CN111542619A - 早产的生物标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物标记,特别地,尽管并非唯一,涉及检测早产的生物标记。该生物标记适于,在出生前数周或数月,区分个体在妊娠37周前的生育风险。
Description
本申请要求2017年10月30日提交的SG10201708890Y的优先权,出于所有目的,其内容和要素通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及生物标记,特别地,尽管并非唯一,涉及检测早产的生物标记。该生物标记适于,在出生前数周或数月,区分个体在妊娠37周前的生育风险。
背景
早产的定义是在妊娠37周之前的出生。据估计,每年有超过1500万个婴儿早产。在全球中,早产是五岁以下儿童死亡的主要原因之一,估计有一百万个与早产相关的死亡案例。许多幸存者面临终生残疾的挑战,包括学习障碍及视觉与听觉问题。尽管过去几十年来新生儿学的进步提高了早产存活率,但超过20%的早产新生儿将遭受至少一种严重残疾,包括慢性肺病、智力发育受损、脑性麻痹(cerebral palsy)、耳聋、或失明。
迫切需要确定有早产风险的孕妇。在目前的实例中,高风险妊娠的治疗涉及预防性治疗或加强监测或密切监测妊娠,以降低早产率。然而,在大多数情况下,妊娠的高危分类归因于既往病史或临床检查,仅能确定真正高危妊娠中的一小部分易早产。多数易早产妊娠在早期阶段仍无法识别,因此不可能对这等病例进行早期医疗干预。
市场上有几个针对存在风险症状女性的早产风险评估测试。其中一例为胎儿纤维接合素(Fetal Fibronectin,fFN)测试,针对有症状的女性提供风险评估。若可能出现早产,则胎儿纤维接合素会存在于阴道内;因此,fFN测试常用于出现早产可能症状的孕妇,如收缩、阴道流血、自阴道渗出流体、阴道排出物增加、背痛、及下腹部痉挛。fFN测试的强项在于,测试后长达10天的高阴性预测值(亦即,阴性结果意指,测试的后7至10天内早产可能性低)。然而,当fFN测试为阳性时,结果较无法确定。
病患管理因风险因子而异。黄体酮等预防性治疗在许多临床研究中经证明可降低早产率,这些临床研究将子宫颈长度短或有早产病史的妇女列为高危人群。有症状的妇女可能会基于风险因子接受安胎剂(tocolytic)或类固醇的治疗。现今临床上实践的局限在于,治疗与预后的相关性极低。
因此,迫切需要有效鉴定高早产风险的妊娠,以便及时给予适当治疗以降低早产率。本发明提供一种用于预测早产风险的生物标记及方法,以至少部分克服其中的一些缺点。特别地,本发明寻求提供一种风险评估,在早产症状出现之前的数周甚至数月内,对早产高风险妇女进行分类。
鉴于上述考虑,设计本发明。
发明概述
本发明提供用于预测受试者早产风险或可能性的新颖生物标记及方法。本发明公开的生物标记通过元数据分析(meta-data analysis)鉴定,接着在病患来源的样本中验证。本发明公开的生物标记在个体症状出现之前数周或数月,将足月产与早产个体的样本区分。此类生物标记可用于鉴定个体的早产风险,因此可用于指导临床决策,例如开始治疗以延长妊娠期及/或预防或减少早产风险。
本发明公开的方法可用于确定无症状或有症状个体的早产风险或可能性。在特定实施例中,个体是无症状的。
如本发明公开的,ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2为早产的生物标记。ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2中的每一个可用于鉴定有早产风险个体的方法,以及用于确定是否个体有早产风险或用于预测是否个体有早产风险的方法。相较于对照组或参考水平,生物标记的水平的变化可代表该个体有早产风险。所述方法涉及确定受测个体样本中ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2的量。在一些方面,所述方法涉及确定所有生物标记ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2的量,并预测早产风险。
特定生物标记低度表达时,可表示该个体有早产风险,所述生物标记包括ECM1、GGH、LAMC2、EFEMP1、PTN、及FGA。
特定生物标记过度表达时,可表示该个体有早产风险,所述生物标记包括GGH、LAMC2、EFEMP1、PTN、FGA、及PEDF。
在一些情况下,若生物标记在妊娠的特定时点过度表达,或在妊娠的不同时点低度表达,则可表示个体具有早产风险。
本发明提供一种预测是否个体有早产风险的方法,所述方法包括确定从个体取得的样本的生物标记的水平,及基于生物标记数值,将个体分类为有早产风险或无早产风险,其中生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。本方法可进一步包括对经确定具有风险的个体给予治疗。所述治疗可包括子宫颈环扎术或给予一种或多种药剂,所述药剂选自于黄体酮或其类似物、安胎剂(tocolytic)、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-α-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
本发明还公开了一种确定个体经历早产可能性的方法,所述方法包括检测个体样本的生物标记数值,所述生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2,及基于生物标记数值,确定一个体将经历早产的百分比可能性。
本发明还公开了一种用于预测是否个体有早产风险的计算机执行方法,该方法包含在计算机上检索个体的生物标记信息。所述信息包含对应于至少一种选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2的生物标记的生物标记数值,并通过计算机对生物标记数值进行分类;基于所述分类,指出个体有早产风险的可能性。
本发明还公开了一种治疗方法,包含投予一或多个药剂,其选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物,于一基于生物标记数值,确定有早产风险的个体,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。本发明还公开了一种用于本方法的黄体酮,以及黄体酮在制备用于本方法药物的用途。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-α-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
本发明还公开了一种治疗方法,包括基于生物标记数值来确定有早产风险的个体的子宫颈环扎术,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。还公开了用于选择个体进行子宫颈环扎术治疗的方法。
本发明还公开了一种用于经预测有早产风险个体的治疗方法的安胎剂或类固醇,其中所述个体基于生物标记数值确定有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。还公开了一种治疗方法,包括给予安胎剂或类固醇于确定有早产风险的个体,其中所述个体基于生物标记数值确定有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。
与此相关,本发明提供一种安胎剂或类固醇用于制造药剂的用途,以治疗确定有早产风险的个体,其中所述个体基于生物标记数值预测有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。
所述安胎剂或类固醇用于,或所述药剂可用于一涉及确定生物标记数值方法,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2,且基于该生物标记数值确定早产风险。
本发明还公开了一或多个药剂,选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物,用于预测有早产风险的个体的治疗方法,其中所述个体基于生物标记数值确定有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-α-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
本发明还公开了一治疗方法,包含投予一或多个药剂,其选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物,于确定有早产风险的个体,其中所述个体基于生物标记数值确定有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。黄体酮可为一合成的黄体酮,如17-α-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
本发明还提供一或多个药剂,选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物,制成药剂的用途用于治疗确定有早产风险的个体,其中所述个体基于生物标记数值确定有早产风险,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-α-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
所述试剂或药剂用于或可用于涉及确定一生物标记数值的方法,该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2,基于该生物标记数值可确定早产风险。本发明提供一种用于检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2的方法,该方法包括:
a.从个体取得阴道流体样本;
b.通过阴道流体样本与抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体的接触并且检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2与抗体间的结合作用,检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2是否存在于阴道流体样本中。
还提供了一种用于确定个体有早产风险的方法,所述方法包括:
a.从个体取得样本;
b.通过样本与抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体的接触并且检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2与抗体间的结合作用,检测是否ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2存在于样本中;以及
c.当检测到阴道流体样本中存在ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2时,则确定个体有早产风险。
在一些情况下,抗体来源自小鼠、兔子、或山羊,较佳地,小鼠或兔子。抗体可为人类、人源化、或嵌合抗体。较佳地,样本为阴道流体样本。阴道流体样本可为子宫颈阴道流体样本。或者,样本为羊水样本。
一种确定个体有早产风险并延长个体妊娠的方法,该方法包含:
a.从个体取得样本;
b.检测是否ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2存在于血浆样本;
c.当阴道流体样本中检测到存在ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2时,则确定个体有早产风险;以及
d.给予经确定有早产风险的个体一有效量的一或多个药剂,其选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物,或者若个体经确定有早产风险,则选择该个体并以一有效量的安胎剂或类固醇治疗。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-a-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
在一方面,本发明公开了一用于预测受试者早产风险或可能性的试剂盒,该试剂盒包含抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体。较佳地,该抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体能选择性结合至ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2。
本发明公开的某些方面描述确定个体早产风险的计算机执行方法。本方法可涉及提供从个体所取得样本中ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2中至少一种的相对应量的数据;通过由计算机,进行生物标记数值的分类;以及基于该分类确定个体的早产风险。
本发明包括所述诸多方面和优选特征的组合,除非这样的组合是明显不允许的或明确避免的。
附图简述
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方式和实验。,其中:
图1.本图代表足月产与早产样本间的ECM1量差异。依据调整总蛋白质浓度的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周之间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图2.本图代表依据采样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的ECM1量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图3.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的ECM1量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12,5-8,1-4)。计算各组平均值。
图4.本图代表足月产与早产样本间的GGH量差异。依据调整总蛋白质浓度的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周之间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图5.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的GGH量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图6.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的GGH量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12,5-8,1-4)。计算各组平均值。
图7.本图代表足月产与早产样本间的LAMC2量差异。依据调整总蛋白质浓度的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周之间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图8.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的LAMC2量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图9.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的LAMC2量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12、5-8、1-4)。计算各组平均值。
图10.本图代表足月产与早产样本间的EFEMP1量差异。依据调整总蛋白质的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周之间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图11.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的EFEMP1量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图12.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的EFEMP1量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12、5-8、1-4)。计算各组平均值。
图13.本图代表足月产与早产样本间的PTN量差异。依据调整总蛋白质浓度的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周的间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图14.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的PTN量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图15.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的PTN量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12、5-8、1-4)。计算各组平均值。
图16.本图代表足月产与早产样本间的FGA量差异。依据调整总蛋白质的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周的间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图17.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的FGA量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图18.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的FGA量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12、5-8、1-4)。计算各组平均值。
图19.本图代表足月产与早产样本间的PEDF量差异。依据调整总蛋白质的ELISA免疫试验结果,计算平均生物标记蛋白质浓度。在妊娠19-37周的间收集足月(n=136)与早产(n=64)样本,并呈现整个组间的平均差异。以学生t检测分析数据。P=p值。
图20.本图代表依据取样时的妊娠年龄,足月产与早产样本间的PEDF量差异。依据取样时间,将样本分成四组,18+0-23+6天的妊娠周数(18-24)、24+0-27+6天的妊娠周数(24-28)、28+0-31+6天的妊娠周数(28-32)、及32+0-37+6天的妊娠周数(32-37)。各组随后分成足月产与早产样本且计算平均值,并以柱状图表示。
图21.本图代表依据从样本收集到分娩时间,妇女足月产与早产间的PEDF量差异。样本分成4组,每组间距4周,以评估依据出生前几周的足月产与早产样本间的差异。各组的取样与分娩间的时间分别为超过12周(>12)、9-12、5-8、及1-4周(9-12、5-8、1-4)。计算各组的平均值。
图22.H2O2对细胞存活力与增生的影响。Ect1与End1细胞以50μM、100μM、200μM、及400μM H2O2处理24h。利用MTT试验评估Ect1与End1的细胞活性与增殖,并以对未经处理对照组(0μMH2O2)的%表示。数据以平均值±SEM表示,且利用学生t检定分析。相较于个别的对照组,*P<0.05,n=3。
图23.H2O2对Ect1与End1细胞中ECM1表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的ECM1。计算H2O2处理后的ECM1表达的倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)除以标准化的ECM1量(pg/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少4个独立实验,并利用学生t检定分析。相较于对照组,*P<0.05。
图24.H2O2对Ect1与End1细胞中LAMC2表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的LAMC2。计算H2O2处理后的LAMC2表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的LAMC2量(pg/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少4个独立实验,并利用学生t检定分析。相较于对照组,*P<0.05。
图25.H2O2对Ect1与End1细胞中FGA表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的FGA。计算H2O2处理后的FGA表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的FGA量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少5个独立实验,并利用学生t检定分析。**P<0.005,相较于对照组。
图26.H2O2对Ect1与End1细胞中GGH表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的GGH。计算H2O2处理后的GGH表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的GGH量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少5个独立实验,并利用学生t检定分析。
图27.LPS对Ect1与End1细胞中ECM1表达的影响。利用ELISA定量LPS处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的ECM1。计算LPS处理后的ECM1表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的ECM1量(pg/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,并利用学生t检定分析,n=5。相较于个别对照组,*P<0.05。
图28.LPS对Ect1与End1细胞中LAMC2表达的影响。利用ELISA定量LPS处理(24h)之后(a)Ect1与(b)End1培养基中的LAMC2。计算LPS处理后的LAMC2表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的LAMC2量(pg/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,并利用学生t检定分析,n=5。较于个别对照组,*P<0.05、**P<0.05。
图29.LPS对Ect1与End1细胞中GGH表达的影响。利用ELISA定量LPS处理(24h)之后Ect1与End1培养基中的GGH。计算LPS处理后的GGH表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的GGH量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,并利用学生t检定分析,n=5。
图30.LPS对Ect1与End1细胞中FGA表达的影响。利用ELISA定量LPS处理(24h)之后Ect1与End1培养基中的FGA。计算LPS处理后的FGA表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的FGA量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,并利用学生t检定分析,n=5。
图31.H2O2对Ect1细胞中EFEMP1表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)之后Ect1培养基中的EFEMP1。计算H2O2处理后的EFEMP1表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的EFEMP1量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少5个独立实验,并利用学生t检定分析。相较于对照组,**P<0.05,。
图32.H2O2对End1细胞中EFEMP1表达的影响。利用ELISA定量H2O2处理(24h)的后End1培养基中的EFEMP1。计算H2O2处理后的EFEMP1表达倍数变化,以经处理细胞与未经处理细胞(对照组)的量除以标准化的EFEMP1量(ng/mg总蛋白质)。数据以平均值±SEM表示,其取自至少5个独立实验,并利用学生t检定分析。相较于对照组,**P<0.005,。
发明详述
现将参照附图讨论本发明的诸方面与实施例。进一步方面与实施例对本领域技术人员而言将显而易见。本文中提到的所有文献皆并入本案以做为参考文献。
本文所述的方法与生物标记可用于确定是否个体有早产风险、鉴定个体有早产风险、或预测个体的早产风险。
本文中的术语“预测”与“确定”可互换使用,且用于说明或评估个体将发生早产。本文揭示的方法可用于确定或预测个体将经历早产的可能性(或“风险”)。
早产为母体在妊娠达到37周之前分娩胎儿。早产可细分为晚期早产35+0天至36+6天的妊娠、中期早产32+0天至34+6天的妊娠、及早期早产32周前的妊娠。
早产成因往往不明。危险因子包括糖尿病、高血压、怀有一个以上的婴儿、肥胖或体重不足、多种阴道感染、吸烟、及心理压力等。
子痫前症(preeclampsia)临床上的表现为高血压与蛋白尿,表现在产前20周与产后6周。尽管子痫前症可导致早产,但在许多情况下却不能。子痫前症只是导致早产风险增加的一个因子,因此,已知引起子痫前症或与子痫前症相关的因子不一定是致病因素或与早产有关。
生物标记
本发明公开的方法涉及确定生物标记的存在或不存在,或进行定量。所述生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2的组合。
本文所使用的每一个生物标记可单独使用或结合其他生物早产标记使用。在一些试验中,本文公开的生物标记蛋白质中的一些或全部被组合使用。此外,生物标记可与一或多个其他早产指标一起使用,包括胎儿纤维接合素(Fetal Fibronectin,fFN)测试、收缩、阴道流血、自阴道渗出流体、阴道排出物增加、背痛、及下腹部痉挛。
细胞外基质蛋白1(ECM1);UniProtKB–Q16610
此基因编码一~85KDa的可溶性蛋白质,其参与软骨内骨形成(endochondralbone formation)、内皮细胞增生、血管生成(angiogenesis)、及肿瘤生物学。所述蛋白亦与多种细胞外与结构蛋白质相互作用,有助于维持皮肤完整性与体内平衡。ECM1在多种组织中可作为”生物胶”,其有助于胶原蛋白的组织与支撑。
此基因已被提及有4个编码不同异构型的可变剪接转录变体。依据本发明所公开的,所述变体的任一种都可用作生物标记。在一些情况下,检测到变体1。如图1所示,所有样本(在19与37周妊娠之间收集)中ECM1的整体平均浓度,在经历过早产的个体样本中低于经历过足月产的样本(p=0.025)。这表明样本中ECM1的低度表达,表示个体有早产风险。
此进一步如图2所示,在所有的取样时点,经历过早产的个体样本中ECM1低度表达。在疑似有早产风险的个体中,较低的ECM1量可表示,分娩将发生在不到12周、不到9周、或不到4周内。
γ-谷氨酰基水解酶(GGH);UniProtKB–Q92820
GGH水解喋酰基聚谷氨酸的聚谷氨酸侧链,其逐步从喋酰基聚-γ-谷氨酸移除γ-谷氨残基,以产生喋酰基-α-谷氨酸(叶酸)与游离谷氨酸。其可在膳食喋酰基聚谷氨酸的生物利用率及喋酰基聚谷氨酸与抗叶酸的代谢中扮演重要角色。
如图4所示,所有样本(在19与37周妊娠之间收集)中GGH的整体平均浓度,在经历过早产的个体样本中高于经历过足月产的样本。这表明样本中GGH的过度表达,表示个体有早产风险。从图5与图6中特别明显可见,在妊娠1-4周以内或在32-37周的早产样本中,GGH特别地过度表达。这表明在妊娠32-37周的样本中,GGH过度表达,表示个体有早产风险。反过来,在妊娠32周之前或约26周以内所得样本的GGH低度表达,可表示个体有早产风险。在怀疑有早产风险的个体中,GGH的量增加可表示将在4周以内分娩。
层连结蛋白亚基γ-2(LAMC2);UniProtKB–Q13753
LAMC2为肝素结合蛋白,其经由高亲和性受体结合细胞。层连结蛋白被认为利用与其他细胞外基质组分相互作用,在胚胎发育过程中介导细胞附着、迁移、及组织化进入组织。拉德辛(Ladsin),一含有层连结蛋白γ-2链的层连结蛋白变体,对多种细胞发挥细胞发散活性(cell-scattering activity),包括上皮细胞、内皮细胞、及纤维母细胞。
如图7所示,LAMC2在经历过早产的个体样本中高于经历过足月产的样本。这表明样本中LAMC2的过度表达,表示个体有早产风险。
如图8所示,LAMC2在妊娠不到32周的早产样本中或在出生前少于8周获得的早产样本中过度表达(图9)。
含有类纤连蛋白的EGF细胞外基质蛋白1(EFEMP1);UniProtKB–Q12805
EFEMP1蛋白结合EGFR,即EGF受体,且诱发EGFR自磷酸化(autophosphorylation)及下游讯息路径活化。其在细胞黏附与迁移中发挥作用。其可作为软骨细胞分化的负调节因子。在嗅上皮(olfactory epithelium)中,其可调节胶质细胞迁移、分化、及神经胶质细胞支持神经元突起生长(neurite outgrowth)的能力。
如图10所示,EFEMP1在经历过早产的个体样本中高于经历过足月产的样本。这表明样本中EFEMP1的过度表达,表示个体有早产风险。在图11与图12中也明显可见,在出生前至少8周或妊娠28周的早产样本中,EFEMP1增加。
从确定有早产风险的个体样本中,EFEMP1的显著上调,可表示将在接下来的1-4周内分娩。从妊娠18-24之间或19-26周之间的样本中,EFEMP1的下调,可表示个体将经历早产。
多效生长因子(Pleiotrophin;PTN);UniProtKB–P21246
PTN为分泌型生长因子,其诱导神经突起生长,对纤维母细胞、上皮细胞、及内皮细胞有促有丝分裂作用(PubMed:1768439,PubMed:1733956)。其与间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase;ALK)结合,后者诱导MAPK路径活化,为PTN抗细胞凋亡讯息传导及细胞增生调节的重要步骤(PubMed:11278720)。其经由硫酸软骨素(chondroitinsulfate)基团与细胞表面标靶蛋白质结合(PubMed:26896299)。在结合时,PTN使PTPRZ1的去磷酸酶活性失活。
如图13所示,PTN在经历过早产的个体样本中低于经历过足月产的样本。这显示,样本中PTN低度表达可表示个体有早产风险。在图14与图15中也明显可见,其中PTN在经历过早产、妊娠32周以内、或产前4周以上取样的个体样本中减少。样本中PTN过度表达,可表示个体将在接下来的1-4周内经历早产。
纤维蛋白原α链(FGA);UniProtKB–P02671
FGA经蛋白酶凝血酶(thrombin)切割,产生单体,其与纤维蛋白原β(FGB)与纤维蛋白原γ(FGG)一起聚合形成不溶性纤维蛋白基质。纤维蛋白在止血(haemostasis)过程中具有主要功能,其为血液凝块的主要成分之一。此外,其在伤口修复早期阶段起作用,以稳定病变,并于再次上皮化(re-epithelialization)期间引导细胞迁移。基于抗凝血的体外研究,FGA最初被视为血小板凝集所必需的。然而,随后的研究显示,其在体内血栓(thrombus)形成并非绝对必要。FGA经由ITGB3依赖性途径增强活化型血小板中P选择素(P-selectin;SELP)的表达。产妇纤维蛋白原是成功妊娠的必要条件。纤维蛋白沉积亦与感染相关联,其可预防IFNG介导的出血。其亦可经由先天性与T细胞介导的途径促进免疫反应。
如图16所示,FGA在经历过早产的个体样本中高于经历过足月产的样本。这表明样本中FGA过度表达,表示个体有早产风险。在图17与图18中也明显可见,样本中FGA的过度表达可表示个体可能会经历早产,特别是当样本在妊娠24周以前或妊娠32周以后收集。FGA的过度表达可表示个体可能会在接下来的1-4周内经历早产。
在妊娠24与28周之间所收集样本中FGA的低度表达,可表示个体可能会经历早产。
色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium-Derived Factor;PEDF);UniProtKB–P36955
PEDF为神经营养性蛋白(neurotrophicprotein),其在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)细胞中诱发广泛的神经元分化,且为血管生成(angiogenesis)的有效抑制剂。由于其不经历活性丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)的S(应激)至R(松弛)构象转变特征,因此其没有丝氨酸蛋白酶抑制活性。
如图19所示,PEDF在经历过早产的个体样本中高于经历过足月产的样本。这表明样本中PEDF过度表达,表示个体有早产风险。在图20与图21也明显可见,样本中PEDF过度表达可表示个体可能会经历早产,不论采样时间如何。PEDF的过度表达,表示个体在接下来的1-4周内可能会经历早产。
本文公开的特定方法涉及检测生物标记数值或生物标记的水平。所述术语指使用任何适当的分析方法检测生物样本中的生物标记,并指示其存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、量、表达量、比率、或相对应样本中生物标记的其他测量值。值或量的确切性质取决于用于检测生物标记的特定分析方法的特殊设计与组分。
若生物标记表示个体有早产风险,则可为过度表达或低度表达,其相较于参考值或量,或指示或有足月产征象的生物标记。“上调”、“过度表达”、“增加”、相关术语意指样本的值或量大于生物标记的值或量(或值或量的范围),后者通常在已知经历过足月产的个体的类似样本中检测到。
“下调”、“低度表达”、“减少”、及相关术语意指样本的值或量小于生物标记的值或量(或值或量的范围),后者通常在已知经历过足月产的个体的类似样本中检测到。
生物标记过度表达或低度表达亦可指相较于已知经历足月产个体中观察到的表达量或值,视为“差异性表达”或具有“差异”量或值。差异性表达亦可指生物标记“正常”表达量的变异值。
术语“差异基因表达”与“差异性表达”可互换使用,代表一基因(或其相应的蛋白质表达产物)在有早产风险的受试者中,相对于其在已知经历过足月产的个体中,所述基因表达经活化至更高或更低的量。本术语也包括基因(或相应的蛋白质表达产物)的表达在相同疾病的不同阶段中经活化至更高或更低的量。还应理解到,差异性表达基因的核酸量或蛋白质量可经活化或抑制,或者可进行选择性剪接(alternative splicing),以产生不同的多肽产物。此类差异可通过多种变化证明,包括mRNA量、表面表达、分泌、或多肽的其他区分方式。差异性基因表达可包括二或多个基因或其基因产物之间的表达比较;或二或多个基因或其基因产物之间的表达比率的比较;或甚至同一基因的二个不同加工产物的比较,其在有早产风险个体或足月产的个体之间有所不同。差异性表达包括,在经历早产与足月产个体中,一基因或其表达产物在时间或细胞表达模式上的定量与定性差异。
方法结果
本文揭示的方法用于鉴定个体有早产风险,或用于确定是否一个体有或无早产风险。本方法亦可用于预测个体的早产风险。
在一些情况下,本方法可涉及记录生物标记的水平的步骤。在一些情况下,本方法可涉及将本文公开的生物标记的水平传递给参与护理受测个体的医师的步骤。在一些情况下,本方法也涉及传递生物标记参考水平,用于与个体的生物标记的水平比较。在一些情况下,将经确定的个体的早产风险量传递给医师。举例而言,风险量可以用百分比表示(其中100%表示个人确定会经历早产,0%表示个体确定会经历足月产)。因此,本文公开的一些方法涉及将百分比数值分配给确定具有风险量的个体。本方法涉及将该百分比传递于参与护理该个体的医师的步骤。
本文公开的方法可用于选择要治疗或其他管理的个体。本文公开的特定方法涉及给经鉴定有早产风险的个体给予治疗。
本文所公开的方法中有用的治疗包括给予黄体酮、合成的黄体酮或黄体酮类似物、一或多个选自于黄体酮或其类似物的药剂、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物。黄体酮可为合成的黄体酮,如17-a-羟基黄体酮己酸酯。安胎剂可为硫酸镁、吲哚美辛、或硝苯地平。抗生素可为红霉素或青霉素。NSAID可为吲哚美辛。ω3脂肪酸衍生物可为二十二碳六烯酸(DHA)。
个体可经筛选以进行黄体酮治疗。黄体酮经证实在许多临床研究中可降低早产率,这些研究中的女性为子宫颈长度较短或有早产病史的高风险群体。黄体酮治疗可包含投予天然的黄体酮,或合成的黄体激素(progestin),如17-α-羟基黄体酮己酸酯。黄体酮可为P4微粉化(天然)黄体酮。17-α-羟基黄体酮己酸酯已知的品牌名称有DelalutinTM、ProlutonTM、Proluton DepotTM、及MakenaTM。天然的微粉化黄体酮与天然黄体酮,与在黄体与胎盘中产生的类似。微粉化黄体酮可用作口服胶囊、阴道凝胶、或阴道栓剂。合成的黄体激素包括醋酸甲羟黄体酮(MPA,亦称作贮型醋酸甲羟黄体酮(DMPA))与醋酸炔诺酮(NETA)。它们通常通过注射给予。合成的黄体激素已知的品牌名称有(MPA)ProveraTM,Depo-ProveraTM,Depo-SubQProvera104TM,CurretabTM,CycrinTM,FarlutalTM,GestapuranTM,PerlutexTM,VeramixTM and(NETA)Primolut-NorTM,AygestinTM,GestakadinTM,MilligynonTM,MonogestTM,NorlutateTM,PrimolutNTM,SH-420TM,SovelTM,StyptinTM。微粉化黄体酮可由病患自行投予。天然的微粉化黄体酮亦有品牌名称PrometriumTM,UtrogestanTM,EndometrinTM and CrinoneTM。投予方式可为口服、阴道、或肌内给药。还公开了用于此类方法的黄体酮、黄体激素、或17-α-羟基黄体酮己酸酯,或用于制造用于此类方法的药剂所使用的黄体酮、黄体激素、或17-α-羟基黄体酮己酸酯。
经鉴定有早产风险的个体,可利用子宫颈环扎术治疗。子宫颈环扎术亦可称作子宫颈针术(cervical stitch)。子宫颈环扎术用于治疗子宫颈功能不全或子宫颈功能不足,其在怀孕期间子宫颈太早缩短与打开。子宫颈环扎术可涉及在子宫颈内与子宫颈周围强力缝合。
可使用任何已知形式的子宫颈环扎术。举例而言,子宫颈环扎术可为麦当劳环扎术(McDonald cerclage)、施罗卡环扎术(Shirodkar cerclage)、或腹部环扎术。子宫颈环扎术可特别适用于经确定具有子宫颈功能不全的个体。子宫颈功能不全可利用经阴道超音波扫描(transvaginal ultrasound scan)确定。
或者,治疗可包含子宫颈子宫托(cervical pessary)。在一些情况下,治疗可为阿拉伯胶素子宫托(Arabin Pessary)。
在一些情况下,个体可经筛选以接受安胎剂或类固醇,如皮质类固醇。安胎剂可用于阻止早产期间的子宫收缩。类固醇可能有助于胎儿肺部发育。本方法可涉及将安胎剂或类固醇投予个体的步骤。安胎剂与类固醇已用于妇女子宫收缩。适用于本发明的安胎剂药剂实例为硫酸镁、吲哚美辛、及硝苯地平。
在一些情况下,本方法用于选择一个体以进一步、定期、或密集监测。举例而言,本方法可用于确定应该从该个体获得更多的样本,且在未来确定生物标记的存在或不存在及/或量。可在第一次取样后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36周,取得进一步样本。进一步样本可在妊娠的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或27周取得。本方法可涉及在怀孕期间每1、2、3、4、或5周进一步取样。
在一些情况下,个体可以抗生素处理。抗生素可特别用于早产胎膜早破(pretermpremature rupture of the membranes;PPROM)的个体。适用的抗生素包括红霉素与青霉素。
在一些情况下,治疗可以是给予NSAID。NSAID可抑制前列腺素,以减少子宫收缩。NSAID可为吲哚美辛。在一些情况下,治疗可为ω3脂肪酸或ω3脂肪酸的衍生物。举例而言,治疗可为DHA(二十二碳六烯酸)。
监测可包含监测胎儿窘迫(fetal distress),如监测胎儿心跳、监测胎儿运动、或胎粪监测。
生物标记测定
本文公开的生物标记较佳地为蛋白质生物标记。可使用本领域已知的任何检测及/或定量蛋白质的方法。
可以体外、离体、或体内方式进行本发明方法,或者呈现产物。术语“体外”指在涵盖以材料、生物物质、细胞、及/或组织在实验室条件下或培养中进行实验,而术语“体内”指在涵盖以完整多重细胞生物体的实验与程序。“离体”指在生物体外存在或发生的事物,如人体或动物体外,其可在生物体的组织(如整个器官)或细胞上进行。
本文公开的方法与确定蛋白质表达有关。蛋白质表达可通过定量细胞、组织、或样本中蛋白质的量,或通过观察蛋白质在细胞与组织内的位置测量。
在一些情况下,免疫试验用于检测受试者样本中的生物标记标靶。免疫试验使用对标靶分子具有特异性亲和力的抗体或其他实体结合可检测分子。在一些情况下,抗体与可检测分子结合。可检测分子可指一标记。当抗体结合至标靶分子时,可检测分子产生一可检测讯号。可检测讯号可为一可定量讯号。在一些情况下,以适配体(aptamer)代替抗体,或与抗体一起使用。免疫试验包括ELISA、免疫墨点法、流式细胞术、及免疫组织化学法。在本文所述的特定方面中,试验为免疫组织化学式验。此类测定通常使用抗体,尽管亦可使用其他标靶特异性分子,如适配体或其他配体。亦可使用抗体数组或蛋白质芯片。
本方法经监管机构批准使用。本方法为FDA批准的方法。
抗体
与本发明的生物标记结合的抗体是已知的。鉴于现今与单克隆抗体技术相关的技术,可以针对多数抗原制备抗体。
抗原结合部分可为抗体的一部分(如Fab片段)或合成的抗体片段的一部分(如单链Fv片段[ScFv])。可利用已知的技术制备针对所选抗原的合适的单克隆抗体,如《单克隆抗体:技术手册》(Monoclonal Antibodies:A manual of techniques),HZola(CRC出版社,1988);与《单克隆杂交瘤抗体:技术与应用》(Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications),J G R Hurrell(CRC出版社,1982)所公开的。嵌合抗体由Neuberger等人在1988年第八届国际生物技术研讨会第二部分,第792-799页(1988,8thInternational Biotechnology Symposium Part 2,792-799)所论及。
单克隆抗体(mAbs)适用于本发明方法,且为特异性靶向抗原上单一表位的同源抗体群体。适用的单克隆抗体可利用本领域的已知方法制备(例如,参见G.;Milstein,C.(1975).连续培养分泌预定特异性抗体的融合细胞(Continuous cultures offused cells secreting antibody of predefined specificity),Nature 256(5517):495;Siegel DL(2002).重组单克隆抗体技术(Recombinant monoclonal antibodytechnology).Schmitz U,Versmold A,Kaufmann P,Frank HG(2000);噬菌体展示综述:生成抗体的分子工具(Phage display:a molecular tool for the generation ofantibodies--a review).Placenta.21增刊A:S106–12.Helen E.Chadd和StevenM.Chamow;治疗性抗体表达技术(Therapeutic antibody expression technology),Current Opinion in Biotechnology 12,no.2(4月1日,2001):188-194;McCafferty,J.;Griffiths,A.;Winter,G.;Chiswell,D.(1990).噬菌体抗体:显示抗体可变结构域的丝状噬菌体(Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variabledomains).Nature 348(6301):552–554;《单克隆抗体:技术手册》(MonoclonalAntibodies:A manual of techniques),H Zola(CRC出版社,1988)及在《单克隆杂交瘤抗体:技术与应用》(Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications),JG R Hurrell(CRC出版社,1982).嵌合抗体由Neuberger等人在1988年第八届国际生物技术研讨会第二部分,第792-799页(1988,8th International Biotechnology SymposiumPart 2,792-799)所论及)。
多克隆抗体适用于本发明方法。较佳地,为单特异性多克隆抗体。适用的多克隆抗体可利用本领域已知的方法制备。
抗体片段,如Fab与Fab2片段,亦可作为或基因工程为抗体与抗体片段。抗体的可变重链(VH)与可变轻链(VL)结构域涉及抗原识别,此一事实在早期的蛋白酶消化实验中首次确认。利用啮齿类抗体的"人源化"进一步确认。将啮齿源的可变结构域融合至人源的恒定结构域,如此得到的抗体保留啮齿类亲代抗体的抗原特异性(Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 81,6851-6855)。
该抗原特异性由可变结构域赋予,且独立于恒定结构域,其由细菌表达抗体片段的实验得知,所有皆含有一或多个可变结构域。此等分子包括类Fab分子(Better等(1988)Science 240,1041);Fv分子(Skerra等(1988)Science 240,1038);单链Fv(ScFv)分子,其中VH与VL配偶体结构域经由一挠性多胜肽连接(Bird等(1988)Science 242,423;Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 85,5879),且单一结构域抗体(dAbs)包含经分离的V结构域(Ward等(1989)Nature 341,544)。针对抗体片段合成中涉及的技术及其保留的特异性结合位点的一般性综述,可见于Winter&Milstein(1991)Nature 349,293-299。
术语"ScFv分子"意指VH与VL配偶体结构域通过共价相连接的分子,。例如,直接地,通过多肽或者通过柔性寡肽连接。
Fab、Fv、ScFv、及dAb抗体片段皆可在大肠杆菌中表达并分泌出,因此容易生产大量的所述片段。
整个抗体,及F(ab')2片段为"二价"。术语"二价"意指该抗体与F(ab')2片段具有二个抗原结合位点。相反地,Fab、Fv、ScFv、及dAb片段为单价,其仅具有一个抗原结合位点。可结合生物标记的合成抗体亦可利用本领域已知的噬菌体展示(phage display)技术制备(如,请见噬菌体展示综述:生成抗体的分子工具(Phage display:a molecular tool forthe generation of antibodies--a review).Placenta.21增刊A:S106–12.HelenE.Chadd和Steven M.Chamow;噬菌体抗体:显示抗体可变结构域的丝状噬菌体(Phageantibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains).Nature 348(6301):552–554)。
在一些较佳的实施例中,抗体可检测地标记,或至少能检测。举例而言,抗体可以放射性原子或有色分子(发色团)或荧光分子或可以任何其他方式易于检测的分子标记。适用的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物、及放射性标记物。抗体可直接以可检测标记物标记,或可间接标记。举例而言,抗体可未经标记,且可通过另一本身被标记的抗体进行检测。或者,二级抗体可结合生物素(biotin),而以经标记的链霉亲和素结合生物素,可用于间接标记一级抗体。
本文公开的一方面为抗体与生物标记的复合物,所述生物标记选自于由ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2组成的组合。本复合物可进一步包含二级、不同的抗体。本复合物可进一步包含可检测部分。本复合物可出现在子宫颈阴道流体样本的中。本复合物可经分离。
检测与标记
本文公开的方法涉及检测及/或定量生物标记。
在本文公开的方法中,可直接检测生物标记(即“标靶”)。也就是说,该标靶通过利用抗-标靶抗体检测。
或者,可间接检测标靶。也就是说,可利用抗-标靶抗体检测该标靶,且该抗-标靶抗体接着利用二级可检测抗检测体。二级抗体优先地被标记。适用的二级抗体可为针对动物物种的抗体异构型,其中已有一级抗体产生。举例而言,二级抗体可为抗-小鼠抗体,其能结合小鼠抗体。使用二级抗体的方法可比直接检测方法更灵敏,因多个二级抗体结合各一级抗体时信号放大。
适用的标记包括酶,如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、及荧光素酶,以及比色试剂,包括量子点、荧光团、及发色团。适用的荧光团包括FITC、TRITC、Cy5、TexasRed、Alexa Fluor等。标记可为放射性标记。
有多个可检测的酶底物可用于酶标记抗体。这些包括显色(chromogenic)检测统,如辣根过氧化物酶(HRP)、pNNP、BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸盐/硝基蓝四唑鎓)、TMB(四甲基联苯胺)、DAB(3,3’-二胺基基联苯胺)、邻苯二胺二盐酸盐(ortho-phenylenediainedihydrochloride;OPD)、及2,2’-次偶氮基双[乙基苯并噻唑啉-6-磺酸](2,2’-azinobis[-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]);ABTS),以及化学发光底物,如ECL(增强型化学发光)标记或吖啶酯(Acridinium ester;AE)。
本方法可涉及使用抗体或抗体衍生的结合剂,如scFv或Fab片段。或者,与抗体结合,本方法可涉及使用适配体。
ELISA
在一些情况下,标靶可利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay;ELISA)检测。将样本中的标靶分子(如本文公开的蛋白质生物标记)连接至一表面,并利用特异性抗体检测。标靶可以非特异性方式(经由吸附至表面)或特异性方式(利用特定捕获试剂,如抗体)连接至表面。ELISA可用于定量样本中的标靶。表面可为固体撑体,如多孔盘、微珠、或量杆(dipstick)。
可使用商购的ELISA试验。ELISA可为间接型ELISA、夹层型ELISA、或竞争型ELISA。
ELISA涉及使用一级、捕获用抗体,以结合标靶分子。接着,加入二级、检测用抗体至该标靶分子。二级抗体的结合作用表示存在及/或标靶的量。
一级抗体可结合至固体撑体。一级与二级抗体不相同。通常,一级与二级抗体结合至标靶分子上的不同表位。在一些情况下,二级抗体结合至一级抗体与标靶的复合体,而非未形成复合物的单独一级抗体或标靶。二级抗体可经标记。
免疫染色
在一些方面中,标靶利用免疫印迹法或蛋白质印迹法检测。在此类方法中,样本中的蛋白质可依据其电荷或大小分离。其可利用电泳为主的方法分离。将分离的蛋白质转移至薄膜上,通过对标靶特异性的抗体染色。接着检测抗体,直接通过将抗体与可检测的标记物结合,或通过添加标记的第二抗体间接地检测抗体。
质谱
在一些方面中,本文公开的方法涉及使用质谱法检测及/或定量蛋白质。质谱法可使用具有标靶蛋白质独特序列的多肽作为标靶的替代物。依据蛋白质、蛋白质片段、或感兴趣的部分多肽的波峰质量与强度进行测量。在测量之前,将作为内标准品的固定量物质加入原始生物材料,并测量其波峰强度。由标靶的波峰强度与内标准品波峰强度的比率,计算原始生物材料中的标靶浓度。多个已知质谱法,可用于检测及/或定量本文公开的生物标记,包括MALDI-TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相层析-质谱法(LC-MS)、气相层析-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱法、核磁共振光谱法、或串联质谱法。
体外诊断剂与试剂盒
本发明公开的一方面包括体外诊断方法,以及使用此类方法的体外诊断试剂盒。本文所述的试剂盒可包括一或多个抗体,如抗-生物标记抗体或其片段。试剂盒可适于筛选出有早产风险的受试者。
所述试剂盒可适于定点照护(point-of-care)体外诊断测试。其可为用于以实验室测试为主的试剂盒。试剂盒可包括使用说明,如说明书或小册子。说明书可包括用于进行一或多个本文所述方法的任一者的步骤。说明书可包括用于进行免疫层析试验的步骤。其可描述用于针对不同类型样本的调整测试方法与建议。其可提供用于优化从测试获得的结果的方法与建议,如将信噪比最小化。
试剂盒可适进行免疫层析试验。在一些情况下,体外诊断测试涉及一侧流装置(lateral flow device),或一“量杆”测试。在一些情况下,试剂盒包括多孔盘或其他固体支撑体,所述支撑体预先覆盖捕获试剂,如抗-生物标记抗体。
试剂盒可额外包括标准品或对照组。试剂盒可额外包括缓冲液、稀释剂、或其他试剂,如中止缓冲液、样本制备缓冲液、呈色试剂、链霉亲和素偶联物、底物、或清洗缓冲液。
试剂盒适用于干燥样品、潮湿样品、冷冻样品、固定样本、尿液样品,唾液样品,组织样品,血液样品或任何其他类型样本,包括本文公开样品类型的任一者。
试剂盒可包含取得或处理阴道流体样本的装置。试剂盒可包含阴道流体萃取缓冲液,如含有约50mM HEPES,150mM NaCl,0.1%SDS,1mM EDTA,1mM Pefabloc SC 4-(2-胺基乙基)苯磺酰氟化物(AEBSF)的缓冲液。试剂盒可包含样本收集装置,如棉签(swab)、子宫颈阴道芯条(cervicovaginalwick)、类隔膜(diaphragm-like device)装置、子宫颈抽吸器、或细胞刷。试剂盒可包含适于储存阴道流体样本的容器。
适用于试剂盒的棉签包括泡沫棉签(foam swabs)、涤纶棉签(Dacron swabs)、人造丝棉签(rayon swabs)、植绒棉签(flocked swabs)、及棉质棉签。适用的泡状棉签包括MW942(Sigma Swab Duo)、聚胺酯泡状棉签(Catch All;Epicenter)、及Culture Swab EZ聚氨酯泡沫棉签(BD)。适用的涤纶棉签包括Deltalab Eurotubo 300263(FisherScientific,英国),、无菌G-in型涤纶针尖塑料涂抹器(Solon,斯科希甘,缅因州)、涤纶棉签(Cardinal Health,麦格劳公园,伊利诺伊州)、及涤纶棉签(Puritan Medical,吉尔福德,缅因州,美国)。适用的人造丝棉签包括BBL CultureSwab(Becton Dickinson,牛津,英国)及MW167适用的植绒棉签(尼龙)包括Seacliff包装,BD,COPAN。适用的棉质棉签包括无菌干燥棉签(Eurotubo,Rubi,西班牙)、棉质针尖棉签(FalconTM ScrewCap Single SWUBETM涂抹器,Becton Dickinson and Co.,斯帕克斯,马里兰州)、FalconTMScrew Cap Single SWUBETM涂抹器(BD)。
适用于试剂盒的芯条包括卫生棉条、条带、或海绵,包括眼用PVA海绵(EyetecTM,Network Medical Ltd.),Tear-FloTM条带(Wilson Ophthalmic),海绵(XomedSurgical Products,杰克逊维尔,佛罗里达州),Sno-strips(Akorn Inc.,阿比塔斯普林斯,洛杉矶)和Polywicks(Polyfiltronics,Rockland,马萨诸塞州,美国)。
适用于试剂盒的类隔膜装置包括Instead SoftCup(Ultrafem)、无菌纱布、或月经杯(SoftCup,EuroFemPro,Netherlands,or the SoftCup,Instead Inc.,圣地亚哥,加利福尼亚州)。
适用的子宫颈抽吸器包括阴道标本吸气器(CarTika),或长结核菌素(longtuberculin)注射器。
本文公开的特定试剂盒包含结合至早产生物标记的抗体,以及用于取得或加工阴道流体样本的装置或缓冲液。
结合至早产生物标记的抗体可为抗-ECM1抗体、抗-GGH抗体、抗-LAMC2抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-PTN抗体、抗-FGA抗体、或抗-PEDF抗体。
本文亦公开一组合物,包含阴道流体及抗-ECM1抗体、抗-GGH抗体、抗-LAMC2抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-PTN抗体、抗-FGA抗体、或抗-PEDF抗体。
采样方法
本文所述的方法与药剂涉及子宫颈阴道流体中特定生物标记的分析。数个已知的子宫颈阴道流体的取样方法,可用于本方法。
本方法可涉及利用子宫颈阴道灌洗取样。此涉及利用清洗缓冲液冲洗子宫颈阴道,且在冲洗后收集流体,以取得子宫颈阴道清洗液。
在一些方法中,采用子宫颈阴道棉签。适用的棉签为本领域熟知。较佳地,用于本文公开的方法与试剂盒的棉签包括泡沫棉签、涤纶棉签、人造丝棉签、植绒棉签、及棉质棉签。适用的泡沫棉签包括MW942(Sigma-Swab Duo)、聚胺酯泡状棉签(Catch-All;Epicenter)、及Culture SwabEZ聚胺酯泡状棉签(BD)。适用的涤纶棉签包括DeltalabEurotubo 300263(Fisher Scientific,UK),、无菌G-in型涤纶针尖塑料涂抹器(Solon,Skowhegan,ME)、涤纶棉签(Cardinal Health,McGraw Park,IL)、及涤纶棉签(PuritanMedical,Guilford,ME,USA)。适用的人造丝棉签包括BBLCultureSwab(Becton Dickinson,Oxford,UK)及MW167适用的植绒棉签(尼龙)包括Seacliff包装,BD,COPAN。适用的棉质棉签包括无菌干燥棉签(Eurotubo,Rubi,Spain)、棉质针尖棉签(FalconTM Screw Cap Single SWUBETM涂抹器,Becton Dickinson and Co.,Sparks,MD)、FalconTM Screw Cap Single SWUBETM涂抹器(BD)。
在其他方法中,子宫颈阴道流体以芯条取样。适用于本文公开方法的芯条包括卫生棉条、条带、或海绵,包括眼用PVA海绵(EyetecTM,Network Medical Ltd.),Tear-FloTM条带(Wilson Ophthalmic),海绵sponges(Xomed Surgical Products,Jacksonville,FL),Sno-strips(Akorn Inc.,Abita Springs LA)and和Polywicks(Polyfiltronics,Rockland,MA,USA)。
其他方法中,利用类隔膜装置取样子宫颈阴道流体。将合适的类隔膜装置放置在子宫颈上,以收集子宫颈阴道流体,并包括Instead SoftCup(Ultrafem)、无菌纱布、或月经杯(SoftCup,EuroFemPro,Netherlands,or the SoftCup,Instead Inc.,San Diego,CA)。
本方法亦涉及使用子宫颈抽吸器,如阴道标本吸气器(CarTika),或长结核菌素注射器。
在一些方法中,以细胞刷取样子宫颈阴道流体。
本文公开的特定试剂盒包含结合至早产生物标记的抗体,以及用于取得或加工阴道流体样本的装置或缓冲液。
对照组
在本文公开的一些方法中,生物标记的水平与对照组量或参考值或量相比较。
在一些情况下,对照组可为一参考样本或参考数据组。参考组可源自一或多个样本,其事先取自已知经历过早产的受试者。或者,参考组可源自一或多个样本,其事先取自已知经历过足月产的受试者。参考组可为分析一参考样本获得的数据组。
对照组可为阳性对照组,其中标靶分子已知存在或高量表达,或者可为标靶分子已知不存在或低量表达的阴性对照组。
对照组可为取自已知经历过早产或足月产的病患样本或量。对照组的值可为利用待测个体样本进行生物标记的平行分析而取得。或者,对照组的值可取自数据库或其他先前取得的值。
样本
本文公开的方法涉及从个体或病患取得的样本中检测生物标记。本方法可体外进行。较佳地,本方法涉及从个体取得样本。因此,本方法可行,但并非较佳,涉及从个体取得样本的步骤。
较佳地,样本为阴道流体样本,如子宫颈阴道(子宫颈-阴道(cervico-vaginal);宫颈-阴道(cervical-vaginal))流体(cervicovaginal fluid,CVF)或子宫颈流体(cervical fluid)。或者,样本可为血液样本,如全血、血浆、或血清样本、淋巴样本、尿液样本、或羊水样本。样本可为源自阴道流体或子宫颈阴道流体样本的蛋白质样本,或源自血液样本的蛋白质样本,如全血、血浆、或血清样本、淋巴样本、尿液样本、或羊水样本。
样本可经预先处理。举例而言,样本可事先接触一或多个防腐剂或缓冲液。样本可经冷冻、冻干、或干燥。
尽管个体或病患可为哺乳类动物,如猫、狗、马、或猿,但个体较佳为人类。“病患”、“个体”、及“受试者”等词于此可互换使用。
个体可为女性个体。个体可能怀孕。个体可能有症状或无症状。较佳地,个体无症状。
有症状的个体可为出现一或多个早产症状的个体,如收缩、特别规律的收缩、背痛,包括下背疼痛、下腹痉挛、或类似月经痉挛、自阴道渗出流体、类似流感症状、恶心、呕吐、骨盆或阴道压力增加、阴道排出物增多、及/或阴道出血。
无症状个体可为未出现任何早产症状或症状可能或可能不表示早产,如背痛,包括下背疼痛、下腹痉挛、或类似月经痉挛、自阴道渗出流体、类似流感症状、恶心、呕吐、骨盆或阴道压力增加、阴道排出物增多、及/或阴道出血。通常,无症状的个体不会出现任何早产症状。
在一些情况下,个体在取得样本之前,可能被怀疑处于高早产风险。举例而言,可取得样本及/或可确定生物标记的存在或生物标记的量,因怀疑个体有高早产风险。个体由于有早产或流产的过往病史,可怀疑其有高早产风险。或者,或额外地,个体依据其胎儿纤维接合素(fFN)测试结果,或依据症状如收缩、阴道出血、自阴道渗出流体、阴道排出物增加、背痛、或下腹痉挛,可怀疑其有高早产风险。或者,或额外地,个体由于存在一或多个危险因子,如糖尿病、高血压、怀有一个以上的婴儿、BMI(太高或太低)、多种阴道感染、吸烟、心理压力、种族背景、及社会经济地位或收入,可能被视为有高早产风险。
样本可在出生前几周或几个月,或在预产期之前取得。举例而言,样本可在出生前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36周取得。在一些情况下,样本在出生前1-4、5-8、9-12、或12周以上取得。
样本可在正常出生前的某时点取得,依据预估的37周期限,预期在出生前第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36周取得。在一些情况下,样本在预期正常出生日前1-4、5-8、9-12、或12周以上取得。
或者,样本可在预期正常出生日前约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、或约9个月取得。
另外而言,样本可在妊娠的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、或37周取得。
样本可在妊娠期10周至13周又6天、14周至21周又6天、22周至25周又6天、26周至29周又6天、30周至33周又6天、或34周以上取得。第一个样本可在约第12-14周取得。第二个样本可在16-24周之间取得。
样本可在第一、第二、或第三个妊娠期取得。第一个妊娠期持续从第0至13周又6天。第二个妊娠期持续从第14至27周加6天。第三个妊娠期持续从第28周至出生。
本领域技术人员应理解到,很难精准确定妊娠周数。评估妊娠周数为本领域熟知的方法,且所述的任一者可用于本文所公开的方法。举例而言,妊娠周数通常依据最后一次月经期(LMP)的日期估算。妊娠周数可因最后一次月经期开始的日期而定。或者,若知道的话,妊娠周数可依据排卵日而定。通常,排卵日是在最后一次月经开始日期之后的两周。妊娠长度可依据产检而定。产检通常在第10到13周又6天之间进行,依据最后一次月经第一天的日期而定。
不同的生物标记可能更合适不同的样本时间。举例而言,一生物标记在早期阶段个体取得的样本中,确定个体是否有早产风险可能有用,而不同的生物标记在后续阶段个体取得的样本中,确定个体是否有早产风险则可能有用。
在一些情况下,样本可在多个时间点从个体取得。举例而言,可在第一个妊娠期取得第一个样本,且可在第二个妊娠期取得第二个样本。可取得多个样本,以确定生物标记表达的趋势或变化。在一些情况下,可在妊娠早期取得样本,如在第一个妊娠期,以便为该个体建立对照组或生物标记的基线量。
蛋白质与多肽
尽管本发明的方法可涉及检测全长蛋白质序列,但这并非总是必需的。作为替代,可检测全长多肽的同源物、突变体、衍生物、异构型、剪接变体、或片段。
衍生物包括一给定全长蛋白质序列的变体,且包括天然存在的等位基因变体及合成的变体,其与全长蛋白质有实质性的氨基酸序列一致性。
蛋白质片段可有最多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或150个氨基酸残基长度。最小片段长度可有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或30个氨基酸,或介于3与30个之间的氨基酸数目。
相较于相应的野生型多肽,突变体可包含至少一个修饰(如添加、取代、倒位、及/或缺失)。突变体可呈现改变的活性或性质,如结合能力。
突变可在任何生物标记蛋白质中发生,且含有此片段的组分可用于调控突变体的活性,以完全或部分恢复野生型多肽的活性。
衍生物亦可包含天然变异或多型性,其可存在于个体之间或家族成员之间。所有此类衍生物皆涵盖在本发明的范畴内。纯粹作为实例,可在此类多型性中发现保守性替代,并可在下列各组氨基酸之内发现:
丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸;
谷氨酸与天冬氨酸;
精氨酸与亮氨酸;
天冬酰氨酸与谷氨酰氨酸;
异亮氨酸、亮氨酸、及缬氨酸;
苯丙氨酸、酪氨酸、及色氨酸。
在本说明书中,生物标记可为任何肽、多肽、或蛋白质,其氨基酸序列与生物标记序列之一或与所述序列之一的片段,具有特定程度的序列一致性。特定程度的序列一致性可为至少60%至100%的序列一致性。更佳地,特定程度的序列一致性可为至少65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之一者。
在前述说明、或下列申请专利范围、或附图中公开的特征,以其特定形式或以用于执行所公开功能的方法、或用于获得所公开结果的方法或过程的方式表达,视情况,可单独地,或以此类特征的任何组合方式,以各种形式实现本发明。
尽管本发明综合上述示例性实施例进行说明,但当给出本公开发明时,许多等效的改良与变化,对本领域技术人员而言将显而易见。据此,上述本发明的示例性实施例,将视为仅具说明性且非局限。在不脱离本发明实质与范畴的情况下,可对所述实施例进行各种改变。
为避免任何疑问,本文提供的任何理论解释仅旨在改善读者的理解。发明人不希望受到任何所述理论解释的约束。
本文使用的任何章节标题,仅用于组织目的,不应解释为局限所述的主体事项。
在整个说明书中,除非上下文另有要求,否则包括下面的申请专利范围,字词“包含”与“包括”,及其变体,诸如“包含有”、“含有”、及“包括了”,将理解为暗示涵盖所述的整数或步骤、或整数或步骤的组合,但不排除任何其他的整数或步骤、或整数或步骤的组合。
必须注意的是,如说明书及所附申请专利范围中所使用的,单数形式“一”、“一者”、及“该”包括复数指示物,除非上下文另有明定。于此,范围可以从“约”一特定值及/或至“约”另一特定值的方式表示。当表达此一范围时,另一实施例则包括从一特定值及/或至其他特定值。类似地,当数值以近似值表示时,当使用先行词“约”时,将理解为该特定值形成另一实施例。当“约”与数值相关时是可能的,并意指诸如+/-10%。
实施例
范例1
CVF(子宫颈阴道流体)样本收集自妊娠期19-37周的孕妇。将无菌双瓣窥镜(bivalve speculum)伸入病患阴道内。将双针尖棉签置于阴道后穹顶处30秒,接着置入1mL冷的CVF萃取缓冲液(50mM HEPES,150mM NaCl,0.1%SDS,1mM EDTA,1mM Pefabloc SC 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟化物(AEBSF))。将样本涡旋10秒,之后倒置棉签并以1000xg离心5分钟。丢弃棉签,将样本管涡旋10秒,之后以1000xg离心5分钟。将萃取的CVF(上清液)等分到管中,并保存在-80℃备用。
在200个CVF样本中,测试7个蛋白质生物标记(ECM1、GGH、LAMC2、EFEMP1、PTN、FGA、及PEDF),其取自86位最终足月产与早产病患。在妊娠19-38周期间以纵向方式收集样本。利用商用ELISA试剂盒测量CVF样本中的生物标记表达量,亦即,PEDF(DuoSet,#DY1177-05,R&D Systems,美国明尼苏达州明尼阿波利斯),ECM1(#ELH-ECM1-1,Raybiotech),GGH(#EH4206,武汉菲恩生物科技有限公司),LAMC2(#SEC083Hu,Cloud-clone),PTN(#23437,LSBIO),FGA(#11466,LSBIO),EFEMP1(#MBS178533,MyBioSource)。样本在标准96孔盘中与参考对照组和已知浓度的标准品蛋白质一起以重复方式进行实验。
依据制造商说明书操作ELISA步骤。下面描述整体步骤:
以100μl的捕获抗体涂布96孔盘,其在涂布缓冲液中的浓度为介于0.8-10μg/ml之间。
盖上培养盘并在4℃下过夜孵育。
将300μl的阻断溶液加入各孔。培养60分钟。以清洗缓冲液清洗培养盘三次,并在干燥的纸上拍打倒置的培养盘将其干燥。
加入100μl的梯度稀释蛋白质标准品及经适当稀释的样本。样本或标准品以重复方式进行实验,并在37℃下培养90min。以清洗缓冲液清洗培养盘三次,并在干燥的纸上拍打倒置的培养盘将其干燥。
加入100μl的生物素键接检测抗体、以缓冲试剂或适当缓冲液稀释、及在37℃下培养1小时。以清洗缓冲液清洗培养盘三次。
加入100μl的酶键接链亲和素(streptavidin)、以缓冲试剂或适当缓冲液稀释、及在37℃下培养60分钟。以清洗缓冲液清洗培养盘三次,并在干燥的纸上拍打倒置的培养盘将其干燥。
加入100μl的适当底物溶液至各孔。在37℃下培养至多20分钟,或直到达到所需的颜色变化。
立即以适当波长读取吸亮度数值或加入50μl的“终止溶液”。轻拍培养盘,以确保彻底混合。测量450nm时的吸亮度,配合540nm的参考值。
依据每盘上的标准曲线,确定生物标记浓度,前者为线性或4参数对数(4PL)标准曲线。依据二辛可宁酸试验(BCA测定)所确定的总蛋白质浓度,将最终浓度标准化。
接着,组合样本数值与数据,比较足月产与早产的结果,并依据3个主要方法分层:
·评估整组(n=200),包括足月(n=136)与早产(n=64)的平均值差异并确认p值,p值取自学生t检验分析。
·依据取样的妊娠周数,将妊娠周数样本分组。
·依据样本与分娩间的天数,将分娩样本时间分组。
统计分析
针对统计分析,使用Microsoft Excel软件,进行双尾未配对学生t检定,其中置信区间(CI)=0.95,且p值(P)小于0.05视为显著。所有数值数据,包括误差线,代表平均值+/-平均的标准误(SEM)。
结果与讨论
针对200个临床衍生样本的生物标记定量,证实足月产与早产样本之间有差异。样本的进一步分层使得能够强调妊娠中潜在的时间点,这将有助于更好地理解早产风险基础。
ECM1在所有200个足月产与早产样本之间存在表达差异性,p值0.0025(图1)。将样本分层为不同的妊娠时期与不同的采样至分娩时间,差异性表达仍维持相同的方向(亦即,ECM1在所有早产样本中平均表达较少,不论妊娠年龄与分娩时间)(图2与图3)。由于ECM1熟知为数个皮肤相关疾病与血管新生的标记,因此,其与早产的相关性令人惊讶。
GGH在足月产与早产样本之间有差异性表达。GGH表达在早产妇女样本与足月妇女样本中平均升高(图4)。有趣的是,在足月产与早产的情况中,随着妊娠年龄增长与距离分娩时间缩短,GGH表达量逐渐增加(图5与图6)。GGH并非广为人知的生物标记,其涉及免疫途径与细胞外基质调节。
LAMC2在所有200个足月产与早产样本中有差异性表达(图7)。与其他标记相反的是,差异在分娩前的最后一天更为明显(图9)。LAMC2涉及上皮转换途径,且因其涉及数个皮肤疾病适应症而闻名。有趣的是,其从未与子宫颈阴道空间的变化相关。
EFEMP1在所有200个足月产与早产样本之间亦有差异性表达(图10)。然而,更有趣的是,在足月产与早产样本之间的整个妊娠期间,EFEMP1的表达增加与表达减少之间存在转变。在妊娠时间与距离分娩时间的早期时间点,相较于早产样本,足月样本的EFEMP1增加。然而,此趋势在妊娠时间后期与距离分娩时间有逆转情形(图11与图12)。
PTN在所有200个足月产与早产样本之间有差异性表达(图13)。在妊娠的最早期及距离分娩时间的最早与最晚时间点,观察到足月产与早产样本之间PTN的表达概况有最显著的差异(图14与图15)。
FGA在所有200个足月产与早产样本之间有差异性表达(图16)。FGA表达的差异在妊娠晚期与分娩前最后一天更为明显(图17与图18)。蛋白质形式的FGA涉及发炎与免疫反应途径,因此可能与由这些途径引发的早产病例有关。
PEDF在所有200个足月产与早产样本之间有差异性表达(图19)。在所有分层中,PEDF在早产样本中持续升高(图20与图21),代表其在任何时间点皆为有效的生物标记。PEDF为一与血管新生紧密相关知蛋白质,从而能重塑组织。发明人假设,其所参与早产与子宫颈重塑有关(cervical remodelling)。
现今,女性早产风险的预测非常局限。预测风险概况的二个最常见方式为,依据病史与子宫颈长度。这些方法未能正确评估大多数女性的早产风险,即使组合使用亦然。因此,若能有一个准确预测女性早产风险的工具,将成为临床上怀孕管理的重要资产,并将进一步减少早产病例及节省大量医疗费用。发明人在此证实可利用个体生物标记工具做为基石。如所见,所述生物标记ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2所组成的试剂盒,将结合个体生物标记的预测值,成为高精确度的工具。
范例2:体外试验
选择外子宫颈Ect1/E6E7(ATCC CRL-2614)与内子宫颈End1/E6E7(ATCC CRL-2615)细胞株,进行各种细胞压力条件下(过氧化氢与LPS)的生物标记体外研究,其依据下列步骤:
H2O2处理
将Ect1与End1细胞接种于角质形成细胞无血清培养基(KSFM)中,其中在第0天补充0.1ng/ml EGF,50μg/ml BPE and 0.4mM CaCl2。在第2天达到70-80%细胞生长汇合度时,以剂量渐增的H2O2(50μM,100μM,200μM,400μM)处理细胞。在24小时后,收集培养基,并利用ELISA定量生物标记。利用MTT试验评估H2O2对细胞存活力与增殖的影响。
LPS处理
将Ect1与End1细胞接种于KSFM中,其中在第0天补充0.1ng/ml EGF,50μg/ml BPEand 0.4mM CaCl2。在第1天,移除细胞培养基,并以不含生长因子补充物的KSFM替换。接着,在第2天时,以剂量渐增的LPS(10μg/ml,25μg/ml,50μg/ml)处理细胞。在LPS处理后24小时,收集培养基,并以ELISA定量生物标记。
结果与讨论:
外子宫颈Ect1/E6E7(ATCC CRL-2614)与内子宫颈End1/E6E7(ATCC CRL-2615)细胞株,两者皆源自正常子宫颈上皮组织,选择其作为体外生物标记研究。End1表现出简单柱状上皮细胞(simple columnar epithelium,)的特征,而Ect1表现出分层鳞状非角化上皮细胞(stratified squamous nonkeratinizing epithelia)的特征。由于CVF为源自阴道、子宫颈、及相邻上覆胎膜(adjacent overlying foetal membranes)的流体混合物,因此在不同细胞外压力的存在下研究Ect1与End1的分泌内容物,可提供怀孕期间子宫颈的局部生化环境及生理变化的参考与推论。
据报导,氧化压力在正常足月和自发性早产(PTB)及许多妊娠并发症,如早产胎膜早破(PPROM)与子痫前症,扮演重要角色。尽管分子机制尚不清楚,但PTB中氧化压力的作用可归因于各种活性氧(ROS)介导的病理生理途径,如发炎、细胞凋亡、自噬、衰老、及胶原代谢改变。Menon等人的研究显示,在PTB与PPROM的胎膜中,F2-异前列腺素(F2-Isoprostanes)与OS诱发的3-硝基酪氨酸修饰蛋白(3-NT)等氧化压力标记的表达明显高于足月产的胎膜。同时,PTB与PPROM均具有比足月产更高的羊水F2-异前列素。同一组研究人员进一步推断,氧化压力介导的细胞凋亡导致胎膜中的蛋白水解,最终导致PPROM中膜的减弱与破裂。另一方面,Heng等人显示,随着分娩接近,抗氧化酶、硫氧还原蛋白(thioredoxin)、及SOD1的表达,以及CVF的总抗氧化能力显著下降。得出的结论为,分娩与氧化压力增加有关,且抗氧化酶可作为分娩的预测因子。
欲在发明人的系统中诱发氧化压力,以剂量渐增的H2O2处理Ect1与End1细胞24小时。利用MTT试验评估处理H2O2的细胞的细胞存活力与增殖(图22)。发明人发现,H2O2处理会诱发Ect1与End1细胞的差异性细胞反应。在Ect1细胞中,较低剂量的H2O2(50μM and 100μM)无法影响细胞存活力。在200μM H2O2之下,相较于对照组未经处理细胞,经处理细胞的细胞密度减少20%,尽管该减少无统计上显著性。在400μM H2O2,之下,观察到经处理细胞的细胞存活力明显减少~50%。在End1细胞中,虽然50μM不具影响,100μM,200μM和400μM H2O2会造成细胞存活力分别显著减少~20%、~50%、及~90%。
发明人利用ELISA,以处理H2O2的细胞培养基进行生物标记表达的定量。有趣的是,生物标记在H2O2处理后显示差异性表达。在Ect1中,FGA(图25)、LAMC2(图24)、及EFEMP1(图31)的表达,在处理200μM与400μM的H2O2之后,发现明显减少。当Ect1暴露在400μM H2O2中24h之后,ECM1表达减少(P<0.05)(图23)。GGH的表达在H2O2处理后维持相对不变(图26)。
在End1细胞方面,以200μM的H2O2处理细胞后,观察到FGA与EFEMP1的表达有显著变化(图25与图32)。ECM1(图23)、GGH(图26)、及LAMC2(图24)的表达类似于对照组未经处理细胞,尽管以H2O2处理24h。表1与表2总结了以H2O2处理后,Ect1与End1中生物标记表达的变化。
表1.Ect1在H2O2处理24小时后的生物标记表达
相较于对照组未经处理细胞,倍数变化代表至少4个独立实验的平均值。其结果以倍数变化±SEM表示。*P<0.05,**P<0.005。
表2.End1在H2O2处理24小时后的生物标记表达
相较于对照组未经处理细胞,倍数变化代表至少3个独立实验的平均值。其结果以倍数变化±SEM表示。**P<0.005。
类似于氧化压力,发炎反应长期以来都与分娩及足月产与早产时的分娩有关。在大多数情况下,PTB与PPROMs与羊膜腔内感染、子宫内感染、及发炎密切相关。许多实验与临床研究指出,由炎性介质介导的病理生理途径,为早产分娩及数个妊娠并发症的根本原因。所述发炎介导的途径包括白血球活化、增加的炎性细胞介素与趋化介素、及细胞外基质金属蛋白酶(extracellular matrix metalloproteinases;MMPs)的胶原溶解。所述情况最终造成膜结构完整性丧失、子宫肌层活化、及过早/早期子宫颈重塑,导致PTB与PPROM。此外,发炎的标记,如白介素(IL)1、2、6、及8、肿瘤坏死因子-[TNF-]、及C-反应蛋白[CRP],经评估为PTB的生物标记。
本研究中,发明人以不同剂量的脂多醣(LPS)处理Ect1与End1细胞,在发明人的系统中诱发发炎反应。
在Ect1细胞中,处理25μg/ml的LPS,造成条件培养基中ECM1表达明显减少(图27)。此外,当相较于对照组未经处理细胞,处理较低剂量的LPS(10μg/ml与25μg/ml),引起LAMC2的表达有统计学上显著增加超过5倍(图28)。发明人亦观察到,在Ect1细胞的条件培养基中,以三个不同剂量的LPS处理,GGH(图29)与FGA(图30)表达略微增加,然而,此增加在统计学上不具显著性。
在End1细胞中,类似于Ect1细胞,在条件培养基中,处理LPS造成ECM1表达小量减少(图27),尽管此减少在统计学上不具有显著性。在End1的条件培养基中,所有三个高与低剂量的LPS(10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml),导致LAMC2表达有~8倍增加(图28)。相反地,在End1的条件培养基中,GGH(图29)与FGA(图30)的表达量在LPS处理后下调。表3与表4摘录了以LPS处理后生物标记的表达变化。
表3.Ect1在LPS处理24小时后的生物标记表达
相较于对照组未经处理细胞,倍数变化代表至少4个独立实验的平均值。其结果以倍数变化±SEM表示。*P<0.05。
表4.End1在LPS处理24小时后的生物标记表达
相较于对照组未经处理细胞,倍数变化代表至少4个独立实验的平均值。其结果以倍数变化±SEM表示。*P<0.05,**P<0.005。
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上文中引用许多出版文献,以便充分描述与公开本发明及本发明所属领域的现有技术。以下提供所述参考文献的完整引用。所述参考文献中每一者的全部内容皆并入本案。
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针对标准分子生物学技术,请见Sambrook,J.,Russel,D.W.的《分子克隆,实验操作手册》(Molecular Cloning,A Laboratory Manual),第3版.2001,冷泉港,纽约:冷泉港实验室出版社
Claims (15)
1.一种用于预测是否个体有早产风险的方法,该方法包含测定从该个体取得的样本的生物标记的水平,及基于该生物标记的水平预测是否该个体有早产风险,其中该生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样本为阴道流体样本。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述生物标记为蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法,其特征在于,所述生物标记的水平与参考水平相比较,其中所述参考水平源自从已知经历过早产或足月分娩的个体取得的样本的生物标记的水平。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包含以一或多个其他早产指标,其选自于胎儿纤维接合素测试、收缩、阴道流血、自阴道渗出流体、增加的阴道排出物、背痛、及下腹部痉挛,预测所述早产风险。
6.一种用于治疗预期有早产风险的个体的黄体酮,其特征在于,所述个体已利用如权利要求1至4中任一项所述的方法预测有早产风险。
7.一种选择治疗个体以减少早产风险的方法,该方法包含使用如权利要求1至4中任一项所述的方法预测个体的早产风险,若所述个体经确定有早产风险,则实施治疗以减少该早产风险,其中用于减少该早产风险的治疗包含黄体酮及/或子宫颈环扎术。
8.一种用于预测是否个体有早产风险的方法,该方法包含测定从该个体取得的样本的生物标记的水平,及将测得的量传递给参与该个体治疗的医师,其中,基于样本的生物标记的水平预测所述早产风险,且其中所述生物标记选自于ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、及LAMC2。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其特征在于,所述用于预测是否该个体有早产风险的方法为计算机实行方法。
10.一种用于检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2的方法,该方法包含:
a.从个体取得阴道流体样本;
b.通过使该阴道流体样本与抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体接触并且检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN或LAMC2与抗体间的结合,检测是否ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2存在于所述阴道流体样本中。
11.一种用于测定个体有早产风险的方法,该方法包含:
a.从个体取得样本;
b.通过使该样本与抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体接触并且检测ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN或LAMC2与抗体间的结合,检测是否ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN、或LAMC2存在于该样本中;和
c.当检测到所述样本中存在ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN或LAMC2时,则确定所述个体有早产风险。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述样本为阴道流体样本。
13.一种测定个体有早产风险并延长个体妊娠的方法,该方法包含:
a.从个体取得样本;
b.检测是否ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN或LAMC2存在于阴道流体样本中;
c.当所述阴道流体样本中检测到存在ECM1、FGA、EFEMP1、GGH、PEDF、PTN或LAMC2时,则确定所述个体有早产风险;以及
d.给予一有效量的黄体酮至经确定有早产风险的个体,或者若个体经确定有早产风险,则选择该个体以一有效量的一或多个选自于黄体酮或其类似物、安胎剂、皮质类固醇、抗生素、NSAID、或ω3脂肪酸或其衍生物的试剂治疗;和/或
e.在确定有早产风险的个体身上进行子宫颈环扎术,或者若个体经确定有早产风险,则选择该个体进行子宫颈环扎术。
14.如权利要求10至13中任一项所述的方法,其特征在于,所述生物标记的水平利用ELISA测定。
15.一种用于预测受试者早产风险或可能性的试剂盒,该试剂盒包含抗-ECM1抗体、抗-FGA抗体、抗-EFEMP1抗体、抗-GGH抗体、抗-PEDF抗体、抗-PTN抗体、或抗-LAMC2抗体。
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