反转录PCR(RT-PCR)(参见，例如，美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Weiss，Science 254：1292-93(1991))、链置换扩增(SDA)(参见，例如，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396(1992)；美国专利No.5,270,184和5,455,166)、嗜热SDA(tSDA)(参见，例如，欧洲专利No.0 684 315)以及美国专利No.5,130,238；Lizardi等人，BioTechnol.6：1197-1202(1988)；Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-77(1989)；Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-78(1990)；美国专利No.5,480,784；5,399,491；美国专利公开No.2006/46265中所述的方法。
在一些实施方式中，生物样品中mRNA的测量可以用作生物样品中相应蛋白质生物标志物水平检测的替代。因此，还可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何生物标志物、生物标志物对或者生物标志物逆转组。可以通过反转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，然后qPCR)来测量mRNA的水平。使用RT-PCR从mRNA产生cDNA。随着DNA扩增过程的进行，可以在qPCR测定中使用cDNA以产生荧光。与标准曲线相比，qPCR可以产生绝对测量，如单位细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、侵入测定(Invader assay)和与毛细管电泳结合的RT-PCR均已用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling：Methods and Protocols，Richard A.Shimkets主编，Humana Press，2004。
本文所公开的一些实施方式涉及确定怀孕的雌性动物中早产概率的诊断和预后方法。一种或多种生物标志物的表达水平的检测和/或生物标志物比值的确定可以用于确定怀孕的雌性动物中的早产概率。可以将这些检测方法(例如)用于状况的早期诊断以确定受试者是否对早产易感，以监控早产的发展或者治疗规程的进展，以评价早产的严重性，以预测早产结局和/或恢复或足月产的前景或者以帮助确定适合的早产治疗。
可以非限制地通过如上所述的方法以及本领域中已知的任何其它方法确定生物样品中生物标志物的量。然后，将因此所获得的定量数据进行分析分类法。在该方法中，根据算法调控原始数据，其中已通过训练数据组对算法进行预定义，例如，如本文所提供的实例中所述的。算法可以使用本文所提供的训练数据组，或者可以使用本文所提供的指导以通过不同的数据组产生算法。
在一些实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括预测模型的使用。在其它实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括将所述可测量特征与参考特征相比较。如本领域技术人员可以理解的，这种比较可以是与参考特征的直接比较或者是其中已将参考特征引入预测模型的间接比较。在其它实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括以下中的一种或多种：线性差别分析模型、支持向量机分类算法、回归特征消去模型、微阵列预测分析模型、线性逻辑Cox比例风险或加速失效时间回归模型、CART算法、flex tree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法、惩罚回归方法及其组合。在具体的实施方式中，所述分析包括逻辑回归。
分析分类法可以使用多种统计分析方法中的任一种以调控定量数据并为样品分类做准备。有用的方法的实例包括线性差别分析、回归特征消去、微阵列预测分析、逻辑回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法；等。
为了产生预测GAB的随机森林，本领域技术人员可以考虑一组k位出生时胎龄(GAB)已知的和已测量生产前几周采集的血液样本中N个分析物(转变)的受试者(孕妇)。回归树起始于含有所有受试者的根节点。可以在根节点计算所有受试者的平均GAB。根节点内GAB的变化较高，这是因为存在具有不同GAB的妇女的混合。然后，将根节点划分(分配)为两个分枝，从而每个分枝含有具有类似GAB的妇女。再次计算每个分枝中受试者的平均GAB。每个分枝内的GAB变化将低于根节点中的变化，这是因为每个分枝内的妇女亚组具有比根节点中相对更类似的GAB。通过选择分析物和产生具有类似GAB的分枝的分析物的阈值来产生两个分枝。从所有分析物和阈值的组中选择分析物和阈值，通常在每个节点具有分析物的随机亚组。程序连续递归产生分枝以产生其中受试者具有极类似GAB的叶(终端节点)。每个终端节点中预测的GAB是该终端节点中受试者的平均GAB。该程序产生单一回归树。随机森林可以包括数百或数千个这样的树。
可以根据设置确定样品属于给定分类的概率的阈值的预测模型方法来进行分类。所述概率优选地为至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％或更高。还可以通过确定所获得的数据集和参考数据集之间的比较是否产生统计学显著差异来进行分类。如果产生，则将获得该数据集的样品分为不属于参考数据集类。相反地，如果该比较不统计学显著地不同于参考数据集，则将获得该数据集的样品分为属于参考数据集类。
可以根据提供具体值或数值范围的质量度量，例如，AUROC(ROC曲线下面积)或准确度来评价模型的预测能力。曲线下面积量度对于比较整个数据范围内分类因子的精确性是有用的。具有较大AUC(曲线下面积)的分类因子将具有较大的将未知在所关心的两组之间正确分类的能力。在一些实施方式中，所需质量阈值是以至少约0.5、至少约0.55、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或更高的准确度将样品分类的预测模型。作为替代量度，所需质量阈值可以表示以至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高的AUC将样品分类的预测模型。
如本领域中已知的，可以调整预测模型的相对灵敏度和特异性以有利于选择性度量或灵敏度度量，其中两种度量具有反比关系。根据所进行的测试的具体要求，可以调整上述模型中的限度以提供选择的灵敏度或特异性水平。灵敏度和特异性中的一个或两个可以为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高。
开始，可以通过测量每个生物标志物的值来分析原始数据，通常重复三次或多次重复三次。然而，应理解只要可以通过所使用的测定充分测量所述分析物，则不需要重复测量。可以调控数据，例如，可以使用标准曲线转化原始数据，并使用三次测量的平均值来计算每位患者的平均值和标准偏差。可以在模型中使用前转化这些值，例如，log-转化，Box-Cox转化(Box and Cox，Royal Stat.Soc.，Series B，26：211-246(1964)。然后，将数据输入到预测模型中，所述模型将根据状况对样品分类。可以将所得信息传达给患者或保健供应商。
为了产生早产预测模型，在训练组中使用稳健数据集，其包括已知对照样品和对应于所关心的早产分类的样品。可以使用公认标准选择样本容量。如以上所讨论的，可以使用不同的统计方法来获得高精度预测模型。实施例2提供了这种分析的实例。
在一个实施方式中，在预测模型的推导中实施分级聚类，其中使用皮尔逊相关性作为簇度量。一种方法是将早产数据集考虑为“监督学习”问题中的“学习样本”。CART是医学应用中的标准(Singer，Recursive Partitioning in the Health Sciences，(1999))并且可以通过以下方式修改：将任何定性特征转化为定量特征；按通过用于霍特林T2统计量的样品再使用方法评价的所达到的显著性水平分类；和lasso方法的适合应用。的确，通过在回归质量评价中适当使用Gini分类标准，将预测问题转化为回归问题而不损失预测目标(sight ofprediction)。
该方法导致产生了所谓的FlexTree(Huang，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A 101：10529-10534(2004))。在模拟和应用于多种数据形式时，FlexTree运行良好并且对实践所主张的方法是有用的。已开发了软件自动FlexTree。作为另外一种选择，可以使用LARTree或LART(Turnbull(2005)Classification Trees with Subset Analysis Selection by the Lasso，Stanford University)。名称反映了二元树，如CART和FlexTree中；lasso，如所提及的；和通过所谓的LARS对lasso的实施，Efron等人(2004)Annals of Statistics 32：407-451(2004)。另外，参见，Huang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101(29)：10529-34(2004)。可以使用的其它分析方法包含逻辑回归。逻辑回归的一种方法：Ruczinski，Journal of Computational and Graphical Statistics 12：475-512(2003)。逻辑回归类似于CART，其中它的分类因子可以显示为二元树。不同在于每个节点具有有关特征的布尔语句，它比CART产生的简单“与”语句更常规。
另一种方法是最近缩小形心(nearest shrunken centroid)方法(Tibshirani，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99：6567-72(2002))。该技术是k均值样的，但是具有下述优点：通过缩小簇中心，自动化选择特征(如在lasso中)以集中关注有信息的那些小数目。该方法可获得为PAM软件并被广泛使用。可以使用的两个其它算法集是随机森林(Breiman，Machine Learning 45：5-32(2001))和MART(Hastie，The Elements of Statistical Learning，Springer(2001))。在本领域中，这两种方法已知是“委员会方法”，其涉及对结局“投票”的预测因子。
为了提供重要性排序，可以确定假发现率(FDR)。首先，产生一组不同性值的零分布。在一个实施方案中，排列观察到的谱的值以产生偶然获得的相关系数的分布序列，借此产生相关系数的零分布的适当的集(Tusher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98，5116-21(2001))。通过下述获得零分布集：排列所有可用谱的每个谱的值；计算所有谱的配对相关系数；计算该排列的相关系数的概率密度函数；和重复该过程N次，其中N是大数，通常约300。使用N分布，计算其值以给定显著性水平超过从实验观察到的相似性值的分布获得的值(相似性的值)的相关系数值的计数的适当量度(平均值、中值等)。
FDR是预期假显著相关数目(从大于随机数据集中该选择的皮尔逊相关性的相关性估计)与经验数据中大于该选择的皮尔逊相关性的相关数目(显著相关)的比值。该截止相关值可应用于实验谱之间的相关性。使用上述分布，选择显著性的置信水平。这用来确定超出偶然获得的结果的相关系数的最低值。使用该方法，获得正相关、负相关或两者的阈值。使用该阈值，用户可以过滤配对相关系数的观察值并去除不超过阈值的那些。另外，可以获得给定阈值的假阳性率的估计。对于单个“随机相关”分布的每一个，可以找到有多少观察值落在阈值范围之外。该程序提供计数序列。所述序列的平均值和标准偏差提供潜在假阳性的平均数目及其标准偏差。
在替代的分析方法中，截面分析中选择的变量单独用作时间事件分析(生存分析)中的预测因子，其中事件是早产的发生，并且无事件受试者可认为是在分娩时检查的。考虑特定妊娠结果(早产事件或无事件)，每个患者观察到的随机时长和蛋白质组学及其它特征的选择，分析存活的参数方法可能好于广泛应用的半参数Cox模型。存活的Weibull参数拟合允许风险率是单一性增加、降低或恒定的，并且还具有成比例的风险表现(与Cox模型一样)和加速失败时间表现。可用于获得回归系数及相应函数的近似最大似然评估的所有标准工具在该模型中是可用的。
此外，可以使用Cox模型，特别是因为协变量数目减少至可用lasso管理的大小将显著简化分析，从而使得有可能使用非参数或半参数法预测早产时间。这些统计学工具在本领域中是已知的并且可应用于蛋白质组学数据的所有方式。提供了可容易确定并且具有关于所述怀孕的雌性动物中早产概率和预测的早产事件时间的丰富信息的一组生物标志物、临床和遗传数据。另外，算法提供了有关怀孕的雌性动物中的早产概率的信息。
因此，本领域技术人员将理解可以使用定量或类别变量确定根据本发明的早产概率。例如，在本发明所述的方法的实践中，可以对N个生物标志物的每一个的可测量特征进行分类数据分析以作为二元分类结局确定早产概率。作为另外一种选择，本发明所述的方法可以通过初始计算定量变量，具体地，出生时预测的胎龄来分析N个生物标志物的每一个的可测量特征。随后，出生时预测的胎龄可以用作预测早产风险的基础。通过初始使用定量变量和随后将定量变量转化为类别变量，本发明所述的方法考虑了对可测量特征检测的测量的连续区域。例如，通过预测出生时的胎龄而不是做出早产相对于足月产的二元预报，有可能调整怀孕的雌性动物的治疗。例如，早期预测的出生时的胎龄将导致比预测接近足月的胎龄更密切的产前干预，即监控和治疗。
在预测GAB为j天加或减k天的妇女中，可以将p(PTB)估计为PAPR临床试验(参见实施例1)中预测GAB为j天加或减k天而实际在37周胎龄之前分娩的妇女的比例。一般地，对于预测GAB为j天加或减k天的妇女，将真实出生时的胎龄将小于指定胎龄的概率p(真实GAB＜指定GAB)估计为PAPR临床试验中预测GAB为j天加或减k天而实际在指定胎龄之前分娩的妇女的比例。
在预测模型的建立过程中，可以期望选择标志物的亚组，即至少3、至少4、至少5、至少6个标志物，和多至完整的标志物组。通常，将选择提供用于定量样品分析需要的标志物亚组，例如，试剂的可用性、定量的方便性等，同时维持高精度预测模型。对用于构建分类模型的一些信息性标志物的选择需要定义性能度量和用户基于该度量定义的产生具有有用预测能力的模型的阈值。例如，所述性能度量可以是AUC、预测的灵敏度和/或特异性以及预测模型的总体准确度。
如本领域技术人员将理解的，分析分类法可以使用多种统计分析方法中的任一种以调控定量数据并为样品分类做准备。有用的方法的实例非限制地包括线性差别分析、回归特征消去、微阵列预测分析、逻辑回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法和机器学习算法。在训练模型中使用了多种方法。标志物亚组的选择可以是标志物亚组的正向选择或反向选择。可以选择将优化模型性能而不使用所有标志物的标志物数目。定义最佳项目数的一种方法是选择产生具有所需预测能力的模型的项目数(例如，AUC＞0.75，或灵敏度/特异性的等价测量)，所述预测能力在于使用用于给定算法的任何组合和项目数，与对该度量获得的最大值不超过一个标准偏差。
在另一个方面，本发明提供了用于确定早产概率的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于检测生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳分离自怀孕的雌性动物的生物样品的容器；和将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以检测生物样品中分离的生物标志物的存在或量的打印的说明书。所述试剂可以包装在单独的容器中。所述试剂盒还可以包含一个或多个对照参考样品和用于实施免疫测定的试剂。
所述试剂盒可以包含用于包含在所述试剂盒内的组合物的一个或多个容器。组合物可以处于液体形式或者可以是冷冻干燥的。适合用于所述组合物的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述试剂盒还可以包含包装说明书，其含有确定早产概率的方法的书面说明。
根据上述说明，显而易见的是可以对本文所述的本发明做出改变和变化以使其适合于多种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
在本文中，对变量的任何定义中的元素列表的列举包括该变量作为任何单个元素或所列元素组合(或子组合)的定义。在本文中，对实施方式的列举包括作为任何单个实施方式或者与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
在本说明书中提及的所有专利和专利公开以每个单独的专利和专利公开具体并且单独表明作为参考并入本文的相同程度作为参考并入本文。
通过非限制性说明提供了以下实施例。
实施例
实施例1.PPROM和PTL表型的特征在于潜在的生物化学途径的差异
目标：
为了检查与由于早产胎膜早破(PPROM)相对于特发性自然分娩(PTL)所造成的早产(PTB)有关的母体生物标志物的潜在生物途径
研究设计：
早产风险研究的蛋白质组学评价的第二嵌套病例对照分析。我们分析了临床特征和来自在191/7-206/7周从195位受试者(39位PTB＜37周：17位PPROM和22位PTL；156位足月产对照)预期性采集的样品的血清。根据情况，使用X2，Fisher精确检验或者双样本Wilcoxon检验分析临床变量。使用多反应监控质谱测量了表示多个sPTB途径的63种蛋白质的母体血清水平。对每种蛋白产生了受试者工作曲线下面积。使用途径分析对在PPROM或PTL相对于足月产(AUC≥0.64和p-值≤0.05)或者在PPROM相对于PTL中差异表达的蛋白质进行分类。
方法
早产风险研究的蛋白质组学评价的第二分析(Clinicaltrials.gov标识符：NCT01371019)
在妊娠191/7-206/7周预期性采集的血清：39位SPTB＜37周：17位PPROM和22位PTL，156位匹配的足月产对照。
临床变量分析：X2或Fisher精确检验
质谱分析：(1)通过多反应监控测量的63种蛋白质；(2)对于每种蛋白质计算的受试者工作曲线下面积和p-值；(3)使用途径分析所分析的在PPROM或PTL相对于足月产中差异表达的蛋白质(AUC≥0.64和p-值≤0.05)。
在PPROM或PTL病例和足月产对照之间，在年龄、种族/ethnicity(race/ethnicity)和胎次方面无显著差异。PPROM群组中的中值BMI(33.1)高于PTL病例(24.9)和足月产对照(25.7)。虽然非统计学显著(p＝0.13)，但是PPROM群组中的妇女(244天)比PTL群组(254天)中的更早分娩。下表1显示了与PTL相对于足月产中的相比，PPROM相对于足月产中更多蛋白质差异表达且包含更广泛的途径组。
表1.PPROM相对于足月产和PTL相对于足月产中的差异蛋白表达和途径
下表2中显示了PPROM相对于足月产对照中差异表达的蛋白。
表2.PPROM相对于足月产对照中差异表达的蛋白
下表3中显示了PTL相对于足月产对照中差异表达的蛋白。
表3.PTL相对于足月产对照中差异表达的蛋白
| 分析物 | AUROC | p-值 | 蛋白水平 |
| PSG3 | 0.66 | 0.0137 | 下调 |
| IGF2 | 0.66 | 0.0137 | 下调 |
| IBP4 | 0.64 | 0.0376 | 上调 |
| IBP3 | 0.64 | 0.0333 | 下调 |
病例和对照之间在种族(race)或族群(ethnicity)方面无显著差异。如所期望的，在病例和对照之间，出生时胎龄和先前足月分娩次数显著不同(表4)。另外，相对于足月产，PPROM中BMI较高(表4)。在所测量的63种蛋白质中，23种在PPROM相对于足月产之间显著不同。在途径图(图1)中显示了亚组(加粗：IBP4、SHBG、ENPP2、CO8A、CO8B、VTNC、HABP2、CO5、HEMO、KNG1、CFAB、APOC3、APOH、LBP、CD14、FETUA)，其中13种绘制于炎性和免疫应答途径(加粗、阴影：CO8A、CO8B、VTNC、HABP2、CO5、HEMO、KNG1、CFAB、APOC3、APOH、LBP、CD14、FETUA)。在PTL相对于足月产中，四种蛋白差异表达，并且均绘制于涉及生长调控的途径(图2)(加粗，阴影：IBP4、IGF2、IBP3、PSG3)。将PPROM与PTL相比，在PPROM中富集的蛋白质具有调控血管生成、急性期反应和先天免疫的作用。
表4.通过早产表型划分的母体特性和妊娠结局
结论：
在通过PPROM相对于PTL早产分娩的妇女中，孕中期时的母体血清蛋白谱不同。在PPROM相对于足月产妇女中鉴别的不同的生物标志物组表明PPROM本身具有多个生物基础。包括PPROM和PTL生物标志物的多分析物预测因子可以更好地鉴别处于SPTB风险的妇女并指导治疗选择。
实施例2.对于PPROM和PTL表型的进一步研究
以大量分析物并且对于基于胎龄的不同数据亚组重复实施例1的研究。除单变量分析之外，本实施例包括对于PPROM相对于足月产，PTL相对于足月产和PPROM相对于PTL的两种-分析物逆转(上调蛋白/下调蛋白)的评价。最后，通过将高性能PPROM相对于足月产逆转与高性能PTL相对于足月产逆转组合，评价逆转对以用于预测整体早产，并且使用对于每种表型的高选择性逆转组合以用于区分PPROM相对于PTL。
研究设计：
早产风险研究的蛋白质组学评价的第二嵌套病例对照分析。我们分析了临床特征和来自在119-153天妊娠时预期性采集的样品的母体血清。使用整个群组(119-153天)，在分成重叠的3周窗期的样品(119-139天，126-146天和133-153天)并且在对于PreTRM测定指明的商品化窗期中进行数据分析。根据情况，使用X2，Fisher精确检验或者双样本Wilcoxon检验分析临床变量。使用多反应监控质谱测量了代表多个sPTB途径的109种蛋白质加上用于质量控制的其它14种蛋白质的母体血清水平。通过总计181种肽定量了109种蛋白质，其中每种蛋白质1至4种肽。对于每种肽产生了受试者工作曲线下面积以鉴别在PPROM或PTL相对于足月产和在PPROM相对于PTL中差异表达的蛋白。将任何窗期中AUC＞0.64的蛋白划分为功能类别。
方法
早产风险研究的蛋白质组学评价的第二分析(Clinicaltrials.gov标识符：NCT01371019)
将分析以指明的样本数(N)分成以下胎龄窗期：
表5.胎龄窗期和样本数的总结
将临床变量分析：t检验、X2或Fisher精确检验用于比较PPROM、PTL和足月产受试者(表37-41)。
基本如实施例1来分析样品。简要地，使用Human 14 Multiple Affinity RemovalSystem(MARS 14)从血清样品中除去了高丰度蛋白，其除去了14种丰度最大的蛋白质，这些蛋白质被视为对血清蛋白质组学中疾病相关变化的鉴别是无信息性的。出于此目的，将相等体积(50μl)的每个临床、混合人血清样品(HGS)或者人混合孕妇血清样品(pHGS)用150μlAgilent柱缓冲液A稀释并在Captiva过滤板上过滤以除去沉淀物。根据生产商的规程，使用MARS-14柱(4.6×100mm，产品目录#5188-6558，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)除去过滤的样品。在自动进样器中，将样品冷却至4℃，在室温下运行除去柱，并将收集的馏分保持在4℃直至进一步分析。收集未结合的馏分用于进一步分析。
将除去的血清样品用二硫苏糖醇还原，使用碘乙酰胺烷基化，然后用5.0μg胰蛋白酶Gold-质谱级(Promega)在37℃水解17小时(±1小时)。胰蛋白酶消化后，将稳定同位素标准(SIS)肽的混合物加入至样品，并将每个样品的一半在Empore C18 96-孔固相萃取板(3MBioanalytical Technologies；St.Paul，MN)上脱盐。根据生产商的规程来调节板。将肽用300μl 1.5％三氟乙酸、2％乙腈清洗，用250μl 1.5％三氟乙酸、95％乙腈洗脱，在-80℃冷冻30分钟，然后冷冻干燥至干燥。将冷冻干燥的肽用含有三种非人内标(IS)肽的2％乙腈/0.1％甲酸复溶。将肽在40℃，在Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(2.1×100mm，2.7μm)上用400μl/min的30min的乙腈梯度分离，并进样至Agilent6490三重四极杆质谱仪。
质谱分析：(1)通过多反应监控来测量代表109种蛋白质的181种肽和它们相应的稳定同位素标准(SIS)肽；使用Mass Hunter定量分析软件(Agilent Technologies)对色谱峰积分。使用两种不同的质谱测定，通过相同复原的肽水解物的序列分折，产生了181种肽所代表的109种蛋白质的数据。第一LC-MS方法定量了实施例1中的那些蛋白质，第二测定定量了另外50种独有的蛋白质和这两种方法之间重叠的一些蛋白质。
(2)通过将内源肽的峰面积除以加样合成SIS肽的峰面积，对每种肽计算了响应比，(3)对于每种肽响应比计算的受试者工作曲线下面积和p-值(表7-36和42-67)；(4)对于每个GABD窗期，使用上调和下调分析物的全部组合形成了逆转组。逆转值是上调分析物的响应比与下调分析物的响应比的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。对于每个窗期中所有可能的逆转以及对于每个比较(PPROM相对于足月产，PTL相对于足月产，PPROM相对于PTL)产生了AUC值。本文报道了显著AUC值的亚组(表7-36和42-67)。为了简单起见，仅报告每种蛋白的最高得分逆转对(即仅对逆转中每种蛋白的1个肽报告AUC，尽管其它的肽将具有类似的AUC值)。对于每个分析，我们还标注了上调或下调蛋白在逆转中所表现的频率(给定截止值内)。
然后，将来自PPROM相对于足月产分析的最高逆转(AUC＞＝0.7)(和IBP4/SHBG)与来自PTL相对于足月产分析的最高逆转(AUC＞＝0.65)(和IBP4/SHBG)配对，并与单独的每种单一逆转相比，测试预测整体早产(PPROM和PTL一起)相对于足月产分娩的能力。最后，使用蒙特卡洛交叉验证(MCCV)分析测试最大400组的两种逆转分类因子加上所有含有IBP4/SHBG的分类因子的表现。在MCCV中，使用500次迭代，通过67％的数据训练模型，并通过33％的数据进行测试。对于训练组计算AUC值和置信区间。
结果：
对于所有窗期，如所期望的，与足月产群组相比，在PPROM和PTL群组中，出生时胎龄(GAB)和因此的出生体重均显著较早/较小(表37-41)。在任何分析窗期内，在PPROM或PTL病例和足月产对照之间或者在PPROM和PTL病例之间未观察到年龄、种族/族群(race/ethnicity)和产次的显著差异。在所有窗期内，在PPROM群组中观察到较大的BMI，其通常在统计学上不同于另一群组(表37-41)。与表明先前PTB代表最大PTB风险的证据一致，在完整群组中，与足月产中的相比，PPROM和PTL群组中存在更高百分比的具有先前PTB的妇女(表41)。然而，与具有先前sPTB的受试者成比例的差异不显著，并且它们在较小的胎龄窗期内也不一致(表37-41)。我们还注意到与PTL相比，对于PPROM，出生时胎龄趋于更早，这与全国统计数据一致，但是在该群组中未达到统计显著性(表37-41)。
在所有窗期内，如下表6所示，与PTL相对于足月产中的相比，PPROM相对于足月产中更多蛋白质差异表达且包含更广泛的途径组。
表6.在来自任何GA窗期的PPROM或PTL相对于足月产中鉴别为差异表达的蛋白质的功能特征
这表明PTL和PPROM中的任一种具有非常不同的病原学或者在这些胎龄中PTL可能不太容易预测。我们的数据表明与PTL中相比，免疫性和炎症在PPROM中更显著，或者在119-153天妊娠时，在PTL中尚未出现这些反应。
最后，为了举例说明可以区分PPROM和PTL的那些逆转，我们进行了以下分析。对于和足月产的每个比较(PPROM相对于足月产，PTL相对于足月产，PTB相对于足月产)，我们要求比较方向要使得AUC＞0.5表明病例得分大于足月产并且AUC＜0.5表明足月产得分大于病例。这使得我们能够通过相对于足月产，对于PPROM和PTL相反方向的得分来鉴别逆转。对于在方向上具有最大差异的那些逆转，PPROM相对于足月产的AUC与PTL相对于足月产的AUC的绝对差值将是最大的。出于对逆转排名的目的，还对于PPROM相对于PTL计算了AUC值，并且在该情况下，不需要一致方向性。最终逆转选择标准包括对于PPROM相对于PTL，AUC＞＝0.65和0.2的AUC差值(PPROM相对于足月产减去PTL相对于足月产)。在这种情况下的分析，我们限制于134-146天的GABD。我们使得能够在该分析中对每种蛋白考虑多个肽。表66总结了以最初从PTL相对于足月产选择的逆转开始，然后应用以上所列的分析的结果。表67总结了以最初从PPROM相对于足月产选择的逆转开始，然后应用以上所列的分析的结果。
在下表7-36和42-67中，将分析物列为蛋白质名称_肽序列。
表7.在GABD 119-139，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于足月产的逆转(上调/下调)
表8.在GABD 126-146，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于足月产的逆转(上调/下调)
表9.在GABD 133-153，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于足月产的逆转(上调/下调)
表10.在GABD 134-146，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于足月产的逆转(上调/下调)
表11.在GABD 119-153，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于足月产的逆转(上调/下调)
表12.对于PPROM相对于足月产，119-139 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表13.对于PPROM相对于足月产，119-139 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表14.对于PPROM相对于足月产，GABD 126-146，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表15.对于PPROM相对于足月产，GABD 126-146，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表16.对于PPROM相对于足月产，GABD 133-153，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表17.对于PPROM相对于足月产，GABD 133-153，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表18.对于PPROM相对于足月产，134-146 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表19.对于PPROM相对于足月产，GABD 134-146，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表20.对于PPROM相对于足月产，GABD 119-153，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表21.对于PPROM相对于足月产，GABD 119-153，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表22.在GABD 119-139，以AUC＞＝0.65预测PTL相对于足月产的逆转(上调/下调)
表23.对于PTL相对于足月产，GABD 119-139，在逆转＞＝0.65中上调蛋白_肽的计数
表24.对于PTL相对于足月产，GABD 119-139，在逆转＞＝0.65中下调蛋白_肽的计数
表25.在GABD 126-146，以AUC＞＝0.65预测PTL相对于足月产的逆转(上调/下调)
表26.对于PTL相对于足月产，GABD 126-146，在逆转＞＝0.65中上调蛋白_肽的计数
表27.对于PTL相对于足月产，GABD 126-146，在逆转＞＝0.65中下调蛋白_肽的计数
表28.在GABD 133-153，以AUC＞＝0.65预测PTL相对于足月产的逆转(上调/下调)
表29.对于PTL相对于足月产，GABD 133-153，在逆转＞＝0.65中上调蛋白_肽的计数
表30.对于PTL相对于足月产，GABD 133-153，在逆转＞＝0.65中下调蛋白_肽的计数
表31.在GABD 134-146，以AUC＞＝0.65预测PTL相对于足月产的逆转(上调/下调)
表32.对于PTL相对于足月产，GABD 134-146，在逆转＞＝0.65中上调蛋白_肽的计数
表33.对于PTL相对于足月产，GABD 134-146，在逆转＞＝0.65中下调蛋白_肽的计数
表34.在GABD 119-153，以AUC＞＝0.65预测PTL相对于足月产的逆转(上调/下调)
表35.对于PTL相对于足月产，GABD 119-153，在逆转＞＝0.65中上调蛋白_肽的计数
表36.对于PTL相对于足月产，GABD 119-153，在逆转＞＝0.65中下调蛋白_肽的计数
表37.PPROM、PTL和足月产分娩的妇女之间的临床特征比较(119-139天妊娠群组)
表38.PPROM、PTL和足月产分娩的妇女之间的临床特征比较(126-146天妊娠群组)
表39.PPROM、PTL和足月产分娩的妇女之间的临床特征比较(133-153天妊娠群组)
表40.PPROM、PTL和足月产分娩的妇女之间的临床特征比较(134-146天妊娠群组)
表41.PPROM、PTL和足月产分娩的妇女之间的临床特征比较(119-153天妊娠群组)
表42.在来自任何GA窗期的PPROM或PTL相对于足月产中鉴别为差异表达的蛋白质的功能特征
表43.在抽血窗期(天)，不同胎龄中PPROM相对于足月产对照的蛋白质的差异表达
表44.在抽血窗期(天)，不同胎龄中PTL相对于足月产对照的蛋白质的差异表达
表45.在抽血窗期(天)，不同胎龄中PPROM相对于PTL的蛋白质的差异表达
表46.在GABD 119-139，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于PTL的逆转(上调/下调)
表47.对于PPROM相对PTL，119-139 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表48.对于PPROM相对于PTL，119-139 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表49.在GABD 126-146，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于PTL的逆转(上调/下调)
表50.对于PPROM相对于PTL，126-146 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表51.对于PPROM相对于PTL，126-146 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表52.在GABD 133-153，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于PTL的逆转(上调/下调)
表53.对于PPROM相对于PTL，133-153 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表54.对于PPROM相对于PTL，133-153 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表55.在GABD 134-146，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于PTL的逆转(上调/下调)
表56.对于PPROM相对于PTL，134-146 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表57.对于PPROM相对于PTL，134-146 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表58.在GABD 119-153，以AUC＞＝0.7预测PPROM相对于PTL的逆转(上调/下调)
表59.对于PPROM相对于PTL，119-153 GABD，在逆转＞＝0.7中上调蛋白_肽的计数
表60.对于PPROM相对于PTL，119-153 GABD，在逆转＞＝0.7中下调蛋白_肽的计数
表61.在119-139 GABD，预测SPTB相对于足月产的2个逆转的组
表62.在126-146 GABD，预测SPTB相对于足月产的2个逆转的组
表63.在133-153 GABD，预测SPTB相对于足月产的2个逆转的组
表64.在134-146 GABD，预测SPTB相对于足月产的2个逆转的组
表65.在119-153 GABD，预测SPTB相对于足月产的2个逆转的组
表66.在134-146 GABD，区分PPROM相对于PTL并且单独预测任一种结局风险的最佳PTL逆转
表67.在134-146 GABD，区分PPROM相对于PTL并且单独预测任一种结局风险的最佳PPROM逆转
序列表
<110> 赛拉预测公司
<120> 用于预测由于早产胎膜早破相对于特发性自然分娩所造成的早产的生物标志物
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Claims (4)
1.组合物，其包含选自图1和2以及表1至3、6至38和44至68中所述的生物标志物的一种或多种生物标志物。
2.确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1和2以及表1至3，6至38和44至68中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率。
3.确定怀孕的雌性动物中与早产胎膜早破(PPROM)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图1以及表6至22、44、45和47至68中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PPROM有关的早产概率。
4.确定怀孕的雌性动物中与特发性自然分娩(PTL)有关的早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量选自图2以及表6、23至38、44和46至68中所述的一种或多种生物标志物的一种或多种生物标志物以确定所述怀孕的雌性动物中与PTL有关的早产概率。
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