BR112020008605A2 - método para previsão e tratamento para redução e determinação do risco de parto prematuro e prolongamento da gestação, detecção de ecm1, fga, efemp1, ggh, pedf, ptn ou lamc2, progesterona e kit - Google Patents

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Abstract

A presente invenção diz respeito a biomarcadores, e particularmente, embora não exclusivamente, a biomarcadores de parto prematuro. Os biomarcadores são úteis, várias semanas ou meses antes do parto, para distinguir indivíduos em risco de experimentar o parto antes das 37 semanas de gestação. Os biomarcadores, isto é ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2, são identificados por uma análise proteômica, como sendo diferencialmente expressos no fluido vaginal por mulheres que terão parto prematuro.

Description

MÉTODO PARA PREVISÃO E TRATAMENTO PARA REDUÇÃO E
DETERMINAÇÃO DO RISCO DE PARTO PREMATURO E PROLONGAMENTO DA GESTAÇÃO, DETECÇÃO DE ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN OU LAMC2, PROGESTERONA E KIT
[0001] Este aplicativo reivindica prioridade do SG10201708890Y depositado em 30 de outubro de 2017, cujo conteúdo e elementos são incorporados neste documento por referência para todos os fins. Campo da Invenção
[0002] A presente invenção diz respeito à biomarcadores, e particularmente, embora não exclusivamente, a biomarcadores de parto prematuro. Os biomarcadores são úteis, várias semanas ou meses antes do parto, para distinguir indivíduos em risco de experimentar o parto antes das 37 semanas de gestação. Fundamentos
[0003] O parto prematuro é definido pelo parto que ocorre antes das 37 semanas de gestação. Estima-se que mais de 15 milhões de bebês nascem prematuros anualmente. Globalmente, o parto prematuro é uma das principais causas de morte de crianças menores de cinco anos, com uma estimativa de um milhão de mortalidades relacionadas ao parto prematuro. Muitos dos sobreviventes enfrentam uma vida inteira de deficiências desafiadoras, que incluem dificuldades de aprendizagem e problemas visuais e auditivos. Embora os avanços da neonatologia nas últimas décadas tenham aumentado as taxas de sobrevivência para partos prematuros, mais de 20% dos recém-nascidos prematuros sofrerão pelo menos uma grande incapacidade, incluindo doença pulmonar crônica, comprometimento do desenvolvimento mental, paralisia cerebral, paralisia cerebral, surdez ou cegueira.
[0004] Existe uma necessidade significativa de identificar gestantes que correm risco de parto prematuro. Nos paradigmas atuais, o tratamento para gestações de alto risco envolve tratamento profilático ou vigilância aprimorada ou monitoramento rigoroso da gravidez, o que reduz as taxas de partos prematuros. No entanto, na maioria dos casos, a classificação das gestações como de alto risco é atribuída ao histórico médico anterior ou a exames clínicos,
identificando apenas uma pequena subseção das verdadeiras gestações de alto risco propensas ao parto prematuro. Ainda assim, a maioria das gestações propensas a partos prematuros não é identificada nos estágios iniciais e, portanto, a intervenção médica precoce para esses casos não é possível.
[0005] Existem vários testes no mercado para avaliação de risco de parto prematuro para mulheres que apresentam sintomas de risco. Um exemplo é o teste de fibronectina fetal (fFN), que fornece uma avaliação de risco para mulheres sintomáticas. A fibronectina fetal está presente na vagina se é provável que ocorra um parto prematuro; portanto, o teste fFN é comumente usado em mulheres grávidas com sintomas que indicam uma possibilidade de parto prematuro, como contrações, sangramento vaginal, vazamento de líquido da vagina, aumento da secreção vaginal, dor nas costas e cãibras na parte inferior do abdome. A força do teste fFN reside no seu alto valor preditivo negativo por até 10 dias após o teste (ou seja, um resultado negativo significa que há uma baixa possibilidade de trabalho de parto prematuro nos próximos 7 a 10 dias após o teste). No entanto, quando o teste fFN é positivo, os resultados são menos conclusivos.
[0006] O gerenciamento de pacientes varia com base nos fatores de risco. Demonstrou-se que o tratamento profilático, como a progesterona, reduz as taxas de parto prematuro em vários estudos clínicos que analisam mulheres com comprimento cervical curto ou história prévia de parto prematuro como uma população de alto risco. Mulheres sintomáticas podem receber tratamentos como tocolíticos ou esteroides com base nos fatores de risco. A limitação da prática clínica atual é que a correlação de tratamento e resultados é muito baixa.
[0007] Assim, há uma necessidade urgente de identificação eficaz de gestações com alto risco de parto prematuro, para que o tratamento apropriado possa ser administrado prontamente para reduzir as taxas de parto prematuro. A presente invenção fornece biomarcadores e métodos para prever o risco de parto prematuro para superar pelo menos em parte algumas das desvantagens. Em particular, a presente invenção procura fornecer uma avaliação de risco para classificação de mulheres com alto risco para parto prematuro várias semanas ou até meses antes que os sintomas do parto prematuro apareçam.
[0008] A presente invenção foi concebida em relação às considerações acima. Resumo da Invenção
[0009] A presente invenção fornece novos biomarcadores e métodos para prever risco ou probabilidade de parto prematuro em um indivíduo. Os biomarcadores divulgados neste documento foram identificados em uma análise de metadados e subsequentemente demonstrados em amostras derivadas de pacientes. Os biomarcadores divulgados neste documento diferenciam amostras de indivíduos a termo e prematuros, semanas ou meses antes de o indivíduo ser sintomático. Esses biomarcadores podem ser úteis para identificar um indivíduo em risco de parto prematuro e, portanto, podem ser úteis para orientar decisões clínicas, como o início do tratamento para prolongar a gestação e/ou prevenir ou reduzir o risco de parto prematuro.
[0010] Os métodos divulgados neste documento podem ser usados para determinar o risco ou a probabilidade de parto prematuro em indivíduos assintomáticos ou sintomáticos. Em modalidades particulares, o indivíduo é assintomático.
[0011] Como divulgado neste documento, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 são biomarcadores de parto prematuro. Cada um dos ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 pode ser usado em métodos para identificar indivíduos em risco de parto prematuro e em métodos para determinar se um indivíduo está em risco de parto prematuro ou para prever se um indivíduo está em risco de parto prematuro. A variação do nível do biomarcador, em comparação com um controle ou nível de referência, pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Tais métodos envolvem a determinação do nível de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 em uma amostra obtida do indivíduo sendo testado. Em alguns aspectos, os métodos envolvem determinar o nível de todos os biomarcadores ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 e prever o risco de parto prematuro.
[0012] A subexpressão de certos biomarcadores pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro, incluindo ECM1, GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN e FGA.
[0013] A super expressão de certos biomarcadores pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro, incluindo GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN, FGA e PEDF.
[0014] Em alguns casos, o biomarcador pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro se for super expresso em um determinado ponto da gestação ou subexpresso em outro ponto da gestação.
[0015] É fornecido neste documento um método para prever se um indivíduo está em risco de parto prematuro, o método compreendendo determinar o nível de um biomarcador em uma amostra obtida do indivíduo e classificá-lo como em risco de parto prematuro ou não em risco de parto prematuro, com base no valor do biomarcador, em que o biomarcador é selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. O método pode compreender adicionalmente administração de um tratamento a um indivíduo determinado como estando em risco. O tratamento pode compreender cerclagem cervical ou administração de um ou mais agentes selecionados a partir de uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo Ômega 3 ou derivado do mesmo. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0016] Também divulgado neste documento é um método para determinar a probabilidade de um indivíduo ter um parto prematuro, o método compreendendo detecção, em uma amostra do indivíduo, de um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 e determinar a probabilidade percentual de um indivíduo ter um parto prematuro, com base no valor do biomarcador.
[0017] Também divulgado neste documento é um método implementado por computador para prever se um indivíduo está em risco de parto prematuro, o método compreendendo a recuperação em uma informação de biomarcador de computador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende valores de biomarcadores correspondentes a pelo menos um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2, e com o computador uma classificação do valor de biomarcador; e indicando a probabilidade de o indivíduo estar em risco de parto prematuro, com base na classificação.
[0018] Também divulgado neste documento é um método de tratamento compreendendo administração de um ou mais agentes selecionados entre uma progesterona ou um análogo do mesmo, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou um derivado do mesmo a um indivíduo determinado como sendo em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. A progesterona para uso em tal método também é divulgada, juntamente com o uso de progesterona na fabricação de um medicamento para uso em tal método. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a- hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0019] Também divulgado neste documento é um método de tratamento compreendendo cerclagem cervical a um indivíduo determinado em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. Os métodos para selecionar um indivíduo para tratamento com cerclagem cervical também são divulgados.
[0020] Também divulgado neste documento é um tocolítico ou esteroide para uso em um método de tratamento de um indivíduo com risco de parto prematuro, em que o indivíduo foi determinado como em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. Um método de tratamento compreendendo administração de um tocolítico ou esteroide a um indivíduo determinado como em risco de parto prematuro, em que o indivíduo foi determinado como em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 também são divulgados.
[0021] De maneira semelhante, é fornecido o uso de um tocolítico ou esteroide para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo determinado como estando em risco de parto prematuro, em que se prevê que o indivíduo esteja em risco de parto prematuro com base em um biomarcador valor para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2.
[0022] O tocolítico ou esteroide para uso, ou o medicamento pode ser para uso em um método que envolve determinar um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 e determinar o risco de parto prematuro com base no valor desse biomarcador.
[0023] Também é divulgado neste documento um ou mais agentes selecionados a partir de uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou derivado do mesmo para uso em um método de tratamento de um indivíduo previsto risco de parto prematuro, em que foi determinado que o indivíduo está em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para uma seleção de biomarcadores A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0024] Um método de tratamento compreendendo administração de um ou mais agentes selecionados entre uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou derivado do mesmo, a um indivíduo determinado como estando em risco de parto prematuro, em que o indivíduo foi determinado como estando em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 também é divulgado. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0025] Também é provido o uso de um ou mais agentes selecionados entre uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou derivado do mesmo na fabricação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo determinado para estar em risco de parto prematuro, em que foi determinado que o indivíduo está em risco de parto prematuro com base em um valor de biomarcador para uma seleção de biomarcadores entre ECM1, FCA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0026] O agente para uso, ou o medicamento pode ser para uso em um método que envolve determinar um valor de biomarcador para um biomarcador selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2 e determinar o risco de parto prematuro com base no valor desse biomarcador.
[0027] Neste documento é provido um método para detectar ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2, o método compreendendo: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na amostra de fluido vaginal colocando a amostra de fluido vaginal em contato com um anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti-EFEMP1, anti-GGH,
anti-PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2 e detectar a ligação entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 e o anticorpo.
[0028] Neste documento também é provido um método para determinar que um indivíduo está em risco de parto prematuro, dito método compreendendo: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na amostra de fluido vaginal colocando a amostra de fluido vaginal em contato com um anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti-EFEMP1, anti-GGH, anti-PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2 e detectar a ligação entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 e o anticorpo; e c. determinar que o indivíduo está em risco de parto prematuro quando a presença de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 na amostra de fluido vaginal é detectada.
[0029] Em alguns casos, o anticorpo é derivado de camundongo, coelho ou cabra, preferencialmente camundongo ou coelho. O anticorpo pode ser humano, humanizado ou quimérico.
[0030] Preferencialmente, a amostra é uma amostra de fluido vaginal. A amostra de fluido vaginal pode ser uma amostra de fluido cervicovaginal. Alternativamente, a amostra é uma amostra de líquido amniótico.
[0031] Um método para determinar que um indivíduo está em risco de parto prematuro e prolongar a gestação nesse indivíduo, o método compreendendo: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na no plasma da amostra; c. determinar que o indivíduo está em risco de parto prematuro quando a presença de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 na amostra de fluido vaginal é detectada; e d. administrar uma quantidade efetiva de um ou mais agentes selecionados a partir de uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou derivado do mesmo. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser ácido docosahexaenóico (DHA) para o indivíduo determinado como em risco de parto prematuro ou selecionar o indivíduo para tratamento com uma quantidade eficaz de tocolítico ou esteroide, se o indivíduo estiver em risco de parto prematuro.
[0032] Em um aspecto, é divulgado um kit para uso na previsão do risco ou probabilidade de parto prematuro em um indivíduo, o kit compreendendo anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti-EFEMP1, anti-GGH, anti- PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2. Preferencialmente, o anticorpo anti-ECM1, anti- FGA, anti-EFEMP1, anti-GGH, anti-PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2 é capaz de se ligar seletivamente a ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 .
[0033] Certos aspectos divulgados neste documento descrevem métodos implementados por computador para determinar o risco de parto prematuro em um indivíduo. Os métodos podem envolver o fornecimento de dados correspondentes ao nível de pelo menos um de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 em uma amostra obtida do indivíduo; executar, com o computador, uma classificação do valor do biomarcador; e determinar o risco de parto prematuro no indivíduo, com base na classificação.
[0034] A invenção inclui combinar aspectos e características preferenciais descritas, exceto quando tal combinação é claramente inadmissível ou expressamente evitada. Resumo das Figuras
[0035] Modalidades e experimentos ilustrando os princípios da invenção serão agora discutidos com referência às figuras anexas, em que: Figura 1. Esta figura representa a diferença no nível de ECM1 entre amostras a termo e prematuras. A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas. Amostras a termo (n = 136) e prematuras (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 2. Esta figura representa a diferença no nível de ECM1 entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 3. A figura representa a diferença no nível de ECM1 entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 4. Esta figura representa a diferença no nível de GGH entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematura (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 5. Esta figura representa a diferença no nível de GGH entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematura e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 6. A figura representa a diferença no nível de GGH entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 7. Esta figura representa a diferença no nível de LAMC2 entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematura (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 8. Esta figura representa a diferença no nível de LAMC2 entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 9. A figura representa a diferença no nível de LAMC2 entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 10. Esta figura representa a diferença no nível de EFEMP1 entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematuras (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 11. Esta figura representa a diferença no nível de EFEMP1 entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 12. A figura representa a diferença no nível de EFEMP1 entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 13. Esta figura representa a diferença no nível de PTN entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematuras (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 14. Esta figura representa a diferença no nível de PTN entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 15. A figura representa a diferença no nível de PTN entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 16. Esta figura representa a diferença no nível de FGA entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematuras (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 17. Esta figura representa a diferença no nível de FGA entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32+0-37+6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 18. A figura representa a diferença no nível de FGA entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 19. Esta figura representa a diferença no nível de PEDF entre amostras a termo e prematuras.
A concentração média de proteínas do biomarcador foi calculada com base nos resultados de um imuno ensaio ELISA ajustado para a concentração total de proteínas.
Amostras a termo (n = 136) e prematuras (n = 64) coletadas entre 19-37 semanas de gestação e a diferença média entre os grupos inteiros são representadas.
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
P = valor p.
Figura 20. Esta figura representa a diferença no nível de PEDF entre amostras a termo e prematuras baseadas na idade gestacional no tempo da amostragem.
As amostras foram agrupadas em quatro grupos com base no tempo de amostragem, 18+0-23+6 dias Semanas de gestação (18-24), 24+0- 27+6 dias Semanas de gestação (24-28), 28+0-31+6 dias Semanas de gestação (28-32) e 32 + 0-37 + 6 dias Semanas de gestação (32-37). Os grupos foram divididos em amostras a termo e prematuras e a média foi calculada e representada no gráfico de barras.
Figura 21. A figura representa a diferença no nível de PEDEF entre as mulheres de parto a termo e as prematuras, com base no tempo desde a coleta da amostra até o parto.
As amostras foram agrupadas em 4 grupos com intervalo de 4 semanas para avaliar a diferença entre amostras a termo e prematuras com base nas semanas antes do parto.
Os grupos têm mais de 12 semanas entre amostragem e parto (>12), 9-12, 5-8 e 1-4 semanas, desde a amostragem até o parto (9-12, 5-8, 1-4), respectivamente.
A média foi calculada para cada grupo.
Figura 22. Efeito de H2O2 na viabilidade e proliferação celular.
As células Ect1 e End1 foram tratadas com 50μM, 100μM, 200μM e 400μM H2O2 por 24h.
A viabilidade celular e a proliferação de Ect1 e End1 foram avaliadas pelo ensaio MTT e demonstradas como % do controle não tratado (0 μM H2O2). Os dados são representados como a média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student. *P<0,05 comparado aos respectivos controles, n = 3. Figura 23. Efeito de H2O2 na expressão de ECM1 de células Ect1 e End1. O ECM1 no meio de (a) Ect1 e (b) End1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de ECM1 após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de ECM1 (pg/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 4 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student. *P<0,05 comparado ao controle.
Figura 24. Efeito de H2O2 na expressão de LAMC2 de células Ect1 e End1. O LAMC2 no meio de (a) Ect1 e (b) End1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de LAMC2 após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de LAMC2 (pg/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 4 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student. *P<0,05 comparado ao controle.
Figura 25. Efeito de H2O2 na expressão de FGA de células Ect1 e End1. O FGA no meio de (a) Ect1 e (b) End1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de FGA após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de FGA (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 5 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student. **P<;0,005 comparado ao controle.
Figura 26. Efeito de H2O2 na expressão de GGH de células Ect1 e End1. O GGH no meio de (a) Ect1 e (b) End1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de GGH após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de GGH (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 5 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student.
Figura 27. Efeito de LPS na expressão de ECM1 de células Ect1 e End1. O ECM1 no meio de Ect1 e End1 após o tratamento com LPS (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de ECM1 após o tratamento com LPS foi calculada dividindo o nível normalizado de ECM1 (pg/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student, n = 5. *P<0,05, para o respectivo controle.
Figura 28. Efeito de LPS na expressão de LAMC2 de células Ect1 e End1. O LAMC2 no meio de Ect1 e End1 após o tratamento com LPS (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de LAMC2 após o tratamento com LPS foi calculada dividindo o nível normalizado de LAMC2 (pg/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student, n = 5. *P<0,05, **P<0,05, para o respectivo controle.
Figura 29. Efeito de LPS na expressão de GGH de células Ect1 e End1. O GGH no meio de Ect1 e End1 após o tratamento com LPS (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de GGH após o tratamento com LPS foi calculada dividindo o nível normalizado de GGH (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student, n = 5. Figura 30. Efeito de LPS na expressão de FGA de células Ect1 e End1. O FGA no meio de Ect1 e End1 após o tratamento com LPS (24h) foi quantificado por ELISA.
A mudança de dobra na expressão de FGA após o tratamento com LPS foi calculada dividindo o nível normalizado de FGA (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM e foram analisados pelo teste t de Student, n = 5. Figura 31. Efeito de H2O2 na expressão de EFEMP1 de células Ect1 e End1. O EFEMP1 no meio de Ect1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA. A mudança de dobra na expressão de EFEMP1 após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de EFEMP1 (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 5 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student. **P<0,05 comparado ao controle. Figura 32. Efeito de H2O2 na expressão de EFEMP1 de células End1. O EFEMP1 no meio de End1 após o tratamento com H2O2 (24h) foi quantificado por ELISA. A mudança de dobra na expressão de EFEMP1 após o tratamento com H2O2 foi calculada dividindo o nível normalizado de EFEMP1 (ng/mg de proteína total) nas células tratadas em células não tratadas (controle). Os dados são representados como a média ± SEM de pelo menos 5 experimentos independentes e foram analisados pelo teste t de Student. **P<0,005 comparado ao controle. Descrição Detalhada da Invenção
[0036] Aspectos e modalidades da presente invenção serão discutidos agora com referência às figuras anexas. Aspectos e modalidades adicionais serão evidentes àqueles versados na técnica. Todos os documentos mencionados neste texto são incorporados neste documento como referência.
[0037] Os métodos e biomarcadores descritos neste documento podem ser úteis para determinar se um indivíduo está em risco de parto prematuro, identificar um indivíduo em risco de parto prematuro ou prever o risco de parto prematuro em um indivíduo.
[0038] O termo "previsão" é usado de forma intercambiável com "determinação" neste documento e é usado para dizer ou estimar que o parto prematuro ocorrerá em um indivíduo. Os métodos divulgados neste documento podem ser usados para determinar ou prever a probabilidade (ou "risco") de um indivíduo experimentar o parto prematuro.
[0039] O parto prematuro é o parto que ocorre antes da mãe atingir 37 semanas de gestação. O parto prematuro é subdividido no parto prematuro tardio 35 + 0 dias a 36 + 6 dias Semanas de gestação, parto prematuro moderado 32 + 0 dias a 34 + 6 dias de gestação e prematuro precoce é anterior a 32 semanas de gestação.
[0040] A causa do parto prematuro geralmente não é conhecida. Os fatores de risco incluem diabetes, pressão alta, gravidez de mais de um bebê, obesidade ou baixo peso, várias infecções vaginais, tabagismo e estresse psicológico, entre outros.
[0041] A pré-eclâmpsia é clinicamente indicada como hipertensão e proteinúria, manifestando-se entre 20 semanas de gestação e até 6 semanas após o parto. Embora a pré-eclâmpsia possa levar ao parto prematuro, em muitos casos isso não ocorre. A pré-eclâmpsia é apenas um fator que pode contribuir para um risco aumentado de parto prematuro e, portanto, fatores que causam ou estão associados à pré-eclâmpsia não são necessariamente causais ou associados ao parto prematuro. Biomarcadores
[0042] Os métodos divulgados neste documento envolvem a determinação da presença ou ausência ou quantificação do nível de um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2.
[0043] Cada um dos biomarcadores utilizados neste documento pode ser usado sozinho ou em combinação com outros biomarcadores de parto prematuro. Em alguns ensaios, algumas ou todas as proteínas de biomarcadores divulgadas neste documento são usadas em combinação. Além disso, os biomarcadores podem ser usados em conjunto com um ou mais indicadores de parto prematuro, incluindo o teste de fibronectina fetal (fFN), contrações, sangramento vaginal, vazamento de fluido da vagina, aumento da secreção vaginal, dor nas costas e cãibras no abdome inferior. Proteína 1 da matriz extracelular (ECM1); UniProtKB - Q16610
[0044] Esse gene codifica uma proteína solúvel de ~85 KDa que está envolvida na formação óssea endocondral, proliferação de células endoteliais,
angiogênese e biologia do tumor. Também interage com uma variedade de proteínas extracelulares e estruturais, contribuindo para a manutenção da integridade da pele e da homeostase. O ECM1 atua como uma "cola biológica" em uma variedade de tecidos, contribuindo para a organização e o andaime de colágeno.
[0045] 4 variantes de transcrição alternadamente unidas que codificam isoformas distintas foram descritas para esse gene. Qualquer um destes pode ser usado como um biomarcador de acordo com a presente divulgação. Em alguns casos, a variante 1 é detectada. Como mostrado na Figura 1, a concentração média geral de ECM1 de todas as amostras (coletadas entre 19 e 37 semanas de gestação) foi menor nas amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que nas amostras que tiveram parto a termo (p = 0,025). Isso indica que a subexpressão do ECM1 em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro.
[0046] Isso é mostrado ainda na Figura 2, na qual o ECM1 foi subexpresso em amostras de indivíduos que tiveram parto prematuro, em todos os momentos amostrados. Em um indivíduo com suspeita de risco de parto prematuro, um nível mais baixo de ECM1 pode indicar que o parto ocorrerá em menos de 12 semanas, menos de 9 semanas ou menos de 4 semanas. Gama-glutamil-hidrolase (GGH); UniProtKB - Q92820
[0047] O GGH hidrolisa as cadeias laterais de poliglutamato dos poliglutamatos de pterolil, que remove progressivamente os resíduos gama- glutamil do pterolil-poli-gama-glutamato para produzir pterolil alfa-glutamato (ácido fólico) e glutamato livre. Pode desempenhar um papel importante na biodisponibilidade de poliglutamatos de dieta e no metabolismo de poliglutamatos e antifolatos de dieta.
[0048] Como mostrado na Figura 4, a concentração média geral de GGH de todas as amostras (coletadas entre 19 e 37 semanas de gestação) foi aumentada em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a super expressão de GGH em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Isto é particularmente aparente nas Figuras 5 e 6, que demonstram que o GGH é particularmente superexpresso em amostras obtidas 1-4 semanas antes do parto prematuro ou nas 32-37 semanas de gestação. Isso indica que a super expressão de GGH em uma amostra obtida entre 32-37 semanas de gestação indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Por outro lado, a subexpressão de GGH em uma amostra obtida antes de 32 semanas ou em torno de 26 semanas ou menos de gestação pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Em um indivíduo com suspeita de risco de parto prematuro, um nível aumentado de GGH pode indicar que o parto ocorrerá em 4 semanas ou menos. Subunidade laminina gama-2 (LAMC2); UniProtKB - Q13753
[0049] O LAMC2 é uma proteína de ligação à heparina que se liga às células através de um receptor de alta afinidade. Pensa-se que a laminina medeia a ligação, migração e organização das células nos tecidos durante o desenvolvimento embrionário, interagindo com outros componentes da matriz extracelular. A Ladsin, uma variante da laminina que contém a cadeia gama-2 da laminina, exerce atividade de dispersão celular em direção a uma ampla variedade de células, incluindo células epiteliais, endoteliais e fibroblásticas.
[0050] Como mostrado na Figura 7, a LAMC2 foi aumentada em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a super expressão de LAMC2 em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro.
[0051] Como mostrado na Figura 8, o LAMC2 foi super expresso em amostras de parto prematuro obtidas antes de 32 semanas de gestação ou em amostras obtidas menos de 8 semanas antes do parto em amostras de parto prematuro (Figura 9). EGF contendo proteína 1 da matriz extracelular do tipo fibulina (EFEMP1); UniProtKB - Q12805
[0052] A proteína EFEMP1 liga-se ao EGFR, o receptor de EGF, e induz a auto fosforilação de EGFR e a ativação das vias de sinalização a jusante. Pode desempenhar um papel na adesão e migração celular. Pode funcionar como um regulador negativo da diferenciação de condrócitos. No epitélio olfativo, ele pode regular a migração das células gliais, a diferenciação e a capacidade das células gliais de suportar o crescimento de neurites neuronais.
[0053] Como mostrado na Figura 10, a EFEMP1 é aumentada em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a super expressão de EFEMP1 em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Isso também é aparente nas Figuras 11 e 12, nas quais a EFEMP1 foi aumentada em amostras de parto prematuro até 8 semanas antes do parto ou a partir de 28 semanas de gestação.
[0054] A regulação positiva significativa da EFEMP1 em uma amostra de um indivíduo determinado como em risco de parto prematuro pode indicar que o parto ocorrerá nas próximas 1-4 semanas.
[0055] A regulação negativa da EFEMP1 em uma amostra obtida entre 18-24 ou 19-26 semanas de gestação pode indicar que o indivíduo experimentará um parto prematuro. Pleiotrofina (PTN); UniProtKB - P21246
[0056] O PTN é um fator de crescimento secretado que induz o crescimento de neurites e é mitogênico para fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (PubMed: 1768439, PubMed: 1733956). Liga-se ao linfoma quinase anaplásico (ALK), que induz a ativação da via MAPK, um passo importante na sinalização anti-apoptótica do PTN e na regulação da proliferação celular (PubMed: 11278720). Liga-se às proteínas alvo da superfície celular através de seus grupos sulfato de condroitina (PubMed: 26896299). Após a ligação, o PTN inativa a atividade da fosfatase do PTPRZ1.
[0057] Como mostrado na Figura 13, o PTN é diminuído em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a subexpressão do PTN em uma amostra pode indicar que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Isso também é aparente nas Figuras 14 e 15, com o PTN diminuído nas amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro, amostrados antes de 32 semanas de idade gestacional ou mais de 4 semanas antes do parto.
[0058] A superexpressão de PTN em uma amostra pode indicar que um indivíduo experimentará um parto prematuro nas próximas 1-4 semanas. Cadeia alfa de fibrinogênio (FGA); UniProtKB - P02671
[0059] O FGA é clivado pela protease trombina para produzir monômeros que, juntamente com o fibrinogênio beta (FGB) e o fibrinogênio gama (FGG), polimerizam para formar uma matriz de fibrina insolúvel. A fibrina tem uma função importante na hemostasia como um dos principais componentes dos coágulos sanguíneos. Além disso, funciona durante os estágios iniciais do reparo da ferida para estabilizar a lesão e orientar a migração celular durante a reepitelização. Originalmente, acreditava-se que o FGA era essencial para a agregação plaquetária, com base em estudos in vitro usando sangue anticoagulado. No entanto, estudos subsequentes demonstraram que não é absolutamente necessário para a formação de trombos in vivo. O FGA melhora a expressão de P-selectina (SELP) nas plaquetas ativadas por uma via dependente de ITGB3. O fibrinogênio materno é essencial para o sucesso da gravidez. A deposição de fibrina também está associada à infecção, onde protege contra a hemorragia mediada por IFNG. Também pode facilitar a resposta imune por vias inatas e mediadas por células T.
[0060] Como mostrado na Figura 16, o FGA é aumentado em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a super expressão de FGA em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Isso também é aparente nas Figuras 17 e 18, que a superexpressão de FGA em uma amostra pode indicar que é provável que o indivíduo tenha parto prematuro, principalmente quando a amostra foi coletada antes de 24 semanas gestacionais ou após 32 semanas gestacionais. A super expressão de FGA pode indicar que é provável que o indivíduo tenha parto prematuro nas próximas 1-4 semanas.
[0061] A subexpressão do FGA em uma amostra coletada entre 24 e 28 semanas de gestação pode indicar que é provável que o indivíduo tenha parto prematuro. Fator derivado de epitélio pigmentar (PEDF); UniProtKB - P36955
[0062] O PEDF é uma proteína neurotrófica, que induz extensa diferenciação neuronal nas células do retinoblastoma, bem como um potente inibidor da angiogênese. Como não sofre a característica de transição conformacional S (estressada) para R (relaxada) das serpinas ativas, ela não exibe atividade inibidora da serina protease.
[0063] Como mostrado na Figura 19, a PEDF é aumentada em amostras obtidas de indivíduos que tiveram parto prematuro do que em amostras que tiveram parto a termo. Isso indica que a super expressão de PEDF em uma amostra indica que o indivíduo está em risco de parto prematuro. Isso também é evidente nas Figuras 20 e 21, que a superexpressão de PEDF em uma amostra pode indicar que é provável que o indivíduo tenha parto prematuro, independentemente do tempo de amostragem. A super expressão de PEDF pode indicar que é provável que o indivíduo tenha parto prematuro nas próximas 1-4 semanas.
[0064] Certos métodos divulgados neste documento envolvem a detecção de um valor de biomarcador ou nível de biomarcador. Esses termos se referem a uma medição feita usando qualquer método analítico apropriado para detectar o biomarcador em uma amostra biológica e que indica a presença, ausência, quantidade ou concentração absoluta, quantidade ou concentração relativa, título ou concentração relativa, título, nível, nível de expressão, razão ou outra medição correspondente ao biomarcador na amostra. A natureza exata do valor ou nível depende do design e componentes específicos do método analítico específico empregado para detectar o biomarcador.
[0065] Os biomarcadores que indicam que um indivíduo está em risco de parto prematuro podem ser superexpressos ou subexpressos, em comparação com um valor ou nível de referência ou com o biomarcador que indica ou é um sinal de parto a termo. "Regulação positiva", "superexpressão", termos aumentados e relacionados são usados para se referir a um valor ou nível em uma amostra que é maior que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é tipicamente detectados em amostras semelhantes de indivíduos que são conhecidos por terem experimentado parto a termo.
[0066] “Regulação negativa”, “subexpressão”, “reduzida” e termos relacionados são usados para se referir a um valor ou nível em uma amostra que é menor que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é normalmente detectado em amostras semelhantes de indivíduos que são conhecidos por terem experimentado parto a termo.
[0067] Um biomarcador que é superexpresso ou subexpresso pode também ser referido como sendo "expresso diferencialmente" ou como tendo um nível ou valor "diferencial" em comparação com o nível ou valor de expressão observada em indivíduos que são conhecidos por terem experimentado parto a termo. A expressão diferencial também pode ser referida como uma variação do nível de expressão "normal" do biomarcador.
[0068] O termo "expressão de gene diferencial" e "expressão diferencial" são usados de forma intercambiável para se referir a um gene (ou seu produto de expressão de proteína correspondente) cuja expressão é ativada para um nível mais alto ou mais baixo em um sujeito em risco de parto prematuro, em relação a sua expressão em um indivíduo conhecido por ter experimentado o parto a termo. Os termos também incluem genes (ou os produtos de expressão de proteínas correspondentes) cuja expressão é ativada para um nível mais alto ou mais baixo em diferentes estágios da mesma doença. Entende-se também que um gene expresso diferencialmente pode ser ativado ou inibido no nível de ácido nucleico ou nível de proteína, ou pode estar sujeito a splicing alternativo para resultar em um produto polipeptídico diferente. Tais diferenças podem ser evidenciadas por uma variedade de mudanças, incluindo níveis de mRNA, expressão de superfície, secreção ou outra partição de um polipeptídeo. A expressão gênica diferencial pode incluir uma comparação da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos gênicos; ou uma comparação das razões da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos gênicos; ou até mesmo uma comparação de dois produtos processados de maneira diferente do mesmo gene, que diferem entre indivíduos em risco de parto prematuro ou indivíduos que sofrem de parto a termo. A expressão diferencial inclui diferenças quantitativas e qualitativas no padrão de expressão temporal ou celular em um gene ou em seus produtos de expressão em indivíduos que experimentam parto prematuro e a termo. Resultados do método
[0069] Os métodos divulgados neste documento são úteis para identificar indivíduos em risco de parto prematuro, ou para determinar se um indivíduo está ou não em risco de parto prematuro. Os métodos também podem ser usados para prever o risco de parto prematuro em um indivíduo.
[0070] Em alguns casos, o método pode envolver uma etapa de registro do nível dos biomarcadores. Em alguns casos, os métodos podem envolver uma etapa de transmissão do nível dos biomarcadores divulgados neste documento a um médico envolvido no cuidado do indivíduo que está sendo testado. Em alguns casos, o método também pode envolver a transmissão de um nível de referência do biomarcador, para comparação com o nível de biomarcador no indivíduo. Em alguns casos, o nível de risco de parto prematuro determinado no indivíduo é transmitido ao médico. Por exemplo, um nível de risco pode receber uma porcentagem (onde 100% indica que o indivíduo certamente experimentará um parto prematuro e 0% indica que o indivíduo certamente experimentará um parto a termo). Assim, alguns métodos divulgados neste documento envolvem alocar um valor percentual ao nível de risco que o indivíduo está determinado a ter. O método pode envolver a etapa de transmissão dessa porcentagem para um médico envolvido no cuidado desse indivíduo.
[0071] Os métodos divulgados neste documento podem ser usados para selecionar um indivíduo para tratamento ou outro gerenciamento. Certos métodos divulgados neste documento envolvem a administração de um tratamento a um indivíduo identificado como em risco de parto prematuro.
[0072] Os tratamentos úteis nos métodos divulgados neste documento incluem a administração de progesterona, progesterona sintética ou análogo de progesterona, um ou mais agentes selecionados a partir de uma progesterona ou um análogo do mesmo, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ômega 3 ácido ou derivado do mesmo. A progesterona pode ser uma progesterona sintética, como caproato de 17-a-
hidroxiprogesterona. O tocolítico pode ser sulfato de magnésio, indometacina ou nifedipina. O antibiótico pode ser eritromicina ou penicilina. O NSAID pode ser indometacina. O derivado de ácidos graxos ômega 3 pode ser o ácido docosahexaenóico (DHA).
[0073] O indivíduo pode ser selecionado para tratamento com progesterona. Demonstrou-se que a progesterona reduz as taxas de parto prematuro em vários estudos clínicos que analisam mulheres com comprimento cervical curto ou histórico anterior de parto prematuro como uma população de alto risco. O tratamento com progesterona pode compreender a administração de progesterona natural ou progestina sintética, como o caproato de 17-α- hidroxiprogesterona. A progesterona pode ser progesterona micronizada P4 (natural). O caproato de 17-α-hidroxiprogesterona também é conhecido pelas marcas Delalutin™, Proluton™, Proluton Depot™ e Makena™. A progesterona micronizada natural, uma progesterona natural, é semelhante à produzida no corpo lúteo e na placenta. A progesterona micronizada pode ser utilizada como cápsula oral, gel vaginal ou supositório vaginal. Progestinas sintéticas incluem acetato de medroxiprogesterona (MPA, também conhecido como acetato de medroxiprogesterona de depósito (DMPA)) e acetato de noretindrona (NETA). Eles são normalmente administrados por injeção. As progestinas sintéticas também são conhecidas pelos nomes de marca (MPA) Provera™, Depo- Provera™, Depo-SubQ Provera 104™, Curretab™, Cycrin™, Farlutal™, Gestapuran™, Perlutex™, Veramix™ e (NETA) Primolut. Nor™, Aygestin™, Gestakadin™, Milligynon™, Monogest™, Norlutate™, Primolut N™, SH-420™, Sovel™, Styptin™. A progesterona micronizada pode ser auto-administrada pelo paciente. A progesterona micronizada natural também é conhecida pelas marcas Prometrium™, Utrogestan™, Endometrin™ e Crinone™. A administração pode ser oral, vaginal ou intramuscular. Também são divulgados progesterona, progestina ou caproato de 17-α-hidroxiprogesterona para uso em tais métodos, ou o uso de progesterona, progestina ou caproato de 17-α-hidroxiprogesterona para uso na fabricação de um medicamento para uso em tal método.
[0074] Indivíduos identificados com risco de parto prematuro podem ser tratados com cerclagem cervical. Cerclagem cervical também pode ser chamada de ponto cervical. A cerclagem cervical é usada para tratar a incompetência ou insuficiência cervical, onde o colo do útero começa a encurtar e abrir muito cedo durante a gravidez. A cerclagem cervical pode envolver a inserção de uma sutura forte dentro e ao redor do colo do útero.
[0075] Qualquer forma conhecida de cerclagem cervical pode ser usada. Por exemplo, a cerclagem cervical pode ser uma cerclagem McDonald, uma cerclagem Shirodkar ou uma cerclagem abdominal. A cerclagem cervical pode ser particularmente útil quando o indivíduo está determinado a ter incompetência cervical. A incompetência cervical pode ser determinada por ultrassonografia transvaginal.
[0076] Alternativamente, o tratamento pode compreender um pessário cervical. Em alguns casos, o tratamento pode ser um Pessário Arabin.
[0077] Em alguns casos, o indivíduo pode ser selecionado para receber tocolíticos ou esteroides, como corticosteroides. Os tocoloytics podem ser usados para deter a contração uterina durante o parto prematuro. Os esteroides podem ajudar no desenvolvimento pulmonar fetal. O método pode envolver uma etapa de administração do tocolítico ou esteroide ao indivíduo. Tocolíticos e esteroides têm sido usados para mulheres que apresentam contrações. Exemplos de agentes tocolíticos adequados na invenção são sulfato de magnésio, indometacina e nifedipina.
[0078] Em alguns casos, os métodos são usados para selecionar um indivíduo para monitoramento adicional, regular ou intensivo. Por exemplo, os métodos podem ser usados para determinar que uma amostra adicional deve ser obtida desse indivíduo, e a presença ou ausência e/ou nível do biomarcador deve ser determinada no futuro. A amostra adicional pode ser obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 semanas após a primeira amostra. A amostra adicional pode ser obtida na semana gestacional 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 27. O método pode envolver amostragens adicionais a cada 1, 2, 3, 4 ou 5 semanas durante a gravidez.
[0079] Em alguns casos, o indivíduo pode ser tratado com antibióticos. Antibióticos podem ser particularmente utilizados em indivíduos com ruptura prematura das membranas (PPROM). Antibióticos adequados incluem eritromicina e penicilina.
[0080] Em alguns casos, o tratamento pode ser a administração de um NSAID. Os NSAIDs podem inibir a prostaglandina para reduzir as contrações uterinas. O NSAID pode ser indometacina. Em alguns casos, o tratamento pode ser ácido graxo ômega 3 ou um derivado do ácido graxo ômega 3. Por exemplo, o tratamento pode ser DHA (ácido docosahexaenóico).
[0081] O monitoramento pode compreender o monitoramento do sofrimento fetal, como o monitoramento do batimento cardíaco fetal, o monitoramento do movimento fetal ou o monitoramento do mecônio. Medição de Biomarcadores
[0082] Os biomarcadores divulgados neste documento são preferencialmente biomarcadores de proteínas. Qualquer método de detecção e/ou quantificação de uma proteína conhecida na técnica pode ser usado.
[0083] Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser realizados ou produtos podem estar presentes, in vitro, ex vivo ou in vivo. O termo "in vitro" se destina a abranger experimentos com materiais, substâncias biológicas, células e/ou tecidos em condições de laboratório ou em cultura, enquanto o termo "in vivo" se destina a abranger experimentos e procedimentos com organismos multicelulares intactos. "Ex vivo" refere-se a algo presente ou ocorrendo fora de um organismo, por exemplo, fora do corpo humano ou animal, que pode estar no tecido (por exemplo, órgãos inteiros) ou células retiradas do organismo.
[0084] Os métodos divulgados neste documento referem-se à determinação da expressão de proteínas. A expressão da proteína pode ser medida quantificando a quantidade de proteína em uma célula, tecido ou amostra, ou observando a localização da proteína dentro das células e tecidos.
[0085] Em alguns casos, os imuno ensaios são usados para detectar o alvo em uma amostra do indivíduo. Os imuno ensaios usam anticorpos ou outras entidades com afinidade específica para a molécula-alvo em conjunto com uma molécula detectável. Em alguns casos, o anticorpo é conjugado à molécula detectável. A molécula detectável pode ser referida como uma marcação. A molécula detectável produz um sinal detectável quando o anticorpo está ligado à molécula-alvo. O sinal detectável pode ser um sinal quantificável. Em alguns casos, um aptâmero é usado em vez do, ou juntamente com, anticorpo. Os imuno ensaios incluem ELISA, análise de imunoblotina (immunoblotting), citometria de fluxo e imuno-histoquímica. Em certos aspectos descritos neste documento, o ensaio é um ensaio imuno-histoquímico. Tais ensaios geralmente usam anticorpos, embora outras moléculas específicas de alvo, como aptâmeros ou outros ligantes, possam ser usadas. Matrizes de anticorpos ou chips de proteína também podem ser usados.
[0086] O método pode ser aprovado para uso por uma agência reguladora. O método pode ser um método aprovado pela FDA. Anticorpos
[0087] Os anticorpos que se ligam aos biomarcadores da invenção já são conhecidos. Tendo em vista as técnicas atuais em relação à tecnologia de anticorpo monoclonal, os anticorpos podem ser preparados para a maioria dos antígenos.
[0088] A porção de ligação a antígeno pode ser uma parte de um anticorpo (por exemplo, um fragmento Fab) ou um fragmento de anticorpo sintético (por exemplo, um fragmento Fv de cadeia única [ScFv]). Anticorpos monoclonais adequados para selecionar antígenos podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo, aquelas divulgadas em "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Anticorpos quiméricos são discutidos por Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).
[0089] Anticorpos monoclonais (mAbs) são úteis nos métodos da invenção e são uma população homogênea de anticorpos visando especificamente um único epítopo em um antígeno. Os anticorpos monoclonais adequados podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, vide Köhler, G.; Milstein, C. (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495; Siegel DL (2002). "Recombinant monoclonal antibody technology". Schmitz U, Versmold A, Kaufmann P, Frank HG (2000); "Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review". Placenta. 21 Suppl A: S106–12. Helen E. Chadd e Steven M. Chamow; “Therapeutic antibody expression technology,” Current Opinion in Biotechnology 12, no. 2 (April 1, 2001): 188-194; McCafferty, J.; Griffiths, A.; Winter, G.; Chiswell, D. (1990). "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains". Nature 348 (6301): 552–554; "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) e em "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982). Os anticorpos quiméricos são discutidos por Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792- 799)).
[0090] Os anticorpos policlonais são úteis nos métodos da invenção. Anticorpos policlonais monoespecíficos são preferenciais. Os anticorpos policlonais adequados podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos na técnica.
[0091] Os fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab e Fab2, também podem ser usados/providos, tal como podem anticorpos geneticamente manipulados e fragmentos de anticorpos. Os domínios pesado variável (VH) e leve variável (VL) do anticorpo estão envolvidos no reconhecimento de antígeno, um fato primeiramente reconhecido pelos experimentos de digestão de protease precoces. Confirmação adicional foi encontrada pela "humanização" dos anticorpos de roedores. Domínios variáveis de origem de roedor podem ser fundidos a domínios constantes de origem humana, de tal forma que o anticorpo resultante mantém a especificidade antigênica do anticorpo precursor de roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. EUA 81, 6851-6855).
[0092] Essa especificidade antigênica é conferida pelos domínios variáveis e é independente dos domínios constantes, é conhecida a partir de experimentos envolvendo a expressão bacteriana de fragmentos de anticorpos, todos contendo um ou mais domínios variados. Estas moléculas incluem moléculas similares a Fab (Better et al (1988) Science 240, 1041); moléculas Fv (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); moléculas Fv de cadeia única (ScFv), em que os domínios parceiros VH e VL estão ligados através de um oligopeptídeo flexível (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. EUA 85, 5879) e anticorpos de domínio único (dAbs) compreendendo domínios V isolados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Uma revisão geral das técnicas envolvidas na síntese de fragmentos de anticorpos, que mantêm seus locais de ligação específicos, deve ser encontrada em Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.
[0093] Por "moléculas ScFv" queremos dizer moléculas em que os domínios parceiros VH e VL são ligados de forma covalente, por exemplo, diretamente, por um peptídeo ou por um oligopeptídeo flexível.
[0094] Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv, ScFv e dAb podem ser expressos e secretados a partir de E. coli, assim, permitindo a fácil produção de grandes quantidades dos ditos fragmentos.
[0095] Anticorpos completos e fragmentos F(ab')2 são "bivalentes". Por "bivalente", queremos dizer que os ditos anticorpos e fragmentos F(ab')2 têm dois sítios de combinação de antígeno. Por outro lado, fragmentos Fab, Fv, ScFv e dAb são monovalentes, com apenas um sítio de combinação de antígeno. Os anticorpos sintéticos que se ligam ao biomarcador também podem ser produzidos usando a tecnologia phage display, como é bem conhecido na técnica (por exemplo, vide "Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review". Placenta. 21 Suppl A: S106–12. Helen E. Chadd e Steven M. Chamow; "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains". Nature 348 (6301): 552–554).
[0096] Em algumas modalidades preferenciais, o anticorpo é marcado de forma detectável ou, pelo menos, capaz de detecção. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um átomo radioativo, ou uma molécula colorida (cromóforo), ou uma molécula fluorescente ou uma molécula que pode ser facilmente detectada de qualquer outra forma. Moléculas detectáveis adequadas incluem proteínas fluorescentes, luciferase, substratos enzimáticos e radiomarcadores. O anticorpo pode ser diretamente marcado com uma marcação detectável ou pode ser indiretamente marcado. Por exemplo, o anticorpo pode não ser marcado e pode ser detectado por outro anticorpo que é marcado. Alternativamente, o segundo anticorpo pode ter se ligado a sua biotina e a ligação de estreptavidina marcada à biotina é usada para indiretamente marcar o primeiro anticorpo.
[0097] Um aspecto divulgado neste documento é um complexo de um anticorpo e um biomarcador selecionado do grupo que consiste em ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2. O complexo pode compreender adicionalmente um segundo anticorpo diferente. O complexo pode compreender adicionalmente uma fração detectável. O complexo pode estar presente em uma amostra de líquido cervicovaginal. O complexo pode ser isolado. Detecção e Etiquetagem
[0098] Os métodos divulgados neste documento envolvem a detecção e/ou quantificação de um biomarcador.
[0099] Nos métodos divulgados neste documento, o biomarcador (o "alvo") pode ser detectado diretamente. Isto é, o alvo é detectado por um anticorpo anti-alvo.
[00100] Alternativamente, a detecção do alvo pode ser indireta. Isto é, o alvo pode ser detectado pelo anticorpo anti-alvo e o anticorpo anti-alvo é subsequentemente detectado por um anticorpo detectável secundário. O anticorpo secundário é preferencialmente marcado. Os anticorpos secundários adequados podem ser criados contra o isotipo de anticorpo da espécie animal em que o anticorpo primário foi criado. Por exemplo, o anticorpo secundário pode ser um anticorpo anti-camundongo, capaz de se ligar a anticorpos de camundongo. Os métodos que utilizam um anticorpo secundário podem ser mais sensíveis que os métodos de detecção direta, devido à amplificação do sinal de múltiplos anticorpos secundários que se ligam a cada anticorpo primário.
[00101] Marcações adequadas incluem enzimas como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, glicose oxidase e luciferase e agentes colorimétricos, incluindo pontos quânticos, fluoróforos e cromóforos. Fluoróforos adequados incluem FITC, TRITC, Cy5, Texas Red, Alexa Fluor e outros. A marca pode ser uma marca de rádio.
[00102] Uma variedade de substratos enzimáticos detectáveis está disponível para uso com anticorpos enzimáticos marcados. Estes incluem sistemas de detecção cromogênica, tais como a peroxidase de rabanete (HRP), pNNP, BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato / nitro-azul tetrazólio), TMB (tetrametibenzidina), DAB (3,3'-diaminobenzidina), OPD (dicloridrato de orto- fenilenodiaína) e ABTS (2,2'- ácido azinobis [-etilbenzotiazolina-6-sulfônico]), e substratos quimioluminescentes, como uma marca ECL (quimioluminescente aprimorado) ou éster de acridinio (AE).
[00103] Os métodos podem envolver o uso de um anticorpo ou de um agente de ligação derivado de anticorpos, como um fragmento scFv ou Fab. Alternativamente, ou em combinação com o anticorpo, o método pode envolver o uso de um aptâmero.
ELISA
[00104] Em alguns casos, o alvo pode ser detectado por ELISA (ensaio de imuno absorção enzimática). Moléculas alvo (como as proteínas de biomarcadores divulgadas neste documento) de uma amostra são anexadas a uma superfície e detectadas usando um anticorpo específico. O alvo pode ser anexado à superfície não especificamente (via adsorção à superfície) ou especificamente (usando um agente de captura específico, como um anticorpo). ELISA pode ser usado para quantificar o alvo em uma amostra. A superfície pode ser um suporte sólido, como uma placa de várias paredes, microesferas ou “dipstick”.
[00105] Podem ser utilizados ensaios ELISA disponíveis comercialmente. O ELISA pode ser um ELISA indireto, ELISA Sanduíche ou ELISA competitivo.
[00106] O ELISA envolve o uso do primeiro anticorpo de captura para ligar a molécula alvo. Um segundo, detecção, anticorpo para a molécula alvo é então adicionado. A ligação do segundo anticorpo indica a presença e/ou o nível do alvo.
[00107] O primeiro anticorpo pode estar ligado a um suporte sólido. O primeiro e o segundo anticorpos não são idênticos. Normalmente, o primeiro e o segundo anticorpos se ligam a diferentes epítopos na molécula alvo. Em alguns casos, o segundo anticorpo se liga a um complexo do primeiro anticorpo e do alvo, mas não ao primeiro anticorpo ou ao alvo quando não está complexo. O segundo anticorpo pode ser marcado. Análise de imunoblotina
[00108] Em alguns aspectos, o alvo é detectado por análise de imunoblotina, ou transferência western. Nesses métodos, as proteínas em uma amostra são separadas com base em sua carga elétrica ou tamanho. Eles podem ser separados por um método baseado em eletroforese. As proteínas separadas são transferidas para uma membrana, onde são manchadas com um anticorpo específico para o alvo. O anticorpo é então detectado, diretamente em virtude de o anticorpo ser conjugado a uma marcadetectável, ou indiretamente, adicionando um anticorpo secundário marcado. Espectrometria de massa
[00109] Em alguns aspectos, os métodos divulgados neste documento envolvem a detecção e/ou quantificação de proteínas utilizando espectrometria de massa. A espectrometria de massa pode usar peptídeos com sequências exclusivas da proteína alvo como substitutos para o alvo. As medições são feitas com relação à massa e intensidade do pico devido à proteína, fragmento de proteína ou peptídeo parcial de interesse. Antes das medições, uma quantidade fixa de substância que serve como padrão interno é adicionada ao material biológico original e a intensidade de seu pico também é medida. A concentração do alvo no material biológico original pode ser calculada a partir da razão de intensidade de pico do alvo até a intensidade máxima do padrão interno. Vários métodos de espectrometria de massa são conhecidos e podem ser usados para detectar e/ou quantificar biomarcadores divulgados neste documento, incluindo MALDI-TOF (tempo de voo), SELDI/TOF, cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), cromatografia em fase gasosa espectrometria de massa (GC-MS), cromatografia líquida de alta eficiência - espectrometria de massa (HPLC-MS), eletroforese capilar-espectrometria de massa, espectrometria de ressonância magnética nuclear ou espectrometria de massa em tandem. Diagnósticos e Kits In vitro
[00110] Um aspecto da presente divulgação inclui métodos de diagnóstico in vitro e kits de diagnóstico in vitro para a realização de tais métodos. Um kit como descrito neste documento pode incluir um ou mais anticorpos, como um anticorpo anti-biomarcador ou fragmento dele. O kit pode ser adequado para selecionar um sujeito com risco de parto prematuro.
[00111] O kit pode ser adequado para um teste de diagnóstico in vitro. Pode ser kit para testes em laboratório. O kit pode incluir instruções de uso, como um livreto de instruções ou folheto. As instruções podem incluir um protocolo para a execução de qualquer um ou mais dos métodos descritos neste documento. As instruções podem incluir um protocolo para a realização de um ensaio imunocromatográfico. Eles podem descrever métodos e sugestões para adaptar o teste para diferentes tipos de amostra. Eles podem fornecer métodos e sugestões para otimizar os resultados obtidos a partir do teste, como minimizar o sinal para a razão de ruído.
[00112] O kit pode ser adequado para a realização de um ensaio imunocromatográfico. Em alguns casos, o teste de diagnóstico in vitro envolve um dispositivo de fluxo lateral, ou teste de "dipstick". Em alguns casos, o kit inclui uma placa com múltiplos poços (multiwell) ou outro suporte sólido que é pré-revestido com um agente de captura, como um anticorpo anti-biomarcador.
[00113] Além disso, o kit pode incluir padrões ou controles. Além disso, o kit pode incluir buffers, diluentes ou outros reagentes, como buffer de parada, tampão de preparação de amostra, reagentes de desenvolvimento de cores, conjugados de estreptavidina, substratos ou tampão de lavagem.
[00114] O kit pode ser adaptado para uso com amostras secas, amostras úmidas, amostras congeladas, amostras fixas, amostras de urina, amostras de saliva, amostras de tecidos, amostras de sangue ou qualquer outro tipo de amostra, incluindo qualquer um dos tipos de amostras divulgados neste documento.
[00115] O kit pode incluir um dispositivo para obtenção ou processamento de uma amostra de fluido vaginal. O kit pode compreender tampão de extração de fluido vaginal, por exemplo, um tampão contendo aproximadamente 50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 1 mM de
EDTA, 1 mM de Pefabloc SC 4- (2-aminoetil_benzeno sulfonil fluoreto (AEBSF). O kit pode incluir um dispositivo de coleta de amostras, como um cotonete, pavio cervicovaginal, dispositivo semelhante ao diafragma, aspirador cervical ou citoescova. O kit pode incluir um recipiente adequado para armazenar uma amostra de fluido vaginal.
[00116] Os cotonetes (swabs) adequados para uso nos kits incluem cotonetes de espuma, cotonetes Dacron, cotonetes rayon, cotonetes flocados e cotonetes de algodão. Os cotonetes de espuma adequados incluem MW942 (Sigma-Swab Duo), cotonete de espuma de poliuretano (Catch-All; Epicentro) e cotonete de espuma de poliuretano EZ (Db) e CultureSwab EZ. Os cotonetes Dacron adequados incluem Deltalab Eurotubo 300263 (Fisher Scientific, Reino Unido), Sterile G-in, Aplicadores plásticos com ponta da Cron (Solon, Skowhegan, ME), Dacron swab (Cardinal Health, McGraw Park, IL) e Dacron swabs (Puritan Medical, Guilford, ME, EUA). Os cotonetes de rayon adequados incluem BBL CultureSwab (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) e MW167 (Duo-Transtube®). Os cotonetes reunidos adequados (nylon) incluem Seacliff Packaging, BD, COPAN. Os cotonetes adequados incluem cotonetes secos estéreis (Eurotubo, Rubi, Espanha), cotonetes com ponta de algodão (aplicador Falcon ™ Screw Cap Single SWUBE ™, Becton Dickinson and Co., Sparks, MD), aplicador Falcon ™ Single Cap Screw SWUBE ™ (BD).
[00117] Os pavios adequados para uso no kit divulgado neste documento incluem tampões, tiras ou esponjas, incluindo esponja oftálmica de PVA (Eyetec ™, Network Medical Ltd.), tiras Tear-Flo ™ (Wilson Ophthalmic), esponjas Weck-Cel® (Xomed Surgical Products, Jacksonville, FL), Sno-strips (Akorn Inc., Abita Springs LA) e Polywicks (Polyfiltronics, Rockland, MA, EUA).
[00118] Os dispositivos do tipo diafragma adequados para uso no kit incluem o SoftCup (Ultrafem), a gaze estéril ou um copo menstrual (SoftCup, EuroFemPro, Holanda ou SoftCup, vez Inc., San Diego, CA).
[00119] Aspiradores cervicais adequados incluem aspiradores de espécimes vaginais (CarTika), ou seringas de tuberculina longa.
[00120] Certos kits divulgados neste documento compreendem um anticorpo que se liga a um biomarcador de parto prematuro e um dispositivo ou tampão para a obtenção ou processamento de uma amostra de fluido vaginal.
[00121] O anticorpo que se liga a um biomarcador de parto prematuro pode ser um anticorpo anti-ECM1, anti-GGH, anti-LAMC2, anti-EFEMP1, anti- PTN, anti-FGA ou anti-PEDF.
[00122] Também é divulgada neste documento uma composição composta por fluido vaginal e um anti-ECM1, anti-GGH, anti-LAMC2, anti- EFEMP1, anti-PTN, anti-FGA ou anti-PEDF. Métodos de amostragem
[00123] Métodos e agentes descritos neste documento envolvem a análise de certos biomarcadores no fluido cervicovaginal. Vários métodos de amostragem de fluido cervicovaginal são conhecidos e podem ser utilizados nos métodos.
[00124] Os métodos podem envolver amostragem por lavagem cervicovaginal. Isso envolve a obtenção de lavagens cervicovaginais lavando a cervicovagina com tampão de lavagem e coletando o líquido após a lavagem.
[00125] Em alguns métodos, são colhidos cotonetes cervicovaginais. Cotonetes adequados são conhecidos no estado da técnica. Os cotonetes preferenciais para uso nos métodos e kits divulgados neste documento incluem cotonetes de espuma, cotonetes Dacron, cotonetes de rayon, cotonetes reunidos e cotonetes de algodão. Os cotonetes de espuma adequados incluem MW942 (Sigma-Swab Duo), cotonete de espuma de poliuretano (Catch-All; Epicentro) e cotonete de espuma de poliuretano EZ (Db) e CultureSwab EZ. Os cotonetes Dacron adequados incluem Deltalab Eurotubo 300263 (Fisher Scientific, Reino Unido), Sterile G-in, Aplicadores plásticos com ponta da Cron (Solon, Skowhegan, ME), Dacron swab (Cardinal Health, McGraw Park, IL) e Dacron swabs (Puritan Medical, Guilford, ME, EUA). Os cotonetes de rayon adequados incluem BBL CultureSwab (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido) e MW167 (Duo-Transtube®). Os cotonetes reunidos adequados (nylon) incluem Seacliff Packaging, BD, COPAN. Os cotonetes adequados incluem cotonetes secos estéreis (Eurotubo, Rubi, Espanha), cotonetes com ponta de algodão
(aplicador Falcon ™ Screw Cap Single SWUBE ™, Becton Dickinson and Co., Sparks, MD), aplicador Falcon ™ Single Cap Screw SWUBE ™ (BD).
[00126] Em outros métodos, o fluido cervicovaginal é amostrado com um pavio. Os pavios adequados para uso nos métodos divulgados neste documento incluem tampões, tiras ou esponjas, incluindo esponja oftálmica de PVA (Eyetec™, Network Medical Ltd.), tiras Tear-Flo™ (Wilson Ophthalmic), esponjas Weck-Cel® (Xomed Surgical Products, Jacksonville, FL), Sno-strips (Akorn Inc., Abita Springs LA) e Polywicks (Polyfiltronics, Rockland, MA, EUA).
[00127] Em outros métodos, dispositivos como o diafragma são usados para provar fluido cervicovaginal. Diafragma adequado como dispositivos são colocados sobre o colo do útero para coletar o fluido cervicovaginal e incluem, em vez disso, SoftCup (Ultrafem), gaze estéril ou um copo menstrual (SoftCup, EuroFemPro, Holanda, ou a SoftCup, Instead Inc., San Diego, CA).
[00128] O método pode envolver o uso de aspiradores cervicais, como um Aspirador de Amostras Vaginais (CarTika), ou uma seringa de tuberculina longa.
[00129] Em alguns métodos, o fluido cervicovaginal é amostrado com uma citoescova.
[00130] Certos kits divulgados neste documento compreendem um anticorpo que se liga a um biomarcador de parto prematuro e um dispositivo ou tampão para a obtenção ou processamento de uma amostra de fluido vaginal. Controles
[00131] Em alguns métodos divulgados neste documento o nível do biomarcador é comparado ao nível de um controle ou um valor ou nível de referência.
[00132] Em alguns casos, o controle pode ser uma amostra de referência ou conjunto de dados de referência. A referência pode ser derivada de uma ou mais amostras que foram previamente obtidas de um indivíduo conhecido por ter sido submetido ao parto prematuro. Alternativamente, a referência pode ser derivada de uma ou mais amostras que foram previamente obtidas de um sujeito conhecido por ter sido submetido ao parto a termo. A referência pode ser um conjunto de dados obtido a partir da análise de uma amostra de referência.
[00133] Os controles podem ser controles positivos, em que se sabe que a molécula-alvo está presente, ou expressa em alto nível, ou controles negativos, em que se sabe que a molécula-alvo está ausente, ou expressa em baixo nível.
[00134] O controle pode ser uma amostra ou nível de um paciente conhecido por ter experimentado um parto prematuro ou a termo. O valor de controle pode ser obtido realizando a análise do biomarcador em paralelo com uma amostra do indivíduo a ser testada. Alternativamente, o valor de controle pode ser obtido a partir de um banco de dados ou outro valor previamente obtido. Amostras
[00135] Os métodos divulgados neste documento referem-se à detecção de biomarcadores em uma amostra obtida de um indivíduo ou paciente. O método pode ser realizado in vitro. Preferencialmente, o método envolve uma amostra obtida de um indivíduo. Assim, o método pode, mas preferencialmente não, envolver uma etapa de obtenção de uma amostra de um indivíduo.
[00136] Preferencialmente, a amostra é uma amostra de fluido vaginal, como o fluido cervicovaginal (cervico-vaginal; cervical-vaginal) ou fluido cervical (CVF) ou fluido cervical. Alternativamente, a amostra pode ser amostra de sangue, como sangue total, plasma ou amostra de soro, uma amostra linfática, uma amostra de urina ou uma amostra de fluido amniótico. A amostra pode ser uma amostra de proteína derivada de uma amostra de fluido vaginal ou fluido cervicovaginal ou uma amostra de proteína derivada de uma amostra de sangue, como amostra de sangue total, plasma ou soro, amostra de linfa, amostra de urina ou amostra de líquido amniótico.
[00137] A amostra pode ter sido pré-tratada. Por exemplo, a amostra pode ter sido contatada com um ou mais agentes conservantes ou buffers. A amostra pode ter sido congelada, liofilizada ou seca.
[00138] Embora o indivíduo ou paciente possa ser mamífero, como um gato, cão, cavalo ou macaco, o indivíduo é preferencialmente um humano. Os termos "paciente", "indivíduo" e "sujeito" são usados alternadamente neste documento.
[00139] O indivíduo pode ser do sexo feminino. O indivíduo pode estar grávido. O indivíduo pode ser sintomático ou assintomático. Preferencialmente, o indivíduo é assintomático.
[00140] Indivíduos sintomáticos são indivíduos que apresentam um ou mais sintomas de parto prematuro, como contrações, particularmente contrações regulares, dor nas costas, incluindo dor nas costas, cólicas na parte inferior do abdômen ou cólicas menstruais, fluido vazando da vagina, sintomas semelhantes à gripe, náuseas, vômitos, aumento da pressão na pelve ou vagina, aumento da descarga vaginal e/ou sangramento vaginal.
[00141] Indivíduos assintomáticos podem não apresentar qualquer sintoma de parto prematuro, ou com sintomas que podem ou não ser indicativos de parto prematuro, como dor nas costas, dor nas costas, cólicas na parte inferior do abdômen ou cólicas menstruais, vazamento de fluido da vagina, sintomas semelhantes à gripe, náuseas, vômitos, aumento da pressão na pelve ou vagina, aumento da descarga vaginal e/ou sangramento vaginal. Comumente, os indivíduos assintomáticos não apresentam nenhum sintoma de parto prematuro.
[00142] Em alguns casos, o indivíduo pode ser suspeito de estar em alto risco de parto prematuro antes de obter a amostra. Por exemplo, a amostra pode ser obtida e/ou a presença ou nível do biomarcador pode ser determinado porque suspeita-se que o indivíduo tenha alto risco de parto prematuro. Pode-se suspeitar que um indivíduo tenha um alto risco de parto prematuro com base em seu histórico médico prévio de partos prematuros ou abortos. Alternativamente, ou adicionalmente, o indivíduo pode ser suspeito de ter alto risco de parto prematuro com base nos resultados de um teste de Fibronectina Fetal (fFN), ou com base em sintomas como contrações, sangramento vaginal, vazamento de fluido da vagina, aumento da descarga vaginal, dor nas costas ou cãibras no abdômen inferior. Alternativamente, ou adicionalmente, o indivíduo pode ser considerado de alto risco de parto prematuro devido à presença de um ou mais fatores de risco, como diabetes, pressão alta, estar grávida de mais de um bebê, IMC (muito alto ou muito baixo), uma série de infecções vaginais, tabagismo, estresse psicológico, origem étnica e status socioeconômico ou renda.
[00143] As amostras podem ser obtidas a partir de uma semana ou meses antes do parto, ou antes da data prevista do parto a termo. Por exemplo, as amostras podem ser obtidas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 semanas antes do parto. Em alguns casos, as amostras são colhidas 1-4, 5-8. 9- 12 ou mais de 12 semanas antes do parto.
[00144] As amostras podem ser obtidas em um ponto de tempo que, com base em um prazo esperado de 37 semanas, é previsto para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 semanas antes do parto normal. Em alguns casos, as amostras são colhidas 1-4, 5-8. 9-12 ou mais de 12 semanas antes da data esperado do parto normal.
[00145] Alternativamente, as amostras podem ser colhidas em torno de 1 mês, em torno de 2 meses, em torno de 3 meses, em torno de 4 meses, em torno de 5 meses, em torno de 6 meses, em torno de 7 meses, em torno de 8 meses, ou cerca de 9 meses antes da data prevista do parto normal.
[00146] Olhando de outra maneira, amostras podem ser colhidas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, ou 37 semanas de gestação.
[00147] As amostras podem ser colhidas de 10 semanas a 13 semanas mais 6 dias, 14 semanas a 21 semanas mais 6 dias, 22 semanas a 25 semanas mais 6 dias, 26 semanas a 29 semanas mais 6 dias, 30 semanas a 33 semanas mais 6 dias, ou mais de 34 semanas de idade gestacional. A primeira amostra pode ser colhida em torno de 12-14 semanas. A segunda amostra pode ser colhida entre 16-24 semanas.
[00148] As amostras podem ser colhidas no primeiro, segundo ou terceiro trimestre. O primeiro trimestre dura de zero a 13 semanas mais 6 dias.
O segundo trimestre dura de 14 semanas a 27 semanas mais 6 dias. O terceiro trimestre dura de 28 semanas até o parto.
[00149] O versado na técnica vai apreciar que pode ser difícil determinar precisamente o número de semanas de gestação. Métodos para estimar o número de semanas de gestação são conhecidos no estado da técnica, e qualquer um deles pode ser utilizado nos métodos divulgados neste documento. Por exemplo, semanas de gestação são comumente estimadas com base na data do último período menstrual (LMP). As semanas de gestação podem ser determinadas com base na data em que o último período menstrual começou. Alternativamente, semanas de gestação podem ser baseadas na data da ovulação, se conhecido. Comumente, a data da ovulação é duas semanas após a data em que o último período menstrual começou. O tempo de gestação pode ser determinado com base em uma ultrassonografia de primeiro trimestre. Uma ultrassonografia de primeiro trimestre (dating scan) é comumente realizado entre 10 e 13 semanas mais 6 dias, com base na data do primeiro dia do último período menstrual.
[00150] Diferentes biomarcadores podem ser mais apropriados em diferentes momentos de amostra. Por exemplo, um biomarcador pode ser útil para determinar se um indivíduo está em risco de parto prematuro em uma amostra obtida a partir desse indivíduo em um estágio inicial, enquanto um biomarcador diferente pode ser útil para determinar que um indivíduo está em risco em uma amostra obtida a partir desse indivíduo em um estágio posterior.
[00151] Em alguns casos, as amostras podem ser obtidas de um indivíduo em vários pontos de tempo. Por exemplo, uma primeira amostra pode ser obtida no primeiro trimestre, e uma segunda amostra pode ser obtida no segundo trimestre. Várias amostras podem ser obtidas para identificar tendências ou mudanças na expressão do biomarcador. Em alguns casos, uma amostra pode ser obtida no início da gravidez, como no primeiro trimestre, de modo a estabelecer um controle ou nível de linha de base de biomarcador para esse indivíduo. Proteínas e Polipeptídeos
[00152] Embora os métodos da presente invenção possam envolver a detecção de sequências proteicas completas, isso nem sempre é necessário. Como uma alternativa, podem ser detectados homólogos, mutantes, derivados, isoformas, variantes de emenda ou fragmentos do polipeptídeo de comprimento total.
[00153] Os derivados incluem variantes de uma dada sequência de proteínas de comprimento completo e incluem variantes alelicais de ocorrência natural e variantes sintéticas que têm uma identidade substancial de sequência de aminoácidos para a proteína de comprimento completo.
[00154] Os fragmentos de proteína podem ter até 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 150 resíduos de aminoácidos de comprimento. O comprimento mínimo do fragmento pode ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 30 aminoácidos ou vários aminoácidos entre 3 e 30.
[00155] Os mutantes podem compor pelo menos uma modificação (por exemplo, adição, substituição, inversão e/ou exclusão) em comparação com o polipeptídeo do tipo selvagem correspondente. O mutante pode exibir uma atividade ou propriedade alterada, por exemplo, vinculação.
[00156] Mutações podem ocorrer em qualquer uma das proteínas biomarcadoras e componentes que contêm tais fragmentos podem servir ao propósito de modular a atividade do mutante para restaurar, total ou parcialmente, a atividade do polipeptídeo do tipo selvagem.
[00157] Os derivados também podem incluir variações naturais ou polimorfismos que podem existir entre indivíduos ou entre membros de uma família. Todos esses derivados estão incluídos no escopo da invenção. Puramente como exemplos, substituições conservadoras que podem ser encontradas em tais polimorfismos podem estar entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: alanina, serina, treonina; ácido glutamico e ácido aspártico; arginina e leucina; asparagine e glutamina; isoleucina, leucina e valina;
fenilanina, tiranosina e triptofano.
[00158] Neste relatório descritivo, um biomarcador pode ser qualquer peptídeo, polipeptídeo ou proteína com uma sequência de aminoácidos com um grau especificado de sequência de identidade para uma das sequências de biomarcadores, ou para um fragmento de uma dessas sequências. O grau especificado de identidade de sequência pode ser de pelo menos 60% a 100% de sequência de identidade. Mais preferencialmente, o grau especificado de identidade sequência pode ser de pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.
[00159] As características divulgadas no relatório descritivo anterior, ou nas seguintes reivindicações, ou nos desenhos que acompanham, expressas em suas formas específicas ou em termos de meios para o desempenho da função divulgada, ou um método ou processo para obtenção dos resultados divulgados, conforme apropriado, podem, separadamente, ou em qualquer combinação de tais características, ser utilizadas para realizar a invenção de diversas formas.
[00160] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades exemplares descritas acima, muitas modificações e variações equivalentes serão aparentes para aqueles versados na técnica quando dada essa divulgação. Em conformidade, as modalidades exemplares da invenção estabelecidas acima são consideradas ilustrativas e não limitativas. Podem ser feitas várias mudanças às modalidades descritas podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
[00161] Para evitar qualquer dúvida, quaisquer explicações teóricas fornecidas neste documento são fornecidas com o propósito de melhorar a compreensão de um leitor. Os inventores não desejam ser obrigados por nenhuma dessas explicações teóricas.
[00162] Quaisquer títulos de seção utilizados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita.
[00163] Em todo este relatório descritivo, incluindo as reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender" e "incluir", e variações como "compreende", "compreendendo" e "incluindo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas.
[00164] Deve-se notar que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "a/o" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente imponha de outra forma. Intervalos podem ser expressos neste documento como de "cerca de" um determinado valor, e/ou a "cerca de" outro determinado valor. Quando tal intervalo é expresso, outra modalidade inclui de um determinado valor e/ou ao outro determinado valor. Da mesma forma, quando valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", entender-se-á que o determinado valor forma outra modalidade. O termo "sobre" em relação a um valor numérico é opcional e significa, por exemplo +/- 10%. Exemplos EXEMPLO 1
[00165] Amostras de CVF (fluido cervicovaginal) foram coletadas de gestantes de 19-37 semanas de idade gestacional. Um espéculo bivalve estéril foi inserido na vagina dos pacientes. Um cotonete de duas pontas foi colocado no fornix posterior da vagina por 30 segundos e, em seguida, colocado em 1 mL de tampão de extração CVF refrigerado (50mM HEPES, 150mM NaCl, 0,1% SDS, 1mM EDTA, 1 mM de Pefabloc SC fluoreto de 4- (2-aminoetil) benzeno sulfonil (AEBSF)). As amostras foram vórtices por 10s, após o qual o cotonete foi invertido e foi centrifugado por 5min a 1000xg. O cotonete foi descartado, e o tubo de amostra foi vórticepara 10s antes da centrifugação a 1000xg por 5min. O CVF extraído (sobrenadante) foi alicitado em tubos e armazenado a -80°C até que necessário.
[00166] Sete biomarcadores de proteína foram testados nas 200 amostras de CVF que foram obtidas de 86 pacientes que eventualmente tiveram partos a termo e prematuros (ECM1, GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN, FGA e
PEDF). As amostras foram coletadas longitudinalmente entre 19-38 semanas de gestação. O nível de expressão biomarcadores nas amostras cvf foram medidos usando kits ELISA comerciais, ou seja, PEDF (DuoSet, #DY1177-05, P&D Systems, Minneapolis, MN), ECM1 (#ELH-ECM1-1, Raybiotech), GGH (# EH4206, Wuhan Fine Biotech), LAMC2 (#SEC083Hu, Cloud-clone), PTN (#23437, LSBIO), FGA (#11466, LSBIO), EFEMP1 (#MBS178533, MyBioSource). As amostras foram executadas como duplicatas em uma placa padrão de 96- bem ao lado de um controle de referência e uma proteína padrão em concentração conhecida.
[00167] Os protocolos ELISA foram testados com base no manual do fabricante. Abaixo descrito o protocolo geral:
[00168] Revestir 96 poços com 100 µl de Anticorpo Capture, a uma concentração entre 0,8-10μg/ml em tampão de revestimento. Cobrir a placa e incubar durante a noite a 4 °C.
[00169] Adicionar 300 µl de solução de bloqueio a cada poço. Incubar por 60 minutos. Lavar a placa três vezes com tampão de lavagem e secar batendo na placa invertida em papel seco.
[00170] Adicionar 100 µl de proteína padrão em diluições em série e amostras adequadamente diluídas. As amostras ou padrões são processados em duplicatas e incubados por 90 minutos a 37 °C. Lavar a placa três vezes com tampão de lavagem e secar batendo na placa invertida em papel seco.
[00171] Adicionar 100 µl de anticorpo de detecção conjugado com biotina, diluído em diluente de reagente ou tampão apropriado e incubar por 1 hora a 37 °C. Lavar a placa três vezes com tampão de lavagem.
[00172] Adicionar 100 µl de estreptavidina conjugada com enzima, diluída em diluente reagente ou tampão apropriado e incubar por 60 minutos a 37 °C. Lavar a placa três vezes com tampão de lavagem e secar batendo na placa invertida em papel seco.
[00173] Adicionar 100 µl da solução de substrato apropriada a cada poço. Incubar a 37 °C por até 20 minutos ou até que a mudança de cor desejada seja alcançada.
[00174] Ler os valores de absorbância imediatamente no comprimento de onda apropriado ou adicionar 50 µl de "solução de parada". Bater suavemente na placa para garantir uma mistura completa. Medir a absorvância a 450nm e fazer referência a 540nm.
[00175] A concentração do biomarcador foi determinada com base na curva padrão executada em todas as placas como uma curva linear ou linear de 4 parâmetros (4PL). A concentração final foi normalizada com base na concentração total de proteínas determinada pelo ensaio com ácido bicinchonínico (ensaio BCA).
[00176] Os valores e dados das amostras foram então reunidos para comparar os resultados do A Termo e do Prematuro estratificando com base em três métodos principais: • Grupo inteiro no qual a coorte inteira (n = 200) do A Termo (n = 136) e Prematuro (n = 64) foram avaliadas quanto à diferença na média e na demonstração de valores de p obtidos na análise do teste t de Student. • Semana gestacional - amostras agrupadas com base na semana gestacional na amostragem • Tempo desde o parto - As amostras foram agrupadas com base no número de dias entre a amostra e o parto Análise estatística.
[00177] Para análise estatística, o teste t de Student bicaudal não pareado foi realizado no intervalo de confiança (CI) = 0,95 usando o software Microsoft Excel, com valor de p (P) menor que 0,05 considerado significativo. Todos os dados numéricos, incluindo barras de erro, representam a média +/- Erro padrão da média (SEM). Resultados e discussão
[00178] A quantificação do biomarcador nas 200 amostras clinicamente derivadas demonstrou uma diferença entre amostras a termo e prematuras. Uma estratificação adicional das amostras permitiu enfatizar os possíveis momentos da gestação que permitirão uma melhor compreensão da base de risco de parto prematuro.
[00179] O ECM1 foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras coletadas com um valor p de P = 0,0025 (Figura 1). Após a estratificação das amostras em diferentes idades gestacionais e tempo diferente da amostragem até o parto, a expressão diferencial permaneceu na mesma direção (ou seja, o ECM1 foi expresso menos em média em todas as amostras prematuras, independentemente da idade gestacional e do tempo para o parto) (Figura 2 e Figura 3). Como o ECM1 é um marcador conhecido em vários distúrbios e angiogênese relacionados à pele, é, portanto, um tanto surpreendente por sua correlação com o parto prematuro.
[00180] O GGH foi expresso diferencialmente entre amostras a termo e prematuras. A expressão de GGH foi, em média, elevada em amostras de mulheres prematuras versus amostras de mulheres a termo (Figura 4). Curiosamente, tanto nos casos a termo quanto nos prematuros, houve um aumento incremental nos níveis de expressão à medida que a idade gestacional progredia e o tempo para o parto diminuía (Figura 5 e 6). O GGH não é um biomarcador amplamente conhecido, está envolvido nas vias imunológicas e na regulação da matriz extracelular.
[00181] O LAMC2 foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras (Figura 7). Ao contrário dos outros marcadores, a diferença foi mais acentuada nos últimos dias antes do parto (Figura 9). O LAMC2 está envolvido nas vias de transição epitelial e é conhecido por seu envolvimento em várias indicações de doenças de pele. Curiosamente, nunca foi associado a mudanças no espaço vaginal cervical.
[00182] O EFEMP1 também foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras (Figura 10). No entanto, mais interessante, houve uma transição entre expressão elevada e expressão reduzida de EFEMP1 ao longo da gestação entre amostras a termo e prematuras. Nos momentos iniciais da idade gestacional e do tempo para o parto, as amostras a termo EFEMP1 foram elevadas em comparação com as amostras prematuras. No entanto, essa tendência foi revertida em períodos posteriores das idades gestacionais e do tempo para o parto (Figura 11 e Figura 12).
[00183] O PTN foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras (Figura 13). A diferença mais acentuada no perfil de expressão de PTN entre amostras a termo e prematuras foi observada nas primeiras idades gestacionais e nos primeiros e mais recentes momentos no tempo do parto (Figura 14 e 15).
[00184] O FGA foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras (Figura 16). As diferenças na expressão da FGA foram mais pronunciadas nos estágios tardios da gestação e nos últimos dias antes do parto (Figura 17 e 18). O FGA como uma proteína está envolvido nas vias de inflamação e resposta imune e, portanto, pode estar relacionado a casos de parto prematuro iniciados por essas vias.
[00185] O PEDF foi expresso diferencialmente entre todas as 200 amostras a termo e prematuras (Figura 19). O PEDF foi consistentemente elevado nas amostras prematuras em todas as estratificações (Figura 20 e 21), indicando que este seria um biomarcador robusto a qualquer momento. O PEDF é uma proteína fortemente relacionada à angiogênese e, portanto, à remodelação do tecido. Nossa hipótese é que seu envolvimento no parto prematuro esteja relacionado ao remodelamento cervical.
[00186] O estado atual de previsão de mulheres em risco de parto prematuro é bastante limitado. As duas maneiras mais comuns de obter um perfil de risco são baseadas na história anterior e no comprimento do colo do útero. Esses métodos não avaliam corretamente o risco de parto prematuro na maioria das mulheres, mesmo quando usadas em combinação. Assim, uma ferramenta que preveja com precisão as mulheres em risco de parto prematuro seria um grande trunfo para a comunidade clínica no gerenciamento de gestações e permitiria ainda a redução de casos de parto prematuro e a economia nos custos significativos de assistência médica. Aqui, demonstramos as pedras angulares dessa ferramenta por meio de biomarcadores individuais. A nosso ver, esses biomarcadores, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2, constituem a base de um kit que combina os valores preditivos de cada biomarcador, gerando uma ferramenta altamente precisa. Exemplo 2: Ensaios in vitro
[00187] As linhas celulares ectocervicais Ect1/E6E7 (ATCC CRL- 2614) e endocervical End1/E6E7 (ATCC CRL-2615) foram selecionadas para o estudo in vitro de biomarcadores sob várias condições de estresse celular (peróxido de hidrogênio e LPS) com base nos seguintes protocolos: Tratamento com H2O2
[00188] As células Ect1 e End1 foram semeadas no meio sem soro de Queratinócito (KSFM) suplementado com 0,1ng/ml de EGF, 50μg/ml de BPE e 0,4mM CaCl2 no Dia 0. Ao atingir 70-80% de confluência no dia 2, as células foram tratadas com doses crescentes de H2O2 (50μM, 100μM, 200μM, 400μM). Após 24 horas, a mídia cultural foi coletada para quantificação de biomarcadores usando ELISA. O efeito de H2O2 na viabilidade e proliferação celular foi avaliado utilizando-se o ensaio MTT. Tratamento de LPS
[00189] As células Ect1 e End1 foram semeadas no meio sem soro de Queratinócito (KSFM) suplementado com 0,1ng/ml de EGF, 50μg/ml de BPE e 0,4mM CaCl2 no Dia 0. No dia 1, a cultura das células foi removida e substituída por KSFM sem suplemento de fator de crescimento. As células foram então tratadas com doses crescentes de LPS (10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml) no dia 2. Após 24 horas de tratamento com LPS, foram coletados meios de cultura para quantificação de biomarcadores utilizando ELISA. Resultados e discussão:
[00190] As linhas celulares ectocervical Ect1/E6E7 (ATCC CRL-2614) e endocervical End1/E6E7 (ATCC CRL-2615), ambas derivadas de tecido epitelial cervical normal, foram selecionadas para estudo in vitro de biomarcadores. A extremidade 1 expressa características do epitélio colunar simples, enquanto a Ect1 expressa características dos epitélios escamosos não queratinizados estratificados. Como o CVF é uma mistura de fluidos originários da vagina, colo uterino e membranas fetais adjacentes, o estudo do conteúdo secretado de Ect1 e End1 na presença de diferentes estresses extracelulares fornece referências e inferências ao ambiente bioquímico local e às mudanças fisiológicas do colo do útero durante a gravidez.
[00191] Foi relatado que o estresse oxidativo desempenha papéis importantes no termo normal e no parto prematuro espontâneo (PTB), bem como em muitas complicações na gravidez, como ruptura prematura de membranas (PPROM) e pré-eclâmpsia. Embora os mecanismos moleculares permaneçam obscuros, os papéis do estresse oxidativo no PTB podem ser atribuídos a várias vias fisiopatológicas mediadas por espécies reativas de oxigênio (ROS), como inflamação, apoptose, autofagia, senescência e metabolismo alterado do colágeno. O estudo de Menon et al mostrou que nas membranas fetais de PTB e PPROM, a expressão de marcadores de estresse oxidativo, como F2-isoprostanos e proteínas modificadas por 3-nitrotirosina induzida por OS (3-NT), foi significativamente maior do que a membrana fetal de parto a termo. Ao mesmo tempo, tanto o PTB quanto o PPROM apresentaram F2-isoprostanos do líquido amniótico mais elevados do que o parto a termo. O mesmo grupo de pesquisadores deduziu ainda que a apoptose mediada pelo estresse oxidativo resultou em proteólise na membrana fetal que eventualmente leva ao enfraquecimento e ruptura da membrana na PPROM. Por outro lado, Heng et al mostraram que a expressão de enzimas antioxidantes, tioredoxina e SOD1, bem como a capacidade antioxidante total da CVF, diminuíram significativamente com a aproximação do trabalho de parto. Eles concluíram que o trabalho de parto está associado ao aumento do estresse oxidativo e as enzimas antioxidantes podem servir como preditores de trabalho de parto.
[00192] Para induzir o estresse oxidativo em nosso sistema, as células Ect1 e End1 foram tratadas com doses crescentes de H2O2 por 24 h. A viabilidade celular e a proliferação de células tratadas com H2O2 foram avaliadas utilizando o ensaio MTT (Figura 22). Verificou-se que o tratamento com H2O2 induziu resposta diferencial celular em células Ect1 e End1. Nas células Ect1, a dosagem mais baixa de H2O2 (50 μM e 100 μM) não afetou a viabilidade celular. Em 200μM H2O2, houve uma diminuição de 20% na densidade celular nas células tratadas, em comparação com o controle de células não tratadas, embora a diminuição não seja estatisticamente significativa. Em 400μM H2O2, foi observada uma diminuição significativa de ~ 50% na viabilidade celular nas células tratadas. Nas células End1, enquanto 50μM não tiveram efeito, 100μM,
200μM e 400μM H2O2 resultaram em uma diminuição significativa de ~20%, ~50% e ~90% na viabilidade celular, respectivamente.
[00193] Prosseguimos com a quantificação da expressão de biomarcadores no meio de cultura das células tratadas com H 2O2 usando ELISA. Curiosamente, os biomarcadores mostraram expressão diferencial no tratamento H2O2. Em Ect1, a expressão de FGA (Figura 25), LAMC2 (Figura 24) e EFEMP1 (Figura 31) em Ect1 foi encontrada para diminuir significativamente no tratamento com 200μM e 400μM de H2O2. A expressão ECM1 diminuiu (P<0,05) quando Ect1 foi exposta a 400μM de H2O2 por 24h (Figura 23). A expressão GGH permaneceu relativamente inalterada após tratamento de H2O2 (Figura 26).
[00194] Para as células End1, observou-se mudança significativa na expressão em FGA e EFEMP1 em células tratadas com 200μM de H 2O2 (Figuras 25 e 32). A expressão de ECM1 (Figura 23), GGH (Figura 26) e LAMC2 (Figura 24) foram semelhantes com o controle de células não tratadas, apesar do tratamento com H2O2 por 24h. A Tabela 1 e a Tabela 2 resumem as mudanças na expressão dos biomarcadores em Ect1 e End1 após o tratamento com H2O2. Tabela 1. Expressão de biomarcadores em Ect1 após tratamento com H2O2 por 24 horas Ect1 Biomarcador Mudança de dobra (200μM Mudança de dobra (400μM H2O2) H2O2) ECM1 1,09 ± 0,21 0,62 * ± 0,10 GGH 0,73 ± 0,16 1,01 ± 0,25 FGA 0,49** ± 0,08 0,35** ± 0,08 LAMC2 0,80* ± 0,06 0,33* ± 0,10 EFEMP1 0,82* ± 0,07 0,65* ± 0,12 A mudança de dobra em comparação com o controle de células não tratadas representa a média de pelo menos 4 experiências independentes. Os resultados são mostrados como mudança de dobra ± SEM. *P<0,05, **P<0,005. Tabela 2. Expressão de biomarcadores em End1 após tratamento com H2O2 por 24 horas
End1 Biomarcador Mudança de dobra (100μM Mudança de dobra (200μM H2O2) H2O2) ECM1 1,02 ± 0,16 0,90 ± 0,07 GGH 0,75 ± 0,16 0,86 ± 0,18 FGA 0,96 ± 0,21 0,56** ± 0,08 LAMC2 1,15 ± 0,17 0,95 ± 0,16 EFEMP1 0,73 ± 0,12 0,49** ± 0,04 A mudança de dobra em comparação com o controle de células não tratadas representa a média de pelo menos três experiências independentes. Os resultados são mostrados como mudança de dobra ± SEM. **P<0,005.
[00195] Semelhante ao estresse oxidativo, a inflamação tem sido associada ao trabalho de parto e parto a termo e prematuro. Na maioria dos casos, PTB e PPROMs estão intimamente relacionados à infecção intra- amniótica, infecção intra-uterina e inflamação. Numerosos estudos experimentais e clínicos apontam as vias fisiopatológicas mediadas por mediadores inflamatórios como as causas subjacentes ao parto prematuro e várias complicações na gravidez. Tais vias mediadas pela inflamação incluem a ativação de leucócitos, aumento de citocinas e quimiocinas inflamatórias e colagenólise pelas metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs). Esses eventos acabam resultando em perda da integridade estrutural da membrana, ativação miometrial e remodelamento cervical precoce/prematuro, levando a PTB e PPROM. Além disso, marcadores de inflamação, como as interleucinas (IL) 1,2,6 e 8, fator de necrose tumoral [TNF-] e proteína C reativa [CRP]) foram avaliados como biomarcadores no PTB.
[00196] Em nosso estudo, induzimos inflamação em nosso sistema tratando células Ect1 e End1 com várias doses de lipopolissacarídeo (LPS).
[00197] Nas células Ect1, o tratamento com LPS de 25μg/ml resultou em uma diminuição significativa na expressão de ECM1 no meio condicionado (Figura 27). Além disso, doses mais baixas de LPS (10μg/ml e 25μg/ml) causaram um aumento estatisticamente significativo na expressão de LAMC2 de mais de 5 vezes, quando comparadas às células de controle não tratadas
(Figura 28). Também observamos discretos aumentos na expressão de GGH (Figura 29) e FGA (Figura 30) nos meios condicionados das células Ect1 tratadas com 3 doses diferentes de LPS, no entanto, esse aumento foi estatisticamente insignificante.
[00198] Nas células End1, semelhante às células Ect1, o tratamento com LPS resultou em uma pequena diminuição na expressão de ECM1 no meio condicionado (Figura 27), embora essa diminuição tenha sido considerada estatisticamente insignificante. Todas as três doses de LPS alto e baixo (10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml) levaram a um aumento de ~8 vezes na expressão de LAMC2 nos meios condicionados End1 (Figura 28). Pelo contrário, o nível de expressão de GGH (Figura 29) e FGA (Figura 30) no meio condicionado End1 foi sofreu regulação negativa com tratamento com LPS. As Tabelas 3 e 4 resumem as mudanças na expressão dos biomarcadores após o tratamento com LPS. Tabela 3. Expressão de biomarcadores em Ect1 após tratamento de LPS por 24 horas Ect1 Biomarcador Mudança de dobras Mudança de Mudança de (10μg/ml LPS) dobras (25μg/ml dobras (50μg/ml LPS) LPS) ECM1 0,87 ± 0,18 0,86* ± 0,05 0,81 ± 0,17 GGH 1,67 ± 0,40 1,42 ± 0,23 1,80 ± 0,52 FGA 1,05 ± 0,15 1,13 ± 0,12 1,19 ± 0,22 LAMC2 5,72* ± 1,44 5,50* ± 1,23 5,99 ± 1,86 A mudança de dobra em comparação com o controle de células não tratadas representa a média de pelo menos 4 experiências independentes. Os resultados são mostrados como mudança de dobra ± SEM. *P<0,05 Tabela 4. Expressão de biomarcadores em End1 após tratamento de LPS por 24 horas End1 Biomarcador Mudança de dobras Mudança de Mudança de
(10μg/ml LPS) dobras (25μg/ml dobras LPS) (50μg/ml LPS) ECM1 0,94 ± 0,14 0,87 ± 0,11 0,76 ± 0,11 GGH 0,69 ± 0,15 0,92 ± 0,19 0,76 ± 0,13 FGA 0,90 ± 0,10 0,92 ± 0,15 0,78 ± 0,10 LAMC2 8,25 ** ± 1,22 8,01 ** ± 0,90 7,81 * ± 1,28 A mudança de dobra em comparação com o controle de células não tratadas representa a média de pelo menos 4 experiências independentes. Os resultados são mostrados como mudança de dobra ± SEM. *P<0,05, **P<0,005. Referências
[00199] Várias publicações são citadas acima, a fim de descrever e divulgar completamente a invenção e o estado da técnica a que a invenção se refere. Citações completas para essas referências são fornecidas abaixo. A totalidade de cada uma dessas referências é incorporada aqui.
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[00200] Para técnicas padrão de biologia molecular, veja Sambrook, J., Russel, DW Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para previsão de se um indivíduo tem risco de parto prematuro, o método caracterizado pelo fato de que compreende determinar o nível de um biomarcador em uma amostra obtida do indivíduo e prever se o indivíduo tem risco de parto prematuro com base no nível do biomarcador, em que o biomarcador é selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de fluido vaginal.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o biomarcador é uma proteína.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o nível de um biomarcador é comparado a um nível de referência, em que o nível de referência é derivado do nível de biomarcador em uma amostra obtida de um indivíduo conhecido por ter tido parto prematuro ou a termo.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente prever o risco de parto prematuro com um ou mais outros indicadores de parto prematuro, selecionados entre o teste de Fibronectina Fetal (fFN), contrações, sangramento vaginal, vazamento de fluido da vagina, aumento do corrimento vaginal, dor nas costas e cãibras na parte inferior do abdome.
6. Progesterona para uso no tratamento de um indivíduo previsto para ter risco de parto prematuro, caracterizado pelo fato de que o indivíduo em risco de parto prematuro foi previsto por um método conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. Método para seleção de um indivíduo para tratamento para reduzir o risco de parto prematuro, o método caracterizado pelo fato de que compreende a previsão do risco de parto prematuro no indivíduo usando um método conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e, se o indivíduo estiver determinado a ter risco de parto prematuro, a administração de um tratamento para reduzir o risco de parto prematuro, em que o tratamento para reduzir o risco de parto prematuro compreende progesterona e/ou cerclagem cervical.
8. Método para previsão de se um indivíduo tem risco de parto prematuro, o método caracterizado pelo fato de que compreende a determinação do nível de um biomarcador em uma amostra obtida do indivíduo e a transmissão do nível determinado a um médico envolvido no tratamento do indivíduo, em que o risco é previsto o parto prematuro, com base no nível do biomarcador na amostra e em que o biomarcador é selecionado entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN e LAMC2.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o método para prever se o indivíduo tem risco de parto prematuro é um método implementado por computador.
10. Método para detecção de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na amostra de fluido vaginal colocando a amostra de fluido vaginal em contato com um anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti- EFEMP1, anti-GGH, anti-PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2 e detectar a ligação entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 e o anticorpo.
11. Método para determinação de que um indivíduo tem risco de parto prematuro, dito método caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na amostra de fluido vaginal colocando a amostra de fluido vaginal em contato com um anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti- EFEMP1, anti-GGH, anti-PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2 e detectar a ligação entre ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 e o anticorpo; e c. determinar se o indivíduo tem risco de parto prematuro quando a presença de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 na amostra é detectada.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de fluido vaginal.
13. Método para determinação de que um indivíduo tem risco de parto prematuro e prolongar a gestação nesse indivíduo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma amostra de fluido vaginal de um indivíduo; b. detectar se ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 está presente na amostra de fluido vaginal; c. determinar se o indivíduo tem risco de parto prematuro quando a presença de ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN ou LAMC2 na amostra de fluido vaginal é detectada; e d. administrar uma quantidade eficaz de progesterona ao indivíduo determinado como em risco de parto prematuro ou selecionar o indivíduo para tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais agentes selecionados entre uma progesterona ou um análogo da mesma, um tocolítico, um corticosteroide, um antibiótico, um NSAID ou um ácido graxo ômega 3 ou derivado do mesmo, se for determinado que o indivíduo tem risco de parto prematuro; e/ou e. realizar cerclagem cervical no indivíduo determinado como em risco de parto prematuro ou selecionar o indivíduo para cerclagem cervical, se o indivíduo for determinado como em risco de parto prematuro.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o nível do biomarcador é determinado por ELISA.
15. Kit para uso na previsão do risco ou probabilidade de parto prematuro em um indivíduo, o kit caracterizado pelo fato de que compreende anticorpo anti-ECM1, anti-FGA, anti-EFEMP1, anti-GGH, anti- PEDF, anti-PTN ou anti-LAMC2.
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