KR20200094742A - 조산의 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오마커, 그리고 구체적으로, 전적인 것은 아니나, 조산 바이오마커에 관한 것이다. 바이오마커는 출산 몇 주 또는 몇 달 전에, 임신 37주 전의 출산을 경험할 위험이 있는 개체를 구별하는데 유용하다. 바이오마커, 즉 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2는 프로테오믹스 분석에 의해 확인되며, 조산 예정의 여성에 따라 질액에서 다르게 발현된다.

Description

조산의 바이오마커
본 출원은 2017년 10월 30일에 출원된 SG10201708890Y의 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 구성요소는 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 바이오마커(biomarker), 그리고 구체적으로, 전적인 것은 아니나, 조산(preterm birth) 바이오마커에 관한 것이다. 바이오마커는 출산 몇 주 또는 몇 달 전에, 임신 37주 전의 출산을 경험할 위험이 있는 개체(individual)를 구별하는데 유용하다.
조산은 임신 37주의 완료 전에 발생하는 출생으로 정의된다. 매년 1,500만명 이상의 아기가 조산되는 것으로 추정된다. 전세계적으로, 조산은 5세 미만 아동의 주요 사망 원인 중 하나로, 조산-관련 사망은 약 100만명으로 추산된다. 많은 생존자들은 학습 장애와 시각 및 청각 문제를 포함하여 일생 동안 매우 힘든 장애에 직면한다. 지난 수십년 동안 신생아학의 발전이 조산의 생존율을 높여왔으나, 20% 이상의 조산 신생아가 만성 폐 질환 (chronic lung disease), 정신 발달 장애 (impaired mental development), 뇌성마비 (cerebral palsy), 청각장애 (deafness), 또는 실명 (blindness)을 포함한 적어도 하나의 주요 장애를 겪는다.
조산의 위험이 있는 임산부를 확인할 상당한 필요가 있다. 현재의 패러다임에서, 고위험 임신에 대한 치료는 예방적 치료 또는 임신의 강화된 감시 또는 근접 모니터링을 포함하며, 이는 조산율을 감소시킨다. 그러나, 대부분의 경우, 고위험 임신으로의 분류는 이전의 병력 또는 임상 검사에 기인하며, 조산의 경향이 있는 진정한 고위험 임신의 작은 하위섹션만을 확인한다. 그러나, 조산의 경향이 있는 임신의 대부분은 초기 단계에서 확인되지 않으므로 그러한 경우에 대한 조기 의료 개입은 불가능하다.
위험 증상을 보이는 여성에 대한 조산의 위험 평가를 위해 출시된 여러 검사가 있다. 그러한 예 중 하나는 증상이 있는 여성에 대한 위험 평가를 제공하는 태아 피브로넥틴 (fFN) 검사이다. 조산이 일어날 가능성이 있는 경우 태아 피브로넥틴이 질 내에 존재하므로, 진통, 질 출혈, 질에서의 체액 누출, 증가된 질 분비물, 요통 및 하복부 경련과 같은 조산의 가능성을 나타내는 증상이 있는 임산부에게 fFN 검사가 일반적으로 사용된다. fFN 검사의 강점은 검사 후 최대 10일 동안의 높은 음성 예측 값에 있다 (즉, 음성 결과는 검사 후 다음 7일 내지 10일 내 조기 분만 가능성이 낮음을 의미한다). 그러나, fFN 검사가 양성인 경우, 그 결과는 덜 결정적이다.
환자 관리는 위험 요인에 따라 다르다. 자궁경부 길이가 짧거나 조산의 이력이 있는 여성을 고위험군으로 프로파일링한 수많은 임상 연구에서 프로게스테론과 같은 예방 치료는 조산율을 감소시키는 것으로 나타났다. 증상이 있는 여성은 위험 인자에 따라 자궁수축억제제 또는 스테로이드와 같은 치료를 받을 수 있다. 현재 임상 실무의 한계는 치료와 결과 간의 상관관계가 매우 낮다는 것이다.
따라서, 적절한 치료를 신속하게 진행하여 조산율을 낮출 수 있도록 조산의 위험이 높은 임신의 효과적인 확인이 절실히 필요하다. 본 발명은 그 난점을 적어도 일부 극복하기 위해 바이오마커 및 조산의 위험을 예측하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 조산 증상이 나타나기 수 주 또는 심지어 수 개월 전에 조산의 위험이 높은 여성을 분류하기 위한 위험 평가를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 고려사항을 고려하여 고안되었다.
본 발명은 대상체 내 조산의 위험성 또는 가능성을 예측하기 위한 신규한 바이오마커 및 방법을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 바이오마커는 메타-데이터 분석에서 확인된 후, 환자-유래 샘플에서 입증되었다. 본 명세서에서 개시된 바이오마커는 개체가 증상을 보이기 수 주 또는 수 개월 전에, 만기 출산 및 조산 개체로부터의 샘플을 구별한다. 이러한 바이오마커는 조산의 위험이 있는 개체를 확인하는데 유용할 수 있으므로, 임신 연장 및/또는 조산의 위험의 예방 또는 감소를 위한 치료의 개시와 같은 임상 결정을 이끄는데 유용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 무증상 또는 증상이 있는 개체 내 조산의 위험 또는 가능성을 결정하는데 사용될 수 있다. 구체적인 실시양태에서 개체는 무증상이다.
본 명세서에서 개시된 것과 같이, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2는 조산의 바이오마커이다. ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2 각각은 조산의 위험이 있는 개체를 확인하는 방법, 및 개체의 조산의 위험 여부를 결정하거나, 개체의 조산의 위험 여부를 예측하는 방법에서 사용될 수 있다. 대조군 또는 기준 수준(reference level)과 비교하여 바이오마커의 수준의 변화는 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다. 이러한 방법은 검사 대상 개체로부터 얻은 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 바이오마커 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2 모두의 수준을 결정하고 조산의 위험을 예측하는 단계를 포함한다.
ECM1, GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN 및 FGA를 포함하는 특정 바이오마커의 과소발현(under-expression)은 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다.
GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN, FGA 및 PEDF를 포함하는 특정 바이오마커의 과발현(over-expression)은 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다.
경우에 따라, 바이오마커는 임신 중 특정 시점에 과발현되거나 임신 중 다른 시점에서 과소발현되는 경우 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다.
개체의 조산의 위험 여부의 예측 방법으로, 개체로부터 얻어진 샘플 내 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 및 바이오마커 수치에 기초하여 조산의 위험이 있거나 조산의 위험이 없는 것으로 개체를 분류하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 바이오마커는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택된다. 방법은 위험이 있는 것으로 결정된 개체에 대한 치료를 진행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 치료는 자궁경부 봉합술 또는 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 투여를 포함할 수 있다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
또한 개체가 조산을 경험할 가능성을 결정하는 방법으로, 개체로부터의 샘플 내, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 검출하는 단계, 및 바이오마커 값에 기초하여 개체가 조산을 경험할 가능성 백분율을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 개시된다.
또한 개체의 조산의 위험 여부를 예측하는 컴퓨터로 구현되는 방법이 본 명세서에서 개시되는데, 상기 방법은 개체에 대한 컴퓨터 바이오마커 정보를 검색하는 단계로, 여기서 바이오마커 정보는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커에 상응하는 바이오마커 값, 및 컴퓨터를 이용한 바이오마커 값의 분류를 포함하는 단계; 및 분류에 기초하여 개체가 조산의 위험이 있을 가능성을 나타내는 단계를 포함한다.
또한 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여, 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에게 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 투여를 포함하는 치료 방법이 본 명세서에서 개시된다. 이러한 방법에 사용하기 위한 프로게스테론이, 이러한 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 프로게스테론의 용도와 함께 또한 개시된다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
또한 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에 대한 자궁경부 봉합술을 포함하는 치료 방법이 본 명세서에서 개시된다. 자궁경부 봉합술 치료를 위한 개체를 선택하는 방법이 또한 개시된다.
또한 조산의 위험성이 있는 것으로 예측된 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 자궁수축억제제 또는 스테로이드가 본 명세서에서 개시되는데, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 결정되었다. 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에게 자궁수축억제제 또는 스테로이드를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 또한 개시되는데, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 결정되었다.
이와 관련하여, 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 자궁수축억제제 또는 스테로이드의 용도가 제공되는데, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 예측된다.
용도를 위한 자궁수축억제제 또는 스테로이드, 또는 의약은 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 결정하는 단계, 및 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험을 결정하는 단계를 포함하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있다.
또한 조산의 위험성이 있는 것으로 예측된 개체를 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한, 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제가 본 명세서에서 개시되며, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 결정되었다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제를, 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 또한 개시되는데, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있는 것으로 결정되었다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제의, 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도가 또한 제공되며, 여기서 개체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험이 있다고 결정되었다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
용도를 위한 제제, 또는 의약은 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는 바이오마커에 대한 바이오마커 값을 결정하는 단계, 및 상기 바이오마커 값에 기초하여 조산의 위험을 결정하는 단계를 포함하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있다.
하기 단계를 포함하는, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2를 검출하는 방법이 본 명세서에서 제공된다:
(a) 개체로부터 질액 샘플을 얻는 단계;
(b) 질액 샘플을 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체와 접촉시키고 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2와 상기 항체 간의 결합을 검출함으로써, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 질액 샘플 내 존재하는지 여부를 검출하는 단계.
하기 단계를 포함하는, 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정하는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다:
(a) 개체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플을 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체와 접촉시키고 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2와 상기 항체 간의 결합을 검출함으로써, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
(c) 질액 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2의 존재가 검출되는 경우 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정하는 단계.
경우에 따라, 항체는 마우스, 토끼 또는 염소, 바람직하게는, 마우스 또는 토끼에서 유래한다. 항체는 인간, 인간화된 또는 키메릭일 수 있다.
바람직하게는, 샘플은 질액 샘플이다. 질액 샘플은 자궁경질액 샘플일 수 있다. 또는, 샘플은 양수 샘플이다.
하기 단계를 포함하는, 개체의 조산의 위험을 결정하고 상기 개체의 임신을 연장시키는 방법:
(a) 개체로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 혈장 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 존재하는지 여부를 검출하는 단계;
(c) 질액 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2의 존재가 검출되는 경우 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정하는 단계; 및
(d) 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 경우 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에게 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 유효한 양의 제제를 투여하거나 유효한 양의 자궁수축억제제 또는 스테로이드를 처리하기 위한 개체를 선택하는 단계. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
하나의 양태에서, 대상체 내 조산의 위험 또는 가능성을 예측하는데 사용하기 위한 키트(kit)를 개시하는데, 키트는 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체를 포함한다. 바람직하게, 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2에 선택적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 특정 양태는 개체에서 조산의 위험을 결정하기 위한 컴퓨터로 구현되는 방법을 기술한다. 방법은 개체로부터 얻은 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2 중 적어도 하나의 수준에 해당하는 데이터를 제공하는 단계; 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터를 이용하여 수행하는 단계; 및 분류에 기초하여 개체 내 조산의 위험을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 이러한 조합이 명확하게 허용되지 않거나 명시적으로 회피되는 경우를 제외하고는 기술된 양태 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본 발명의 원리를 설명하는 실시양태 및 실험은 이제 첨부된 도면을 참조하여 논의될 것이다:
도 1. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 ECM1 수준 차이를 나타낸다. 평균 바이오마커 단백질 농도를 총 단백질 농도에 대해 조정된 ELISA 면역분석 결과를 기초로 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 2. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 ECM1 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 그리고 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 3. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 ECM1 수준의 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 4. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 GGH 수준 차이를 나타낸다. 평균 바이오마커 단백질 농도를 총 단백질 농도에 대해 조정된 ELISA 면역분석 결과를 기초로 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 5. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 GGH 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 및 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 6. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 GGH 수준의 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 7. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 LAMC2 수준 차이를 나타낸다. 평균 바이오마커 단백질 농도를 총 단백질 농도에 대해 조정된 ELISA 면역분석 결과를 기초로 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 8. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 LAMC2 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 그리고 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 9. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 LAMC2 수준의 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 10. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 EFEMP1 수준 차이를 나타낸다. 총 단백질에 대해 조정한 ELISA 면역분석 결과에 기초하여 평균 바이오마커 단백질 농도를 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 11. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 EFEMP1 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 및 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 12. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 EFEMP1 수준의 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 13. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 PTN 수준 차이를 나타낸다. 평균 바이오마커 단백질 농도를 총 단백질 농도에 대해 조정된 ELISA 면역분석 결과를 기초로 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 14. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 PTN 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 그리고 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 15. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 PTN 수준 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 16. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 FGA 수준 차이를 나타낸다. 총 단백질에 대해 조정한 ELISA 면역분석 결과에 기초하여 평균 바이오마커 단백질 농도를 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 17. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 FGA 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 그리고 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 18. 본 도면은 샘플 수집부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 FGA 수준 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 19. 본 도면은 만기 출산 및 조산 샘플 간의 PEDF 수준 차이를 나타낸다. 총 단백질에 대해 조정한 ELISA 면역분석 결과에 기초하여 평균 바이오마커 단백질 농도를 계산하였다. 임신 19-37주 사이에 수집된 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64) 샘플 및 전체 그룹 간 평균차를 나타내었다. 데이터는 Student's t-검정을 이용하여 분석하였다. P = p-값.
도 20. 본 도면은 샘플링 시점의 임신 나이를 기준으로 한 만기 출산 및 조산 샘플 간의 PEDF 수준 차이를 나타낸다. 샘플링 시간을 기준으로 샘플을 4개의 그룹으로 나누었다: 임신 주수 18+0-23+6일 (18-24), 임신 주수 24+0-27+6일 (24-28), 임신 주수 28+0-31+6일 (28-32) 및 임신 주수 32+0-37+6일 (32-37). 이후 그룹을 만기 출산 그리고 조산 샘플로 나누고 평균을 계산하고 막대 그래프로 나타내었다.
도 21. 본 도면은 샘플링부터 출산까지의 시간을 기준으로 한 만기 출산 및 조산 여성 간의 PEDF 수준 차이를 나타낸다. 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 출산까지 남은 주수를 기준으로 평가하기 위해 샘플을 4주의 간격을 가지는 4개의 그룹으로 나누었다. 그룹은 각각 샘플링과 출산 사이가 12주 초과 (>12), 샘플링부터 출산까지가 9-12, 5-8 및 1-4주 (9-12, 5-8, 1-4)였다. 각 그룹에 대해 평균을 계산하였다.
도 22. H2O2의 세포 생존 및 증식에 대한 영향. Ect1 및 End1 세포를 24시간 동안 50μM, 100μM, 200μM 및 400μM H2O2로 처리하였다. Ect1 및 End1의 세포 생존 및 증식을 MTT 분석으로 평가하고, 비처리 대조군 (0 μM H2O2)의 %로 표시하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 각각 대조군 대비 *P<0.05, n= 3.
도 23. Ect1 및 End1 세포의 ECM1 발현에 대한 H2O2의 영향. (a) Ect1 및 (b) End1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 ECM1을 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 ECM1 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 ECM1 수준 (pg/mg 총 단백질)을 비처리 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 대조군 대비 *P<0.05.
도 24. Ect1 및 End1 세포의 LAMC2 발현에 대한 H2O2의 영향. (a) Ect1 및 (b) End1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 LAMC2를 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 LAMC2 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 LAMC2 수준 (pg/mg 총 단백질)을 비처리 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 대조군 대비 *P<0.05.
도 25. Ect1 및 End1 세포의 FGA 발현에 대한 H2O2의 영향. (a) Ect1 및 (b) End1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 FGA를 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 FGA 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 FGA 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 대조군 대비 **P<0.005.
도 26. Ect1 및 End1 세포의 GGH 발현에 대한 H2O2의 영향. (a) Ect1 및 (b) End1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 GGH를 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 GGH 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 GGH 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다.
도 27. Ect1 및 End1 세포의 ECM1 발현에 대한 LPS의 영향. Ect1 및 End1 LPS 처리-후 (24시간)의 배지 내 ECM1을 ELISA로 정량화하였다. LPS 처리에 따른 ECM1 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 ECM1 수준 (pg/mg 총 단백질)을 비처리 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다, n= 5. 각 대조군 대비 *P<0.05.
도 28. Ect1 및 End1 세포의 LAMC2 발현에 대한 LPS의 영향. Ect1 및 End1 LPS 처리-후 (24시간)의 배지 내 LAMC2를 ELISA로 정량화하였다. LPS 처리에 따른 LAMC2 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 LAMC2 수준 (pg/mg 총 단백질)을 비처리된 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다, n= 5. 각 대조군 대비 *P<0.05, **P<0.05.
도 29. Ect1 및 End1 세포의 GGH 발현에 대한 LPS의 영향. Ect1 및 End1 LPS 처리-후 (24시간)의 배지 내 GGH를 ELISA로 정량화하였다. LPS 처리에 따른 GGH 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 GGH 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리된 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다, n= 5.
도 30. Ect1 및 End1 세포의 FGA 발현에 대한 LPS의 영향. Ect1 및 End1 LPS 처리-후 (24시간)의 배지 내 FGA를 ELISA로 정량화하였다. LPS 처리에 따른 FGA 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 FGA 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리된 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다, n= 5.
도 31. Ect1 세포의 EFEMP1 발현에 대한 H2O2의 영향. Ect1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 EFEMP1을 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 EFEMP1 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 EFEMP1 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리된 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 대조군 대비 **P<0.05.
도 32. End1 세포의 EFEMP1 발현에 대한 H2O2의 영향. End1 H2O2 처리-후 (24시간)의 배지 내 EFEP1을 ELISA로 정량화하였다. H2O2 처리에 따른 EFEMP1 발현의 배수 변화는 처리된 세포에서 정규화된 EFEMP1 수준 (ng/mg 총 단백질)을 비처리된 세포 (대조군)로 나누어 계산하였다. 데이터를 적어도 5개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SEM으로 표시하고 Student's t-검정으로 분석하였다. 대조군 대비 **P<0.005.
본 발명의 양태 및 실시양태는 첨부 도면을 참조하여 이하 설명될 것이다. 추가의 양태 및 실시양태는 당업자에게 명백할 것이다. 본 문서에 언급된 모든 문서는 참조로 본 명세서에 통합된다.
본 명세서에 기술된 방법 및 바이오마커는 개체의 조산의 위험 여부를 결정하거나, 조산의 위험이 있는 개체를 확인하거나, 개체 내 조산의 위험을 예측하는데 유용할 수 있다.
용어 "예측"은 본 명세서에서 "결정"과 호환되어 사용될 수 있으며, 조산이 개체에서 일어날 것이라고 말하거나 추정하는데 사용된다. 본 명세서에 개시된 방법은 개체가 조산을 경험할 가능성 (또는 "위험")을 결정하거나 예측하는데 사용될 수 있다.
조산은 모체가 임신 37주에 도달하기 전에 발생하는 출산이다. 조산은 임신 주수 35+0 일 내지 36+6일의 말기 조산, 임신 주수 32+0일 내지 34+6일의 중간 조산으로 세분되며 초기 조산은 임신 32주 이전이다.
조산의 원인은 보통 알려져 있지 않다. 위험 요소는 그 중에서도 당뇨 (diabetes), 고혈압 (high blood pressure), 하나 이상의 아기를 임신중임, 비만 (obese) 또는 저체중, 여러 질 감염 (vaginal infection), 담배 흡연, 및 심리적 스트레스를 포함한다.
자간전증 (preeclampsia)은 임상적으로 임신 20주부터 산후 6주 사이에 고혈압 (hypertension) 및 단백뇨 (proteinuria)가 나타나는 것을 가리킨다. 자간전증은 조산으로 이어질 수 있으나, 많은 경우 그렇지 않다. 자간전증은 조산의 증가된 위험에 기여할 수 있는 한 가지 요소에 불과하므로, 자간전증을 유발하거나 이와 관련이 있는 것으로 알려진 요인들이 반드시 조산의 원인이 되거나 이와 관련된 것은 아니다.
바이오마커
본 명세서에 개시된 방법은 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로 이루어진 군에서 선택되는 바이오마커의 존재 또는 부재의 결정, 또는 그 바이오마커의 수준의 정량화를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 각 바이오마커는 단독으로 또는 조산의 다른 바이오마커와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 분석에서, 본 명세서에서 개시된 바이오마커 단백질 일부 또는 전부가 조합되어 사용된다. 나아가, 바이오마커는 태아 피브로넥틴 (fFN) 검사, 진통, 질 출혈, 질에서의 체액 누출, 증가된 질 분비물, 요통 및 하복부 경련을 포함하는, 하나 이상의 다른 조산 지표와 함께 사용될 수 있다.
세포외 기질 단백질 1 (Extracellular matrix protein 1, ECM1); UniProtKB - Q16610
상기 유전자는 연골내 골 형성, 내피 세포의 증식, 혈관신생, 및 종양 생물학에 관여하는 ~85 KDa 가용성 단백질을 암호화한다. 이는 또한 다양한 세포외 및 구조 단백질과 상호 작용하여, 피부 통합성 (skin integrity) 및 항상성 유지에 기여한다. ECM1은 콜라겐의 조직 및 스캐폴딩에 기여하는 다양한 조직에서 "생물학적 접착제"로 작용한다.
별개의 아형 (isoform)을 암호화하는 4개의 대체 스플라이싱 전사 변이체는 이러한 유전자에 대해 번역된다. 이들 중 어느 것이든 본 개시에 따른 바이오마커로 사용될 수 있다. 경우에 따라, 변이체 1이 검출된다. 도 1에 나타나듯이, 모든 샘플 (임신 19주 내지 37주 사이에 수집됨)로부터의 ECM1의 전체 평균 농도는, 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 더 낮았다 (p = 0.025). 이는 샘플 내 ECM1의 과소발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다.
이는 도 2에 추가로 나타나는데, 샘플링된 모든 시점에서 ECM1은 조산을 경험한 개체로부터의 샘플에서 과소발현되었다. 조산의 위험이 있는 것으로 의심되는 개체의 경우, ECM1의 낮은 수준은 12주 미만, 9주 미만, 또는 4주 미만 내에 출산이 나타날 것임을 보여줄 수 있다.
감마-글루타밀 히드롤라아제 (Gamma-glutamyl hydrolase, GGH); UniProtKB - Q92820
GGH는 프테로일폴리글루타메이트의 폴리글루타메이트 측쇄를 가수분해하며, 프테로일폴리-감마-글루타메이트로부터 감마-글루타밀 잔기를 점진적으로 제거하여 프테로일-알파-글루타메이트 (엽산) 및 유리 글루타메이트를 생성한다. 이는 식이성 프테로일폴리글루타메이트의 생체이용률과 프테로일폴리글루타메이트 및 항엽산의 대사에서 중요한 역할을 할 수 있다.
도 4에 나타나듯이, 모든 샘플 (임신 19주 내지 37주 사이에 수집됨)로부터의 GGH의 전체 평균 농도는, 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 증가하였다. 이는 샘플 내 GGH의 과발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다. 이는 특히, 조산 1-4주 전, 또는 임신 32-37주에 얻은 샘플에서 GGH가 특히 과발현되었음을 보여주는 도 5 및 도 6으로부터 명백하다. 이는 임신 32-37주에 얻은 샘플 내 GGH의 과발현이 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다. 반대로, 임신 32주 전, 또는 임신 26주 경 또는 26주 미만에 얻은 샘플 내 GGH의 과소발현은 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다. 조산의 위험이 있는 것으로 의심되는 개체의 경우, GGH의 증가된 수준은 출산이 4주 또는 그 이내에 일어날 수 있음을 나타낼 수 있다.
라미닌 서브유닛 감마-2 (Laminin subunit gamma-2, LAMC2); UniProtKB - Q13753,
LAMC2는 고친화성 수용체를 통해 세포에 결합하는 헤파린 결합 단백질이다. 라미닌은 다른 세포외 기질 성분과 상호 작용함으로써 배아 발생 동안 조직으로의 세포의 부착, 이동, 및 조직을 매개하는 것으로 생각된다. 라미닌 감마-2 쇄를 포함하는 라미닌 변이체인 라드신 (ladsin)은 상피, 내피, 및 섬유아세포를 포함하여 광범위한 세포에 대해 세포-분산 활성을 발휘한다.
도 7에 나타나듯이, LAMC2는 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 증가하였다. 이는 샘플 내 LAMC2의 과발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 8에 나타나듯이, LAMC2는 임신 32주 이전에 얻어진 조산 샘플 또는 조산 샘플 중에서 출산 8주 미만 전에 얻어진 샘플에서 과발현되었다 (도 9).
EGF 함유 피불린-유사 세포외 기질 단백질 1(EGF containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, EFEMP1); UniProtKB - Q12805
EFEMP1 단백질은 EGF 수용체인 EGFR에 결합하고, EGFR 자가인산화 및 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 유도한다. 이는 세포 접착 및 이동에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이는 연골 세포 분화의 음성 조절제로 기능할 수 있다. 후각 상피에서, 이는 신경교 세포 이동, 분화, 및 뉴런성 신경돌기의 성장을 지원하는 신경교 세포의 능력을 조절할 수 있다.
도 10에 나타나듯이, EFEMP 1은 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 증가한다. 이는 샘플 내 EFEMP1의 과발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다. 이는 또한, EFEMP1이 출산 최대 8주 전까지, 또는 임신 28주의 조산 샘플에서 증가하였음을 보여주는 도 11 및 12로부터 명백하다.
조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체로부터의 샘플에서 EFEMP1의 유의한 상향조절은 출산이 다음 1-4주 내에 일어날 것임을 보여줄 수 있다.
임신 18-24주 또는 19-26주 사이에 얻어진 샘플에서 EFEMP1의 하향조절은 개체가 조산을 경험할 수 있음을 보여줄 수 있다.
플레이오트로핀 (Pleiotrophin, PTN); UniProtKB - P21246
PTN은 신경돌기 성장을 유도하는 분비된 성장 인자로, 섬유아세포, 상피, 및 내피 세포에 대해 유사분열을 촉진한다 (PubMed:1768439, PubMed:1733956). 이는 ALK (anaplastic lymphoma kinase)에 결합하는데, ALK는 PTN의 항-아폽토시스 신호전달 및 세포 증식 조절에서 중요한 단계인 MAPK 경로 활성화를 유도한다 (PubMed:11278720). 이는 콘드로이틴 설페이트 그룹을 통해 세포-표면 표적 단백질에 결합한다 (PubMed:26896299). 결합 시, PTN은 PTPRZ1의 포스파타아제 활성을 불활성화시킨다.
도 13에 나타나듯이, PTN은 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 감소한다. 이는 샘플 내 PTN의 과소발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낼 수 있다는 것을 시사한다. 이는 또한, 임신 나이 32주 전에 또는 출산으로부터 4주 이상 이전에 샘플링된, 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 PTN이 감소한 도 14 및 15로부터 명백하다.
샘플 내 PTN의 과발현은 개체가 다음 1-4주 내에 조산을 경험할 것임을 나타낼 수 있다.
피브리노겐 알파 체인 (Fibrinogen alpha chain, FGA); UniProtKB - P02671
FGA는 프로테아제 트롬빈에 의해 절단되어 단량체를 생성하고, 이는 피브리노겐 베타 (FGB) 및 피브리노겐 감마 (FGG)와 함께 중합하여 불용성 피브린 매트릭스를 형성한다. 피브린은 혈전의 주요 성분 중 하나로서 지혈에서 중요한 기능을 한다. 또한, 이는 상처 복구 초기 단계에서 병변을 안정화시키고 재상피화 동안 세포 이동을 안내하는 기능을 한다. FGA는 원래, 항응고 혈액을 사용한 시험관내 연구를 바탕으로 혈소판 응집에 필수적이라고 생각되었다. 그러나, 후속 연구는 FGA가 생체내 혈전 형성에 절대적으로 필요한 것은 아님을 보여주었다. FGA는 ITGB3-의존성 경로를 통해 활성화된 혈소판에서 P-셀렉틴 (SELP)의 발현을 향상시킨다. 모체 피브리노겐은 성공적인 임신을 위해 필수적이다. 피브린 침착은 또한 감염과 관련이 있으며, 이는 IFNG-매개 출혈로부터 보호한다. 이는 또한 선천성 및 T-세포 매개 경로를 통해 면역 반응을 촉진할 수 있다.
도 16에 나타나듯이, FGA는 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 증가한다. 이는 샘플 내 FGA의 과발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 시사한다. 이는 또한 도 17 및 18로부터 명백한데, 샘플 내 FGA의 과발현은 특히 샘플이 임신 24주 전 또는 임신 32주 후에 수집되었을 때 개체가 조산을 경험할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. FGA의 과발현은 개체가 다음 1-4주 내에 조산을 경험할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다.
임신 24주와 28주 사이에 수집된 샘플 내 FGA의 과소발현은 개체가 조산을 경험할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다.
색소 상피-유래 인자 (Pigment Epithelium-Derived Factor, PEDF); UniProtKB - P36955
PEDF는 신경영양 단백질로, 망막모세포종 (retinoblastoma) 세포에서 광범위한 뉴런 분화를 유도하며, 혈관신생의 강력한 저해제이다. 활성 세르핀의 S (stressed)에서 R (relaxed)로의 입체 구조 전이 특성을 갖지 않으므로, 세린 프로테아제 억제 활성을 나타내지 않는다.
도 19에 나타나듯이, PEDF는 만기 출산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에 비해 조산을 경험한 개체로부터 얻은 샘플에서 증가한다. 이는 샘플 내 PEDF의 과발현이 그 개체가 조산의 위험이 있음을 나타낸다는 것을 보여준다. 이는 또한 도 20 및 21로부터 명백한데, 샘플 내 PEDF의 과발현은 샘플링 시기와 상관없이 개체가 조산을 경험할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. PEDF의 과발현은 개체가 다음 1-4주 내에 조산을 경험할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 개시된 특정 방법은 바이오마커 값 또는 바이오마커 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 용어는 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하는 임의의 적절한 분석 방법을 사용하여 이루어지며 샘플 내 바이오마커에 맞는 존재, 부재, 절대량 또는 농도, 상대량 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 비율 또는 기타 측정을 나타내는 측정을 가리킨다. 값 또는 수준의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하기 위해 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 구성 요소에 따라 달라진다.
개체가 조산의 위험이 있음을 나타내는 바이오마커는 기준 값 또는 수준 또는 만기 출산을 나타내거나 그 징후인 바이오마커와 비교하여, 과발현되거나 과소발현될 수 있다. "상향조절", "과발현", 증가된 및 관련된 용어는, 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 개체로부터의 유사한 샘플에서 일반적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 큰 샘플 내 값 또는 수준을 지칭하는데 사용된다.
"하향조절", "과소발현", "감소된" 및 관련된 용어는, 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 개체로부터의 유사한 샘플에서 일반적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 수준 (또는 값 또는 수준의 범위) 보다 작은 샘플 내 값 또는 수준을 지칭하는데 사용된다.
과발현 또는 과소발현된 바이오마커는 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 개체에서 발견되는 발현 수준 또는 값과 비교하여 "차등 발현"되거나 "차등" 수준 또는 값을 갖는 것을 또한 지칭할 수 있다. 차등 발현은 또한 바이오마커의 "정상" 발현 수준으로부터의 변형으로 지칭될 수 있다.
용어 "차등 유전자 발현" 및 "차등 발현"은 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 개체에서 그 발현에 상대적으로, 조산의 위험이 있는 대상체에서 발현이 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자 (또는 그의 상응하는 단백질 발현 산물)를 지칭하는 것으로 호환하여 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 동일한 질병의 상이한 단계에서 발현이 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자 (또는 그의 상응하는 단백질 발현 산물)를 포함한다. 이는 차등 발현된 유전자가 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화 또는 억제될 수 있거나, 이에 대해 대체 스플라이싱이 수행되어 상이한 폴리펩티드 산물을 생성할 수 있는 것으로 또한 이해된다. 이러한 차이는 mRNA 수준, 표면 발현, 폴리펩티드의 분비 또는 다른 파티셔닝을 포함한 다양한 변화에 의해 입증될 수 있다. 차등 유전자 발현은 둘 이상의 유전자 또는 그의 유전자 산물 간의 발현 비교; 또는 둘 이상의 유전자 또는 그의 유전자 산물의 발현 비율의 비교; 또는 심지어 동일한 유전자의 2개의 별도로 처리된 산물의 비교를 포함할 수 있으며, 상기 산물은 조산의 위험이 있는 개체 또는 만기 출산을 경험한 개체 간에 상이하다. 차등 발현은 조산 및 만기 출산을 경험한 개체에서 유전자 또는 그의 발현 산물 내 시간적 또는 세포적 발현 패턴의 정량적, 및 정성적 차이를 포함한다.
방법 결과
본 명세서에 개시된 방법은 조산의 위험이 있는 개체를 확인하거나, 개체가 조산의 위험이 있는지 없는지를 결정하는데 유용하다. 방법은 또한 개체에서 조산의 위험을 예측하는데 사용될 수 있다.
경우에 따라, 방법은 바이오마커의 수준을 기록하는 단계를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 방법은 검사받는 개체의 치료에 관여하는 의사에게 본 명세서에서 개시된 바이오마커의 수준을 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 방법은 개체에서 바이오마커의 수준의 비교를 위하여, 바이오마커의 기준 수준을 전달하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 경우에 따라, 개체에서 결정된 조산의 위험 수준이 의사에게 전달된다. 예를 들어, 위험 수준에는 백분율이 할당될 수 있다 (100%는 개체가 확실히 조산을 경험할 것임을 나타내고, 0%는 개체가 확실히 만기 출산을 경험할 것임을 나타낸다). 따라서, 본 명세서에 개시된 일부 방법은 개체가 갖는 것으로 결정된 위험 수준에 백분율 값을 할당하는 단계를 포함한다. 방법은 그 개체의 치료에 관여하는 의사에게 백분율을 전달하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 치료 또는 기타 관리를 위해 개체를 선택하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 특정 방법은 조산의 위험이 있는 것으로 확인된 개체에 대한 치료의 진행을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법에 유용한 치료는 프로게스테론, 합성 프로게스테론 또는 프로게스테론 유사체, 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 제제의 투여를 포함한다. 프로게스테론은 17-a-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스테론일 수 있다. 자궁수축억제제는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 또는 니페디핀일 수 있다. 항생제는 에리트로마이신 또는 페니실린일 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 오메가 3 지방산 유도체는 도코사헥사노익산 (DHA)일 수 있다.
개체는 프로게스테론을 이용한 치료를 위해 선택될 수 있다. 자궁경부 길이가 짧거나 조산 이력이 있는 여성을 고-위험군으로 프로파일링하는 다양한 임상 연구에서 프로게스테론은 조산율을 감소시키는 것으로 나타났다. 프로게스테론을 이용한 치료는 천연 프로게스테론, 또는 17-α-히드록시프로게스테론 카프로에이트와 같은 합성 프로게스틴의 투여를 포함할 수 있다. 프로게스테론은 P4 마이크로화된 (천연) 프로게스테론일 수 있다. 17-α-히드록시프로게스테론 카프로에이트는 상표명 델라루틴 (Delalutin™), 프로루톤 (Proluton™), 프로루톤 데포 (Proluton Depot™) 및 마케나 (Makena™)로도 알려져 있다. 천연 프로게스테론인 천연 마이크로화된 프로게스테론은 황체 및 태반에서 생성된 것과 유사하다. 마이크로화된 프로게스테론은 경구 캡슐, 질 겔 또는 질좌제로 사용될 수 있다. 합성 프로게스틴은 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA, 데포 (depot) 메드록시프로게스테론 아세테이트 (DMPA)로도 알려져 있음) 및 노르에틴드론 아세테이트 (NETA)를 포함한다. 이들은 일반적으로 주사로 제공된다. 합성 프로게스틴은 상표명 (MPA) 프로베라 (Provera™), 데포-프로베라 (Depo-Provera™), 데포-서브Q 프로베라 (Depo-SubQ Provera 104™), 큐레탭 (Curretab™), 사이크린 (Cycrin™), 파루탈 (Farlutal™), 게스타푸란 (Gestapuran™), 페루텍스 (Perlutex™), 베라믹스 (Veramix™) 및 (NETA) 프리모루트-노르 (Primolut-Nor™), 아이게스틴 (Aygestin™), 게스타카딘 (Gestakadin™), 밀리기논 (Milligynon™), 모노게스트 (Monogest™), 노르루테이트 (Norlutate™), 프리모루트 N (Primolut N™), SH-420™, 소블 (Sovel™), 스팁틴 (Styptin™)으로도 알려져 있다. 마이크로화된 프로게스테론은 환자에 의해 자가-투여될 수 있다. 천연 마이크로화된 프로게스테론은 상표명 프로메트리움 (Prometrium™), 유트로게스탄 (Utrogestan™), 엔도메트린 (Endometrin™) 및 크리논 (Crinone™)으로도 알려져 있다. 투여는 경구, 질, 또는 근육내 투여일 수 있다. 이러한 방법에 사용하기 위한 프로게스테론, 프로게스틴 또는 17-α-히드록시프로게스테론 카프로에이트, 또는 이러한 방법에 사용하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 프로게스테론, 프로게스틴 또는 17-α-히드록시프로게스테론 카프로에이트의 용도가 또한 개시된다.
조산의 위험이 있는 것으로 확인된 개체는 자궁경부 봉합술을 이용하여 치료될 수 있다. 자궁경부 봉합술은 자궁경부 스티치(stitch)라고도 지칭될 수 있다. 자궁경부 봉합술은 임신 중에 너무 일찍 자궁경부가 짧아지고 열리기 시작하는 자궁경부 무력증 (cervical incompetence) 또는 자궁경부 부전 (cervical insufficiency)을 치료하는데 사용된다. 자궁경부 봉합술은 자궁경부 내부와 주변에 강한 봉합사를 삽입하는 것을 포함할 수 있다.
임의의 공지된 형태의 자궁경부 봉합술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 자궁경부 봉합술은 맥도날드 (McDonald) 원형결찰, 쉬로드카 (Shirodkar) 원형결찰 또는 복부 원형결찰일 수 있다. 자궁경부 봉합술은 개체가 자궁경부 무력증을 갖는 것으로 결정되는 경우에 특히 유용할 수 있다. 자궁경부 무력증은 경질 초음파 검사에 의해 결정될 수 있다.
또는, 치료는 질 페사리 (pessary)를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 치료는 아라빈 (Arabin) 페사리일 수 있다.
경우에 따라, 개체는 자궁수축억제제 또는 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드를 받도록 선택될 수 있다. 자궁수축억제제는 조기 분만 동안 자궁 수축을 막는데 사용될 수 있다. 스테로이드는 태아 폐 발달을 도울 수 있다. 방법은 자궁수축억제제 또는 스테로이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 자궁수축억제제 및 스테로이드는 진통이 있는 여성에게 사용되어 왔다. 본 발명에 적합한 자궁수축억제제의 예로는 마그네슘 설페이트, 인도메타신 및 니페디핀이 있다.
경우에 따라, 방법은 추가적, 정기적 또는 집중적 모니터링을 위해 개체를 선택하는데 사용된다. 예를 들어, 방법은 그 개체로부터 추가 샘플을 얻어야 하며, 바이오마커의 존재 또는 부재 및/또는 수준이 추후에 결정되어야 한다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다. 추가 샘플은 최초 샘플로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36주 후에 얻어질 수 있다. 추가 샘플은 임신 주수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 27에 얻어질 수 있다. 방법은 임신 기간 동안 매 1, 2, 3, 4, 또는 5주마다의 추가 샘플링을 포함할 수 있다.
경우에 따라, 개체는 항생제로 치료될 수 있다. 항생제는 만삭전 조기양막 파열 (Preterm premature rupture of membranes, PPROM)이 있는 개체에게 특히 사용될 수 있다. 적합한 항생제는 에리트로마이신 및 페니실린을 포함한다.
경우에 따라, 치료는 NSAID의 투여일 수 있다. NSAID는 프로스타글린딘을 억제하여 자궁 수축을 감소시킬 수 있다. NSAID는 인도메타신일 수 있다. 경우에 따라, 치료는 오메가 3 지방산 또는 오메가 3 지방산의 유도체일 수 있다. 예를 들어, 치료는 DHA (도코사헥사노익산)일 수 있다.
모니터링은 태아 심장박동 모니터링, 태동 모니터링 또는 태변 모니터링과 같은 태아 곤란증 (fetal distress)에 대한 모니터링을 포함할 수 있다.
바이오마커의 측정
본 명세서에서 개시된 바이오마커는 바람직하게는 단백질 바이오마커이다. 해당 기술분야에 공지된 단백질을 검출 및/또는 정량화하는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 시험관내 (in vitro), 생체외 (ex vivo), 또는 생체내 (in vivo)에서 수행되거나 산물이 존재할 수 있다. 용어 "시험관내"는 실험실 조건 또는 배양에서 재료, 생물학적 물질, 세포 및/또는 조직을 이용한 실험을 포함하는 것으로 의도되는 반면, 용어 "생체내"는 온전한 다세포 유기체를 사용한 실험 및 절차를 포함하는 것으로 의도된다. "생체외"는 유기체 외부, 예를 들어 인간 또는 동물 신체 외부에 존재하거나 일어나는 것을 지칭하며, 유기체에서 채취한 조직 (예를 들어 전체 장기) 또는 세포 상일 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법은 단백질 발현의 결정에 관한 것이다. 단백질 발현은 세포, 조직 또는 샘플 내 단백질의 양을 정량화함으로써, 또는 세포 및 조직 내 단백질의 위치를 관찰함으로써 측정될 수 있다.
경우에 따라, 면역분석법은 대상체로부터의 샘플 내 바이오마커 표적을 검출하는데 사용된다. 면역분석법은 검출가능한 분자와 함께 표적 분자에 특이적 친화성을 갖는 항체 또는 다른 요소를 이용한다. 경우에 따라, 항체는 검출가능한 분자에 접합된다. 검출가능한 분자는 표지로 지칭될 수 있다. 검출가능한 분자는 항체가 표적 분자에 결합할 때, 검출가능한 신호를 만들어낸다. 검출가능한 신호는 정량화 가능한 신호일 수 있다. 경우에 따라, 압타머가 항체 대신에 또는 항체와 함께 사용된다. 면역분석법은 ELISA, 면역블롯팅, 유세포 분석 및 면역조직화학 분석을 포함한다. 본 명세서에 기재된 특정 양태에서, 분석법은 면역조직화학 분석이다. 이러한 분석법은 일반적으로 항체를 이용하지만, 압타머 또는 기타 리간드와 같은 다른 표적 특이적 분자가 사용될 수 있다. 항체 어레이 또는 단백질 칩이 또한 사용될 수 있다.
방법은 관리 기관에 의해 사용 승인될 수 있다. 방법은 FDA 승인된 방법일 수 있다.
항체
본 발명의 바이오마커에 결합할 항체는 이미 공지되어 있다. 단일클론 항체 기술과 관련된 오늘날의 기술을 고려할 때, 항체는 대부분의 항원에 대해 제조될 수 있다.
항원-결합 부분은 항체의 일부 (예를 들어 Fab 단편) 또는 합성 항체 단편 (예를 들어 단일 사슬 Fv 단편 [ScFv])일 수 있다. 선택된 항원에 대해 적합한 단일클론 항체는 공지된 기술, 예를 들어 "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 개시된 기술에 의해 제조될 수 있다. 키메릭 항체는 Neuberger 등(1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)에 의해 논의되었다.
단일클론 항체 (mAb)는 본 발명의 방법에 유용하며 항원 상의 단일 에피토프를 항체 특이적으로 표적하는 균질한 항체 군집이다. 적합한 단일클론 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, K
Figure pct00001
hler, G.; Milstein, C. (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256 (5517): 495; Siegel DL (2002). "Recombinant monoclonal antibody technology". Schmitz U, Versmold A, Kaufmann P, Frank HG (2000); "Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review". Placenta. 21 Suppl A: S106-12. Helen E. Chadd and Steven M. Chamow; "Therapeutic antibody expression technology," Current Opinion in Biotechnology 12, no. 2 (April 1, 2001): 188-194; McCafferty, J.; Griffiths, A.; Winter, G.; Chiswell, D. (1990). "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains". Nature 348 (6301): 552-554; "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982) 참조). 키메릭 항체는 Neuberger 등 (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)에 의해 논의되었다.
다클론 항체는 본 발명의 방법에서 유용하다. 단일특이적 다클론 항체가 바람직하다. 적합한 다클론 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
Fab 및 Fab2 단편과 같은 항체의 단편이 또한 유전적으로 조작된 항체 및 항체 단편과 마찬가지로 사용될 수 있다. 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 도메인은 항원 인식에 관여하는데 이는 초기 프로테아제 분해 실험에 의해 초기에 인식된 사실이다. 설치류 항체의 "인간화"에 의해 추가로 확인되었다. 설치류 기원의 가변 도메인은 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있으며 이로 인해 그에 따른 항체가 설치류 모 항체의 항원 특이성을 갖는다 (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855).
항원 특이성은 가변 도메인에 의해 부여되며 모두 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 항체 단편의 세균 발현과 관련된 실험으로부터 공지된 불변 도메인과는 별개이다. 이들 분자는 Fab-유사 분자 (Better et al (1988) Science 240, 1041); Fv 분자 (Skerra et al (1988) Science 240, 1038); VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩티드를 통해 연결된 단일-사슬 Fv (ScFv) 분자 (Bird et al (1988) Science 242, 423; Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85, 5879) 및 단리된 V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 (dAb) (Ward et al (1989) Nature 341, 544)를 포함한다. 특이적 결합 부위를 갖는 항체 단편의 합성에 관련된 기술의 일반적인 리뷰는 하기에서 찾을 수 있다: Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293- 299.
"ScFv 분자"는 VH 및 VL 파트너 도메인이 공유 결합된, 예를 들어 펩티드 또는 유연한 올리고펩티드에 의해 직접적으로 연결된 분자를 의미한다.
Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 대장균 (E. coli)에서 발현되고 분비될 수 있어, 다량의 상기 단편이 용이하게 생산되도록 한다.
전체 항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가"이다. "2가"는 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 결합 부위를 가짐을 의미한다. 그에 반해, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 오직 1개의 항원 결합 부위를 갖는 1가이다. 바이오마커에 결합하는 합성 항체는 당업계에 공지된 것과 같이 파지 디스플레이 기술을 이용해 또한 제조될 수 있다 (예를 들어, "Phage display: a molecular tool for the generation of antibodies--a review". Placenta. 21 Suppl A: S106-12. Helen E. Chadd 및 Steven M. Chamow; "Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains". Nature 348 (6301): 552-554 참조).
일부 바람직한 실시양태에서 항체는 검출가능하게 표지되거나, 적어도, 검출가능하다. 예를 들어, 항체는 방사성 원자 또는 유색 분자 (발색단) 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방식으로 쉽게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출가능한 분자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질, 및 방사성표지를 포함한다. 항체는 검출가능한 표지로 직접적으로 표지되거나 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비표지될 수 있고 그 자체로 표지된 다른 항체에 의해 검출될 수 있다. 또는, 제2 항체는 비오틴에 결합했을 수 있고 표지된 스트렙트아비딘의 비오틴에 대한 결합은 제1 항체를 간접적으로 표지하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 개시된 양태는 항체, 및 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로 이루어지는 군에서 선택되는 바이오마커의 복합체이다. 복합체는 제2의, 상이한 항체를 더 포함할 수 있다. 복합체는 검출가능한 모이어티를 더 포함할 수 있다. 복합체는 자궁경질액의 샘플 내에 존재할 수 있다. 복합체는 단리될 수 있다.
검출 및 표지
본 명세서에 개시된 방법은 바이오마커의 검출 및/또는 정량화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법에서, 바이오마커 ("표적")는 직접 검출될 수 있다. 즉, 표적은 항-표적 항체에 의해 검출될 수 있다.
또는, 표적의 검출은 간접적일 수 있다. 즉, 표적은 항-표적 항체에 의해 검출될 수 있고, 항-표적 항체는 이어 2차 검출가능한 항체에 의해 검출된다. 2차 항체는 바람직하게는 표지된다. 적합한 2차 항체는 1차 항체가 상승한 동물 종의 항체 동형 (isotype)에 대해 상승할 수 있다. 예를 들어, 2차 항체는 마우스 항체에 결합할 수 있는 항-마우스 항체일 수 있다. 각 1차 항체에 결합하는 다수의 2차 항체로부터의 신호 증폭으로 인하여, 2차 항체를 이용한 방법은 직접 검출 방법보다 더 민감할 수 있다.
적합한 표지는 호스라디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 글루코스 옥시다아제 및 루시퍼라아제와 같은 효소, 및 퀀텀 닷, 형광단 및 발색단을 포함하는 비색제 (colorimetric agent)를 포함한다. 적합한 형광단은 FITC, TRITC, Cy5, Texas Red, Alexa Fluor 등을 포함한다. 표지는 방사성표지일 수 있다.
효소적으로 표지된 항체와 함께 사용하기 위해 다양한 검출가능한 효소 기질을 이용할 수 있다. 여기에는 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), pNNP, BCIP/NBT (5-브로모-4-클로로-3'-인돌일포스페이트/니트로-블루 테트라졸륨), TMB (테트라메틸벤지딘), DAB (3,3'-디아미노벤지딘), OPD (오쏘-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 및 ABTS (2,2'-아지노비스[-에틸벤조티아졸린-6-술폰산])와 같은 발색 검출 시스템 및 ECL (enhanced chemiluminscent) 표지 또는 아크리디늄 에스테르 (AE)와 같은 화학발광 기질이 포함된다.
방법은 scFv 또는 Fab 단편과 같은 항체 또는 항체-유래 결합제의 사용을 포함할 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 항체와 조합하여, 방법은 압타머의 사용을 포함할 수 있다.
ELISA
경우에 따라, 표적은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 검출될 수 있다. 샘플로부터의 (본 명세서에서 개시된 바이오마커 단백질과 같은) 표적 분자는 표면에 부착되며 특이적 항체를 이용하여 검출된다. 표적은 비특이적으로 (표면에의 흡착을 통해) 또는 특이적으로 (항체와 같은 특정 포획제를 이용하여) 표면에 결합될 수 있다. ELISA는 샘플 내 표적을 정량화하는데 사용될 수 있다. 표면은 다중벽 플레이트, 마이크로비드, 또는 딥스틱과 같은 고체 지지체일 수 있다.
시판되는 ELISA 분석법이 사용될 수 있다. ELISA는 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA 또는 경쟁적 ELISA일 수 있다.
ELISA는 표적 분자에 결합하기 위한 제1, 포획, 항체의 사용을 포함한다. 표적 분자에 대한 제2, 검출, 항체가 이후 첨가된다. 제2 항체의 결합은 표적의 존재 및/또는 수준을 나타낸다.
제1 항체는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 제1 및 제2 항체는 동일하지 않다. 일반적으로, 제1 및 제2 항체는 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 경우에 따라, 제2 항체는 제1 항체 및 표적의 복합체에 결합하지만, 복합체로 있지 않은 경우에는 제1 항체 또는 표적에 결합하지 않는다. 제2 항체는 표지될 수 있다.
면역블롯팅
일부 양태에서, 표적은 면역블롯팅, 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 그러한 방법에서, 샘플 내 단백질은 전하 또는 크기에 따라 분리된다. 이들은 전기영동-기반의 방법에 의해 분리될 수 있다. 분리된 단백질은 막으로 옮겨져 표적에 특이적인 항체로 염색된다. 이후 항체는 검출가능한 표지에 접합되어 있는 항체에 의해 직접적으로, 또는 표지된 2차 항체를 가하여 간접적으로 검출된다.
질량 분석법
일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 질량 분석법을 이용한 단백질의 검출 및/또는 정량화를 포함한다. 질량 분석법은 표적에 대한 대용으로서 표적 단백질 특유의 서열을 갖는 펩티드를 사용할 수 있다. 측정은 관심있는 단백질, 단백질 단편 또는 부분 펩티드로 인한 피크의 질량 및 강도와 관련하여 이루어진다. 측정 전에 내부 표준으로서 제공되는 고정된 양의 물질이 원래의 생물학적 물질에 가해지며 피크의 강도가 또한 측정된다. 원래의 생물학적 물질 내 표적의 농도는 내부 표준의 피크 강도에 대한 표적의 피크 강도의 비율로부터 계산될 수 있다. MALDI-TOF (time of flight), SELDI/TOF, 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS), 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (HPLC-MS), 모세관 전기영동-질량 분석법, 핵 자기 공명 분석법, 또는 탠덤 질량 분석법을 포함하여, 다양한 질량 분석 방법이 공지되어 있으며 본 명세서에서 개시된 것과 같이 바이오마커의 검출 및/또는 정량화를 위해 사용될 수 있다.
시험관내 진단 및 키트
본 개시내용의 하나의 양태는 시험관내 진단 방법, 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시험관내 진단 키트를 포함한다. 본 명세서에 기술된 키트는 항-바이오마커 항체 또는 그의 단편과 같은 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 키트는 조산의 위험이 있는 대상체를 선택하기에 적합할 수 있다.
키트는 현장 진료 시험관내 진단 검사에 적합할 수 있다. 실험실-기반 검사를 위한 키트일 수 있다. 키트는 설명 책자 또는 리플렛와 같은 사용 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 임의의 방법을 수행하기 위한 프로토콜을 포함할 수 있다. 설명서는 면역크로마토그래피 분석을 수행하기 위한 프로토콜을 포함할 수 있다. 이들은 다른 종류의 샘플에 대해 검사를 조정하기 위한 방법 및 제안을 기술할 수 있다. 이들은 신호 대 잡음 비를 최소화하는 것과 같이, 검사로부터 얻은 결과를 최적화하기 위한 방법 및 제안을 제공할 수 있다.
키트는 면역크로마토그래피 분석을 수행하기에 적합할 수 있다. 경우에 따라, 시험관내 진단 검사는 측면 흐름 장치, 또는 "딥스틱" 검사를 포함한다. 경우에 따라, 키트는 항-바이오마커 항체와 같이 포획제로 미리 코팅된 다중벽 플레이트 또는 기타 고체 지지체를 포함한다.
키트는 표준 또는 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다. 키트는 정지 버퍼, 샘플 제조 버퍼, 발색 시약, 스트렙트아비딘 컨쥬게이트, 기질 또는 세척 버퍼와 같은, 버퍼, 희석제 또는 다른 시약을 추가적으로 포함할 수 있다.
키트는 본 명세서에서 개시된 임의의 샘플 종류를 포함하여, 건식 샘플, 습식 샘플, 냉동 샘플, 고정 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플, 조직 샘플, 혈액 샘플, 또는 임의의 기타 샘플과 함께 사용하도록 조정될 수 있다.
키트는 질액 샘플을 얻거나 처리하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 키트는 질액 추출 버퍼, 예를 들어 약 50mM HEPES, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1mM EDTA, 1mM Pefabloc SC 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐플루오라이드 (AEBSF)를 포함하는 버퍼를 포함할 수 있다. 키트는 스왑, 자궁경부 심지, 격막-유사 장치, 자궁경부 흡인기, 또는 세포브러쉬와 같은 샘플 수집 장치를 포함할 수 있다. 키트는 질액 샘플을 저장하기에 적합한 용기를 포함할 수 있다.
키트에 사용하기에 적합한 스왑에는 폼 스왑, 데이크론 (dacron) 스왑, 레이온 스왑, 깃털 (flocked) 스왑 및 면 스왑이 포함된다. 적합한 폼 스왑에는 MW942 (Sigma-Swab Duo), 폴리우레탄 폼 스왑 (Catch-All; Epicenter) 및 CultureSwab EZ 폴리우레탄 폼 스왑 (BD)이 포함된다. 적합한 데이크론 스왑에는 Deltalab Eurotubo 300263 (Fisher Scientific, UK), 멸균 G-in, 데이크론-팁 플라스틱 어플리케이터 (Solon, Skowhegan, ME), 데이크론 스왑 (Cardinal Health, McGraw Park, IL) 및 데이크론 스왑 (Puritan Medical, Guilford, ME, USA)이 포함된다. 적합한 레이온 스왑에는 BBL 컬쳐스왑 (Becton Dickinson, Oxford, UK) 및 MW167 (Duo-Transtube®)이 포함된다. 적합한 깃털 스왑 (nylon)에는 Seacliff Packaging, BD, COPAN이 포함된다. 적합한 면 스왑에는 멸균 건식 스왑 (Eurotubo, Rubi, Spain), 면-팁 스왑 (Falcon™ Screw Cap Single SWUBE™ applicator, Becton Dickinson Co., Sparks, MD), Falcon™ Screw Cap Single SWUBE™ 어플리케이터 (BD)가 포함된다.
키트에 사용하기에 적합한 적합한 심지에는 안과 PVA 스폰지 (Eyetec™, Network Medical Ltd.), Tear-Flo™ 스트립 (Wilson Ophthalmic), Weck-Cel® 스폰지 (Xomed Surgical Products, Jacksonville, FL), Sno-스트립 (Akorn Inc., Abita Springs LA) 및 폴리윅스 (Polyfiltronics, Rockland, MA, USA)를 포함한, 탐폰, 스트립 또는 스폰지가 포함된다.
키트에 사용하기에 적합한 격막-유사 장치에는 Instead SoftCup (Ultrafem), 멸균 거즈, 또는 생리 컵 (SoftCup, EuroFemPro, Netherlands, 또는 the SoftCup, Instead Inc., San Diego, CA)이 포함된다.
적합한 자궁경부 흡인기에는 질 시편 흡인기 (Vaginal Specimen Aspirator, CarTika), 또는 긴 투베르쿨린 주사기가 포함된다.
본 명세서에서 개시된 특정 키트는 조산 바이오마커에 결합하는 항체 및 질액 샘플을 얻거나 처리하기 위한 장치 또는 버퍼를 포함한다.
조산 바이오마커에 결합하는 항체는 항-ECM1, 항-GGH, 항-LAMC2, 항-EFEMP1, 항-PTN, 항-FGA 또는 항-PEDF 항체일 수 있다.
또한 질액 및 항-ECM1, 항-GGH, 항-LAMC2, 항-EFEMP1, 항-PTN, 항-FGA 또는 항-PEDF 항체를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 개시된다.
샘플링 방법
본 명세서에 기술된 방법 및 작용제는 자궁경질액 내 특정 바이오마커의 분석을 포함한다. 자궁경질액 샘플을 채취하는 여러 방법이 알려져 있으며, 본 방법에서 사용될 수 있다.
방법은 자궁경질 세척에 의한 샘플링을 포함할 수 있다. 이는 세척 버퍼를 이용해 자궁경질을 헹굼으로써 자궁경질 세척을 하는 단계 및 헹굼 후 체액을 수집하는 단계를 포함한다.
일부 방법에서, 자궁경질 스왑이 사용된다. 적합한 스왑이 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서 개시된 방법 및 키트에 사용하기에 바람직한 스왑에는 폼 스왑, 데이크론 스왑, 레이온 스왑, 깃털 스왑 및 면 스왑이 포함된다. 적합한 폼 스왑에는 MW942 (Sigma-스왑 Duo), 폴리우레탄 폼 스왑 (Catch-All; Epicenter) 및 CultureSwab EZ 폴리우레탄 폼 스왑 (BD)이 포함된다. 적합한 데이크론 스왑에는 Deltalab Eurotubo 300263 (Fisher Scientific, UK), 멸균 G-in, 데이크론-팁 플라스틱 어플리케이터 (Solon, Skowhegan, ME), 데이크론 스왑 (Cardinal Health, McGraw Park, IL) 및 데이크론 스왑 (Puritan Medical, Guilford, ME, USA)이 포함된다. 적합한 레이온 스왑에는 BBL Culture스왑 (Becton Dickinson, Oxford, UK) 및 MW167 (Duo-Transtube®)이 포함된다. 적합한 깃털 스왑 (나일론)에는 Seacliff Packaging, BD, COPAN이 포함된다. 적합한 면 스왑에는 멸균 건식 스왑 (Eurotubo, Rubi, Spain), 면-팁 스왑 (Falcon™ Screw Cap Single SWUBE™ 어플리케이터, Becton Dickinson and Co., Sparks, MD), Falcon™ Screw Cap Single SWUBE™ 어플리케이터 (BD)가 포함된다.
다른 방법에서, 자궁경질액은 심지로 샘플링되었다. 본 명세서에 개시된 방법의 사용에 적합한 심지에는 안과 PVA 스폰지 (Eyetec™, Network Medical Ltd.), Tear-Flo™ 스트립 (Wilson Ophthalmic), Weck-Cel® 스폰지 (Xomed Surgical Products, Jacksonville, FL), Sno-스트립 (Akorn Inc., Abita Springs LA) 및 폴리윅스 (Polyfiltronics, Rockland, MA, USA)를 포함하는 탐폰, 스트립 또는 스폰지가 포함된다.
다른 방법에서, 격막-유사 장치가 자궁경질액을 샘플링하는데 사용된다. 적합한 격막-유사 장치가 자궁경질액을 수집하기 위해 자궁경부 상에 놓여지며 Instead SoftCup (Ultrafem), 멸균 거즈, 또는 생리 컵 (SoftCup, EuroFemPro, Netherlands, 또는 the SoftCup, Instead Inc., San Diego, CA)이 포함된다.
방법은 질 시편 흡인기 (Vaginal Specimen Aspirator, CarTika), 또는 긴 투베르쿨린 주사기와 같은 자궁경부 흡인기의 사용을 포함할 수 있다.
일부 방법에서, 자궁경질액은 세포브러쉬를 이용해 샘플링된다.
본 명세서에서 개시된 특정 키트는 조산 바이오마커에 결합하는 항체 및 질액 샘플을 얻거나 처리하기 위한 장치 또는 버퍼를 포함한다.
대조군
본 명세서에 개시된 일부 방법에서 바이오마커의 수준은 대조군의 수준 또는 기준 값 또는 수준과 비교된다.
경우에 따라, 대조군은 기준 샘플 또는 기준 데이터세트일 수 있다. 기준은 조산을 겪은 것으로 알려진 대상체로부터 사전에 얻은 하나 이상의 샘플에서 유래할 수 있다. 또는, 기준은 만기 출산을 겪은 것으로 알려진 대상체로부터 사전에 얻은 하나 이상의 샘플에서 유래할 수 있다. 기준은 기준 샘플을 분석하여 얻은 데이터세트일 수 있다.
대조군은 표적 분자가 존재하거나 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 양성 대조군이거나, 표적 분자가 존재하지 않거나 낮은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 음성 대조군일 수 있다.
대조군은 조산 또는 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 환자의 샘플 또는 수준일 수 있다. 대조군 값은 검사될 개체로부터의 샘플과 병행하여 바이오마커의 분석을 수행함으로써 얻을 수 있다. 또는, 대조군 값은 데이터베이스 또는 이전에 얻은 다른 값으로부터 얻을 수 있다.
샘플
본 명세서에 개시된 방법은 개체 또는 환자로부터 얻은 샘플에서의 바이오마커의 검출에 관한 것이다. 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 방법은 개체로부터 얻은 샘플을 포함한다. 따라서, 방법은 개체로부터 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 포함하지 않는다.
바람직하게, 샘플은 자궁경질 (자궁경부-질; 경부-질) 액 (CVF) 또는 자궁경부액과 같은 질액 샘플이다. 또는, 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청 샘플과 같은 혈액 샘플, 림프 샘플, 소변 샘플 또는 양수 샘플일 수 있다. 샘플은 질액 또는 자궁경질액 샘플로부터 유래한 단백질 샘플, 또는 전혈, 혈장 또는 혈청 샘플과 같은 혈액 샘플, 림프 샘플, 소변 샘플 또는 양수 샘플로부터 유래한 단백질 샘플일 수 있다.
샘플은 전처리 되었을 수 있다. 예를 들어, 샘플은 하나 이상의 보존제 또는 버퍼와 접촉되었을 수 있다. 샘플은 동결, 동결건조, 또는 건조되었을 수 있다.
개체 또는 환자는 고양이, 개, 말, 또는 원숭이와 같은 포유류일 수 있으나, 개체는 바람직하게는 인간이다. 용어 "환자", "개체 (individual)" 및 "대상 체(subject)"는 호환하여 사용될 수 있다.
개체는 여성 개체일 수 있다. 개체는 임신했을 수 있다. 개체는 증상이 있거나 무증상일 수 있다. 바람직하게, 개체는 무증상이다.
증상이 있는 개체는 진통, 특히 규칙적인 진통, 등 하부의 허리 통증을 포함하는 요통, 하복부 경련 또는 생리-유사 경련, 질에서의 체액 누출, 독감-유사 증상, 메스꺼움, 구토, 골반 또는 질의 압력 증가, 증가된 질 분비물 및/또는 질 출혈과 같은 조산 증상이 하나 이상 있는 개체이다.
무증상 개체는 조산의 증상이 없거나, 등 하부의 허리 통증을 포함하는 요통, 하복부 경련 또는 생리-유사 경련, 질에서의 체액 누출, 독감-유사 증상, 메스꺼움, 구토, 골반 또는 질의 압력 증가, 증가된 질 분비물 및/또는 질 출혈과 같은 조산의 지표이거나 지표가 아닐 수 있는 증상이 없을 수 있다. 일반적으로, 무증상 개체는 조산의 증상이 없다.
경우에 따라, 개체는 샘플을 얻기 전에 조산의 위험이 큰 것으로 의심될 수 있다. 예를 들어, 개체가 조산의 위험이 높다고 의심되기 때문에 샘플이 얻어지고/얻어지거나 바이오마커의 존재 또는 수준이 결정될 수 있다. 개체는 그 개체의 조산 또는 유산 병력에 기초하여 조산의 위험이 높다고 의심될 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 추가적으로, 개체는 태아 피브로넥틴 (fFN) 검사 결과에 기초하여, 또는 진통, 질 출혈, 질에서의 체액 누출, 증가된 질 분비물, 요통 또는 하복부 경련과 같은 증상에 기초하여 조산의 위험이 높다고 의심될 수 있다. 그렇지 않으면, 또는 추가적으로, 개체는 당뇨 (diabetes), 고혈압 (high blood pressure), 하나 이상의 아기를 임신중임, BMI (너무 높거나 너무 낮음), 여러 질 감염 (vaginal infection), 담배 흡연, 및 심리적 스트레스, 인종 배경, 및 사회경제적 지위 또는 수입과 같은 위험 요소가 하나 이상 존재하기 때문에 조산의 위험이 높은 것으로 간주될 수 있다.
샘플은 출산 또는 만기 출산의 예정일로부터 수 주 또는 수 개월 이전에 개체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 샘플은 출산으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36주 전에 얻을 수 있다. 경우에 따라, 샘플은 출산으로부터 1-4, 5-8, 9-12 또는 12주 이상 이전에 얻어진다.
샘플은 37주 예정된 기간에 기초하여 정상 출산으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36주 이전으로 예측되는 시점에 얻을 수 있다. 경우에 따라, 예정된 정상 출산일로부터 1-4, 5-8, 9-12 또는 12주 이상 이전에 샘플이 수집된다.
또는, 샘플은 예정된 정상 출산일로부터 약 1 개월, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월, 약 6 개월, 약 7 개월, 약 8 개월, 또는 약 9 개월 전에 수집될 수 있다.
다른 방법으로 살펴 보면, 샘플은 임신 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37주에 수집될 수 있다.
샘플은 임신 나이 10주에서 13주+6일, 14주에서 21주+6일, 22주에서 25주+6일, 26주에서 29주+6일, 30주에서 33주+6일, 또는 34주 이상에 수집될 수 있다. 제1 샘플은 약 12-14주에 수집될 수 있다. 제2 샘플은 16-24주에 수집될 수 있다.
샘플은 제1, 제2 또는 제3 삼개월기 (trimester)에 수집될 수 있다. 제1 삼개월기는 0주에서 13주에 6일을 더한 기간이다. 제2 삼개월기는 14주에서 27주에 6일을 더한 기간이다. 제3 삼개월기는 28주부터 출산까지이다.
당업자는 임신 주수를 정확하게 결정하는 것이 어려울 수 있음을 이해할 것이다. 임신 주수를 추정하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이들 중 임의의 방법이 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 임신 주수는 일반적으로 마지막 생리 기간 (LMP)의 일자에 기초하여 추정된다. 임신 주수는 마지막 생리 기간이 시작된 날짜에 기초하여 결정될 수 있다. 또는, 임신 주수는 알려진 경우 배란일을 기준으로 할 수 있다. 일반적으로, 배란일은 마지막 생리 기간이 시작된 날로부터 2주 후이다. 임신 기간은 데이팅 스캔 (dating scan)에 기초하여 결정될 수 있다. 데이팅 스캔은 일반적으로 마지막 생리 기간의 첫날의 날짜를 기준으로 10주에서 13주+6일 사이에 수행된다.
상이한 샘플 시간에 대해 상이한 바이오마커가 더 적합할 수 있다. 예를 들어, 한 바이오마커가 초기 단계의 개체로부터 얻은 샘플에서 개체의 조산의 위험 여부를 결정하는데 더 유용할 수 있는 반면, 다른 바이오마커는 더 후기 단계의 개체로부터 얻은 샘플에서 개체가 조산의 위험이 있음을 결정하는데 유용할 수 있다.
경우에 따라, 여러 시점에서 샘플을 개체로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 제1 삼개월기에 제1 샘플을 얻을 수 있고, 제2 삼개월기에 제2 샘플을 얻을 수 있다. 바이오마커 발현의 경향 또는 변화를 확인하기 위하여 복수의 샘플을 얻을 수 있다. 경우에 따라, 그 개체에 대한 바이오마커의 대조군 또는 기준 수준을 확립하기 위하여, 제1 삼개월기와 같은 임신 초기에 샘플을 얻을 수 있다.
단백질 및 폴리펩티드
본 발명의 방법은 전장 단백질 서열의 검출을 수반할 수 있으나, 그것이 항상 필요한 것은 아니다. 대안으로서, 전장 폴리펩티드의 상동체, 돌연변이, 유도체, 아형, 스플라이스-변이체 또는 단편이 검출될 수 있다.
유도체는 주어진 전장 단백질 서열의 변이체를 포함하며 전장 단백질에 대해 실질적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 자연적으로 발생한 대립 유전자 변이체 및 합성 변이체를 포함한다.
단백질 단편은 최대 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 150 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 최소 단편 길이는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 30개의 아미노산 또는 3 내지 30개의 다수의 아미노산일 수 있다.
돌연변이는 대응되는 야생형 폴리펩티드와 비교할 때 하나 이상의 변형 (예를 들어, 삽입, 치환, 역위 및/또는 결실)을 포함할 수 있다. 돌연변이는 변경된 활성 또는 특성, 예를 들어 결합을 나타낼 수 있다.
돌연변이는 임의의 바이오마커 단백질에서 나타날 수 있으며 이러한 단편을 포함하는 성분은 야생형 폴리펩티드의 활성을 완전히 또는 부분적으로 회복하기 위해 돌연변이의 활성을 조절하는 목적을 수행할 수 있다.
유도체는 개체 간에 또는 패밀리 멤버 간에 존재할 수 있는 천연 변이체 또는 다형을 또한 포함할 수 있다. 이러한 모든 유도체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 순전히 예로서, 이러한 다형에서 발견될 수 있는 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 간에 이루어질 수 있다:
알라닌, 세린, 트레오닌;
글루탐산 및 아스파르트산;
아르기닌 및 류신;
아스파라긴 및 글루타민;
이소류신, 류신 및 발린;
페닐알라닌, 티로신 및 트립토판.
본 명세서에서, 바이오마커는 바이오마커 서열 중 하나, 또는 이들 서열 중 하나에 대한 단편과 지정된 정도의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 임의의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다. 지정된 정도의 서열 동일성은 적어도 60% 내지 100%의 서열 동일성일 수 있다. 더욱 바람직하게, 지정된 정도의 서열 동일성은 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 중 하나일 수 있다.
특정한 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단의 측면에서 나타낸, 전술한 설명, 또는 하기의 청구범위, 또는 첨부 도면에 개시된 특징, 또는 개시된 결과를 적절히 얻기 위한 방법 또는 프로세스는, 본 발명을 다양한 형태로 구현하기 위해 개별적으로 또는 이러한 특징들의 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명은 전술한 예시적인 실시양태와 관련하여 기술되었으나, 본 개시가 주어질 때 당업자에게는 많은 등가 수정 및 변형이 명백할 것이다. 따라서, 앞서 제시된 본 발명의 예시적 실시양태는 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는 것으로 간주된다. 기술된 실시양태에 대한 다양한 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
어떠한 의문도 피하기 위해, 본 명세서에서 제공된 임의의 이론적 설명은 읽는 사람의 이해를 높이기 위한 목적으로 제공된다. 본 발명자들은 이러한 이론적 설명에 구속되는 것을 바라지 않는다.
본 명세서에서 사용된 임의의 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
하기의 청구범위를 포함한 본 명세서에 걸쳐, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다 (comprise)" 및 "포함하다 (include)", 및 "포함하는 (comprises)", "포함하는 (comprising)", 및 "포함하는 (including)"과 같은 변형은, 언급된 정수 또는 단계 또는 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 것과 같이, 단수 형태 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 문맥이 명백히 다르게 지시하고 있지 않는 한 복수 지시 대상체를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 범위는 본 명세서에서 "약" 하나의 특정 값부터, 및/또는 "약" 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 실시양태는 하나의 특정한 값부터 및/또는 다른 특정한 값까지를 포함한다. 유사하게, 선행하는 "약"의 사용에 의해 값이 근사치로 표현될 때, 특정 값은, 다른 실시양태를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치 값과 관련하여 용어 "약"은 선택적이며 예를 들어 +/- 10%를 의미한다.
실시예
실시예 1
임신 나이 19-37주의 임신한 여성으로부터 CVF (자궁경질액) 샘플을 수집하였다. 멸균 이막 검경을 환자의 질에 삽입하였다. 이중-팁 스왑을 후방질원개에 30초 동안 위치시키고 이를 냉각된 CVF 추출 버퍼 (50mM HEPES, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 1mM EDTA, 1mM Pefabloc SC 4-(2-아미노에틸)벤젠 술포닐 플루오라이드 (AEBSF)) 1 mL에 넣는다. 샘플을 10초 동안 볼텍싱하고, 이후 스왑을 뒤집고 5분 동안 1000xg에서 원심분리 하였다. 스왑을 버리고, 1000xg에서 5분 동안 원심분리 하기 전에 샘플 튜브를 10초 동안 볼텍싱하였다. 추출된 CVF (상등액)를 튜브에 분액하고 -80℃에서 필요할 때까지 보관하였다.
7개의 단백질 바이오마커 (ECM1, GGH, LAMC2, EFEMP1, PTN, FGA 및 PEDF)를 최종적으로 만기 출산 및 조산을 한 86명의 환자로부터 얻은 200개의 CVF 샘플에서 검사하였다. 샘플을 임신 19-38주차로부터 종단 수집하였다. CVF 샘플 내 바이오마커 발현 수준을 상업적 ELISA 키트, 즉, PEDF (DuoSet, #DY1177-05, R&D Systems, Minneapolis, MN), ECM1 (#ELH-ECM1-1, Raybiotech), GGH (# EH4206, Wuhan Fine Biotech), LAMC2 (#SEC083Hu, Cloud-clone), PTN (#23437, LSBIO), FGA (#11466, LSBIO), EFEMP1 (#MBS178533, MyBioSource)을 이용하여 측정하였다. 샘플을 알려진 농도의 기준 대조군 및 표준 단백질과 함께 표준 96-웰 플레이트 상에 2번 중복하여 흘려 넣었다.
제조사 매뉴얼에 기초하여 ELISA 프로토콜을 분석하였다. 이하 일반적인 프로토콜을 설명한다:
코팅 버퍼 내 0.8-10μg/ml 농도의 포획 항체 (Capture Antibody) 100 μl로 96 웰을 코팅한다. 플레이트를 덮고 밤새 4℃에서 배양한다.
300 μl의 블로킹 용액을 각 웰에 가한다. 60분 동안 배양한다. 세척 버퍼로 플레이트를 3번 세척하고 마른 종이에 뒤집은 플레이트를 두드려 건조시켰다.
연속 희석 및 적절히 희석된 샘플에 100 μl의 표준 단백질을 추가한다. 샘플 또는 표준물을 2번 중복하여 흘려 넣고 90분 동안 37℃에서 배양하였다. 세척 버퍼로 플레이트를 3번 세척하고 마른 종이에 뒤집은 플레이트를 두드려 건조시켰다.
시약 희석제 또는 적절한 버퍼에 희석된 100 μl의 비오틴-결합된 검출 항체를 가하고, 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세척 버퍼로 플레이트를 3번 세척하였다.
시약 희석제 또는 적절한 버퍼에 희석된 100 μl의 효소-결합된 스트렙트아비딘을 가하고, 60분 동안 37℃에서 배양하였다. 세척 버퍼로 플레이트를 3번 세척하고 마른 종이에 뒤집은 플레이트를 두드려 건조시켰다.
100 μl의 적절한 기질 용액을 각 웰에 가하였다. 37℃ 최대 20분 동안, 또는 원하는 색 변화가 이루어질 때까지 배양하였다.
적절한 파장에서 즉시 흡광도 값을 읽거나 50 μl의 "정지 용액"을 가한다. 완전하게 혼합하기 위해 플레이트를 가볍게 두드린다. 450nm에서 흡광도를 측정하고 540nm에서 참조하였다.
선형 또는 4 파라미터 로지스틱 (4 Parameter Logistic, 4PL) 표준 곡선으로서 모든 플레이트에서 나온 표준 곡선을 기초로 바이오마커 농도를 결정하였다. 바이신코닌산 분석법 (BCA assay)에 의해 결정된 총 단백질 농도에 기초하여 최종 농도를 정규화하였다.
이후 샘플의 값과 데이터를 모아 3가지 주요 방법에 따라 계층화한 만기 출산 및 조산의 결과를 비교하였다:
ㆍ 평균 차이가 평가되며 Student's t-검정 분석에서 얻은 p-값을 나타내는 만기 출산 (n=136) 및 조산 (n=64)의 전체 코호트 (n=200)를 갖는 전체 그룹.
ㆍ 임신 주수 - 샘플링 시의 임신 주수에 기초하여 그룹화된 샘플
ㆍ 출산까지의 시간 - 샘플과 출산 사이의 일수를 기준으로 샘플을 그룹화하였다
통계 분석.
통계 분석을 위해, Microsoft Excel 소프트웨어를 사용하여 양측 비쌍체 (two-tailed unpaired) Student's t-검정을 신뢰구간 (CI)= 0.95에서 수행하였으며, 0.05 미만의 p-값 (P)은 유의한 것으로 간주하였다. 오차 막대를 포함한 모든 수치 데이터는 평균 +/- 표준 평균 오차 (SEM)를 나타낸다.
결과 및 논의.
200개의 임상 유래 샘플 상의 바이오마커 정량화는 만기 출산 및 조산 샘플 간의 차이를 보여준다. 샘플의 추가 계층화는 조산의 위험 기반을 더 잘 이해하도록 하는 임신 중 잠재적 시점에 중점을 둘 수 있도록 하였다.
ECM1은 수집된 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플 사이에서 P=0.0025의 p-값으로 차등 발현되었다 (도 1). 상이한 임신 나이 및 샘플링부터 출산까지 중 상이한 시점으로 샘플을 계층화할 때, 차등 발현은 동일한 방향으로 유지되었다 (즉, ECM1은 임신 나이 및 출산까지의 시간에 관계없이 모든 조산 샘플에서 평균적으로 덜 발현되었다) (도 2 및 도 3). ECM1이 여러 피부 관련 장애 및 혈관신생에서 공지된 마커이므로, 조산과의 상관 관계는 다소 놀라운 것이다.
GGH는 만기 출산 및 조산 샘플 사이에서 차등 발현되었다. GGH의 발현은 조산 여성 샘플 대 만기 출산 여성 샘플에서 평균적으로 상승하였다 (도 4). 흥미롭게도, 만기 출산과 조산 경우 모두에서, 임신 나이가 많아지고 출산까지의 시간이 감소함에 따라 발현 수준이 점진적으로 증가하였다 (도 5 및 6). GGH는 널리 알려진 바이오마커가 아니며, 면역 경로 및 세포외 기질 조절에 관여한다.
LAMC2는 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플 사이에서 차등 발현되었다 (도 7). 다른 마커들과는 달리, 차이는 출산 전 마지막 날로 갈수록 더욱 두드러졌다 (도 9). LAMC2는 상피 전이 경로에 관여하며 여러 피부 질환 적응증에 관여하는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, 이는 자궁경부 질 공간의 변화와 전혀 관련이 없었다.
EFEMP1 또한 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플에서 차등 발현되었다 (도 10). 그러나, 보다 흥미롭게도 임신 전반에 걸쳐 만기 출산 및 조산 샘플 간에 EFEMP1의 상승된 발현 및 감소된 발현 간의 전이가 있었다. 임신 나이 및 출산까지의 시간 중 모두 초기 시점에서, EFEMP1 만기 출산 샘플은 조산 샘플과 비교하여 상승하였다. 그러나, 이 경향은 임신 나이 및 출산까지의 시간 중 후기 시점에서 역전되었다 (도 11 및 도 12).
PTN은 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플 사이에서 차등 발현되었다 (도 13). 만기 출산 및 조산 샘플 간의 PTN 발현 프로파일에서 가장 뚜렷한 차이는 가장 이른 임신 나이와, 출산까지의 시간에서 가장 늦은 시점뿐만 아니라 가장 이른 시점에서 관찰되었다 (도 14 및 15).
FGA는 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플에서 차등 발현되었다 (도 16). FGA 발현의 차이는 임신 후기에서 그리고 출산 전 마지막 날로 갈수록 보다 두드러졌다 (도 17 및 18). 단백질로서 FGA는 염증 및 면역 반응 경로에 관여하므로 이러한 경로에 의해 개시되는 조산 사례와 관련될 수 있다.
PEDF는 모든 200개의 만기 출산 및 조산 샘플 사이에서 차등 발현되었다 (도 19). PEDF는 모든 계층화에서 조산 샘플 내 일관되게 상승하였는데 (도 20 및 21), 이는 임의의 시점에서 강력한 바이오마커가 될 것임을 시사한다. PEDF는 혈관신생및 조직의 리모델링에 밀접한 관련이 있는 단백질이다. 조산에 대한 관련성이 자궁경부 리모델링과 관련이 있다고 가정한다.
조산의 위험이 있는 여성을 예측하는 현재 상황은 상당히 제한적이다. 위험 프로파일을 얻는 가장 일반적인 2가지 방법은 이전 병력과 자궁경부 길이를 기반으로 한다. 이 방법들은 조합하여 사용한다고 하더라도 대부분의 여성들에서 조산의 위험을 정확하게 평가하지 못한다. 따라서, 조산의 위험이 있는 여성을 정확하게 예측하는 도구는 임신 관리에 있어 임상계에 큰 자산이 될 것이며, 나아가 조산 사례를 줄이고 상당한 의료 비용을 절약할 수 있다. 여기, 우리는 개별 바이오마커를 통해 이러한 도구의 초석을 보여준다. 보다시피, 이들 바이오마커, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2는 개별 바이오마커의 예측 값을 조합하여, 매우 정확한 도구를 생성하는 키트의 토대를 마련했다.
실시예 2: 시험관내 분석법
하기 프로토콜에 따른 다양한 세포 스트레스 조건 (과산화수소 및 LPS)에서 바이오마커의 시험관내 연구를 위해 외자궁경부 Ect1/E6E7 (ATCC CRL-2614) 및 내자궁경부 End1/E6E7 (ATCC CRL-2615) 세포주를 선택하였다:
H 2 O 2 처리
0.1ng/ml EGF, 50μg/ml BPE 및 0.4mM CaCl2로 보충된 각질세포 (keratinocyte) 무혈청 배지 (KSFM)에 0일차에 Ect1 및 End1 세포를 접종하였다. 2일차에 70-80% 컨플루언시 (confluency)에 도달하면, 세포를 증가하는 양의 H2O2 (50μM, 100μM, 200μM, 400μM)로 처리하였다. 24시간 후, ELISA를 이용한 바이오마커 정량화를 위해 배양 배지를 회수하였다. 세포 생존 및 증식에 대한 H2O2의 영향을 MTT 분석법을 사용하여 평가하였다.
LPS 처리
0.1ng/ml EGF, 50μg/ml BPE 및 0.4mM CaCl2로 보충된 KSFM에 0일차에 Ect1 및 End1 세포를 접종하였다. 1일차에, 세포 배양물을 제거하고 성장 인자 보충 없이 KSFM으로 대체하였다. 이후 2일차에 세포를 증가하는 양의 LPS (10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml)로 처리하였다. LPS 처리-후 24시간째에, ELISA를 이용한 바이오마커 정량화를 위해 배양 배지를 회수하였다.
결과 및 논의:
모두 정상 자궁경부 상피 조직에서 유래한 외자궁경부 Ect1/E6E7 (ATCC CRL-2614) 및 내자궁경부 End1/E6E7 (ATCC CRL-2615) 세포주를 바이오마커의 시험관내 연구를 위해 선택하였다. End1은 단층 원주 상피의 특성을 나타내는 반면, Ect1은 계층화된 편평 비각질화 상피의 특성을 나타낸다. CVF는 질, 자궁경부 및 인접한 위에 놓인 태아막으로부터 유래한 체액의 혼합물이므로, 다른 세포외 스트레스의 존재 하에서 분비된 Ect1 및 End1의 내용물을 연구하는 것은 임신 중 자궁경부의 국소 생화학적 환경 및 생리학적 변화에 대한 참조 및 추론을 제공한다.
산화 스트레스는 정상적 만기 출산 및 자발적 조산 (spontaneous preterm birth, PTB)뿐만 아니라 만삭전 조기양막 파열 (Preterm premature rupture of membranes, PPROM) 및 자간전증 (pre-eclampsia)과 같은 많은 임신 합병증에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 왔다. 분자 매커니즘은 불분명하지만, PTB에서 산화 스트레스의 역할은 염증, 아폽토시스, 자가포식, 노화, 및 변경된 콜라겐 대사와 같은 다양한 반응 산소종 (ROS)-매개 병태생리학적 경로에 기인할 수 있다. Menon 등의 연구는 PTB 및 PPROM에서의 태아막에서 F2-이소프로스탄 및 OS-유도된 3-니트로티로신 변형 단백질 (3-NT)과 같은 산화 스트레스 마커의 발현이, 만기 출산에서의 태아막에서의 발현보다 유의하게 높았음을 보여주었다. 동시에, PTB 및 PPROM은 만기 출산보다 양수 F2-이소프로스탄이 더 높았다. 같은 그룹의 연구자들은 나아가 산화 스트레스-매개 아폽토시스가 태아막에서 단백질 분해 (proteolysis)를 일으켜 결국 PPROM에서 막 약화 및 파열을 초래한다고 추론하였다. 한편, Heng 등은 항산화 효소인 티오레독신 및 SOD1의 발현뿐만 아니라 CVF의 총 항산화 능력이 분만에 다가갈수록 유의하게 감소함을 보여주었다. 그들은 분만이 증가된 산화 스트레스와 관련이 있으며 항산화 효소는 잠재적으로 분만의 예측인자가 될 수 있다고 결론지었다.
본 시스템에서 산화 스트레스를 유도하기 위해, Ect1 및 End1 세포를 증가하는 양의 H2O2로 24시간 동안 처리하였다. H2O2-처리된 세포의 세포 생존 및 증식을 MTT 분석법을 이용하여 평가하였다 (도 22). H2O2 처리가 Ect1 및 End1 세포에서 차등적 세포 반응을 유도했음을 발견하였다. Ect1 세포에서, 저용량의 H2O2 (50μM 및 100μM)는 세포 생존에 영향을 미치지 않았다. 200μM H2O2에서, 대조군인 비처리된 세포와 비교할 때 처리된 세포에서 20%의 세포 밀도 감소가 있었으나, 그 감소가 통계적으로 유의하지는 않았다. 400μM H2O2에서, 처리된 세포의 세포 생존율에서 ~50%의 유의한 감소가 관찰되었다. End1 세포에서, 50μM은 효과가 없었으나, 100μM, 200μM 및 400μM H2O2는 각각 세포 생존율에서 ~20%, ~50% 및 ~90%의 유의한 감소를 가져왔다.
H2O2로 처리된 세포의 배양 배지에서 ELISA를 사용하여 바이오마커 발현의 정량화를 진행하였다. 흥미롭게도, H2O2 처리 시 바이오마커는 차등 발현을 보였다. Ect1에서, Ect1 내 FGA (도 25), LAMC2 (도 24) 및 EFEMP1 (도 31)의 발현은 200μM 및 400μM의 H2O2 처리 시 유의하게 감소하는 것으로 밝혀졌다. Ect1이 24시간 동안 400μM H2O2에 노출되었을 때 ECM1 발현은 감소하였다 (P<0.05) (도 23). GGH 발현은 H2O2 처리 시 비교적 변하지 않고 유지되었다(도 26).
End1 세포의 경우, 200μM의 H2O2로 처리된 세포 내 FGA 및 EFEMP1에서 유의한 발현 변화가 관찰되었다 (도 25 및 32). ECM1 (도 23), GGH (도 26) 및 LAMC2 (도 24)의 발현은 24시간 동안의 H2O2의 처리에도 불구하고 대조군인 비처리된 세포와 유사했다. 표 1 및 표 2는 H2O2 처리 시의 Ect1 및 End1에서 바이오마커의 발현 변화를 요약한 것이다.
24시간 동안의 H 2 O 2 처리에 따른 Ect1 내 바이오마커의 발현
Ect1
바이오마커 배수 변화 (200μM H2O2) 배수 변화 (400μM H2O2)
ECM1 1.09 ± 0.21 0.62* ± 0.10
GGH 0.73 ± 0.16 1.01 ± 0.25
FGA 0.49** ± 0.08 0.35** ± 0.08
LAMC2 0.80* ± 0.06 0.33* ± 0.10
EFEMP1 0.82* ± 0.07 0.65* ± 0.12
대조군인 비처리된 세포 대비 배수 변화는 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 결과는 배수 변화 ± SEM으로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.005.
24시간 동안의 H 2 O 2 처리에 따른 End1 내 바이오마커의 발현
End1
바이오마커 배수 변화 (100μM H2O2) 배수 변화 (200μM H2O2)
ECM1 1.02 ± 0.16 0.90 ± 0.07
GGH 0.75 ± 0.16 0.86 ± 0.18
FGA 0.96 ± 0.21 0.56** ± 0.08
LAMC2 1.15 ± 0.17 0.95 ± 0.16
EFEMP1 0.73 ± 0.12 0.49** ± 0.04
대조군인 비처리된 세포 대비 배수 변화는 적어도 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 결과는 배수 변화 ± SEM으로 나타내었다. **P<0.005.
산화 스트레스와 유사하게, 염증은 만기 출산 및 조산 시 분만 및 출산과 오랫동안 연관되어 왔다. 대부분의 경우, PTB 및 PPROM은 양수내 감염, 자궁내 감염, 및 염증과 밀접한 관련이 있다. 다수의 실험 및 임상 연구는 조산 및 여러 임신 합병증의 근본 원인으로서 염증 매개체에 의해 매개되는 병태생리학적 경로를 정확히 지적한다. 이러한 염증-매개 경로는 백혈구 활성화, 증가된 염증성 사이토카인 및 케모카인, 및 세포외 기질 금속단백질분해효소 (MMP)에 의한 콜라겐분해를 포함한다. 이러한 결과는 결국 막의 구조적 완전성, 자궁근 활성화, 및 초기/조기 자궁경부 리모델링의 손실을 초래하여, PTB 및 PPROM으로 이어진다. 또한, 인터루킨 (IL)1,2,6, 및 8, 종양 괴사 인자- [TNF-], 및 C-반응성 단백질 [CRP]과 같은 염증 마커가 PTB에서 바이오마커로 평가되어 왔다.
우리의 연구에서, Ect1 및 End1 세포를 다양한 용량의 리포폴리사카라이드 (LPS)로 처리함으로써 우리 시스템에 염증을 유도하였다.
Ect1 세포에서, 25μg/ml LPS 처리는 조절된 배지에서 ECM1 발현의 유의한 감소를 초래하였다 (도 27). 또한, 저용량의 LPS (10μg/ml 및 25μg/ml)는 대조군인 비처리된 세포와 비교할 때 통계적으로 유의한 5배 이상의 LAMC2 발현 증가를 야기하였다 (도 28). 또한 3가지 다른 용량의 LPS로 처리된 Ect1 세포의 조절된 배지에서 GGH (도 29) 및 FGA (도 30)의 발현이 약간 증가한 것을 발견하였으나, 이러한 증가는 통계적으로 유의하지 않았다.
End1 세포에서, Ect1 세포와 유사하게, LPS 처리는 조절된 배지에서 ECM1 발현이 약간 감소되는 결과를 낳았으나 (도 27), 이러한 감소는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주되었다. 높고 낮은 3가지 용량의 LPS (10μg/ml, 25μg/ml, 50μg/ml) 모두는 End1의 조절된 배지에서 LAMC2 발현을 ~8배 증가시켰다 (도 28). 반면, End1의 조절된 배지 내 GGH (도 29) 및 FGA (도 30)의 발현 수준은 LPS 처리로 하향조절되었다. 표 3 및 4는 LPS 처리 시의 바이오마커의 발현 변화를 요약한 것이다.
24시간 동안의 LPS 처리에 따른 Ect1 내 바이오마커의 발현
Ect1
바이오마커 배수 변화 (10μg/ml LPS) 배수 변화 (25μg/ml LPS) 배수 변화 (50μg/ml LPS)
ECM1 0.87 ± 0.18 0.86* ± 0.05 0.81 ± 0.17
GGH 1.67 ± 0.40 1.42 ± 0.23 1.80 ± 0.52
FGA 1.05 ± 0.15 1.13 ± 0.12 1.19 ± 0.22
LAMC2 5.72* ± 1.44 5.50*± 1.23 5.99 ± 1.86
대조군인 비처리된 세포 대비 배수 변화는 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 결과는 배수 변화 ± SEM으로 나타내었다. *P<0.05.
24시간 동안의 LPS 처리에 따른 End1 내 바이오마커의 발현
End1
바이오마커 배수 변화 (10μg/ml LPS) 배수 변화 (25μg/ml LPS) 배수 변화 (50μg/ml LPS)
ECM1 0.94 ± 0.14 0.87 ± 0.11 0.76 ± 0.11
GGH 0.69 ± 0.15 0.92 ± 0.19 0.76 ± 0.13
FGA 0.90 ± 0.10 0.92 ± 0.15 0.78 ± 0.10
LAMC2 8.25** ± 1.22 8.01** ± 0.90 7.81* ± 1.28
대조군인 비처리된 세포 대비 배수 변화는 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 결과는 배수 변화 ± SEM으로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.005.
참고 문헌
본 발명 및 본 발명이 속하는 기술분야를 충분히 기재하고 개시하기 위해 다수의 공보가 상기에 인용되어있다. 이러한 참고 문헌에 대한 모든 인용은 하기와 같다. 이들 참고 문헌 각각의 전문은 본원에 포함된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
표준 분자 생물학 기술에 대해, 문헌 [Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조.

Claims (15)

  1. 개체(individual)로부터 얻은 샘플 내 바이오마커(biomarker)의 수준을 결정하는 단계, 및 바이오마커의 수준에 기초하여 개체의 조산(preterm birth)의 위험 여부를 예측하는 단계를 포함하며, 상기 바이오마커는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는, 개체의 조산의 위험 여부의 예측 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 샘플은 질액 샘플인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이오마커는 단백질인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준은 기준 수준(reference level)과 비교되며, 상기 기준 수준은 조산 또는 만기 출산을 경험한 것으로 알려진 개체로부터 얻은 샘플 내 바이오마커의 수준으로부터 유래한 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 태아 피브로넥틴 (fFN) 검사, 진통, 질 출혈, 질에서의 체액 누출, 증가된 질 분비물, 요통 및 하복부 경련으로부터 선택되는, 하나 이상의 다른 조산 지표를 사용하여 조산의 위험을 예측하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  6. 조산의 위험이 있는 것으로 예측되는 개체의 치료에 사용하기 위한 프로게스테론으로서, 상기 개체는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 조산의 위험이 있는 것으로 예측되는, 프로게스테론.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 개체 내 조산의 위험을 예측하는 단계, 및 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정되는 경우, 조산의 위험을 감소시키는 치료를 진행하는 단계를 포함하며, 상기 조산의 위험을 감소시키는 치료는 프로게스테론 및/또는 자궁경부 봉합술을 포함하는, 조산의 위험을 감소시키는 치료를 위한 개체를 선택하는 방법.
  8. 개체로부터 얻은 샘플 내 바이오마커의 수준을 결정하는 단계, 및 개체의 치료에 관여하는 의사에게 상기 결정된 수준을 전달하는 단계를 포함하며, 조산의 위험은 샘플 내 바이오마커의 수준에 기초하여 예측되고, 상기 바이오마커는 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 및 LAMC2로부터 선택되는, 개체의 조산의 위험 여부의 예측 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체의 조산의 위험 여부의 예측 방법은 컴퓨터로 구현되는 방법인, 방법.
  10. 하기 단계를 포함하는, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2의 검출 방법:
    (a) 개체로부터 질액 샘플을 얻는 단계;
    (b) 질액 샘플을 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체와 접촉시키고 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2와 상기 항체 간의 결합을 검출함으로써, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 질액 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 단계.
  11. 하기 단계를 포함하는, 개체의 조산의 위험 여부의 결정 방법.
    (a) 개체로부터 샘플을 얻는 단계;
    (b) 샘플을 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체와 접촉시키고 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2와 상기 항체 간의 결합을 검출함으로써, ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
    (c) 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2의 존재가 검출되는 경우 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 샘플은 질액 샘플인, 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, 개체의 조산의 위험을 결정하고 상기 개체의 임신을 연장시키는 방법:
    (a) 개체로부터 샘플을 얻는 단계;
    (b) ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2가 질액 샘플 내에 존재하는지 여부를 검출하는 단계;
    (c) 질액 샘플 내 ECM1, FGA, EFEMP1, GGH, PEDF, PTN 또는 LAMC2의 존재가 검출되는 경우 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정하는 단계;
    (d) 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 경우, 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에게 유효한 양의 프로게스테론을 투여하거나 프로게스테론 또는 그의 유사체, 자궁수축억제제, 코르티코스테로이드, 항생제, NSAID 또는 오메가 3 지방산 또는 그의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 유효한 양의 제제를 이용한 치료를 위한 개체를 선택하는 단계; 및/또는
    (e) 개체가 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 경우 조산의 위험이 있는 것으로 결정된 개체에 자궁경부 봉합술을 수행하거나 자궁경부 봉합술을 위한 개체를 선택하는 단계.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준은 ELISA에 의해 결정되는, 방법.
  15. 항-ECM1, 항-FGA, 항-EFEMP1, 항-GGH, 항-PEDF, 항-PTN 또는 항-LAMC2 항체를 포함하는, 대상체에서의 조산의 위험 또는 가능성의 예측에 사용하기 위한 키트(kit).
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