CN108450003B - 用于预测早产的生物标志物对 - Google Patents

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Abstract

本发明公开提供了分离的生物标志物对，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。还提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值以确定怀孕的雌性动物中的早产概率，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1。

Description

用于预测早产的生物标志物对
本发明申请主张2016年2月3日提交的美国临时专利申请No.62/290,796，2015年12月24日提交的美国临时专利申请No.62/387,420和2015年6月19日提交的美国临时专利申请No.62/182,349的优先权，以上每篇专利的全部内容作为参考并入本文。
本发明一般地涉及精确医学领域，并且更具体地，涉及用于确定怀孕的雌性动物中早产概率的组合物和方法。
发明背景
根据世界卫生组织，每年估计1500万婴儿早产(妊娠第37完整周之前)。根据可靠数据，在几乎所有国家，早产率日益提高。参见，World Health Organization；March ofDimes；The Partnership for Maternal,Newborn&Child Health；Save the Children,Born too soon: the global action report on preterm birth,ISBN 9789241503433(2012)。每年估计有100万婴儿死于早产并发症。就全世界而言，早产是新生儿死亡的主要原因(出生前4周的婴儿)，而第二主要死亡原因是5岁以下儿童中的肺炎。多数存活者面临一生残疾，包括无学习能力以及视觉和听觉问题。
根据可靠数据，在184个国家，早产率在出生婴儿的5％至18％的范围内。Blencowe等人,“National,regional and worldwide estimates of preterm birth.”The Lancet,9；379(9832):2162-72(2012)。尽管超过60％的早产发生在非洲和南亚，但早产仍是全球性问题。早产数最高的国家包括巴西、印度、尼日利亚和美国。在早产率超过15％的11个国家中，除两个国家外，全部处于下撒哈拉非洲。在最穷的国家中，平均地，12％的婴儿出生过早，相比之下，较高收入国家为9％。在国家内，较穷困家庭具有更高的风险。可以通过可行的、成本有效的护理挽救超过3/4的早产婴儿，例如，对具有早产风险的孕妇给予出生前类固醇注射以加强婴儿的肺。
对于死亡和多种健康和发育问题，早产婴儿比足月产婴儿具有更高的风险。并发症包含急性呼吸问题、胃肠问题、免疫学问题、中枢神经系统问题、听觉问题和视觉问题，以及长期运动问题、认知问题、视觉问题、听觉问题、行为问题、社会-情绪问题、健康问题和生长问题。早产婴儿的出生还可以给家庭带来大量情绪和经济成本，并且牵涉公共部门服务，如健康保险、教育及其它社会支持系统。最大的死亡和发病风险是对于那些在最早妊娠期出生的婴儿。然而，较接近足月出生的那些婴儿代表了最多数早产婴儿，并且仍经受了比足月产婴儿更多的并发症。
为了防止小于妊娠24周且超声显示宫颈打开的妇女中的早产，可以使用被称为宫颈环扎的手术程序，其中用稳固的缝合线将宫颈缝合闭合。对于小于妊娠34周并且处于主动早产分娩的妇女，住院治疗可能是必需的并且施用药物暂时停止早产分娩和/或促进胎儿肺发育。如果确定孕妇处于早产风险，则保健供应商可以实施多种临床策略，其可以包括预防性药物治疗，例如，17-α己酸羟孕酮(Makena)注射和/或阴道黄体酮凝胶、宫颈阴道栓剂、限制性生活和/或其它身体活动和改变提高早产风险的慢性病况(如糖尿病和高血压)治疗。
急需鉴别具有早产风险的妇女，并为其提供适当的产前护理。可以对鉴别为高风险的妇女安排更密切的产前监督和预防性干预。当前用于风险评估的策略基于产科史和病史以及临床检查，但是这些策略仅能够鉴别较低比例的处于早产分娩风险的妇女。目前，在先的自发PTB(sPTB)史是后续PTB的单一最强的预测物。一次在先的sPTB之后，第二次PTB的概率为30-50％。其它母体风险因素包括：黑色人种、低母体体质指数和短宫颈长度。预测sPTB的羊膜水、宫颈阴道液和血清生物标志物研究表明在最终早产的妇女中多个分子途径异常。可靠的早期早产风险鉴别法将能够安排适当的监控和临床管理以预防早产分娩。这种监控和管理可以包含：更频繁的产前护理拜访、连续的宫颈长度量测、加强有关早期早产体征和症状的教育、对可改变的风险行为的生活方式干预(如戒烟)、宫颈阴道栓剂和黄体酮治疗。最后，早产风险的可靠产前鉴别法还对监控资源的成本-有效的分配是至关重要的。
尽管对鉴别风险妇女进行了大量研究，但是PTB预测算法仅基于临床和人口因素或使用测量的血清或者阴道生物标志物未导致临床有用的测试。需要在她们首次妊娠期间并且在妊娠足够早的时候鉴别处于风险的妇女的更准确的方法以使得能够进行临床干预。本发明通过提供用于确定孕妇是否处于早产风险的组合物和方法解决了该需求。还提供了相关优势。
发明概述
本发明提供了用于预测怀孕的雌性动物中早产概率的组合物和方法。
本发明提供了选自表26中所述的组的分离的生物标志物。本发明所述的生物标志物可以预测怀孕的雌性动物中早产的风险。在一些实施方式中，所述分离的生物标志物选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3。
本发明提供了选自表26中所述的组的分离的生物标志物的替代肽。在一些实施方式中，所述分离的生物标志物的替代肽选自表26中所述的替代肽组。本发明所述的生物标志物和它们的替代肽可以在预测怀孕的雌性动物中早产风险的方法中使用。在一些实施方式中，所述替代肽对应于选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3的分离的生物标志物。
本发明提供了对应于选自表26中所述的组的替代肽的稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。本发明所述的生物标志物、它们的替代肽和SIS肽可以在预测怀孕的雌性动物中早产风险的方法中使用。在一些实施方式中，所述SIS肽对应于选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3的分离的生物标志物的替代肽。
本发明提供了选自表26中所列的分离的生物标志物的分离的生物标志物对，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间的比值方面显示出变化。
本发明提供了分离的生物标志物对，其选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出比值的变化。
本发明提供了分离的生物标志物对，其选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出比值的变化。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对，其选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对，其选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
在一个实施方式中，本发明提供了包含对应于生物标志物对的替代肽对的组合物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在一个实施方式中，本发明提供了包含对应于生物标志物对的替代肽对的组合物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在具体的实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对IBP4/SHBG，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在其它实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对IBP4/SHBG，其中与足月产对照相比，所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物中显示出更高的比值。
在一个实施方式中，本发明提供了包含对应于生物标志物对IBP4/SHBG的替代肽对的组合物，其中与足月产对照相比，所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物中显示出更高的比值。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对生物标志物的组，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组对来源于每个所述生物标志物的替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对生物标志物的组，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组对来源于每个所述生物标志物的替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中至少一对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中至少一对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中来源于至少两对生物标志物的组的计算得分在怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，其中来源于至少两对生物标志物的组的计算得分在怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出值的变化。在一个实施方式中，所述组合物对每个替代肽包含稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的比值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的比值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中的早产概率包括通过测量选自早产妊娠群组和在出生时具有已知胎龄的足月产妊娠群组中的分离的生物标志物的比值形成概率/风险指数的初始步骤。在其它实施方式中，通过测量早产群组和足月产妊娠群组中IBP4/SHBG的比值形成早产风险指数，其中记录了出生时的胎龄。在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率包括测量IBP4/SHBG的比值，并将该值与使用相同分离和测量技术得出早产风险的指数相比较以得出IBP4/SHBG处于所述指数组中。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在单个生物标志物的相对强度变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中由IBP4和SHBG所组成的生物标志物对的逆转值以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中由IBP4相对于SHBG(IBP4/SHBG)的比值组成的生物标志物对的逆转值以确定怀孕的雌性动物中的早产概率，其中与足月产对照相比，怀孕的雌性动物中较高的比值表示早产风险提高。在其它实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物对IBP4和SHBG的逆转值以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述怀孕的雌性动物的体重指数(BMI)大于22并且小于或等于37kg/m2。在一些实施方式中，所述方法包括获得生物样品的初始步骤。在一些实施方式中，所述方法包括检测、测量或定量每个生物标志物的SIS替代肽。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合所述对的第一成员的第一捕获试剂和特异地结合所述对的第二成员的第二捕获试剂接触，检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中；和检测所述对的第一生物标志物和第一捕获试剂之间以及所述对的第二成员与第二捕获试剂之间的结合。
在一个实施方式中，本发明提供了检测怀孕的雌性动物中IBP4和SHBG的方法，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合IBP4的捕获试剂和特异地结合SHBG的捕获试剂接触，检测IBP4和SHBG是否存在于所述生物样品中；和c.检测IBP4和所述捕获试剂之间以及SHBG和所述捕获试剂之间的结合。在一个实施方式中，所述方法包括测量所述生物标志物对的逆转值。在其它实施方式中，在所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间逆转值的变化的存在指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一个实施方式中，在19至21周胎龄之间获得样品。在其它实施方式中，所述捕获试剂选自抗体、抗体片段、核酸-基蛋白结合试剂、小分子或其变体。在其它实施方式中，通过测定实施所述方法，所述测定选自酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、IBP4/PSG3、IBP4/LYAM1、IBP4/IGF2、CLUS/IBP3、CLUS/IGF2、CLUS/LYAM1、INHBC/PSG3、INHBC/IGF2、PSG2/LYAM1、PSG2/IGF2、PSG2/LYAM1、PEDF/PSG3、PEDF/SHBG、PEDF/LYAM1、CD14/LYAM1和APOC3/LYAM1，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；和b.检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中，其包括对所述样品进行由质谱定量组成的蛋白质组学工作流程。
在一个实施方式中，本发明提供了检测怀孕的雌性动物中IBP4和SHBG的方法，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；和b.检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中，其包括对所述样品进行由质谱定量组成的蛋白质组学工作流程。
在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在单个生物标志物的相对强度变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。在一个实施方式中，通过测量早产群组和足月产妊娠群组中IBP4/SHBG的比值形成早产风险指数，其中记录了出生时的胎龄。然后，在临床实践中，将单个妊娠中所测量的IBP4/SHBG的比值与使用相同分离和测量技术得出早产风险的指数相比较以得出IBP4/SHBG处于所述指数组中。
根据详细说明和权利要求，本发明的其它特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1.抽血窗。显示了整个抽血窗的个体逆转表现。所显示的逆转：IBP4/SHBG；VTNC/VTDB；IBP4/SHBG；VTNC/SHBG；IBP4/SHBG；CATD/SHBG；PSG2/ITIH4；CHL1/ITIH4；PSG2/C1QB；PSG2/FBLN3；HEMO/IBP6；HEMO/PTGDS。
图2.GABD的发现病例、复核病例和验证病例。
图3.妊娠期间的蛋白质表达。基于已知的蛋白质作用并且了解未受早产影响的蛋白质/途径，可以分析多种蛋白质。图3显示了妊娠期间妊娠-相关蛋白的表达。在所显示的胎龄中，这些蛋白质及其网络不受早产病理影响。
图4.妊娠期间的蛋白质表达。图4显示了与胎盘-特异性生长激素有关的图3中所示的图的放大版本。
图5.妊娠期间的蛋白质病理。在抽血窗19-21周中，胰岛素样生长因子结合蛋白4(IBP4)过表达至少10％。在抽血窗19-21周中，性激素结合蛋白(SHBG)低表达至少10％。
图6.复核选择标准。图6显示了实施高性能的临床和分析学稳健的早产测试的标准。
图7.蒙特卡洛交叉验证(MCVV)。MCCV是估计分类器将对从相同群体(例如，PAPR)抽取的样品的独立集进行分类的良好程度的保守方法。
图8.[IBP4]/[SHBG CHL1CLUS]的分析。仅相对于IBP4/SHBG，CHL1和CLUS的表现提高了0.03。
图9.功效和样本容量分析。功效和样本容量分析预测了在样本数阈值和表现估值下足以将研究驱动至拒绝虚无假设(AUC＝0.5)的可能性。
图10.妊娠时钟和分娩时间。在妊娠中升高但在PTB病例和对照中不变的多个分析物可以用于通过生物化学方法确定妊娠时间。生物化学日期可以用于按照末次经期时间或超声日期，或者在sPTB风险、TTB或GAB预测的后续确定之前的时间进行日期确认。
图11.分类器开发。图11显示了开发分类器的标准。
图12.发现测定中的途径覆盖度。图12显示了通过途径的蛋白质分布。
图13.发现数据的PCA检测了整个抽血窗期间的变化，并因此表明高度的多路测定对胎龄灵敏。
图14.发现样品中测量的蛋白质的分级聚类。
图15.大群集内的胎盘特异性蛋白分枝。右侧小图列出了Thompson确认的妊娠期间表达的基因模块，而左侧小图显示发现血清-蛋白质组学测定再现了该模块的相关表达。(Thompson等人,Genome Res.12(10):1517-1522(2002)。
图16.失调的蛋白质PreTRMTM样品。
图17.突出显示的性激素结合蛋白(SHGB)的生物学。在胎盘细胞中表达SHBG(右图)。SHBG可能负责控制胎盘胎儿区室中游离的睾酮水平和雌激素水平(左图)。
图18.IBP4、IGF2、PAPP-A和PRG2的相互作用。IBP4是IGF2的负调节因子。通过PAPPA介导的蛋白水解，IBP4不与IGF2作用。低水平的PAPPA已涉及了IUGR和PE。升高的IBP4水平是抑制的IGF2活性的指示。PTB病例具有抑制的PAPPA、PRG2水平和升高的IBP4水平。
图19.胰岛素样生长因子结合蛋白4(IBP4)。IBP4在PTB病例中上调。在妊娠早期，IGF2刺激增殖、分化和EVT的侵袭。IGF活性是正常胎盘形成和胎儿生长所必不可少的。IBP4介导母体-胎儿连接处IGF2活性的自分泌和旁分泌控制。细胞滋养层表达的IGF2的活性受蜕膜细胞产生的IBP的平衡。在第一个三个月中升高的IBP4和降低的IGF2与胎盘功能障碍有关(例如，IUGR/SGA)。
图20.对于IBP4、SHBG和CHL1，MS vs ELISA的相关性。对于重要分析物，质谱和ELISA一致性良好。两个互不相关的平台的一致性确定了分析物测量的可靠性。
图21.来自19-21周GABD的发现样品中IBP4/SHBG的PTB分类。将妊娠19-21周的发现样品分为高和低BMI。由于较低的SHBG值，在高BMI分类中，IBP4/SHBG的逆转值较高。在低BMI中，病例和对照的分离较大。
图22.低BMI时，PTB病例中抑制的SHBG水平。PAPR受试者中SHBG血清水平在整个GABD的线性拟合。SHBG水平受高BMI的抑制。在整个妊娠期间，SHBG水平升高。低BMI时，PTB病例具有降低的SHBG水平，而该水平在整个妊娠期间加速升高。
图23总结了PAPR中研究受试者的分布。
图24显示了使用IBP4/SHBG预测因子分类BMI划分的验证样本组的ROC曲线和相应AUC值。
图25显示了发病率调节的阳性预测值(PPV)，它是作为预测因子得分的函数的临床风险测量。预测因子得分和PPV的计算关系使得能够确定任何未知受试者的sPTB风险概率。风险曲线图之下最上方(紫色)的线对应于GAB<35 0/7周；从上数第二条线(红色)对应于35 0/7至37 0/7/周之间的GAB；从上数第三条线(绿色)对应于37 0/7至39 0/7/周之间的GAB；从上数第四条线(蓝色)对应于GAB≥GAB 39 0/7周。
图26显示了Kaplan Meier分析中作为事件的高和低风险组的分娩率。高和低风险定义为高于或低于来自图25中数据的平均人口sPTB风险(＝14.6％)的2×的相对风险。
图27显示了使用来自最优BMI和GA间隔内的盲式复核和验证分析的受试者组合，对应于预测因子表现的ROC曲线。组合样品的ROC曲线对应于0.72的AUROC(p＝0.013)
图28显示在重叠的3周GA间隔中44种蛋白上调或下调并且通过了分析过滤器。
图29显示在19 0/7至21 6/7的间隔中，整体表现最好的逆转IBP4/SHBG具有AUROC＝0.74。
图30显示得自2,000个自举迭代的平均AUROC为0.76。复核样本中盲式IBP4/SHBGAUROC表现对所有受试者和BMI划分的受试者分别为0.77和0.79，这与发现中所得的表现良好一致。在盲式复核后，将发现和复核样本混合用于自举表现确定。
图31显示了通过MS vs ELISA得分值所得出的sPTB病例vs对照的分离
图32显示了无BMI限制的情况下的免疫测定相对于MS ROC分析。
图33显示了对于BMI大于22并且小于或等于37，免疫测定相对于MS ROC分析。
图34显示了对于BMI划分的受试者(左侧小图)和所有受试者(右侧小图)，在GABD133-146内，MS和ELISA所得的IBP4/SHBG得分值之间的相关性。
图35显示了对照和病例(BMI划分)的ELISA和MS分离
图36显示了对照和病例(所有BMI)的ELISA和MS分离
图37显示了通过Abbott Architect CMIA(半自动化免疫测定仪)和血清预测蛋白质组学分析法(Sera Prognostics'proteomic analysis method)(包括样品的免疫消耗、酶促消化和在Agilent 6490质谱仪上的分析)的SHBG测量的比较。
图38显示了通过Roche cobas e602分析仪(半自动化免疫测定仪)和血清预测蛋白质组学分析法(Sera Prognostics'proteomic analysis method)(包括样品的免疫消耗、酶促消化和在Agilent 6490质谱仪上的分析)的SHBG测量的比较。
图39显示了通过Abbott Architect CMIA和Roche cobas e602分析仪(两者均为半自动化免疫测定仪)的SHBG测量比较。
图40显示了IBP4蛋白最长的同工型(Uniprot：P22692)的域和结构特征。IBP4QCHPALDGQR(aa,214-223)肽(SEQ ID NO:2)位于甲状球蛋白1型域内。IBP4在残基125处具有单一的N-连接的糖基化位点。
图41突出显示了两个IBP4同工型(按出现顺序分别为SEQ ID NOS 158和159)中QCHPALDGQR肽(SEQ ID NO:2)的位置。
图42显示了SHBG蛋白最长的同工型(Uniprot：P04278)的域和结构特征。SHBGIALGGLLFPASNLR(aa，170-183)肽(SEQ ID NO:18)位于第一个Lamin G-样域中。SHBG具有三个糖基化位点；残基380和396处的两个N-连接的位点；残基36处的一个O-连接的位点。
图43突出显示了SHBG的7个同工型(按出现顺序分别为SEQ ID NO：160、160、160、160、160、160和161)内的外显子4中的IALGGLLFPASNLR肽(SEQ ID NO:18)的位置。
图44显示了在整个抽血时胎龄(GABD)中，单独对于sPTB病例和足月产对照的IBP4水平的平均响应比。使用滑动的10天窗口，通过平滑处理分析交叉分组(Cross sectional)的发现数据。相对于对照信号的病例对应于最大约10％的差异。
图45显示了在整个抽血时胎龄(GABD)中，单独对于sPTB病例和足月产对照的SHBG水平的平均响应比。使用滑动的10天窗口，通过平滑处理分析交叉分组(Cross sectional)的发现数据。相对于对照信号的病例对应于最大约10％的差异。
图46显示了在整个抽血时胎龄(GABD)中，单独对于sPTB病例和足月产对照的IBP4/SHBG预测因子得分。使用滑动的10天窗口，通过平滑处理分析交叉分组(Crosssectional)的发现数据。与单个分析物信号中约10％的差异相比(图45和46)，两条曲线之间的最大差异对应于约20％的差异。这些数据显示了通过使用IBP4/SHBG逆转策略获得的诊断信号的放大。
图47显示了由于多种不同逆转的形成所引起的诊断信号放大。为了研究逆转的形成一般是否会放大诊断信号，我们检验了通过ROC分析由多种不同蛋白所形成的逆转的诊断表现。顶部小图中显示了使用来自在19/0周至21/6周妊娠之间收集的样品的数据组的AUC值的范围(sPTB病例相对于足月产对照)。附近的箱图显示了用于形成相关逆转的单个上调和下调蛋白的ROC表现的范围。类似地，下部小图显示了来源于Wilcoxon检验(sPTB病例相对于足月产对照)的逆转的p-值比相应单个蛋白的p-值更显著。
图48显示了单个IBP4和SHBG响应比的测量以及所计算的相应逆转得分的分析变异系数(CV)。在多个批次中并且在若干天内分析了来自无生物学差异的怀孕供体的混合对照血清样品(pHGS)。逆转变异小于与单个蛋白有关的变异。这些数据表明对于样品的实验室处理期间发生的分析变异，形成了逆转对照。分析变异不是生物学现象。
图49显示了多种逆转和它们单个的上调和下调蛋白的分析CV。为了研究逆转形成一般是否会放大诊断信号，我们检验了由多种蛋白的比值所形成的高性能逆转(AUC>0.6)的ROC表现(AUC)。顶部小图中显示了使用来自在19/0周至21/6周妊娠之间收集的样品的数据组的AUC值的范围(sPTB病例相对于足月产对照)。附近的箱图显示了用于形成相关逆转的单个上调和下调蛋白的ROC表现的范围。类似地，来源于Wilcoxon检验(sPTB病例相对于足月产对照)的逆转的p值比相应单个蛋白的p值更显著。
图50显示了相对于其它指征，注释为医学上指明为子痫前期的受试者的PreTRMTM得分比较。
图51显示了验证样品组(22<BMI<＝37)中IBP4/SHBG预测因子表现的量度的表。使用不同的边界相对于对照(大于截止值)定义病例(小于截止值)，确定了预测因子的灵敏度、特异性、ROC曲线下面积(AUC)和优势率。
图52显示了具有糖尿病注释的逆转强度的热图。红色箭头显示糖尿病病例。底部列出了样本，其中PTB病例在屏幕右侧，足月产在屏幕左侧。糖尿病患者聚集在右侧，其显示有可能根据生物标志物建立诊断测试以预测妊娠期糖尿病。
图53显示了分析物响应比的分级聚类。
图54显示了在胞外基质相互作用中起作用的差异表达的蛋白质。
图55显示了在18周显示出最大分离的在IGF-2途径中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图56A显示了影响这些蛋白质在sPTB中的生物利用率的IGF-2、IBP4、PAPP1和PRG2蛋白之间的相互作用；56B显示了通过结合至IR-B的胰岛素和通过结合至IR-A或IGF1R中任一个的胰岛素和IGF优先激活的胞内信号的示意图。
图57显示了在代谢激素平衡中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图58显示了在血管生成中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图59显示了在先天免疫中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图60显示了在凝血中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图61显示了差异表达的血清/分泌的蛋白的动力学图。
图62显示了差异表达的PSGs/IBPs的动力学图。
图63显示了差异表达的ECM/细胞表面蛋白的动力学图。
图64显示了差异表达的补体/急性期蛋白-1的动力学图。
图65显示了差异表达的补体/急性期蛋白-2的动力学图。
图66显示了差异表达的补体/急性期蛋白-3的动力学图。
图67显示了差异表达的补体/急性期蛋白-4的动力学图。
图68显示了通过来自17周0天至28周6天的抽血期胎龄(GABD)的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图69显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图70显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图71显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图72显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图73显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图74显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图75显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图76显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图77显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图78显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图79显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图80显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图81显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图82显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图83显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图84显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至I中指明的分析物的动力学图。
图85显示了通过来自17周0天至28周6天的GABD的数据，小图A至G中指明的肽转化的动力学图。
图86显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图87显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图88显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图89显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图90显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图91显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图92显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图93显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图94显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图95显示了使用<37 0/7相对于>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至C中指明的肽转化的动力学图。
图96显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图97显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图98显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图99显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图100显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图101显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图102显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图103显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图104显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至I中指明的肽转化的动力学图。
图105显示了使用<35 0/7相对于>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值，小图A至C中指明的肽转化的动力学图。
图106分别显示sPTB病例和对照中IBP4和SHBG的水平以及IBP4/SHBG的逆转值。
图107显示了使用商品化ELISA试剂盒和MS-MRM的MSD结果的相关性。
图108提供了显示在非PPROM的早产(PTL)中，在19-20周具有良好表现的逆转实例的箱图。
图109提供了显示在早产胎膜早破(PPROM)中，在19-20周具有良好表现的逆转实例的箱图。
图110是使用<37 0/7周相对于>＝37 0/7周妊娠的截止值，显示预测因子得分(lnIBP4/SHBG)和发病率调节的sPTB相对风险(阳性预测值)之间关系的风险曲线。风险曲线图之下最上方(紫色)的线对应于sPTB(GAB<35周)；从上数第二条线(红色)对应于sPTB(35≤GAB≤37周)；从上数第三条线(绿色)对应于足月产(37≤GAB≤39周)；从上数第四条线(蓝色)对应于足月产(39周≤GAB)。
图111是使用<35 0/7周相对于>＝35 0/7周妊娠的截止值，显示预测因子得分(lnIBP4/SHBG)和发病率调节的sPTB相对风险(阳性预测值)之间关系的风险曲线。风险曲线图之下最上方(紫色)的线对应于sPTB(GAB<35周)；从上数第二条线(红色)对应于sPTB(35≤GAB≤37周)；从上数第三条线(绿色)对应于足月产(37≤GAB≤39周)；从上数第四条线(蓝色)对应于足月产(39周≤GAB)。
发明详述
本发明公开一般地基于以下发现：相对于对照，得自怀孕的雌性动物的生物样品中某些蛋白质和肽在具有高早产风险的怀孕的雌性动物中差异表达。本发明公开还具体地部分基于以下意外发现：可以在确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法中高灵敏度和高特异性地使用本文所公开的生物标志物对的逆转值。本文作为比值和/或逆转对的组分所公开的蛋白质和肽在具有PTB风险的怀孕的雌性动物中以比值、逆转对单独或以生物标志物/逆转对的组的形式用作用于对测试样品分类、预测早产概率、预测足月产概率、预测出生时胎龄(GAB)、预测分娩时间(TTB)和/或监控预防疗法发展的生物标志物。逆转值是上调生物标志物的相对峰面积与下调生物标志物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。本发明部分在于当组对在一起时，可以基于逆转值预测早产概率的特定生物标志物的选择。因此，选择一旦配对，在本发明潜在的新型逆转中具有信息型的特异性生物标志物是人为的创造性。
术语“逆转值”(reversal value)是指上调分析物的相对峰面积与下调分析物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。在狭窄窗内所有可能的逆转中，可以基于各个单变量的表现来选择亚组。如本文所公开的，在本文中被称为逆转值的上调生物标志物的相对峰面积与下调生物标志物的相对峰面积的比值可以在怀孕的雌性动物中用于鉴别稳健且准确的分类器并预测早产概率、预测足月产概率、预测出生时胎龄(GAB)、预测分娩时间和/或监控预防疗法的进展。因此，本发明部分基于生物标志物对的鉴别，其中生物标志物对的相对表达逆转，其在PTB和非PTB之间的逆转值显示出变化。在本文所公开的方法中，生物标志物比值的使用修正了从怀孕的雌性动物中除去生物样品后作为人为调节的结果的差异度。这种差异度可以在(例如)用于测量样品中存在的生物标志物的方法的样品采集、处理、消耗、消化或任何其它步骤期间引入，并且所述差异度与生物标志物在本质上的表现无关。因此，本发明一般地包括了在诊断或预后方法中逆转对的使用以减少差异度和/或扩大、归一化诊断信号或使其清晰。
尽管术语逆转值是指上调分析物的相对峰面积相对于下调分析物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号，但是还考虑了可以通过任何其它方式，例如，通过相对峰面积的减法、加法或乘法来测量本发明的生物标志物对。本文所公开的方法涵盖了通过这些其它方式的生物标志物对的测量。
该方法是有利的，这是因为它提供了最简单的可能的分类器，该分类器独立于数据归一化，有助于避免过度拟合并且导致产生了易于在诊所中实施的非常简单的实验测试。基于独立于数据归一化的逆转值变化的标志物对的使用使得能够开发本文所公开的临床相关的生物标志物。由于任何单一蛋白的定量受到由测量差异度、正常波动和基线表达中单个相关变化所引起的不确定性的影响，因此可以处于协调、系统控制下的标志物对的鉴别使得能够获得用于个体诊断和预后的稳健方法。
本发明公开提供了用于确定怀孕的雌性动物中早产概率的生物标志物逆转对和相关的逆转对的组、方法和试剂盒。本发明公开的一个主要优势在于可以在妊娠早期评价发展早产的风险，从而可以以及时的方式起始适当的监控和临床管理以预防早产分娩。本发明对于缺少任何早产风险因素和将不会被鉴别和治疗的雌性动物是特别有用的。
举例来说，本发明公开包括通过获得与样品有关的数据组来产生在确定怀孕的雌性动物中早产概率中有用的结果的方法，其中所述数据组至少包括有关已鉴别为显示出指示早产的逆转值变化的生物标志物对的相对表达的定量数据，和将所述数据组输入至使用所述数据组产生在确定怀孕的雌性动物中早产概率中有用的结果的分析方法。如以下进一步描述的，定量数据可以包括氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸、核苷、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合。
除了通过(例如)公众数据库中的登录号、序列或参考在本发明公开中鉴别的具体的生物标志物外，本发明还考虑了与所举例说明的序列具有至少90％或至少95％或至少97％的同一性并且是现在已知或随后将发现的并且对本发明所述的方法有用的生物标志物变体的使用。这些变体可以代表多态性、剪接变体、突变等。在这点上，本说明书在本发明的背景下公开了多种本领域已知的蛋白质并且提供了与一个或多个公共数据库有关的示例性登录号以及与这些本领域已知的蛋白质有关的发表的期刊论文的示例性参考文献。然而，本领域技术人员认识到可以容易地鉴别其它登录号和期刊论文，它们可以提供所公开的生物标志物的其它特征并且举例说明的参考文献绝不是对所公开的生物标志物的限制。如本文所述，多种技术和试剂在本发明所述的方法中是有用的。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水、阴道分泌物、唾液和尿。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。如本文所述，可以通过本领域中已知的多种测定和技术检测生物标志物。如本文进一步所述的，这些测定无限制地包括基于质谱(MS)的测定、基于抗体的测定以及将两种方法的方面结合的测定。
作为本文所述的逆转对的组分的蛋白生物标志物包括(例如)胰岛素样生长因子结合蛋白4(IBP4)、性激素结合蛋白(SHBG)、玻连蛋白(VTNC)、组特异性组分(维生素D结合蛋白)(VTDB)、组织蛋白酶D(溶酶体天冬氨酰蛋白酶)(CATD)、妊娠特异性β-1-糖蛋白2(PSG2)、内源性-α-胰蛋白酶抑制剂重链家族，成员4(ITIH4)、细胞粘附分子L1-样蛋白(CHL1)、补体组分1、Q亚组分、B链(C1QB)、腓骨蛋白3(FBLN3)、血液结合素(HEMO或HPX)、胰岛素样生长因子结合蛋白6(IBP6)、前列腺素D2合酶21kDa(PTGDS)。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自附图和表，包括图1中的任一个中所列的那些对。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4、HPX/PTGDS。
本发明提供了选自表26中所述的组的分离的生物标志物。本发明所述的生物标志物可以预测怀孕的雌性动物中早产的风险。在一些实施方式中，所述分离的生物标志物选自IBP4、SHBG、VTNC、VTDB、CATD、PSG2、ITIH4、CHL1、C1QB、FBLN3、HPX和PTGDS。在一些实施方式中，所述分离的生物标志物选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3。
本发明提供了选自表26中所述的组的分离的生物标志物的替代肽。在一些实施方式中，所述分离的生物标志物的替代肽选自表26中所述的替代肽组。本发明所述的生物标志物和它们的替代肽可以在预测怀孕的雌性动物中早产风险的方法中使用。在一些实施方式中，所述替代肽对应于分离的生物标志物，其选自IBP4、SHBG、VTNC、VTDB、CATD、PSG2、ITIH4、CHL1、C1QB、FBLN3、HPX和PTGDS。在一些实施方式中，所述替代肽对应于选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3的分离的生物标志物。
本发明提供了对应于选自表26中所述的组的替代肽的稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。本发明所述的生物标志物、它们的替代肽和SIS肽可以在预测怀孕的雌性动物中早产风险的方法中使用。在一些实施方式中，所述SIS肽对应于所述分离的生物标志物的替代肽，其选自IBP4、SHBG、VTNC、VTDB、CATD、PSG2、ITIH4、CHL1、C1QB、FBLN3、HPX和PTGDS。在一些实施方式中，所述SIS肽对应于选自IBP4、SHBG、PSG3、LYAM1、IGF2、CLUS、IBP3、INHBC、PSG2、PEDF、CD14和APOC3的分离的生物标志物的替代肽。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对IBP4/SHBG，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在其它实施方式中，本发明提供了分离的生物标志物对IBP4/SHBG，其中与足月产对照相比，所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物中显示出更高的比值。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG和CATD/SHBG以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，在GABD的19至21周之间获得样品。在其它实施方式中，在GABD的19至22周之间获得样品。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中IBP4/SHBG的逆转值以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，在GABD的19至21周之间获得样品。在其它实施方式中，在GABD的19至22周之间获得样品。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4、HPX/PTGDS以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，其中所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间逆转值的变化的存在确定了怀孕的雌性动物中的早产概率。在其它实施方式中，在GABD的19至21周之间获得样品。在其它实施方式中，在GABD的19至22周之间获得样品。
本发明的实施方式内包括了确定怀孕的雌性动物中早产概率的迭代方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4、HPX/PTGDS和选自本文所述和/或举例说明的蛋白的任何其它生物标志物对以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，其中所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间逆转值变化的存在确定了所述怀孕的雌性动物中的早产概率。本文所述方法的迭代表现包括得子单一样品的后续测量以及获得用于测量的后续样品。例如，如果确定怀孕的雌性动物中早产概率(其可以表示为风险得分)高于给定值，则可以使用来自相同样品的不同逆转对或者来自后续样品的相同或不同的逆转对来重复所述方法以进一步划分sPTB的风险。
除特异性生物标志物之外，本发明公开还包括与举例说明的序列具有约90％、约95％或约97％的同一性的生物标志物变体。如本文所使用的，变体包括多态性、剪接变体、突变等。尽管参考蛋白生物标志物进行描述，但是可以在蛋白或基因表达水平鉴别生物标志物对的逆转值变化。
其它标志物可以选自一种或多种风险指征，其包括(但不限于)母体特性、病史、过往妊娠史和婚育史。这些其它标志物可以包括(例如)先前的低出生体重或早产分娩、多次在第2个三个月中自发性流产、先前在第1个三个月中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未孕、胎盘异常、宫颈和子宫异常、宫颈长度量测短、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infant sex)、身材矮小、低妊娠前体重、体重指数低或高、糖尿病、高血压、泌尿生殖器感染(即尿路感染)、哮喘、焦虑症和抑郁症、哮喘、高血压、甲状腺机能减退。早产的人口统计学风险指征可以包括(例如)母体年龄、种族/种族(race/ethnicity)、单身婚姻状况、社会经济地位低、母体年龄、职业相关身体活动、职业性曝露以及环境暴露和压力。其它风险指征可以包括产前护理不足、吸烟、使用大麻及其它非法毒品、可卡因使用、饮酒、咖啡因摄入、母体体重增加、饮食摄入、妊娠晚期的性活动以及业余时间的身体活动。(Preterm Birth:Causes,Consequences,and Prevention,Institute of Medicine(US)Committee on Understanding Premature Birth andAssuring Healthy Outcomes；Behrman RE,Butler AS主编,Washington(DC):NationalAcademies Press(US)；2007)。可以使用本领域中已知的学习算法鉴别对作为标志物有用的其它风险指征，所述学习算法如线性差别分析、支持向量机分类、回归特征消去、微阵列的预测分析、逻辑回归、CART、FlexTree、LART、随机森林、MART和/或存活分析回归，它们是本领域技术人员已知的并且在本文中进一步得到说明。
应注意除非上下文中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形成的“一个”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“生物标志物”的提及包括两种或更多种生物标志物的混合物等。
具体地，与给定量有关的术语“约”表示包括正或负5％的偏差。
除非内容中明确规定，否则如包括所附权利要求在内的本发明申请中所使用的，单数形式的“一个”和“所述”包括复数参考并且与“至少一个”和“一个或多个”是可互换使用的。
如本文所使用的，术语“包含”、“包括”、“含有”及其任何变化形式旨在覆盖非排他包含物，从而包含、包括或含有元素或元素表的工艺、方法、方法限定的产品或物质组合物不仅仅包括那些元素，而且可以包括未明确列出的或非这些工艺、方法、方法限定的产品或物质组合物固有的其他元素。
如本文所使用的，术语“组”是指包含一个或多个生物标志物的组合物，如阵列或集合。该术语还可以表示本文所述的一种或多种生物标志物的表达类型的谱图或指数。用于生物标志物组的生物标志物的数目基于生物标志物值的特定组合的灵敏度和特异性值。
如本文所使用的并且除非另作说明，否则术语“分离的”和“纯化的”通常描述已从其天然环境(例如，如果它是天然存在的，自然环境)中除去并因此通过人手从其自然状态改变，从而在结构、功能和性质中的至少一个中具有显著不同特征的物质组合物。分离的蛋白或核酸不同于它在自然界中存在的方式并且包括合成的肽和蛋白。
术语“生物标志物”是指生物分子或生物分子片段，其变化和/或检测可以与特定身体状况或状态相关。术语“标志物”和“生物标志物”在整个发明公开中可互换使用。例如，本发明的生物标志物与早产可能性提高有关。这些生物标志物包括任何适合的分析物，但不局限于生物分子，包括核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢产物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂肪、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的感兴趣区及其组合(例如，糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还包括生物分子的部分或片段，例如，包含至少5个连续的氨基酸残基、至少6个连续的氨基酸残基、至少7个连续的氨基酸残基、至少8个连续的氨基酸残基、至少9个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少11个连续的氨基酸残基、至少12个连续的氨基酸残基、至少13个连续的氨基酸残基、至少14个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少5个连续的氨基酸残基、至少16个连续的氨基酸残基、至少17个连续的氨基酸残基、至少18个连续的氨基酸残基、至少19个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少21个连续的氨基酸残基、至少22个连续的氨基酸残基、至少23个连续的氨基酸残基、至少24个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基或更多个连续的氨基酸残基的蛋白质或多肽的肽片段。
如本文所使用的，术语“替代肽”是指在MRM测定配置中选择用作所关心的生物标志物定量的替代物的肽。替代肽的定量最好使用稳定同位素标记的标准替代肽(“SIS替代肽”或者“SIS肽”)结合MRM检测技术实现。替代肽可以是合成的。可以合成在肽的C-末端具有重标记，例如，具有精氨酸或赖氨酸或任何其它氨基酸的SIS替代肽以用作MRM测定中的内标。SIS替代肽不是天然存在的肽并且与其天然存在的对应物相比具有显著不同的结构和性质。
在一些实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的比值以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4、HPX/PTGDS，其中怀孕的雌性动物和足月产对照之间比值变化的存在确定了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述比值可以包括分子中上调的蛋白质、分母中下调的蛋白质或两者。例如，如本文所举例说明的，IBP4/SHBG是分子中上调的蛋白质和分母中下调的蛋白质，其在本文中被定义为“逆转”。在其中所述比值包括分子中上调的蛋白质或分母中下调的蛋白质的情况下，上调的蛋白质将用于归一化(例如，减少分析前或分析差异度)。在比值为“逆转”的具体情况下，放大和归一化两者均可能。应理解本发明所述的方法不局限于逆转亚组，而且还涵盖生物标志物的比值。
如本文所使用的，术语“逆转”是指上调分析物的测量值与下调分析物的测量值的比值。在一些实施方式中，分析物的值本身就是内源分析物的峰值面积与相应稳定同位素标准分析物的峰值面积的比值，这在本文中称为：响应比或相对比。
如本文所使用的，术语“逆转对”是指在相比较的类别之间显示出值的变化的成对的生物标志物。蛋白质浓度或基因表达水平中逆转的检测消除了对数据归一化或者群体宽的阈值的建立的需要。在一些实施方式中，所述逆转对是分离的生物标志物对IBP4/SHBG，其中所述逆转对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在其它实施方式中，与足月产对照相比，所述逆转对IBP4/SHBG在具有早产风险的怀孕的雌性动物中显示出更高的比值。在任何逆转对的定义内涵盖了其中单个生物标志物在分子和分母之间切换的相应的逆转对。本领域技术人员将理解对于其预测能力，这种相应的逆转对具有同样的信息性。
术语“逆转值”是指上调分析物的相对峰面积与下调分析物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。在狭窄窗内所有可能的逆转中，可以基于各个单变量的表现来选择亚组。如本文所公开的，在本文中被称为逆转值的上调生物标志物的相对峰面积与下调生物标志物的相对峰面积的比值可以在怀孕的雌性动物中用于鉴别稳健且准确的分类器并预测早产概率、预测足月产概率、预测出生时胎龄(GAB)、预测分娩时间和/或监控预防疗法的进展。
这种逆转方法是有利的，这是因为它提供了最简单的可能的分类器，该分类器独立于数据归一化，有助于避免过度拟合并且导致产生了易于在诊所中实施的非常简单的实验测试。如本文所述的独立于数据归一化的基于逆转的生物标志物对作为鉴别临床相关PTB生物标志物的方法的使用具有巨大能力。由于任何单一蛋白的定量受到由测量差异度、正常波动和基线表达中单个相关变化所引起的不确定性的影响，因此可以处于协调、系统控制下的标志物对的鉴别应证明对于个体诊断和预后是更稳健的。
本发明提供了包含分离的生物标志物对的组合物，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。在一个实施方式中，所述组合物包含来源于每个所述生物标志物的替代肽的稳定同位素标记的标准肽(SIS肽)。
在具体的实施方式中，本发明提供了由IBP4和SHBG组成的分离的生物标志物对，其中所述对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
IBP4是负调控胰岛素样生长因子IGF1和IGF2的胰岛素样生长因子结合蛋白(IBP)家族的成员(Forbes等人,Insulin-like growth factor I and II regulate the lifecycle of trophoblast in the developing human placenta.Am J Physiol,CellPhysiol.2008；294(6):C1313–22)。IBP4是由合胞体滋养层表达的(Crosley等人,IGFBP-4and-5are expressed in first-trimester villi and differentially regulate themigration of HTR-8/SVneo cells.Reprod Biol Endocrinol.2014；12(1):123)并且是绒毛外滋养母细胞所表达的主要IBP(Qiu等人,Significance of IGFBP-4in thedevelopment of fetal growth restriction.J Clin Endocrinol Metab.2012；97(8):E1429–39)。与足月产妊娠相比，早期妊娠中母体IBP4水平在并发胎儿生长受限和子痫前期的妊娠中较高。(Qiu等人,同上,2012)。
SHBG调控生物学活性的未结合的甾体激素的可用度。Hammond GL.Diverse rolesfor sex hormone-binding globulin in reproduction.Biol Reprod.2011；85(3):431–41。在妊娠期间，血浆SHBG水平提高5-10倍(Anderson DC.Sex-hormone-bindingglobulin.Clin Endocrinol(Oxf).1974；3(1):69–96)并且存在肝外表达，包括胎盘滋养层细胞表达的迹象。(Larrea等人.Evidence that human placenta is a site of sexhormone-binding globulin gene expression.J Steroid Biochem Mol Biol.1993；46(4):497–505)。生理学上，SHBG水平与甘油三酯、胰岛素水平和BMI负相关。(Simó等人,Novel insights in SHBG regulation and clinical implications.Trends EndocrinolMetab.2015；26(7):376–83)。BMI对SHBG水平的影响可以部分解释通过BMI划分的改善的预测表现。
羊膜内感染和炎症已与PTB相关，如其具有提高的促炎细胞因子，包括TNF-α和IL1-β的水平。(Mendelson CR.Minireview:fetal-maternal hormonal signaling inpregnancy and labor.Mol Endocrinol.2009；23(7):947–54；Gomez-Lopez等人,Immunecells in term and preterm labor.Cell Mol Immunol.2014；11(6):571–81)。肝中SHBG转录受IL1-β和NF-kB介导的TNF-α信号传导的抑制(Simó等人,Novel insights in SHBGregulation and clinical implications.Trends Endocrinol Metab.2015；26(7):376–83)，这是参与正常和异常分娩起始的途径(Lindstm TM,Bennett PR.The role ofnuclear factor kappa B in human labour.Reproduction.2005；130(5):569–81)。注定发生sPTB的妇女中较低的SHBG水平可以是感染和/或炎症的结果。因此，对于对上游炎症信号响应的胎盘-胎儿单元中雄激素和雌激素作用的控制，SHBG可以是重要的。
在一个实施方式中，本发明提供了包含对应于生物标志物对的替代肽对的组合物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对生物标志物的组，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
在其它实施方式中，本发明提供了至少两对替代肽的组，所述每对替代肽对应于一对生物标志物，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，其中每对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。
在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在逆转值变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。
在一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表1至77和图1至111中任一个中所列的生物标志物以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。
在其它实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表27至59、61至72、76至77中所指明的生物标志物对以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。
在其它实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少一对生物标志物的逆转值，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表26中所列的生物标志物以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。
在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表1至77和图1至111中任一个中所指明的生物标志物对以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在逆转值变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。
在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表27至59、61至72、76至77中所指明的生物标志物对以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在逆转值变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。
在另一个实施方式中，本发明提供了确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法，所述方法包括在得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中测量至少两对生物标志物的组的逆转值的变化，所述生物标志物对选自怀孕的雌性动物中表26中所指明的生物标志物以确定怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述逆转值显示在怀孕的雌性动物和足月产对照之间存在逆转值变化并且其指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一些实施方式中，所述测量步骤包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中生物标志物的替代肽。
对于针对预测分娩时间的方法，应理解“分娩”是指有或没有羊膜破裂的情况下，自发分娩发作后的分娩。
尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法进行描述和举例说明，但是本发明公开类似地适用于预测出生时胎龄(GAB)的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间(TTB)的方法。对于本领域技术人员显而易见的是出于对母体-胎儿健康的考虑，上述方法中的每一个具有具体和大量的应用和益处。
此外，尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法进行描述和举例说明，但是本发明公开类似地适用于预测异常葡萄糖测试、妊娠期糖尿病、高血压、子痫前期、宫内生长受限、死产、胎儿生长受限、HELLP综合征、羊水过少、绒毛膜羊膜炎、绒毛膜羊膜炎、前置胎盘、胎盘增生、破裂、胎盘早期剥离、胎盘出血、早产胎膜早破、早产、宫颈不良、过期妊娠、胆石病、子宫过度膨胀、紧张。如以下更详细说明的，基于病况，如(例如)子痫前期或妊娠期糖尿病，本文所述的分类器对医学上指明的PTB的组分敏感。
在一些实施方式中，本发明公开提供了通过使用ITIH4/CSH在本文中举例说明的生物标志物、生物标志物对和/或逆转，所述ITIH4/CSH是分娩时间(TTB)的强预测因子(图10)。TTB定义为GABD和出生时胎龄(GAB)之间的差异。该发现使得能够单独或以TTB或GAB的这些分析物的数学组合进行预测。根据本发明所述的方法，缺少病例相对于对照的差异，但是表明妊娠期间分析物强度变化的分析物在妊娠时钟中是有用的。可能不是早产或其它病症的诊断的多个分析物的标定可以用于确定妊娠时间。这种妊娠时钟对通过另一种测量(例如，末次经期的日期和/或超声日期)的日期确认是有价值的，或者单独对随后且更准确预测(例如)sPTB、GAB或TTB是有用的。这些分析物在本文中还称为“时钟蛋白质”，其可以在没有其它确定日期的方法的情况下或者与其它确定日期的方法结合用于确定妊娠日期。表60提供了在本发明的预测TTB和GAB的妊娠时钟中有用的时钟蛋白质列表。
在其它实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法还包括检测与早产有关的一种或多种风险指征的可测量特征。在其它实施方式中，所述风险征候选自先前的低出生体重或早产分娩、多次在第2个三个月中自发性流产、先前在第1个三个月中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未产妇、受孕、初孕妇、经产孕妇、胎盘异常、宫颈和子宫异常、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infantsex)、身材矮小、低妊娠前体重、体重指数低或高、糖尿病、高血压和泌尿生殖器感染。
“可测量特征”是可以确定并且与受试者中早产概率相关的任何性质、特性或方面。术语还包括可以确定并且与GAB的预测、足月产的预测或怀孕的雌性动物中生产时间的预测有关的任何性质、特性或方面。对于生物标志物，这种可测量特征可以包括(例如)生物样品中生物标志物或其片段的存在、不存在或浓度、改变的结构，如(例如)翻译后修饰的存在或量，如生物标志物氨基酸序列上一个或多个位置处的氧化，或(例如)与足月产对照受试者中生物标志物的构象相比，改变的构象的存在，和/或作为不止一个生物标志物的谱的一部分的生物标志物的存在、量或改变的结构。
除生物标志物之外，可测量特征还可以包括风险指征，其包括(例如)母体特性、年龄、人种、种族、病史、过往妊娠史和婚育史。对于风险指征，可测量特征可以包括(例如)先前的低出生体重或早产分娩、多次在第2个三个月中自发性流产、先前在第1个三个月中人工流产、家族和存在于两代人之间的因素、不育史、未孕、胎盘异常、宫颈和子宫异常、宫颈长度测量短、妊娠期出血、宫内生长受限、宫内己烯雌酚暴露、多次妊娠、婴儿性别(infantsex)、身材矮小、低妊娠前体重/低体重指数、糖尿病、高血压、泌尿生殖器感染、甲状腺机能减退、哮喘、低学历、吸烟、使用毒品和饮酒。
在一些实施方式中，本发明所述的方法包括体重指数(BMI)的计算。
在一些实施方式中，用于确定早产概率的所公开的方法涵盖了使用质谱、捕获试剂或其组合检测和/或定量一种或多种生物标志物。
在其它实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的所公开的方法涵盖了从怀孕的雌性动物提供生物样品的初始步骤。
在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的所公开的方法包括向保健供应商传达所述概率。所公开的预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法类似地涵盖了向保健供应商传达所述概率。如上所述，尽管参考确定怀孕的雌性动物中早产概率进行描述和举例说明，但是在整个发明公开中描述的所有实施方式类似地适用于预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法。具体地，在本发明申请中，明确参考用于早产的方法所列举的生物标志物和组还可以用于预测GAB的方法、预测足月产的方法、确定怀孕的雌性动物中足月产概率的方法和预测怀孕的雌性动物中分娩时间的方法。对于本领域技术人员显而易见的是出于对母体-胎儿健康的考虑，上述方法中的每一个具有具体和大量的应用和益处。
在其它实施方式中，交流告知了对怀孕的雌性动物的后续治疗决策。在一些实施方式中，确定怀孕的雌性动物中早产概率的方法包括将所述概率表示为风险得分的其它特征。
在本文所公开的方法中，确定怀孕的雌性动物中的早产概率涵盖了包括通过测量选自早产妊娠群组和在出生时具有已知胎龄的足月产妊娠群组中的分离的生物标志物的比值形成概率/风险指数的初始步骤。对于个体妊娠，确定怀孕的雌性动物中的早产概率包括使用与产生概率/风险指数的初始步骤中所使用的相同的测量方法测量分离的生物标志物的比值，并将所述测量的比值与所述风险指数相比较以得出所述个体妊娠的个性化风险。在一个实施方式中，通过测量早产群组和足月产妊娠群组中IBP4/SHBG的比值形成早产风险指数，其中记录了出生时的胎龄。然后，在临床实践中，将单个妊娠中所测量的IBP4/SHBG的比值与使用相同分离和测量技术得出早产风险的指数相比较以得出IBP4/SHBG处于所述指数组中。
如本文所使用的，术语“风险得分”是指可以基于得自怀孕的雌性动物的生物样品中一种或多种生物标志物的量或逆转值与代表从得自怀孕的雌性动物的随机混合的生物样品计算的一种或多种生物标志物的平均量的标准或参考得分相比较来分配的得分。在一些实施方式中，所述风险得分可以表示为逆转值的对数，即各个生物标志物的相对强度的比值。本领域技术人员将理解可以基于多种数据转换表示风险得分，并且所述风险得分表示为比值本身。此外，通过特别关注逆转对，本领域技术人员将理解如果分子和分母中生物标志物切换或者应用了相关数据转化(例如，减法)，则任何比值同样是有信息型的。由于在整个妊娠期间，生物标志物的水平可能不是固定的，因此必需对应于采集样品时怀孕的雌性动物的妊娠时间点来获得标准或参考得分。可以预先确定标准或参考得分并建立预测模型，从而比较是间接的，而不是每次对受试者确定概率时实际进行的。风险得分可以是标准(例如，数值)或者阈值(例如，图上的线)。风险得分值相关于根据得自怀孕的雌性动物的随机混合的生物样品计算的一种或多种生物标志物的平均量上下偏差。在某些实施方式中，如果风险得分大于标准或参考风险得分，则怀孕的雌性动物可以具有提高的早产可能。在一些实施方式中，怀孕的雌性动物风险得分的大小或其超过参考风险得分的量可以作为怀孕的雌性动物的风险水平的指示或与之相关。
如本文举例说明的，PreTRMTM分类器定义为IBP4肽转化(QCHPALDGQR_394.5_475.2(SEQ ID NO:2))和SHBG肽转化(IALGGLLFPASNLR_481.3_657.4(SEQ ID NO:18))的SIS归一化强度的自然log。得分＝ln(P1 n/P2 n)，其中P1 n和P2 n分别表示IBP4和SHBG转化的SIS归一化峰面积值。SIS归一化定义为内源峰面积除以相应SIS峰面积的相对比：例如，P1 n＝P1 e/P1 SIS，其中P1 e＝IBP4内源转化的峰面积，P1 SIS＝IBP4SIS转化的峰面积。根据PreTRMTM得分分布和相应发病率调节的阳性预测值之间所鉴别的联系，可以基于对它们得分的确定将sPTB概率分配给未知受试者。图25中显示了这种关系或联系，并且它将实验室测量与临床预测相联系。
尽管PreTRMTM分类器定义为IBP4肽转化(QCHPALDGQR_394.5_475.2(SEQ ID NO:2))和SHBG肽转化(IALGGLLFPASNLR_481.3_657.4(SEQ ID NO:18))的SIS归一化强度的自然log，但是本发明还包括包含多个逆转的分类器。可以通过构建由不止一个逆转所形成的预测因子来实现改善的表现。在其它实施方式中，本发明方法因此包括多个逆转，其对于(例如)单独的GABD窗、早产胎膜早破(PPROM)相对于非PPROM的早产(PTL)、胎儿性别、初孕妇相对于经产孕妇具有强大的预测表现。在实施例10和表61中对在胎龄范围中早期(例如，17-19周)或晚期(例如，19-21周)产生强大预测表现的逆转举例说明了该实施方式。如所举例说明的，对于整个抽血范围评价了由多个逆转的组合(SumLog)所形成的预测因子的表现，并且预测因子得分来源于各个逆转的Log值的总和(SumLog)。本领域技术人员可以选择其它模型(例如，逻辑回归)以构建由不止一个逆转所形成的预测因子。
本发明所述的方法还包括含有指示变量的分类器，所述指示变量基于已知的临床因素，例如，抽血期、胎儿性别、妊娠以及在本发明申请中描述的任何其它可知的患者特征和/或风险因素选择一个逆转或者逆转亚组。在实施例10、表61至64中举例说明了该实施方式，其单独对于sPTB的两种不同表型，PPROM和PTL举例说明了逆转表现(17-21周)。类似地，在实施例10、表76和77以及图108和109中举例说明了该实施方式，其单独对于sPTB的两种不同表型，早产胎膜早破(PPROM)和非PPROM的早产(PTL)举例说明了逆转表现(19-21周)。本发明所述的方法因此包括逆转的选择以建立PPROM和PTL独立的预测因子，或者通过如上所述的单一预测因子中不止一种逆转的组合使表现整体最大化。在实施例10、表65-68中进一步举例说明了该实施方式，其单独对于sPTB的两种不同类型，初孕妇和经产孕妇举例说明了逆转表现(17-21周)。在实施例10、表69-72和图106中进一步举例说明了该实施方式，其单独对于基于胎儿性别的sPTB的两种不同类型举例说明了逆转表现(17-21周)。尽管对于PPROM和PTL、妊娠和胎儿性别进行了举例说明，但是本发明所述的方法包括含有指示变量的分类器，所述指示变量基于GABD或者本文所述的或本领域技术人员已知的任何已知的临床因素/风险因素选择一个逆转或者逆转亚组。作为具有包含指示变量的分类器的替代，本发明还提供了单独的分类器，所述分类器基于GABD或者本文所述的或本领域技术人员已知的任何已知的临床因素/风险因素适合于孕妇亚组。例如，该实施方式对于GABD的连续和/或重叠时间窗涵盖了基于对每个时间窗最好地实施逆转的单独的分类器。
如本文所举例说明的，可以通过大于22并且等于或小于37kg/m2的BMI划分来改善所主张方法的预测表现。因此，在一些实施方式中，可以通过得自具有指定BMI的怀孕的雌性动物的样品实践本发明所述的方法。简要地，BMI是个体体重(千克)除以身高(米)的平方。BMI不直接测量体脂肪，但是研究已显示BMI与得自皮褶厚度测量、生物电阻抗、密度测定(水下称重)、双能X线吸收测定(DXA)及其它方法的体脂肪的更直接的测量有关。此外，BMI似乎与这些更直接的体脂测量一样与多种代谢和疾病结局强烈相关。通常，BMI低于18.5的个体被认为是低于正常体重，BMI等于或大于18.5至24.9的个体被认为是正常体重，而BMI等于或大于25.0至29.9的个体被认为是过重，而BMI等于或大于30.0的个体被认为是肥胖。在一些实施方式中，可以通过等于或大于18、等于或大于19、等于或大于20、等于或大于21、等于或大于22、等于或大于23、等于或大于24、等于或大于25、等于或大于26、等于或大于27、等于或大于28、等于或大于29或等于或大于30的BMI划分来改善所主张的方法的预测表现。在其它实施方式中，可以通过等于或小于18、通过等于或小于19、通过等于或小于20、通过等于或小于21、通过等于或小于22、通过等于或小于23、通过等于或小于24、通过等于或小于25、通过等于或小于26、通过等于或小于27、通过等于或小于28、通过等于或小于29或通过等于或小于30的BMI划分来改善所主张的方法的预测表现。
在本发明的背景中，术语“生物样品”涵盖了得自怀孕的雌性动物并且含有本文所公开的一种或多种生物标志物的任何样品。在本发明的背景中，适合的样品包括(例如)血液、血浆、血清、羊膜水、阴道分泌物、唾液和尿。在一些实施方式中，所述生物样品选自全血、血浆和血清。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。如本领域技术人员将理解的，生物样品可以包括血液的任何部分或组分，无限制地，T细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、红细胞、血小板和微囊，如外来体和外来体样微囊。在具体的实施方式中，所述生物样品是血清。
如本文所使用的，术语“早产”是指在小于37个完整周的胎龄分娩或生产。已经建立了其它常用的早产子类，并将其表示为适度早产(在妊娠的第33至36周生产)、过度早产(在<妊娠的第33周生产)和严重早产(在<妊娠的第28周生产)。对于本文所公开的方法，本领域技术人员将理解可以在实践本文所公开的方法中调整表示早产和足月产的截止时间以及表示早产子类的截止时间，例如，以使特定健康益处最大化。在本发明的多个实施方式中，描述早产的截止时间包括(例如)在≤37周妊娠时分娩、≤36周妊娠时分娩、≤35周妊娠时分娩、≤34周妊娠时分娩、≤33周妊娠时分娩、≤32周妊娠时分娩、≤30周妊娠时分娩、≤29周妊娠时分娩、≤28周妊娠时分娩、≤27周妊娠时分娩、≤26周妊娠时分娩、≤25周妊娠时分娩、≤24周妊娠时分娩、≤23周妊娠时分娩或≤22周妊娠时分娩。在一些实施方式中，描述早产的截止时间为≤35周妊娠。应进一步理解这些调整在本领域技术人员的技术组合范围内，并涵盖在本文所公开的本发明的范围内。胎龄是胎儿发育程度和胎儿生产准备程度的代表。胎龄通常定义为最后一次正常月经至生产日期之间的时间长度。然而，产科测量和超声估计也可以辅助估计胎龄。早产通常被分为两个不同的亚组。一个是自发早产，它是在早产分娩或早产过早羊膜破裂的自发发生后发生的那些，不考虑后续催产或剖腹产。第二个是医学上的人工早产(indicated preterm births)，它是对于妇女的护理人员确定威胁母体和/或胎儿的健康或生命的一种或多种条件，在引产或剖腹产后发生的那些早产。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及确定自发早产或医学上的人工早产的概率。在一些实施方式中，本文所公开的方法涉及确定自发早产的概率。在其它实施方式中，本文所公开的方法涉及医学上的人工早产。在其它实施方式中，本文所公开的方法涉及预测出生时的胎龄。
如本文所使用的，术语“估计的胎龄”或“估计的GA”是指基于最后一次正常月经的日期和其它产科测量、超声估计或其它临床参数(其无限制地包括前段中所述的那些)确定的GA。相反，术语“预测的出生时的胎龄”或“预测的GAB”是指基于如本文所公开的本发明所述的方法确定的GAB。如本文所使用的，“足月产”是指在等于或大于37个完整周的胎龄时的分娩。
在一些实施方式中，怀孕的雌性动物在采集生物样品时处于妊娠17至28周之间，这也称为GABD(抽血时的胎龄)。在其它实施方式中，在采集生物样品时，怀孕的雌性动物在妊娠的第16至29周之间，第17至28周之间，第18至27周之间，第19至26周之间，第20至25周之间，第21至24周之间或第22至23周之间。在其它实施方式中，在采集生物样品时，怀孕的雌性动物在妊娠的约第17至22周之间，约第16至22周之间，约第22至25周之间，约第13至25周之间，约第26至28周之间或约第26至29周之间。因此，采集生物样品时怀孕的雌性动物的胎龄可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周。在具体的实施方式中，在19至21周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至22周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至21周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在19至22周胎龄之间收集生物样品。在具体的实施方式中，在18周胎龄收集生物样品。在其它实施方式中，可以在单一分类器中组合连续或重叠时间窗的最高实施逆转以预测较宽的抽血时的胎龄窗的sPTB概率。
如本文所使用的，术语“量”或“水平”是指在生物样品和/或对照中可检测或可测量的生物标志物的量。生物标志物的量可以是(例如)多肽的量、核酸的量或者片段或替代物的量。作为另外一种选择，术语可以包括它们的组合。术语生物标志物的“量”或“水平”是该生物标志物的可测量特征。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述生物标志物对选自表1至77和图1至111中任一个中所指明的生物标志物对，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合所述对的第一成员的第一捕获试剂和特异地结合所述对的第二成员的第二捕获试剂接触，检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中；和检测所述对的第一生物标志物和第一捕获试剂之间以及所述对的第二成员与第二捕获试剂之间的结合。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述生物标志物对选自表27至59、61至72、76和77中所指明的生物标志物对，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合所述对的第一成员的第一捕获试剂和特异地结合所述对的第二成员的第二捕获试剂接触，检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中；和检测所述对的第一生物标志物和第一捕获试剂之间以及所述对的第二成员与第二捕获试剂之间的结合。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合所述对的第一成员的第一捕获试剂和特异地结合所述对的第二成员的第二捕获试剂接触，检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中；和检测所述对的第一生物标志物和第一捕获试剂之间以及所述对的第二成员与第二捕获试剂之间的结合。在一个实施方式中，本发明提供了检测怀孕的雌性动物中IBP4和SHBG的方法，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；b.通过将所述生物样品与特异地结合IBP4的捕获试剂和特异地结合SHBG的捕获试剂接触，检测IBP4和SHBG是否存在于所述生物样品中；和c.检测IBP4和所述捕获试剂之间以及SHBG和所述捕获试剂之间的结合。在一个实施方式中，所述方法包括测量所述生物标志物对的逆转值。在其它实施方式中，在所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间逆转值的变化的存在指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。在一个实施方式中，在19至21周胎龄之间获得样品。在其它实施方式中，所述捕获试剂选自抗体、抗体片段、核酸-基蛋白结合试剂、小分子或其变体。在其它实施方式中，通过测定实施所述方法，所述测定选自酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
本发明还提供了检测怀孕的雌性动物中分离的生物标志物对的方法，所述分离的生物标志物对选自IBP4/SHBG、VTNC/VTDB、VTNC/SHBG、CATD/SHBG、PSG2/ITIH4、CHL1/ITIH4、PSG2/C1QB、PSG2/FBLN3、HPX/IBP4和HPX/PTGDS，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；和b.检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中，其包括对所述样品进行由质谱定量组成的蛋白质组学工作流程。
在一个实施方式中，本发明提供了检测怀孕的雌性动物中IBP4和SHBG的方法，所述方法包括以下步骤：a.从所述怀孕的雌性动物获得生物样品；和b.检测所述分离的生物标志物对是否存在于所述生物样品中，其包括对所述样品进行由质谱定量组成的蛋白质组学工作流程。
“蛋白质组学工作流程”通常涵盖了以下步骤中的一种或多种：将血清样品融化并通过免疫-亲和色谱消耗掉14种丰度最高的蛋白质。将所消耗的血清通过蛋白酶，例如，胰蛋白酶水解以获得肽。随后，向水解物中添加SIS肽的混合物，然后脱盐并使用以MRM模式运行的三重四极杆设备进行LC-MS/MS。根据内源肽峰值和相应SIS肽对应物峰值的面积比形成响应比。本领域那些技术人员应理解可以在本发明所述的方法中使用其它类型的MS，如(例如)MALDI-TOF或ESI-TOF。另外，本领域技术人员可以(例如)通过选择特定试剂(如蛋白酶)或者省去或改变某些步骤的顺序来改变蛋白质组学工作流程，例如，它可以不必需进行免疫去除，可以稍早或稍晚加入SIS肽并且可以将稳定同位素标记的蛋白质代替肽用作标准品。
可以在本文中使用任何现有的，可用的或常规的分离、检测和定量方法来测量样品中生物标志物、肽、多肽、蛋白质和/或其片段和任选地一种或多种其它生物标志物或其片段的存在或不存在(例如，读数为存在相对于不存在；或者可检测的量相对于不可检测的量)和/或量(例如，读数是绝对或相对量，如(例如)绝对或相对浓度)。在一些实施方式中，一种或多种生物标志物的检测和/或定量包括使用捕获试剂的测定。在其它实施方式中，所述捕获试剂是抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂、小分子或其变体。在其它实施方式中，所述测定选自酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。在一些实施方式中，一种或多种生物标志物的检测和/或定量还包括质谱分析法(MS)。在其它实施方式中，所述质谱分析法是免疫共沉淀-质谱分析法(co-IP MS)，其中免疫共沉淀是适合于完整蛋白质络合物分离的技术，在它之后进行质谱分析。
如本文所使用的，术语“质谱”是指能够使分析物挥发/离子化以形成气相离子并确定它们的绝对或相对分子量的装置。适合的挥发/电离方法是基质辅助激光解吸电离(MALDI)、电喷雾、激光/光、热、电、雾化/喷雾等，或它们的组合。适合的质谱形式包括(但不限于)离子阱仪器、四极仪器、静电和磁性扇形场仪器、飞行时间仪器、飞行时间串联质谱仪(TOF MS/MS)、傅里叶变换质谱仪、Orbitraps以及由这些类型的质谱分析仪的不同组合组成的混合仪器。反过来，这些仪器可以与多种其它仪器连接，所述其它仪器分离样品(例如，液相色谱或基于化学或生物性质的固相吸附技术)并且使样品电离以引入到质谱仪中，其包括基质辅助激光解吸(MALDI)、电喷雾或纳喷雾电离(ESI)或它们的组合。
通常，可以在本文所公开的方法中使用任何质谱(MS)技术，所述技术可以提供肽质量的精确信息，并且优选地还提供所选肽的片段和/或(部分)氨基酸序列的精确信息(例如，在串联质谱，MS/MS；或在源后衰变，TOF MS中)。适合的肽MS和MS/MS技术和系统本身是熟知的(参见，例如，Methods in Molecular Biology,146卷:“Mass Spectrometry ofProteins and Peptides”,Chapman主编,Humana Press 2000；Biemann 1990.MethodsEnzymol 193:455-79；或Methods in Enzymology,402卷:“Biological MassSpectrometry”,Burlingame主编,Academic Press 2005)并且可以在实践本文所公开的方法中使用。因此，在一些实施方式中，所公开的方法包括实施定量MS以测量一种或多种生物标志物。这些定量方法可以以自动(Villanueva等人,Nature Protocols(2006)1(2):880-891)或半自动形式进行。在具体的实施方式中，MS可以可操作地连接至液相色谱装置(LC-MS/MS或LC-MS)或者气相色谱装置(GC-MS或GC-MS/MS)。在上下文中有用的其它方法包含同位素亲合标签(isotope-coded affinity tag)(ICAT)、串联质谱标签(TMT)或通过细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)，然后进行色谱和MS/MS。
如本文所使用的，术语“多反应监控(MRM)”或“选择的反应监控(SRM)”是指对于低丰度分析物定量特别有用的MS基定量方法。在SRM实验中，通过三重四极仪的两个质量过滤器选择预先确定的前体离子以及一个或多个其片段并随时间监控精确定量。可以通过在不同前体/碎片对之间快速转换以实施MRM实验，在相同实验内在色谱时间尺度上测量多个SRM前体和碎片离子对。一系列跃迁(前体/碎片离子对)与靶标分析物(例如，肽或小分子，如化学个体、类固醇、激素)的保留时间的组合可以构成确定的测定。可以在单次LC-MS实验期间定量大量分析物。与MRM或SRM有关的术语“安排的”或“动态的”是指测定的变化，其中在预期保留时间周围的时窗中仅获得特定分析物的跃迁，从而显著提高了可以在单次LC-MS实验中检测和定量的分析物的数目并有助于测试的选择性，这是因为保留时间是依赖于分析物物理性质的性质。还可以以不止一个跃迁来监控单个分析物。最后，在测定中可以包括对应于所关心的分析物的标准品(例如，相同的氨基酸序列)，但差别在于包含了稳定同位素。可以将稳定同位素标准品(SIS)以精确水平引入所述测定并用于定量相应的未知分析物。通过未知分析物与其相应SIS的共洗脱以及它们的跃迁性质(例如，未知物两种跃迁水平的比值和其相应SIS的两种跃迁的比值的相似性)，促进了额外的特异性水平。
适合于生物标志物肽分析的质谱测定、仪器和系统可以无限制地包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS；MALDI-TOF源后衰变(PSD)；MALDI TOF/TOF；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)MS；电喷雾电离质谱(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n(n是大于零的整数)；ESI 3D或线性(2D)离子阱MS；ESI三重四级MS；ESI四极正交TOF(Q-TOF)；ESI傅里叶变换MS系统；硅上解吸/电离(DIOS)；次级离子质谱法(SIMS)；大气压化学电离质谱法(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)n；离子迁移光谱(IMS)；电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、大气压光化电离质谱仪(APPI-MS)；APPI-MS/MS；和APPI-(MS)n。可以使用在本领域中建立的方式实现串联MS(MS/MS)布置中的肽离子碎片化，如(例如)碰撞诱导解离(CID)。如本文所述，通过质谱的生物标志物的检测与定量可以包括多次反应监控(MRM)，如Kuhn等人Proteomics 4:1175-86(2004)。在LC-MS/MS分析期间，经调度的多次反应监控(经调度的MRM)模式采集提高了肽定量的灵敏度与准确度。Anderson andHunter,Molecular and Cellular Proteomics 5(4):573(2006)。如本文所述，基于质谱的测定可以有利地与上游肽或蛋白质分离或分馏方法组合，如(例如)与色谱和本文以下所述的其它方法组合。如本文进一步所述的，鸟枪法定量蛋白质组学可以与基于SRM/MRM的测定组合以用于早产预后生物标志物的高通量鉴别和复核。
本领域技术人员将理解一些方法可以用于确定生物标志物的量，其包括质谱法，如MS/MS、LC-MS/MS、多反应监控(MRM)或SRM以及产物离子监控(PIM)并且还包括基于抗体的方法，如免疫测定，如免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹和FACS。因此，在一些实施方式中，确定至少一种生物标志物的水平包括使用免疫测定和/或质谱法。在其它实施方式中，质谱法选自MS、MS/MS、LC-MS/MS、SRM、PIM以及本领域中已知的其它这类方法。在其它实施方式中，LC-MS/MS还包括1DLC-MS/MS、2D LC-MS/MS或3D LC-MS/MS。免疫测定技术和规程通常是本领域技术人员所知的(Price and Newman,Principles and Practice ofImmunoassay,第2版,Grove’sDictionaries,1997；和Gosling,Immunoassays:A Practical Approach,OxfordUniversity Press,2000)。可以使用多种免疫测定技术，包含竞争和非竞争免疫测定(Self等人,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996))。
在其它实施方式中，免疫测定选自免疫印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定(RIA)、斑点印迹和FACS。在某些实施方式中，所述免疫测定为ELISA。在其它实施方式中，所述ELISA是直接ELISA(酶联免疫吸附测定)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA、多通道ELISA、ELISPOT技术及其它本领域中已知的类似技术。这些免疫测定方法的原理在本领域中是已知，例如John R.Crowther,The ELISA Guidebook,第1版,HumanaPress 2000,ISBN 0896037282。通常，使用抗体进行ELISA，但是它们可以使用与本发明的一种或多种生物标志物特异性结合的并且可以检测的任何捕获试剂进行。多通道ELISA使得能够在单个隔室(例如，微孔板的孔)内同时检测两种或更多种分析物，这通常是在多个阵列位置完成的(Nielsen and Geierstanger 2004.J Immunol Methods 290:107-20(2004)和Ling等人,2007.Expert Rev Mol Diagn 7:87-98(2007))。
在一些实施方式中，放射免疫测定(RIA)可以在本发明所述的方法中用于检测一种或多种生物标志物。RIA是本领域熟知的基于竞争的测定，并且包括将已知量的放射性标记的(例如，125I或131I标记的)靶标分析物与所述分析物的特异性抗体混合，然后加入来自样品的未标记的分析物并测量替换的标记的分析物的量(参见，例如，An Introduction to Radioimmunoassayand Related Techniques,Chard T主编,Elsevier Science1995,ISBN 0444821198for guidance)。
在本发明所述的方法中，可以在本文所述的测定中使用可检测的标记物以用于生物标志物的直接或间接检测。可以使用多种可检测的标记物，并基于所需的灵敏度、与抗体缀合的容易性、稳定性要求和可用的仪器以及处理规定选择标记物。本领域技术人员熟悉基于本发明所述的方法中生物标志物的测定检测的适合的可检测标记物的选择。适合的可检测标记物包括(但不限于)荧光染料(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OregonGreen、罗丹明、得克萨斯红、四若丹明异硫氰酸酯(tetrarhodimine isothiocynate,TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、酶(例如，荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、金属等。
对于质谱基分析，使用同位素试剂的差异标记，例如，同位素编码的亲合标签(ICAT)或使用同量异序标记试剂的更近期的变化、iTRAQ(Applied Biosystems,FosterCity,Calif.)或串联质谱标签，TMT(Thermo Scientific,Rockford,IL)，然后进行多维液相色谱(LC)和串联质谱(MS/MS)分析可以在本发明方法的实践中提供其它方法。
使用化学发光抗体的化学发光测定可以用于蛋白水平的灵敏、非放射性检测。用荧色物标记的抗体也可以是适合的。荧色物的实例无限制地包括DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻青蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、得克萨斯红和丽丝胺(lissamine)。间接标记物包括在本领域中熟知的多种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿酶等。使用适合于辣根-过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶的底物的检测系统在本领域中是熟知的。
例如，可以使用分光光度计检测来自发色底物的颜色；使用辐射计数器来检测辐射，如γ粒子计数器检测125I；或者在存在特定波长的光的情况下使用荧光计检测荧光，从而分析来自直接或间接标记物的信号。对于酶连抗体的检测，可以根据生产商的说明，使用分光光度计，如EMAX酶标仪(Molecular Devices；Menlo Park,Calif.)进行定量分析。如果需要，用于实践本发明的测定可以自动或机械化进行，并且可以同时检测来自多个样品的信号。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括使用质谱(MS)定量生物标志物。在其它实施方式中，质谱可以是液相色谱-质谱(LC-MS)、多次反应监控(MRM)或选择反应监控(SRM)。在其它实施方式中，MRM或SRM还可以包括经调度MRM或经调度SRM。
如上所述，还可以在本发明所述方法的实践中使用色谱法。色谱法包括用于分离化学物质的方法，并且通常涉及以下过程：通过移动液体或气体流(“流动相”)携带分析物的混合物并当它们流过或在固定液或固相(“固定相”)上流动时由于分析物在流动相和所述固定相之间的差异分配而分成不同组分。所述固定相通常可以是细碎的固体、过滤材料片层或位于固体表面上的液体薄膜等。本领域技术人员很好地认识到色谱法是适合于生物来源的化合物(如，例如，氨基酸、蛋白质、蛋白质或肽片段等)分离的技术。
色谱可以柱色谱(即其中固定相沉积或装填成柱)，优选地，液相色谱，并且更优选地，高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UHPLC)。色谱法的详细资料在本领域中是熟知的(Bidlingmeyer,Practical HPLC Methodology and Applications,John Wiley&SonsInc.,1993)。色谱的示例性类型无限制地包括高效液相色谱(HPLC)、UHPLC、正相HPLC(NP-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、离子交换色谱(IEC)，如阳离子或阴离子交换色谱、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水性相互作用色谱(HIC)、尺寸排阻层析(SEC)，包括凝胶过滤色谱或凝胶渗透色谱、色谱焦聚、亲和色谱，如免疫亲和、固定化金属亲和色谱等。可以将色谱(包括一维、二维或多维色谱)与其它肽分析方法(如，例如，如本说明书其它处描述的下游质谱分析)一起用作肽分离方法。
可以任选地与任何上述分析方法一起使用其它肽或多肽分离、鉴别或定量方法以用于在本发明公开中测量生物标志物。这些方法无限制地包括化学提取分配、等电点聚焦(IEF)，包括毛细管等电点聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管电色谱(CEC)等、一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)，自由流动电泳(FFE)等。
在本发明的背景中，术语“捕获试剂”是指可以特异性结合至靶标，具体地生物标志物的化合物。该术语包括抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂(例如，适体、慢解离速率修饰的适体(SOMAmer))、蛋白捕获试剂、天然配体(即用于其受体的激素或反之)、小分子或其变体。
可以配置捕获试剂以特异性结合至靶标，具体地生物标志物。捕获试剂可以包括(但不限于)有机分子，如多肽、多核苷酸以及技术人员可鉴别的其它非聚合物分子。在本文所公开的实施方式中，捕获试剂包括可以用于检测、纯化、分离或富集靶标，具体地生物标志物的任何试剂。任何本领域已知的亲合捕获技术可以用于选择性分离和富集/浓缩作为在所公开的方法中使用的生物培养基的复杂混合物的成分的生物标志物。
可以使用本领域中已知的任何适合的方法制备特异性结合至生物标志物的抗体捕获试剂。参见，例如，Coligan,Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第2版,1986)。抗体捕获试剂可以是任何免疫球蛋白或其衍生物，无论是天然的或者完全或部分合成产生的。维持特异结合能力的它的所有的衍生物也包含在该术语中。抗体捕获试剂具有与免疫球蛋白结合域同源或基本同源的并且可以来源于天然来源或者部分或完全合成产生的结合域。抗体捕获试剂可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单链抗体。本领域那些技术人员将理解抗体可以以任何多种形式提供，其包括(例如)人源化、部分人源化、嵌合、嵌合人源化等。抗体捕获试剂可以是抗体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双链抗体和Fd片段。可以通过任何方式产生抗体捕获试剂。例如，抗体捕获试剂可以通过完整抗体的碎片化来酶促或化学产生和/或它可以从编码所述部分抗体序列的基因重组产生。抗体捕获试剂可以包含单链抗体片段。作为另外一种选择或另外，抗体捕获试剂可以包含(例如)通过二硫键连接在一起的多条链。；和，得自这些分子的任何功能性片段，其中这些片段保留了亲本抗体分子的特异性结合性质。由于它们作为完整分子的功能性组分的较小尺寸，对于在某些免疫化学技术和实验应用中的使用，抗体片段可以提供优于完整抗体的优势。
对实践本发明有用的适合的捕获试剂还包括适体。适体是可以通过唯一的立体(3-D)结构特异性地结合至它们的靶标的寡核苷酸序列。适体可以包括任何适合数目的核苷酸，并且不同的适体可以具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA或化学修饰的核酸，并且可以是单链、双链或含有双链区的，并且可以包括更高的有序结构。适体还可以是光适体，其中在适体中包含光反应性或化学反应性官能团以使其与其相应靶标共价连接。适体捕获试剂的使用可以包括特异性结合相同生物标志物的两种或更多种适体的使用。适体可以包括标签。可以使用任何已知的方法鉴别适体，包括SELEX(指数富集配体系统进化)法。一旦鉴别，则可以根据任何已知的方法制备或合成适体，包括化学合成法和酶促合成法，并且可以在用于生物标志物检测的多种应用中使用。Liu等人，Curr Med Chem.18(27):4117-25(2011)。在本发明所述方法的实践中有用的捕获试剂还包括本领域中已知具有改善的解离速率特征的SOMAmers(慢解离速率修饰的适体)。Brody等人,J Mol Biol.422(5):595-606(2012)。可以使用任何已知的方法，包括SELEX法产生SOMAmer。
本领域技术人员应理解可以在分析前修饰生物标志物以改善它们的分辨率或确定它们的身份。例如，可以在分析前对生物标志物进行蛋白消化。可以使用任何蛋白酶。可能将生物标志物切割成不连续个数的片段的蛋白酶(如胰蛋白酶)是特别有用的。由消化产生的片段用作生物标志物的指纹，借此使得能够间接检测它们。这在生物标志物具有可能与所讨论的生物标志物混淆的类似的分子量的情况下是特别有用的。另外，蛋白水解碎片化对高分子量生物标志物是有用的，这是因为较小的生物标志物更易于通过质谱分辨。在另一个实例中，可以修饰生物标志物以改善检测分辨率。例如，神经氨糖酸苷酶可以用于从糖蛋白除去末端唾液酸残基以改善与阴离子吸附剂的结合和改善检测分辨率。在另一个实例中，可以通过连接具有特定分子量的特异性结合至分子生物标志物的标签来修饰生物标志物，从而进一步区分它们。任选地，在检测这些修饰的生物标志物后，可以通过在蛋白质数据库(例如，SwissProt)中将修饰的生物标志物的物理和化学特性进行匹配来进一步确定生物标志物的身份。
在本领域中还将认识到可以将样品中的生物标志物捕获在用于检测的基底上。常规基底包括随后用于探索蛋白质存在的抗体涂覆的96-孔板或硝化纤维素膜。作为另外一种选择，可以将连接至微球、微粒、微珠、珠或其它颗粒的蛋白结合分子用于生物标志物的捕获和检测。蛋白结合分子可以是连接到颗粒表面的抗体、肽、类肽、适体、小分子配体或其它蛋白结合捕获试剂。每个蛋白结合分子可以包括唯一的可检测标记物，编码所述标记物从而使它可以不同于连接至其它蛋白结合分子的可检测标记物，从而使得能够在多通道测定中检测生物标志物。实例包括(但不限于)具有已知荧光强度的颜色编码的微球(参见，例如，由Luminex(Austin,Tex.)通过xMAP技术生产的微球)；含有量子点纳米晶体的微球，例如，其具有不同的量子点颜色的比值和组合(例如，由Life Technologies(Carlsbad,Calif.)生产的Qdot纳米晶体)；玻璃涂覆的金属纳米颗粒(参见，例如，由NanoplexTechnologies,Inc.(Mountain View,Calif.)生产的SERS nanotags)；条型码材料(参见，例如，亚微米尺寸的条纹金属棒，如由Nanoplex Technologies,Inc.生产的Nanobarcodes)，具有彩色条码的编码微粒(参见，例如，由Vitra Bioscience,vitrabio.com生产的cellcard)，具有数字全息编码图像的玻璃微粒(参见，例如，由Illumina(San Diego,Calif.)生产的CyVera微珠)；化学发光染料、染料化合物的组合；和具有可检测的不同尺寸的珠。
在另一个方面，可以将生物芯片用于本发明的生物标志物的捕获和检测。在本领域中，多种蛋白质生物芯片是已知的。这些包括(例如)通过Packard BioScience Company(Meriden Conn.)、Zyomyx(Hayward,Calif.)和Phylos(Lexington,Mass.)生产的蛋白质生物芯片。一般地，蛋白质生物芯片包含具有表面的基底。将捕获试剂或吸附剂连接至基底表面。通常，所述表面包括多个可寻址地址，每个地址具有在此结合的捕获试剂。所述捕获试剂可以是生物分子，如多肽或核酸，其以特异性方式捕获其它生物标志物。作为另外一种选择，捕获试剂可以是色谱材料，如阴离子交换材料或亲水材料。蛋白质生物芯片的实例在本领域中是熟知的。
本发明公开还提供了预测早产概率的方法，其包括测量生物标志物对逆转值的变化。例如，可以将生物样品与包含一种或多种多核苷酸结合试剂的组接触。然后，可以根据以下所公开的方法，例如，使用或不使用核酸扩增方法，评价所检测的生物标志物中一种或多种的表达。熟练的开业医生理解在本文所述的方法中，基因表达的测量可以是自动的。例如，可以使用可以进行基因表达的多路测量的系统，例如，同时提供数百种mRNA的相对丰度的数字读数。
在一些实施方式中，核酸扩增方法可以用于检测多核苷酸生物标志物。例如，可以在使用通过任何多种熟知和确立的方法分离的核酸底物的扩增和检测方法中使用本发明所述的寡核苷酸引物和探针(例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,A laboratoryManual,第7.37-7.57页(第2版,1989)；Lin等人,in Diagnostic MolecularMicrobiology,Principles and Applications,第605-16页(Persing等人主编,(1993)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(2001以及随后的更新))。扩增核酸的方法包括(但不限于)(例如)聚合酶链反应(PCR)和反转录PCR(RT-PCR)(参见，例如，美国专利No.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Weiss,Science 254:1292-93(1991))、链置换扩增(SDA)(参见，例如，Walker等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396(1992)；美国专利No.5,270,184和5,455,166)、嗜热SDA(tSDA)(参见，例如，欧洲专利No.0 684 315)和美国专利No.5,130,238；Lizardi等人,BioTechnol.6:1197-1202(1988)；Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-77(1989)；Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-78(1990)；美国专利No.5,480,784；5,399,491；美国专利公开No.2006/46265中所述的方法。
在一些实施方式中，生物样品中mRNA的测量可以用作生物样品中相应蛋白质生物标志物水平检测的替代。因此，还可以通过检测适当的RNA来检测本文所述的任何生物标志物、生物标志物对或者生物标志物逆转组。可以通过反转录定量聚合酶链反应(RT-PCR，然后qPCR)来测量mRNA的水平。使用RT-PCR从mRNA产生cDNA。随着DNA扩增过程的进行，可以在qPCR测定中使用cDNA以产生荧光。与标准曲线相比，qPCR可以产生绝对测量，如单位细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、侵入测定(Invader assay)和与毛细管电泳结合的RT-PCR均已用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods and Protocols,Richard A.Shimkets主编,Humana Press,2004。
本文所公开的一些实施方式涉及确定怀孕的雌性动物中早产概率的诊断和预后方法。一种或多种生物标志物的表达水平的检测和/或生物标志物比值的确定可以用于确定怀孕的雌性动物中的早产概率。可以将这些检测方法(例如)用于状况的早期诊断以确定受试者是否对早产易感，以监控早产的发展或者治疗规程的进展，以评价早产的严重性，以预测早产结局和/或恢复或足月产的前景或者以帮助确定适合的早产治疗。
可以无限制地通过如上所述的方法以及本领域中已知的任何其它方法确定生物样品中生物标志物的量。然后，将因此所获得的定量数据进行分析分类法。在该方法中，根据算法调控原始数据，其中已通过训练数据组对算法进行预定义，例如，如本文所提供的实例中所述的。算法可以使用本文所提供的训练数据组，或者可以使用本文所提供的指导以通过不同的数据组产生算法。
在一些实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括预测模型的使用。在其它实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括将所述可测量特征与参考特征相比较。如本领域技术人员可以理解的，这种比较可以是与参考特征的直接比较或者是其中已将参考特征引入预测模型的间接比较。在其它实施方式中，分析可测量特征来确定怀孕的雌性动物中早产概率包括以下中的一种或多种：线性差别分析模型、支持向量机分类算法、回归特征消去模型、微阵列预测分析模型、逻辑回归模型、CART算法、flex tree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法、惩罚回归方法及其组合。在具体的实施方式中，所述分析包括逻辑回归。
分析分类法可以使用多种统计分析方法中的任一种以调控定量数据并为样品分类做准备。有用的方法的实例包括线性差别分析、回归特征消去、微阵列预测分析、逻辑回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法；等。
为了产生预测GAB的随机森林，本领域技术人员可以考虑一组k位出生时胎龄(GAB)已知的和已测量生产前几周采集的血液样本中N个分析物(转变)的受试者(孕妇)。回归树起始于含有所有受试者的根节点。可以在根节点计算所有受试者的平均GAB。根节点内GAB的变化较高，这是因为存在具有不同GAB的妇女的混合。然后，将根节点划分(分配)为两个分枝，从而每个分枝含有具有类似GAB的妇女。再次计算每个分枝中受试者的平均GAB。每个分枝内的GAB变化将低于根节点中的变化，这是因为每个分枝内的妇女亚组具有比根节点中相对更类似的GAB。通过选择分析物和产生具有类似GAB的分枝的分析物的阈值来产生两个分枝。从所有分析物和阈值的组中选择分析物和阈值，通常在每个节点具有分析物的随机亚组。程序连续递归产生分枝以产生其中受试者具有极类似GAB的叶(终端节点)。每个终端节点中预测的GAB是该终端节点中受试者的平均GAB。该程序产生单一回归树。随机森林可以包括数百或数千个这样的树。
可以根据设置确定样品属于给定分类的概率的阈值的预测模型方法来进行分类。所述概率优选地为至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％或更高。还可以通过确定所获得的数据组和参考数据组之间的比较是否产生统计学显著差异来进行分类。如果产生，则将获得该数据组的样品分为不属于参考数据组类。相反地，如果该比较不统计学显著地不同于参考数据组，则将获得该数据组的样品分为属于参考数据组类。
可以根据提供具体值或数值范围的质量度量，例如，AUROC(ROC曲线下面积)或准确度来评价模型的预测能力。曲线下面积量度对于比较整个数据范围内分类器的精确性是有用的。具有较大AUC的分类器将具有较大的将未知在两关心组之间正确分类的能力。在一些实施方式中，所需质量阈值是以至少约0.5、至少约0.55、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或更高的准确度将样品分类的预测模型。作为替代量度，所需质量阈值可以表示至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高的AUC将样品分类的预测模型。
如本领域中已知的，可以调整预测模型的相对灵敏度和特异性以有利于选择性度量或灵敏度度量，其中两种度量具有反比关系。根据所进行的测试的具体要求，可以调整上述模型中的限度以提供选择的灵敏度或特异性水平。灵敏度和特异性中的一个或两个可以为至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高。
开始，可以通过测量每个生物标志物的值来分析原始数据，通常重复三次或多次重复三次。可以调控数据，例如，可以使用标准曲线转化原始数据，并使用三次测量的平均值来计算每位患者的平均值和标准偏差。可以在模型中使用前转化这些值，例如，log-转化，Box-Cox转化(Box and Cox,Royal Stat.Soc.,Series B,26:211-246(1964)。然后，将数据输入到预测模型中，所述模型将根据状况对样品分类。可以将所得信息传达给患者或保健供应商。
为了产生早产预测模型，在训练组中使用稳健数据组，其包括已知对照样品和对应于所关心的早产分类的样品。可以使用公认标准选择样本容量。如以上所讨论的，可以使用不同的统计方法来获得高精度预测模型。实施例2提供了这种分析的实例。
在一个实施方式中，在预测模型的推导中实施分级聚类，其中使用皮尔逊相关性作为簇度量。一种方法是将早产数据组考虑为“监督学习”问题中的“学习样本”。CART是医学应用中的标准(Singer,Recursive Partitioning in the Health Sciences,(1999))并且可以通过以下方式修改：将任何定性特征转化为定量特征；按通过用于霍特林T2统计量的样品再使用方法评价的所达到的显著性水平分类；和lasso方法的适合应用。的确，通过在回归质量评价中适当使用Gini分类标准，将预测问题转化为回归问题而不损失预测目标(sight of prediction)。
该方法导致产生了所谓的FlexTree(Huang,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A101:10529-10534(2004))。在模拟和应用于多种数据形式时，FlexTree运行良好并且对实践所主张的方法是有用的。已开发了软件自动FlexTree。作为另外一种选择，可以使用LARTree或LART(Turnbull(2005)Classification Trees with Subset Analysis Selection by the Lasso,Stanford University)。名称反映了二元树，如CART和FlexTree中；lasso，如所提及的；和通过所谓的LARS对lasso的实施，Efron等人(2004)Annals of Statistics 32:407-451(2004)。另外，参见，Huang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.101(29):10529-34(2004)。可以使用的其它分析方法包含逻辑回归。逻辑回归的一种方法：Ruczinski,Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512(2003)。逻辑回归类似于CART，其中它的分类器可以显示为二元树。不同在于每个节点具有有关特征的布尔语句，它比CART产生的简单“与”语句更常规。
另一种方法是最近缩小形心(nearest shrunken centroid)方法(Tibshirani,Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A 99:6567-72(2002))。该技术是k均值样的，但是具有下述优点：通过缩小簇中心，自动化选择特征(如在lasso中)以集中关注有信息的那些小数目。该方法可获得为PAM软件并被广泛使用。可以使用的两个其它算法集是随机森林(Breiman,Machine Learning45:5-32(2001))和MART(Hastie,The Elements of StatisticalLearning,Springer(2001))。在本领域中，这两种方法已知是“委员会方法”，其涉及对结局“投票”的预测因子。
为了提供重要性排序，可以确定假发现率(FDR)。首先，产生一组不同性值的零分布。在一个实施方案中，排列观察到的谱的值以产生偶然获得的相关系数的分布序列，借此产生相关系数的零分布的适当的集(Tusher等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 98,5116-21(2001))。通过下述获得零分布集：排列所有可用谱的每个谱的值；计算所有谱的配对相关系数；计算该排列的相关系数的概率密度函数；和重复该过程N次，其中N是大数，通常约300。使用N分布，计算其值以给定显著性水平超过从实验观察到的相似性值的分布获得的值(相似性的值)的相关系数值的计数的适当量度(平均值、中值等)。
FDR是预期假显著相关数目(从大于随机数据组中该选择的皮尔逊相关性的相关性估计)与经验数据中大于该选择的皮尔逊相关性的相关数目(显著相关)的比值。该截止相关值可应用于实验谱之间的相关性。使用上述分布，选择显著性的置信水平。这用来确定超出偶然获得的结果的相关系数的最低值。使用该方法，获得正相关、负相关或两者的阈值。使用该阈值，用户可以过滤配对相关系数的观察值并去除不超过阈值的那些。另外，可以获得给定阈值的假阳性率的估计。对于单个“随机相关”分布的每一个，可以找到有多少观察值落在阈值范围之外。该程序提供计数序列。所述序列的平均值和标准偏差提供潜在假阳性的平均数目及其标准偏差。
在替代的分析方法中，截面分析中选择的变量单独用作时间事件分析(生存分析)中的预测因子，其中事件是早产的发生，并且无事件受试者可认为是在分娩时检查的。考虑特定妊娠结果(早产事件或无事件)，每个患者观察到的随机时长和蛋白质组学及其它特征的选择，分析存活的参数方法可能好于广泛应用的半参数Cox模型。存活的Weibull参数拟合允许风险率是单一性增加、降低或恒定的，并且还具有成比例的风险表现(与Cox模型一样)和加速失败时间表现。可用于获得回归系数及相应函数的近似最大似然评估的所有标准工具在该模型中是可用的。
此外，可以使用Cox模型，特别是因为协变量数目减少至可用lasso管理的大小将显著简化分析，从而使得有可能使用非参数或半参数法预测早产时间。这些统计学工具在本领域中是已知的并且可应用于蛋白质组学数据的所有方式。提供了可容易确定并且具有关于所述怀孕的雌性动物中早产概率和预测的早产事件时间的丰富信息的一组生物标志物、临床和遗传数据。另外，算法提供了有关怀孕的雌性动物中的早产概率的信息。
因此，本领域技术人员将理解可以使用定量或类别变量确定根据本发明的早产概率。例如，在本发明所述的方法的实践中，可以对N个生物标志物的每一个的可测量特征进行分类数据分析以作为二元分类结局确定早产概率。作为另外一种选择，本发明所述的方法可以通过初始计算定量变量，具体地，出生时预测的胎龄来分析N个生物标志物的每一个的可测量特征。随后，出生时预测的胎龄可以用作预测早产风险的基础。通过初始使用定量变量和随后将定量变量转化为类别变量，本发明所述的方法考虑了对可测量特征检测的测量的连续区域。例如，通过预测出生时的胎龄而不是做出早产相对于足月产的二元预测，有可能调整怀孕的雌性动物的治疗。例如，早期预测的出生时的胎龄将导致比预测接近足月的胎龄更密切的产前干预，即监控和治疗。
在预测GAB为j天加或减k天的妇女中，可以将p(PTB)估计为PAPR临床试验(参见实施例1)中预测GAB为j天加或减k天而实际在37周胎龄之前分娩的妇女的比例。一般地，对于预测GAB为j天加或减k天的妇女，将真实出生时的胎龄将小于指定胎龄的概率p(真实GAB<指定GAB)估计为PAPR临床试验中预测GAB为j天加或减k天而实际在指定胎龄之前分娩的妇女的比例。
在预测模型的建立过程中，可以期望选择标志物的亚组，即至少3、至少4、至少5、至少6个标志物，和多至完整的标志物组。通常，将选择提供用于定量样品分析需要的标志物亚组，例如，试剂的可用性、定量的方便性等，同时维持高精度预测模型。对用于构建分类模型的一些信息性标志物的选择需要定义性能度量和用户基于该度量定义的产生具有有用预测能力的模型的阈值。例如，所述性能度量可以是AUC、预测的灵敏度和/或特异性以及预测模型的总体准确度。
如本领域技术人员将理解的，分析分类法可以使用多种统计分析方法中的任一种以调控定量数据并为样品分类做准备。有用的方法的实例无限制地包括线性差别分析、回归特征消去、微阵列预测分析、逻辑回归、CART算法、FlexTree算法、LART算法、随机森林算法、MART算法和机器学习算法。在训练模型中使用了多种方法。标志物亚组的选择可以是标志物亚组的正向选择或反向选择。可以选择将优化模型性能而不使用所有标志物的标志物数目。定义最佳项目数的一种方法是选择产生具有所需预测能力的模型的项目数(例如，AUC>0.75，或灵敏度/特异性的等价测量)，所述预测能力在于使用用于给定算法的任何组合和项目数，与对该度量获得的最大值不超过一个标准偏差。
在另一个方面，本发明提供了用于确定早产概率的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于检测生物标志物的一种或多种试剂，用于容纳分离自怀孕的雌性动物的生物样品的容器；和将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以检测生物样品中分离的生物标志物的存在或量的打印的说明书。所述试剂可以包装在单独的容器中。所述试剂盒还可以包含一个或多个对照参考样品和用于实施免疫测定的试剂。
所述试剂盒可以包含用于包含在所述试剂盒内的组合物的一个或多个容器。组合物可以处于液体形式或者可以是冷冻干燥的。适合用于所述组合物的容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述试剂盒还可以包含包装说明书，其含有确定早产概率的方法的书面说明。
根据上述说明，显而易见的是可以对本文所述的本发明做出改变和变化以使其适合于多种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
在本文中，对变量的任何定义中的元素列表的列举包括该变量作为任何单个元素或所列元素组合(或子组合)的定义。在本文中，对实施方式的列举包括作为任何单个实施方式或者与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
在本说明书中提及的所有专利和专利公开以每个单独的专利和专利公开具体并且单独表明作为参考并入本文的相同程度作为参考并入本文。
通过非限制性说明提供了以下实施例。
实施例
实施例1.用于早产生物标志物的发现和验证的样品组的建立
建立控制早产风险蛋白质组学评价(PAPR)临床研究实施的标准规程。在整个美国，在11个机构审查委员会(IRB)批准的地点从妇女获得样品。在提供知情同意书后，获得血清和血浆样品，以及有关患者人口统计学特征、过往病史和妊娠史、当前妊娠史和并行药物治疗的相关信息。分娩后，采集与母体和婴儿状况以及并发症有关的数据。根据规程处理血清和血浆样品，所述规程需要标准化冷冻离心，将样品等分至2-D条码冷冻小瓶并随后在-80℃冷冻。
分娩后，逐个回顾早产病例以确定它们的状态是自发早产还是医学人工早产。仅自发早产病例用于该分析。对于早产生物标志物的发现，分析了来自86个早产病例和172个对照的血清样品，其覆盖了17周0天(17.0)至28周6天(28.6)的抽血时胎龄(GABD)。出于复核的目的，还分析了单独的样品组，所述样品组由来自在相同胎龄范围的50个早产病例和100个对照的血清组成。通过GABD匹配每个病例的两个对照，并且所述对照选自一些随机产生的对照组，所述对照组与2012年国家人口统计报告中报告的出生分布相匹配。制定了规程以确保实验室人员不知道出生时的胎龄以及用于两个样品组的受试者的病例vs对照状态。资料人员也不清楚复核样本组，直至样品的解析分析完成。
使用人14多重亲和去除系统(MARS 14)从血清样品中除去了高丰度蛋白，其除去了14种丰度最大的蛋白质，这些蛋白质被视为对血清蛋白质组学中疾病相关变化的鉴别是无信息性的。根据生产商的规程，使用MARS-14柱(4.6×100mm，产品目录#5188-6558,Agilent Technologies)除去过滤的样品。在自动进样器中，将样品冷却至4℃，在室温下运行除去柱，并将收集的馏分保持在4℃直至进一步分析。收集未结合的馏分用于进一步分析。
将除去的血清样品用二硫苏糖醇还原，使用碘乙酰胺烷基化，然后用5.0μg胰蛋白酶Gold-Mass Spec级(Promega)在37℃水解17小时(±1小时)。胰蛋白酶消化后，将187个稳定同位素标准(SIS)肽的混合物加入至样品，并将每个样品的一半在Empore C18 96-孔固相萃取板(3M Bioanalytical Technologies)上脱盐。根据生产商的规程来调节板。将肽用300μl 1.5％三氟乙酸、2％乙腈清洗，用250μl 1.5％三氟乙酸、95％乙腈洗脱，在-80℃冷冻30分钟，然后冷冻干燥至干燥。将冷冻干燥的肽用含有三种非人内标(IS)肽的2％乙腈/0.1％甲酸复溶。将肽在40℃，在Agilent Poroshell120EC-C18柱(2.1×100mm，2.7μm)上用400μl/min的30min的乙腈梯度分离，并进样至Agilent 6490三重四极杆质谱仪。
使用经调度多次反应监控方法(sMRM)分析去除后的和胰蛋白酶水解的样品。sMRM测定监控了898个转化，其测量了259个生物肽和190个IS肽(187个SIS+3个IS)，其代表了148种蛋白。使用Mass Hunter定量分析软件(Agilent Technologies)对色谱峰值积分。
数据分析
在两个阶段进行发现和复核样本数据的分析。在第一阶段，通过使用发现样品的选择和使用独立复核样品组的确认来鉴别稳健的生物标志物。在第二阶段，将发现和复核数据混合并用于鉴别对于分类器发展的最佳分析物和分析物组。
阶段I：盲式分析
起初分类器发展针对胎龄17.0至25.6。使用发现样品，基于预分析和分析标准，选择对应于62种蛋白的一组肽。在横跨三周的一系列窄GABD窗(相邻的窗之间有两周重叠)中评价分析物的诊断表现。基于诊断表现中的一致性(在整个GABD中，在病例相对于对照中上调和下调)，选择43个分析物的亚组进行进一步分析。
对于每个窄GABD窗，使用所述窄窗内上调和下调的分析物的全部组合形成一组逆转。逆转值是上调分析物的相对峰面积与下调分析物的相对峰面积的比值并且用于归一化差异度和放大诊断信号。在狭窄窗内所有可能的逆转中，基于它们各个单变量的表现来选择亚组(AUC>＝0.6)。
对于每个窗，形成了不同大小的逆转组(大小为2、3、4、6、8)。对于窗内每个组的大小，通过分别对70％和30％的样本迭代训练和测试1000次逻辑分类器来实施蒙特卡洛交叉验证(MCCV)。随后，将通过平均MCCV AUC确定为最优的组大小4用于鉴别对组良好实施的候选逆转。通过在MCCV分析中在组大小为4的表现最佳的逻辑分类器上的出现频率鉴别候选逆转。对于每个窗，使用灵敏度范围在0.7至1的AUC或部分AUC(pAUC)的表现量度或者分类器输出得分与分娩时间值(TTB)的相关性(GABD和出生时胎龄之间的天数差异)产生三组逆转频率表。从这些逆转列表中的每一个中选择前15个逆转进行进一步分析。
对于每个GABD窄窗，从三个列表(AUC、pAUC和TTB)中的每一个形成大小为2、3、4的逆转组，并且基于MCCV分析的表现，在每个窗中，对于每个组大小选择前15个组。与对于每个窗来自三个列表(AUC、pAUC和TTB)中每一个的前15个逆转一起，将大小为2、3、4的这些前15个组用于对发现样品训练逻辑分类器，并且以盲式方式对复核样本产生分类得分。
第三方统计学家评价所有逆转和分类器组的表现，并且报告ROC曲线的AUC、pAUC和分类器得分的TTB相关性。
阶段II：非盲分析
在非盲之后，将发现和复核数据组合并并再分析。由于诊断蛋白的表达在妊娠过程中可能会变化，因此我们检验了与GABD有关的蛋白水平。应用+/-10天的中值平滑窗以产生动力学图。将蛋白质的相对水平表示为内源肽峰面积相对于其相应SIS标准的比值(相对比值)。图3、4和10中显示了妊娠期间水平升高，但在PTB病例和对照之间并无不同的蛋白质的实例。这种蛋白质水平的测量可以用于准确确定妊娠日期(例如，妊娠“时钟”)。妊娠时钟根据一种或多种蛋白质的相对丰度(转化)预测胎龄。作为另外一种选择，在该相同分析中，我们鉴别了在GABD期间水平变化，但在PTB病例和对照之间显示出差异的蛋白质，图5。这些蛋白质是PTB分类器发展的显而易见的诊断候选。还举例说明了使用过表达蛋白相对于低表达蛋白的比值形成逆转的影响(图8和21)。很明显这导致PTB病例和对照之间分离的增加。先前分析表明一些分析物的水平可能受孕前体重指数(BMI)的影响。CLIN.CHEM.37/5,667-672(1991)；European Journal of Endocrinology(2004)150 161–171。出于该原因，通过仅在BMI小于35的患者中表示妊娠期间的逆转值来研究BMI对分离的影响(图21)。这导致分离中的进一步改善。
合并的发现和复核数据组中的逆转选择和分类器发展反映了早期研究。我们关注第3重叠GABD窗(133-153天)以举例说明分析。实施MCCV分析以鉴别候选逆转。为了评价组的表现，在简单的LogSum分类器中将逆转值合并。LogSum分类器基于每个逆转对该样品的相对比值的log值的和将得分分配给每个样品。这类分类器中系数的缺少有助于避免过度拟合的问题。本领域的任何技术人员可以通过良好建立的技术使用相同的分析物获得等价的逻辑分类器。将由4种蛋白所形成的三个最佳逆转的组的多变量表现显示为通过交叉验证所获得的AUC值的柱状图并在图8的ROC曲线中显示。先前分析表明一些分析物的水平可能受孕前体重指数(BMI)的影响。
我们确定了通过使用ITIH4/CSH在本文中举例说明的蛋白质和/或逆转，所述ITIH4/CSH是分娩时间(TTB)的强预测因子(图10)。TTB定义为GABD和出生时胎龄(GAB)之间的差异。这具有使得能够单独或以这些分析物的数学组合进行预测的潜能以临床估计TTB(或GAB)。
实施例2.IBP4/SHBG sPTB预测因子的验证
本实施例显示了在妊娠早期的无症状妇女中在大型母体血清蛋白质组学工作中鉴别的IBP4/SHBG sPTB预测因子的验证。
受试者
在美国11个机构审查委员会(IRB)-批准的地点，在标准化协议下进行早产风险的蛋白质组学评价(PAPR)(Clinicaltrials.gov识别号：NCT01371019)。招募17 0/7至28 6/7周GA之间的受试者。使用通过早期超声生物测量学或单独的超声确认的月经日期的预先规定的协议确立日期，从而提供最好的临床估计的胎龄。体重指数(BMI)来源于身高和妊娠前自我报告的体重。排除多次妊娠和具有已知或怀疑的主要胎儿异常的妊娠。收集有关受试者人口统计学特征、过往医学和妊娠史、当前妊娠史和正在进行的药物治疗的相关信息并输入电子病例报告形式。分娩后，采集母体和婴儿结局和并发症的数据。将所有分娩判定为足月产(≥37 0/7周GA)、自发早产(包括早产胎膜早破)或医学人工早产。如所指示的，由主要研究者在研究地点澄清差异。在验证研究之前完成判定并锁定数据。
样本采集
如下所述采集并处理母体血液：10分钟室温凝血期，然后是快速冷冻离心或在冰水浴上在4-8℃放置直至离心。在采集2.5小时内将血液离心，并将0.5ml的血清等份在-80℃储存直至分析。
预测因子发展原则
IBP4/SHBG预测因子的发展包括与医学研究所(IOM)在“组学”研究中的最佳实践的指导方针一致的独立和顺序发现、复核和验证步骤。IOM(Institute of Medicine)。Evolution of Translation Omics:Lessons Learned and the Path Forward.(MicheelCM,Nass SJ,Omenn GS主编).Washington,DC:The National Academies Press.；2012:1–355。分析验证在临床验证样本分析之前并且包括批次间和批次内的精确度、残留和检测限的评价。
独立于发现和复核，对预先指定的sPTB病例和对照样本实施验证巢式病例/对照分析。sPTB病例包括来自全部9个地点的样品，其中两个地点对于验证是唯一的。在质谱(MS)血清分析前，验证病例和对照通过每位受试者的医疗记录进行了100％的原地来源文档复核。该过程确保所有受试者满足包括和排除标准，并且在样品采集和递送时对所有受试者确认医学/妊娠并发症以及出生时GA的分配。预先制定了详细的分析规程，包括验证研究设计、分析计划和盲式规程。除了临床操作主管(DCO)和临床数据经理外，工作人员对受试者病例、对照和出生时GA数据分配不知情。数据分析计划包括预先指定的验证主张以及用于双重独立外部分析的规程。通过不知情的统计学家，对所有受试者样品确定了如下所述计算的预测因子得分。对通过DCO与预测因子得分相联系的病例、对照和GA数据进行独立的外部统计分析。然后，将接收工作特性曲线下面积(AUROC)和显著性测试结果转移回DCO。数据转移引入了SUMPRODUCT功能的使用(Microsoft.Microsoft Excel.2013)以确保维持数据完整性。为了提供来自每个受试者的数据直至验证结果的审核跟踪，将实时数字时间戳应用于分析数据、计划和报告。
验证研究设计
在初步分析中，将sPTB病例定义为由于早产胎膜早破(PPROM)或者<37 0/7周的GA的自发分娩发作而分娩的受试者。对照是在≥37 0/7周GA分娩的受试者。先前的发现和复核分析使用在宽胎龄范围(17 0/7至256/7周GA)采集的血清样品研究了44个候选生物标志物(补充材料)。发现和复核鉴别了最优的窄抽血GA间隔(19 0/7至21 6/7周)和两个蛋白IBP4和SHBG，其通过AUROC以比值(IBP4/SHBG)用作sPTB的最佳预测因子(补充材料)。在发现和复核中，无极端BMI值的患者通过IBP4/SHBG具有改善的分类表现(补充结果)。在发现和复核分析后，我们继续进行分析和临床验证。
验证sPTB病例总计有18位抽血时在19 0/7至21 6/7周GA(GABD)之间的采集的受试者，其来自17 0/7至28 6/7周GA之间的总计81位可用的受试者。对照组包括每个sPTB病例通过GABD匹配的两个对照，其是使用R统计程序(R 3.0.2)随机选择的(Team RC.R:aLanguage and Environment for Statistical Computing.Vienna,Austria；2014.2015；Matei A,TilléY.The R“sampling”package.European Conference on Quality inSurvey Statistics.2006)并使用X2检验与2012年国家人口统计报告(Martin JA,Hamilton BE,Osterman MJ,Curtin SC,Mathews TJ.Births:Final Datafor2012.National Vital Statistics Reports.2014；63(09):1–86)中所列的足月分娩分布相比较。检验随机产生的对照组(10个一组)获得接近于1.0的p-值的组。
主要目标是验证IBP4/SHBG比值作为使用AUROC的sPTB的预测因子的表现(TeamRC.R:a Language and Environment for Statistical Computing.Vienna,Austria；2014.2015；Sing T,Sander O,Beerenwinkel N,Lengauer T.ROCR:visualizingclassifier performance in R.Bioinformatics.2005；21(20):7881)。为了控制整体多个测试的错误率(α＝0.05)，将固定的顺序方法(Dmitrienko A,Tamhane AC,Bretz F,eds.Multiple Testing Problems in Pharmaceutical Statistics.Boca Raton,Florida:CRC Press；2009:1–320；Dmitrienko A,D'Agostino RB,Huque MF.Keymultiplicity issues in clinical drug development.Stat Med.2012；32(7):1079–111.doi:10.1002/sim.5642.)应用于在应用和不应用BMI划分的发现和复核中鉴别的最优间隔(19 0/7至21 6/7周GA)内的GABD增量(参见补充材料)。通过检验与AUROC＝0.5(随机偶然因素)的等价性的Wilcoxon-Mann-Whitney统计评价显著性。(Bamber D.The areaabove the ordinal dominance graph and the area below the receiver operatingcharacteristic graph.Journal of mathematical psychology.1975；12(4):387–415.doi:10.1016/0022-2496(75)90001-2；Mason SJ,Graham NE.Areas beneath therelative operating characteristics(ROC)and relative operating levels(ROL)curves:Statistical significance and interpretation.QJR Meteorol Soc.2002；128(584):2145–2166.doi:10.1256/003590002320603584.)。对于<37 0/7相对于≥37 0/7周GA之外的GA边界(例如，<36 0/7相对于≥36 0/7，<35 0/7相对于≥35 0/7)的分类表现的确定，将病例和对照重新定义为分别小于和等于/大于所述具体边界的所有受试者。
实验室方法
使用系统生物学方法来产生高度多路的多反应监控(MRM)MS测定(补充方法和结果)。验证测定定量了对预测因子蛋白IBP4和SHBG及其它对照特异的蛋白水解肽。将样品以32批处理，其包括临床受试者(24)、来自健康非妊娠供体的混合血清标准品(HGS)(3)、来自健康妊娠供体的混合血清标准品(pHGS)(3)和用作处理对照的磷酸盐缓冲盐水(2)。对于所有分析，首先使用MARS-14免疫去除柱(Agilent Technologies)去除血清样品中的高丰度和非诊断蛋白，将所述样品用二硫苏糖醇还原，用碘乙酰胺烷基化并用胰蛋白酶水解。然后，将重稳定同位素标记的标准(SIS)肽加入样品，随后对其脱盐并通过反相液相色谱(LC)/MRM-MS分析。通过产生响应比(RR)将SIS肽用于归一化，其中将在血清中测量的肽片段离子的峰面积(即转化)除以加样到相同血清样品中的相应SIS转化的峰面积。
IBP4/SHBG预测因子
将预测因子得分定义为IBP4和SHBG肽转化响应比的比值的自然log：
Figure GDA0001913956120000561
其中RR是各个肽测量的响应比。
结果
图23总结了PAPR中研究受试者的分布。在2011年3月至2013年8月之间，招募了5,501名受试者。如规程中预先确定的，由于在妊娠的第一个三个月后接受了孕激素疗法，将410名(6.7％)受试者排除在分析之外。由于早期停止排除了另外120名(2.2％)受试者，并且146名(2.7％)受试者失去随访。总计4,825名受试者可用于分析。有533例PTB；248例(4.7％)自发和285例(5.9％)医学指示的PTB。与足月分娩的那些相比，sPTB受试者很可能具有一次或多次在先的PTB并且在本研究的妊娠中在妊娠12周后经历过出血(表1)。选择用于验证的sPTB病例和足月产对照的特征彼此未显著不同，除了有显著更多的西班牙裔对照外(47.5％相对于33.3％，p＝0.035)。类似地，除足月产对照的种族外，选择用于验证的受试者在很大程度上作为整体代表了研究群组(表1)。
验证分析
在发现和复核分析中，分别通过AUROC和GA间隔，将IBP4/SHBG的比值和19 0/7至21 6/7周GA之间的间隔鉴别为最佳表现的sPTB预测因子(下文中的补充结果)。对于验证，在使用和不使用BMI划分的情况下，以对于19 1/7至20 6/7周的GA间隔所鉴别的最佳表现，预先确定的固定顺序方法验证了IBP4/SHBG预测因子。不考虑BMI，验证的表现为AUROC＝0.67(p＝0.02)(补充结果)。然而，如所期望的，通过>22和≤37kg/m2的BMI划分改善了表现，其对应于AUROC＝0.75(p＝0.016，95％CI0.56-0.91)(图24)。BMI划分的更详细鉴定可见于补充结果。在不同的病例vs.对照边界确定了灵敏度、特异性、AUROC和优势率(OR)的表现量度(表2)。对于sPTB vs.足月产(<37 0/7vs.≥37 0/7周)，灵敏度和特异性分别为0.75和0.74，优势率(OR)为5.04(95％CI 1.4-18)。表2中总结了其它边界的结果。在较低的GA边界改善了测试的准确性。
图25中显示了发病率调节的阳性预测值(PPV)，它是作为预测因子得分的函数的临床风险测量。随着PPV从背景值(在美国，对于单胎分娩，群体sPTB率为7.3％)(Martin等人,Births:final data for 2013.Natl Vital Stat Rep.2015；64(1):1–65Martin JA,Hamilton BE,Osterman MJ,Curtin SC,Matthews TJ.Births:final data for 2013.NatlVital Stat Rep.2015；64(1):1–65)提高至2×(14.6％)或3×(21.9％)(虚线)或更高的相对风险(图25)，发生了通过提高预测因子得分对受试者的划分。在图25中的箱图中显示了通过出生时GA分类进行彩色编码的受试者的IBP4/SHBG预测因子得分值的分布。最早的sPTB病例(<35 0/7周GA)的预测因子得分高于晚期足月产对照(≥39 0/7周GA)，而晚期sPTB病例(≥35 0/7至<37 0/7周GA)的得分与早期足月产对照(≥37 0/7至<39 0/7周GA)的重叠(图25)。根据对应于2×相对风险(14.6％的PPV)的预测因子得分截止值，将验证受试者鉴别为高或低风险。然后，将高和低风险组的分娩率显示为Kaplan Meier分析中的事件(图26)。根据该分析，分类为高风险的那些通常比分类为低风险的那些更早分娩(p＝0.0004)。
验证后分析
使用来自最优BMI和GA间隔内的盲式复核(下文中的补充数据)和验证分析的受试者组合，测量了预测因子的表现。显示了合并样品组的ROC曲线，并且其对应于0.72的AUROC(p＝0.013)(图27)。
使用“组学”方法，我们发展了由BMI间隔在>22和≤37kg/m2之间的19-20周的IBP4/SHBG水平的比值组成的母体血清预测因子，其鉴别了75％注定发生sPTB的妇女。在先的sPTB史(Goldenberg等人,Epidemiology and causes of preterm birth.Lancet.2008；371(9606):75–84.doi:10.1016/S0140-6736(08)60074-4；Petrini等人,Estimatedeffect of 17alpha-hydroxyprogesterone caproate on preterm birth in the UnitedStates.Obstet Gynecol.2005；105(2):267–272)和宫颈长度量测(Iams等人,The lengthof the cervix and the risk of spontaneous premature delivery.NationalInstitute of Child Health and Human Development Maternal Fetal Medicine UnitNetwork.N Engl J Med.1996；334(9):567–72；Hassan等人,Vaginal progesteronereduces the rate of preterm birth in women with a sonographic short cervix:amulticenter,randomized,double-blind,placebo-controlled trial.UltrasoundObstet Gynecol.2011；38(1):18–31)。被认为是到目前为止最好的临床风险测量；然而，它们单独或组合都不能预测大部分sPTB。
理想的sPTB预测工具将是微创的，在与常规产科访问时机一致的妊娠早期实施，并且将准确鉴别具有最高风险的那些。当前的“组学”研究表明可以在sPTB受试者中测量的母体血清分析物中检测妊娠生理状态的扰动。PTB中组学发现研究包括蛋白质组学(Gravett等人,Proteomic analysis of cervical-vaginal fluid:identification ofnovel biomarkers for detection of intra-amniotic infection.J ProteomeRes.2007；6(1):89–96；Goldenberg等人,The preterm prediction study:the value ofnew vs standard risk factors in predicting early and all spontaneous pretermbirths.NICHD MFMU Network.Am J Public Health.1998；88(2):233–8；Gravett等人,Diagnosis of intra-amniotic infection by proteomic profiling andidentification of novel biomarkers.JAMA.2004；292(4):462–469；Pereira等人,Insights into the multifactorial nature of preterm birth:proteomic profilingof the maternal serum glycoproteome and maternal serum peptidome among womenin preterm labor.Am J Obstet Gynecol.2010；202(6):555.e1–10；32；Pereira等人,Identification of novel protein biomarkers of preterm birth in humancervical-vaginal fluid.J Proteome Res.2007；6(4):1269–76；Dasari等人,Comprehensive proteomic analysis of human cervical-vaginal fluid.J ProteomeRes.2007；6(4):1258–1268；Esplin等人,Proteomic identification of serum peptidespredicting subsequent spontaneous preterm birth.Am J Obstet Gynecol.2010；204(5):391.e1–8)、转录组学(Weiner等人,Human effector/initiator gene sets thatregulate myometrial contractility during term and preterm labor.Am J ObstetGynecol.2010；202(5):474.e1–20；Chim等人,Systematic identification ofspontaneous preterm birth-associated RNA transcripts in maternal plasma.PLoSONE.2012；7(4):e34328。Enquobahrie等人,Early pregnancy peripheral blood geneexpression and risk of preterm delivery:a nested case control study.BMCPregnancy Childbirth.2009；9(1):56)、基因组学(Bezold等人,The genomics ofpreterm birth:from animal models to human studies.Genome Med.2013；5(4):34；Romero等人,Identification of fetal and maternal single nucleotidepolymorphisms in candidate genes that predispose to spontaneous preterm laborwith intact membranes.Am J Obstet Gynecol.2010；202(5):431.e1–34；Swaggart等人,Genomics of preterm birth.Cold Spring Harb Perspect Med.2015；5(2):a023127；Haataja等人,Mapping a new spontaneous preterm birth susceptibility gene,IGF1R,using linkage,haplotype sharing,and association analysis.PLoSGenet.2011；7(2):e1001293；McElroy等人,Maternal coding variants in complementreceptor 1and spontaneous idiopathic preterm birth.Hum Genet.2013；132(8):935–42)和代谢组学(Menon等人,Amniotic fluid metabolomic analysis in spontaneouspreterm birth.Reprod Sci.2014；21(6):791–803)方法。然而，到目前为止，这些方法无一产生验证的测试方法以可靠预测无症状妇女中的sPTB风险。
本发明是允许独立发现、复核和验证分析，同时遵守有关组学测试发展的IOM指导方针的大型预期性和同时期临床研究的结果。它涉及构建大型和标准化的多路蛋白质组学测定以探索妊娠中具有相关性的生物学途径。研究规模和相关较宽的血液采集窗(17 0/7至28 6/7周GA)还使得能够鉴别其中在sPTB病例和足月产对照之间存在明显蛋白质浓度变化的GA间隔。低复杂性预测因子模型(即两种蛋白质的比值)的使用限制了过度拟合的问题。
蛋白质组学测定和模型建立的应用导致鉴别了对sPTB具有一致优良预测表现的一对关键蛋白质(IBP4和SHBG)。尽管对归因于多种病原学的病况建立分类器存在困难，但是所述预测因子在<37 0/7vs.≥37 0/7周GA的截止点显示出良好性能，其AUROC为0.75。重要地，对于早期sPTB(例如，<35 0/7周GA)预测因子准确度改善，这使得能够检测具有最大发病可能的那些sPTB。使用IBP4/SHBG预测因子确定为对sPTB具有高风险的受试者比鉴定为低风险的受试者显著更早分娩。我们的发现表明IBP4和SHBG可以发挥与sPTB的病原学有关的重要功能和/或在相关生物学途径中起到汇合点的作用。
在我们的大部分研究中心，未定期进行宫颈长度(CL)通用的经阴道超声(TVU)测量，并且这种测量对不到1/3的研究受试者可用。评价在今后的研究中通过蛋白质组学预测因子是否改善CL测量，或者作为另外一种选择，通过IBP4/SHBG分类器的风险划分是否鉴别了从后续CL测量中最受益的妇女将是有意义的。最后，研究所述分子预测因子以及BMI变量，或者可能结合其它医学/妊娠史和社会人口学特征的表现将是有趣的。
总之，在完全独立的受试者组中验证了基于无症状经产和未产妇女中IBP4和SHBG的血清测量的对sPTB预定的指示测试。对这些蛋白质、它们的基因调控以及相关途径的其它功能研究可能有助于阐明sPTB的分子和生理学基础。该预测因子的应用应使得能够早期和灵敏地检测具有sPTB风险的妇女。这可以通过提高的临床监管改善妊娠结局并加快PTB预防的临床干预的发展。
补充的材料和方法
发现和复核受试者
发现和复核受试者来源于本实施例中如上所述的PAPR研究。
发现和复核原则
sPTB病例如本实施例中以上所述。根据“组学”研究中最佳实践的指导方针进行预测因子的发现和复核。(IOM(医学研究所))。Evolution of Translation Omics:LessonsLearned and the Path Forward(Micheel CM,Nass SJ,Omenn GS主编).Washington,DC:The National Academies Press.；2012:1–355)。巢式病例/对照分析使用了彼此完全独立的样品组。选择用于发现和复核的病例和对照经历了受试者内数据差异的中心审查；未实施具有医疗记录的源文档复核(SDV)。通过首席医务官单个判断用于发现和复核的所有sPTB病例和对照，并且由临床地点的PI澄清差异。预先制定了详细的分析规程，包括研究设计、分析计划和复核盲式规程。实验室和数据分析人员对复核受试者病例、对照和GA数据分配不知情。通过内部不知情的统计学家，对所有受试者分配如下所述计算的预测因子得分。将通过DCO与预测因子得分相联系的病例、对照和GA数据提供至独立的外部统计学家用于分析。然后，将AUROC结果转移回DCO。数据转移使用了Excel中的SUMPRODUCT(Microsoft.Microsoft Excel.2013)功能以确保维持数据完整性。为了提供来自受试者的数据直至复核结果的审核跟踪，将数字时间戳应用于分析数据、计划和报告。
发现和复核的研究设计
发现和复核sPTB病例分别总计为86和50位受试者，其在17 0/7至28 6/7周的抽血时GA(GABD)采集。在发现和复核中使用的受试者彼此完全独立，并且与验证中使用的那些无关。在本实施例中，在如上所述的发现和复核中对sPTB病例鉴别了匹配的对照。
发病率分析
在发现、复核和验证分析后，从PAPR数据库选择在先前研究中未使用的其它足月产对照并使用在验证中应用的和在本实施例中如上所述的MRM-MS测定在实验室中进行处理。使用R Statistical软件(3.0.3版)中的采样包(Sampling package)(Team RC.R:aLanguage and Environment for Statistical Computing.Vienna,Austria；2014.2015；Matei A,TilléY.The R“sampling”package.European Conference on Quality inSurvey Statistics.2006)，从验证的GA抽血间隔随机选择了187名受试者组并通过单变量统计分析(X2检验)针对来自2012年国家人口统计报告(NVSR)的出生时胎龄(GAB)数据进行比较。Martin等人,Final Data for 2012.National Vital Statistics Reports.2014；63(09):1–86。然后，基于最佳p值(接近1，最小可接受值为0.950)选择最接近于2012NVSR中的分娩分布的对照组用于针对作为整体的PAPR研究中的BMI分布进行比较。使用单变量统计分析(X2检验)，针对来自PAPR研究数据库的BMI数据，选择最接近于BMI分布(接近1，最小可接受值0.950)和NVSR中分娩时间分布的对照组并与验证的抽血样品的GABD进行比较。选择最接近所有三种分布的组作为发病率研究的受试者组。验证GABD间隔和BMI限制内用于复核、验证和发病率的预测因子得分值总计150名受试者。在图25中，将该复合数据组用于获得有关PPV曲线的置信区间的最佳估值。通过二项式比例误差的正态近似计算有关PPV的置信区间。Brown等人,Interval estimation for a binomial proportion.Statisticalscience.2001；16(2):101–133。
实验室方法
通过以下步骤的迭代应用，使用系统生物学方法产生高度多路的多反应监控(MRM)质谱(MS)测定：文献管理、靶向和非靶向蛋白质组学发现以及受试者样品的小型MRM-MS分析。在发现和复核研究中应用了测量147种蛋白质的成熟MRM-MS测定。对于所有分析，如本实施例中以上所述，在实验室中处理血清样品。将混合血清对照(pHGS)等份用于计算IBP4和SHBG的批次内分析变异系数(CV)。
一般预测因子的发展策略
发展策略以避免过度拟合并克服妊娠期间由于蛋白质表达的动态性质所造成的在宽胎龄范围内预期生物标志物表现的稀释。在预测因子发展中使用了上调相对于下调分析物强度的比值。这种“逆转”类似于最高得分对和2-基因分类器策略。(Geman等人,Classifying gene expression profiles from pair wise mRNA comparisons.StatAppl Genet Mol Biol.2004；3(1):Article19；Price等人,Highly accurate two-geneclassifier for differentiating gastrointestinal stromal tumors andleiomyosarcomas.Proc Natl Acad Sci USA.2007；104(9):3414–9)。由于两种蛋白在“逆转”中经历了相同的预分析和分析处理步骤，因此这种方法允许放大诊断信号和自归一化。作为复杂蛋白质组学工作流程中归一化肽强度测量的策略，逆转还类似于被称为“内原蛋白归一化(EPN)”的最近引入的方法。(Li等人,An integrated quantification method toincrease the precision,robustness,and resolution of protein measurement inhuman plasma samples.Clin Proteomics.2015；12(1):3；Li等人,A blood-basedproteomic classifier for the molecular characterization of pulmonarynodules.Sci Transl Med.2013；5(207):207ra142)。通过分析标准减少了用于模型建立的候选分析物的数目。分析过滤器包括：分析精确度、强度、干扰迹象、样品处理顺序依赖性和预分析稳定性的截止值。任一个预测因子中分析物的总数受限于单一逆转，因此避免了复杂的数学模型。将预测因子得分定义为单一逆转值的自然log，其中所述逆转本身是响应比(在本实施例以上定义)。最后，在妊娠的窄重叠3-周间隔中研究了预测表现。
接收工作特性曲线
对本实施例中如上所述的逆转计算了AUROC值和相关的p-值。使用通过有放回地选择随机样品组来迭代实施自举采样，计算合并的发现和复核组中预测因子AUROC的分布和平均值。Efron B,Tibshirani RJ.An Introduction to the Bootstrap.Boca Raton,Florida:Chapman and Hall/CRC Press；1994。每次迭代时所选样品的总数对应于起始混合中可用的总数。
补充结果
表3中总结了发现、复核和验证受试者的特征。发现sPTB病例中具有一次或多次在先sPTB的受试者的百分比高于复核或验证，并且其它特征在所述研究中基本一致。
发现和复核分析
在重叠的3周GA间隔中44种蛋白上调或下调并且通过了分析过滤器(图28)。逆转由上调相对于下调蛋白的比值以及重叠3-周GA间隔中的每一个中的样品中所测试的预测表现组成。图29中显示了逆转亚组的表现，其显示了代表性图案。表现的波动是明显的：IBP4/SHBG和APOH/SHBG逆转在早期窗中具有更好的AUROC值，而ITIH4/BGH3和PSG2/BGH3在妊娠晚期达到峰值(图24)。一些逆转在整个胎龄范围内具有一致但适度的表现(PSG2/PRG2)(图29)。在19 0/7至21 6/7的间隔中，整体表现最好的逆转IBP4/SHBG具有AUROC＝0.74(图29)。当通过妊娠前BMI<35(kg/m2)划分受试者时，IBP4/SHBG预测因子的AUROC表现增至0.79(表4)。由于其在妊娠初期(即17 0/7至22 6/7周GA)一致强大的表现(图29)和潜在所期望的临床应用，选择IBP4/SHBG预测因子用于复核分析。
复核样本中盲式IBP4/SHBG AUROC表现对所有受试者和BMI划分的受试者分别为0.77和0.79，这与发现中所得的表现良好一致(表5)。在盲式复核后，将发现和复核样本混合用于自举表现确定。从2,000次自举迭代中获得了0.76的平均AUROC(图30)。
BMI验证分析
在验证样品中在一些BMI截止值评价了IBP4/SHBG预测因子的表现(表5)。通过去除极高(例如>37kg/m2)或者低BMI(例如≤22kg/m2)适度改善了AUROC测量的表现。通过两种截止值的组合的划分，提供了0.75的AUROC(表5)。
实施例3.质谱和免疫测定数据的相关性
本实施例显示了在早期、中期和晚期胎龄采集窗鉴别IBP4以及sPTB的其它单个生物标志物的Myriad RBM筛选的结果，(2)SHBG/IBP4的MS和免疫测定结果的相关性，和(3)与作为sPTB的生物标志物的SHBG有关的临床数据。
RBM数据
简要地，RBM测定了来自PAPR的40例病例和40例对照(20/20来自早期窗，10/10来自中期窗，10/10来自晚期窗)。RBM使用了Human Discovery MAP 250+v2.0(Myriad RBM,Austin,TX)。这些分析的目标是使用多个分析物发展多元模型以预测PTB。我们使用了四种建模方法：随机森林(rf)、助力(boosting)、lasso和逻辑(logit)方法。我们实施了第一轮变量选择，其中每种方法独立选择对该方法最好的15个变量。从这15个变量中，使用向后逐步选择和使用袋外自举样品(out-of-bag bootstrap samples)的ROC曲线下面积(AUC)估计，通过四种建模方法中的每一个独立选择最好的分析物。表6显示了一些多变量模型的最大采样数。表7显示了通过不同多元模型的早期窗(GABD 17-22周)分析物分级。表8显示了通过不同多元模型的中期窗(GABD 23-25周)分析物分级。表9显示了通过不同多元模型的晚期窗(GABD 26-28周)分析物分级。
鉴别与质谱数据相关的商品化ELISA试剂盒
简要地，ELISA相对于MS的比较包括使用PAPR样品且大小范围在30-40名受试者的多个研究。根据生产商的规程，实施每个ELISA。然后，将通过ELISA的每个分析物的预测浓度与MS所得的来自相同样品的相对比进行比较。然后，产生Person's R相关值用于比较。ELISA相对于MS的比较包括使用PAPR样品且大小范围在30-40名受试者的多个研究。根据生产商的规程，实施每个ELISA。然后，将通过ELISA的每个分析物的预测浓度与MS所得的来自相同样品的相对比进行比较。然后，产生Person's R相关值用于比较。表10提供了对分析物IBP4_HUMAN和SHBG_HUMAN所测试的试剂盒的表位和克隆性信息。表11显示并非所有ELISA试剂盒与MS相关，即使对于其中存在相关性的蛋白。参见，例如：IBP4、CHL1、ANGT、PAPP1。
选择120个先前冷冻的具有已知结局的来自PAPR研究的血清样品用于ELISA和MS测定之间的比较。这些样品的抽血时胎龄(GABD)在119至180天之间。由于母体BMI，未排除样品。在可商购的IBP4(AL-126,ANSCH Labs Webster,Texas)和SHBG(DSHBG0B,R&DSystems Minneapolis,Minnesota)试剂盒上实施ELISA。根据生产商的规程进行测定。将内标用于板间归一化。根据LN([IBP4]/[SHBG])从ELISA浓度值并且根据LN(IBP4RR/SHBGRR)通过MS计算得分，其中RR是指内源肽对SIS肽峰面积的相对比。在病例相对于对照分离中比较了来源于两种方法的得分(p值来源于假设相等标准偏差的非配对t检验)(图31)。
选择57个先前冷冻的具有已知结局的来自PAPR研究的血清样品(19例sPTB病例，38例足月产对照)用于ELISA和MS测定之间的比较。这些样品的抽血时胎龄(GABD)在133至148天之间。在可商购的IBP4(AL-126,ANSCH Labs Webster,Texas)和SHBG(DSHBG0B,R&DSystems Minneapolis,Minnesota)试剂盒上实施ELISA。根据生产商的规程进行测定。使用内标对在不同板上运行的样品归一化。根据LN([IBP4]/[SHBG])从ELISA浓度值并且根据LN(IBP4RR/SHBGRR)通过MS计算得分，其中RR是指内源肽对SIS肽峰面积的相对比。然后，确定通过接收工作特性曲线下面积(AUC)的免疫测定表现，并将其与相同样品组的MS来源的AUC相比较(图32)。在对样品应用BMI划分(BMI>22≤37)，从而导致产生了总计34个样品(13例sPTB病例，21例足月产对照)后，还确定了AUC值(图33)。
通过ELISA和MS测定分析了60个先前冷冻的具有已知结局的来自PAPR研究的血清样品。这些样品预测的抽血时胎龄(GABD)在133至146天之间。对全部BMI的样品(图34，右侧小图)或者对BMI>22或者≤37的样品亚组(图34，左侧小图)进行相关分析。在可商购的IBP4(AL-126,ANSCH Labs Webster,Texas)和SHBG(DSHBG0B,R&D Systems Minneapolis,Minnesota)试剂盒上实施ELISA。根据生产商的规程进行测定。将内标用于板间归一化。根据LN([IBP4]/[SHBG])从ELISA浓度值并且根据LN(IBP4RR/SHBGRR)通过MS计算得分，其中RR是指内源肽对SIS肽峰面积的相对比。通过相关性并且在病例相对于对照分离中比较了来源于两种方法的得分(p值来源于假设相等标准偏差的非配对t检验)。表12显示了表明sPTB相对于对照分离(单变量)的IBP4和SHBG的ELISA试剂盒。
通过质谱和临床分析仪的SHBG测量的比较
将来自单个受试者和怀孕和未怀孕的血清混合物的35个样品在SeraPrognostics和两个独立参考实验室，ARUP Laboratories和Intermountain LaboratoryServices同时进行分析。将等份冷冻运输至每个实验室，并且协调运输，从而使测试将在全部三个实验室在同一天开始。ARUP使用Roche cobas e602分析仪，Intermountain使用Abbott Architect CMIA，两者均为半自动化免疫测定工具。Sera Prognostics使用了独特的蛋白质组学分析方法，其包括样品的免疫去除，酶促消化和在Agilent 6490质谱仪上的分析。以nmol/L报告了ARUP和IHC的结果，而Sera使用了重和轻肽替代物的相对比(RR)。将ARUP和Intermountain的数据彼此比较以确定准确度(图39)。线性度和精确度在整个较宽的结果范围内良好匹配，其线性度斜率为1.032并且r2值为0.990。然后，将每个参考实验室的数据与Sera的RR和线性回归图相比较(图37和38)。数据与Sera的结果良好对比，其中ARUP的r2值为0.937，Intermountain的r2值为0.934。
实施例4.PreTRMTM IBP4和SHBG肽内的SNP、插入和缺失以及结构变体
本实施例显示了PreTRMTM IBP4和SHBG肽内已知的SNP、插入和缺失(indels)以及结构变体。
表13和表14详细描述了PreTRMTM IBP4和SHBG肽内已知的SNP、插入和缺失(indels)以及结构变体。所述信息来源于单核苷酸多态性数据库(dbSNP)Build 146。SHBG中的单个错义变化(G>C)A179P(dbSNP id：rs115336700)具有最高的整体等位基因频率0.0048。尽管该等位基因频率较低，但是千人基因组计划中所研究的一些亚群具有显著较高的频率。这些群体(等位基因频率)为：美国SW的具有非洲祖先的美国人(0.0492)；巴巴多斯的非洲加勒比人(0.0313)；尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人(0.0278)；肯尼亚韦布耶的卢希亚人(0.0101)；尼日利亚的伊山人(Esan)(0.0101)；来自哥伦比亚麦德林的哥伦比亚人(0.0053)；冈比亚西部区域的冈比亚人(0.0044)。所有其它所研究的亚群在该核苷酸位置没有变化。表头包括群集号-(dbSNP rs号)、杂合性-平均杂合性、验证-验证方法(或者无验证时为空白)、MAF-次要等位基因频率、功能-多态性的功能特性、dbSNP等位基因-等位基因核苷酸的同一性、蛋白质残基-由等位基因所产生的残基、密码子位置-密码子中的位置、NP_001031.2氨基酸位置-参考序列NP_001031.2中氨基酸的位置和NM_001040.2mRNA位置-参考序列NM_001040.2中核苷酸的位置。
实施例5.IBP4/SHBG逆转放大了sPTB的诊断信号并且降低了分析变异性
本实施例显示了使用IBP4/SHBG逆转策略获得的诊断信号的放大和变异性的降低。
分别对sPTB病例和足月产对照显示了在所指明的胎龄范围内通过MS确定的IBP4和SHBG的水平(图44和图45)。通过所述肽的相对比(内源肽峰面积相对于相应SIS峰面积)的均值平滑处理产生了曲线。对于IBP4和SHBG，病例相对于对照的信号对应于最大约10％的差异。当将作为ln(IBP4RR/SHBGRR)计算的得分作图时，信号的放大是明显的(最大差异约20％)(图46)。这些数据表明了使用IBP4/SHBG逆转策略获得的诊断信号的放大。
由于每个蛋白质经历了相同的分析和预分析处理步骤，因此形成两个蛋白水平的比值可以降低变异性。为了检验变异性的影响，在来自怀孕供体(pHGS)的混合对照血清样品中，对单个蛋白(IBP4和SHBG的RR)和对IBP4RR/SHBG RR的比值确定了CV。在多个批次中并且在若干天内分析了无生物学差异的混合对照样品。逆转变异小于与单个蛋白有关的变异。(图48)
为了研究逆转形成一般是否会放大诊断信号，我们检验了由多种蛋白的比值所形成的高性能逆转(AUC>0.6)的ROC表现(AUC)。图47的顶部小图中显示了使用来自在19/0周至21/6周妊娠之间收集的样品的数据组的AUC值的范围(sPTB病例相对于足月产对照)。附近的箱图显示了用于形成相关逆转的单个上调和下调蛋白的ROC表现的范围。类似地，来源于Wilcoxon检验(sPTB病例相对于足月产对照)的逆转的p值比相应单个蛋白的p值更显著(图47，底部)。
为了研究逆转的形成是否会更一般地降低变异性，相对于在来自怀孕供体(pHGS)的混合对照血清样品中包含逆转的单个蛋白质的分析变异性，我们检验了72个不同的逆转值(即，相对峰面积的比值)的分析变异性。在多个批次中并且在若干天内分析了无生物学差异的混合对照样品。逆转变异小于与单个蛋白有关的变异(图49)。
逆转策略的普遍性以降低分析变异性。
图48报告了对在几个批次、几天和几种工具中在实验室分析的pHGS样品(混合的怀孕样品)计算的CV。由于使用缺少生物学差异的pHGS样品计算CV，因此它们对应于实验室样品处理中所引入的分析变异性的量度。与72个逆转的比值有关的分析变异性低于用于形成逆转的单个上调和下调蛋白的相对峰面积的分析变异性，图49。
实施例6.医学指明的PTB分析
本实施例确认分类器对基于如子痫前期或妊娠期糖尿病的病况的医学指明的PTB的组分灵敏。
发展了PreTRMTM并作为自发PTB的预测因子进行了验证。在美国，全部PTB中约75％是自发的，而其余的是由于一些母体或胎儿并发症(例如，子痫前期、宫内生长受限、感染)所医学指明的PTB。在实验室分析了来自PAPR生物库的41个医学指明的PTB样品并计算了PreTRMTM得分。相对于其它指征，对注释为医学上指明为子痫前期的受试者比较了PreTRMTM得分。医学上指明为由于子痫前期而早产分娩的受试者比其它受试者具有显著更高的得分(图50)。
图52显示了具有糖尿病注释的逆转强度的热图。红色箭头显示糖尿病受试者。底部列出了样本，其中PTB病例在屏幕右侧，足月产在屏幕左侧。糖尿病患者聚集在右侧，其显示可以鉴别划分妊娠期糖尿病的逆转，并因此有可能根据生物标志物建立诊断测试以预测妊娠期糖尿病。
实施例7.其它转化和肽
表16显示了比较性IBP4肽和转化MS数据。四种不同的重标记的肽(R*+10道尔顿)举例说明了可以对其进行监控以定量IBP4的多种转化和它们的相对强度。本领域技术人员可以潜在地选择这些肽或转化中的任一个或者未举例说明的其它肽或转化以定量IBP4。
表17显示了比较性IBP4肽和转化MS数据。通过MRM-MS分析了来源于重组蛋白的IBP4胰蛋白酶水解肽以鉴别候选替代物肽和它们的转化。本领域技术人员可以潜在地选择这些肽或转化中的任一个或者未举例说明的其它肽或转化以定量IBP4。在RBM中鉴别了IBP4(上文)，然后订购合成肽以建立测定。
表18显示了比较性SHBG肽和转化MS数据。通过MRM-MS分析了来源于重组蛋白或混合的怀孕血清的SHBG胰蛋白酶水解肽以鉴别候选替代物肽和它们的转化。本领域技术人员可以潜在地选择这些肽或转化中的任一个或者未举例说明的其它肽或转化以定量SHBG。还显示了在血清中鉴别的同工型特异性肽。
表19显示了PTB样品中在17-25周GA之间具有改变的血清水平的蛋白质。*PTB中的其它蛋白质限于19-21周GA。来自多个途径的148种蛋白的LC-MS(MRM)测定并分析了来自312名妇女(104个sPTB病例，208个足月产对照)的胎龄(GA)17-25周的血清样品。通过分级聚类、t检验和与GA的关系分析了MRM峰面积数据。分析过滤后，在sPTB相对于足月产受试者中，25种蛋白显示出显著差异(p<0.05)(表1)。在整个GA范围内，在sPTB样品中，14种蛋白质的水平较高，3种较低。发现在GA期的子间隔中，其它蛋白是动态调控的。例如，在GA 19-21周中，在sPTB中其它7种蛋白升高，1种降低。
表20列出了满足分析过滤器的在sPTB相对于足月产对照中上调或下调的44种蛋白。
实施例8.根据自发早产的血清蛋白质组学生物标志物指示的机制理解
本实施例表明随着整个妊娠期间特异性蛋白质表达的动态变化，生物标志物在GA期间的表现显著不同。差异表达的蛋白质在类固醇代谢、胎盘发育、免疫耐受性、血管生成和妊娠维持方面起作用。图55、57-59。sPTB中所见的这些蛋白谱的差异反映了第二个三个月期间胎儿/胎盘区室内受损的发育转变。
简要地，本实施例中所述的研究目标是了解与自发早产(sPTB)预测有关的生物标志物的生理学基础。
研究设计
如炎症、感染和出血的途径已涉及早产的病原学。然而，有关血液中哪些蛋白是可测量的并且它们在妊娠中何时被破坏的了解较少。为了回答这些问题，我们对来自多个途径的148种蛋白建立了LC-MS(MRM)测定并分析了来自312名妇女(104个sPTB病例，208个足月产对照)的胎龄(GA)17-25周的血清样品。
简要地，对血清样品除去高丰度蛋白，用胰蛋白酶水解并对几乎所有蛋白添加稳定重同位素标记的标准(SIS)肽。通过产生响应比将SIS肽用于归一化，其中将在血清中测量的肽片段离子的峰面积(即转化)除以相应SIS转化的峰面积。通过分级聚类、t检验和与GA的关系分析MRM峰面积数据的响应比。
如图53所示，多个肽与相同的蛋白质良好相关。不连续的分支(通过颜色分组)对应于可鉴别的功能种类，如：急性期蛋白、脱脂蛋白和已知的妊娠特异性蛋白质。生殖生物学中重要的蛋白质复合物，如：PAPP1:PRG2、INHBE:INHBC和IGF2:IBP3:ALS是明显的。这些质量评价和突出显示的关系验证了本发明申请中所述的用于探索妊娠生物学和指示sPTB的分析物的发现的高度多路的MRM-MS测定。
图54显示了在胞外基质相互作用中起作用的差异表达的蛋白质。TENX激活潜在的TGF-b并且在细胞滋养层分化的转变点定位至胎儿和母体基质。Alcaraz,L.等人,2014J.Cell Biol.205(3)409–428；Damsky,C等人,1992J.Clin.Invest.89(1)210-222。sPTB中降低的血清TENX水平表示胎盘中的血管缺陷或降低的TGF-b活性。NCAM1(CD56)在神经细胞和自然杀伤细胞上高度表达。NCAM1还由血管内滋养母细胞表达，但是在PE胎盘中减少或不存在。Red-Horse,K.等人,2004J.Clin.Invest.114:744–754。sPTB病例中颠倒的血清NCAM1水平可以反映不良的螺旋动脉重塑和/或有缺陷的免疫调节。CHL1与NCAM1同源并且指导整合素-介导的细胞迁移。BGH3(TGFBI)是血管内皮细胞中表达的细胞粘附分子并且通过与αv/β3整合素的特异性相互作用抑制血管生成。Son,H-N.等人,2013Biochimica etBiophysica Acta 1833(10)2378–2388。sPTB病例中升高的TGFBI可以表示减少的胎盘血管生成。
图55显示了在18周显示出最大分离的在IGF-2途径中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。在妊娠早期，IGF2刺激增殖、分化和绒毛外滋养母细胞的子宫内膜侵袭。IBP4结合并调节母体-胎儿连接处的IGF2的生物利用率。在第一个三个月中升高的IBP4和降低的IGF2分别与IUGR和SGA有关。Qiu,Q.等人,2012J.Clin.Endocrino.l Metab.97(8):E1429-39；Demetriou,C.等人,2014PLOS 9(1):e85454。PAPP1是胎盘-特异性蛋白酶，其切割IBP4并释放活性IGF2。在妊娠初期，低血清PAPP1水平与IUGR、PE和PTB有关。Huynh,L.等人,2014Canadian Family Physician 60(10)899-903。PRG2(proMBP)在胎盘中表达并且共价结合PAPP1并使其失活。PRG2:PAPP1失活复合物在母体血清中循环。Huynh,L等人,2014Canadian Family Physician 60(10)899-903。受干扰的途径调控与可能导致异常胎盘形成的sPTB病例中受损的IGF2活性一致。图56A显示了sPTB期间上述蛋白的动态调控和生物利用率的示意图。
图56B显示了通过结合至IR-B的胰岛素和通过结合至IR-A或IGF1R中任一个的胰岛素和IGFs优先激活的胞内信号的示意图。Belfiore and Malaguarnera,Endocrine-Related Cancer(2011)18R125–R147。通过胰岛素和IGF的IR-A和IGF1R的激活导致了生长优势和通过IRS1/2和Shc蛋白的磷酸化的增殖信号。Shc激活导致了Grb2/Sos复合物的招募，以及Ras/Raf/MEK1和Erk1/2的后续激活。该后一种激酶移位至核并引起参与细胞增殖和存活的一些基因的转录。IRS1/2的磷酸化引起PI3K/PDK1/AKT途径的激活。除了其在代谢效应中的作用之外，AKT还导致参与细胞凋亡和存活(BAD、Mdm2、FKHR、NFkB和JNK)以及蛋白质合成和细胞生长(mTOR)的控制的效应因子的激活。
图57显示了在代谢激素平衡中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。性激素-结合球蛋白(SHBG)是胎盘蛋白，其在妊娠期间升高并且确定了性甾体激素的生物利用率和代谢。降低的SHBG水平导致了更高的游离雄激素和雌激素水平。通过胎盘芳香酶活性可以将游离的雄激素转化为雌激素。雌激素的黄体酮相反活性(Progesterone opposingactivity)促进了妊娠/分娩。甲状腺素-结合球蛋白(THBG)受雌激素诱导并且在中期妊娠提高～2.5倍。sPTB病例中升高的血清THBG水平可以导致降低的游离甲状腺激素。妊娠中甲状腺机能减退与流产和早产风险升高有关。Stagnaro-Green A.and PearceE.2012Nat.Rev.Endocrinol.8(11):650-8。在中期妊娠，雌激素使血管紧张素原提高～3倍以刺激血浆容量～40％的升高。ANGT的上调可以导致妊娠期高血压，这是与sPTB风险提高有关的病况。
图58显示了在血管生成中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。TIE1是TIE2血管生成素受体的抑制性共受体，其阻断Ang-2的功能以刺激血管生成。Seegar,T.等人,2010Mol.Cell.37(5):643–655。色素上皮细胞衍生因子(PEDF)是在胎盘中表达的抗血管生成因子，其通过γ-分泌酶刺激VEGFR-1的切割和失活。组织蛋白酶D(CATD)切割促乳泌素以产生抑制血管生成的血管抑制素(vasoinhibins)。升高的血清CATD和血管抑制素与子痫前期有关。Nakajima,R等人,2015Hypertension Research 38,899-901。富亮氨酸的α-2-糖蛋白(LRG1/A2GL)通过结合共受体内皮糖蛋白(endoglin)促进TGF-β的信号传导。TGF-β通过Smad1/5/8信号通路激活内皮细胞有丝分裂发生和血管生成。Wang,X等人,2013Nature499(7458)。PSG3从单核细胞和巨噬细胞诱导抗炎细胞因子，并通过结合TGF-β刺激血管生成。低PSGs水平与IUGR有关。Moore,T.,and Dveksler,G.2014Int.J.Dev.Biol.58:273-280。ENPP2(自家趋化素(autotaxin))是具有溶血磷脂酶D活性的胞外酶，其产生溶血磷脂酸(LPA)。LPA对胎盘受体起作用以刺激NK细胞和单核细胞的血管生成和趋化性。自家趋化素水平在PIH和早期发生的PE病例中降低。Chen,S-U等人,2010Endocrinology 151(1):369–379。
图59显示了在先天免疫中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。LBP通过其共受体CD14将细菌LPS提供至Toll-样受体-4以引起先天免疫途径的炎症反应。胎球蛋白-A(α-2-HS-糖蛋白)是血液中脂肪酸的载体蛋白并且FetA-FA复合物可以结合并激活TLR4受体。Pal,D等人,2012Nature Med.18(8):1279-85。
图60显示了在凝血中起作用的差异表达的蛋白质的动力学图。
图61显示了差异表达的血清/分泌的蛋白的动力学图。
图62显示了差异表达的PSGs/IBPs的动力学图。
图63显示了差异表达的ECM/细胞表面蛋白的动力学图。
图64显示了差异表达的补体/急性期蛋白-1的动力学图。
图65显示了差异表达的补体/急性期蛋白-2的动力学图。
图66显示了差异表达的补体/急性期蛋白-3的动力学图。
图67显示了差异表达的补体/急性期蛋白-4的动力学图。
实施例9.SDT4/SV4的动力学分析
本实施例提供了如上在实施例1中一开始所举例说明的所有分析物的动力学分析，其数据为17周0天至28周6天。
对于图68-85，使用平均平滑函数均值，针对GABD使用R ggplot2软件包，对每个肽转化的平均相对比作图(窗＝+/-10天)。图展示了使用两种不同的出生时胎龄截止值(<370/7vs>＝37 0/7周和<35 0/7vs>＝35 0/7周)，对病例相对于对照的单独的图。图的标题显示了蛋白质的缩写、下划线和肽序列。分析物序列可以对于标题进行调整以适合该图。
本文中举例说明的动力学分析起到了一些目的。这些分析表明妊娠期间分析物水平是否改变并且向何方向改变，它们是否对病例和对照的改变不同并且显示了与胎龄有关的诊断差异。在一些情况下，诊断信号位于狭窄的胎龄范围，并且随时间升高或降低。动力学图的形状还提供了对于选择在逆转中配对良好的蛋白质的目视指导。
发现在早期窗中，例如，胎龄18至20周之间的样品采集，显示出显著的病例相对于对照的分离的分析物包括(例如)AFAM、B2M、CATD、CAH1、C1QB、C1S、F13A、GELS、FETUA、HEMO、LBP、PEDF、PEPD、PLMN、PRG2、SHBG、TENX、THRB和VCAM1。发现在晚期窗中，例如，26至28周胎龄之间的样品采集，显示出显著的病例相对于对照的分离的分析物包括(例如)ITIH4、HEP2、IBP3、IGF2、KNG1、PSG11、PZP、VASN和VTDB。使用小于35 0/7vs大于或等于35 0/7周，相对于小于37 0/7vs大于或等于37 0/7周的截止值，病例相对于对照的分离得到改善，如对以下分析物所见，其包括(例如)AFAM、APOH、CAH1、CATD、CD14、CLUS、CRIS3、F13B、IBP6、ITIH4、LYAM1、PGRP2、PRDX、PSG2、PTGDS、SHBG和SPRL1。据发现使用较小的出生时妊娠截止值，多种炎性和免疫调控分子显示出改善的分离。本领域技术人员将理解附图中对给定时间窗在病例和对照之间显示出显著分离的任何分析物是作为单个生物标志物或者作为分析物的生物标志物组的一部分，用于在本发明的逆转对中使用的候选。
最后，根据本发明所述的方法，对于缺少病例相对于对照的差异，但是表明妊娠期间分析物强度变化的分析物的动力学图在妊娠时钟中是有用的。这些分析物在本文中还称为“时钟蛋白质”，其可以在没有其它确定日期的方法(例如，末次经期的日期、通过超声确定日期)的情况下或者与其它确定日期的方法结合用于确定妊娠日期。表60提供了在本发明的妊娠时钟中有用的时钟蛋白质列表。
实施例10.sPTB病例的发现2分析
本实施例描述了如在先前实施例中所述的所有先前分析的sPTB病例、它们的匹配对照(每个病例2个)和2个新的对照的分析。本实施例中所述的这一分析将商品化抽血窗扩大至19和20周之外，基于来自所有先前实施例的大量样品产生了对于sPTB<35周的预测的额外数据，导致发现了新的分析物和逆转，定义了分子时钟蛋白，澄清了风险阈值并形成了对未来临床研究的准确验证主张。
样品处理方法
建立控制早产风险蛋白质组学评价(PAPR)临床研究实施的标准规程。该规程还规定样品和临床信息可以用于研究其它妊娠并发症。在整个美国，在11个内部审查委员会(IRB)批准的地点从妇女获得样品。在提供知情同意书后，获得血清和血浆样品，以及有关患者的人口统计学特征、过往病史和妊娠史、当前妊娠史和并行药物治疗的相关信息。分娩后，采集与母体和婴儿状况以及并发症有关的数据。根据规程处理血清和血浆样品，所述规程需要标准化冷冻离心，将样品等份至0.5mL 2-D条码冷冻小瓶以及随后在-80℃冷冻。
分娩后，逐个回顾早产病例以确定它们的状态是自发早产还是医学人工早产。仅自发早产病例用于该分析。对于早产生物标志物的发现，对胎龄17 0/7-21 6/7周之间的413个样品(82个sPTB病例，331个足月产对照)产生了LC-MS数据，并且通过抽血时的胎龄，每个早产样品匹配4个足月产对照。除一天外，17 0/7-21 6/7周内的每个胎龄日包括至少一个sPTB病例(和匹配的足月产对照)。选择了在该天抽血的4个足月产对照。在本研究中，未对实验室分析失败的一个足月产对照进行再次分析。
随后，使用人14多重亲和去除系统(MARS-14)除去血清样品中的高丰度蛋白，其除去了14个丰度最高的蛋白。用柱缓冲液稀释相等体积的每个临床样品或两种质量控制血清混合物的实验重复并过滤以除去沉淀物。使用MARS-14柱(4.6×100mm，AgilentTechnologies)除去过滤样品。在自动进样器中，将样品冷却至4℃，在室温下运行除去柱，并将收集的馏分保持在4℃直至进一步分析。收集未结合的馏分用于进一步分析。
将去除的血清样品用二硫苏糖醇还原，使用碘乙酰胺烷基化，然后用胰蛋白酶水解。胰蛋白酶水解后，向样品添加了浓度近似于替代肽分析物浓度的稳定同位素标准品混合物。将添加了SIS的样品混合并分成两个相等的体积。将每个等份放置于-80℃储存直至准备好继续工作程序。将来自每个样品的一个冷冻等份从-80℃储存中取出，使其融化，然后在C18固相萃取板(Empore,3M)上脱盐。将洗脱的肽冷冻干燥至干燥。将冷冻干燥的样品在含有仅监控LC-MS步骤质量的内标的复原溶液(IS Recon)中重新溶解。
使用动态多反应监控方法(dMRM)分析完全处理的样品。将肽在2.1×100mmPoroshell EC-C18,2.7μ颗粒尺寸的柱上，以0.4mL/min的流速使用Agilent 1290UPLC分离，并且使用乙腈梯度将所述肽洗脱至以阳离子模式运行的具有电喷雾源的Agilent 6490三重四极杆质谱中。dMRM测定测量了起诊断和质量作用的对应于119个肽和77个蛋白质的442个转化。使用MassHunter定量分析软件(Agilent Technologies)对色谱峰积分。报告了替代肽分析物的色谱峰面积与相应SIS的色谱峰面积的比值。
表21中显示了在dMRM方法中测量的蛋白质、肽和血清分析物的转化、SIS转化和ISRecon标准品的总结信息。MARS-14去除的蛋白鉴别了MARS-14免疫去除柱靶向的分析物并且出于质量控制的目的测量了所述MARS-14去除的蛋白。将定量转化(Quant transitions)用于相对响应比，并且定性转化(qual transitions)起质量控制的目的。星号(*)表示名称改变。CSH表示肽对应于CSH1和CSH2两者。由于所述肽在几个HLA I型同种型中保守，因此HLAG现称为HLACI。LYAM3现称为LYAM1，这是因为尽管所述肽序列存在于每一个中，但它仅通过胰蛋白酶切割来源于LYAM1。由于所述肽对SOM2和CSH两者特异，因此SOM2现称为SOM2.CSH。
显著的蛋白质和逆转选择
对于每个分析物，在两周和三周重叠窗的每一个中，使用和不使用BMI限制并且使用两种SPTB定义(37/37和35/35)，计算了表示SPTB病例样品的平均值是否高于或低于TERM对照样品的平均值的变化倍数值。表22和23显示了重叠1周的两周胎龄窗(例如，119-132是指妊娠119-132天，其相当于妊娠17和18周)的蛋白质/转化AUROC。对于两个不同的病例vs对照截止值(<37 0/7vs>＝37 0/7，<35 0/7vs>＝35 0/7)以及使用(rBMI)和不使用(aBMI)BMI划分，报告了每个两周窗中的表现。表24和25显示了重叠两周的三周妊娠窗(以天表示，例如，“119-139”是指妊娠119-139天，其相当于妊娠17、18和19周)的蛋白质/转化AUROC。对于两个不同的病例vs对照截止值(<37 0/7vs>＝37 0/7，<35 0/7vs>＝35 0/7)以及使用(rBMI)和不使用(aBMI)BMI划分，报告了每个三周窗中的表现。
图86至95显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的出生时胎龄的截止值对于病例相对于对照的多种肽转化的动力学图。图96至105显示了使用<350/7vs>＝35 0/7周的出生时胎龄的截止值对于病例相对于对照的多种肽转化的动力学图。简要地，使用平均平滑函数均值，针对GABD使用R ggplot2软件包，对每个肽转化的平均相对比作图(窗＝+/-10天)。图展示了使用两种不同的出生时胎龄截止值(<37 0/7vs>＝37 0/7周和<35 0/7vs>＝35 0/7周)，对病例相对于对照的单独的图。图的标题显示了蛋白质的缩写、下划线和肽序列。分析物序列可以对于标题进行调整以适合该图。
基于表示SPTB病例样品均值是否大于或小于TERM对照样品均值的变化倍数值，将每个分析物对每种组合(即重叠2或3周窗、BMI限制和SPTB定义)标记为上调或下调，并且如果分析物具有标记为上调的组合中的大多数，则将其称为整体上调分析物，反之亦然。这在表26中显示。
基于这些上调和下调分配(55个上调和30个下调)，通过将每个上调分析物的相对比值除以下调分析物的相对比值并对结果取自然对数来产生逆转。这导致产生了1650个逆转(55×30＝1650)。对于每个逆转，计算了表示SPTB和TERM分离的ROC曲线下面积(AUCROC)以及表示AUCROC值是否显著不同于AUCROC＝0.5(即无显著SPTB和TERM分离)的p-值。对于不同的条件(例如，妊娠窗、有和没有BMI限制以及两个sPTB截止值)，对于AUCROC>0.6且p-值<0.05的那些逆转，将每个逆转的表现列表表示。表27至42显示了妊娠17和18周的逆转分类表现。表47至58显示了妊娠17、18和19周的逆转分类表现。表43至46显示了妊娠17至21周的逆转分类表现。表59显示了具有潜在显著性的其它逆转。
还显示了由不止一个逆转(17-21周)形成的预测因子改善的表现。简要地，将在该胎龄中早期(例如，17-19周)或晚期(例如，19-21周)提供强大预测表现的逆转组合并且对整个抽血范围评价由多个逆转组合(SumLog)所形成的预测因子的表现。这在表61中显示。预测因子得分来源于单个逆转Log值之和(SumLog)，但是本领域技术人员可以选择其它模型(例如，逻辑回归)。还考虑将这一多个逆转的方法应用于对早产胎膜早破(PPROM)相对于非PPROM早产(PTL)、胎儿性别和受孕特异的逆转组合。还考虑预测因子可以含有考虑到对抽血期、胎儿性别或受孕的认识，选择要使用的逆转亚组的指示变量。
图110显示了使用<37 0/7周相对于>＝37 0/7周妊娠的截止值，预测因子得分(lnIBP4/SHBG)和发病率调节的sPTB相对风险(阳性预测值)之间的关系。在19 1/7周至20 6/7周之间，以BMI>22<＝37吸取样品。随着预测因子得分的升高，相对风险从7.3％的背景比率(单胎妊娠中sPTB的平均人口风险)提高至约50％。对所有得分阈值，添加了筛选阳性率曲线。假设观察结果呈二项分布并且用正态分布近似误差分布，计算置信区间(灰色阴影)。根据图例中的颜色方案，通过柱状图显示了由分类器得分划分的样本分布。
图111显示了使用<35 0/7周相对于>＝35 0/7周妊娠的截止值，预测因子得分(lnIBP4/SHBG)和发病率调节的sPTB相对风险(阳性预测值)之间的关系。在19 1/7周至20 6/7周之间吸取样品。随着预测因子得分的升高，相对风险从4.4％的背景比率(单胎妊娠中sPTB(<35)的平均人口风险)提高至约50％。对所有得分阈值，添加了筛选阳性率曲线。假设观察结果呈二项分布并且用正态分布近似误差分布，计算置信区间(灰色阴影)。根据图例中的颜色方案，通过柱状图显示了由分类器得分划分的样本分布。
临床观察：sPTB、PPROM和PTL
对于sPTB、PPROM和PTL的两种不同表型，独立评价了逆转表现(GABD 17-21周)。PPROM在早期更常发生，并且它与感染或炎症有关。PTL可以晚期发生，并且通常认为是不太严重的表型。对于PPROM，存在更显著和表现更好的逆转，并且这些逆转由已知涉及炎症和感染的蛋白组成。考虑了逆转的选择以建立PPROM和PTL独立的测试方法，或者通过单一预测因子中不止一种逆转的组合使表现整体最大化。在表61至64所示的分析中，对于PPROM或PTL，要求AUC>0.65且p<0.05。
表61显示了使用<37 0/7vs≥37 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，分别对于PPROM和PTL，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表62显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，分别对于PPROM和PTL，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表63显示了使用<35 0/7vs>＝35 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，分别对于PPROM和PTL，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表64显示了使用<35 0/7vs>＝35 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，分别对于PPROM和PTL，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。
对于GABD 19-20周，还确定了对于PTL表现最好的分析物和对于PPROM表现最好的分析物，并且从表现最好的分析物构建了一些逆转。IBP4作为PTL和PPROM两者中表现优良的分析物存在，从而使其能够一般地应用于sPTB。表76列出了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，对于PTL，妊娠19 1/7至20 6/7周的转化AUROC。表77列出了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，对于PPROM，妊娠19 1/7至20 6/7周的转化AUROC。图108举例说明了在PTL中在19-20周具有良好表现的逆转。图109举例说明了在PPROM中在19-20周具有良好表现的逆转。
临床观察：初孕妇和经产孕妇
对于sPTB、初孕妇和经产孕妇的两种不同表型，进一步独立评价了逆转表现(17-21周)。在表65-68中，分别对初孕妇(初次为母)和经产孕妇受试者显示了表现最好的逆转(17-21周)。初次为母者最需要测试以预测PTB概率，这是因为对于医师来说，她们没有妊娠史来确定/估计风险。这些结果使得能够对这两组独立进行测试，或者在单一分类器中组合表现较好的逆转以预测两者的风险。在表65-68所示的分析中，对于初孕妇或经产孕妇，要求AUC>0.65且p<0.05。
表65显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，分别对于初孕妇和经产孕妇，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表66显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，分别对于初孕妇和经产孕妇，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表67显示了使用<35 0/7vs>＝350/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，分别对于初孕妇和经产孕妇，妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表68显示了使用<350/7vs>＝35 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，分别对于初孕妇和经产孕妇，妊娠170/7至21 6/7周的逆转AUROC。
临床观察：胎儿性别
还对怀有男性vs女性胎儿的受试者独立评价了逆转表现(17-21周)。发现一些逆转具有胎儿性别特异的指示表现。图106显示了胎儿性别特异的IBP4和SHBG分析物和得分(IBP4/SHBG)差异。IBP4在怀有男性胎儿的受试者中显著更高。对于无BMI划分的胎龄19-21周来说，逆转表现保持相当(图106)。另外，在PAPR临床试验中，发现男性胎儿具有提高的sPTB风险，其p值为0.0002并且优势率为1.6。最后，可以将胎儿性别引入预测因子(例如，逆转值加胎儿性别)。在表69-72所示的分析中，对于男性或女性胎儿，要求AUC>0.69且p<0.05。
表69显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，单独通过胎儿性别的妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表70显示了使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，单独通过胎儿性别的妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表71显示了使用<35 0/7vs>＝35 0/7周的病例vs对照的截止值，在无BMI划分的情况下，单独通过胎儿性别的妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。表72显示了使用<35 0/7vs>＝35 0/7周的病例vs对照的截止值，在使用BMI划分的情况下(>22<＝37)，单独通过胎儿性别的妊娠17 0/7至21 6/7周的逆转AUROC。
实施例11.质谱和免疫测定数据的相关性
本实施例显示了使用MSD平台的免疫测定的实施(例如，对于IBP4和SHBG，MSD数据与商品化ELISA数据和MS数据相关)。
材料
使用了以下抗体：性激素结合蛋白(Biospacific目录号#s 6002-100051和6001-100050；R&D Systems目录号#s MAB2656和AF2656)、IGFBP-4(Ansh目录号#s AB-308-AI039和AB-308-AI042)。作为标定物，测试了来自Origene(目录号#TP328307)、Biospacific(目录号#J65200)、NIBSC(编号：95/560)和R&D Systems(仅作为ELISA SHBG试剂盒的一部分获得)的SHBG蛋白。将重组人IGFBP-4(Ansh,目录号#AG-308-AI050)用作标定品。
产生单个U-PLEX-偶联的抗体溶液
对于≥200μL的最终体积，将每个生物素化的抗体在Diluent 100中稀释至10μg/mL。然后，将生物素化的抗体加入至300μL指定的U-PLEX接头(U-PLEX Linker)。(对于每个生物素化的抗体，使用不同的接头)。将样品涡旋并在室温下培育30分钟。将终止溶液(200μL)加入至每个管中。将管涡旋并在室温下培育30分钟。
多路涂覆溶液的制备
将每种U-PLEX-偶联的抗体(600μL)溶液合并至一管并涡旋混合。当合并少于10种抗体时，用终止溶液使溶液体积达到6mL以导致产生最终1×的浓度。注意，在这些实验中，每孔仅存在单一抗体。
涂覆U-PLEX板。
将多路涂覆溶液(50μL)加入至每个孔中。将板用粘合性板封条密封，并在约700rpm震荡的条件下，在室温下培育1小时或者在2-8℃培育过夜。用至少150μL 1×MSD清洗缓冲液清洗3次后，板即可使用。
样品分析
将50μl样品或标准物等份加入至每个孔中。将板密封并在约700rpm震荡的条件下在室温下培育1小时。然后，用至少150μL 1×MSD清洗缓冲液将板清洗3次*。将50μL检测抗体溶液加入至每个孔中。密封后，将板在约700rpm震荡的条件下在室温下培育1小时。用至少150μL 1×MSD清洗缓冲液将板清洗3次。将150μL 2×读取缓冲液加入至每个孔中后，立即在MSD仪上对板读数。
SHBG抗体和标定物筛选
在两种捕获-检测器取向中，对所有成对组合测试全部抗体。将捕获抗体制备成10μg/mL，与U-PLEX接头偶联并涂覆至U-PLEX板。将SHBG R&D Systems标定物在Diluent 43中稀释以产生7-点标准曲线(以测定稀释剂为空白)。如下所示，将样品在Diluent 43中稀释并在测定中测试：Sera SHBG“高”和“低”样品：100-和500-倍稀释，和Sera Pregnant混合物：100-、200-、400-、800-倍稀释。将检测抗体在1μg/ml在Diluent 3中测试。评价标准曲线和与血清中天然分析物的结合。然后，用如上所述稀释的NIBSC和Biospacific标定物测试最优的分析物对。
IGFBP-4抗体和标定物筛选。
在两种捕获-检测器取向中，测试两种抗体。将捕获抗体制备成10μg/mL，与U-PLEX接头偶联并涂覆至U-PLEX板。将IGFBP-4标定物在Diluent 12中稀释以产生7-点标准曲线(以测定稀释剂为空白)。如下所示，在Diluent 12中稀释样品并在测定中测试：SeraIGFBP-4“高”和“低”样品：5-倍，Sera Pregnant混合物：从2-至64-倍的2-倍稀释，和2个单个人血清样品(MSD样品)：2-、4-、8-和16-倍。将检测抗体在1μg/ml在Diluent12中测试。评价标准曲线和与血清中天然分析物的结合。
使用60个Sera样品的SHBG和IGFBP-4测试。
选择抗体对12测量来自Sera的60个血浆样品中的SHBG，重复两次。对于IGFBP-4，选择对2。对于SHBG和IGFBP-4，将血浆样品分别1:1000和1:20稀释。将MSD ELISA的结果与商品化ELISA试剂盒以及MS-MRM数据相比较。
结果：
SHBG抗体筛选
仅抗体对1(R&D mono capture,poly detection)与Origene标定物一起提供了强信号，表明该标定物可以代表内源SHBG分析物亚群。因此，在后续研究中测试了其它标定物以鉴别与全部的对一起工作的标定物。尽管如此，所有抗体对识别Sera高、低和妊娠混合样品中的天然分析物。R&D poly AF2656和Biospacific mono 6001-100050提供了类似的表现。对2、3和12对样品稀释显示出大致的线性滴定(表73)。然后，用三种其它标定物测试最好的4个抗体对的表现。在3个标定物中，对4个最好的对实现了良好的标定物曲线(表74)。信号差异可能部分由指定浓度的差异造成。
底部小图显示根据抗体对，NIBSC或Biospacific信号相对于R&D校准物是不同的。对3和10(捕获-检测取向翻转的相同抗体)具有类似的谱。对于NIBSC和Biospacific，对2提供了较低的信号(与对3相比，相同捕获)。对12对Biospacific提供了较高的信号，并且对于NIBSC标准品，提供了超过3倍更高的信号。
IGFBP-4抗体筛选
与对1相比，抗体对2标准曲线提供了4-6倍更高的特异性校准物信号和背景(表75)。对于所测试的大部分稀释，血清样品信号在线性范围内；妊娠混合物在32和64-倍稀释时接近背景。对2对样品提供了～12倍更高的信号，从而导致了2-4倍的定量差异。对于两个对，信号CV通常<5％。
60个血清样品中SHBG和IGFBP-4的测量。
对于SHBG，通过1000-倍稀释，样品落在标定物标准品1-3之间。中值测量浓度为58.4μg/mL。重复测量的CV较低，其中值CV为2.4％。IGFBP-4的中值测量浓度为234ng/ml，并且重复样品间的中值CV为2.2％。如图107所示，与商品化ELISA试剂盒和MS-MRM测定相比，在MSD测定中对两种蛋白观察到了良好的相关性。
根据上述说明，显而易见的是可以对本文所述的本发明做出改变和变化以使其适合于多种用途和条件。这些实施方式也在以下权利要求的范围内。
在本文中，对变量的任何定义中的元素列表的列举包括该变量作为任何单个元素或所列元素组合(或子组合)的定义。在本文中，对实施方式的列举包括作为任何单个实施方式或者与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
在本说明书中提及的所有专利和专利公开以每个单独的专利和专利公开具体并且单独表明作为参考并入本文的相同程度作为参考并入本文。
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表4
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表5
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表11：显示试剂盒与MS数据相关或不相关的分析物
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表12：显示sPTB vs对照分离的IBP4和SHBG ELISA试剂盒(单变量)
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表19：PTB样品中在17-25周GA之间具有改变的血清水平的蛋白质。
蛋白质 变化 功能类别
THRB 上调 凝血/急性期反应
VTNC 上调 细胞粘附/急性期反应
HEMO 上调 亚铁原卟啉转运/急性期反应
FETUA 上调 炎症/急性期反应
LBP 上调 先天免疫/急性期反应
IBP4 上调 生长因子调控
CD14 上调 先天免疫
HABP2 上调 细胞粘附/迁移
INHBC 上调 生长因子调控
CFAB 上调 补体/急性期反应
ICAM1 上调 细胞粘附/迁移
IC1 上调 补体/急性期反应
APOH 上调 凝血/自身免疫
B2MG 上调 MHC/免疫性
C1S 上调* 补体
APOE 上调* 胆固醇代谢
APOC3 上调* 甘油三酯代谢
PEDF 上调* 血管生成
CATD 上调* ECM重塑/细胞迁移
INHBE 上调* 生长因子调控
IBP6 上调* 生长因子调控
PRG2 下调 生长因子调控
SHBG 下调 炎症/类固醇代谢
GELS 下调 肌动蛋白结合/急性期反应
PSG4 下调* 生长因子调控
*PTB中的其它蛋白质限于19-21周GA。
表20：满足分析过滤器的在sPTB vs.足月产对照中上调或下调的44种蛋白。
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*HLA-G的肽替代物对该蛋白不唯一。
表21
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*表示名称变化。CSH表示对应于CSH1和CSH2两者的肽。HLAG现称为HLACI，因此该肽在一些I型HLA同种型中保守。LYAM3现称为LYAM1，因为尽管该肽序列存在于每一个中，但是它仅通过胰蛋白酶切割来源于LYAM1。SOM2现称为SOM2.CSH，因为所述肽对SOM2和CSH两者特异。
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表26：用于逆转的上调和下调的蛋白质/转化
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表59：其它逆转
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表60：时钟蛋白质
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表74：使用其它标定物，表现最好的SHBG抗体对
Figure GDA0001913956120004401
表75：IGFBP-4抗体筛选
Figure GDA0001913956120004402
表76：转化分类表现，19-20周。
使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照截止值，无BMI划分的情况下，对于PTL，妊娠19 1/7至20 6/7周的转化AUROC。
Figure GDA0001913956120004411
表77：转化分类表现，19-20周。
使用<37 0/7vs>＝37 0/7周的病例vs对照截止值，无BMI划分的情况下，对于PPROM，妊娠19 1/7至20 6/7周的转化AUROC。
Figure GDA0001913956120004412
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Figure IDA0001913956160000011
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Claims (40)

1.组合物，其包含分离的生物标志物对，所述分离的生物标志物对由IBP4/SHBG组成，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化。
2.组合物，其包含生物标志物对的替代肽对，所述生物标志物对由IBP4/SHBG组成，其中所述生物标志物对在具有早产风险的怀孕的雌性动物和足月产对照之间显示出逆转值的变化，其中所述替代肽对包括对应于IBP4的第一替代肽和对应于SHBG的第二替代肽，其中所述第一替代肽的序列包括QCHPALDGQR，并且其中所述第二替代肽的序列包括IALGGLLFPASNLR。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第一替代肽和所述第二替代肽是稳定同位素标记的。
4.特异地结合IBP4的捕获试剂和特异地结合SHBG的捕获试剂在制备用于在来自怀孕的雌性动物的生物样品中确定早产风险的试剂盒的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述确定通过如下实现：
a. 通过将所述生物样品与所述特异地结合IBP4的捕获试剂和所述特异地结合SHBG的捕获试剂接触，检测所述IBP4和SHBG是否存在于所述生物样品中；和
b. 检测IBP4和所述特异地结合IBP4的捕获试剂之间以及SHBG和所述特异地结合SHBG的捕获试剂之间的结合。
6.分离的生物标志物对在制备用于在来自怀孕的雌性动物的生物样品中确定早产风险的试剂盒的用途，其中所述分离的生物标志物对由IBP4/SHBG组成。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述确定通过以下实现：检测所述IBP4和SHBG是否存在于所述生物样品中，其包括对所述样品进行由质谱定量组成的蛋白质组学工作流程。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的用途，其中所述生物样品选自全血、血浆和血清。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述生物样品是血清。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品在19至21周胎龄之间获得。
11.根据权利要求7所述的用途，其中所述蛋白质组学工作流程包括稳定同位素标记的肽的定量。
12.根据权利要求5或7所述的用途，还包括检测一种或多种风险指征的可测量特征。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述风险指征选自体重指数、受孕和胎儿性别。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述风险指征选自体重指数。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述怀孕的雌性动物的体重指数大于22 kg/m2并且小于或等于37kg/m2。
16.根据权利要求7所述的用途，其中所述质谱选自包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱；基质辅助激光解吸/电离飞行时间源后衰变；基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱；电喷雾电离质谱；电喷雾电离质谱/质谱；电喷雾电离质谱/质谱n，其中n是大于零的整数；电喷雾电离3D或线性2D离子阱质谱；电喷雾电离三重四级质谱；电喷雾电离四极正交飞行时间；电喷雾电离傅里叶变换质谱系统；硅上解吸/电离；次级离子质谱法；大气压化学电离质谱法；大气压化学电离质谱法/质谱；大气压化学电离质谱法-质谱n；离子迁移光谱；电感耦合等离子体质谱、大气压光化电离质谱仪；大气压光化电离质谱仪/质谱；大气压光化电离质谱仪-质谱n。
17.根据权利要求7所述的用途，其中所述质谱包含免疫共沉淀-质谱分析法。
18.根据权利要求7所述的用途，其中所述质谱包含液相色谱-质谱。
19.根据权利要求7所述的用途，其中所述质谱包含多反应监控或选择的反应监控。
20.生物标志物对IBP4和SHBG在制备用于根据来自怀孕的雌性动物的生物样品中所述生物标志物对的逆转值确定所述怀孕的雌性动物中早产概率的试剂盒中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述怀孕的雌性动物和足月产对照之间逆转值变化的存在指示了怀孕的雌性动物中的早产概率。
22.根据权利要求20所述的用途，其中所述确定包括测量得自所述怀孕的雌性动物的生物样品中所述生物标志物的替代肽。
23.根据权利要求20所述的用途，其中所述概率表示为风险得分。
24.根据权利要求20所述的用途，其中所述生物样品选自全血、血浆和血清。
25.根据权利要求20所述的用途，其中所述生物样品是血清。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述样品在19至22周胎龄之间获得。
27.根据权利要求22所述的用途，其中所述测量包括质谱法。
28.根据权利要求22所述的用途，其中所述测量包括使用捕获试剂的测定。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述捕获试剂选自抗体、抗体片段、核酸基蛋白结合试剂、小分子或其变体。
30.根据权利要求28所述的用途，其中所述测定选自酶免疫测定、酶联免疫吸附测定和放射免疫测定。
31.根据权利要求20所述的用途，还包括检测一种或多种风险指征的可测量特征。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述风险指征选自体重指数、受孕和胎儿性别。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述风险指征是体重指数。
34.根据权利要求20所述的用途，其中所述用途还包括所述早产概率确定之前对出生时胎龄的预测。
35.根据权利要求33所述的用途，其中所述怀孕的雌性动物的体重指数大于22 kg/m2并且小于或等于37 kg/m2。
36.根据权利要求20所述的用途，其中所述逆转值基于所述IBP4相对于所述SHBG的比值IBP4/SHBG以确定所述怀孕的雌性动物中的早产概率，其中与足月产对照相比怀孕的雌性动物中较高的比值表示早产风险提高。
37.根据权利要求27所述的用途，其中所述质谱选自包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱；基质辅助激光解吸/电离飞行时间源后衰变；基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱；电喷雾电离质谱；电喷雾电离质谱/质谱；电喷雾电离质谱/质谱n，其中n是大于零的整数；电喷雾电离3D或线性2D离子阱质谱；电喷雾电离三重四级质谱；电喷雾电离四极正交飞行时间；电喷雾电离傅里叶变换质谱系统；硅上解吸/电离；次级离子质谱法；大气压化学电离质谱法；大气压化学电离质谱法/质谱；大气压化学电离质谱法-质谱n；离子迁移光谱；电感耦合等离子体质谱、大气压光化电离质谱仪；大气压光化电离质谱仪/质谱；大气压光化电离质谱仪-质谱n。
38.根据权利要求27所述的用途，其中所述质谱包含免疫共沉淀-质谱分析法。
39.根据权利要求27所述的用途，其中所述质谱包含液相色谱-质谱。
40.根据权利要求27所述的用途，其中所述质谱包含多反应监控或选择的反应监控。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10928402B2 (en) 2012-12-28 2021-02-23 Nx Prenatal Inc. Treatment of spontaneous preterm birth
CA3210007A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc Biomarkers and methods for predicting preeclampsia
IL256399B (en) 2015-06-19 2022-09-01 Sera Prognostics Inc Pairs of biomarkers for predicting premature birth
JP2019505815A (ja) 2015-12-04 2019-02-28 エヌエックス・プリネイタル・インコーポレイテッドＮＸ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｉｎｃ． 自然早産リスクを層別化するための循環マイクロ粒子の使用
CA3032944A1 (en) * 2016-08-05 2018-02-08 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth in a pregnant female exposed to progestogens
JP2019532261A (ja) * 2016-08-05 2019-11-07 セラ プログノスティックス， インコーポレイテッド 予定日前の早期破水対特発性自然陣痛に起因する早産を予測するためのバイオマーカー
WO2018071845A1 (en) * 2016-10-13 2018-04-19 Krishnamurti Tamar Priya A structured medical data classification system for monitoring and remediating treatment risks
JP2018140172A (ja) * 2017-02-28 2018-09-13 株式会社Ｎｔｔドコモ データ収集装置及びデータ収集方法
AU2018317902A1 (en) 2017-08-18 2020-03-05 Sera Prognostics, Inc. Pregnancy clock proteins for predicting due date and time to birth
EP3746087A4 (en) * 2018-01-31 2022-02-09 Nx Prenatal Inc. METHODS FOR EARLY PREDICTION AND PREVENTION OF PRE-ECLAMPSIA USING BIOMARKERS ASSOCIATED WITH CIRCULATING MICROPARTICLES
SG11202007316TA (en) * 2018-01-31 2020-08-28 Nx Prenatal Inc Use of circulating microparticles to stratify risk of spontaneous preterm birth
US20220170941A1 (en) * 2019-04-04 2022-06-02 Carmentix Pte. Ltd. Biomarker Pairs of Preterm Birth
WO2020201521A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Carmentix Pte. Ltd. Biomarker pairs of preterm birth
EP3786977A1 (de) * 2019-08-29 2021-03-03 WPmed GbR Computerimplementiertes verfahren und elektronisches system zur prognose eines entbindungszeitpunkts
BR112022015303A2 (pt) * 2020-02-10 2022-09-27 Somalogic Operating Co Inc Biomarcadores de esteato-hepatite não alcoólica (nash) e usos dos mesmos
WO2022034118A1 (en) 2020-08-11 2022-02-17 University College Cork - National University Of Ireland, Cork A method of predicting the risk of spontaneous pre-term birth (sptb)
CN112126683A (zh) * 2020-08-31 2020-12-25 中山大学 用于迟发型子痫前期诊断的标志物
US20230101470A1 (en) * 2020-10-27 2023-03-30 Lipocine Inc. Hydroxyprogesterone Caproate Compositions and Methods of Use in Preventing Preterm Birth
CN112730692B (zh) * 2021-01-08 2022-11-29 首都医科大学附属北京朝阳医院 用于预测胎膜早破的生物标记物和方法
CN112899360A (zh) * 2021-02-02 2021-06-04 北京航空航天大学 一种检测特雷彻·柯林斯综合征发生概率的组合物的应用方法
CN113223714B (zh) * 2021-05-11 2022-07-05 吉林大学 一种用于预测子痫前期风险的基因组合、子痫前期风险预测模型及其构建方法
CA3220282A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Sera Prognostics, Inc. Biomarker pairs and triplets for predicting preterm birth
CN113933516A (zh) * 2021-09-06 2022-01-14 山东省妇幼保健院 早产潜在预测标志物筛选方法、早产检测试剂盒及其用途
WO2023110832A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 UNIVERSITé LAVAL Biomarkers for the prediction of preterm birth

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005031364A1 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
WO2009108073A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-03 Auckland Uniservices Limited Biomarkers for prediction of preeclampsia and/or cardiovascular disease
WO2014089124A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Cenexys, Inc. Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells
WO2014143977A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preeclampsia
WO2014144129A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preterm birth

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
EP0731174B1 (en) 1989-07-11 2004-11-17 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification methods
WO1991016633A1 (en) 1990-04-12 1991-10-31 Adeza Biomedical Corporation Pregnancy induced hypertension and eclampsia immunoassay and reagents
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
CA2121680C (en) 1991-11-04 2005-03-22 Andrew E. Senyei Screening method for identifying women at increased risk for preterm delivery
US5270184A (en) 1991-11-19 1993-12-14 Becton, Dickinson And Company Nucleic acid target generation
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US6678669B2 (en) 1996-02-09 2004-01-13 Adeza Biomedical Corporation Method for selecting medical and biochemical diagnostic tests using neural network-related applications
NZ330475A (en) 1996-09-20 1999-11-29 Univ Emory Antibodies, and use thereof in measuring lipid peroxidation in biological samples and method for inducing inflammation
US7091316B2 (en) 2000-08-09 2006-08-15 Maruho Co., Ltd. Protein induced by homogeneous blood transfusion and DNA encoding the same
GB0026823D0 (en) 2000-11-02 2000-12-20 King S College London Diagnosis of pre-eclampsia
EP1364069B1 (en) 2001-03-01 2009-04-22 Epigenomics AG Method for the development of gene panels for diagnostic and therapeutic purposes based on the expression and methylatoin status of the genes
WO2002088750A2 (en) 2001-05-02 2002-11-07 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer
US7435419B2 (en) 2002-07-19 2008-10-14 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of diagnosing and treating pre-eclampsia or eclampsia
CN101692090B (zh) 2002-08-06 2014-06-25 约翰霍普金斯大学 用于检测卵巢癌的生物标记的用途
AU2003290775A1 (en) 2002-11-14 2004-06-03 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for intra-amniotic inflammation
US7541182B2 (en) 2003-02-13 2009-06-02 Yale University In vitro test to detect risk of preeclampsia
US7191068B2 (en) 2003-03-25 2007-03-13 Proteogenix, Inc. Proteomic analysis of biological fluids
US8068990B2 (en) 2003-03-25 2011-11-29 Hologic, Inc. Diagnosis of intra-uterine infection by proteomic analysis of cervical-vaginal fluids
WO2005014635A2 (en) 2003-07-15 2005-02-17 Genova Ltd. Secreted polypeptide species reduced in cardiovascular disorders
WO2005017192A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
US20050043640A1 (en) 2003-08-21 2005-02-24 Chang Alexander C. Remote electrocardiogram for early detection of coronary heart disease
US20050233400A1 (en) 2004-03-03 2005-10-20 Weiner Carl P Proteomic method for predicting success of rescue cerclage
EP1737979B9 (en) 2004-03-23 2011-09-21 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing non-small cell lung cancer
EP1970454B1 (en) 2004-08-27 2012-09-19 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US20080090759A1 (en) 2004-08-30 2008-04-17 Robert Kokenyesi Methods and kits for predicting risk for preterm labor
WO2006029838A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Geneprot Inc. Secreted polypeptide species involved in alzheimer’s disease
EP1799861A2 (en) 2004-09-20 2007-06-27 Proteogenix, Inc. Diagnosis of fetal aneuploidy
WO2006052924A2 (en) 2004-11-08 2006-05-18 Nanobac Life Sciences Methods and compositions for protein-hydroxy apatite complexes and their application in testing and modulating immunological system including a novel in vitro test for the detection of antibodies against calcium binding protein-hydroxy apatite complexes
US20060166242A1 (en) 2005-01-06 2006-07-27 Mount Sinai Hospital Markers of pre-term labor
ATE501267T1 (de) 2005-01-06 2011-03-15 Eastern Virginia Med School Apolipoprotein-a-ii-isoform als biomarker für prostatakrebs
US7662570B2 (en) 2005-01-26 2010-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Labor biomarkers, methods comprising same, and methods targeting same
CA2602088C (en) 2005-03-11 2021-07-27 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for ovarian cancer and endometrial cancer
US7972770B2 (en) 2005-08-16 2011-07-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of detection of cancer using peptide profiles
SI1929297T1 (sl) 2005-09-29 2013-06-28 Caprion Proteomics Usa, Llc Bioloĺ ki oznaäśevalci pri multipli sklerozi in metode za njihovo uporabo
US8263342B2 (en) 2005-10-27 2012-09-11 Yale University Urinary proteomic biomarker patterns in preeclampsia
US20070111326A1 (en) 2005-11-14 2007-05-17 Abbott Laboratories Diagnostic method for proteinaceous binding pairs, cardiovascular conditions and preeclampsia
US7790463B2 (en) 2006-02-02 2010-09-07 Yale University Methods of determining whether a pregnant woman is at risk of developing preeclampsia
AU2007214253B2 (en) 2006-02-06 2013-01-10 Pacific Biotech Pty Ltd Method related to gestation periods
GB0605950D0 (en) 2006-03-24 2006-05-03 Jopejo Ltd Device for prediction of human or other mammalian labour onset
WO2007146229A2 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Tethys Bioscience, Inc. Markers associated with arteriovascular events and methods of use thereof
US8450057B2 (en) * 2006-08-14 2013-05-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
EP1914553A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of foetal growth retardation
EP1914552A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of pre-eclampsia
EP1914548A1 (en) 2006-10-20 2008-04-23 The University Of Newcastle Research Associates Limited Method for identifying women with an increased risk of preterm delivery
WO2008046160A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Newcastle Innovation Limited Assay for the detection of biomarkers associated with pregnancy related conditions
US20100143949A1 (en) 2006-10-31 2010-06-10 George Mason Intellectual Properties, Inc. Biomarkers for colorectal cancer
CN101636175A (zh) 2006-11-01 2010-01-27 乔治梅森知识产权公司 用于神经病况的生物标记
AU2007338634A1 (en) 2006-12-26 2008-07-03 Brigham Young University Serum proteomics system and associated methods
WO2008085024A1 (en) 2007-01-12 2008-07-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Identification and detection of peptides relating to specific disorders
EP2038431A1 (en) 2007-02-01 2009-03-25 Diagnostic Technologies Ltd. Method for determining preeclampsia risk
US20080233583A1 (en) 2007-02-20 2008-09-25 Regents Of The University Of California Biomarkers for preeclampsia
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
US20080274481A1 (en) 2007-03-28 2008-11-06 Vermillion, Inc. Methods for diagnosing ovarian cancer
EP2147309A4 (en) 2007-05-05 2010-08-04 Univ Western Ontario METHODS OF DETECTING PRECLAMPSY
WO2008146100A1 (en) 2007-06-01 2008-12-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for absolute quantification of polypeptides
KR20100058496A (ko) 2007-07-20 2010-06-03 더 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 조산의 위험을 평가하기 위한 바이오마커의 확인 및 정량화
GB0724735D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Psynova Neurotech Ltd Methods and biomarkers for diagnosing and monitoring psychotic disorders
US20100017143A1 (en) 2008-01-30 2010-01-21 Proteogenix, Inc. Gestational age dependent proteomic changes of human maternal serum for monitoring maternal and fetal health
US20100016173A1 (en) 2008-01-30 2010-01-21 Proteogenix, Inc. Maternal serum biomarkers for detection of pre-eclampsia
AU2009235925A1 (en) 2008-04-09 2009-10-15 The University Of British Columbia Methods of diagnosing acute cardiac allograft rejection
EP2310859A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 University of Utah Research Foundation Identifying and quantifying biomarkers associated with preeclampsia
US20110256560A1 (en) 2008-10-20 2011-10-20 University Health Network Methods and compositions for the detection of ovarian cancer
US20100216250A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Lopez Mary Frances Methods for Predicting Trisomy 21 in a Fetus
WO2010099211A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for diagnosing and preventing spontaneous preterm birth
US20120149041A1 (en) 2009-08-20 2012-06-14 University Of Utah Research Foundation Identification and quantification of biomarkers for evaluating the risk of preterm birth
BR112012010108A2 (pt) 2009-10-30 2016-05-31 Prometheus Laboratoires Inc métodos para auxiliar no diagnóstico e para monitorar a progressão ou regressão da síndrome do intestino irritável, meio legível por computador, e, sistema para classificar se uma amostra de soro ou sangue de um indivíduo está associada com a síndrome do intestino irritável
GB0922240D0 (en) 2009-12-21 2010-02-03 Cambridge Entpr Ltd Biomarkers
WO2011094535A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarkers of aging for detection and treatment of disorders
TWI390204B (zh) 2010-02-11 2013-03-21 Univ Chang Gung Biomarker of bladder cancer and its detection method
US20130183684A1 (en) 2010-02-16 2013-07-18 Crc For Asthma And Airways Ltd Protein biomarkers for obstructive airways diseases
JP5899213B2 (ja) 2010-08-06 2016-04-06 マイカーティス エヌ．ヴェ．ＭｙＣａｒｔｉｓ ＮＶ 腎機能不全のバイオマーカーとしてのパールカン
CN102445534A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 无锡市凯奥善生物医药科技有限公司 一种孕妇早产及胎膜早破联检试剂盒
US20120190561A1 (en) 2010-11-15 2012-07-26 Ludwig Wildt Means and methods for diagnosing endometriosis
JP5990542B2 (ja) * 2011-02-11 2016-09-14 エグザジェン ダイアグノスティクス インコーポレイテッドＥｘａｇｅｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 全身性エリテマトーデスのリスクスコアを算出する方法
EP2718721A4 (en) * 2011-06-07 2014-10-01 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings S A R L CIRCULATING BIOMARKERS FOR CANCER
RU2486519C1 (ru) * 2011-11-15 2013-06-27 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразви Способ прогнозирования преждевременных родов и внутриутробного инфицирования плода
US20130130278A1 (en) * 2011-11-22 2013-05-23 Ottawa Hospital Research Institute Detection of risk for pregnancy-related medical conditions
WO2013081721A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Battelle Memorial Institute Biomarkers for lymphoma
ES2690782T3 (es) * 2012-10-24 2018-11-22 Nyu Winthrop Hospital Biomarcador no invasivo para identificar sujetos en riesgo de parto prematuro
WO2014110098A1 (en) 2013-01-08 2014-07-17 Duke University Biomarkers for the prediction of preterm birth
US20140287948A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preterm birth
IL256399B (en) 2015-06-19 2022-09-01 Sera Prognostics Inc Pairs of biomarkers for predicting premature birth
CA3032944A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers for predicting preterm birth in a pregnant female exposed to progestogens
JP2019532261A (ja) 2016-08-05 2019-11-07 セラ プログノスティックス， インコーポレイテッド 予定日前の早期破水対特発性自然陣痛に起因する早産を予測するためのバイオマーカー
AU2018317902A1 (en) 2017-08-18 2020-03-05 Sera Prognostics, Inc. Pregnancy clock proteins for predicting due date and time to birth

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005031364A1 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
WO2009108073A1 (en) * 2008-02-28 2009-09-03 Auckland Uniservices Limited Biomarkers for prediction of preeclampsia and/or cardiovascular disease
WO2014089124A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Cenexys, Inc. Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells
WO2014143977A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preeclampsia
WO2014144129A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sera Prognostics, Inc. Biomarkers and methods for predicting preterm birth

Also Published As

Publication number Publication date
CN108450003A (zh) 2018-08-24
US20200071761A1 (en) 2020-03-05
AU2016279002A1 (en) 2018-01-25
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CN115015552A (zh) 2022-09-06
JP2020165993A (ja) 2020-10-08
RU2017144232A (ru) 2019-07-19
US20170022565A1 (en) 2017-01-26
KR20180029046A (ko) 2018-03-19
EP4321626A2 (en) 2024-02-14
PL3311158T3 (pl) 2023-11-27
BR112017027528A2 (pt) 2018-09-11
EP3311158B1 (en) 2023-08-30
US20210180135A1 (en) 2021-06-17
AU2022241477A1 (en) 2022-10-20
EP3311158C0 (en) 2023-08-30
AU2016279002B2 (en) 2022-06-30
EP3311158A4 (en) 2019-01-23
JP2022145783A (ja) 2022-10-04
JP2022173239A (ja) 2022-11-18
WO2016205723A2 (en) 2016-12-22
JP6840391B2 (ja) 2021-03-10
RU2017144232A3 (zh) 2019-12-24
US10392665B2 (en) 2019-08-27
JP7385951B2 (ja) 2023-11-24
CA2990000A1 (en) 2016-12-22
US10961584B2 (en) 2021-03-30
JP2018524581A (ja) 2018-08-30

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